ES2356167T3

ES2356167T3 - Método de diagnóstico y terapia para enfermedades asociadas con un haplotipo inflamatorio il-1.

Info

Publication number: ES2356167T3
Application number: ES05744466T
Authority: ES
Inventors: Gordon W. Duff; Kenneth Kornman; Leon Wilkins; Hong Min Chen; John Rogus
Original assignee: Interleukin Genetics Inc
Current assignee: Interleukin Genetics Inc
Priority date: 2004-05-03
Filing date: 2005-05-03
Publication date: 2011-04-05
Anticipated expiration: 2025-05-03
Also published as: DE602005025111D1; WO2005108619A3; WO2005108619A2; EP1751304B1; EP1751304A2; ATE490341T1; CA2565562A1

Abstract

Un método para predecir la sensibilidad de un sujeto humano a la periodontopatía, que comprende la etapa de identificar en una muestra de DNA genómico del sujeto un modelo alélico que comprende una de las siguientes series de alelos de IL-1B: (1)alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 2 (-3737); (2)alelo 2 (-511), alelo 2 (-1468) y alelo 1 (-3737); (3)alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737); o (4)alelo 2 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737), en donde la presencia de uno cualquiera de los modelos alélicos 1, 3 o 4 indica que dicho sujeto tiene mayor sensibilidad a la periodontopatía y en donde la presencia del modelo alélico 2 indica que el sujeto tiene menor sensibilidad a la periodontopatía.

Description

Método de diagnóstico y terapia para enfermedades asociadas con un haplotipo inflamatorio IL-1.

1. Fundamento de la invención Genética de la agrupación de genes IL-1

La agrupación de genes IL-1 está en el brazo largo del cromosoma 2 (2q13) y contiene al menos los genes IL-1\alpha (IL-1A), IL-1\beta (IL-1B), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RN), dentro de una región de 430 Kb (Nicklin, et al., (1994) Genomics, 19: 382-4). Las moléculas agonistas, IL-1\alpha y IL-1\beta, tienen una actividad pro-inflamatoria potente y están en el principio de muchas cascadas inflamatorias. Sus acciones, frecuentemente vía la inducción de otras citoquinas, tales como IL-6 e IL-8, conducen a la activación y el reclutamiento de leucocitos en el tejido dañado, la producción local de agentes vasoactivos, respuesta de fiebre en el cerebro y respuesta de la fase hepática aguda. Todas las tres moléculas IL-1 se unen a los receptores de IL-1 de tipo I y tipo II, pero solamente el receptor de tipo I transduce una señal al interior de la célula. En contraste, el receptor de tipo II es liberado de la membrana celular y actúa como receptor señuelo. El antagonista del receptor y el receptor de tipo II, por tanto, son ambos anti-inflamatorios en sus acciones.

La producción inapropiada de IL-1 desempeña un papel central en la patología de muchas enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide; trastorno intestinal inflamatorio, psoriasis y similares. Además, hay diferencias inter-individuales estables en las tasas de producción de IL-1, y algo de esta variación puede ser explicado por diferencias genéticas en los loci de los genes IL-1. Por tanto, los genes IL-1 son candidatos razonables para determinar parte de la sensibilidad genética a las enfermedades inflamatorias, la mayoría de las cuales tienen una etiología multifactorial con un componente poligénico.

Determinados alelos de la agrupación de genes IL-1 se sabe que están asociados con estados morbosos particulares. Por ejemplo, para el alelo 2 de IL-1RN con repeticiones en tándem de número variable (abreviadamente VNTR por la expresión inglesa Variable Number of Tandem Repeats) se ha demostrado que está asociado con osteoporosis (Patente de EE.UU. Nº 5.698.399), nefropatía en diabetes mellitus (Blakemore, et al., (1996) Hum. Genet. 97(3): 369-74), alopecia areata (Cork, et al., (1995) J. Invest. Dermatol. 104(5 Supp.): 15S-16S; Cork et al., (1996) Dermatol. Clin. 14: 671-8), enfermedad de Graves (Blakemore, et al., (1995) J. Clin. Endocrinol. 80(1): 111-5), lupus eritematoso sistémico (Blakemore, et al., (1994) Arthritis Rheum. 37: 1380-85), esclerosis del liquen (Clay, et al., (1994) Hum. Genet. 94: 407-10), y colitis ulcerosa (Mansfield, et al., (1994) Gastroenterol. 106(3): 637-42).

Además, se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1A del marcador -889.y el alelo 2 de IL-1B (TagI) del marcador +3954 están asociados con la periodontopatía (Patente de EE.UU. Nº 5.686.246; Kornman y diGiovine (1998) Ann. Periodont. 3: 327-38; Hart y Kornman (1997) Periodontol. 2000 14: 202-15; Newman (1997) Compend. Contin. Educ. Dent. 18: 881-4; Kornman et al., (1997) J. Clin. Periodontol. 24: 72-77). También se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1A del marcador -889 está asociado con la artritis crónica juvenil, particularmente la iridociclitis crónica (McDowell, et al., (1995) Arthritis Rheum. 38: 221-28). También se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1B (TagI) del marcador +3954 de IL-1B está asociado con la psoriasis y la diabetes dependiente de insulina en pacientes con DR3/4 (diGiovine, et al., (1995) Cytokine 7: 606; Pociot, et al., (1992) Eur. J. Clin. Invest. 22: 396-402). Adicionalmente, se ha encontrado que el alelo 1 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la retinopatía diabética (véanse las solicitudes USSN 09/037472, y PCT/GB97/02790). Además, se ha encontrado que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la colitis ulcerante en la población caucásica de Norte América y Europa (Mansfield, J. et al., (1994) Gastroenterology 106: 637-42). Es muy interesante saber que esta asociación es particularmente fuerte con poblaciones de judíos ashkenazis étnicamente relacionados (solicitud PCT WO97/25445).

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Cribado de genotipos

Los métodos tradicionales para el cribado de enfermedades heredables han dependido de la identificación de productos génicos anormales (por ejemplo, la anemia de células falciformes) o de un fenotipo anormal (por ejemplo, el retraso mental). Estos métodos son de una utilidad limitada para las enfermedades heredables que comienzan tarde y para las que no existen fenotipos fácilmente identificables, tales como, por ejemplo, las enfermedades vasculares. Con el desarrollo de la metodología del cribado genético sencillo y barato ahora es posible identificar polimorfismos que indican una propensión a desarrollar la enfermedad, incluso cuando la enfermedad es de origen poligénico. El número de enfermedades que pueden ser cribadas por métodos de la biología molecular continúa creciendo con la mayor comprensión de las bases genéticas de los trastornos multifactoriales.

El cribado genético (también denominado genotipificación o cribado molecular), puede ser definido ampliamente como un análisis para determinar si un paciente tiene mutaciones (alelos o polimorfismos) que causan un estado morboso o están "ligadas" a la mutación que causa el estado morboso. El ligamiento se refiere al fenómeno de que las secuencias de DNA que están próximas entre sí en el genoma tienden a ser heredadas conjuntamente. Dos secuencias pueden estar ligadas debido a alguna ventaja selectiva de la herencia conjunta. Más típicamente, sin embargo, dos secuencias polimorfas se heredan conjuntamente porque debido a la infrecuencia relativa con la que los eventos de recombinación meióticos ocurren dentro de la región entre los dos polimorfismos. Los alelos polimórficos heredados conjuntamente se dice que se encuentran en desequilibrio del ligamiento uno con el otro debido a que, en una población humana dada, tienden ambos a estar presentes conjuntamente o de otro modo no lo están en absoluto en cualquier miembro particular de la población. Realmente, cuando se encuentran polimorfismos múltiples en una región cromosómica dada están en desequilibrio del ligamiento uno con el otro, definiendo un "haplotipo" genético cuasi estable. En contraste, los eventos de recombinación que ocurren entre dos loci polimórficos hacen que lleguen a estar separados en distintos cromosomas homólogos. Si la recombinación meiótica entre dos polimorfismos ligados físicamente ocurre con suficiente frecuencia, los dos polimorfismos aparecerán segregados independientemente y se dice de ellos que está en equilibrio de ligamiento.

Aunque la frecuencia de la recombinación meiótica entre dos marcadores es generalmente proporcional a la distancia física entre ellos en el cromosoma, la presencia de "puntos calientes", así como regiones de recombinación cromosómica reprimida puede dar como resultado discrepancias entre la distancia física y la de recombinación entre los dos marcadores. Por tanto, en determinadas regiones cromosómicas, múltiples locis polimórficos que se extienden en un amplio dominio cromosómico pueden encontrarse en desequilibrio de ligamiento uno con respecto al otro y, por ello definir un haplotipo genético de amplia extensión. Además, cuando se encuentra una mutación causante de una enfermedad dentro de o en unión con este haplotipo, se pueden usar uno o más alelos polimórficos del haplotipo como indicador de diagnóstico o pronóstico de la probabilidad de desarrollar la enfermedad. Esa asociación entre polimorfismos de otro modo benignos y un polimorfismo causante de la enfermedad ocurre si la mutación causante de la enfermedad surgió en un pasado reciente, de modo que no ha transcurrido un tiempo suficiente para conseguir el equilibrio a través de eventos de recombinación. Por lo tanto, la identificación de un haplotipo humano que abarque o esté dentro de un cambio mutacional causante de la enfermedad, sirve como medida predictiva de la probabilidad de un individuo de tener heredada una mutación causante de la enfermedad. Importantemente, dichos métodos de pronóstico o diagnóstico se pueden utilizar sin necesidad de la identificación y aislamiento de la lesión causante de la enfermedad. Esto es significativo debido a que puede ser difícil y laboriosa la determinación precisa del defecto molecular implicado en un proceso morboso, especialmente en el caso de enfermedades multifactoriales tales como los trastornos inflamatorios.

Realmente, la correlación estadística entre un trastorno inflamatorio y un de polimorfismo de IL-1 no indica necesariamente que el polimorfismo cause directamente el trastorno. En su lugar el polimorfismo correlacionado puede ser una variante alélica benigna que está ligada a (es decir, en desequilibrio del ligamiento con) una mutación causante del trastorno que ha ocurrido en el pasado evolutivo humano reciente, de modo que no ha transcurrido suficiente tiempo para que se consiga el equilibrio a través de eventos de recombinación en el segmento cromosómico intercalado. Por tanto, para los fines de análisis para diagnóstico y pronóstico de una enfermedad particular, la detección de un alelo polimórfico asociado con la enfermedad puede ser utilizado sin la consideración de si el polimorfismo está directamente implicado en la etiología de la enfermedad. Por otra parte, cuando un locus polimorfo benigno está en un desequilibrio del ligamiento con un locus polimorfo aparentemente causante de la enfermedad, todavía son probables otros loci polimorfos que están en desequilibrio del ligamiento estén también en desequilibrio del ligamiento con el locus polimorfo causante de la enfermedad. Por tanto, estos otros loci polimorfos también serán un pronóstico o diagnóstico de la probabilidad de tener heredado el locus polimorfo causante de la enfermedad. Realmente, un haplotipo humano de amplia extensión (que describe el modelo típico de la herencia conjunta de alelos de un conjunto de marcadores polimorfos ligados) puede servir como diana para fines de diagnóstico una vez que se haya establecido una asociación entre una enfermedad o estado particular y un haplotipo humano correspondiente. Por tanto, la determinación de la probabilidad de un individuo de desarrollar una enfermedad o estado particular se puede realizar caracterizando uno o más alelos polimorfos asociados a la enfermedad (o incluso uno o más haplotipo asociados a la enfermedad) si determinar o caracterizar necesariamente la variación genética causante.

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2.- Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para predecir en un sujeto humano la sensibilidad a padecer la periodontopatía, que comprende la etapa de identificar en una muestra de DNA genómico de un sujeto un modelo alélico que comprende uno de los siguientes conjuntos de alelos IL-1B:

(1): (-511) alelo 1, (-1468) alelo 1 y (-3737) alelo 2;

(2): (-511) alelo 2, (-1468) alelo 2 y (-3737) alelo 1;

(3): (-511) alelo 1, (-1468) alelo 1 y (-3737) alelo 1; o

(4): (-511) alelo 2, (-1468) alelo 1 y (-3737) alelo 1,

en donde la presencia de uno cualquiera de los modelos 1, 3 o 4 indica que dicho sujeto ha aumentado la sensibilidad a la periodontopatía, y en donde la presencia del modelo alélico 2 indica que el sujeto tiene una sensibilidad disminuida a la periodontopatía.

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El sujeto es homocigótico para cada uno de los alelos. La transcripción de IL-1B alterado da como resultado la producción de IL-1B alterada. El sujeto es de etnicidad asiática, tal como japonesa, china, taiwanesa o vietnamita.

Un alelo que comprende un haplotipo inflamatorio de IL-1 puede ser detectado por cualquiera de una variedad de técnicas que incluyen: 1) realizar una reacción de hibridación entre una muestra de ácido nucleico y una sonda que es capaz de hibridarse con el alelo; 2) secuenciar al menos una porción del alelo; o 3) determinar la movilidad electroforética del alelo o sus fragmentos (por ejemplo, fragmentos generados por la digestión con endonucleasas). El alelo puede ser sometido opcionalmente a una etapa de amplificación antes de la realización de la etapa de detección. Los métodos de amplificación incluyen por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación con desplazamiento de cadenas (abreviadamente en lo sucesivo SDA por la expresión inglesa Strand Displacement Amplification), clonación y variaciones de los anteriores (por ejemplo RT-PCR y amplificación específica de alelos). Los oligonucleótidos necesarios para la amplificación se seleccionan, por ejemplo, dentro de los loci del gen IL-1, bien los que flanquean el marcador de interés (como se requiere para la amplificación por PCR) o bien directamente los que están solapados con el marcador (como en la hibridación de oligonucleótidos específica de alelos, abreviadamente en lo sucesivo ASO, por la expresión Allele Specific Oligonucleotide). Por ejemplo, la muestra se hibrida con un conjunto de cebadores, que se hibridan en 5' y 3' en una secuencia con sentido o antisentido para el alelo asociado al haplotipo inflamatorio de IL-1 y se somete a amplificación por PCR.

Un alelo que contiene un haplotipo inflamatorio de IL-1 también se detecta indirectamente, por ejemplo analizando el producto proteínico codificado por el DNA. Por ejemplo, cuando el marcador en cuestión da como resultado la traducción de una proteína mutante, la proteína se detecta por cualquiera de una variedad de métodos de detección de proteínas. Dichos métodos incluyen inmunodetección y ensayos bioquímicos, tales como fraccionamiento por tamaños, en donde la proteína experimenta un cambio en el peso molecular aparente, a través de truncamiento, prolongación, plegamiento alterado o modificaciones posteriores a la traducción alteradas.

Se describen kits para realizar los análisis antes descritos. El kit puede incluir medios de recogida de muestras de ácidos nucleicos y medios para determinar si un sujeto lleva al menos un alelo que comprende un haplotipo inflamatorio de IL-1. Opcionalmente, el kit contiene una muestra de control positivo o negativo o un patrón y/o un dispositivo algorítmico para evaluar los resultados y reactivos y componentes adicionales que incluyen, por ejemplo reactivos de amplificación del DNA, DNA-polimerasa, reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, tampones, un dispositivo de muestreo de ácidos nucleicos, dispositivo de purificación de DNA, desoxinucleótidos, oligonucleótidos (por ejemplo sondas y cebadores) etc.

El control puede ser un control positivo o negativo. Además, la muestra de control puede contener los productos positivos (o negativos) de la técnica de detección de alelos empleada. Por ejemplo, cuando la técnica de detección de alelos es amplificación por PCR, seguida por fraccionamiento por tamaños, la muestra de control puede comprender fragmentos de DNA fragmentos del tamaño apropiado. Análogamente, cuando la técnica de detección de alelos implica la detección de una proteína mutante, la muestra de control puede comprender una muestra de la proteína mutada. Sin embargo, se prefiere que la muestra de control contenga el material que se va analizar. Por ejemplo, los controles pueden ser una muestra del DNA genómico o una porción clonada de la agrupación de genes IL-1. Preferiblemente, la muestra de control es una muestra altamente purificada de DNA genómico en donde la muestra a analizar es el DNA genómico.

Los oligonucleótidos presentes en dicho kit se usan para amplificación de la región de interés o para la hibridación directa de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO) a los marcadores en cuestión. Por tanto, los oligonucleótidos flanquean el marcador de interés (como es requerido para la amplificación por PCR) o están solapados directamente con el marcador (como en la hibridación ASO).

También se proporcionan ácidos nucleicos aislados de una longitud menor de 250, 200, 150, 100, 50, 25 o menos nucleótidos que contienen la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO; 36-39. Opcionalmente, el ácido nucleico se fija a un soporte sólido o semi-sólido o está presente como una matriz (chip) de oligonucleótidos.

La información obtenida usando los análisis y kits descritos en la presente memoria (sola o junto con la información sobre otro defecto genético o factor ambiental, que contribuya a la enfermedad o estado que está asociado al haplotipo inflamatorio de IL-1) es útil para determinar si un sujeto no sintomático tiene o es probable que desarrolle la enfermedad o estado particular. Además, la información puede permitir una propuesta más personalizada para impedir el comienzo o progreso de la enfermedad o estado. Por ejemplo, esta información puede facilitar al profesional clínico prescribir más eficazmente una terapia que estará dirigida a la base molecular de la enfermedad o estado.

Se describen métodos para tratar o prevenir el desarrollo de una enfermedad o estado que está asociado con un haplotipo inflamatorio de IL-1 en un sujeto por administración al sujeto de un agente terapéutico adecuado de la invención. En incluso otro aspecto, la invención proporciona ensayos in vitro o in vivo para cribar los compuestos de ensayo para identificar agentes terapéuticos para tratar o prevenir el desarrollo de una enfermedad o estado que está asociado con un haplotipo inflamatorio de IL-1. El ensayo comprende poner en contacto una célula transfectada con una mutación causante, que está unida operativamente con un promotor apropiado, con un compuesto de ensayo y determinar el nivel de expresión de una proteína en la célula en presencia y en ausencia del compuesto de ensayo. La mutación causante da como resultado una producción disminuida del antagonista del receptor de IL-1, y una producción aumentada del antagonista del receptor de 1L-1 en presencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto es un agonista de la actividad antagonista del receptor de IL-1. Alternativamente, la mutación causante da como resultado una producción aumentada de IL-1\alpha o IL-\beta, y una producción disminuida de IL-1\alpha o IL-\beta en presencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto es un antagonista de la actividad de IL-1\alpha o IL-1\beta.

A no ser que se definan de otro modo todos los términos científicos y técnicos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que son usualmente entendidos por los expertos ordinarios en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque en la práctica o análisis de la presente invención se pueden usar materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, se describen a continuación materiales y métodos adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente memoria se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria, que incluye las
definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.

Otras realizaciones y ventajas se exponen en la siguiente descripción y reivindicaciones.

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3.- Breve descripción de las figuras de los dibujos

La Fig. 1 es una representación esquemática de la agrupación de genes IL-1 que incluye unos cuantos marcadores polimórficos.

La Fig. 2 es una gráfica que representa la correlación entre los valores del desequilibrio de ligamiento y la distancia física como se describe en la presente memoria.

La Fig. 3 muestra la del secuencia ácido nucleico para IL-1A (GEN X03833; SEQ ID NO. 1).

La Fig. 4 muestra la secuencia del ácido nucleico secuencia para la IL-1B (GEN X04500; SEQ ID NO. 2).

La Fig. 5 muestra la secuencia del ácido nucleico para IL-1RN secretada (GEN X64532; SEQ ID NO. 3).

La Fig. 6 muestra construcciones con polimorfismo de un solo nucleótido (abreviadamente en lo sucesivo SNP por la expresión inglesa Single Nucleotide Polymorphism) dentro de la región del promotor de IL-1B. La construcción parental en donde todos los SNP son el alelo 1 están indicadas por pGL3(IL1)BS para los SNP 1-15, pGL(3-IL1)BS(3)K(M) para los SNP 2-15, y pGL3-(IL1)BL(3)KM para los SNP 2-17 (los paréntesis indican partes de los identificadores de las construcciones que no aparecen en el gráfico de la Fig. 7). Debajo de cada serie parental están las construcciones en donde los SNP individuales han sido convertidos en el alelo 2 por mutagénesis dirigida a un sitio.

Las Fig.7 A-B muestran la localización de los SNP y las construcciones de promotor. En la Fig. 7A, las posiciones de los SNP se indican dentro de la región del promotor del gen IL-1B en la línea de la parte superior. Las líneas de la parte inferior representan las longitudes de la región del promotor usadas en las diferentes construcciones del indicador (luciferasa), cuyos resultados de actividad transcripcional se muestran en la Fig. 7B. Están indicados los sitios KpnI y BamHI. En las series de IL-1BS, los SNP están indicados por líneas verticales.

La Fig. 8 muestra construcciones de plásmidos de los SNP dentro de la región del promotor de IL-1B en la cual los SNP 14 y 15 se han mantenido mayoritariamente constantes en el alelo 2. La construcción parental, en donde todos los SNP excepto el 14 y el 15 son el alelo 1 está identificada como pGL-BS.2. Debajo están las construcciones en donde el SNP individual ha sido convertido en el alelo 2 mediante mutagénesis dirigida al sitio. Los SNP del alelo 2 SNP aparecen resaltados.

La Fig. 9A-B muestra la localización de los SNP y las construcciones del promotor. En la Fig. 9A, las posiciones de los SNP están indicadas dentro de la región del promotor del gen IL-1B en la línea de la parte superior. Las líneas inferiores representan las longitudes de la región del promotor usadas en las diferentes construcciones del indicador (luciferasa) cuyos resultados de la actividad transcripcional relativa se muestran en la Fig. 9B. Están indicados los sitios KpnI y BamHI. En la serie de IL-1BS, los SNP están indicados por líneas verticales.

La Fig. 10 es un diagrama que muestra el análisis de transfección del SNP 4 en diferentes modelos alélicos de los SNP 14 y 15. La actividad del promotor de los alelos construidos denominados A-D como se miden por la actividad de la luciferasa de luciérnaga se muestra a diferentes dosis de LPS (lipopolisacárido) (0, 1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de miristato-acetato de forbol (abreviadamente PMA por la expresión inglesa Phorbol 12-myristate 13-acetate). La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de Renilla para controlar la eficacia de la transfección. Cada construcción se transfectó por triplicado y la transfección para cada construcción se repitió al menos tres veces.

La Fig. 11 es un diagrama que muestra el análisis de transfección del SNP 10. Las actividades del promotor de las construcciones A (rombo) y B (círculo) como se miden por la actividad de luciferasa de luciérnaga se muestran a diferentes dosis de LPS (0, 1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de PMA. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de Renilla para controlar la eficacia de la transfección. Cada construcción se transfectó por triplicado y la transfección para cada construcción se repitió al menos tres veces.

La Fig. 12 es un diagrama que demuestra el análisis de transfección de los SNP 14 y 15. La actividad del promotor de las construcciones con los modelos de alelos representados como A-D como se mide por la actividad de luciferasa de luciérnaga se muestra a diferentes dosis de LPS (0, 1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de PMA. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de Renilla para controlar la eficacia de la transfección. Cada construcción se transfectó por triplicado y la transfección para cada construcción se repitió al menos tres veces.

La Fig. 13 es un diagrama que muestra el análisis de transfección del haplotipo del promotor que comprende los SNP 10, 14 y 15. Las combinaciones alélicas se muestran para los plásmidos A-C. Las actividades del promotor de las construcciones A (rombo), B (cuadrado) y C (triángulo) como se miden por la actividad de luciferasa de luciérnaga se muestran a diferentes dosis de LPS (0, 1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de PMA. La actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de Renilla para controlar la eficacia de la transfección. Cada construcción se transfectó por triplicado y la transfección para cada construcción se repitió al menos tres veces.

La Fig. 14 es una imagen fotográfica de los resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del SNP 4. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1 y 2 oligómeros bicatenarios etiquetados del SNP 4 usadas para el análisis del cambio de la movilidad (abreviadamente en lo sucesivo EMSA por la expresión inglesa Electrophoretic Mobility Shift Assay). Se usaron las proteínas nucleares aisladas de las células THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas con LPS (100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la sonda libre y los complejos retardados se indican por flechas.

La Fig. 15 es una imagen fotográfica de los resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del SNP 4, usando sondas no etiquetadas para competir con la unión específica. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1 y 2 oligómeros bicatenarios marcados del SNP 4 usadas para el ensayo EMSA. Para determinar la especificidad de unión se usaron los oligómeros bicatenarios no etiquetados para los alelos 1 y 2 en el ensayo EMSA para competir con las sondas etiquetadas.

La Fig. 16 una imagen fotográfica de los resultados del análisis de super-cambio de los anticuerpos NF-kB para el SNP 4. Los anticuerpos NF-kB para ambas subunidades p50 y p65 se usaron en el ensayo EMSA para determinar que los complejos DNA-proteínas formados fueron debidos a las proteínas NF-kB.

La Fig. 17 una imagen fotográfica de los resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del SNP 10. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1 y 2 oligómeros bicatenarios etiquetados de SNP 10 usadas para el ensayo EMSA. Se usaron las proteínas nucleares aisladas de las células THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas con LPS (100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la sonda libre y de los complejos retardados están indicadas por flechas.

La Fig. 18 es una imagen fotográfica de los resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del SNP 10 que muestra la especificidad de la formación del complejo para el SNP 10. Se muestran las secuencias de los alelos 1 y 2 de de los oligómeros bicatenarios etiquetados usadas para el ensayo EMSA. Para determinar la especificidad de unión los alelos 1 y 2 de los oligómeros bicatenarios no etiquetados se usaron en el ensayo EMSA para competir por la unión de las sondas etiquetadas.

La Fig. 19 es una imagen fotográfica de los resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del SNP 14. Se muestran las secuencias de los alelos 1 y 2 de de los oligómeros bicatenarios marcados del SNP 14 usadas para el ensayo EMSA. Se usaron las proteínas nucleares aisladas de las células THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas con LPS (100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la sonda libre y de los complejos retardados están indicadas por flechas.

La Fig. 20 una imagen fotográfica de los resultados de un análisis del cambio de la movilidad electroforética resultados del SNP 15. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1 y 2 de de los oligómeros bicatenarios etiquetados del SNP 15 usados para el ensayo EMSA. Se usaron las proteínas nucleares aisladas de las células THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas con LPS (100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la sonda libre y de los complejos retardados están indicadas por flechas.

La Fig. 21 es una imagen fotográfica de los resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del SNP 15 que muestra la especificidad de la formación del complejo para el SNP 15. Se muestran las secuencias de los alelos 1 y 2 de de los oligómeros bicatenarios etiquetados de SNP 15 usados para el ensayo EMSA. Para determinar la especificidad de unión los alelos 1 y 2 de los oligómeros bicatenarios no etiquetados se usaron en el ensayo EMSA para competir por la unión de las sondas marcadas.

La Fig. 22 es un diagrama que muestra la gravedad de la periodontitis en sujetos por medida de la profundidad de las cavidades en las encías de los sujetos.

La Fig. 23 es un diagrama que muestra la frecuencia de los haplotipos IL-1B en sujetos japoneses y de raza blanca.

La Fig. 24 es un diagrama que muestra las cantidades relativas de IL-1\beta en fluidos gingivales de individuos de raza blanca que tienen haplotipos de IL-1B que tienen haplotipos IL-1B específicos.

La Fig. 25 es un diagrama que demuestra el riesgo reducido de periodontitis in en sujetos japoneses que tienen un genotipo IL-1B específico.

La Fig. 26 es un diagrama que demuestra la asociación de haplotipos IL-1B y la gravedad de periodontitis en sujetos japoneses.

4. Descripción detallada de la invención 4.1.- Definiciones

Por conveniencia, se facilitan a continuación el significado de ciertos términos y frases empleados en esta parte descriptiva de la memoria, los ejemplos y las reivindicaciones anexas.

El término "alelo" se refiere a las diferentes variantes de secuencias encontradas en diferentes regiones polimórficas. Por ejemplo, IL-1RN (VNTR) tiene al menos cinco alelos diferentes. Las variantes de secuencias pueden ser cambios de una sola base o de múltiples bases, incluyendo sin limitación inserciones, deleciones o sustituciones, o puede ser un número variable de repeticiones de secuencias.

La expresión "modelo alélico" se refiere a la identidad de un alelo o alelos en una o más regiones polimórficas. Por ejemplo, un modelo alélico puede consistir en un solo alelo en un sitio polimórfico, como el alelo 1 para IL-1RN (VNTR), que es un modelo alélico que tiene al menos una copia del alelo 1 de IL-1RN en las VNTR de los loci del gen IL-1RN. Alternativamente, un modelo alélico puede consistir en un estado homocigótico o heterocigótico en un solo sitio polimórfico. Por ejemplo, el alelo 2,2 de IL1-RN (VNTR) es un modelo alélico en el que hay dos copias del segundo alelo en el marcador de las VNTR de IL-1RN que corresponde al estado del alelo 2 de IL-RN (VNTR) homocigótico. Alternativamente, un modelo alélico puede consistir en la identidad de alelos en más de un sitio polimórfico.

El término "anticuerpo" tal como se usa en la presente memoria se refiere a un agente de unión que incluye un anticuerpo completo o uno de sus fragmentos de unión que es específicamente reactivo con un polipéptido IL-1. Los anticuerpos pueden ser fragmentados usando técnicas convencionales y los fragmentos pueden ser cribados para su utilidad del modo descrito antes para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab)2 pueden ser generados tratando un anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro para producir los fragmentos Fab. Los anticuerpos de la presente invención incluyen además moléculas quiméricas y humanizadas, monocatenarias y bi-específicas que tienen afinidad para un polipéptido IL-1B conferida por al menos una región determinante de la complementariedad (abreviadamente en lo sucesivo CDR por la expresión inglesa Complementarity Determining Region) del anticuerpo.

"Actividad biológica" o "bioactividad" o "actividad" o "función biológica", que se usan intercambiablemente para los fines de la presente memoria significa una función efectora o antigénica que es realizada directamente o indirectamente por un polipéptido IL-1 (tanto en su conformación natural como desnaturalizada), o por cualquiera de sus sub-secuencias. Las actividades biológicas incluyen unión a un péptido diana, por ejemplo, un receptor de IL-1. Las actividades biológicas también incluyen la transcripción de un gen IL-1, tal como IL-1B. Una bioactividad de IL-1 puede ser modulada afectando directamente a un polipéptido IL-1. Alternativamente, una bioactividad de IL-1 puede ser modulada, modulando el nivel de un polipéptido IL-1, tal como modulando la expresión de un gen IL-1.

Como se usa en la presente memoria la expresión "fragmento bioactivo de un polipéptido IL-1" se refiere a un fragmento del polipéptido IL-1 de longitud completa, en donde el fragmento mimetiza o antagoniza específicamente la actividad del polipéptido IL-1 de tipo natural. El fragmento bioactivo es preferiblemente un fragmento capaz de interactuar con un receptor de interleuquina.

La expresión "una actividad aberrante", tal como se aplica a una actividad de un polipéptido tal como IL-1, se refiere a una actividad que difiere de la actividad del polipéptido del tipo silvestre o natural del polipéptido en un sujeto sano. Una actividad de un polipéptido puede ser aberrante porque es más fuerte que la actividad de su correspondiente natural. Alternativamente, una actividad puede ser aberrante porque sea más débil o esté ausente con respecto a la actividad de su correspondiente natural. Una actividad aberrante también puede ser un cambio de actividad. Por ejemplo un polipéptido aberrante puede interactuar con un péptido diana diferente. Una célula puede tener una actividad aberrante de IL-1 debido a la sobre-expresión o sub-expresión de un gen del locus IL-1 que codifica un polipéptido del locus IL-1.

"Células", "células hospedantes" o "células recombinantes" son términos usados intercambiablemente en la presente memoria para referirse no solamente a la célula sujeto particular, sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a ciertas modificaciones puede ocurrir, en generaciones subsiguientes debido a influencias mutacionales o ambientales, que dicha progenie pueda no ser de hecho idéntica, a la célula parental, pero todavía está incluida dentro del alcance de término tal como se usa en la presente memoria.

Una "quimera", "mosaico", "mamífero quimérico " y similares, se refiere a un mamífero transgénico no humano con una construcción desactivada (knock-out) o activada (knock-in) en al menos algunas de sus células que contienen el genoma.

El término "animal" tal como se usa en la presente memoria nunca se refiere a un ser humano.

Los términos "control" o "muestra de control" se refieren a cualquier muestra apropiada para la técnica de detección apropiada empleada. La muestra de control puede contener los productos de la técnica de detección de alelos empleada o la materia que se ha de analizar. Además, los controles pueden ser positivos o negativos. A modo de ejemplo, cuando la técnica de detección de alelos es la amplificación por PCR, seguida por fraccionamiento por tamaños, la muestra de control puede comprender fragmentos de DNA de un tamaño apropiado. Análogamente, cuando la técnica de detección de alelos implique la detección de una proteína mutada, la muestra de control puede comprender una muestra de una proteína mutante. Sin embargo, se prefiere que la muestra de control comprenda el material que se ha de analizar. Por ejemplo, los controles pueden ser una muestra de DNA genómico o una porción clonada del agrupamiento de genes de IL-1. Sin embargo, cuando la muestra que se ha de analizar es DNA genómico, la muestra de control es preferiblemente una muestra de control altamente purificada de DNA genómico.

La frase "enfermedades y estados asociados con los polimorfismos de IL-1" se refiere a una variedad de enfermedades o estados, cuya sensibilidad a los cuales puede estar indicada en un sujeto basado en la identificación de uno o más alelos dentro del complejo IL-1. Ejemplos incluyen: enfermedad inflamatoria o degenerativa, incluyendo: respuesta inflamatoria sistémica (abreviadamente SIRS por la expresión inglesa Systemic Inflammatory Response Syndrome); enfermedad de Alzheimer (y estados y síntomas asociados que incluyen: neuroinflamación crónica, activación glial; aumento de las microglias; formación de placas neuríticas; y respuesta a terapia); esclerosis lateral amilotrópica (abreviadamente ALS por la expresión inglesa Amylotropic Lateral Sclerosis), artritis (y estados y síntomas asociados incluyendo: artritis aguda, artritis inducida por antígenos, artritis asociada con tiroiditis linfocítica crónica, artritis inducida por colágeno, artritis crónica juvenil; artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, prognosis y artritis inducida por estreptococos), asma (y estados y síntomas asociados, incluyendo: asma bronquial; enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma juvenil y asma ocupacional); enfermedades cardiovasculares (y estados y síntomas asociados, incluyendo: aterosclerosis; miocarditis autoinmunitaria, hipoxia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, arteriopatía coronaria, miocardiopatía y disfunción de células cardíacas, incluyendo: activación de las células musculares lisas aórticas; apoptosis de las células cardíacas; e inmunomodulación de la función de las células cardíacas; diabetes y estados y síntomas asociados, incluyendo diabetes autoinmune, diabetes dependiente de insulina (Tipo 1), periodontitis diabética, retinopatía diabética, y nefropatía diabética); inflamaciones gastrointestinales (y estados y síntomas relacionados, incluyendo la enfermedad celiaca, osteopenia asociada, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal y colitis ulcerosa); úlceras gástricas; inflamaciones hepáticas, cálculos biliares de colesterol y fibrosis hepática, infección por el VIH (y estados y síntomas relacionados, incluyendo respuestas degenerativas, respuestas neurodegenerativas, y enfermedad de Hodgkin asociada al VIH), síndrome de Kawasaki (y estados y síntomas asociados, incluyendo síndrome de los ganglios linfáticos mucocutáneos, linfadenopatía cervical, lesiones de las arterias coronarias, edema, fiebre, aumento de leucocitos, anemia leve, descamación de la piel, erupción cutánea, enrojecimiento conjuntival, trombocitosis; esclerosis múltiple, nefropatías (y estados y síntomas asociados, incluyendo nefropatía diabética, nefropatía terminal, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, lesiones por supervivencia de hemodiálisis y reperfusión isquémica renal), enfermedades neurodegenerativas (y estados y síntomas asociados, incluyendo neurodegeneración aguda, inducción de IL-1 en el envejecimiento y enfermedad neurodegenerativa, plasticidad inducida por IL-1 de las neuronas hipotalámicas e hiper-reactividad crónica por estrés), oftalmopatías (y estados y síntomas asociados, incluyendo retinopatía diabética, oftalmopatía de Graves, y uveitis, osteoporosis (y estados y síntomas asociados, incluyendo disminución de la masa ósea o frecuencia de fractura alveolar, femoral, radial, vertebral o de la muñeca, disminución de la masa ósea posmenopáusica, tumores, frecuencia de fracturas o tasa de disminución de la masa ósea), otitis media (en adultos o niños), pancreatitis o acinitis pancreática, periodontitis o periodontopatía (y estados y síntomas asociados, incluyendo en adultos, de iniciación temprana y diabética); enfermedades pulmonares, incluyendo neumopatía crónica, sinusitis crónica, enfermedad de las membranas hialinas, hipoxia y enfermedad pulmonar en el síndrome de muerte súbita del latente (abreviadamente SIDS por la expresión inglesa (Sudden Infant Death Syndrome); reestenosis; reumatismo incluyendo artritis reumatoide, nódulos de Aschoff reumáticos, enfermedades reumáticas y miocarditis reumática; tiroiditis incluyendo tiroiditis linfocítica crónica; infecciones de las vías urinarias incluyendo prostatitis crónica, síndrome del dolor pélvico crónico y urolitiasis. Trastornos inmunológicos, incluyendo enfermedades autoinmunitarias, tales como alopecia aerata, miocarditis autoinmune, enfermedad de Graves, oftalmopatías de Graves, esclerosis del liquen, esclerosis múltiple, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, enfermedades del tiroides (por ejemplo bocio y estruma linfomatosa (tiroiditis de Hashimoto, bocio linfadenoide), trastornos del sueño y síndrome de fatiga crónica y obesidad (no diabética o asociada con diabetes). Resistencia a las enfermedades infecciosas, tales como leishmaniosis, lepra, enfermedad de Lyme, carditis de Lyme, malaria, malaria cerebral, meningititis, nefritis túbulo-intersticial asociada con malaria), que son causadas por bacterias, virus (por ejemplo citomegalovirus, encefalitis, virus de Epstein-Barr, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la gripe) o protozoos (por ejemplo, Plasmodium falciparum, tripanosomas). traumatismo, incluyendo traumatismo cerebral (incluyendo ictus e isquemias, encefalitis, encefalopatías, epilepsia, lesión cerebral perinatal, convulsiones febriles, SIDS y hemorragias subaracnoidea), bajo peso al nacer (por ejemplo parálisis cerebral), lesiones pulmonares (lesiones pulmonares hemorrágicas agudas, síndrome de Goodpasture, reperfusión isquémica aguda), disfunción miocárdica, causada por contaminantes laborales y medioambientales (por ejemplo sensibilidad al síndrome del aceite tóxico y silicosis), traumatismo por radiación, y eficacia de las respuestas de cicatrización de heridas (por ejemplo heridas por quemaduras o térmicas, heridas crónicas, heridas quirúrgicas y lesiones de la médula espinal). Sensibilidad a neoplasias, incluyendo metástasis osteolítica asociadas a cáncer de mama, caquexia, cáncer colo-rectal, enfermedades hiper-proliferantes, enfermedad de Hodgkin, leucemias, linfomas, enfermedades metabólicas y tumores, metástasis, mielomas y diversos cánceres (incluyendo de mama, próstata, ovario, colon, pulmón, etc), anorexia y caquexia. Regulación hormonal incluyendo fertilidad/fecundidad, probabilidad de un embarazo, incidencia de parto prematuro, complicaciones prenatales y neonatales incluyendo bajo peso al nacer prematuro, parálisis cerebral, septicemia, hipotiroxinemia, dependencia del oxígeno, deformidad craneal, menopausia temprana. Una respuesta del sujeto a trasplantes (rechazo o aceptación), respuesta en fase aguda (por ejemplo, respuesta febril), respuesta inflamatoria general, respuesta a la dificultad respiratoria aguda, respuesta inflamatoria sistémica aguda, cicatrización de heridas, adherencia, respuesta inmuno-inflamatoria, respuesta neuroendocrina, desarrollo y resistencia a la fiebre, respuesta en fase aguda, respuesta al estrés, sensibilidad a enfermedades, estrés por movimiento repetitivo, epicondilitis, y tratamiento y respuesta del dolor.

Las frases "interrupción del gen" e "interrupción dianizada" o cualquier frase similar se refieren a la interrupción específica de un sitio de una secuencia de DNA de modo que se impida la expresión de ese gen en la célula en comparación con la copia de tipo natural del gen. La interrupción puede ser causada por deleciones, inserciones o modificaciones en el gen o cualquiera de sus combinaciones.

El término "haplotipo" como se usa en la presente memoria está destinado a referirse a un conjunto de alelos que se heredan juntos como un grupo (están en desequilibrio de ligamiento) a niveles estadísticamente significativos (p_{corr} < 0,05). Como se usa en la presente memoria, la frase "un haplotipo de IL-1" se refiere a un haplotipo en los loci de IL-1. Un haplotipo de IL-1 inflamatorio o pro-inflamatorio se refiere a un haplotipo que es indicativo de actividades agonistas aumentadas y/o antagonistas disminuidas. Un haplotipo inflamatorio o pro-inflamatorio de IL-1 se refiere también a un haplotipo que es indicativo de una expresión alterada de los genes IL-1, tales como una expresión aumentada de IL-1B.

Los términos "agrupación de genes IL-1 " y "loci de IL-1" como se usan en la presente memoria incluyen la totalidad del ácido nucleico en o cerca de la región 2q13 del cromosoma 2, incluyendo al menos los genes IL-1A, IL-1B y IL-1RN y cualesquiera otras secuencias unidas. (Nicklin et al., Genomics 19: 382-84, 1994). Los términos "IL-1A", "IL-1B", y "IL-1RN" como se usan en la presente memoria se refieren a los genes que codifican los antagonistas de los receptores de IL-1A, IL-1B, y IL-1, respectivamente. Los números de acceso a los genes (en el banco de datos GenBank) para IL-1A, IL-1B, y IL-1RN son X03833, X04500, y X64532, respectivamente.

"Mutación funcional de IL-1" se refiere a una mutación dentro de la agrupación de genes IL-1 que da como resultado un fenotipo alterado (es decir, afecta a la función de un gen o proteína de IL-1).Ejemplos incluyen: el alelo 2 de IL-1A(+4845), el alelo 2 de IL-1B (+3954), el alelo 2 de IL-1B (+6912), el alelo 1 de IL-IB (+3737), el alelo 1 de IL-1B (-1468); y el alelo 2 de IL-1RN (+2018).

"Alelo Y de IL-1X (Z)" se refiere a una forma alélica particular, denominada Y, que está presente en un sitio polimórfico del locus IL-1 en el gen X, en donde X es IL-1A, B o RN y situado en o cerca del nucléotido Z, en donde el nucléotido Z está numerado con respecto al sitio del comienzo transcripcional principal, que es el nucléotido +1, del gen X particular de IL-1. Como se usa además en la presente memoria, la expresión "alelo (Z) de IL-1X" se refiere a todos los alelos de un sitio polimórfico en IL-1 en el gen X posicionado en o cerca del nucléotido Z. Por ejemplo, la expresión "alelo IL-1RN (+2018)" se refiere a formas alternativas del gen IL-1RN en el marcador +2018. "Alelo 1 de L-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen IL-1RN que contiene una citosina (C) en la posición +2018 de la cadena con sentido. Clay et al., Hum. Genet. 97:723-26, 1996. "Alelo 2 de IL-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen IL-1RN que contiene una timina en la posición (T) +2018 de de la cadena positiva (+). Cuando un sujeto tiene dos alelos IL-1RN idénticos, se dice que el sujeto es homocigótico, o que tiene un estado homocigótico. Cuando un sujeto tiene dos alelos IL-1RN diferentes, se dice que el sujeto es heterocigótico, o que tiene el estado heterocigótico. La expresión "alelo 2,2 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado 2 del alelo 2 de IL-1 RN (+2018) homocigótico. Inversamente, la expresión "alelo 1,1 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado del alelo 1 de IL-1RN (+2018) homocigótico. La expresión "alelo 1,2 de IL-1RN (+2018)" se refiere a los estados 1 y 2 del alelo heterocigótico.

"Relacionado con IL-1" como se usa en la presente memoria se emplea para incluir todos los genes relacionados con los genes del locus IL-1 humano en el cromosoma 2 humano (2q 12-14). Estos incluyen los genes IL-1 de la agrupación de genes IL-1 humanos localizada en el cromosoma 2 (2q 13-14) que incluye: el gen IL-1A que codifica interleuquina-1\alpha, el gen IL-1B gene que codifica interleuquina-1\beta, y el gen IL-1RN (o IL-1ra) que codifica el antagonista del receptor de interleuquina-1. Además, estos genes IL-1 relacionados incluyen los genes de los receptores de IL-1 de tipo I y tipo II localizados en el cromosoma 2 (2q 12) y sus homólogos de ratón localizados en el cromosoma 1 del ratón en la posición 19,5 cM. La interleuquina-1\alpha, la interleuquina-1\beta y la interleuquina-1RN están relacionadas tanto más cuanto que todas se unen a los receptores de tipo l de IL-1, sin embargo sólo la interleuquina-1\alpha y la interleuquina-1\beta son ligandos agonistas que activan los receptores de tipo I de IL-1, mientras que la interleuquina-1RN es un ligando antagonista que se presenta de modo natural. Cuando se usa el término "IL-1" con referencia un producto o polipéptido génico, pretende significar que se refiere a todos los productos génicos codificados por el locus de la interleuquina-1 en el cromosoma 2 (2q 12-14) humano y sus homólogos correspondientes de otras especies o sus variantes funcionales. El término IL-1 incluye por tanto los polipéptidos secretados que promueven una respuesta inflamatoria, tal como IL-1\alpha y IL-1\beta, así como un polipéptido secretado que antagoniza las respuestas inflamatorias, tales como el antagonista del receptor de IL-1 y el receptor de tipo II de IL-1 (señuelo).

Un "receptor de IL-1" o "IL-1R" se refiere a receptores proteínicos unidos a la membrana de diversas células capaces de unirse a, y/o transducir, una señal de un ligando codificado por el locus IL-1. El término se aplica a cualquiera de las proteínas que son capaces de unirse a moléculas de interleuquina-1 (IL-1) y, en su configuración natural como proteínas de membrana en el plasma de mamífero, desempeñan presumiblemente una función en transducir la señal proporcionada por IL-1 a una célula. Como se usa en la presente memoria, el término incluye análogos de las proteínas naturales con unión a IL-1 o actividad transductora de señales. Ejemplos incluyen los receptores de IL-1 humanos y de múridos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.968.607. La expresión "ácido nucleico de IL-1" se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína IL-1.

Un "polipéptido IL-1" y "proteína IL-1" se emplea para abarcar polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias del DNA genómico de IL-1 mostradas en la Figuras 1, 2, y 3, o sus fragmentos, y sus homólogos e incluyen polipéptidos agonistas y antagonistas.

"Riesgo aumentado" se refiere a una frecuencia estadísticamente superior de que se produzca la enfermedad o estado en un individuo que lleva un alelo polimórfico particular en comparación con la frecuencia de que se produzca la enfermedad o estado en un miembro de una población que no lleva el alelo polimórfico particular.

El término "interactuar" tal como se usa en la presente memoria se emplea para significar relaciones o asociaciones detectable (por ejemplo, interactuaciones bioquímicas) entre moléculas naturales, tales como interactuaciones entre proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, ácido nucleico-ácido nucleico y proteína-molécula pequeña o ácido nucleico-molécula pequeña.

El término "aislado" como se una en la presente memoria con respecte a ácidos nucleicos, tales como DNA o RNA, se refiere a moléculas separadas de otros DNA o RNA, respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos IL-1 objeto incluye no más de 10 kilobases (kb) de la secuencia del ácido nucleico que flanquea natural e inmediatamente el gen IL-1 en el DNA genómico, más preferiblemente no más de 5 kb de dichas secuencias flanqueantes que se presentan de modo natural, y más preferiblemente menos de 1,5 kb de dichas secuencias flanqueante que se presentan de modo natural. El término aislado como se usa en la presente memoria se refiere también a un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente exento de material celular, material viral, o medio de cultivo cuando es producido por técnicas de DNA recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Además, un "ácido nucleico aislado" se emplea para incluir fragmentos de un ácido nucleico que no se presentan de modo natural como fragmentos y no se encontrarían en estado natural. El término "aislado" se usa también en la presente memoria para referirse a polipéptidos que están aislados de otras proteínas celulares y se emplea para abarcar tanto polipéptidos purificados como recombinantes.

Un animal transgénico activado ("knock-in") se refiere a un animal no humano que ha tenido un gen modificado introducido en su genoma y el gen modificado puede ser de origen exógeno o endógeno.

Un animal transgénico inactivado ("knock-out") se refiere a un animal no humano en el cual hay una supresión parcial o completa de la expresión de un gen endógeno (por ejemplo, basado en la deleción de al menos una porción del gen, reemplazamiento de al menos una porción del gen con una segunda secuencia, introducción de codones de parada, mutación de bases que codifican aminoácidos críticos, o la eliminación de un empalme de intrones, etc.).

Una "construcción desactivada (knock-out)" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se puede usar para disminuir o suprimir la expresión de una proteína codificada por secuencias de DNA endógeno en una célula. En un ejemplo sencillo, la construcción desactivada está constituida por un gen, tal como el gen IL-1RN, con una deleción en una porción crítica del mismo, de modo que no se puede expresar a partir del mismo la proteína activa. Alternativamente, a un gen natural se le pueden añadir cierto número de codones de terminación para provocar la terminación temprana de la proteína o puede ser desactivado un empalme de intrones. En una típica construcción desactivada, alguna porción del gen está reemplazada con un marcador seleccionable (tal como el gen neo) de modo que el gen puede ser representado como sigue: IL-1RN 5'/neo/ IL-1RN 3', donde IL-1RN5' y IL-1RN 3', se refieren a secuencias genómicas o de cDNA que están, respectivamente en una posición situada hacia el extremo 5 y respectivamente en una posición situada hacia el extremo 3', respectivamente con respecto a una porción del gen 1L-1RN y donde neo se refiere a un gen de resistencia a neomicina. En otra construcción desactivada, un segundo marcador seleccionable está añadido en una posición flanqueante de modo que el gen puede ser representado como: IL-1RN/neo/IL-1RN/TK, donde TK es un gen de la timidina-quinasa que puede ser añadido a la secuencia IL-1RN5' o 1L-1RN3' de la construcción precedente y que además puede ser seleccionado contra (es decir, es una marcador seleccionable negativo) en medios apropiados. Esta construcción de dos marcadores permite la selección de eventos de recombinación homólogos, que elimina el marcador con TK flanqueante, a partir de eventos de recombinación no homólogos que típicamente retienen las secuencias TK. La deleción y/o el reemplazamiento de genes pueden ser de exones, intrones, especialmente empalmes de intrones, y/o las regiones reguladoras tales como los promotores.

"Desequilibrio de ligamiento" se refiere a la herencia conjunta de dos alelos a frecuencias mayores que la que se podría esperar a partir de las frecuencias separadas que presentan cada alelo en una población de control dada. La frecuencia esperada de presentación de dos alelos que se heredan conjuntamente es la frecuencia del primer alelo multiplicada por la frecuencia del segundo alelo. Los alelos que se presentan conjuntamente a las frecuencias esperadas se dice que están en "desequilibrio de ligamiento". La causa del desequilibrio de ligamiento frecuentemente no está clara. Puede ser debida a la selección para ciertas combinaciones de alelos o a la mezcla reciente de poblaciones genéticamente heterogéneas. Además, en el caso de marcadores que estén vinculados muy fuertemente a un gen de una enfermedad, se espera una asociación de un alelo (o grupo de alelos unidos) con el gen de la enfermedad si la mutación de la enfermedad ocurrió en pasado reciente, de modo que no transcurrido suficiente tiempo para que sea conseguido el equilibrio a través de los eventos de recombinación en la región cromosómica específica. Cuando se hace referencia a modelos alélicos que están constituidos por más de un alelo, un primer modelo alélico está en desequilibrio de ligamiento con un segundo modelo alélico si todos los alelos que comprende el primer modelo alélico están en desequilibrio de ligamiento con al menos uno de los alelos del segundo modelo alélico. Un ejemplo de desequilibrio de ligamiento es el que ocurre entre los alelos en los sitios polimórficos IL-1RN (+2018) y IL-1RN (VNTR). Los dos alelos en IL-1RN (+2018) están 100% en desequilibrio de ligamiento con los dos alelos más frecuentes de IL-1RN (VNTR), que son el alelo 1 y el alelo 2.

El término "marcador" se refiere a una secuencia del genoma que se sabe que varía entre individuos. Por ejemplo, el gen IL-1RN tiene un marcador que consiste en un número variable de repeticiones en tándem (VNTR).

Un "gen mutado " o "mutación" o "mutación funcional" se refiere a una forma alélica de un gen, que es capaz de alterar el fenotipo de un sujeto que tiene el gen mutado respecto a un sujeto que no tiene el gen mutado. El fenotipo alterado causado por una mutación puede ser corregido o compensado para ciertos agentes. Si un sujeto debe ser homocigótico para esta mutación que tiene un fenotipo alterado, se dice que la mutación es recesiva. Si una copia del gen mutado es suficiente para alterar el fenotipo del sujeto, se dice que la mutación es dominante. Si un sujeto tiene una copia del gen mutado y tiene un fenotipo que es intermedio entre el de un sujeto homocigótico y el de un sujeto heterocigótico (para ese gen), se dice que la mutación es co-dominante.

Un "animal no humano" de la invención incluye mamíferos tales como roedores, primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, etc., anfibios, tales como los miembros del género Xenopus, y aves transgénicas (por ejemplo, pollos, pájaros, etc.). La expresión "animal quimérico" se usa en la presente memoria para referirse a animales no humanos en los cuales se encuentra el gen recombinante, o en los cuales se expresa el gen recombinante en algunas pero no en todas las células del animal. La expresión "animal quimérico específico de tejido" indica que está presente uno de los genes IL-1 y/o está expresado o interrumpido en algunos tejidos pero no en otros. El término "mamífero" se refiere a cualquier miembro de la clase mamífero, excepto seres humanos.

Como se usa en la presente memoria, el término "ácido nucleico" se refiere a polinucléotidos u oligonucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (DNA), y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (RNA). El término debe entenderse también para incluir, como equivalentes análogos RNA o DNA hechos de análogos de nucléotidos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos) y como aplicables a la realización que describe polinucléotidos, monocatenarios (con sentido o antisentido) y bicatenarios.

Los términos "periodontitis" y "periodontopatía" se refieren a un trastorno dental que es el resultado del progreso de la gingivitis, que implica inflamación e infección del tejido, incluyendo ligamentos y huesos, que sostienen la dentadura. La periodontitis es frecuentemente diagnosticada por examen que muestra la encía de color rojo púrpura hinchada y blanda. Los depósitos de placa y sarro pueden ser visibles en la base de los dientes, con cavidades alargadas en las encías. Las encías son indoloras usualmente o suavemente sensibles, salvo que esté presente un absceso dental. Se pueden perder los dientes y reabsorber las encías. La gravedad de la periodontitis se cuantifica midiendo la profundidad de las cavidades (PC, también denominada "profundidad de sondeo") en las cavidades de las encías de un sujeto.

El término "polimorfismo" se refiere a la coexistencia de más de una forma de un gen o una de sus porciones (por ejemplo, variante alélica). Una porción de un gen del cual hay al menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias de nucleótidos diferentes, se denomina una "región polimórfica de un gen". Una secuencia genética específica en una región polimórfica de un gen es un alelo. Una región polimórfica puede ser de un solo nucléotido, cuya identidad difiere en alelos diferentes. Una región polimórfica también puede tener una longitud de varios nucléotidos.

La expresión "propensión a enfermedad," también "predisposición" o "sensibilidad" a enfermedad o cualquier frase similar, significa que ciertos alelos descubiertos por la presente invención están asociados con, o son predictivos de, una incidencia del sujeto de desarrollar una enfermedad particular (por ejemplo, una enfermedad vascular). Los alelos están por tanto sobre-expresados en frecuencia en individuos con enfermedad en comparación con los individuos sanos. Por tanto, estos alelos se pueden usar para predecir la enfermedad incluso en individuos pre-sintomáticos o en un estado previo a la enfermedad.

"Molécula pequeña" como se usa en la presente memoria, está destinada a referirse a una composición, que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y más preferiblemente aproximadamente 4 kD. Moléculas pequeñas pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, péptido-miméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "se hibrida específicamente " o "detecta específicamente" se refiere a la capacidad de una molécula de ácido nucleico de hibridarse a al menos aproximadamente 6 nucléotidos consecutivos de un ácido nucleico de una muestra.

"Secuencia reguladora transcripcional" es un término genérico usado a través de la memoria para referirse secuencias de DNA, tales como señales de iniciación, potenciadores, y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias codificadoras de proteínas con las que están unidos operativamente.

Como se usa en la presente memoria, el término "transgén" significa una secuencia de ácido nucleico (que codifica, por ejemplo, uno de los polipéptidos IL-1 o un de transcrito antisentido para el mismo) que ha sido introducido en una célula. Un transgén podría ser parcial o enteramente heterólogo, es decir, extraño, al animal o célula transgénico en el cual está introducido, o, es homólogo para un gen endógeno del animal o célula transgénico en el cual está introducido, pero que está diseñado para ser insertado, o está insertado, en el genoma del animal de tal modo que altera el genoma de la célula en la cual está insertado (por ejemplo, está insertado en una localización que difiere del gen natural o su inserción da como resultado una inactivación o knockout). Un transgén puede estar presente también en una célula en forma de un episoma. Un transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones, que pueden ser necesarios para la expresión óptima de un acido nucleico seleccionado.

Un "animal transgénico" se refiere a un mamífero preferiblemente no humano, un ave o un anfibio, en el cual una o más de las células del animal contienen ácido nucleico heterólogo introducido por medio de intervención humana, tal como métodos transgénicos muy conocidos por los expertos en la técnica. El ácido nucleico se introduce en la célula, directa o indirectamente mediante la introducción en un precursor de la célula, por medio de manipulación genética deliberada, tal como por micro-inyección o por infección con un virus recombinante. La expresión manipulación genética no incluye cría cruzada clásica, o fertilización in vitro, sino que más bien está dirigida a la introducción de una molécula de DNA recombinante. Esta molécula puede estar integrada con un cromosoma, o puede ser DNA que se replica extra-cromosómicamente. En los animales transgénicos típicos descritos en la presente memoria, el transgén hace que las células expresen una forma recombinante de uno de los polipéptidos de IL-1, por ejemplo formas agonísticas o antagonísticas. Sin embargo, también están considerados los animales transgénicos en los cuales el gen recombinante es silencioso, como por ejemplo, la construcción dependiente de recombinasa FLP o CRE descrita más adelante. Además, "animal transgénico" también incluye los animales recombinantes no humanos en los cuales la interrupción de genes de uno o más genes es causada por intervención humana, incluyendo tanto recombinación como técnicas antisentido. El término está destinado a incluir todas las generaciones de la progenie. Por tanto, están incluidos el animal fundador y todos los F1, F2, F3, y así sucesivamente, de su progenie.

El término "tratamiento" como se usa en la presente memoria se pretende que abarque el curado, así como la mejora de al menos un síntoma de un estado o enfermedad.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico, que es capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha estado unido. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extra-cromosómica. Los vectores preferidos son los capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente se denominan en la presente memoria "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante están frecuentemente en la forma de "plásmidos" que se refieren generalmente a bucles de DNA bicatenario circular lo cuales, en su forma de vectores no se encuentran en el cromosoma. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se usan intercambiablemente puesto que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención está destinada a incluir dichas otras formas de vectores de expresión que sirven como equivalentes funcionales y que han llegado a ser conocidos en la técnica con posterioridad a esto.

El término "alelo de tipo natural" se refiere a un alelo de un gen que, cuando está presente en dos copias en un sujeto da como resultado un fenotipo de tipo natural. Puede haber diferentes de alelos de tipo natural de un gen específico, puesto que ciertos cambios de nucleótidos en un gen no pueden afectar al fenotipo de un sujeto que tiene dos copias del gen con los cambios de nucléotidos.

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4.2 Medicina predictiva 4.2.1. Haplotipos inflamatorios de IL-1 y su asociación con ciertas enfermedades o estados

La presente invención se basa al menos en parte, en la identificación de ciertos modelos de haplotipos inflamatorios y la asociación (hasta una extensión estadísticamente significativa) de estos modelos con el desarrollo de ciertas enfermedades o estados. Por tanto, la detección de los alelos que comprenden un haplotipo, solo o junto con otros medios en un sujeto puede indicar que el sujeto tiene o está predispuesto al desarrollo de una enfermedad o estado. Sin embargo, debido a que estos alelos están en desequilibrio de ligamiento con otros alelos, la detección de dichos otros alelos unidos puede indicar también que el sujeto tiene o está predispuesto al desarrollo de una enfermedad o estado particular. Por ejemplo, el haplotipo 44112332 comprende el siguiente fenotipo:

1

Otros tres polimorfismos en un exón alternativo de IL-1RN (exón lic, que produce una forma intracelular del producto génico) están también en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) (Clay et al., (1996) Hum. Genet. 97:723-26). Estos incluyen: el exón lic (1812) de IL-1RN (GenBank: X77090 en 1812); el polimorfismo del exón lic (1868) de IL-1RN (GenBank: X77090 en 1868); y el polimorfismo del exón lic (1887) de IL-1RN (GenBank: X77090 en 1887). Además, todavía otro polimorfismo en el promotor para la forma intracelular empalmada alternativamente del gen, el polimorfismo Pic (1731) (GenBank: X77090 en 1731), está también en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus polimórfico (VNTR) de IL-1RN. Para cada uno de estos loci, se ha determinado la variante de secuencia del alelo 2 en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus (VNTR) de IL-1RN (Clay et al., (1996) Hum. Genet. 97:723-26).

El haplotipo 33221461 haplotipo comprende el siguiente genotipo:

2

Los individuos con el haplotipo 44112332 son típicamente sobre-productores tanto de proteínas IL-1\alpha como IL-1\beta, por estimulación. En contraste, los individuos con el haplotipo 33221461 son típicamente sub-productores de IL-1ra. Cada haplotipo da como resultado una respuesta pro-inflamatoria neta. Cada alelo dentro de un haplotipo puede tener un efecto, así como un efecto de genotipo compuesto. Además, pueden estar asociadas enfermedades particulares con ambos modelos de haplotipos.

La Tabla 1 siguiente expone un número de marcadores de genotipo y diversas enfermedades y estados a los cuales se ha encontrado que están asociados estos marcadores en una extensión estadísticamente significativa.

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TABLA 1 Asociación de marcadores de genes del haplotipo IL-1 con ciertas enfermedades

3

También se describen en la presente memoria alelos y haplotipos de IL-1B adicionales que modulan la expresión y los estados inflamatorios de IL-1\beta. En la presente memoria se describen los SNP en las posiciones -3737 de IL-1B y -1468 de IL-1B. Los individuos con un haplotipo que incluye el alelo 1 de IL-1B (-511), el alelo 1 de IL-1B (-1468) y el alelo 2 de IL-1B (-3737) son típicamente sobre-productores de ambas proteínas IL-1\beta, por estimulación. Los individuos con un haplotipo que incluye el alelo 1 de IL-1B (-511), el alelo 1 de IL-1B (-1468) y el lelo 1 de IL-1B (-3737) son también típicamente sobre-productores de ambas proteínas IL-1\beta. En contraste, los individuos con un haplotipo que incluye el alelo 2 de IL-1B (-511), el alelo 2 de IL-1B (-1468) y el alelo 1 de IL-1B (-3737) son típicamente sub-productores de IL-1. Cada alelo dentro de un haplotipo puede tener un efecto, así como un efecto de genotipo compuesto. Además, pueden estar asociadas enfermedades particulares con ambos modelos de haplotipos. Debe advertirse que el SNP en la posición -1468 de IL-1B también ha sido etiquetado IL-1B (-1464) y IL-1B (-1473). (Véase, Lee, et al, J. Gastroenterol. 2004, 39:429-433).

Además de los modelos alélicos descritos anteriormente, como se describe en la presente memoria, un experto en la técnica puede identificar fácilmente otros alelos (incluyendo polimorfismos y mutaciones) que estén en desequilibrio de ligamiento con un alelo asociado con una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, puede recogerse una muestra de un ácido nucleico de un primer grupo de sujetos sin un trastorno particular, así como DNA de un segundo grupo de sujetos con el trastorno. Las muestras de ácido nucleico pueden ser comparadas para identificar los alelos que están sobre-representados en el segundo grupo comparado con el primer grupo, en donde dichos alelos están supuestamente asociados con un trastorno, que es causado por, o al que contribuye, una regulación inapropiada de la interleuquina 1. Alternativamente, pueden ser identificados los alelos que están en desequilibrio de ligamiento con un alelo que está asociado con el trastorno, por ejemplo, genotipificando una población grande y realizando una análisis estadístico para determinar que alelos aparecen más usualmente juntos que lo esperado. Preferiblemente el grupo se elige para estar constituido por individuos relacionados. Genéticamente los individuos relacionados incluyen individuos de la misma raza, el mismo grupo étnico, o incluso la misma familia. A medida que aumenta el grado de relación genética entre un grupo de control y un grupo de ensayo, aumenta el valor predictivo de los alelos polimórficos que están incluso más distantemente ligados a un alelo causante de enfermedad. Esto es porque ha transcurrido menos tiempo evolutivo para permitir polimorfismos que estén ligados a lo largo de un cromosoma en una población fundadora para redistribuirse a través de eventos de cruzamientos genéticos. Por tanto se pueden desarrollar análisis de genotipificación para el diagnóstico específico de raza, específico de etnia e incluso específico de familia para la detección de alelos de enfermedad que surgieron en incluso tiempos más recientes de la evolución humana, por ejemplo, después de la divergencia de las principales razas humanas, después de la separación de las poblaciones humanas en distintos grupos étnicos, e incluso dentro de la historia reciente de una línea familiar particular.

El desequilibrio de ligamiento entre dos marcadores polimórficos o entre un marcador polimórfico y una mutación causante de una enfermedad es un estado metaestable. Estando ausente la presión selectiva o la presentación reiterada ligada esporádica de los eventos mutacionales subyacentes, los polimorfismos llegarán a estar finalmente disociados por los eventos de recombinación cromosómica y alcanzarán por tanto el equilibrio de ligamiento a través del curso de la evolución humana. Por tanto, la probabilidad de encontrar un alelo polimórfico en desequilibrio de ligamiento con una enfermedad o estado puede aumentar con cambios en al menos dos factores: disminución de la distancia física entre el marcador polimórfico y la mutación causante de la enfermedad, y disminución del número de generaciones meióticas disponibles para la disociación del par ligado. La consideración del último factor sugiere que, cuanto más estrechamente estén relacionados dos individuos más probablemente compartirán un cromosoma o región cromosómica parental común que contiene los polimorfismos ligados y menos probablemente que este par ligado habrá llegado a desligarse a través de los eventos de cruzamiento meiótico que ocurren en cada generación. Como resultado, cuánto más estrechamente relacionados estén dos individuos, más probablemente es que sean heredados conjuntamente los polimorfismos ampliamente espaciados. Por consiguiente, para individuos relacionados por raza, etnicidad o familia comunes, la fiabilidad de los loci polimórficos incluso los más distantemente espaciados puede ser fiable como un indicador de la herencia conjunta de una mutación causante de una enfermedad ligada.

Se pueden diseñar sondas apropiadas para hibridarse a un gen específico del locus IL-1, tal como IL-1A, IL-1B o IL-1RN o un gen relacionado. Estas secuencias de DNA genómicos se muestran en las Figuras 3, 4 y 5, respectivamente, y corresponden además a la SEQ ID NOS. 1, 2 y 3, respectivamente. Alternativamente, estas sondas pueden incorporar otras regiones de locus genómicos relevantes, incluyendo secuencias intergénicas. Realmente la región 1L-1 del cromosoma 2 humano abarca unas 400.000 pares de bases y, suponiendo una media de un polimorfismo de un solo nucleótido cada 1.000 pares de bases, incluye unos 400 loci de SNP solamente. Incluso otros polimorfismos disponibles para uso con la presente invención son obtenibles desde diversas fuentes públicas. Por ejemplo, la base de datos del genoma humano reúne los SNP intragénicos, es buscable por secuencias y usualmente contiene aproximadamente 2.700 entradas (http://hgbase.interactiva.de). También está disponible una base de datos de polimorfismo humano mantenida por el Massachusetts Institute of Technology (MIT SNP database (http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/
human/index.html)). A partir de dichas fuentes se pueden encontrar los SNP, así como otros polimorfismos humanos.

Por ejemplo, el examen de la región de IL-1 del genoma humano en una cualquiera de estas bases de datos revela que los genes de locus IL-1 están flanqueados por un marcador polimórfico próximo al centrómero denominado marcador microsatélite AFM220ze3 en 127,4 cM (centiMorgans) (véase Nº de acceso en GenBank Z17008) y un marcador polimórfico distal denominado marcador de anclaje microsatélite AFM087xa1 en 127,9 cM (véase Nº de acceso en GenBank Z16545). Estos loci polimórficos humanos son ambos polimorfismos microsatélites de repetición del dinucleótido CA, y, como tales, muestran un alto grado de heterocigosidad en poblaciones humanas. Por ejemplo, un alelo de AFM220ze3 genera un producto de amplificación por PCR de 211 pb con un cebador en 5' de la secuencia TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC (SEQ ID No. 4) y un cebador en 3' de la secuencia TGGCCTC
CAGAAACCTCCAA (SEQ ID No. 5). Además, un alelo de AFM087xa1 genera un producto de amplificación por PCR de 177 pb con un cebador en 5' de la secuencia GCTGATATTCTGGTGGGAAA (SEQ ID No. 6) y un cebador en 3' de la secuencia GGCAAGAGCAAAACTCTGTC (SEQ ID No. 7).

El promotor IL-1B humano es de interés en identificar polimorfismos asociados con la producción alterada de IL-1\beta. Se usan dos conjuntos de cebadores para amplificar el promotor IL-1B que contienen extremos 3' diferentes. Los cebadores IL-1BF1 5'cccACGCGTGAGTGAAAGGAATCCCGTTAGAAGT (SEQ ID NO: 33) y IL-1BR2 5'cccACGCGTGCCTGTTGTGCCTTGTGCCTCGAAG (SEQ ID NO: 34) se usan para generar el fragmento del promotor IL-1B, IL-1BS, (+32 a -5326) (S = corto; sin el primer exón). IL-1BR1 5'cccACGCGTGGCTGCTTCAGA
CACCTGTGTA (SEQ ID NO: 35) se usa para generar el fragmento del promotor IL-1BL (+471 a -5326) (L= largo; que contiene el primer exón y el SNP 17 (+45)).

Los cebadores equivalentes que corresponden a secuencias únicas que presentan 5' y 3' para estos polimorfismos de repetición del dinucleótido CA en el cromosoma 2 humano serán evidentes para los expertos en la técnica. Los cebadores equivalentes razonables incluyen los que se hibridan dentro de aproximadamente 1 kb del cebador diseñado, y que además están en cualquier parte desde aproximadamente 17 pb a aproximadamente 27 pb de longitud. Una directriz general para diseñar cebadores para la amplificación de secuencias genómicas cromosómicas humanas únicas es que posean una temperatura de fusión de al menos aproximadamente 50ºC, en donde se puede estimar una temperatura de fusión aproximada usando la fórmula T_{fusión} = [2xnúmero de A o T)+4x(número de G o C)].

Numerosos loci polimórficos están presentes entre estos dos polimorfismos de repetición del dinucléotido CA y proporcionan dianas adicionales para la determinación de un alelo de pronóstico en una familia u otro grupo de individuos genéticamente relacionados. Por ejemplo, el sitio web del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/) contiene un lista de cierto número de marcadores de polimorfismo en la región del locus IL-1 y proporciona una guía para diseñar cebadores apropiados para la amplificación y análisis de esos marcadores.

Por consiguiente, los segmentos nucleotídicos de la invención pueden usarse por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de cromosoma 2 humano, q12-13 o cDNA de esa región o proporcionar cebadores para la amplificación del DNA o el cDNA de esta región. El diseño de sondas apropiadas para este fin requiere la consideración de cierto número de factores. Por ejemplo, los fragmentos que tienen una longitud de entre 10, 15 o 18 nucléotidos hasta aproximadamente 20, o a aproximadamente 30 nucléotidos, encontrarán una utilidad particular. Las secuencias más largas, por ejemplo, 40, 50, 80, 90, 100, incluso hasta la longitud completa, son incluso más preferidas para ciertas realizaciones. Las longitudes de oligonucleótidos de al menos aproximadamente 18 a 20 nucléotidos son bien aceptadas por los expertos en la técnica como suficiente para permitir una hibridación suficientemente específica para ser útil como sonda molecular. Además dependiendo de la aplicación prevista, se podrán emplear condiciones variables de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de sonda para la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, se deseará típicamente emplear condiciones relativamente estrictas para formar los híbridos. Por ejemplo, condiciones de sal relativamente bajas y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl 0,02 M – 0,15 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Dichas condiciones selectivas pueden tolerar poco, si existe, desapareamiento entre la sonda y la cadena molde o diana.

En un sujeto se pueden detectar o monitorizar otros alelos u otros indicios de un trastorno junto con la detección de los alelos descritos antes, por ejemplo, identificar espesores de paredes de vasos sanguíneos (por ejemplo, como se mide por ultrasonido), o si el sujeto es fumador, bebedor, tiene sobrepeso o si está sometido a estrés o a ejercicios.

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4.2.2 Detección de alelos

Hay disponibles muchos métodos para detectar alelos específicos en loci polimórficos humanos. El método preferido para detectar un alelo polimórfico específico dependerá, en parte, de la naturaleza molecular del polimorfismo. Por ejemplo, las diversas formas alélicas del locus polimórfico pueden diferir en un solo par de bases del DNA. Dichos polimorfismos de un solo nucléotido (o SNP) son los principales contribuyentes a la variación genética, que comprende un 80% de todos los polimorfismos conocidos, y su densidad en el genoma humano se estima que es por término medio de 1 por cada 1.000 pares de bases. Los SNP son muy frecuentemente bialélicos que se presentan en solamente dos formas diferentes (aunque son teóricamente posibles hasta cuatro formas diferentes de un SNP, correspondientes a las cuatro bases de nucleótidos diferentes que existen en el DNA). No obstante, los SNP son mutacionalmente más estables que otros polimorfismos, lo que les hace adecuados para estudios de asociación en los cuales el desequilibrio de ligamiento entre marcadores y una variante desconocida se usa para cartografiar mutaciones causantes de una enfermedad. Además, debido a que los SNP tienen típicamente solo dos alelos, pueden ser sometidos a genotipificación mediante un sencillo ensayo más/menos en lugar de una medida prolongada, lo que les hace más susceptibles de automatización.

Una variedad de métodos está disponible para detectar la presencia de polimorfismo de un solo nucleótido particular en un individuo. Los avances en este campo han proporcionado precisión, facilidad y genotipificación de los SNP barato y a gran escala. Muy recientemente, por ejemplo, se han descrito nuevas técnicas que incluyen hibridación dinámica específica de alelos (abreviadamente DASH por la expresión inglesa Dynamic Allele-Specific Hybridization), electroforesis en gel diagonal en matrices de microplacas, abreviadamente MADGE por la expresión inglesa Microplate Array Diagonal Gel Electrophoresis), piro-secuenciación, ligamiento específico de oligonucleótidos, el sistema TaqMan, así como diversas tecnologías de "chips" de DNA, tal como los chips Affymetrix SNP. Estos métodos requieren la amplificación de la región genética diana, típicamente por PCR. Incluso otros métodos recientemente desarrollados, basados en la generación de pequeñas moléculas de señal por escisión invasiva seguido por espectrometría de masas o sondas candados inmovilizadas y amplificación por círculo rodante, podrían finalmente eliminar la necesidad de la PCR. Se recogen resumidamente más adelante varios de los métodos conocidos en la técnica para detectar polimorfismos de un solo nucleótidos específicos. El método de la presente invención se entiende que incluye todos los métodos disponibles.

Se han desarrollado varios métodos para facilitar tal análisis de los polimorfismos de un solo nucleótido. En una realización, el polimorfismo de una sola base se puede detectar usando un nucleótido resistente a exonucleasas especializadas, como se ha descrito, por ejemplo, en Mundy, C. R. (Patente de EE.UU. Nº 4.656.127). De acuerdo con el método, se permite que un cebador complementario a la secuencia alélica inmediatamente 3' respecto al sitio polimórfico se hibride a una molécula diana obtenida de un animal o ser humano particular. Si el sitio polimórfico en la molécula diana contiene un nucléotido que es complementario al derivado de nucleótido resistente a la exonucleasa particular presente, entonces el derivado se incorporará sobre el extremo del cebador hibridado. Dicha incorporación convierte al cebador en resistente a la exonucleasa, y por ello permite su detección. Puesto que se conoce la identidad del derivado resistente a la exonucleasa de la muestra, un hallazgo de que el cebador ha llegado a ser resistente a las exonucleasas revela que el nucléotido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana era complementario al del derivado de nucléotido usado en la reacción. Este método tiene la ventaja de que no requiere la determinación de grandes cantidades de datos de secuencias.

Se describe un método basado en una disolución para determinar la identidad del nucléotido de un sitio polimórfico. Cohen, D. et al. (Patente francesa 2.650.840; solicitud de patente PCT Nº WO91/02087). Como en el método de Mundy de la patente de EE.UU. Nº 4.656.127, se emplea un cebador que es complementario a las secuencias alélicas inmediatamente 3' a un sitio polimórfico. El método determina la identidad del nucléotido de ese sitio usando derivados de didesoxinucléotidos marcados, que, si son complementarios al nucléotido del sitio polimórfico se incorporarán en (extremo) del cebador.

Se describe un método alternativo, conocido como Genetic Bit Analysis o GBA^{TM} Goelet, P. et al., (solicitud de patente PCT Nº 92/15712). El método de Goelet, P. et al., usa mezclas de terminadores marcados y un cebador que es complementario a la secuencia 3' para un sitio polimórfico. El terminador marcado que se incorpora se determina por tanto por el, y es complementario al, nucléotido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana que se evalúa. En contraste con el método de Cohen et al., (Patente francesa 2.650.840; solicitud PCT Nº WO91/02087) el método de Goelet, P. et al., es preferiblemente un ensayo en fase heterogénea, en el que el cebador o la molécula diana está inmovilizado en un fase sólida.

Recientemente, se han descrito varios métodos de incorporación de nucleótidos guiados por cebador para analizar sitios polimórficos en DNA (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. -C., et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). Estos métodos difieren del GBA ^{TM} en que todos se basan en la incorporación de desoxinucleótidos marcados para discriminar entre bases en un sitio polimórfico. En dicho formato, puesto que la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, los polimorfismos que pueden estar presentes en experimentos del mismo nucléotido pueden dar como resultado señales que son proporcionales a la longitud del experimento (Syvanen, A. -C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).

Para mutaciones que producen terminación prematura de la traducción de proteínas, el ensayo de truncamiento de proteínas (abreviadamente en lo sucesivo PTT por la expresión inglesa Protein Truncation Test) ofrece una aproximación eficaz al diagnóstico (Roest, et al., (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1719-21; van der Luijt, et al., (1994) Genomics 20:1-4). Por el PTT, el RNA se aísla inicialmente a partir de tejido disponible y se somete a transcripción inversa, y el segmento de interés se amplifica por PCR. Los productos de la transcripción inversa y la PCR se usan luego como molde para la amplificación por PCR anidada con un cebador que contiene un promotor de RNA-polimerasa y una secuencia para iniciar la traducción en eucariotas. Después de la amplificación de la región de interés, los restos únicos incorporados en el cebador permiten la transcripción y traducción secuenciales in vitro de los productos de la PCR. Por electroforesis en gel de dodecil-sulfato sódico-poliacrilamida de los productos de la traducción, la aparición de polipéptidos truncados señala la presencia de una mutación que causa una terminación prematura de la traducción. En una variación de esta técnica, el DNA (en oposición al RNA) se usa como molde para la PCR cuando la región diana de interés se deriva de un solo exón.

Se puede utilizar cualquier tipo de célula o tejido para obtener muestras de ácido nucleico para uso en los diagnósticos descritos en la presente memoria. En una realización preferida, la muestra de DNA se obtiene a partir de un fluido corporal, por ejemplo, sangre, obtenida por técnicas conocidas (por ejemplo, punción en vena) o saliva. Alternativamente, el ensayo del ácido nucleico se puede realizar en muestras secas (por ejemplo, cabello o piel). Cuando se usa RNA o proteína, las células o tejidos que pueden ser utilizados deben expresar un gen IL-1.

Los métodos de diagnóstico se pueden realizar también directamente in situ en secciones de tejidos (fijadas y/o congeladas) de tejido de pacientes obtenidos de biopsias o resecciones, tales que no es necesaria una purificación del ácido nucleico. Los reactivos de ácido nucleico se pueden usar como sondas y/o cebadores para tales métodos in situ (véase, por ejemplo, Nuovo, G.J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Rayen Press, NY).

Además de los métodos que ponen el énfasis principalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico, también se pueden determinar perfiles en dichos esquemas de detección. Los perfiles de las huellas pueden ser generados, por ejemplo, utilizando un método de presentación diferencial, análisis Northern y /o RT-PCR.

Un método de detección preferido es una hibridación específica de alelos que usa sondas que solapan una región de al menos un alelo de un haplotipo pro-inflamatorio de IL-1 y que tienen aproximadamente 5, 10, 20, 25 o 30 nucléotidos alrededor de la mutación o región polimórfica. En una realización preferida de la invención, se unen a un soporte en fase sólida varias sondas capaces de hibridarse específicamente a otras variantes alélicas implicadas en una reestenosis, por ejemplo, un "chip" (que puede contener hasta aproximadamente 250.000 oligonucleótidos). Los oligonucleótidos pueden estar unidos a un soporte sólido mediante una variedad de procesos, incluyendo litografía. El análisis de la detección de la mutación que usa estos chips que comprenden oligonucleótidos, también denominado "matrices de sondas de DNA" está descrito por ejemplo por Cronin et al., (1996) Human Mutation 7:244. En una realización, un chip comprende todas las variantes alélicas de al menos una región polimórfica. El soporte en fase sólida se pone luego en contacto con un ácido nucleico de ensayo y se detecta la hibridación a las sondas específicas. Por consiguiente, se puede identificar en un sencillo experimento de hibridación la identidad de numerosas variantes alélicas de uno o más genes.

Estas técnicas pueden comprender también la etapa de amplificar el ácido nucleico antes del análisis. Los métodos de amplificación son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, clonación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa de alelos específicos (ASA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción en cadena con la polimerasa anidada, replicaciones de secuencias auto-sostenida (Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), y Q-Beta Replicase (Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197).

Los productos de amplificación pueden analizarse por una variedad de modos, incluyendo análisis por tamaños, digestión por restricción seguida de análisis por tamaños, detección de cebadores oligonucleotídicos con una etiqueta específica en los productos de reacción, hibridación de oligonucleótidos específica de alelos (ASO), detección por 5' exonucleasa específica de alelos, secuenciación, hibridación, y similares.

La detección basada en PCR significa que puede incluir amplificación múltiple de una variedad de marcadores simultáneamente. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR que no se solapan en tamaño y pueden ser analizados simultáneamente. Alternativamente, es posible amplificar diferentes marcadores con cebadores que están etiquetados diferentemente y por tanto cada uno puede ser detectado diferencialmente. Naturalmente, la detección basada en hibridación significa permitir la detección diferencial de múltiples productos de PCR en una muestra. En la técnica se conocen otros métodos para permitir análisis múltiples de una pluralidad de marcadores.

En una realización meramente ilustrativa, el método incluye las etapas de: (i) recoger una muestra de células de un paciente, (ii) aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, mRNA o ambos) de las células de la muestra, (iii) poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan específicamente en 5' y 3' a al menos un alelo de un haplotipo pro-inflamatorio IL-1 en condiciones tales que ocurre la hibridación y la amplificación del alelo, y (iv) detectar el producto de amplificación. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en números muy bajos.

En una realización preferida del análisis pertinente, el alelo de un haplotipo pro-inflamatorio de IL-1 se identifica por alteraciones en los modelos de escisión por enzimas de restricción. Por ejemplo, se aíslan el DNA de muestra y de control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan por electroforesis en gel los tamaños de la longitud de los fragmentos.

En incluso otra realización, se pueden usar cualquiera de las reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el alelo. Reacciones de secuenciación ilustrativas incluyen las basadas en las técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc. Natl Acad Sci USA, 74:560) o por Sanger (Sanger et al., (1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74:5463). También se contempla que cualquiera de una variedad de métodos de secuenciación automatizados pueda ser utilizada cuando se realizan los análisis pertinentes (véase, por ejemplo Biotechniques (1995) 19:448), que incluyen secuenciar por espectrometría de masas (véase por ejemplo la publicación de la solicitud de patente PCT WO 94/16101; Cohen et al., (1996) Adv. Chromatogr., 36:127-162; y Griffin et al., (1993) Appl. Biochem. Biotechnol, 38:147-159). Será evidente para los expertos en la técnica que, para ciertas realizaciones, se necesita determinar la presencia de solamente uno, dos o tres de las bases de los ácidos nucleicos en la reacción de secuenciación. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una huella de A (adenina) o similar, por ejemplo, cuando solamente se detecte un ácido nucleico.

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En una realización adicional, se puede usar la protección de los agentes de escisión (tales como una nucleasa, hidroxilamina o tetróxido de osmio y/con piperidina) para detectar bases desapareadas en heterodúplex RNA/DNA o RNA/DNA o DNA/DNA (Myers, et al., (1985) Science, 230:1242). En general, la técnica de "escisión de desapareamientos" comienza proporcionando los heterodúplex formados hibridando RNA o DNA (marcados) que contienen el alelo de tipo natural con la muestra. Los dúplex bicatenarios se tratan con un agente que escinde las regiones monocatenarias de los dúplex, tales como las que existirán debido a los desapareamientos de bases entre las cadenas de control y de la muestra. Por ejemplo, los dúplex RNA/DNA se pueden tratar con RNasa y los híbridos DNA/DNA ser tratados con nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las regiones desapareadas. En otras realizaciones, los dúplex DNA/DNA o RNA/DNA se pueden tratar con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina para digerir las regiones desapareadas. Después de la digestión de las regiones desapareadas, el material resultante se separa luego por tamaño sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de la mutación. Véase, por ejemplo, Cotton et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397; y Saleeba et al., (1992) Métodos Enzymol. 217:286-295. En una realización preferida, el DNA o RNA de control se puede etiquetar para detección.

En incluso otra realización, la reacción de escisión de desapareamientos emplea una o más proteínas que reconocen pares de bases desapareadas en los DNA bicatenarios (las denominadas "enzimas de reparación de desapareamientos de DNA"). Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde los desapareamientos A en G/A y la timidina DNA-glicosilasa de las células HeLa escinde los desapareamientos T en G/T (Hsu et al., (1994) Carcinogenesis, 15:1657-1662). De acuerdo con una realización ilustrativa, una sonda basada en el alelo del haplotipo del locus de IL-1 se hibrida a un cDNA u otro de producto de DNA de una(s) célula(s) de ensayo. El dúplex se trata con la enzima reparadora de desapareamientos del DNA, y los productos escindidos, si los hubiere, pueden ser detectados por protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.459.039.

En otras realizaciones, las alteraciones en la movilidad electroforética se usarán para identificar un alelo del locus IL-1. Por ejemplo, el polimorfismo conformacional monocatenario (abreviadamente en lo sucesivo SSCP por la expresión inglesa Single Strand Conformation Polymorphism) se puede usar para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre los ácidos nucleicos de tipo mutante y de tipo natural (Orita et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl., 9:73-79). Los fragmentos de DNA monocatenarios de los alelos de IL-1 de la muestra y del control se desnaturalizan y se les deja re-naturalizar. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos monocatenarios varía de acuerdo con la secuencia, y la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de incluso un cambio de una sola base. Los fragmentos de DNA pueden ser etiquetados o detectados con sondas etiquetadas. La sensibilidad del análisis puede ser mejorada usando RNA (en lugar de DNA), en el cual la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, el método pertinente utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas de heterodúplex bicatenarias basándose en cambios de la movilidad electroforética (Keen et al., (1991) Trends Genet., 7:5).

En todavía otra realización, se analiza el movimiento de los alelos en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizante usando electroforesis de gen en gradiente (abreviadamente en lo sucesivo DGGE por la expresión inglesa Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Myers et al., (1985) Nature, 313:495). Cuando la DGGE se usa como el método de análisis, se modificará el DNA para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo añadiendo una pinza o abrazadera de GC de aproximadamente 40 pb de DNA rico en GC de alto punto de fusión por PCR. En una realización adicional, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente de agente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad del DNA de la muestra y del control (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753).

Ejemplos de otras técnicas para detectar alelos incluyen, pero sin limitación, hibridación de oligonucleótidos selectivos, amplificación selectiva o extensión de cebadores selectivos. Por ejemplo, pueden prepararse cebadores "oligonucleotídicos" en los cuales la mutación o la diferencia de nucléotidos conocida (por ejemplo, en variantes alélicas) es colocada centralmente y luego hibridada a un DNA diana en condiciones que permiten la hibridación solamente si se encuentra un apareamiento perfecto (Saiki et al., (1986) Nature, 324:163); Saiki et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6230). Dichas técnicas de hibridación de oligonucleótidos específica de alelos se puede usar para analizar una mutación o región polimórfica por reacción cuando los oligonucleótidos se hibridan a un DNA diana amplificado por PCR o un número de diferentes mutaciones o regiones polimórficas cuando los oligonucleótidos se unen a la membrana hibridante y se hibridan con el DNA diana etiquetado.

Alternativamente, se puede usar junto con la presente invención la tecnología de amplificación específica de alelos que depende de la amplificación por PCR selectiva. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica pueden llevar la mutación o la región polimórfica de interés en el centro de la molécula (de modo que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibbs et al., (1989) Nucleic Acids Res., 17:2437-2448) o en el extremo 3' de un cebador donde, en condiciones apropiadas, puede impedir o reducir la extensión por la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech., 11:238. Además puede ser deseable introducir un nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para crear una detección basada en la escisión (Gasparini et al., (1992) Mol. Cell Probes, 6:1). Se anticipa que en ciertas realizaciones la amplificación se puede realizar también usando Taq ligasa para la amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88:189). En tales casos, la ligación ocurrirá solamente si hay un perfecto apareamiento en el extremo 3' de la secuencia en 5' que lo haga posible para detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de la amplificación.

En otra realización la identificación de la variante alélica se lleva a cabo usando un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (abreviadamente en lo sucesivo OLA por la expresión inglesa Oligonuclotide Ligation Assay), como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 4.998.617 y en Landegren, U. et al., ((1988) Science, 241:1077-1080). El protocolo OLA usa dos oligonucleótidos que están diseñados para ser capaces de hibridarse a secuencias contiguas de una sola cadena de una diana. Uno de los oligonucleótidos se une a un marcador de separación, por ejemplo, biotinilado y el otro está etiquetado detectablemente. Si la secuencia complementaria precisa se encuentra en una molécula diana, los oligonucleótidos se hibridarán de tal modo que sus extremos estén contiguos y creen un sustrato de ligamiento. El ligamiento permite entonces que el oligonucleótido marcado sea recuperado usando avidina u otro ligando de biotina. Nickerson, D. A. et al., han descrito un análisis de detección de ácidos nucleicos que combina los atributos de la PCR y el OLA (Nickerson, D. A. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8923-27). En este método,
la PCR se usa para conseguir la amplificación exponencial del DNA diana, que luego se detecta usando el OLA.

Se han desarrollado varias técnicas basadas en este método OLA y se pueden usar para detectar alelos de un haplotipo del locus IL-1. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.593.826 describe un OLA que usa un oligonucleótido que tiene un grupo 3'-amino y un oligonucleótido 5'-fosforilado para formar un conjugado que tiene un enlace fosforamidato. En otra variación del OLA descrito en Tobe et al., ((1996) Nucleic Acid Res., 24: 3728), el OLA combinado con la PCR permite determinar el tipo de dos alelos en un solo pocillo de microtitulación. Marcando cada uno de los cebadores específicos de alelos con un hapteno único, es decir, digoxigenina y fluoresceína, cada reacción de OLA puede ser detectada usando anticuerpos específicos del hapteno que están etiquetados con diferentes informadores enzimáticos, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano silvestre. Este sistema permite la detección de los dos alelos usando un formato de alto rendimiento que conduce a la producción de dos colores diferentes.

Otra realización de la invención está dirigida a kits para detectar una predisposición para desarrollar una reestenosis. Este kit puede contener uno o más oligonucleótidos, incluyendo 5' y 3' oligonucleótidos que se hibridan 5' y 3' a al menos un alelo de un haplotipo del locus IL-1. Los oligonucleótidos de la amplificación por PCR deben hibridarse entre 25 y 2500 pares de bases separadas, preferiblemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500 bases separadas, para producir un producto de PCR de tamaño conveniente para análisis posteriores.

Los cebadores particularmente preferidos para uso en el método de diagnóstico de la invención incluyen las SEQ ID NO: 8-23 y 36-39.

El diseño de oligonucleótidos adicionales para la amplificación y detección de alelos polimórficos de IL-1 por el método de la invención se facilita por la disponibilidad de tanto información actualizada de secuencias del cromosoma humano 2q13 - que contienen el locus IL-1 humano-, como de información actualizada de polimorfismos humanos disponible para este locus. Por ejemplo, la secuencia de DNA para IL-1A, IL-1B y IL-1RN se muestra en la Figuras 1 (Nº de acceso en GenBank X03833), 2 (Nº de acceso en GenBank X04500) y 3 (Nº de acceso en GenBank X64532) respectivamente. Los cebadores adecuados para la detección de un polimorfismo humano en estos genes pueden ser diseñados fácilmente usando información de secuencias y métodos estándares conocidos en la técnica para el diseño y optimización de secuencias de cebadores. El diseño óptimo de dichas secuencias de cebadores se puede conseguir, por ejemplo, mediante el uso de programas de selección de cebadores comercialmente disponibles, tales como Primer 2.1, Primer 3 o GeneFisher (véase también, Nicklin M.H.J., Weith A. Duff G.W., "A Physical Map de the Region Encompassing the Human Interleukin-1\alpha, interleukin-1\beta, and Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes" Genomics, 19: 382 (1995); Nothwang H.G., et al., "Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q13" Genomics, 41: 370 (1997); Clark, et al., (1986) Nucl. Acids. Res., 14:7897-7914 [la lista de erratas publicadas aparece en Nucl. Acids Res., 15:868 (1987) y el proyecto de Genome Database (GDB) en la URL http://www.gdb.org).

Para uso en un kit, los oligonucleótidos pueden ser de cualquier variedad de composiciones naturales y/o sintéticas, tales como oligonucleótidos sintéticos, fragmentos de restricción, cDNA, ácidos nucleicos de péptidos sintéticos (abreviadamente en lo sucesivo PNA por la expresión inglesa Peptide Nucleic Acids), y similares. El kit para análisis y el método pueden emplear también oligonucleótidos etiquetados para permitir la fácil identificación en los análisis. Ejemplos de etiquetas que pueden emplearse incluyen radio-etiquetas, enzimas, compuestos fluorescentes, estreptavidina, avidina, biotina, restos magnéticos, restos de unión de metales, restos de antígenos o anticuerpos y similares.

El kit puede, opcionalmente, incluir también medios de muestreo de DNA. Los medios de muestreo de DNA son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir, pero sin limitación, sustratos, tales como papeles de filtro, el AmpliCard^{TM} (Universidad de Sheffield, Sheffield, England S10 2JF; Tarlow, JW, et al., J. of Invest. Dermatol., 103:387-389 (1994)) y similares; reactivos de purificación de DNA, tales como kits Nucleon^{TM}, tampones de lisis, soluciones de proteinasa y similares; reactivos de PCR, tales como tampones para reacción de 10 veces, polimerasa termoestable, dNTP y similares; y medios de detección de alelos, tales como la enzima de restricción HinfI,
oligonucleótidos específicos de alelos, cebadores de oligonucleótidos degenerados para PCR anidada de sangre seca.

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4.2.3. Farmacogenómica

El conocimiento de los alelos particulares asociados con una sensibilidad a desarrollar una enfermedad o estado particular, solos o en asociación con la información sobre otros defectos genéticos que contribuyen a la enfermedad o estado particular permite la personalización de la prevención o tratamiento de acuerdo con el perfil genético del individuo, y esto es lo que constituye el objeto de la "farmacogenómica". Por tanto, la comparación de un perfil de IL-1 individual con el perfil de la población para un trastorno vascular, permite la selección o diseño de fármacos u otros regímenes terapéuticos que se espera que sean seguros y eficaces para un paciente o población de pacientes particular (es decir, un grupo de pacientes que tienen la misma alteración genética).

Además, la capacidad para señalar como diana las poblaciones que se espera muestren el beneficio clínico más alto, basado en el perfil genético, puede facilitar: 1) el reposicionamiento de fármacos ya comercializados; 2) el rescate de candidatos a fármacos cuyo desarrollo clínico ha sido interrumpido como resultado de limitaciones de seguridad o eficacia, que son específicas de un sub-grupo de pacientes; y 3) un desarrollo acelerado y menos costoso para agentes terapéuticos candidatos y un etiquetado de fármacos más óptimo (por ejemplo, ya que medir el efecto de varias dosis de un agente sobre la mutación causante es útil para optimizar la dosis eficaz).

El tratamiento de un individuo con un agente terapéutico particular puede ser monitorizado determinando la proteína (por ejemplo IL-1\alpha, IL-1\beta o IL-1Ra), el mRNA y/o el nivel de transcripción. Dependiendo del nivel detectado, el régimen terapéutico puede mantenerse o ajustarse luego (aumentando o disminuyendo la dosis). En una realización preferida la eficacia de tratar un sujeto con un agente comprende las etapas de: (i) obtener una muestra para la pre-administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel o cantidad de una proteína, mRNA o DNA genómico en la muestra para la pre-administración; (iii) obtener una o más muestras del sujeto para la pos-administración; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína, mRNA o DNA genómico en la muestra administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína, mRNA o DNA genómico en la muestra de pre-administración con la proteína correspondiente, mRNA o DNA genómico en la muestra de la pos-administración, respectivamente; y (vi) alterar consecuentemente la administración del agente al sujeto.

Las células de un sujeto se pueden obtener también antes y después de la administración de un agente terapéutico para detectar el nivel de expresión de genes distintos del gen IL-1 para verificar que el agente terapéutico no aumenta ni disminuye la expresión de genes que podrían ser perjudiciales. Esto puede hacerse, por ejemplo, usando el método del perfilado transcripcional. Por tanto, el mRNA procedente de células expuestas in vivo a un agente terapéutico y mRNA procedente del mismo tipo de células que no fueron expuestas al agente terapéutico podrían ser sometidos a reversión, transcritos e hibridados a un chip que contuviera DNA de numerosos genes para comparar con ello la expresión de genes en células tratadas y no tratadas con el agente terapéutico.

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4.3.- Agentes terapéuticos para enfermedades y estados asociados con polimorfismos de IL-1

Los agentes terapéuticos para enfermedades o estados asociados con un polimorfismo o haplotipo de IL-1 se refieren a cualquier agente a régimen terapéutico (incluyendo productos farmacéuticos, productos nutricéuticos y medios quirúrgicos) que impide o pospone el desarrollo de los síntomas o su alivio de la enfermedad o estado particular en el sujeto. El agente terapéutico puede ser un polipéptido, un peptidomimético, ácido nucleico u otra molécula orgánica o inorgánica, preferiblemente una "molécula pequeña" que incluye vitaminas, minerales y otros nutrientes. Preferiblemente el agente terapéutico puede modular al menos una actividad de un polipéptido IL-1, por ejemplo, interactuación con un receptor, mimetizando o potenciando (agonizando) o inhibiendo (antagonizando) los efectos de un polipéptido de origen natural. Un agonista puede ser una proteína de tipo natural o uno de sus derivados que tiene al menos una bioactividad de tipo natural, por ejemplo, actividad de unión a receptores. Un agonista puede ser también un compuesto que sobre-regula la expresión de un gen o que aumenta al menos una bioactividad de una proteína. Un agonista puede ser también un compuesto que aumenta la interactuación de un polipéptido con otra molécula, por ejemplo, un receptor. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o disminuye la interactuación entre una proteína y otra molécula, por ejemplo, un receptor o un agente que bloquea la transducción de señales o el procesamiento pos-traducción (por ejemplo, el inhibidor de la enzima convertidora de 1L-1 (ICE). Por consiguiente, un antagonista preferido es un compuesto que inhibe o disminuye la unión a un receptor y con ello bloquea la activación subsiguiente del receptor. Un antagonista puede ser también un compuesto que sub-regula la expresión de un gen o que reduce la cantidad de una proteína presente. El antagonista puede ser una forma negativa dominante de un polipéptido, por ejemplo, una forma de un polipéptido que sea capaz de interactuar con un péptido diana, por ejemplo, un receptor, pero que no promueve la activación del receptor. El antagonista puede ser también un ácido nucleico que codifica una forma negativa dominante de un polipéptido, un ácido nucleico antisentido o una ribozima capaz de interactuar específicamente con un RNA. Incluso otros antagonistas son moléculas que se unen a un polipéptido e inhiben su acción. Dichas moléculas incluyen péptidos, por ejemplo, formas de péptidos dianas que no tienen actividad biológica, y que inhiben la unión a los receptores. Así, dichos péptidos se unirán al sitio activo de una proteína e impedirán la interactuación con los péptidos dianas. Incluso otros antagonistas incluyen anticuerpos que específicamente interactúan con un epítopo de una molécula, de tal modo que la unión interfiere con la función biológica del polipéptido. En otra realización preferida, el antagonista es una molécula pequeña, tal como una molécula capaz de inhibir la interactuación entre un polipéptido y un receptor diana. Alternativamente, la molécula pequeña puede funcionar como un antagonista interactuando con sitios distintos del sitio de unión al receptor.

Los moduladores de IL-1 (por ejemplo, antagonista de los receptores de 1L-1\alpha, IL-1\beta o IL-1) o una proteína codificada por un gen que está en desequilibrio de ligamiento con un gen IL-1 pueden comprender cualquier tipo de compuesto, incluyendo una proteína, péptido, peptidomimético, molécula pequeña o ácido nucleico. Los agonistas preferidos incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, los que codifican una proteína IL-1 o un gen que está sobre- o sub-regulado por una proteína IL-1), proteínas (por ejemplo proteínas IL-1 o una proteína que está sobre- o sub-regulada) o una molécula pequeña (por ejemplo, que regula la expresión o unión de una proteína IL-1). Los antagonistas preferidos que pueden ser identificados, por ejemplo, usando los análisis descritos en la en la presente memoria, incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, DNA monocatenario (antisentido) o DNA o PNA bicatenario (tríplex) y ribozimas), proteína (por ejemplo anticuerpos) y moléculas pequeñas que actúan para suprimir o inhibir la transcripción de IL-1 y/o la actividad de la proteína.

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4.3.1. Dosis eficaz

La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos puede ser determinada por métodos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis letal para 50% de la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que exhiben índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse compuestos que exhiban efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio de los tejidos afectados con el fin de minimizar el daño potencial a la células no infectadas y, con ello, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de ensayos en cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar en formular un intervalo de dosificaciones para uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos está preferiblemente dentro de las concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. En modelos animales se puede formular una dosis para conseguir un intervalo de concentración circulante en plasma que incluya la CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue la inhibición semi-máxima de los síntomas) como se determina en cultivos celulares. Dicha información se puede para determinar más precisamente las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía de líquidos de alta resolución.

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4.3.2. Formulación y uso

Las composiciones para uso de acuerdo con la presente descripción pueden ser formuladas de un modo convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Por tanto, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden ser formulados para administración, por ejemplo, inyección, inhalación o insuflación (a través de la boca o de la nariz) o administración oral, bucal, parenteral o rectal.

Para dicha terapia los compuestos de la invención pueden ser formulados para una variedad de cargas de de administración, incluyendo administración sistémica y tópica o localizada. Las técnicas y formulaciones generalmente se pueden encontrar en Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Para la administración sistémica se prefiere la inyección, incluyendo la intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, los compuestos de la invención se pueden formular en soluciones líquidas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden ser formulados en forma sólida y re-disueltos o puestos en suspensión inmediatamente antes de su uso. También están incluidas las formas liofilizadas.

Para la administración oral las composiciones pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o capsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil-metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno-fosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón-glicolato sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril-sulfato sódico). Los comprimidos pueden estar revestidos por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral puede tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden ser presentadas como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de puesta en suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles). Los agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma acacia); vehículos no acuosos, (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener también sales tampones, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes según sea apropiado.

Las preparaciones para administración oral pueden ser formuladas adecuadamente para dar una liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal las composiciones pueden tener la forma de comprimidos o píldoras formuladas de la manera usual. Para la administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se suministran convenientemente en forma de presentación de spray de aerosol, desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un gas propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalador o insuflador se pueden formula conteniendo una mezcla de polvos y una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden ser formulados para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar las formas de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación de suspensiones, tales como agentes de puesta en suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos antes de su uso.

Los compuestos se pueden formular también en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios usuales, tales como manteca de coco u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos se pueden formular también como una preparación de liberación retardada. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden ser administradas por implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales polímeros o hidrófobos (por ejemplo, en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Otros sistemas de administración adecuados incluyen microesferas que ofrecen la posibilidad de un suministro no invasivo local de fármacos en un periodo prolongado de tiempo. Esta tecnología utiliza microesferas de tamaño pre-capilar que pueden ser inyectadas mediante un catéter coronario en cualquier parte seleccionada por ejemplo el corazón u otros órganos sin causar inflamación o isquemia. El agente terapéutico administrado se libera lentamente desde estas microesferas y es absorbido por las células del tejido circundante (por ejemplo, las células endoteliales).

La administración sistémica puede ser también por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera que ha de ser atravesada por permeación. Dichos agentes penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosal puede ser a través de sprays nasales o usando supositorios. Para la administración tópica los oligómeros de la invención se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como es generalmente conocido en la técnica. Para tratar una lesión o inflamación se puede usar localmente una solución de lavado para acelerar el curado.

Las composiciones pueden ser presentadas, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contenga el ingrediente activo. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado por las instrucciones para la administración.

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4.4 Análisis para identificar agentes terapéuticos

Basándose en la identificación de las mutaciones que causan o contribuyen al desarrollo de una enfermedad o trastorno que está asociado con un polimorfismo o haplotipo de IL-1, la invención se caracteriza además por análisis basados en células o exentos de células para identificar agentes terapéuticos. En una realización, una célula que expresa un receptor de IL-1, o un receptor para una proteína que está codificada por un gen que está en desequilibrio de ligamiento con un gen de IL-1, sobre la superficie exterior de su membrana celular se incuba en presencia de un compuesto de ensayo sólo o en presencia de un compuesto de ensayo y otra proteína y se detecta la interactuación entre compuesto de ensayo y el receptor o entre la proteína (preferiblemente una proteína señalada como diana) y el receptor, por ejemplo, usando un microfisiómetro (McConnell et al., (1992) Science, 257:1906).

Una interactuación entre el receptor y el compuesto de ensayo o la proteína se detecta por el microfisiómetro como un cambio en la acidez del medio. Este sistema de análisis proporciona por tanto un medio de identificar antagonistas moleculares que, por ejemplo, funcionen por interferencia con la interactuación proteína-receptor, así como agonista molecular que, por ejemplo, funcione activando un receptor.

Los análisis celulares o exentos de células se pueden usar también para identificar compuestos que modulan la expresión de un gen IL-1 o un gen en desequilibrio de ligamiento con él, modular la traducción de un mRNA, o que modulan la estabilidad de un mRNA o proteína. Por consiguiente, en una realización, se incuba una célula que es capaz de producir una proteína IL-1 o de otro tipo con un compuesto de ensayo y la cantidad de proteína producida en el medio celular se mide y compara con la producida por una célula que no ha estado en contacto con el compuesto de ensayo. La especificidad del compuesto frente a la proteína puede ser confirmada por diversos análisis de control, por ejemplo, midiendo la expresión de uno o más genes de control. En particular, este análisis se puede usar para determinar la eficacia de compuestos antisentido, ribozimas y tríplex.

Los análisis exentos de células se pueden usar también para identificar compuestos que sean capaces de interactuar con una proteína, para modificar con ello la actividad del la proteína. Dicho compuesto puede modificar, por ejemplo, la estructura de una proteína afectando a su capacidad de unión a un receptor. En una realización preferida, los análisis exentos de células para identificar dichos compuestos consisten esencialmente en una mezcla de reacción que contienen una proteína y un compuesto de ensayo o una quimioteca de compuestos de ensayo en presencia o ausencia de una pareja de unión. Un compuesto de ensayo puede ser, por ejemplo, un derivado de una pareja de unión, por ejemplo, un péptido diana biológicamente inactivo o una molécula pequeña.

Por consiguiente, un análisis de escrutinio ilustrativo de la presente descripción incluye las etapas de poner en contacto una proteína o uno de sus fragmentos funcionales con un compuesto de ensayo o quimioteca de compuestos de ensayo y detectar la formación de complejos. Para los fines de detección, la molécula puede ser etiquetada con un marcador específico y el compuesto de ensayo o la quimioteca de compuestos de ensayos etiquetados con un marcador diferente. La interactuación de un compuesto de ensayo con una proteína o uno de sus fragmentos se puede detectar luego determinando el nivel de las dos etiquetas después de una etapa de incubación y una etapa de lavado. La presencia de los dos marcadores después de la etapa de lavado es indicativa de una interactuación.

Una interactuación entre moléculas puede ser también identificada usando un análisis de interactuación biomolecular (abreviadamente en lo sucesivo BIA por la expresión inglesa Biomolecular Interaction Analysis), de Pharmacia Biosensor AB, en tiempo real que detecta la resonancia del plasmón de superficie (SPR = Surface Plasmon Resonance) un fenómeno óptico. La detección depende de cambios en la concentración másica de macromoléculas en la interface bioespecífica, y no requiere ningún etiquetado de las entidades que interactúan. En una realización, un quimioteca de compuestos de ensayo puede ser inmovilizada sobre una superficie sensora, por ejemplo, que forma una pared que forma una celda de micro-flujo. Una solución que contiene la proteína o uno de sus fragmentos funcionales se hace fluir luego continuamente sobre la superficie sensora. Un cambio en el ángulo de resonancia como es mostrado en el registro de la señal, indica que ha ocurrido una interactuación. Esta técnica está descrita, por ejemplo, en BlAtechnology Handbook por Pharmacia.

Otro análisis de escrutinio ilustrativo de la presente descripción incluye las etapas de: (a) formar una mezcla de reacción que incluye: (i) una proteína IL-1 o de otro tipo, (ii) un receptor apropiado, y (iii) un compuesto de ensayo; y (b) detectar una interactuación de la proteína y el receptor. Un cambio estadísticamente significativo (potenciación o inhibición) en la interactuación de la proteína y el receptor en la presencia del compuesto de ensayo, relativo a la interactuación en la ausencia del compuesto de ensayo, indica un antagonismo potencial (inhibidor). Los compuestos de este análisis pueden ser puestos en contacto simultánemente. Alternativamente, una proteína se puede poner en contacto primeramente con un compuesto de ensayo durante una cantidad apropiada de tiempo, tras lo cual se añade el receptor a la mezcla de reacción. La eficacia del compuesto puede determinarse generando curvas de dosis-respuestas a partir de los datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de ensayo. Además, se puede realizar un análisis de control para proporcionar una línea base para la comparación.

La formación de un complejo entre una proteína y un receptor puede ser detectada por una variedad de técnicas. La modulación de la formación de complejos puede ser cuantificada usando, por ejemplo, proteínas etiquetadas detectablemente, tales como proteínas o receptores radio-etiquetadas, etiquetadas fluorescentemente o enzimáticamente, por inmunoensayo o por detección cromatográfica.

Típicamente, será deseable inmovilizar la proteína o el receptor para facilitar la separación de formas complejas deformas no complejadas de una o de ambas de las proteínas, así como acomodar la automatización del ensayo. La unión de la proteína y el receptor se puede conseguir en cualquier recipiente adecuado para contener los reaccionantes. Ejemplos incluyen places de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de micro-centrífuga. En una realización se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que la proteína sea unida a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de glutation-S-transferasa pueden ser adsorbidas sobre perlas de glutation-Sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que luego se combinan con el receptor, por ejemplo, un receptor etiquetado con ^{35}S, y el compuesto de ensayo, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación de complejos, por ejemplo en condiciones fisiológicas en cuanto a sal y pH, aunque puede ser deseable, en condiciones ligeramente más estrictas. Tras la incubación, las perlas se lavan para eliminar la etiqueta no unida, y la matriz inmovilizada y radio-etiquetada se determina directamente (por ejemplo, colocando las perlas en un dispositivo destellante), o en el líquido sobrenadante después de que los complejos sean subsiguientemente disociados. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz, separados por SDS-PAGE, y el nivel de proteína o de receptor encontrado en la fracción de perlas cuantificado a partir del gel usando técnicas electroforéticas estándares, tales como las descritas en los ejemplos anexos. También están disponibles otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices para uso en el análisis pertinente. Por ejemplo, la proteína o el receptor pueden ser inmovilizados utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Se pueden obtener animales transgénicos también para identificar agonistas y antagonistas o para confirmar la seguridad y eficacia de un agente terapéutico candidato. Los animales transgénicos de la invención pueden incluir animales no humanos que contienen una mutación causante de la reestenosis bajo el control de un promotor endógeno apropiado o bajo el control de un promotor heterólogo.

Los animales transgénicos pueden ser también animales que contengan un transgén, tal como un gen informador, bajo el control de un promotor apropiado o uno de sus fragmentos. Estos animales son útiles, por ejemplo, para identificar fármacos que modulan la producción de una proteína IL-1, es decir, modulando la expresión del gen. Los métodos para obtener animales transgénicos no humanos son bien conocidos en la técnica. En realizaciones preferidas, la expresión de la mutación causante de la reestenosis está restringida a subconjuntos específicos de células, tejidos o fases del desarrollo que utilizan, por ejemplo, secuencias de acción cis que controlan la expresión en el modelo deseado. En la presente invención, dicha expresión en mosaico de una proteína puede ser esencial para muchas formas de análisis de linajes y pueden proporcionar adicionalmente medios para determinar los efectos de, por ejemplo, el nivel de expresión que podría alterar extremadamente el desarrollo en pequeños parches de tejido dentro de un embrión por los demás normal. Para este fin, se pueden usar secuencias reguladoras específicas de tejidos y secuencias reguladoras condicionales para controlar la expresión de la mutación en ciertos modelos espaciales. Además, pueden proporcionarse modelos temporales de expresión, por ejemplo, sistemas de recombinación condicionales o secuencias reguladoras transcripcionales procarióticas. Las técnicas genéticas, que permiten que la expresión de una mutación pueda ser reguladas mediante manipulación genética específica del sitio in vivo, son conocidas por los expertos en la técnica.

Los animales transgénicos descritos incluyen todos dentro de una pluralidad de sus células un transgén de la mutación causante, que altera el fenotipo de la "célula hospedante". En una realización ilustrativa, puede usarse el sistema de recombinasa cre/IoxP del bacteriófago P1 (Lakso et al., (1992) PNAS, 89:6232-6236; Orban et al., (1992) PNAS, 89:6861-6865) o el sistema de recombinasa FLP de Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al., (1991) Science, 251:1351-1355; publicación PCT WO 92/15694) para generar sistemas de recombinación genética específicos del sitio in vivo. La recombinasa Cre cataliza la recombinación específica del sitio de una secuencia diana intercalada localizada entre las secuencias loxP. Las secuencias loxP son secuencias de repetición de nucleótidos de 34 pares de bases a las cuales se una la recombinasa Cre y son requeridas para la recombinación genética mediada por la recombinasa Cre. La orientación de las secuencias loxP determina si la secuencia diana intercalada es escindida o invertida cuando está presente la recombinasa Cre (Abremski et al., (1984) J. Biol. Chem. 259:1509-1514); catalizando la escisión de la secuencia diana cuando las secuencias loxP están orientadas como repeticiones directas y cataliza la inversión de la secuencia diana cuando las secuencias loxP están orientadas como repeticiones inversas.

Por consiguiente, la recombinación genética de la secuencia diana es dependiente de la expresión de la recombinasa Cre. La expresión de la recombinasa puede ser regulada por elementos promotores que están sometidos a control regulador, por ejemplo, específico de la fase de desarrollo del tejido, inducible o reprimible por agentes añadidos externamente. Este control regulado dará como resultado recombinación genética de la secuencia diana solamente en células en donde la expresión de la recombinasa esté mediada por el elemento promotor. Por tanto, la activación de la expresión del transgén de la mutación causante puede ser regulada mediante el control de la expresión de la recombinasa.

El uso del sistema recombinasa cre/loxP para regular la expresión de un transgén causante requiere la construcción de un animal transgénico que contenga los transgenes que codifican tanto la recombinasa Cre como la proteína pertinente. Los animales que contienen tanto la recombinasa Cre como el transgén de la mutación causante de la reestenosis pueden ser obtenidos a través de la construcción de animales transgénicos "dobles". Un método conveniente para obtener dichos animales es aparear dos animales transgénicos que contenga cada uno un transgén.

Se pueden proporcionar transgenes condicionales similares usando secuencias de promotores procarióticos que requieren que sean simultáneamente expresadas proteínas procarióticas para facilitar la expresión del transgén. En la patente de EE.UU. Nº 4.833.080 se dan promotores ilustrativos y las proteínas procarióticas transactivantes correspondientes.

Además, la expresión de los transgenes condicionales puede ser inducida por métodos similares a la terapia de genes en donde se suministra al tejido un gen que codifica la proteína transactivante, por ejemplo una recombinasa o una proteína procariota, y se hace que se exprese, tal como en un modo específico del tipo de célula. Mediante este método, el transgén podría permanecer silencioso en un adulto hasta ser "conectado" mediante la introducción del transactivador.

En una realización ilustrativa, los "animales transgénicos no humanos" de la invención se obtienen introduciendo transgenes en la línea germinal del animal no humano. Para introducir los transgenes pueden utilizarse células diana embrionarias en diversas etapas de desarrollo. Se utilizan diferentes métodos dependiendo de la etapa de desarrollo de la célula diana embrionaria. La(s) línea(s) específica(s) de cualquier animal no humano utilizada(s) para realizar esta invención se selecciona(n) para conseguir buena salud general, buen rendimiento de embriones, buena visibilidad pronuclear en el embrión y buena aptitud reproductiva. Además, el haplotipo es un factor significativo. Por ejemplo, cuando se quieren obtener ratones transgénicos, se utilizan con frecuencia razas tales como las líneas C57BL/6 o FVB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Las razas preferidas son aquellas con haplotipos H-2b, H-2d o H-2q, tales como C57BL/6 o DBA/1. La(s) línea(s) utilizada(s) para realizar esta invención puede(n) ser ella(s) misma(s) transgénica(s) y/o puede(n) estar desactivada(s) (es decir, obtenida de animales que tienen uno o más genes parcial o completamente suprimidos).

En una realización, la construcción transgénica se introduce en un embrión de una sola etapa. El cigoto es la mejor diana para micro-inyección. En el ratón, el pronúcleo macho alcanza el tamaño de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro que permite la inyección reproducible de 1-2 pl de solución de DNA. El uso de cigotos como diana para la transferencia de genes tiene la ventaja principal de que en la mayoría de los casos el DNA inyectado se incorporará al gen hospedante antes de la primera escisión (Brinster et al., (1985) PNAS, 82:4438-4442). En consecuencia, todas las células del animal transgénico llevarán el transgén incorporado. Esto se reflejará también en general en la transmisión eficiente del transgén a la descendencia del animal fundador, puesto que el 50% de las células germinales albergará el transgén.

Normalmente, se incuban embriones fertilizados en medios adecuados hasta que aparecen los pronúcleos. Aproximadamente en ese momento, la secuencia nucleotídica que comprende el transgén se introduce en el pronúcleo hembra o macho como se describe más adelante. En algunas especies tales como ratones, se prefiere el pronúcleo macho. Se prefiere mejor, que el material genético exógeno sea añadido al complemento de DNA macho del cigoto antes de que sea procesado por el núcleo del óvulo o el pronúcleo hembra del cigoto. Se sabe que el núcleo del óvulo o pronúcleo hembra libera moléculas que afectan al complemento de DNA macho, quizás sustituyendo las protaminas del DNA macho por histonas, facilitando con ello la combinación de los complementos de DNA hembra y macho para formar el cigoto diploide. Así, se prefiere que el material genético exógeno sea añadido al complemento macho de DNA o cualquier otro complemento de DNA antes de que sea afectado por el pronúcleo hembra. Por ejemplo, el material genético exógeno se añade al pronúcleo macho temprano, tan pronto como sea posible después de la formación del pronúcleo macho, que es cuando los pronúcleos macho y hembra están bien separados y ambos están situados próximos a la membrana celular. Alternativamente, el material genético exógeno podría añadirse al núcleo del esperma después que haya sido inducido para experimentar descondensación. El esperma que contiene el material genético exógeno puede añadirse entonces al óvulo o el esperma descondensado podría añadirse al óvulo añadiéndose después tan pronto como sea posible las construcciones transgénicas.

La introducción de la secuencia nucleotídica transgénica en el embrión puede realizarse por cualquier medio conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, micro-inyección, electroporación o lipofección. Después de la introducción de la secuencia nucleotídica transgénica en el embrión, dicho embrión puede ser incubado in vitro durante diversos periodos de tiempo o reimplantado en el hospedante sustituto o ambas técnicas. La incubación in vitro hasta la madurez está incluida en el alcance de esta invención. Un método usual es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de las especies y a continuación reimplantarlos en el hospedante sustituto.

Para los fines de esta invención, un cigoto es esencialmente la formación de una célula diploide que es capaz de convertirse en un organismo completo. Generalmente, el cigoto comprenderá un huevo que contiene un núcleo formado, natural o artificialmente, por la fusión de dos núcleos haploides procedentes de un gameto o gametos. Por tanto, los núcleos de los gametos deben ser naturalmente compatibles, es decir, que den como resultado un cigoto viable capaz de experimentar diferenciación y convertirse en un organismo funcional. En general, se prefiere un cigoto euploide. Si se obtiene un cigoto aneuploide, entonces el número de cromosomas no debe variar en más de uno respecto al número euploide del organismo del que se originó cada gameto.

Además de consideraciones biológicas similares, las físicas también gobiernan la cantidad (por ejemplo, volumen) de material genético exógeno que se puede añadir al núcleo del cigoto o al material genético que forma una parte del núcleo del cigoto. Si no se retira material genético, entonces la cantidad de material genético exógeno que puede añadirse está limitada por la cantidad que será absorbida sin ser físicamente perjudicial. En general, el volumen de material genético exógeno insertado no será superior a aproximadamente 10 picolitros. Los efectos físicos de adición no deben ser tan grandes que destruyan físicamente la viabilidad del cigoto. El límite biológico del número y variedad de secuencias de DNA variará dependiendo del cigoto particular y de las funciones del material genético exógeno y será fácilmente evidente para los expertos en la técnica, debido a que el material genético, incluyendo el material genético exógeno, del cigoto resultante debe ser biológicamente capaz de iniciar y mantener la diferenciación y el desarrollo del cigoto en un organismo funcional.

El número de copias de las construcciones transgénicas que se añade al cigoto es dependiente de la cantidad total de material genético exógeno añadido y será la cantidad que permita que tenga lugar la transformación genética. Teóricamente, solo se requiere una copia; sin embargo, generalmente, se utilizan numerosas copias, por ejemplo, 1.000-20.000 copias de la construcción transgénica, con el fin de garantizar que la copia sea funcional. En cuanto a la presente invención, será con frecuencia una ventaja tener más de una copia funcional de cada una de las secuencias de DNA exógenas insertadas para mejorar la expresión fenotípica de las secuencias de DNA exógeno.

Puede utilizarse cualquier técnica que permita la adición del material genético exógeno en el material genético nucleico siempre que no destructivo para la célula, la membrana nuclear u otras estructuras celulares o genéticas existentes. El material genético exógeno se inserta preferiblemente en el material genético nucleico por micro-inyección. La micro-inyección de células y estructuras celulares es conocida y usada en la técnica.

La reimplantación se consigue utilizando métodos estándares. Generalmente, se anestesia el hospedante sustituto y se insertan los embriones en el oviducto. El número de embriones implantado en un hospedante particular variará según las especies, pero será en general comparable al número de descendientes que las especies producen de forma natural.

Se puede escrutar la descendencia transgénica del hospedante sustituto para detectar la presencia y/o expresión del transgén por cualquier método adecuado. La selección se realiza con frecuencia por análisis de transferencia Southern o transferencia Northern, utilizando una sonda complementaria con al menos una porción del transgén. Se puede emplear el análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo contra la proteína codificada por el transgén como método alternativo o adicional para escrutar la presencia del producto transgénico. Típicamente, el DNA se prepara a partir del tejido de la cola y se analiza por análisis Southern o por PCR para determinar el transgén. Alternativamente, se analizan los tejidos o células que se cree que expresan el transgén a niveles más altos para determinar la presencia y expresión del transgén utilizando análisis Southern o PCR, aunque pueden usarse para este análisis cualesquiera tejidos o tipos de células.

Métodos alternativos o adicionales para evaluar la presencia del transgén incluyen, sin limitación, valoraciones bioquímicas adecuadas, tales como valoraciones enzimáticas y/o inmunológicas, razas histológicas para detectar un marcador particular o actividades enzimáticas, análisis por citometría de flujo y similares. El análisis de la sangre también puede ser útil para detectar la presencia del producto transgénico en la sangre, así como para evaluar el efecto del transgén sobre los niveles de diversos tipos de células sanguíneas y otros constituyentes de la sangre.

La progenie de los animales transgénicos se puede obtener apareando el animal transgénico con una pareja adecuada, o por fertilización in vitro de huevos y/o esperma obtenidos del animal transgénico. Cuando se realiza el apareamiento con una pareja, dicha pareja puede ser o no ser transgénica y/o inactivada; si es transgénica, puede contener el mismo o diferentes transgenes o ambos. Alternativamente, la pareja puede ser una línea parental. Si se usa la fertilización in vitro, el embrión fertilizado puede implantarse en un hospedante sustituto o incubarse in vitro, o ambas cosas. Utilizando cualquier método, se puede evaluar la progenie para determinar la presencia del transgén aplicando los métodos antes descritos u otros métodos apropiados.

Los animales transgénicos producidos de acuerdo con la presente invención incluirán material genético exógeno. Además, en dichas realizaciones la secuencia se unirá a un elemento de control de la transcripción, por ejemplo, un promotor, que permite preferiblemente la expresión del producto transgénico en un tipo específico de célula.

También se puede utilizar la infección retroviral para introducir el transgén en un animal no humano. El embrión no humano en desarrollo se puede cultivar in vitro hasta la etapa del blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas para la infección retroviral (Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). La infección eficaz de los blastómeros se obtiene por tratamiento enzimático para eliminar la zona pelúcida (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). El sistema vector viral utilizado para introducir el transgén es típicamente un retrovirus de replicación defectuosa que lleva el transgén (Jahner et al., (1985) PNAS, 82:6927-6931; Van der Putten et al., (1985) PNAS, 82:6148-6152). La transfección se obtiene fácil y eficazmente cultivando los blastómeros sobre una monocapa de células productoras de virus (Van der Putten, supra; Stewart et al., (1987) EMBO J., 6:383-388). Alternativamente, la infección se puede realizar en una etapa posterior. El virus o las células productoras de virus se pueden inyectar en el blastocele (Jahner et al., (1982) Nature, 298:623-628). La mayoría de los fundadores serán mosaicos para el transgén puesto que la incorporación sólo ocurre en un subconjunto de células que formaban el animal transgénico no humano. Además, el fundador puede contener diversas inserciones retrovirales del transgén en diferentes posiciones en el genoma que generalmente se segregarán en la descendencia. Por otra parte, también es posible introducir los transgenes en la línea germinal por infección retroviral intrauterina del embrión en la mitad de la gestación (Jahner et al., (1982) supra).

Un tercer tipo de célula diana para la introducción de los transgenes es la célula madre embrionaria. Las células madre embrionarias se obtienen de embriones antes de la implantación cultivados in vitro y fusionados con embriones (Evans et al., (1981) Nature, 292:154-156; Bradley et al., (1984) Nature, 309:255-258; Gossler et al., (1986) PNAS, 83: 9065-9069; y Robertson et al., (1986) Nature, 322:445-448). Los transgenes se pueden introducir eficazmente en las células madre por transfección de del DNA o por traducción mediada por un retrovirus. Dichas células madre embrionarias transformadas se pueden combinar a continuación con blastocistos procedentes de un animal no humano. Las células madre colonizan a continuación el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante. Veáse una revisión de Jaenisch, R. (1988) en Science, 240:1468-1474.

La presente invención está además ilustrada por los siguientes ejemplos que no deben considerarse de ningún modo como limitativos. El contenido de todas las referencias citadas (incluyendo las referencias bibliográficas, las patentes concedidas y las solicitudes de patentes publicadas que se citan a lo largo de esta solicitud) se incorporan expresamente como referencia. La práctica de la presente invención empleará, salvo indicación contraria, métodos convencionales que están incluidos en la técnica. Dichos métodos están completamente explicados en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, (2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Patente de EE.UU. Nº 4.683.195; Patente de EE.UU. Nº. 4.683.202; y Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1984).

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5. Ejemplos Ejemplo 1 Genotipificación

Todos los sujetos humanos fueron donantes de sangre sanos, de raza blanca, no relacionados entre sí de Sheffield (n = 112). Los sujetos fueron tipificados en los loci indicados en la Tabla 1.

TABLA 2 Marcadores utilizados en el estudio del haplotipo

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Las secuencias de los cebadores y las etiquetas fluorescentes utilizadas en la amplificación por PCR de los marcadores se muestran en la Tabla 3.

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TABLA 3 Secuencia de los cebadores y etiqueta fluorescente para la genotipificación

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Las condiciones de reacción eran las incluidas en la Tabla 4.

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TABLA 4 Condiciones de reacción

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Los productos de la PCR 222/223, gz5/gz6, gaat.p33330 y Y31 se examinaron por electroforesis en gel de agarosa y el resto de los productos de la PCR se mezclaron de acuerdo con la intensidad de tinción con bromuro de etidio. 2 g/l de la mezcla se analizaron en un secuenciador automático ABI 373A y se determinaron los tamaños de los alelos utilizando el programa informático Genescan and Genotyper. Los alelos se agruparon globalmente utilizando un sencillo programa de ordenador y numerados en orden de tamaño.

Los productos de la PCR -889 se sometieron a digestión con NcoI y los fragmentos resultantes fueron ordenados por tamaños por PAGE al 8%. El alelo 1 produce fragmentos de 83 y 16 pb. El alelo 2 produce un fragmento de 99 pb.

Los productos de la PCR +3954 se sometieron a digestión con la enzima de restricción Taq I. El alelo 1 produce fragmentos de 97, 85 y 12 pb y el alelo 2 produce fragmentos de 182 y 12 pb.

Los productos de la PCR -511 se sometieron a digestión con Aval y Bsu36I y los fragmentos fueron ordenados por tamaños por PAGE al 8%. El alelo 1 produce fragmentos de 190 y 114 pb cuando se sometió a digestión con Aval y un fragmento de 304 pb cuando se sometió a digestión con Bsu36I. El alelo 2 produce un fragmento de 304 pb cuando se sometió a digestión con Aval y fragmentos de 190 y 114 pb cuando se sometió a digestión con Bsu36I.

Los productos de la PCR VNTR fueron ordenados por tamaños por electroforesis sobre gel de agarosa al 2% a 90V durante 45 minutos. El alelo 1 tiene 4 repeticiones y el producto de la PCR tiene 412 pb, el alelo 2 tiene 2 repeticiones y el producto de la PCR tiene 240 pb, el alelo 3 tiene 3 repeticiones y el producto de la PCR tiene 326 pb, el alelo 4 tiene 4 repeticiones y el producto de la PCR tiene 498 pb, el alelo 5 tiene 6 repeticiones y el producto de la PCR tiene 584 pb.

Las distancias intergénicas se determinaron por estimación basándose en los tamaños de los insertos de los clones PAC correspondientes a partir de un conjunto de clones contiguos que abarca la agrupación de genes de IL-1 (Nicklin, et al., Genomics 19:382-4 (1994)). Las distancias intragénicas se determinaron a partir de la secuencia de nucleótidos correspondientes obtenidos de la base de datos GENBANK.

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Ejemplo 2 Método para estimar el desequilibrio de ligamiento

Debido a que cuatro de los marcadores estudiados en la presente invención son multialélicos, se realizó un análisis preliminar para determinar que combinaciones alélicas entre pares de loci contribuían al mayor desequilibrio, con el fin de que el desequilibrio no fuera enmascarado cuando se agruparan los alelos en sistemas bialélicos. Se utilizó el programa E.H. de Xie y Ott (Handbook of Human Genetic Linkage, 1994, John Hopkins University Press, 188-98), incorporado aquí como referencia, para estimar las frecuencias de haplotipos bajo H_{0} (sin ligamiento) y H_{1} (permitido el ligamiento alélico). Se encontró que la estrategia de agrupamiento de alelos elaborada tenía algunas ventajas sobre los métodos utilizados corrientemente, en que se detectó el desequilibrio entre casi todas las combinaciones de marcadores en parejas examinadas y existía buena correlación entre el desequilibrio y la distancia física.

Más específicamente, se utilizó el programa E.H. de Xie y Ott para determinar las estimaciones de probabilidad máxima de desequilibrio (D_{j}) entre cada combinación de alelos en parejas, donde D_{ij} = h_{ij}-p_{i}q_{j} son las frecuencias para el alelo i en el locus 1 y para el alelo j en el locus 2 respectivamente, y h_{ij} es la frecuencia del haplotipo ij. El programa calculó los valores de probabilidad máxima para las frecuencias de los haplotipos (y por consiguiente frecuencias de los alelos) bajo H_{0} (sin asociación) y las frecuencias de los haplotipos bajo H_{1} (permitida la asociación alélica). Para marcadores con más de dos alelos, la estimación por E. H. para las frecuencias de los alelos está mal relacionada con las frecuencias de los alelos estimadas directamente en la población de muestra y por consiguiente no dieron ninguna confianza a las estimaciones de D_{ij} dadas. Por consiguiente no era necesario agrupar alelos de los marcadores multialélicos en un sistema bialélico. El análisis de los marcadores en un formato bialélico tiene las ventajas adicionales de que la anotación ^D_{ij}, p_{j} y q_{j} se pueden simplificar en ^D, p y q respectivamente, donde p y q se definen como las frecuencias de los alelos más raros en ambos loci (de tal forma que sin pérdida de generalidad p \alpha q \alpha 0,5) y ^D es el desequilibrio estimado entre dichos alelos.

En un sistema bialélico, la potencia es también mucho más sencilla de determinar utilizando ecuaciones como las detalladas por Hill (Hill, Heredity, 33: 229-39 (1974)). Además, el signo de ^D se hace más informativo, de tal forma que ^D > 0 cuando se asocian los alelos más raros en cada uno de los dos loci y ^D < 0 cuando el alelo raro en un locus se asocia con el alelo común en el otro locus.

Debido a que el método de agrupamiento de alelos afectaba claramente a la potencia para detectar el desequilibrio (Zouros, et al., Gent. 85: 543-50 (1977); Weir, et al., Gent. 88: 633-42 (1976)), se realizó un análisis preliminar para garantizar que el agrupamiento no enmascaraba el desequilibrio entre subconjuntos de alelos. En este análisis, se calculó \delta_{ij} = (O'_{ij}-E_{ij})//E_{ij} para cada haplotipo, donde E_{ij} es el número esperado de haplotipos ij suponiendo el equilibrio (E_{ij} = 2n p_{i}q_{j}, donde n = número de individuos en el estudio) y O'_{ij} es una estimación básica para el recuento de haplotipos observados, determinada como sigue. Todos los genotipos que podrían ser resueltos sin ambigüedad eran un haplotipo contado. Cada heterocigoto doble (i_{1}i_{2}/j_{1}j_{2}) podría ser resuelto en dos posibles conjuntos de haplotipos, [i_{1}J_{1},i_{2}j_{2}] o [i_{1}J_{2},i_{2}j_{1}]. Utilizando las frecuencias de haplotipos estimadas a partir del recuento de haplotipos sin ambigüedad, se calculó la probabilidad de cada conjunto y se usó como recuento "parcial". De este modo los genotipos ambiguos eran también haplotipos contados y los recuentos totales (ambiguos más no ambiguos) constituían las O'_{ij} utilizadas en \delta_{ij}. Una vez estabilizado, se utilizaron la magnitud y signo de los \delta_{ij} para determinar que combinación alélica mostraba mayor desviación de la hipótesis nula de no asociación. Esta información se utilizó para agrupar alelos en los loci multialélicos en sistemas bialélicos para poder utilizar eficazmente el programa E.H.

Con el fin de comparar el grado de desequilibrio entre diferentes combinaciones de loci en parejas, se calculó una medida independiente de la frecuencia del desequilibrio \simD, (la proporción de desequilibrio máximo posible en la dirección dada), donde \simD = ^D/|D_{max}| (Thompson, et al., Am. J. Hum. Gent. 42: 113-24 (1988)). La relación entre p y q es tal que p \alpha q \alpha 0,5, por consiguiente puede escribirse que -pq \alpha D \alpha p(1-q), tal que cuando ^D<0, D_{max} = -pq y cuando ^D>0, D_{max} = p(1-q). La salida del programa E.H. incluía probabilidades logarítmicas para los valores máximos del parámetro de probabilidad bajo H_{0} y H_{1}, y puesto que -2ln (L_{0}/L_{1})\simX^{2}_{1}, donde L_{0} y L_{1} son las probabilidades bajo H_{0} y H_{1}, se podrían entonces determinar los valores de p para cada ensayo.

Las varianzas asintóticas para ^D, bajo H_{0}: D = 0 y H_{1}, se calcularon utilizando la fórmula definida por Hill
(Heredity, 33: 229-39 (1974)) para datos genotípicos. Utilizándolas, se pudo calcular la potencia para cada comparación en parejas.

Se identificaron haplotipos comunes que contenían todos 8 loci a partir del análisis preliminar de \delta_{ij} antes descrito y respaldados por la magnitud y signo de los desequilibrios una vez que los alelos en los loci multialélicos fueron agrupados. Para estos loci, fue identificado en el haplotipo el alelo en el grupo que contribuía en mayor medida al desequilibrio. Para estimar las frecuencias de haplotipos en la población, se determinaron las tasas de transporte de al menos una copia de los alelos pertinentes en la población. Estos no representan verdaderos haplotipos puesto que la fase es desconocida. Se utilizaron técnicas de simulación de Monte Carlo para analizar la desviación significativa de una distribución nula simulada para estos transportes combinados suponiendo que no hay asociación.

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Ejemplo 3 Estimación del desequilibrio del ligamiento en la agrupación de genes de IL-1

Se han identificado diversos marcadores bialélicos y multialélicos en los genes de IL-1 y alrededor de ellos. Sin embargo, no han sido identificados hasta ahora el grado de desequilibrio del ligamiento entre los marcadores y la prevalencia de haplotipos multimarcadores en la población general.

La Figura 1 muestra las posiciones relativas de los 8 loci marcadores utilizados en este estudio. Muestras de DNA de 212 voluntarios sanos no relacionados fueron genotipificadas para cada uno de estos marcadores, y las estimaciones resultantes de frecuencias de alelos se muestran en la Tabla 5.

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TABLA 5 Frecuencias estimadas de alelos marcadores

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Para determinar el desequilibrio del ligamiento entre combinaciones de loci en parejas, se utilizó el programa de ordenador de Xie y Ott. Se encontró que este programa era el más eficaz cuando se utilizaba con sistemas bialélicos, por consiguiente se agruparon los alelos en los loci multialélicos del modo más apropiado para cada comparación en parejas, de forma que no se enmascarara el desequilibrio entre subconjuntos de alelos.

En la Tabla 6, los desequilibrios entre parejas de loci se expresan como \simD, la relación entre ^D y su valor máximo D_{max}, y se muestran junto con la distancia física aproximada entre los loci en kilopares de bases.

TABLA 6 Desequilibrio (\simD = ^D/|D_{max}|) y distancia física entre marcadores

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La Tabla 7 muestra la potencia para detectar el 50% de D_{max} para cada combinación de loci y los valores de p para cada D correspondiente.

TABLA 7 Potencia para detectar el 50% de D_{max} y valores de p de -2Ln (L_{0}L_{1})

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Se detectó el desequilibrio del ligamiento significativo (p_{corr} < 0,05) entre la mayor parte de las combinaciones de loci, sólo con algunas excepciones. Estas incluyen las comparaciones entre el marcador VNTR y los marcadores bialélicos más distantes, +3954 y -889, en los que el desequilibrio se produce en dirección negativa y en consecuencia se reduce la potencia (Tabla 7). La correlación entre el desequilibrio \simD y la distancia física era r = -0,752 (p < 0,0001, unilateral) (Figura 2).

Con el fin de comparar diferentes métodos de agrupamiento para los marcadores multialélicos, se calculó \simD para todas las comparaciones que implicaban 222/223 utilizando dos estrategias de agrupamiento adicionales. La primera consistía en una propuesta de "alelo común frente al resto" y la segunda en un agrupamiento basado en el tamaño del alelo, utilizando la distribución bimodal de la frecuencia del alelo frente al tamaño que se observaba para todos los marcadores multialélicos examinados. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 8, donde se comparan los valores de \simD para los tres métodos de agrupamiento.

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TABLA 8 Valores de \simD para los tres métodos agrupamiento de alelos en los loci marcadores multialélicos

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Se puede observar que el desequilibrio no se detecta en varios casos utilizando estas otras estrategias de agrupamiento, principalmente 222/223 con -511 y gaat.p33330 en la propuesta común frente al resto, 222/223 con Y31 tanto en la propuesta común frente al resto como en la del tamaño de los alelos y 222/223 con VNTR en la propuesta del tamaño de los alelos.

El examen de qué alelos de los loci multialélicos contribuyeron en mayor grado al desequilibrio, a partir de la determinación de \delta_{ij} reveló la existencia de 2 haplotipos que contenían alelos de los 8 loci. Estos se confirmaron por examen de las frecuencias de haplotipos y valores del desequilibrio obtenidos después del agrupamiento. El primer haplotipo: alelos 44112332 (expresados en orden cromosómico, véase la Fig. 1) es el más común (transporte de 34/198) y está presente 7 veces más frecuentemente que lo esperado (esperado = 4,5/198) (p < 0,000001). El segundo haplotipo: alelos 33221461 (transporte de 2/206) estaba presente 4 veces más frecuentemente que lo esperado (esperado 0,5/206), pero esto no era estadísticamente significativo (p \sim 0,106). Sin embargo, el examen de un tamaño de muestra mayor podía ayudar a aumentar el significado estadístico de este hallazgo.

Los datos presentados indican un grado significativo de desequilibrio del ligamiento en un tramo de aproximadamente 400 Kb del cromosoma 2q13. El desequilibrio era grande tanto para los tres marcadores en el gen de IL-1\alpha, lo que podría esperarse, pero también entre alguno de los marcadores más separados (-899/+3954; \simD = +0,804, distancia física = 50 Kb) (Tabla 6). Sin embargo, \simD disminuyó considerablemente entre los extremos más alejados del agrupamiento. Dentro del gen de IL-1\beta, se obtuvo un valor moderado de \simD (+3954/-511; \simD = -0,617), aunque este valor no era significativo cuando de corrigió para comparaciones múltiples, reflejando probablemente la reducción en potencia cuando el desequilibrio se produce en la dirección negativa (Thompson, et al., Am. J. Hum. Gent. 42: 113-24 (1988)).

En general, existe una buena correlación entre la distancia física y el desequilibrio del ligamiento (Figura 2); r = -0,752. La fiabilidad de r propiamente dicha depende parcialmente de la fiabilidad de las estimaciones tanto de la distancia física como de \simD. En distancias cortas, las distancias físicas son exactas puesto que se determinan a partir de secuencias de DNA conocidas, mientras que las estimaciones de distancias largas son menos precisas. La potencia puede ser considerada provisionalmente como un indicador de la fiabilidad de \simD, puesto que si la potencia es baja esto indica que el tamaño de la muestra era demasiado pequeño y con tamaños de muestras pequeños las estimaciones de \simD pueden no ser fiables.

El éxito de la estrategia elaborada de agrupamiento se indica en la Tabla 8, que presenta varios casos en los que el desequilibrio entre los loci particulares es aparentemente bajo o no detectado cuando se emplean otros métodos de agrupación usualmente utilizados. Las desventajas de la estrategia de agrupamiento utilizada en la presente invención son que dicha estrategia es bastante laboriosa puesto que la información utilizada para el agrupamiento se basaba en una estimación aproximada de las frecuencias de haplotipos "observadas" (véase el Ejemplo 2). Para los marcadores más polimórficos la mayor heterocigosis significa que la estimación de \delta_{ij} era menos precisa puesto que había una mayor proporción de haplotipos ambiguos. A pesar de este inconveniente, se procuró tener en cuenta tanto el signo como la magnitud de \delta_{ij} y las frecuencias de los alelos relacionados.

El método pudo simplificarse, en un estudio suficientemente amplio, sólo considerando los haplotipos no ambiguos cuando se determina el agrupamiento. La determinación de \delta_{ij} utiliza todo el conocimiento anterior para el agrupamiento de los marcadores multialélicos y esta puede ser la razón por la que se detectó el desequilibrio entre casi todas las combinaciones de marcadores en parejas.

Los dos haplotipos que contienen los 8 marcadores, así como otros haplotipos más cortos, son de particular interés puesto que es probable que las combinaciones particulares de alelos de los genes de IL-1 puedan actuar conjuntamente para determinar un fenotipo inflamatorio global. La comprensión de cuales marcadores están en un desequilibrio de ligamiento fuerte no sólo permite un diseño más racional de los estudios genéticos sino que también puede proporcionar claves para comprender el mecanismo de la enfermedad. Por consiguiente, además de los alelos identificados en la presente memoria, el haplotipo de IL-1 (44112332) puede contener los siguientes alelos:

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Ejemplo 4 El haplotipo de IL-1 (441123-32) está asociado a la nefropatía diabética

Se investigó la presencia de los dos haplotipos descritos en la presente memoria en poblaciones sanas y enfermas para determinar si los haplotipos estaban asociados a una enfermedad inflamatoria. En el ejemplo 3 se compararon 81 pacientes con diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) y con nefropatía con 198 sujetos sanos étnicamente similares y 147 pacientes con NIDDM sin nefropatía. Se realizó la genotipificación como en el ejemplo 1.

El haplotipo de IL-1 (44112332) era portado por 24 de 79 de los pacientes con NIDDM y nefropatía y 25 de 141 de los pacientes con NIDDM sin nefropatía. Sin embargo, no se encontró el segundo haplotipo (3322146 1) en los pacientes con nefropatía (0/8 1). El haplotipo de IL-1 (44112332) estaba significativamente sobre-representado en el grupo de pacientes en comparación con el grupo de control sano (24/79 frente a 34/198; p = 0,015) y en el grupo con NIDDM sin nefropatía (24/79 frente a 25/141; p = 0,03).

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Ejemplo 5 Un haplotipo de IL-1 está asociado a una enfermedad inflamatoria

Es un ejemplo profético o predictor. Se examinaron otras enfermedades como en el Ejemplo 4. Se encontró que el haplotipo de IL-1 (44112332) está asociado a la arteriopatía coronaria, osteoporosis, nefropatía en diabetes mellitus, alopecia areata, enfermedad de Graves, lupus eritematoso diseminado, esclerosis del liquen y colitis ulcerosa.

Igualmente, el haplotipo de IL-1 (33221461) está asociado a la periodontopatía, artritis crónica juvenil, psoriasis, diabetes dependiente de la insulina y retinopatía diabética.

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Ejemplo 6 Nuevos marcadores están ligados a un haplotipo de IL-1

Es un ejemplo predictor. Se identificaron más marcadores por análisis de las secuencias y enzimas de restricción de la región 2q13-14. Se identificó que estos nuevos marcadores pertenecen a un haplotipo de IL-1 de la manera descrita en los Ejemplos 2 y 3.

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Ejemplo 7 El haplotipo de IL-1 (44112332) se utiliza para predecir la sensibilidad a enfermedades

Es un ejemplo predictor. Un paciente con un historial familiar de colitis ulcerosa se genotipificó para determinar la presencia del haplotipo de IL-1 (44112332). La genotipificación se realizó como en el Ejemplo 1 y se detectó que el paciente llevaba uno o más alelos del haplotipo. El paciente se trató por consiguiente con antagonistas de IL-1 para evitar la enfermedad.

Un segundo paciente con un historial familiar de arteriopatía coronaria se genotipificó para detectar el agrupamiento de genes IL-1. Se encontró que el paciente llevaba uno o más alelos del haplotipo de IL-1 (44112332) y que era homocigótico para el alelo 2 de VNTR. Por tanto, era 5,4 veces más probable que el paciente desarrollara la arteriopatía coronaria que la población general y se trató exhaustivamente para evitar la enfermedad.

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Ejemplo 8 Los haplotipos adicionales son estadísticamente significativos

Es un ejemplo predictor se tipificaron, como en el Ejemplo 1, 400 cromosomas más y se valoró el desequilibrio de ligamiento como en el Ejemplo 2. Se encontró que el haplotipo de IL-1 (33221461) estaba presente aproximadamente 4 veces más frecuentemente que lo que se esperaba (p-0,05).

De manera similar, se determinó que estaban presentes los siguientes marcadores en el haplotipo de IL- 1
(44112332) (p << 0,05).

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Ejemplo 9 Identificación y caracterización de los polimorfismos de un solo nucleótido en el gen IL-1B humano asociado con la expresión alterada de IL-1\beta y estados inflamatorios

Se estudiaron el gen IL-1B y otros miembros del agrupamiento de genes IL-1. En particular, se investigó el IL-1B debido a que diversas enfermedades están asociadas a los SNP en su región en dirección 5'. Se identificaron diversos SNP nuevos, como se muestra en las Tablas 9ª-E. Se utilizaron valoraciones con genes indicadores para analizar las combinaciones alélicas de los SNP en la región promotora de IL-1B, algunas de las cuales representan haplotipos frecuentes en la población. Una construcción control tiene el tipo natural (designado alelo 1) en todos los alelos que contienen SNP. La actividad transcripcional diferencial de alelos individuales en las valoraciones indicadoras se estudió más a fondo analizando la unión de proteínas nucleares al DNA alélico en valoraciones del desplazamiento de la electro-movilidad.

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Cartografiado de los SNP de alta densidad

Se seleccionaron veinticinco voluntarios sanos de diferente origen étnico, auto-descrito. Cada sujeto proporcionó un consentimiento escrito informado y el protocolo fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad de Sheffield (U.K.). A partir de muestras de sangre se preparó DNA genómico. El DNA se envió a Genome Therapeutics Corporation (Waltham, MA, USA) para su secuenciación y cartografiado de los SNP de alta densidad. La secuencia genómica públicamente disponible en la región de IL-1 se utilizó para establecer la secuencia de referencia de esta región para identificación de los SNP. Además, se escrutó una genoteca del cromosomas artificiales bacterianos (abreviadamente en lo sucesivo BAC por la expresión inglesa Bacterial Artificial Chromosomes) comercialmente disponible para identificar clones de BAC que abarcan la región de IL-1. Se utilizaron BAC positivos para generar un pequeña genoteca de insertos de plásmidos con insertos de 3 a 3,5 kb. Se estudiaron cuatro genes (IL-1A, IL-1B, IL-RN e IL-1F5) y se identificaron los SNP para cada gen en las regiones del exón y 5 kb del extremo 5' del gen. La detección de los SNP se realizó automáticamente utilizando el programa PolyPhred en un instrumento ABI 3700, seguido de inspección visual de los SNP recogidos en las Tablas 9A-E.

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TABLA 9A Descubrimiento de los SNP de IL-1\alpha

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TABLA 9B Descubrimiento de los SNP de IL-1\beta

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TABLA 9C Descubrimiento de los SNP de IL-Rnic

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TABLA 9D Descubrimiento de los SNP de IL-Rnsec

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TABLA 9E Descubrimiento de los SNP de IL-1F5

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En el gen IL-1A, la cartografía reveló un total de 25 SNP. Dos SNP estaban en las regiones del exón y dieron como resultado cambios no sinónimos. Uno de ellos en el Exón 5 era conocido y se encontraba en la posición +4845, el otro en el Exón 4 tenía una frecuencia baja (2%) y los intentos posteriores para confirmarlos en otra población no mostraron variación. De los 11 SNP en la región promotora, 3 sólo se encontraron en un sujeto (2%) y los otros 8 estaban también en la base de datos pública del National Center for Biotechnology Information (NCBI dbSNP). Los 12 SNP restantes eran bien intrónicos (n=9) o se encontraban en la región no traducida (abreviadamente en lo sucesivo UTR por la expresión inglesa UnTranslated Region) 3' (n=3) del Exón 7. Diez de estos se encontraban también en la base de datos pública y los 2 restantes tenían una frecuencia muy baja (2-4%) en nuestra población.

Para identificar las variantes en el gen de IL-1B (IL-1F2) que más probablemente eran funcionales, los siete exones y las regiones intrónicas adyacentes, 5 kb en dirección 5' del gen y 2 kb en la región 3', que comprendían 12 kb, se secuenciaron en un panel de 25 individuos sanos étnicamente diversos. Se identificaron veinte SNP (Tabla 9B). Es significativo que en siete exones secuenciados sólo se identificó un SNP en una región codificadora, el SNP sinónimo bien descrito en +3954. Existían tres SNP intrónicos, tres SNP en la UTR 3' del exón 7 y un SNP en la UTR 5' de exón 1 identificado. Los 12 SNP restantes estaban en la región promotora/potenciadora. Dos de los 12 SNP promotores no se encontraban en las bases de datos públicas y seis de los 12 tenían frecuencias de alelos menores \leq 4%. Se confirmó la presencia de 5 SNP previamente indicados en las posiciones -511 (SNP 14), -31 (SNP15), -1468 (SNP10), +3954 (SNP 25) y +3877 (SNP 24) en el gen de IL-1B. Estos SNP se han asociado a estados clínicos. También se identificó la existencia de otros cinco SNP: -3893 (SNP3); -3737 (SNP4), +5548 (SNP30), +6911 (SNP37) y +7214 (SNP 38).

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Escrutinio de los SNP funcionales

No se identificaron SNP no sinónimos en los exones de IL-1B. Fueron identificados SNP que alteraban la actividad transcripcional y/o la unión al factor de transcripción. Ajustando todos los SNP al alelo 1 excepto el SNP individual del foco, se realizó el escrutinio de la actividad del promotor después de la transfección de las construcciones de SNP en células THP-1. El análisis por transfección con construcciones parentales de longitud variable mostró que la deleción del fragmento distal entre SNP 1 y SNP 10 potenció la actividad promotora, indicando fuertes represores en esta región. Una mayor actividad promotora de los plásmidos que contenían esta región entre SNP 17 y el comienzo del exón también reveló la existencia de potenciadores en la UTR en 5'. Con el fin de evitar la interferencia de los represores y potenciadores durante la identificación de los SNP funcionales individuales en la región promotora, se analizaron los SNP 2 a 17 en los fondos de plásmidos con o sin la región UTR en 5' en dirección 3' del SNP 15 (posible potenciador). También se analizaron los SNP 10 a 17 en los fondos de plásmidos con y sin fuerte interferencia potencial desde las regiones promotoras en dirección 5'. Debido a que se encontró que el clon del BAC inicial contenía el alelo 2 tanto en el SNP 14 como 15, se escrutaron también los SNP individuales para la actividad transcripcional en este fondo. Los resultados
aquí recogidos utilizaron el plásmido promotor más largo que contenía secuencias en dirección 5' incluyendo SNP 2.

Se anotaron los SNP y se agruparon en forma esquemática con relación a su posición en el gen, cDNA, y la proteína como base para desarrollar una clara estrategia para sondear las diferencias específicas de los alelos en la función génica.

Se identificaron cinco SNP funcionales; B4, B7, B10, B14 y B15, demostrando las diferencias alélicas en la transcripción. Los SNP, B4, B10, B14 y B15 se presentan con elevada frecuencia (>25%) en la población utilizada para el descubrimiento de los SNP; mientras que B7 se encontró sólo en el 2% de los sujetos secuenciados.

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Generación de las construcciones promotoras del gen IL-1B

El promotor de IL-1B humano se amplificó por PCR a partir del clon del BAC RP11-67L14 (IL-1B, BAC PAC Resources, Children's Hospital Oakland Research Institute) utilizando DNA-polimerasa turbo Pfu turbo (Stratagene, CA). Se utilizaron dos conjuntos de cebadores para amplificar el promotor de IL-1B que contenía diferentes extremos 3'. Se utilizaron los cebadores de IL-1BF1 5'cccACGCGTGAGTGAAAGGAATCCCGTTAGAAGT (SEQ ID NO: 33) e IL-1BR2 5'cccACGCGTGCCTGTTGTGCCTTGTGCCTCGAAG (SEQ ID NO: 34) para generar el fragmento promotor de IL-1B, IL-1BS (+32 a -5326) (S = corto; sin el primer exón). Se utilizó IL-1BR1 5'cccACGCGTGGCTGCTTCAGACACCTGTGTA (SEQ ID NO: 35) para generar el fragmento promotor de IL-1BL (+471 a -5326) (L=largo; que contenía el primer exón y SNP 17 (+45)). Los fragmentos promotores de IL-1B amplificados se clonaron en el vector pCRBlunt II-TOPO utilizando el kit de clonación Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen, CA) y a continuación se subclonó en el vector pGL3-Basic (Promega, WI) en dirección a 5' del gen indicador de la luciferasa para generar construcciones parentales con diferentes longitudes de la región promotora. La secuenciación de los clones del DNA del BAC reveló que los SNP en las posiciones 14 y 15 eran los alelos secundarios. Estos SNP se convirtieron secuencialmente en las secuencias de los alelos principales por mutagénesis dirigida al sitio de modo que las construcciones en serie parentales tanto para el plásmido más largo (que contenía los SNP 2-15 utilizando el sitio KpnI justo en dirección 5' del SNP 2) como para un plásmido corto (que contenía la región promotora fuera del sitio BamHI entre los SNP 9 y 10) eran uniformemente el alelo 1 en los 13 SNP (12 en la región flanqueante en 5' y 1 en el primer exón). La mutagénesis dirigida al sitio del SNP individual a las secuencias del alelo 2 se realizó con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange XL (Stratagene, CA). Se confirmó el éxito de la mutagénesis del promotor de IL-1B por análisis de secuenciación y se volvió a clonar en el vector pGL3-Basic original para evitar posibles mutaciones introducidas por la PCR en el vector. El DNA utilizado en la transfección celular fue preparado por el kit EndoFree Plasmid Maxi (Qiagen, CA) para garantizar la mínima contaminación con endotoxinas. Los genotipos de las construcciones de SNP de IL-1B se recogen en la Tabla 6.

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Cultivo celular y Reactivos

La línea de células monocíticas humanas, THP-1, se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC, VA). Las células THP-1 se desarrollaron en un medio RPMI 1640 (ATCC, VA) complementado con suero de bovino fetal al 10% (Hyclone, UT). Las células se subcultivaron cada dos días y se mantuvieron a una densidad celular entre 2 x10^{5} a 7 x 10^{5} células/ml. El lipopolisacárido (LPS; de Escherichia coli 055:B5) y 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) se obtuvieron de Sigma (MO). Anti-NF-\kappaB p50 (11-119) y anti-NF-\kappaB p65(c-20) fueron adquiridos a Santa Cruz Biotechnology, Inc. (CA).

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Transfección de las células y valoración de la actividad indicadora

Antes de la transfección, las células THP-1 se contaron, lavaron y volvieron a poner en suspensión en medio RPMI natural a 1,5-2 x10^{7} células/ml. Para la transfección, se mezclaron 200 ng de construcciones promotoras de pGL-IL1 y 6,25 ng de phRL-TK (Promega, WI) con 750 \mul de RPMI, 50 \mul de TRIS 1 M a pH 7,4, 100 \mul de DEAE-dextrano (2mg/ml) en solución salina tamponada con fosfato y 100 \mul de células THP-1. Las mezclas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Las células se centrifugaron, lavaron, volvieron a poner en suspensión en 0,5 ml de medio de cultivo y se transfirieron a una placa de cultivo de 24 pocillos. Dieciocho a veinticuatro horas después de la transfección, se estimularon las células con 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA, 20 ng/ml) y lipopolisacárido (LPS) durante 6 horas. A continuación se lisaron las células en 100 \mul de tampón de lisis pasivo (Promega, WI). Se analizó el lisado celular (20\mul) para determinar las actividades tanto de la luciferasa de luciérnaga como la de Renilla utilizando el sistema de valoración del indicador dual-luciferasa (Promega, WI). La actividad de la luciferasa se midió con un luminómetro 1450 MicroBeta (Perkin Elmer, MA). La actividad promotora se normalizó a la actividad de la Renilla a partir de phRL-TK transfectado conjuntamente. Cada construcción se transfectó y valoró para determinar por triplicado la actividad promotora y se realizó la transfección para cada construcción al menos tres veces.

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Valoración del desplazamiento de la electromovilidad (abreviadamente EMSA por la expresión inglesa Electromobility Shift Assay)

Se cultivaron células THP-1 como se ha descrito anteriormente y se recolectaron sin tratamiento o se trataron con 100 ng/ml de LPS y 20 ng/ml de PMA durante varios periodos de tiempo. Los extractos nucleares se prepararon según Andrews N.C. y Faller D.V.^{31}. En resumen, las células se volvieron a poner en suspensión en tampón A frío (Hepes-KOH 10 mM, pH 7,9 - MgCl_{2} 1,5 mM - KCl 10 mM - DTT 0,5 mM - AEBSF 2 mM) y se incubaron sobre hielo durante 10 minutos. Los sedimentos nucleares se volvieron a poner en suspensión en tampón C frío (Hepes-KOH 20 mM, pH 7,9 - glicerol al 25% - NaCl 420 mM - MgCl_{2} 1,5 mM -EDTA 0,2 mM -DTT 0,5 mM - AEBSF 2 mM) durante 30 minutes sobre hielo. Después de centrifugación durante 2 minutos a 4ºC, se conservaron los extractos nucleares a -80ºC. Se sintetizaron los oligonucleótidos de cada SNP (MWG Biotech, High Point, NC) y se purificaron en gel de poliacrilamida al 10%. Los oligonucleótidos monocatenarios complementarios se re-asociaron y etiquetaron con \alpha-^{32}P-dGTP por relleno con Klenow (exo-). Para la unión proteína-DNA, se incubaron 7 \mug de extractos nucleares con 5,0 X 10^{4} cpm de sondas marcadas con ^{32}-P durante 20 minutos a la temperatura ambiente en un volumen de 20 \mul de tampón de unión (Hepes-KOH 12 mN, pH 7,9 - MgCl_{2} 1,5 mM - KCl 60 mM - EDTA 0,2 mM - DTT 0,5 mM - AEBSF 0,4 mM - glicerol al 10%) y 2 \mug de Poly (dI-dC) (Sigma, St. Louis, MO). Los complejos proteína-DNA se resolvieron sobre gel de poliacrilamida al 4% y se visualizaron por exposición a películas de rayos X. Para las valoraciones de competición con oligonucleótidos fríos, se incubaron extractos nucleares con una sonda fría durante 10 minutos a la temperatura ambiente antes de la adición de la sonda etiquetada. En las valoraciones del superdesplazamiento de anticuerpos, se añadieron 1-2 \mug de anticuerpo después de la unión de los extractos nucleares a la sonda marcada y se incubó durante 15 minutos a la temperatura ambiente antes de la carga del gel. Las secuencias de oligonucleótidos son las siguientes:

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SNP B4 (-3737)

SNP B4 no mostró diferencias de transcripción por alelo, sobre los fondos de los demás

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SNP incluidos en el alelo 1 (Figura 10).

El análisis EMSA muestra diferencias significativas en la unión de proteínas entre sondas que contienen el alelo 1 y el alelo 2 de SNP B4. (Figuras 15-17) Tanto el alelo 1 como el 2 muestran unión constante de una banda de migración rápida (complejo 3) a las 0, 4, 6 y 24 horas de estimulación con LPS de las células. El alelo 1 muestra una fuerte unión de dos complejos de alta movilidad después de la estimulación con LPS. El complejo 1 consiste en dos bandas próximas entre sí y está presente al comenzar las 4 horas. A las 24 horas, desaparece la banda inferior del complejo 1 y se vuelve evidente el complejo 2 (Figura 15) y la competición con la sonda no marcada demostró la especificidad de la unión (Figura 16). El alelo 2 también se unió al complejo 2 a las 24 horas pero no había pruebas del complejo 1 en cualquiera de estos momentos. Debido a la presencia de un elemento regulador NF-\kappaB próximo a SNP B4, se utilizaron anticuerpos tanto para subunidades p50 como p65 de NF-\kappaB en la incubación de la EMSA de las sondas del alelo-1 y el alelo-2. Como se muestra en la Figura 17, pistas 7 y 8, el anticuerpo p50es capaz de superdesplazar ambas bandas del complejo 1 y el anticuerpo p65 es capaz de super-desplazar sólo la banda superior del complejo 1. Este resultado indica que NF-\kappaB estimulado por LPS/PMA se une preferiblemente al alelo 1 de SNP B4.

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SNP B10 (-1468)

En la construcción de fondo con los demás SNP situados en el alelo 1, A) la presencia del alelo 2 en SNP 1310 produjo una actividad transcripcional ligeramente menor. (Véase la Figura 11).

El análisis EMSA con sondas que contenían el alelo-1 y el alelo-2 de SNP10 demostró claras diferencias en los perfiles de unión de las proteínas (Figura 18-19) con el alelo 2 de SNP B 10 que se unía a un grupo de proteínas de alta movilidad (HMG) (complejo 1) más fuertemente que el alelo 2. La competición con una sonda no marcada mostró que esta fuerte preferencia de unión era específica del alelo (Figura 19).

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SNP B14 (-511)

Los resultados del análisis transcripcional para efectos individuales de diversos alelos sólo en SNP 14 se incluyen en la Figura 12. En las construcciones de fondo en las que los demás SNP son el alelo 1 (Fig. 20), SNP B14 se convirtió en el alelo 2 (Fig. 20) y mostró una actividad promotora mayor.

La EMSA con sondas que contenían variantes alélicas de SNP 14 mostró 2 complejos distintos formados con esta sonda pero sin diferencias alélicas en la movilidad de complejos proteinicos. (Figura 20). Sin embargo, la actividad promotora potenciada por el alelo 2 de SNP 14 indica que puede haber diferencias sutiles en las composiciones de las proteínas entre los dos complejos unidos a elementos reguladores que rodean el alelo 1 y 2 del SNP 14 lo que conduce al impacto funcional en la actividad transcripcional.

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SNP 15 (-31)

El efecto de variación alélica sólo en SNP B15 en la actividad transcripcional está también incluido en las Figuras 21-22. Con la conversión de SNP B15 en el alelo 2 (Figura 21), se produjo una reducción significativa de la actividad promotora en comparación con la construcción base (Figura 21).

El perfil proteínico en EMSA de SNP B15 es notablemente diferente para las sondas del alelo-1 (T) que para las del alelo-2 (C) (Figura 22). Como se muestra en la Figura 22, se formaron dos bandas intensas con la sonda del alelo 1 mientras que se formaron 3 bandas distintas con el alelo 2. Se realizó una valoración de competición en frío para determinar la especificidad de la unión de las proteínas a estas sondas alélicas (Figura 22) y se indicó que la unión proteínica del complejo 1 es muy específica para el alelo 2, mientras que los complejos II y III tienen mayor afinidad para el alelo 1.

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Ejemplo 10 Determinación de la gravedad de la periodontitis en sujetos que tenían genotipos de IL-1B

Una indicación de la gravedad de la periodontitis en un sujeto es la profundidad de las cavidades (abreviadamente PD por la expresión ingles pocket depth). Se clasifica periodontitis grave en un sujeto que tiene una PD>2 en una o más cavidades en las encías. La PD se midió en sujetos que tenían diversos genotipos de IL-1B como se muestra en la Tabla 10A (por ejemplo, un sujeto con el genotipo BP1 tiene dos alelos del alelo 1 de IL-1B (-511), dos alelos del alelo 1 de IL-1B (-1468) y dos alelos del alelo 2 de IL-1B (-3737). La Tabla 10B muestra la distribución en porcentaje de los haplotipos de IL-1B en sujetos con grados variables de periodontitis, medidos por el número de cavidades en las encías por sujeto (menos de 2 cavidades, entre 2 y 4 cavidades, entre 4 y 10 cavidades, más de 10 cavidades).

TABLA 10A

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TABLA 10B

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Como se muestra en la Tabla 10B y en la Figura 23, los sujetos que tienen los genotipos BP1, BP3 o BP4 tienen mayor probabilidad de desarrollar periodontitis grave, mientras que los sujetos que tienen el genotipo BP2 tienen menor probabilidad de desarrollar periodontitis grave.

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Ejemplo 11 Determinación de la gravedad de la periodontitis en poblaciones étnicas

Anteriormente, en múltiples estudios se asociaron en hombres de raza blanca las variaciones específicas de los genes de IL-1 (IL-1A(+4845), IL-1A(-889) e IL-1B(+3954)) con el aumento de la gravedad de la periodontitis. Estos SNP de IL-1 son de baja prevalencia en las poblaciones asiáticas que han sido estudiadas, que incluyen japoneses, coreanos y chinos. Puesto que la prevalencia de un polimorfismo y su penetración con relación a la expresión de la enfermedad afecta el tamaño de la muestra necesario para identificar la asociación entre el alelo de interés y la expresión de la enfermedad, la mayor parte de los estudios anteriores en poblaciones asiáticas han sido demasiado pequeños para evaluar fielmente si IL-1A(+4845) e IL-1B(+3954) están asociados a la periodontopatía. Este ejemplo detalla las variaciones específicas de los genes de IL-1 que predicen la periodontitis más grave en adultos japoneses. Esto se realizó analizando los haplotipos en las agrupaciones de genes de IL-1 para determinar las variaciones genéticas asociadas a la varianza clínica en la periodontitis, utilizando la cartografía de SNP de elevada densidad de todos los exones y regiones reguladoras de los genes para IL-1\alpha (IL-1A), IL-1\beta (IL-1B) y el gen para el antagonista receptor IL-1 (IL-1RN), que abarca la agrupación de nueve genes de IL-1 en el cromosoma 2q13-14.

Existen varios haplotipos predominantes de IL-1 que se definen por seis SNP. De los 64 haplotipos posibles, 23 haplotipos constituyen más del 98% de los haplotipos en la raza blanca y afroamericana. Los mismos haplotipos constituyen más del 97% de los haplotipos observados en pacientes japoneses. (Véase la Tabla 11A). Los haplotipos que contienen el alelo 2 en IL-1RN(+2018) sólo representan el 3,7% de los haplotipos, lo que produciría un índice esperado de individuos homocigóticos en dicho locus de aproximadamente 1/1000 sujetos. El alelo 2 en IL-1A(+4845) y en IL-1B(+3954) era también tan poco frecuente que sólo se esperaría que aproximadamente 1/100 individuos fueran homocigóticos en dicho locus. Los haplotipos se estimaron utilizando el programa haplo.score versión 1.0 (Schaid et al, 2002). Este programa informático aplica una versión del algoritmo EM (Excoffier and Slatkin, 1995) para valorar correctamente la ambigüedad de fase.

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Se ha identificado tres SNP en el promotor de IL-1B que son funcionales y altamente prevalentes en sujetos japoneses. Estos SNP incluyen IL-1B (-511), IL-1B (-1468) e IL-1B (-3737). La Figura 24 muestra la distribución de las frecuencias relativas en los haplotipos de los alelos recogidos en la Tabla 11A en sujetos de raza blanca y japoneses. Los autores de la presente invención han determinado que los haplotipos predominantes, basados en estos 3 SNP, muestran diferencias significativas en los niveles de IL-1\beta en el fluido gingival (GCF). La Figura 25 demuestra que los sujetos de raza blanca que tienen el genotipo H1 o H3 presentan mayor inflamación, medida en comparación con los demás haplotipos utilizando una estadística de puntuación. Una estadística de puntuación es una estadística utilizada para evaluar el significado estadístico de estimaciones paramétricas calculadas por métodos de probabilidad máxima. También se denomina algunas veces estadística de puntuación eficaz. El ensayo se basa en el comportamiento de la función de probabilidad logarítmica en el punto en el que la estimación paramétrica respectiva es igual a 0,0 (cero); específicamente, se usa la derivada (pendiente) de la función de probabilidad logarítmica evaluada en el valor de hipótesis nula del parámetro (parámetro = 0,0).

En sujetos de etnia japonesa, se ha determinado que la predisposición a la periodontopatía y la gravedad de dicha enfermedad están afectadas por el haplotipo de IL-1.

Un método para medir la periodontopatía utiliza el ensayo generalizado de hemorragia por sondamiento (en inglés Bleeding on Probing (BOP). Como se muestra en la Figura 26, los sujetos japoneses que tienen un genotipo que es homocigótico en el alelo 2 de IL-1B (-511), homocigótico en el alelo 2 de IL-1B (-1468) y homocigótico en el alelo 1 de IL-1B (-373) tienen menor riesgo de periodontitis medido por el ensayo generalizado de BOP. Esta disminución del riesgo se observa en dos aumentos diferentes en porcentaje en las superficies cubiertas de placa.

Otro método para medir la periodontopatía que permite obtener la asociación entre haplotipos específicos de IL-1 y la gravedad de la periodontitis implica la medida de la profundidad del sondeo y el nivel de acoplamiento de la sonda de un sujeto. Estas medidas se realizan a individuos, cuyos haplotipos están identificados, y se determinan el porcentaje medio de los sitios medidos que tengan una profundidad de sondeo mayor que 4 mm o el nivel de acoplamiento de la sonda mayor o igual a 4 mm. Como se muestra en la Figura 27, los sujetos japoneses que tienen un haplotipo H1, H3 o H4 de IL-1 presentan una mayor gravedad de la periodontitis en comparación con sujetos que tienen un haplotipo H2, medido por estos métodos.

Claims

1. Un método para predecir la sensibilidad de un sujeto humano a la periodontopatía, que comprende la etapa de identificar en una muestra de DNA genómico del sujeto un modelo alélico que comprende una de las siguientes series de alelos de IL-1B:

(1): alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 2 (-3737);

(2): alelo 2 (-511), alelo 2 (-1468) y alelo 1 (-3737);

(3): alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737); o

(4): alelo 2 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737),

en donde la presencia de uno cualquiera de los modelos alélicos 1, 3 o 4 indica que dicho sujeto tiene mayor sensibilidad a la periodontopatía y en donde la presencia del modelo alélico 2 indica que el sujeto tiene menor sensibilidad a la periodontopatía.

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2. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto es homocigótico para cada uno de los alelos en el modelo alélico.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho sujeto es de etnia asiática.