ES2356181T3 - Construcción de apolipoproteínas. - Google Patents

Abstract

Una construcción de apolipoproteínas para uso como un medicamento que tiene la fórmula general apo-A-X, - en la que apo-A es un componente de apolipoproteína seleccionado entre el grupo que consiste en apolipoproteína Al, apolipoproteína AII, apolipoproteína AIV, un análogo, o su variante que comparte al menos 70 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NO 15: y y (i) X es una proteína heteróloga que comprende más de 200 aminoácidos, con la condición que cuando la construcción consiste en exactamente dos apolipoproteínas nativas idénticas están ligadas C-terminal a N-terminal, o (ii) X es un resto heterólogo que es un módulo de oligomerización, en la que la construcción tiene un incremento de semivida en plasma comparada con la apolipoproteína de tipo salvaje; y en la que el análogo o variante es capaz de provocar la misma respuesta fisiológica que la apolipoproteína-A-I, A-II o A-IV.

Description

La invención se refiere a una construcción de apolipoproteínas, una construcción de apolipoproteínas para uso como un medicamento, una secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción de apolipoproteínas, un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico, un procedimiento para producir la construcción de apolipoproteínas, una composición farmacéutica que comprende la construcción de apolipoproteínas, y uso de la 5 construcción de apolipoproteínas para la preparación de una composición farmacéutica.

Técnica anterior

En lo siguiente, el término Apo A o apolipoproteína A se usará para designar cualquiera de las tres apolipoproteínas, Apolipoproteína A 1. Apolipoproteína A 11, o Apolipoproteína A IV.

Las enfermedades cardiovasculares provocadas por aterosclerosis en los vasos es la causa más 10 frecuente de muerte en los países industrializados del mundo. Uno de los factores patogénicos que provocan aterosclerosis es la deposición de colesterol en las paredes de los vasos que conducen a la formación de placas y eventualmente a arterosclerosis y un aumento de riesgo de infarto.

Apolipoproteína A-1 (apo-A-1) es el principal componente de HDL (lipoproteína de alta densidad) en plasma, que está correlacionada de forma negativa con la presencia de arterosclerosis. Existe una fuerte evidencia 15 experimental de que este efecto está provocado por el llamado transporte inversos de colesterol desde los tejidos periféricos al hígado. Existe evidencia experimental de que el transporte inverso de colesterol se puede estimular en mamíferos mediante inyección de apo-A-1.

Apolipoproteína A-1 se elimina rápidamente del plasma. Se cree que Apo-A-1 se retira hasta un gran cantidad del plasma mediante filtración en los riñones sin descomponerse primero (Braschi et al 1999, J Lipid Res, 20 40: 522 - 532; Braschi et al 2000, Biochemistry, 39: 5441 - 5449; Glass et al 1983, J Biol Chem 258:7161-7167). La corta semivida en plasma de apolipoproteína A es una restricción contra el uso de la proteína en el tratamiento de aterosclerosis.

Los documentos US 5.876.968 WO9312143 (SIRTORI ET AL.) se refiere sustancialmente a dímeros puros de una variante de apo-A-1 llamada apolipoproteína A-1-Milano. Los medicamentos que contienen el dímero 25 se pueden usar para prevenir trombosis o se pueden usar como un profármaco para el monómero. Una característica específica de esta variante particular de apo-A-I is es su capacidad para formar dímeros covalentes con ellos mismos. Los autores especularon que la presencia de Apo A-I-M puede ser responsable de una semivida en plasma prolongada, pero no se han presentado datos concluyentes.

El documento US 5.643.757 (SHA-IL ET AL.) desvela un procedimiento para la producción de, 30 apolipoproteína A-I humana estable, madura y biológicamente activa con alto rendimiento.

El documento US 5.990.081 (AGELAND ET AL.) desvela un procedimiento para el tratamiento de arterosclerosis o enfermedades cardiovasculares mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de apolipoproteína A o apolipoproteína E.

El documento WO 96/37608 (RHONE-POULENC ROHRER ET AL.) desvela dímeros homólogos humanos 35 de variantes de apolipoproteína A-I que comprenden cisteína en la posición 151. La presencia del resto de cisteína en la secuencia de aminoácidos permite la formación de dímeros mediarte puentes disulfuro entre los monómeros. La referencia además desvela las secuencias de secuencias de ácido nucleico y vectores correspondientes que comprende éstas así como las composiciones farmacéuticas que comprende las variantes y el uso de éstas en la terapia génica. 40

El documento WO 90/12879 (Sirtori et al) y documento WO 94/13819 (Kabi Pharmacia) desvelan los procedimientos para la preparación de ApoA-1 y ApoA-IM en levadura y E. coli respectivamente. Los documentos también desvelan el uso de ApoA-1 y ApoA-IM como un medicamento para el tratamiento de aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.

En conclusión la técnica anterior se refiere principalmente al uso de monómero ApoA-1 nativa o monómero 45 de ApoA-IM o dímero de ApoA-IM como medicamentos para el tratamiento de enfermedades vasculares, a pesar de las desventajas conocidas de estas proteínas (principalmente eliminación rápida). La técnica anterior no sugiere modificar ApoA-1 con el fin de obtener construcciones con una capacidad incrementada para realizar el transporte inverso de colesterol y / o con semivida más larga en plasma. Es un objeto de la presente invención proporcionar tales construcciones de ApoA, que se pueden usar para el tratamiento y / o prevención de enfermedades 50 cardiovasculares.

Sumario

En un primer aspecto la invención se refiere a una construcción de apolipoproteínas para uso como un medicamento que tiene la fórmula general

- apo A-X,

- en la que apo A es un componente de apolipoproteína A seleccionado entre el grupo constituido por apolipoproteína Al, apolipoproteína AII, apolipoproteína AIV, un su análogo o una de sus variantes, 5

- y X es un resto heterólogo que comprende al menos un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por un aminoácido, un péptido, una proteína, un carbohidrato, y una secuencia de ácido nucleico,

- con la condición de que cuando la construcción consta de dos, apolipoproteínas nativas exactamente idénticas y éstas están unidas en serie. 10

Mediante la invención se proporciona una construcción novedosa para uso como un medicamento. La técnica anterior falla para enseñar una construcción de apolipoproteína como se define en la presente invención para uso médico. Las construcciones de apolipoproteínas de acuerdo con la presente invención se pueden considerar de manera amplia como análogos de HDL debido a su capacidad de formar complejos con colesterol y otros lípidos u ayuda en el transporte de estos compuestos al hígado. 15

A lo largo de toda la invención el componente o parte de la construcción de apolipoproteína se denomina apo A o apolipoproteína. En lo siguiente y en las reivindicaciones, el resto heterólogo se denomina componente X de la construcción. La apolipoproteína o su análogo o variante está unido de forma covalente al resto heterólogo.

El componente X de la construcción se puede considerar de manera amplia como un resto heterólogo. En este contexto un resto heterólogo es cualquier tipo de resto que no está unido a apolipoproteína o un análogo o 20 una de sus variantes o equivalentes funcionales en condiciones nativas. El resto heterólogo de este modo puede ser un péptido o una proteína o parte de un péptido o proteína de la misma o de otras especies, o incluso un único aminoácido. Puede ser un péptido sintético. Puede ser de naturaleza carbohidrato o de otra naturaleza polimérica y biocompatible tal como polioles, secuencias de ácidos nucleicos.

La equivalencia funcional con apolipoproteína nativa A-I, A-II o A-IV se puede medir de manera 25 conveniente usando un ensayo de unión de lípido. La capacidad de la construcción para provocar sustancialmente la misma respuesta fisiológica en un mamífero se puede medir de manera conveniente midiendo la capacidad de realizar transporte de colesterol inverso en un organismo de ensayo tales como conejos o roedores tales como ratones.

La construcción que comprende apolipoproteína y un resto heterólogo es capaz de realizar transporte de 30 colesterol inverso también o incluso que las apolipoproteínas nativas, a pesar de la modificación provocada por la adición de un resto heterólogo. La semivida en plasma de la construcción está incrementada de preferencia comparada con la de la apolipoproteína de tipo salvaje. El aumento de semivida se puede deber o bien al incremento de tamaño de la construcción de apolipoproteínas, que puede reducir la velocidad de filtración a través de los riñones, se puede deber a un incremento en la unión a HDL, o se puede deber a la reducción de la 35 descomposición de la construcción comparado con Apo A nativa.

De preferencia la semivida en plasma es al menos doble o triple, o al menos cuádruple, o al menos doble. De manera similar, la afinidad de unión tal como la afinidad de unión a lípido, y / o la afinidad de unión a colesterol de la construcción está aumentada de preferencia comparada con la apolipoproteína de tipo salvaje. De preferencia, la afinidad de unión a lípido se incrementa en al menos 5 %, tal como al menos 10 %, por ejemplo al 40 menos 15%, tal como al menos 20%, por ejemplo al menos 25%, tal como al menos 30%, por ejemplo al menos 40% tal como al menos 50%, por ejemplo al menos 75%, tal como al menos 100%, tal como al menos 150%, por ejemplo al menos 200%, tal como al menos 300%. Incluso en los casos donde la afinidad de unión a lípido de las construcciones de acuerdo con la invención es la misma o inferior que la afinidad de unión a lípido de apolipoproteína nativa, el efecto clínico se puede potenciar debido al incremento de la semivida en plasma de las 45 construcciones de acuerdo con la invención.

Un incremento de la semivida en plasma y / o incremento de la afinidad de unión a lípido tienen implicaciones profundas para el uso de las construcciones de apolipoproteínas en el tratamiento de arterosclerosis. Por lo tanto se espera que el efecto clínico de las construcciones de apolipoproteínas de acuerdo con la invención sea superior al efecto de las apolipoproteínas de tipo salvaje. 50

La invención también abarca análogos o variantes de apolipoproteínas de tipo salvaje capaces de

provocar sustancialmente la misma respuesta fisiológica en un mamífero.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una construcción de apolipoproteínas que tiene la fórmula general

- apo A-X,

- en la que apo A es componente de apolipoproteína seleccionado entre el grupo constituido por 5 apolipoproteína Al, apolipoproteína AII, apolipoproteína AIV, su análogo o variante,

y X es un resto heterólogo seleccionado entre el grupo constituido por un módulo de oligomerización, y una apolipoproteína unida terminalmente

De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una construcción de apolipoproteínas como se ha definido anteriormente. De preferencia la secuencia de nucleótidos 10 está unida de manera operativa a una secuencia reguladora para la expresión de la construcción de proteínas.

De acuerdo con aspectos adicionales de la invención, se proporciona un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la construcción de apolipoproteínas y una célula huésped transformada que comprende la secuencia de nucleótidos como se ha definido anteriormente.

La construcción de apolipoproteínas de acuerdo con la invención se puede producir mediante diferentes 15 procedimientos.

De acuerdo con un primer procedimiento una célula huésped transformada se cultiva en condiciones que promueven la expresión de una la construcción de proteína de acuerdo con la invención codificada por ADN insertado en una construcción, obteniendo y recuperando la construcción de proteína y opcionalmente procesando además la construcción de proteína. 20

Este procedimiento es el procedimiento preferido cuando la construcción completa es de naturaleza polipeptídica y de esta manera puede estar codificada por una secuencia de ácido nucleico correspondiente.

De acuerdo con un segundo procedimiento la construcción de apolipoproteínas se puede fabricar mediante síntesis química del resto heterólogo y uniéndolo posteriormente a la apolipoproteína o análogo obteniendo una construcción de apolipoproteínas, que se aísla y opcionalmente se procesa después. Este 25 procedimiento es el procedimiento preferido, cuando el resto heterólogo es de naturaleza no peptídica. Sin embargo, también pueden existir condiciones en las que se prefiere sintetizar el resto heterólogo químicamente, cuando es de naturaleza polipeptídica. Tales condiciones pueden ser que el resto heterólogo sea más bien corto tal como inferior a 20 aminoácidos.

De acuerdo con un tercer procedimiento la construcción de apolipoproteínas se puede fabricar mediante 30 cultivo de una célula huésped transformada en condiciones que promocionan la expresión de una apolipoproteína o un análogo de apolipoproteína codificado por un fragmento de ácido nucleico y posteriormente unión covalente de la apolipoproteína o análogo de apolipoproteína a un resto heterólogo obteniendo una construcción de apolipoproteínas, aislamiento de la construcción de apolipoproteínas resultante y opcionalmente después procesamiento de la construcción. 35

Finalmente, la construcción de apolipoproteínas se puede producir mediante cultivo de una célula huésped transformada en condiciones que promueven la expresión de una proteína codificada por un fragmento de ácido nucleico que codifica un módulo de oligomerización y posteriormente unión de dicho módulo a al menos una apolipoproteína obteniendo una construcción de apolipoproteínas.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición farmacéutica que 40 comprende la construcción de apolipoproteínas como se ha descrito anteriormente. De preferencia la composición farmacéutica es capaz de administrarse por vía parenteral tal como mediante inyección.

La invención también abarca el uso de una construcción de apolipoproteínas como se ha definido anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede además comprender excipientes, adyuvantes, aditivos, farmacéuticamente aceptables tal como lípidos, fosfolípidos, 45 colesterol, o triglicéridos.

La composición farmacéutica se puede administrar por vía intravenosa, intra-arterial, intramuscular, transdérmica, pulmonar, subcutánea, intradérmica, intratecal, a través del tejido bucal-, anal-, vaginal-, conjuntivo-, o intranasal, o mediante inoculación en el tejido, tal como tejido tumoral, o mediante implante, o vía oral.

La construcción de apolipoproteínas como se ha definido anteriormente también se puede usar para 50

terapia génica, en la que la secuencia de ADN que codifica la construcción de apolipoproteínas se usa para la transfección o infección de al menos una población celular.

Descripción detallada de la invención

A continuación la invención se describirá en detalle con referencia a las siguientes figuras.

Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos (en código de una letra) de apolipoproteína A-1 humana. 5

Figura 2A muestra la alineación de secuencia múltiple CLUSTALW (1.74) de apolipoproteína A-I usando BLOSUM. Las siguientes secuencias se alinean en la Figura:

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) HUMANA spIP02647IAPA1_HUMANA - Homo sapiens (Humano)

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de Macaco spIP15568IAPA1_MACFA - Macaca fascicularis (macaco comedor de cangrejos). 10

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de bovinos spIP15497IAPA1_BOVINA - Bos taurus (Bovino).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de cerdo sp|P18648|APA1_PIG - Sus scrofa (Pig).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de perro spIP02648IAPA1_CANFA - Canis familiaris (perro).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de conejo spIP09809IAPA1_RABIT - Oryctolagus cuniculus (Conejo).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de Tupaya spl018759|APA1_TUPGB - Tupaia glis belangeri (tupaya 15 común).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de ratón spIQ00623IAPA1_MOUSE - Mus musculus (Ratón).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de rata spIP04639IAPA1_RAT - Rattus norvegicus (Rata).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de erizo común trlQ9TS49, APOA-I=TRANSPORTADOR DE COLESTEROL– Erinaceus europaeus (Erizo común). 20

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de pollo spIP08250IAPA1_CHICK - Gallus gallus (Pollo).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de codorniz japónica spl P32918|APA1_COTJA - Coturnix coturnix japonica (Codorniz japónica).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de pato doméstico splO42296|APA1_ANAPL - Anas platyrhynchos (pato doméstico). 25

Precursor de Apolipoproteína A-I-1 (Apo-AI-1) de trucha arcoiris sp|O57523|AP11_ONCMY (APOA-I-1) - Oncorhynchus mykiss (trucha arcoiris) (Salmo gairdneri).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) splQ91488|APA1_SALTR de la trucha común - Salmo trutta (Trucha común).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de salmón atlántico spIP27007IAPA1_SALSA - Salmo salar (Salmón 30 atlántico).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de pez cebra splO42363|APA1_BRARE - Brachydanio rerio (pez cebra) (Zebra danio).

Precursor de Apolipoproteína A-I (Apo-AI) de dorada spIO42175IAPA1_SPAAU) - Sparus aurata (Dorada).

Figura 2B muestra secuencias de aminoácidos alineadas (en código de una letra) para apolipoproteína A-IV de 35 seres humanos, macaco, ratón, mandril, cerdo, y rata.

Figura 3: Secuencia de Aminoácidos de la región amino terminal de tetranectina (SEQ ID NO 12). Secuencia de aminoácidos (en código de una letra) de El a L51 de tetranectina. Exón 1 comprende restos El a D16 y restos exón 2 V17 a V49, respectivamente. La hélice alfa se extiende más allá de L51 a K52 que es el resto de aminoácido C-terminal en la hélice alfa. 40

Figura 4 muestra una alineación de la secuencias de aminoácidos del elemento estructural de trimerización de la familia de proteínas de tetranectina. Las secuencias de aminoácidos (código de una letra) que corresponde al resto V17 a K52 que comprende exón 2 y los primeros tres restos de exón 3 de tetranectina humana; tetranectina murina

(Sørensen et al., Gene, 152: 243 - 245, 1995); proteína de homólogo de tetranectina aislado de cartílago de tiburón de arrecife (Neame y Boynton, 1992,1996); y proteína homóloga de tetranectina aislado de cartílago de bovinos (Neame y Boynton, número de acceso de la base de datos PATCHX:u22298). Restos en las posiciones a y d en las siete repeticiones se enumeran en negrita. La secuencia de consenso enumerada del elemento estructural de trimerización de la familia de la proteína de tetranectina comprende los restos presentes en las posiciones a y d 5 en las siete repeticiones mostradas en la figura además de los otros restos conservados de la región. "hy" denota un resto hidrófobo alifático.

Figura 5 muestra el plásmido de pT7 H6UbiFx Apo A-I y sus secuencias de aminoácidos correspondientes. El polipéptido expresado y procesado consta de los aminoácidos no 25 - 267 de Apo A-I (SEQ ID NO 1) humana y gly-gly unidos de manera N-terminal a ella. 10

Figura 6 muestra el plásmido pT7 H6UbiFx Cys-Apo A-I y sus correspondientes secuencias de aminoácidos. El polipéptido expresado y procesado consta de un resto cisteína N-terminal y los aminoácidos no 25 - 267 de Apo A-I (SEQ ID NO 2) humana y gly-gly unidas de forma N-terminal a ella.

Figura 7 muestra el plásmido pT7H6 Trip-A-Apo A-I- AmpR y su correspondiente secuencia de aminoácidos. El polipéptido expresado y procesado (SEQ ID NO 3) consta del TTSE, una secuencia de enlace, y los aminoácidos no 15 25 - 267 de Apo A-1 humana.

Figura 8 muestra el plásmido pT7H6 Trip-A-Apo A-I-del 43 - AmpR y su correspondiente secuencia de aminoácidos. El polipéptido expresado y procesado (SEQ ID NO 4) consta del TTSE, una secuencia de enlace, y los aminoácidos no 68 - 267 de Apo A-1 humana.

Figura 9 muestra el plásmido pT7H6FXCysApoAI y su correspondiente secuencia de aminoácidos. El polipéptido 20 expresado y procesado consta de un ersto de cisteína N-terminal y los aminoácidos no 25 - 267 de Apo AI (SEQ ID NO 2) humana y gly-gly unidos de manera N- terminal a ella.

Figura 10 A a G muestra ejemplos ilustrativos de plásmidos y correspondientes secuencias de aminoácidos para construcciones de apolipoproteína de acuerdo con la presente invención.

Fig 10 A: pT7H6-Trip-A-Apo Al K9A K15A: Corresponde a pT7H6-Trip-A-Apo Al pero se han mutado dos restos de 25 Lisina en la región de trimerización para eliminar la afinidad de heparina. El producto de proteína madura se denomina Trip-A-Al K9A,K15A (SEQ ID NO 5).

Fig 10 B: pT7H6 Trip-A-FN-Apo Al: Corresponde a pT7H6-Trip-A-Apo Al, sin embargo, bases que codifican la secuencia de aminoácidos SGH se ha insertado después de la secuencia Trip A y antes de la secuencia apo Al. El producto de proteína madura se llama Trip-A-FN-AI (SEQ ID NO 6). 30

Fig 10 C: pT7H6 Trip-A-FN-Apo Al-final: Corresponde a pT7H6 Trip-A-FN-Apo Al, sin embargo, el sitio BamHI de pTlH6 Trip-A-FN-Apo Al se ha eliminado y la secuencia de tres aminoácidos insertada se ha cambiado, de manera que la secuencia de aminoácidos entre la secuencia de trimarización derivada de tetranectina y apo Al se ha cambiado de GSSGH a GTSGQ. La secuencia de cinco aminoácidos corresponde a una secuencia en la región de engarce de fibronectina. El producto de proteína madura se llama Trip-A-FN-AI-final (SEQ ID NO 7). 35

Fig 10 D: pT7H6 Trip-A-FN-Apo Al-final K9AK15A: Corresponde a pT7H6-Trip-A-FN-Apo Al-final pero dos restos de Lisina en la región de trimerización se ha mutado para eliminar la afinidad a heparina. El producto de proteína madura se llama Trip-A-FN-AI-final-K9A,K15A (SEQ ID NO 8).

Fig 10 E: pT7H6 Trip-A-TN-Apo Al: Corresponde a pT7H6-Trip-A-Apo Al, sin embargo, las bases que codifican la secuencia de aminoácidos KVHMK se ha insertado después de la secuencia Trip A y antes de la secuencia apo Al. 40 El producto de proteína madura se llama Trip-A-TN-AI (SEQ ID NO 9).

Fig 10 F: pT7H6 Trip-A-TN-Apo Al-final: Corresponde a pTlH6 Trip-A-TN-Apo Al, sin embargo, el sitio BamHI de pT7H6 Trip-A-TN-Apo Al se ha eliminado de manera que la secuencia de aminoácidos entre la secuencia de trimerización derivada de tetranectina y apo Al se ha cambiado de GSKVHMK a GTKVHMK. La secuencia de siete aminoácidos corresponde a la secuencia de tetranectina siguiente al dominio de trimerización. El producto de 45 proteína madura se llama Trip-A-TN-AI-final (SEQ ID NO 10).

Fig 10 G: pT7H6 Trip-A-TN-Apo Al-final K9AK15A: Corresponde a pT7H6-Trip-A-TN-Apo Al-final pero dos restos de lisina en la región de trimerización se han mutado para eliminar la afinidad a heparina. El producto de proteína madura se llama Trip-A-TN-AI-final-K9A,K15A (SEQ ID NO 11).

Fig 10 H: pT7H6Fx-Hp(alfa)-ApoAI. El plásmido codifica la proteína de fusión entre Hp(alfa) y ApoAI. El producto de 50 proteína madura se llama Hp(alfa)-ApoAI (SEQ ID NO 14).

Figura 11 muestra el resultado de unión de ApoA-I, TripA-ApoA-I, y TripA-FN-ApoA-1 a DMPC en el ensayo descrito en el Ejemplo 6.

Figura 12 muestra la unión de ApoA-1 y TripA-ApoA-1 a cubilina inmovilizada como se describe en el Ejemplo 7.

Figura 13 muestra filtración de gel analítica de Apo A-I, Trip-A-AI, Trip-A-TN-AI, Trip-A-FN-AI. Como controles se incluyó BSA. Los detalles de desvelan en el Ejemplo 5. 5

Figura 14 muestra los resultados de la evaluación de eliminación en plasma de apolipoproteína A-I, TripA Apo-AI, y TripA-fibronectina-engarce Apo A-I en ratones. Los detalles experimentales se pueden encontrar en el Ejemplo 8.

Descripción detallada de la invención

La funcionalidad de las construcciones de acuerdo con la invención y de los componentes apo-A de las construcciones se puede medir mediante ensayo de unión de lípidos tal como mediante el ensayo de DPMC 10 descrito más adelante. además, el efecto in vivo en el transporte de colesterol inverso se puede medir mediante la administración a animales de ensayo tales como conejos alimentados con una dieta rica en colesterol tal como el procedimiento descrito en Miyazaki et al (Arteriosclerosis, Trombosis, and Vascular Biology, 1995; 15: 55 1882 - 1888) o en ratones deficientes en Apo E (Sha PK et al, Circulation 2001, 103: 3047 - 3050).

La apolipoproteína o análogo 15

A continuación el término "apo-A" se usa para designar cualquier apolipoproteína A que comprende apolipoproteína A-I, apolipoproteína A-II o apolipoproteína A-IV, cualquier variante o análogo de la misma que posee la misma función de unión de lípidos.

Los análogos de apolipoproteína A-I preferidos incluyen los descritos en la Figura 2A. Los análogos de apolipoproteína A-IV preferidos incluyen los descritos en la Figura 2B. 20

Las variantes de las secuencias conocidas de Apo-AI humana en la Figura 1 incluyen las siguientes variantes, indicando la posición de la variación con respecto a la secuencia en la Figura 1, la variación, y cuando sea apropiado el nombre de la variante conocida.

27 P -> H (EN MUNSTER-3C).

27 P -> R. 25

28 P -> R (EN MUNSTER-3B).

34 R -> L (EN BALTIMORE).

50 G -> R (EN IOWA).

84 L -> R (EN AMILOIDOSIS AUTOSÓMICA DOMINANTE).

113 D -> E. 30

119 A-> D (EN HITA).

127 D -> N (EN MUNSTER-3A).

131 MISSING (EN MARBURG/MUNSTER-2).

131 K-> M.

132 W -> R (EN TSUSHIMA). 35

133 E -> K (EN FUKUOKA).

151 R->C (PARIS)

160 E->K (EN NORUEGA).

163 E -> G.

167 P -> R (EN GIESSEN). 40

168 L -> R (EN ZARAGOZA).

171 E->V.

189 P -> R.

197 R -> C (EN MILÁN).

222 E -> K (EN MUNSTER-4).

De acuerdo con la invención el término "apolipoproteína" significa que incluye equivalentes funcionales de 5 al menos una secuencia en la Figura 1, 2a y 2b, o un fragmento de al menos una secuencia en la Figura 1, 2a y 2b, que comprende una secuencia de aminoácidos predeterminada. Un "fragmento" se define como:

i) fragmentos que comprenden una secuencia de aminoácidos capaz de ser reconocida por un anticuerpo también capaz de reconocer las secuencias de aminoácidos predeterminadas en la Figura 1, 2a o 2b, y / o

ii) fragmentos que comprende una secuencia de aminoácidos capaz de unirse a un lípido tal como dimiristoil 10 fosfatidil colina o colesterol, y / o a receptor, que también es capaz de unirse a secuencias de aminoácidos predeterminadas en la Figura 1, 2a o 2b.

De acuerdo con la presente invención un equivalente funcional de una apolipoproteína o sus fragmentos se pueden obtener mediante la adición, sustitución o supresión de al menos un aminoácido. Cuando la secuencia de aminoácidos comprende una sustitución de un aminoácido por otro, tal sustitución puede ser una sustitución de 15 aminoácido conservadora. Fragmentos de las secuencias en la Figura 1, 2a y 2b puede comprender más de una de tales sustituciones, tal como por ejemplo, dos sustituciones de aminoácido conservadoras, por ejemplo tres o cuatro sustituciones de aminoácido conservadoras, tal como cinco o seis sustituciones de aminoácido conservadoras, por ejemplo siete u ocho sustituciones de aminoácido conservadoras, tal como entre 10 y 15 sustituciones de aminoácido conservadoras, por ejemplo entre 15 y 25 sustituciones de aminoácido conservadoras, tal como entre 20 25 y 75 sustituciones de aminoácido conservadoras, por ejemplo entre 75 y 125 sustituciones de aminoácido conservadoras, tal como entre 125 y 175 sustituciones de aminoácido conservadoras. Las sustituciones se pueden realizar dentro de uno cualquiera o más grupos de aminoácidos predeterminados.

Los ejemplos de fragmentos que comprenden una o más sustituciones de aminoácido conservadoras incluyendo una o más sustituciones de aminoácido conservadoras dentro del mismo grupo de aminoácidos 25 predeterminados, o una pluralidad de sustituciones de aminoácido conservadoras, en las que cada sustitución conservadora se genera por la sustitución dentro de un grupo diferente de aminoácidos predeterminados.

De acuerdo con lo anterior, una variante de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos de acuerdo con la invención puede comprender, dentro de las misma variante de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos o entre variante diferente de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, al 30 menos una sustitución, tal como una pluralidad de sustituciones introducidas independientemente entre sí. Las variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos pueden de esta manera comprender sustituciones conservadoras independientemente entre sí, en las que al menos una glicina (Gly) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Ala, Val, Leu, e Ile, e 35 independientemente del mismo, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una de dichas alaninas (Ala) de dicha variante de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Gly, Val, Leu, e Ile, e independientemente del mismo, variante de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una valina (Val) de dicha variante de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida 40 con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Gly, Ala, Leu, e Ile, e independientemente del mismo, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una de dichas leucinas (Leu) de dicha variante de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Gly, Ala, Val, e Ile, e independientemente del mismo, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al 45 menos una isoleucina (Ile) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Gly, Ala, Val y Leu, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos en las que al menos uno de dichos ácidos aspárticos (Asp) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Glu, Asn, 50 y Gln, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una de dichas fenilalaninas (Phe) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Tyr, Trp, His, Pro, e de preferencia seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Tyr y Trp, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al 55

menos una de dichas tirosinas (Tyr) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Phe, Trp, His, Pro, de preferencia un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Phe y Trp, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una de dichas argininas (Arg) de dicho fragmento de las secuencias 5 en la Figura 1, 2a o 2b está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Lys and His, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una Lisina (Lys) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Arg and His, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en 10 las que al menos una de dichas asparaginas (Asn) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Asp, Glu, y Gln, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una glutamina (Gln) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Asp, Glu, 15 y Asn, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una prolina (Pro) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Phe, Tyr, Trp, e His, e independientemente de eso, variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus fragmentos, en las que al menos una de dichas cisteínas (Cys) de dichas variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, o sus 20 fragmentos está sustituida con un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, y Tyr.

Esta claro de la indicación anterior que la misma variante o su fragmento puede comprender más de una sustitución de aminoácido conservadora de más de un grupo de aminoácidos conservadores como se define en el presente documento anteriormente. 25

La adición o supresión de un aminoácido puede ser una adición o supresión de entre 2 y 10 aminoácidos, tal como entre 10 y 20 aminoácidos, por ejemplo entre 20 y 30 aminoácidos, tal como entre 40 y 50 aminoácidos. Sin embargo, adiciones o supresiones de más de 50 aminoácidos, tal como adiciones entre 10 y 200 aminoácidos, también están comprendidas dentro de la presente invención. Más específicamente, 43 aminoácidos N-terminal se pueden eliminar de la secuencia en la Figura 1 sin alterar sustancialmente el efecto de unión de lípidos de la 30 proteína. Tal variante de supresión está incluida en la SEQ ID NO 4 como la parte de apolipoproteína de la construcción.

Se entenderá que la invención se refiere a apolipoproteínas que comprenden al menos un fragmento de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b capaz de unirse a lípidos tal como DPMC, que incluye cualesquiera variantes y equivalentes funcionales de tal al menos un fragmento. 35

La apolipoproteína de acuerdo con la presente invención, que incluye cualesquiera equivalentes funcionales y sus fragmentos, puede en una realización comprender menos de 243 restos de aminoácido, tal como menos de 240 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 225 restos de aminoácido, tal como menos de 200 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 180 restos de aminoácido, tal como menos de 160 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 150 restos de aminoácido, tal como menos de 140 restos de aminoácido, por 40 ejemplo menos de 130 restos de aminoácido, tal como menos de 120 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 110 restos de aminoácido, tal como menos de 100 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 90 restos de aminoácido, tal como menos de 85 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 80 restos de aminoácido, tal como menos de 75 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 70 restos de aminoácido, tal como menos de 65 restos de aminoácido, por ejemplo menos de 60 restos de aminoácido, tal como menos de 55 restos de aminoácido, por 45 ejemplo menos de 50 restos de aminoácido.

Fragmentos

Un fragmento que comprende la región de unión a lípido de las secuencias nativas en la Figura 1, 2a o 2b se prefiere particularmente. Sin embargo, la invención no se limita a fragmentos que comprenden la región de unión a lípido. Las supresiones de tales fragmentos que generan fragmentos funcionalmente equivalentes de las 50 secuencias en la Figura 1, 2a o 2b que comprenden menos de la región de unión a lípido también están comprendidas en la presente invención. Las secuencias funcionalmente equivalentes en los péptidos de la Figura 1, 2a o 2b, y sus fragmentos de acuerdo con la presente invención, pueden comprender menos o más restos de aminoácido que la región de unión a lípido. De preferencia, el fragmento comprende al menos los aminoácidos 100 - 186 de apo-A-I o su variante o equivalente funcional. Se ha determinado que este dominio central y las hélices α 55 dentro del dominio están directamente implicados en las interacciones con fosfolípidos. Por lo tanto, es altamente probable que la región juegue un papel importante en las propiedades funcionales de apo-A-1.

"Equivalencia funcional" como se usa en la presente invención está de acuerdo con una realización preferida establecida por medio de referencia a la funcionalidad correspondiente de un fragmento predeterminado de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b.

Los equivalentes funcionales de las variantes de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b se entenderá que muestran secuencias de aminoácidos que difieren gradualmente de la secuencia predeterminada preferida, ya que 5 el número y alcance de las inserciones, supresiones y sustituciones que incluyen sustituciones conservadoras se incrementa. Esta diferencia se mide como una reducción en la homología entre la secuencia predeterminada preferida y el fragmento o equivalente funcional.

Todos los fragmentos o equivalentes funcionales de apolipoproteína se incluyen dentro del alcance de esta invención, independientemente del grado de homología que muestren con una secuencia predeterminada 10 preferida de apolipoproteína. La razón de esto es que algunas regiones de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b son más probables que puedan mutar fácilmente, o sean capaces de estar completamente suprimidas, sin ningún efecto significativo sobre la actividad de unión del fragmento resultante.

Una variante funcional obtenida mediante sustitución puede también mostrar alguna forma o grado de actividad nativa las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b, e incluso ser menos homóloga, si los restos que contienen 15 cadenas laterales de aminoácidos funcionalmente similares están sustituidos. Funcionalmente similar a este respecto se refiere a características dominantes de las cadenas laterales tal como hidrófobas, básicas, neutras o ácidas, o la presencia o ausencia de volumen estérico. De acuerdo con lo anterior, en una realización de la invención, el grado de identidad entre i) un fragmento dado de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b capaz de efecto y ii) un fragmento predeterminado, no es una medida principal del fragmento como una variante o 20 equivalente funcional de un fragmento de las secuencias predeterminadas preferidas en la Figura 1, 2a o 2b de acuerdo con la presente invención.

La homología entre las secuencias de aminoácidos se puede calcular usando algoritmos bien conocidos tales como BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85, o BLOSUM 90. De preferencia se usa el 25 algoritmo BLOSUM 30.

Los fragmentos que comparten al menos alguna homología con el fragmento de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b se han de considerar que no están dentro del alcance de la presente invención cuando son al menos aproximadamente 40 por ciento homólogos con la apolipoproteína o su fragmento, tal como al menos aproximadamente 50 por ciento homólogos, por ejemplo al menos aproximadamente 60 por ciento homólogos, tal 30 como al menos aproximadamente 70 por ciento homólogos, por ejemplo al menos aproximadamente 75 por ciento homólogos, tal como al menos aproximadamente 80 por ciento homólogos, por ejemplo al menos aproximadamente 85 por ciento homólogos, tal como al menos aproximadamente 90 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 92 por ciento homólogos, tal como al menos 94 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 95 por ciento homólogos, tal como al menos 96 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 97 por ciento homólogos, tal como al menos 98 35 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 99 por ciento homólogos con el fragmento de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b. De acuerdo con una realización de la invención los porcentajes de homología se refieren a porcentajes de identidad.

Los factores adicionales que se pueden tener en consideración cuando se determina la equivalencia funcional de acuerdo con el significado usado en el presente documento i) la capacidad de antisueros contra una de 40 las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b para detectar fragmentos de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b de acuerdo con la presente invención, o ii) la capacidad del fragmento funcionalmente equivalente para competir con las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b en un ensayo de unión de lípidos.

Sustituciones conservadoras se pueden introducir en cualquier posición de una apolipoproteína predeterminada preferida o su fragmento. Sin embargo también puede ser deseable introducir sustituciones no 45 conservadoras, particularmente, pero no se limita a, una sustitución no conservadora en una cualquiera o más posiciones.

Una sustitución no conservadora que conduce a la formación de un fragmento funcionalmente equivalente de las secuencias en la Figura 1, 2a o 2b por ejemplo i) diferirían sustancialmente en polaridad, por ejemplo un resto con una cadena lateral no polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe o Met) sustituido por un resto con una 50 cadena lateral polar tal como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, o Gln o un aminoácido cargado tal como Asp, Glu, Arg, o Lys, o sustituyendo un resto cargado o polar por uno no polar; y / o ii) diferirían sustancialmente en su efecto sobre la orientación de la estructura central de polipéptido tal como sustitución de o por Pro o Gly por otro resto; y / o iii) diferirían sustancialmente en la carga eléctrica, por ejemplo sustitución de un resto cargado negativamente tal como Glu o Asp por un resto cargado positivamente tal como Lys, His o Arg (y viceversa); y / o iv) diferirían 55 sustancialmente en el volumen estérico, por ejemplo sustitución de un resto voluminoso tal como His, Trp, Phe o

Tyr por uno que tenga una cadena lateral secundaria, por ejemplo, Ala, Gly o Ser (y viceversa).

Sustitución de aminoácidos puede en una realización estar basada en sus valores de calidad hidrófoba y calidad hidrófila y la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácido, incluyendo carga, tamaño, y similares. Las sustituciones de aminoácido ejemplares que tienen en consideración diversas de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y Lisina; glutamato 5 y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Además de las variantes descritas en el presente documento, variantes similares estéricas se puede formular para imitar las partes claves de la estructura de la variante y tales compuestos también se pueden usar de la misma manera que las variantes de la invención. Esto se puede lograr mediante técnicas de modelación y diseñó químico conocidos por los expertos en la técnica. Se entenderá que tales construcciones similares de manera 10 estérica no están dentro del ámbito de la presente invención.

El componente X

De preferencia, el componente X de la construcción de proteína de acuerdo con la invención es esencialmente no inmunogénica. Por ejemplo el componente X puede ser un aminoácido, un carbohidrato, una secuencia de ácido nucleico, una proteína inerte o un polipéptido, que no tiene sustancialmente ningún efecto 15 fisiológico y especialmente ningún efecto inmunológico sobre mamíferos.

De preferencia el componente X no es inmunogénico y no interfiere negativamente con relación a la unión a ligando, Es decir, el componente de apolipoproteína no se debe dirigir a un sitio no deseado mediante interacciones del componente X con un ligando.

De acuerdo con una realización el componente X consta de sólo un aminoácido, dicho aminoácido de 20 preferencia es un resto cisteína, que se puede colocar de manera N-terminal, C-terminal o interna en el componente de apolipoproteína. Tal construcción puede formar un dímero con otras construcciones idénticas o similares. De preferencia se introduce un engarce entre el resto cisteína terminal y el componente apolipoproteína para facilitar el plegamiento correcto de interacción de lípido de la construcción.

Sin embargo, más de preferencia el componente X comprende un péptido que tiene más de 1 aminoácido 25 tal como más de 2 aminoácidos, por ejemplo más de 5 aminoácidos, tal como más de 10 aminoácidos, por ejemplo más de 15 aminoácidos, tal como más de 20 aminoácidos, tal como más de 30 aminoácidos, por ejemplo más de 40 aminoácidos, tal como más de 50 aminoácidos, por ejemplo más de 75 aminoácidos, tal como más de 100 aminoácidos, por ejemplo más de 200 aminoácidos, tal como más de 300 aminoácidos, por ejemplo más de 400 aminoácidos, tal como más de 500 aminoácidos, por ejemplo más de 600 aminoácidos, tal como más de 700 30 aminoácidos, por ejemplo más de 800 aminoácidos, tal como más de 900 aminoácidos, por ejemplo más de 1000, 1250, 1500, 2000, o 2500 aminoácidos.

En el caso en el que el componente X sea una proteína, esta proteína es de preferencia una proteína de mamífero y más de preferencia una proteína humana. Los ejemplos de proteínas adecuadas incluyen proteínas de plasma tales como albúmina o albúmina sérica bovina u otro péptido no inmunogénico o proteína tal como el 35 fragmento de serina proteasa de plasminógeno u otra serina proteasa modificada por ingeniería genética para interrupción de la triada catalítica; y la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas. Más de preferencia, la proteína comprende albúmina sérica. Incluso más de preferencia la proteína comprende una apolipoproteína que contiene una hélice anfipática que contiene apolipoproteína.

De acuerdo con una realización especialmente preferida de la invención, el componente X comprende un 40 componente de apolipoproteína seleccionado entre el grupo constituido por apolipoproteína A-I, A-II, AIV, un análogo, variante funcional o su fragmento. Los dos componentes de apolipoproteína pueden estar ligados de manera lineal o pueden estar ligados mediante un puente de cisteína terminal no nativo.

Los oligómeros mayores así como los dímeros del componente de apolipoproteína que comprende al menos un resto de cisteína no nativo se puede fabricar y unir mediante puentes de cisteína en condiciones 45 apropiadas. Oligómeros mediante puentes disulfuro pueden estar ligados en serie (apo-A-S-S-apo-A, o apo-A-S-S-apo-A-S-S-apo-A u oligómeros mayores).

La construcción de proteína de acuerdo con la invención también puede comprender dos, tres o más apolipoproteínas o sus análogos que están ligados en serie o de manera covalente a otro. Esto se puede lograr mediante la unión de una apolipoproteína C-terminal o una apolipoproteína al extremo N de la siguiente 50 apolipoproteína y así sucesivamente. Las proteínas pueden estar así ligadas después de la transcripción y traducción o la secuencia de nucleótidos puede simplemente comprender dos, tres, o más secuencias que codifican la construcción de apolipoproteínas en cuestión así como péptidos de engarce opcionales entre las apolipoproteínas.

Por lo tanto, la necesidad de un resto heterólogoto para realizar la unión se evita. Se espera que en las construcciones que tengan dos, tres, o más unidades apo-A esencialmente todas las unidades apo-A participarán en la unión de lípidos contribuyendo por lo tanto a la funcionalidad de la construcción. Por lo tanto se espera que estas construcciones multi-apo-A tengan una capacidad de unión a lípidos aumentada comparada con la apo-A nativa. Una ventaja adicional de estas construcciones comparada con apo-A nativa, es que tienen una semivida en 5 plasma aumentada comparada con apo-A nativa.

Tales construcciones que comprenden más de un componente de apolipoproteína puede comprender una combinación seleccionado entre el siguiente grupo:

Dímeros:

A-I A-I; A-II AII; A-IV A-IV; A-I A-II; A-I A-IV; A-II A-IV. 10

Trímeros:

A-I A-II A-IV; A-I A-I A-II; A-I A-I A-I; A-I A-I A-IV; A-II A-II A-I; A-II A-II A-IV; A-II A-II A-II; A-IV A-IV A-IV; A-IV A-IV A-II; A-IV A-IV A-1.

Módulos de oligomerización

De acuerdo con una realización especialmente preferida de la invención, el resto heterólogo es un módulo 15 de oligomerización. En este contexto, un módulo de oligomerización es un péptido o una proteína o parte de una proteína que es capaz de interactuar con otra, módulo similar o idéntico de oligomerizaciones. La interacción es del tipo que produce proteínas multiméricas o polipéptidos. Tal como una interacción se puede provocar mediante enlaces covalentes entre los componentes del múltímero así como mediante fuerzas de enlace hidrógeno, fuerzas hidrófobas, fuerzas de van der Waals, puentes de sal. La invención también abarca módulos de oligomerización de 20 naturaleza no peptídica tal como una secuencia de ácido nucleico de ADN, ARN, ALN, o APN. Los expertos en la técnica son familiares con las técnicas para unir se a proteínas y secuencias de ácidos nucleicos entre sí.

El modulo de oligomerización puede ser un módulo der dimerización, un módulo de trimerización, un módulo de tertramerización, o un módulo de multímeroización.

Cuando la apolipoproteína o parte análoga de la construcción se acopla a un módulo de oligomerización, 25 multímeros de la construcción se pueden realizar mediante una mezcla simple de una solución de construcciones (módulo de oligomerización ligado a parte de apolipoproteína) en condiciones apropiadas. De esta manera, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros o meros mayores se pueden preparar dependiendo del tipo de módulo de oligomerización que está ligado a la parte de apolipoproteína de la construcción.

Los multímeros de acuerdo con la invención pueden ser homómeros o heterómeros, ya que diferentes 30 apolipoproteínas pueden estar unidas a los módulos de oligomerización y se pueden incorporar en el multímero. Puede ser ventajoso mezclar los tipos diferentes de apolipoproteínas de esta forma para obtener un efecto clínico mejorado de la construcción. Los homómeros preferidos incluyen trímeros de Apo-A-I y trímeros de Apo-A-IV.

De acuerdo con una realización especialmente preferida de la invención el módulo de oligomerización es de tetranectina y más específicamente comprende el elemento estructural de trimerización de tetranectina (de aquí 35 en adelante denominado TTSE, SEQ ID NO 12), que se describe en detalle en el documento WO 98/56906. La secuencia de aminoácidos de TTSE se establece en la SEQ ID NO 12. El efecto de trimerización de TTSE está provocado por un efecto de estructura de espiral enrollada que interacciona con la estructura de espiral enrollada de otros TTSE para formar un trímero, que es excepcionalmente estable. Una ventaja adicional de TTSE es que es un antígeno débil (documento WO 98/56906). 40

De preferencia el sitio de unión a heparina, que se localiza en la región N-terminal de exón 1 (Figura 4) se suprime mediante la eliminación de o mutagénesis de restos de lisina N- terminal (residues 9 y 14 de la SEQ ID NO 12) (Nielsen et al, 1997, FEBS Lett 412: 388 - 396) sin inhibir la trimerización. De preferencia los restos de Lisina se someten a mutagénesis a alanina. Los TTSE que incluyen la mayoría de todos los exón 1 por lo tanto confieren una afinidad para polisacáridos sulfatados a cualquier proteína diseñada que abarca tal como TTSE como parte de 45 su estructura. Sin se desea, sin embargo, esta afinidad se puede reducir o suprimir mediante el rompimiento de N-terminal o mutagénesis de restos de Lisina en la parte de TTSE que corresponde a los restos N-terminal de aminoácido de tetranectina (Lorentsen et al 2000, Biochem J 347: 83 - 87).

El dominio de interacción del módulo de trimerización de acuerdo con la invención es de preferencia del mismo tipo que en TTSE, a saber como una espiral enrollada de hélice alfa. 50

El TTSE puede ser de tetranectina humana, de tetranectina de conejo, de tetranectina murino o de lectina

de tipo C de cartílago de tiburón. De preferencia, el TTSE comprende una secuencia que tiene al menos 68%, tal como al menos 75%, por ejemplo al menos 81 %, por ejemplo al menos 87% tal como al menos 92% de identidad con la secuencia de consenso de la SEQ ID NO 12. Por lo tanto los análogos del TTSE que tiene sustancialmente el mismo efecto de trimerización están abarcados por la invención.

De preferencia, el resto de cisteína 50 de TTSE (SEQ ID NO 12) se debe someter a mutagénesis a serina, 5 treonina, metionina o a cualquier otro resto de aminoácido con el fin de evitar la formación de un puente disulfuro entre cadena no deseado, que puede conducir a multímerización no deseada.

La presencia de un trímero se puede determinar por técnicas bien conocidas tales como filtración de gel, SDS-PAGE, o electroforesis de gel SDS dependiendo de la naturaleza del trímero. Un procedimiento preferido para determinar la presencia de un oligómero es mediante la unión por DMSI (dimetilsubirimidato) seguido de SDS-10 PAGE.

De acuerdo con una realización preferida de la invención la construcción de proteína se obtiene mediante unión de dos o más apolipoproteínas a módulos de oligomerización. La ventaja de esta realización es que la unión de apolipoproteínas individuales a otra no tiene lugar dentro de la apolipoproteína sino en el módulo de oligomerización. Por lo tanto la naturaleza de la apolipoproteína de tipo salvaje se conserva y la apolipoproteína 15 conserva la estructura secundaria y terciaria, que es ventajoso para su función fisiológica. Mediante la introducción además de un espaciador de péptido entre la apolipoproteína y el módulo de oligomerización se asegura que tanto los componentes de construcción pueden realizar su interacción con lípidos como otros módulos de oligomerización respectivamente sin estar afectada por las interacciones del otro componente. De preferencia, el espaciador de péptido es no inmunógeno, y tiene una estructura de tres dimensiones esencialmente lineal. 20

Diferentes o idénticas unidades de apo-A se pueden oligomerizar usando un módulo de oligomerización tal como un módulo de oligomerización, un módulo de trimerización, un módulo de tertramerización, un módulo de pentamerización, un módulo de hexamerización o un módulo de multimerización. Los módulos de oligomerización pueden comprender una estructura de espiral enrollada capaz de reconocimiento e interacción entre las cadenas.

El procedimiento general para producir un trímero artificial de una proteína o péptido comprende la 25 identificación de un módulo de trimerización de proteínas que forman trímeros en la naturaleza. Mediante análisis cuidadoso, el dominio responsable de la interacción proteína- proteína se puede identificar, aislar, y unir a la proteína o péptido a trimerizar. De acuerdo con la invención tal trimerización no comprende necesariamente la formación de un trímero de apolipoproteína o un análogo. También es posible unir sólo una apolipoproteína a un módulo de trimerización y permite que este péptido se trimerice con otros dos módulos de trimerización. Por lo tanto 30 el peso molecular de la parte de apolipoproteína aumenta y la semivida en plasma se puede aumentar comparada con la apolipoproteína nativa.

Un ejemplo de un módulo de oligomerización se desvela en el documento WO 95/31540 (HOPPE ET AL.), que describe polipéptidos que comprenden una región de cuello de colectina. La secuencia de aminoácido que constituye la región de cuello de colectina se puede unir a cualquier polipéptido de elección. Después los trímeros 35 se pueden preparar en condiciones apropiadas entre tres polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de la región de cuello de colectina.

Otro ejemplo de un módulo de oligomerización es la cadena α1 de Haptoglobina. La cadena α1 tiene un resto de cisteína que puede unirse a otra cadena α1 para formar un dímero. Una variante natural es la cadena α2, que había tenido parte de la cadena α1 implicada en la unión por puente disulfuro por duplicado. La cadena α2 40 puede formar puentes de cisteína a restos de cisteína en otras cadenas α2 o α1 formando por lo tanto trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros y meros superiores. En la forma natural de la cadena α se asocia a una cadena β. Es posible reemplazar la cadena β con una apolipoproteína para preparar una construcción apo-A- cadena α (haptoglobina).

Péptido espaciador 45

La construcción de proteína también puede comprender de manera ventajosa un resto espaciador, que está unido de manera covalente entre la apolipoproteína o análogo de apolipoproteína y el resto heterólogo. El efecto del espaciador es proporcionar espacio entre el resto heterólogo y la parte de apolipoproteína de la construcción. Por lo tanto se asegura que la estructura secundaria de la parte de apolipoproteína no está afectada por la presencia del resto heterólogo de manera que el efecto fisiológico de la parte de apolipoproteína se mantiene. 50 De preferencia, el espaciador es de naturaleza polipeptídica. De esta forma la secuencia de ácido nucleico que codifica el espaciador se puede unir a la secuencia que codifica la parte de apolipoproteína de la construcción y opcionalmente la secuencia para el resto heterólogo, y la construcción entera se puede producir al mismo tiempo.

El diseñó y preparación de los restos de espaciador adecuados se conocen en la técnica y se efectúan de

manera conveniente preparando polipéptidos de fusión que tienen el formato apo-A-espaciador-X, donde el resto espaciador es un fragmento de polipéptido (a menudo uno relativamente inerte), de manera que se eviten las reacciones no deseadas entre el espaciador y los entornos o la construcción.

Un resto espaciador también se puede insertar entre dos TTSE permitiendo que ambos es éstos interaccionen con un tercer TTSE separado para formar un complejo trimérico, que después comprende dos 5 péptidos separados: TTSE y TTSE-espaciador-TTSE. Esta realización facilita la producción de la construcción de apolipoproteínas ya que la parte principal del trímero, que después estrictamente se ve como un dímero, se puede sintetizar en forma de un polipéptido individual que comprende en los patrones de fusión (apo-A que significa cualquier secuencia de polipéptido que forma la parte de apolipoproteína de la construcción) apo-A-TTSE-espaciador- TTSE-apo-A. 10

En las realizaciones donde dos TTSE están presentes en el mismo monómero se prefiere que el resto espaciador tiene una longitud y una conformación que favorece la formación de complejo que implica ambos de los dos TTSE que están unidos de manera covalente por el resto espaciador. De esta forma, los problemas que surgen de la formación no deseada de trímeros de los formatos (2+1+1), (2+2+2), y (2+2+1) (en los que solamente un TTSE de cada monómero participa en la formación de complejo) se puede disminuir. 15

El péptido espaciador de preferencia comprende al menos dos aminoácidos, tal como al menos tres aminoácidos, por ejemplo al menos cinco aminoácidos, tal como al menos diez aminoácidos, por ejemplo al menos 15 aminoácidos, tal como al menos 20 aminoácidos, por ejemplo al menos 30 aminoácidos, tal como al menos 40 aminoácidos, por ejemplo al menos 50 aminoácidos, tal como al menos 60 aminoácidos, por ejemplo al menos 70 aminoácidos, tal como al menos 80 aminoácidos, tal como al menos 90 aminoácidos tal como aproximadamente 20 100 aminoácidos.

El espaciador puede estar unido al componente apo-A y X mediante enlaces covalentes, y de preferencia el espaciador es especialmente no inmunógeno, y / o no es susceptible a escisión proteolítica, y / o no comprende ningún resto de cisteína.

De manera similar, la estructura de tres dimensiones del espaciador es de preferencia lineal o 25 sustancialmente lineal.

Los siguientes son ejemplos de secuencias de espaciador, que se cree que son especialmente preferibles para unión del análogo de apolipoproteínas a un componente X. Los ejemplos preferidos de espaciador o péptidos de engarce incluyen aquellos, que se han usado para unir las proteínas sin alterar sustancialmente la función de las proteínas unidas o al menos sin alterar sustancialmente la función de una de las proteínas unidas. Más de 30 preferencia los engarces o espaciadores se han usado para unir proteínas que comprende estructuras de espiral enrollada.

Engarce basado en tetranectina:

El engarce puede incluir los restos de tetranectina 53 - 56, que en tetranectina forma una hebra β, y los restos 57 - 59 que forma un giro en tetranectina (Nielsen BB, Kastrup JS, Rasmussen H, Holtet TL, Graversen JH, 35 Etzerodt M, Thagersen HC, Larsen IK, FEBS-Letter 412, 388 - 396, 1997). La secuencia del segmento es GTKVHMK. Este engarce tiene la ventaja que en la tetranectina nativa se une por puente al dominio de trimerización con el dominio CRD, y por lo tanto se imagina que está bien adaptado para conectar el dominio de trimerización a otro dominio en general. Además la construcción resultante no se espera que sea más inmunógeno que la construcción sin un engarce. El engarce basado en tetranectina se prefiere en gran medida cuando el 40 componente X comprende el TTSE.

Engarce basado en fibronectina:

El engarce se puede elegir como una subsecuencia de la hebra de conexión 3 de la fibronectina humana, esto corresponde a los restos de aminoácido 1992 - 2102 (numeración SWISS-PROT, entrada P02751). De preferencia la subsecuencia: PGTSGQQPSVGQQ que cubre restos de aminoácido número 2037 - 2049 se usa, y 45 dentro de esa subsecuencia el segmento GTSGQ que corresponde a los restos de aminoácido 2038 - 2042 es más preferible. Esta construcción tiene la ventaja que se sabe que no es susceptible en gran medida a escisión proteolítica y no se espera que sea altamente inmunógeno teniendo en cuenta que la fibronectina está presente a altas concentraciones en plasma.

Engarce basado en la articulación superior de IgG3 humana 50

La secuencia de restos de 10 aminoácidos derivada de la región de articulación superior de IgG3 murina, PKPSTPPGSS, se ha usado para la producción de anticuerpos dimerizados mediante una espiral enrollada (Pack P. y Plückthun, A. Siochemistry 31, p 1579 - 1584 (1992)) y puede ser útil como un péptido espaciador de acuerdo

con la presente invención. Incluso más preferible puede ser una secuencia correspondiente de la región de articulación superior de IgG3 humana. Las secuencias de IgG3 humana no se espera que sean inmunógenas en seres humanos.

Engarces flexibles

Los posibles ejemplos de las secuencias engarce flexible /espaciador incluyen SGGTSGSTSGTGST, 5 AGSSTGSSTGPGSTT o GGSGGAP. Estas secuencias se han usado para la union de diseño de espirales enrolladas a los otros dominios de proteína (Müller, K. M., Arndt, K. M. y Alber, T., Meth. Enzymology, 328, p 261 - 281 (2000).

El enlace

Los dos componentes de la construcción pueden estar ligados conjuntamente por un enlace covalente. 10 Este enlace se puede formar entre el componente X y el aminoácido C o N terminal del componente apo-A. Los componentes también pueden estar unidos mediante más de un enlace covalente. El enlace covalente entre los componentes también pueden comprender un puente S-S, de preferencia entre restos de cisteína. Estos restos de cisteína se colocan de manera C o N terminal en el componente apo-A y de manera terminal o interna en el componente X. 15

Carbohidrato

Independientemente de los otros componentes de la construcción de acuerdo con la invención puede comprender un resto carbohidrato.

Elemento estructural de trimerización de tetranectina

Una realización especialmente preferida de la invención es la trimerización o trimerización parcial de una 20 apolipoproteína o su análogo con el módulo de trimerización de tetranectina.

Esta técnica se describe en el documento WO 98/56906 (THØGERSEN ET AL.), Los polipéptidos triméricos se construyen como una construcción de polipéptido monomérica que comprende al menos un elemento estructural de trimerización de tetranectina (TTSE), que está unido de manera covalente a al menos un resto heterólogo. El elemento estructural de trimerización de tetranectina es capaz de formar un complejo estable con 25 otros dos elementos estructurales de trimerización de tetranectina.

La expresión "elemento estructural de trimerización" (TTSE) usado en la presente descripción y las reivindicaciones pretende referirse a la parte de una molécula de polipéptido de la familia de tetranectina que es responsable de la trimerización entre los monómeros del polipéptido de tetranectina (SEQ ID NO 12). El término también pretende abarcar las variantes de un TTSE de un miembro de la familia de tetranectina de origen natural, 30 variantes que se han modificado en la secuencia de aminoácidos sin afectar de manera adversa, hasta ningún grado sustancial, las propiedades de trimerización con relación a la molécula del miembro de la familia de tetranectina nativa.

Los ejemplos específicos de tales variantes se describirán en detalle en el presente documento, pero en general se prefiere que el TTSE se derive de tetranectina humana, tetranectina murina, lectina de tipo C de 35 cartílago humano o bovino, o lectina de tipo C de cartílago de tiburón. Se prefiere especialmente construcciones monoméricas de polipéptido que incluyen al menos un TTSE derivado de tetranectina humana.

La secuencia de polipéptidos de 51 restos codificada por los exones 1 y 2 de tetranectina (Fig. 3, SEQ ID NO 12) parece ser única para tratar el grupo de tetranectina de las proteínas (Fig. 4) como homología de secuencia no significativa a las otras secuencias de polipéptido conocidas establecidas. En la preparación para las 40 investigaciones experimentales de la arquitectura de tetranectina una colección de proteínas recombinantes se han producido, la colección que incluye tetranectina completa, el dominio CRD (aproximadamente correspondiente al polipéptido codificada por el exón 3), un producto correspondiente al polipéptido codificado por los exones 2+3, un producto correspondiente a exones 1+2 (Holtet et aL, 1996). Tetranectina es de hecho un trímero, pero el polipéptido codificado por el exón 2 es de hecho capaz de efectuar la trimerización por sí mismo como se evidencia 45 por la observación de que la proteína correspondiente a los exones 2+3 es de hecho un trímero en solución.

El análisis de estructura de 3D de los cristales de tetranectina recombinante de longitud completa (Nielsen et aL, 1996; Nielsen, 1996; Larsen et aL, 1996; Kastrup, 1996) ha mostrado que el polipéptido codificado en el exón 2 más tres restos codificados en el exón 3 forman una estructura espiral enrollada triple de hélice alfa.

A partir de la combinación de la secuencia y estructura se hace claro que la trimerización en tetranectina 50 está de hecho generada por un elemento estructural (Fig. 4), que comprende los restos de aminoácido codificados

por los exones dos y los primeros tres restos del exón 3 por una secuencia de repetición no usual heptad, que aparentemente es única para la tetranectina y otros miembros de este grupo: Esta secuencia de aminoácidos (Fig. 4) se caracteriza por dos copias de repeticiones de heptad (abcdefg) con restos hidrófobos en las posiciones a y d como son espirales enrolladas de hélice alfa. Estas dos repeticiones heptad están en secuencia seguida de una tercera copia no usual de la repetición heptad, donde glutamina 44 y glutamina 47 no solamente sustituyen los 5 restos hidrófobos en tanto la posición a como d, pero están directamente implicados en la formación de la estructura espiral enrollada triple de hélice alfa. Estas repeticiones heptad están adicionalmente flanqueadas por dos repeticiones a la mitad de restos hidrófobos en la posición d y a, respectivamente.

La presencia de restos hidrófobos ramificados beta en posiciones a o d espiral enrollada de hélice alfa se sabe que influyen en el estado de oligomerización. En el elemento estructural de tetranectina solamente está 10 presente una valina (número 37) conservada. En la posición 29 de la secuencia en tetranectina ningún resto alifático particular parece ser preferido.

En resumen, es evidente que la estructura de espiral enrollada de hebra triple en tetranectina hasta un gran grado está gobernado por las interacciones que son inesperadas con relación a esas características entre el grupo de proteínas de espiral enrollada conocidas. 15

Los TTSE forman sorprendentemente moléculas triméricas estables. Las observaciones experimentales, son que (1) una parte sustancial de las proteínas recombinantes existe en estado oligomérico y pueden estar reticuladas como moléculas triméricas incluso a 70ºC y (2) que el intercambio de monómeros entre diferentes trímeros se puede solamente detectar después de la exposición a temperatura elevada son evidencia de una estabilidad extremadamente alta del electo estructural de trimerización de tetranectina. Esta característica debe 20 estar reflejada en la secuencia de aminoácidos del elemento estructural. En particular, la presencia y posición de la repetición que contiene glutamina en la disposición secuencial de las repeticiones de heptad es, conjuntamente con la presencia y posición relativa de los otros restos conservados en la secuencia de consenso (Fig. 4), considerado importante para la formación de estas moléculas triméricas estables. Para la mayoría de de los usos prácticos el resto 50 de cisteína se debe mutar a serina, treonina, metionina o a otro resto de aminoácido con el fin 25 de evitar la formación no deseada de puentes disulfuro entre cadena que puede conducir a la multimerización, agregación y precipitación no controlada de un producto polipeptídico que aloja esta secuencia.

En particular junto con el polipéptido codificado por el exón 1, el elemento estructural de trimerización de tetranectina es un módulo de polipéptido verdaderamente autónomo que retiene la integridad estructural y propensión a generar un complejo homotrimérico estable si está unido o no por un enlace peptídico en cualquiera o 30 ambos extremos a otras proteínas.

Esta única propiedad se demuestra por el hecho de que las secuencias polipeptídicas derivadas de proteínas heterólogas se pueden trimerizar fácilmente cuando se unen como proteínas de fusión al elemento estructural de trimerización de tetranectina. Esto es válido independientemente de si las secuencias polipeptídicas heterólogas están colocadas de forma amino-terminal o carboxi-terminal al elemento de trimerización que permite la 35 formación de un ensamblaje molecular que contiene hasta seis copias de una secuencia de polipéptidos particular o entidades funcionales, o la formación de un ensamblaje molecular que contiene hasta seis secuencias de polipéptidos diferentes, contribuyendo cada una a su propiedad funcional individual.

Ya que tres TTSE de tetranectina humana de origen natural forma hasta una triple espiral enrollada de hélice alfa, se prefiere que el complejo estable formado por el TTSE, de la invención también forme una triple 40 espiral enrollada de hélice alfa.

La "familia de tetranectina " son polipéptidos, que comparten la secuencia de consenso mostrada en la Fig. 4 o una secuencia, que es homóloga al nivel de secuencia con esta secuencia de consenso.

Por lo tanto, las construcciones polipeptídicas monoméricas de la invención se prefiere que comprendan una secuencia de polipéptidos que tiene al menos 68% de identidad de secuencia con la secuencia de consenso 45 mostrada en la in Fig. 4, pero mayores identidades de secuencia son preferidas, tal como al menos 75%, al menos 81%, al menos 87%, y al menos 92%.

Módulo de Trip A

En los plásmidos de expresión de acuerdo con la presente invención, el módulo de TTSE (SEQ ID NO 12) se modificó como se indica reemplazando Cys 50 por Ser e incluyendo un resto de lisina C-terminal. Se ha añadido 50 SPGT al extremo N-terminal. Esta es una secuencia de conexión al módulo de trimerización. La secuencia se ha insertado porque proporciona una oportunidad para cortar la hebra de ADN con Bglll y Kpn K. Una secuencia de GS de conexión secuencia se ha añadido C-terminal, que proporciona una oportunidad de cortar Bam HI. Este TTSE modificado se denomina Trip A y se desvela como SEQ ID NO 13. El módulo de trimerización de la construcción

Apo A puede comprender de esta manera ventajosamente esta secuencia o una secuencia que tiene al menos 68% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO 13, pero se prefieren identidades de secuencia mayores, tal como al menos 75%, al menos 81%, al menos 87%, y al menos 92%.

Los ejemplos específicos de las construcciones que abarcan el módulo de Trip A se desvelan en los ejemplos. 5

Ejemplos de construcciones de acuerdo con la invención

La invención abarca las secuencias específicas descritas en los ejemplos anexos como SEQ ID NO 2 a 11 y SEQ ID NO 14. De preferencia la invención abarca SEQ ID NO 3 a 11 y SEQ ID NO 14. Las secuencias que comparten al menos 60 % de identidad de secuencia, tal como al menos 70 % de identidad de secuencia para estas secuencias también están dentro del ámbito de la invención, de preferencia secuencias que comparten al 10 menos 80 % de identidad de secuencia, más de preferencia al menos 90 %, más de preferencia al menos 95 %, más de preferencia al menos 98%.

Producción de la construcción de proteína

Con el fin de producir un componente peptídico de la construcción de proteína el ADNc que codifica esta parte se inserta en un vector de expresión y se transforma una célula huésped. 15

La célula huésped mencionada anteriormente (que es también parte de la invención) se puede modificar mediante técnicas de ingeniería genética tradicionales que comprenden la inserción de un fragmento de ácido nucleico (normalmente un fragmento de ADN) que codifica la parte de polipéptido de una construcción de polipéptido monomérica de la invención en un vector de expresión adecuado, transformando una célula huésped adecuada con el vector, y cultivando la célula huésped en condiciones que permiten la expresión de la parte de 20 polipéptido de la construcción de polipéptido monomérica. El fragmento de ácido nucleico que codifica el polipéptido se puede colocar bajo el control de un promotor adecuado que se puede inducir o un promotor constitutivo.

Dependiendo del sistema de expresión, el polipéptido se puede recuperar de la fase extracelular, el periplasma o del citoplasma de la célula huésped.

Los sistemas de vector adecuados y células huésped son bien conocidos en la técnica como se evidencia 25 por la extensa cantidad de bibliografía t materiales disponibles por los expertos en la técnica. Ya que la presente invención también se refiere al uso de los fragmentos de ácido nucleico de la invención en la construcción de vectores y en células huésped, lo siguiente proporciona una descripción general con relación a tal uso y las consideraciones particulares en la práctica de este aspecto de la invención.

En general, de hecho, se prefieren procariotas para la clonación de secuencias nucleicas de la invención 30 y construcción de los vectores útiles en la invención. Por ejemplo, además de las cepas particulares mencionadas en la descripción más especifica más adelante, se puede mencionar a modo de ejemplo, cepas tales como tal como la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC No. 31446), E. coli B, y E. coli X 1776 (ATCC No. 31537). Estos ejemplos, de hecho, se pretenden que sean ilustrativos en lugar de limitantes. También se prefieren procariotas para la expresión, ya que estrategias de eficaces de purificación y replegamiento de proteína están disponibles. Las cepas 35 anteriormente mencionadas, así como E. coli W3110 (F-λ, prototróficos, ATCC No. 273325), bacilos tales como Bacillus subtilis, u otras enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y diversas especies de Pseudomonas se pueden usar.

En general, los vectores de plásmidos que contienen replicón y secuencias de control que se derivan de las especies compatibles con la célula huésped se usan junto con estos huéspedes. El vector ordinariamente lleva 40 un sitio de replicación, así como secuencias de marca son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (véase, por ejemplo, Bolivar et al., 1977). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y de esta manera proporciona medios fáciles para identificar las células transformadas.

El plásmido pBR, u otro plásmido o fago microbiano también puede contener, o modificarse para que 45 contengan, promotores que también se pueden usar mediante el microorganismo para expresión.

Aquellos promotores mayormente usados en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas de promotor de la B-Iactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) y un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., 1979; EPO Appl. Publ. No. 0036776). Aunque éstos son los usados más comúnmente , otros promotores microbianos se han descubierto y utilizados, y los detalles con 50 relación a su secuencia de nucleótidos se han publicado, permitiendo a un trabajador experto ligarlos funcionalmente con los vectores de plásmido (Siebwenlist et al., 1980). Ciertos genes de procariotas se pueden expresar de manera eficaz en E. coli a partir de sus propias secuencias de promotor, evitando la necesidad de

adición de otro promotor mediante medios artificiales.

Además de los procariotas, microbios eucariotas, tal como cultivos de levadura también se pueden usar. Saccharomyces cerevisiase, o levadura de cerveza común es el usado más comúnmente entre los eucarióticos, aunque numerosas otras cepas están disponibles de manera común. Para la expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, se usa de manera común (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper 5 et al., 1980).

Este plásmido ya contiene el gen trpl que proporciona un marcador de selección de una cepa mutante de lavadura que carece de la capacidad crecer en triptófano por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula huésped de levadura después proporciona un ambiente eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en la ausencia de triptófano. 10

Las secuencias de promoción en vectores de levadura incluyen los promotores para 3- fosfoglicerato quinasa (Hitzman et al., 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas a 15 estos genes también están ligadas a vector de expresión 3' de la secuencia deseada para que se exprese para proporcionar la poliadenilación del ARNm y terminación.

Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento son la región de promotor para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas a metabolismo de nitrógeno, y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa anteriormente 20 mencionada, y las enzimas responsables para el uso de maltosa y galactosa. Cualquier vector de plásmido que contiene un promotor compatible de levadura, origen de secuencias de replicación y terminación es adecuado.

Además de microorganismos, cultivos de células derivados de organismos multicelulares también se pueden usar como huéspedes. En principio, tal cultivo de células puede ser factible, si es cultivo de vertebrados o invertebrados. Sin embargo, el interés ha sido el mayor en células de vertebrados, y propagación de células de 25 vertebrados en en cultivo (cultivo de tejidos) ha llegado a ser un procedimiento rutinario (Tissue Culture, 1973). Los ejemplos de tales líneas de célula huésped son células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster Chino (CHO), y líneas celulares de W138, BHK, COS-7 293 y MDCK.

Vectores de expresión para tales células ordinariamente incluyen (si es necesario) un origen de replicación, un promotor localizado en frente del gen a expresar, junto con cualesquiera sitios de unión de 30 ribosoma necesarios, sitios de ayuste de ARN, sitio de poliadenilación, y secuencias de terminación de la transcripción.

Para uso en células de mamíferos, las funciones de control de los vectores de expresión a menudo se proporcionan por material viral. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, y lo más frecuentemente Virus 40 de Simio (SV40). Los promotores tempranos y tardíos de virus 35 SV40 son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el origen viral de SV40 de replicación (Fiers et al., 1978). Fragmentos más pequeños o mayores de SV40 también se pueden usar, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio Hindlll hacia el sitio BglI localizado en el origen viral de replicación. Además, también es posible, y a menudo deseable, utilizar secuencias de promotor o de control asociadas de manera normal a la 40 secuencia de gen deseada, siempre que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de célula huésped.

Un origen de replicación se puede proporcionar o bien mediante construcción del vector que incluye un origen exógeno, tal como se puede derivar de SV40 u otro viral (por ejemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV) o se puede proporcionar por el mecanismo de replicación cromosómica de la célula huésped. Si el vector se integra en 45 el cromosoma de la célula huésped, esto último es a menudo suficiente.

Tras la producción de las construcciones monómeras de polipéptido puede ser necesario procesar los polipéptidos posteriormente, por ejemplo, introduciendo funciones no proteináceas en el polipéptido, sometiendo el material a condiciones de replegamiento adecuadas (por ejemplo, mediante el uso de estrategias generalmente aplicables sugeridas en el documento WO 94/18227), o mediante eliminación por escisión de los restos de péptidos 50 no deseados del monómero (por ejemplo, expresión que potencia los fragmentos de péptido que no se desean en el producto final).

A la luz de las descripciones anteriores, los procedimientos para producir de manera recombinante la construcción de polipéptido monomérica de la invención son también parte de la invención, como son los vectores

que llevan y / o ser capaces de replicar los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en una célula huésped o una línea celular. De acuerdo con la invención el vector de expresión puede ser por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un minicromosoma, o un fago. Especialmente interesantes son los vectores que están integrados en el genoma de la célula huésped / línea celular después de la introducción en el huésped.

Otra parte de la invención son células transformadas (útiles en los procedimientos anteriormente 5 descritos) que llevan y son capaces de replicar los fragmentos de ácido nucleico de la invención; la célula huésped puede ser un microorganismo tal como una bacteria, una levadura, o un protozoo o una célula derivada de de un organismo multicelular tal como un hongo, una célula de insecto, una célula vegetal, o una célula de mamífero. Especialmente interesantes son las células de las especies bacteriana Escherichia, Bacillus y Salmonella, y una bacteria preferida es E. coli. 10

Todavía otra parte de la invención se refiere a una línea celular estable que produce la parte de parte de polipéptido de una construcción de acuerdo con la invención, y de preferencia la línea celular lleva y expresa un ácido nucleico de la invención.

Unión al receptor

La realización de las construcciones de acuerdo con la invención se puede analizar mediante la medición 15 de la capacidad de las construcciones de unirse a receptores o proteínas HDL que se pueden unir a apolipoproteína nativa A-I, A-II o A-IV. Tales receptores y proteínas incluyen pero no se limitan a cubilina, megalina, receptor de inactivador de clase B tipo 1 (SR-B1), módulo 1 de unión a ATP (ABC1), Lecitina:colesterol aciltransferasa (LCAT), proteína de transferencia de ésteres de colesteril (CETP), proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP). La constante de disociación, Kd, del complejo entre entre cubilina y apolipoproteína nativa A I es 20 nM. 20 Experimentalmente se ha determinado que un trímero de apolipoproteína A I de acuerdo con la presente invención se une incluso más fuerte a cubilina (Figura 12).

Marcadores de afinidad

La construcción de proteína de acuerdo con la invención también puede comprender un marcador de afinidad para uso durante la purificación de la construcción. Tal marcador de preferencia comprende una secuencia 25 de polihistidina. Esta secuencia se puede usar de manera ventajosa para la purificación del producto en una columna Ni2+, que se unirá a la secuencia de polihistidina y por lo tanto a la proteína entera. Después de la elución de la columna la secuencia de polihistidina se puede eliminar por escisión mediante una proteinasa tal como trombina que reconoce una secuencia específica edificada en la construcción entre la construcción de proteína y la secuencia de polihistidina. 30

Otros ejemplos marcadores de afinidad incluyen pero no se limitan a marcadores bien conocidos tales como un marcador antigénico, o un marcador GST. Se puede insertar un sitio de escisión proteolítico entre el marcador y la construcción para eliminar por escisión el marcador.

Péptidos de señal

Cuando se expresan las construcciones de acuerdo con la invención en E. coli o en levadura, puede ser 35 preferible incluir un péptido de señal en la construcción de expresión para asegurar que la proteína expresada se separa y se pueden recoger del medio circundante las células en lugar de procedimiento más laborioso de aislamiento de la proteína expresada dentro de las células. Los ejemplos específicos de los péptidos de señal para la expresión en levadura y E. coli, que se pueden usar junto con la presente invención incluyen los descritos en el documento WO 90/12879 (Sirtori et al), que desvela un péptido de señal para la expresión de Apo-AI y Apo-AIM en 40 levadura, y el documento WO 94/13819 (Kabi Pharmacia) que desvela un péptido de señal para la expresión de Apo-AI y Apo-AIM en E. coli.

Producción de apo-A-TTSE

Con el fin de producir una construcción que comprende una parte de apolipoproteína y un TTSE, el ADNc que cofica la parte de apolipoproteína está ligado en el extremo 3' al extremo 5' del ADNc que codifica el TTSE. 45 Además las unidades de TTSE y unidades de apolipoproteína también pueden estar ligadas. Una secuencia que codifica un sitio de escisión de enzima además está ligado al extremo 3' de la secuencia que codifica TTSE y finalmente una secuencia que codifica polihistidina también está ligada. Esto se puede hacer mediante técnicas de PCR convencionales. El ADNc combinado está insertado en un vector de expresión y transformado en una célula huésped. 50

Después de la expresión en E. coli, la secuencia de polihistidina se usa para capturar la proteína heteróloga en una columna Ni2+. Después de la elución la cola de polihistidina se puede eliminar por una proteinasa tal como Fx que escinde la proteína heteróloga en el sitio específico insertado en él entre el TTSE y la

secuencia de polihistidina. Después el péptido de apo-A-TTSE resultante se puede procesar además mediante su trimerización a otros o idénticos péptidos apo- A-TTSE. Para mejorar la expresión en E. coli it puede ser ventajoso expresar la construcción como una proteína de fusión conjuntamente con por ejemplo, ubiquitina, que se puede eliminar por escisión más tarde.

Uso de una construcción de apo-A para la preparación de una composición farmacéutica 5

La construcción de apo-A se puede usar para la preparación de una composición farmacéutica. La composición puede comprender excipientes, adyuvantes, aditivos farmacéuticamente aceptables tales como fosfolípidos, colesterol, o triglicéridos.

La composición farmacéutica también se puede administrar por vía intravenosa, intra- arterial, intramuscular, transdérmica, pulmonar, subcutánea, intradérmica, intratecal, a tarvés del tejido bucal-, anal-, 10 vaginal-, conjunctival-, o intranasal, o mediante inoculación en el tejido, tal como tejido tumoral, o mediante un implante, o por vía oral.

La formulación de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se realiza de preferencia usando técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Esto puede comprender la adición de excipientes, adyuvantes, o aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como fosfolípidos, colesterol o triglicéridos. 15

Administración de construcción de apo-A

Las construcciones de apo-A- de acuerdo con la invención se pueden administrar para la prevención y / o tratamiento de enfermedades relacionadas con colesterol, fosfolípidos, y triacilglicéridos, trastornos de LDL y HDL tales como hipercolesterolemia, y enfermedades arterioscleróticas tales como aterosclerosis e infarto de miocardio. Otras indicaciones incluyen angina de pecho, angina de pecho de placa, angina de pecho inestable, estenosis 20 arterial tal como estenosis de carótida, incapacidad, o estenosis arterial cerebral. Además, las construcciones de apolipoproteínas se pueden usar para la eliminación de endotoxinas.

En una realización, la administración comprende la administración de al menos 50 mg de la construcción cada semana tal como para obtener una concentración en plasma aproximadamente 0,5 g/l. De preferencia la construcción se administra por vía parenteral tal como mediante inyecciones, supositorios, implantes etc. De 25 preferencia la composición se administra en una cantidad que comprende al menos 50 mg de construcción de apolipoproteínas a la semana, tal como al menos 100 mg/semana, por ejemplo al menos 250 mg/semana, tal como al menos 500 mg/semana, por ejemplo al menos 750 mg/semana tal como al menos 1000 mg/semana, por ejemplo al menos 1250 mg/semana, tal como al menos 1500 mg/semana, por ejemplo al menos 2000 mg/semana, tal como al menos 2500 mg/semana, por ejemplo al menos 5000 mg/semana. La administración se puede realizar 30 diariamente, cada dos o tres días, una vez a la semana, una vez la segunda semana, o una vez la tercera semana, o una vez la cuarta semana.

De acuerdo con otra realización, la construcción se administra una vez, dos veces o tres veces en muchas mayores cantidades especialmente para tratamiento agudo de angina de pecho y angina de pecho de placa o angina de pecho inestable. La administración se puede realizar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o hasta 10 días. Estas 35 cantidades pueden ser al menos 10 mg/kg de peso corporal, tal como al menos 20 mg/kg de peso corporal, por ejemplo al menos 30 mg/kg, tal como al menos 40 mg/kg, por ejemplo al menos 50 mg/kg, tal como al menos 60 mg/kg, por ejemplo al menos 70 mg/kg, tal como al menos 75 mg/kg, por ejemplo al menos 90 mg/kg, tal como al menos 100 mg/kg, por ejemplo al menos 125 mg/kg, tal como al menos 150 mg/kg, por ejemplo al menos 200 mg/kg, tal como al menos 250 mg/kg, por ejemplo al menos 300 mg/kg, tal como al menos 400 mg/kg, por ejemplo 40 al menos 500 mg/kg, tal como al menos 600 mg/kg, por ejemplo al menos 700 mg/kg, tal como al menos 800 mg/kg, por ejemplo al menos 900 mg/kg, tal como al menos 1000 mg/kg.

Las construcciones también se pueden administrar por vía oral. Para esta vía de administración, la tecnología descrita en los documentos WO 99/46283, US 5.922.680, US 5.780.434 o US 5.591.433, US 5.609.871, o US 5.783.193 también se pueden aplicar las construcciones proteína de acuerdo con la presente invención. 45

Población de células

La invención también abarca el uso de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención para terapia génica.

Los genes se pueden transferir a una población de macrófagos y posteriormente transferirse al paciente en necesidad de tratamiento. Por lo tanto, se obtiene una expresión transitoria del gen, ya que el macrófago tiene 50 una vida útil limitada en los vasos sanguíneos.

La transfección permanente se puede obtener mediante transformación de las células hepáticas.

La invención se describe ahora con ejemplos específicos de realizaciones de la invención, que se han de interpretar como ejemplos ilustrativos en lugar de limitantes. El diseño de construcciones adicionales de acuerdo con la invención está dentro de las prácticas normales de los expertos en la técnica

Ejemplo 1: Clonación de Apo A-I

El ADNc que codifica Apo A-I se amplificó a partir de una genoteca de ADNc de hígado humano 5 (Clontech) usando técnicas de PCR convencionales. Para la construcción de Ubi-A-I los cebadores usados fueron: 5'-CAC GGA TCC ATC GAG GGT AGG GGT GGA 55 GAT GAA CCC CCC CAG AGC-3' y 5'- TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'. El producto se clonó en el vector pT7H6Ubi, descrito en (Ellgaard L. et al Eur. J. Biochem. 1997; 244 (2): 544-51) usando los sitios de clonación Bam HI e Hind III. Para la construcción de Trip-A- A-I los cebadores usados fueron 5'-AAG GGA TCC GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC-3' y 5'-TCC AAG 10 CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG-3'. El producto de PCR se clonó en el vector pT7H6tripa descrito en el documento WO 98/56906 usando los sitios de clonación Bam HI y Hind III. Para la construcción de Trip-A-I los cebadores usados fueron: 5'-AGG GGA TCC CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG G-3' y 5'- TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG -3'. El producto de PCR se clonó en el vector pT7H6tripa descrito en el documento WO 98/56906 usando los sitios de clonación Bam HI e Hind III. Para la construcción de Ubi-Cys-A-I los 15 cebadores usados fueron: 5'-GGT GGA TCC ATC GAG GGT AGG GGT GGA TGT GAT GAA CCC CCC C -3' y 5'- TCC AAG CTT ATT ACT GGG TGT TGA GCT TCT TAG TG -3'. El producto se clonó en el vector pT7H6Ubi, descrito en (Ellgaard L. et al Eur. J. Biochem. 1997; 244 (2):544 - 51) usando los sitios de clonación Bam HI y Hind III c. Los plásmidos generados se muestran en las figuras 4, 5, 6, y 7.

Ejemplo 2: Expresión de apolipoproteína A-I (apo A-I) en E. coli 20

Ubi-A-I yTrip-A-I así como las otras construcciones descritas en las figuras se expresan de manera conveniente en células E. coli AV-1 (Stratagene Inc.). Se pueden usar otras líneas celulares se pueden usar también. El cultivo de las células y la inducción de la expresión se realizaron como se describe para tetranectina en el documento WO 98/56906.

Ejemplo 3: Aislamiento y procesamiento de proteína 25

Se aisló la proteína bruta mediante extracción con fenol como se describe para tetranectina en el documento WO 98/56906. El sedimento vuelto a disolver en 6 litros de cultivo de expresión se centrifugó para retirar el material no disuelto y luego el lote se adsorbió a 50 ml de Ni2+-NTA-Sefarosa, preparado como se describe en el documento WO 98/56906. El material de columna se empaquetó en una columna y después se lavó con 500 ml de 8 M urea, 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8.0, después 200 ml de 6 M Guanidinio-HCI, 50 30

mM Tris-HCI pH 8,0 y finalmente 300 ml de 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0. La proteína se eluyó con 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0 y 10 mM EDTA. A la proteína se añadieron 0,5 mg de Factor Xa y se digirió durante toda una noche a temperatura ambiente. Trombina se puede usar para este propósito también. La proteína se filtró por gel sobre una columna G-25 sephadex (Pharmacia) en un tampón 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0. La proteína no digerida se retiró pasando la solución de proteína sobre una columna Ni2+-NTA-Sefarosa lavada 35 previamente en 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0 y después se lavó con 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0. La proteína no digerida se eluyó con 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0 y 10 mM EDTA. La purificación adicional se realizó usando intercambio iónico en Sp Sefarosa.

Ejemplo 4: Eliminación de lípidos de las proteínas

Las proteínas se filtraron por gel en una solución de 10 mM (NH4)2CO3 pH 8,8 y se liofilizó. La proteína 40 liofilizada se volvió a suspender en 25 ml de 1:1 metanol/cloroformo frío, se incubó sobre hielo durante 30 min, se centrifugó a 3000 g durante 20 minutos. El sedimento se volvió a disolver en 25 ml de 1:2 metanol/cloroformo frío, equilibrado durante 30 minutos sobre hielo y se volvió a centrifugar. Se retiró el sobrenadante y el sedimento secó al aire brevemente y después se volvió a disolver en 6 M guanidinio - HCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0 durante toda una noche. 45

Ejemplo 5: Ensayo de multimerización

Reticulación

La multimerización se puede medir mediante reticulación de multímeros seguido de SDS-PAGE analítico.

60 μI de 0,2 mg/ml de proteína disuelta en 150 mM Na-borato pH 9,0 equilibrada a la temperatura deseada durante 30 minutos se añadieron 5 μI de 20 mg/ml dimetilsuberimidato y se incubó durante 30 minutos a la temperatura 50 deseada. La reticulación se inactivó mediante la adición de 5 μl de 3 M Tris-HCI pH 9,0.

El dimetilsuberimidato provoca restos de lisina localizados dentro de una corta distancia entre sí formando un enlace covalente. El resultado es que las proteínas que han formado multímeros están unidas de manera covalente entre sí. El peso molecular de los multímeros se puede obtener en el SDS-PAGE posterior.

Los productos de reticulación se analizaron mediante SDS-PAGE sobre geles de 8 - 16% de poliacrilamida. Opcionalmente se incluyó un adyuvante, tal como un lípido, en la mezcla de reticulación, en cuyo 5 caso la proteína se incubó previamente con un adyuvante.

Filtración por gel analítica

Multimerización también se puede medir mediante filtración por gel analítica

La proteína se disolvió en un tampón 500 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0 y se filtró por gel sobre una columna de Superdex 200 HR 10/30 en el tampón deseado a temperatura ambiente y un flujo de 0,25 ml/min. Para 10 los procedimientos convencionales el tampón era 100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0.

De la Figura 13 se puede observar que Apo A-I eluye como picos compuestos, los principales centrados a aproximadamente 14,5 y 16,5 ml. BSA, con un peso molecular de 68 kDa, eluye a aproximadamente 14,5 ml, indicando que el pico de Apo AI a 16,5 ml corresponde a Apo A-I monomérica, mientras que el otro pico principal corresponde a complejos de auto asociación apo A-I. Las construcciones fusionadas al dominio de trimerización 15 eluyen todas con un pico principal a aproximadamente 10,7 ml y un pico secundario a 14 mI. El pico a 14 ml probablemente corresponde a a la forma trimérica de las construcciones, mientras que el pico principal a 10,7 ml corresponde a un producto de alto peso molecular. Presumiblemente el producto se forma mediante asociación de los trímeros. esto indica que la fusión de apo A-I al dominio de trimerización no solamente conduce a trímeros, sino también a la formación de complejos grandes, cuando las unidades Apo A-I pueden interactuar con otras unidades 20 apo A-I, del mismo modo apo A-I nativa puede interactuar con otras moléculas de Apo A-I.

Ejemplo 6: Cinética de asociación de la construcción de proteína con dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC)

La capacidad de las construcciones de acuerdo con la invención de unirse a un lípido se puede medir de manera conveniente usando un ensayo bien conocido tal como la asociación a dimiristoil fosfatidilcolina (DPMC).

El ensayo se llevó a cabo como se describe en (Bergeron J. et al. (1997), Biochem. Biophys. Acta, 1344, 25 139 - 152. DPMC seca se suspendió en 100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 8,0 y 0,25 mM EDTA por encima de su temperatura de transición a una concentración de 0,5 mg/ml. La muestra de proteína, tampón y la suspensión de DMPC se incubaron todos a 24ºC 10 minutos, y después se mezclaron de manera que la concentración final de DMPC llegó a ser 0,4 mgJml, comn una concentración de proteína de 5,2 μM (del monómero). La reducción de la turbidez de la mezcla, que refleja el incremento de la asociación lípido-proteína, se siguió mediante la medición de 30 la absorbancia de la mezcla a 325 nm. El ensayo se llevó a cabo cuatro veces cada uno para apo Al, Trip-A-AI y Trip-A-FN-AI, y una vez sin la adición de proteína.

De la Figura 11 se puede observar que todas las construcciones Apo A-I se unen a DMPC. Para las tres construcciones ensayadas la turbidez era totalmente transparente después de 24 horas, indicando que la capacidad de las proteínas de fusión de unirse a DMPC está presente en las proteínas de fusión. Sin embargo, aparentemente 35 tanto Trip-A-Apo A-I como Trip- A-FN-Apo Al se une a DMPC mas lentamente que Apo A-I a 24°C, que es solamente la temperatura a la que el ensayo es funcional.

Ejemplo 7: Análisis de resonancia de plasmón superficial de la unión de los derivados a cubilina

El ensayo se llevó a cabo como se describe en: Kozyraki R, Fyfe J, Kristiansen M, Gerdes C, Jacobsen C, Cui S et al. El receptor intrínseco del factor-vitamina B12, cubilina, es un receptor de apolipoproteína A-I de alta 40 afinidad que facilita la endocitosis de lipoproteína de alta densidad. Nat Med 1999; 5(6):656-661. La concentración de la construcción de apolipoproteínas usada era 0,5 μM. Los resultados (Figura 12) solamente se muestran para TripA-Al y apo A-1. La unión similar a la observada para TripA-Al se observó para TripA-FN-AI y TripA-TN-AI. La respuesta se incrementó tras la trimerización de apo A-I, especialmente existía una disminución en la velocidad, basada en la “avidez” ganada de la interacción para un multímero con una diana inmovilizada comparada con un 45 monómero (bono de multivalencia). Mostrando que apo A-I era capaz de unirse a cubilina en el estado trimérico, y que más de una apo A-I estaba en una conformación capaz de interactuar con cubilina, que indica un correcto plegamiento de la unidad apo A-I en la construcción trimérica.

Ejemplo 8: Evaluación la eliminación en plasma de apolipoproteína A-I, TripA Apo-A-I y TripA fibronectina - engarce Apo-A-I en ratones. 50

Tres grupos de cinco ratones cada uno se inyectaron con 1 mg de apo A-I, Trip-A-AI o Trip-A-FN-AI, respectivamente. La proteína se disolvió a una concentración de de 0,33 mg/ml en el siguiente tampón: 1 x PBS pH

7,4, y 8,9 mg/ml dipalmitoilfosfatidilcolina. Se tomaron muestras sangre de cada ratón en los siguientes momentos: 10 min, 4 h, 24 h, y 48 h.

Las concentraciones en plasma de apolipoproteína A-I y derivados se midieron usando un ensayo ELlSA como sigue:

Se usaron placas Nunc Immuno PoliSorp, a cada vial se añadieron 100 gel en cada adición. MB 5 corresponde a la siguiente composición de tampón: 2 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, 10 mM HEPES, 140 mM NaCI.

Se cubrieron las placas durante toda una noche en una habitación fría con 4 μg/ml de apo A-I policlonal anti-humano de conejo (DAKO A/S) disuelto en 50 mMNaHCO3 pH 9,6. Las plaacs se lavaron en MB + 0,05 % de Tween-20 pH 7,8 y se bloquearon en MB + 0,05 % de Tween- 20 + 1 % BSA pH 7,8 durante 1 hora. La muestra se aplicó disuelta en MB + 0,05 % Tween-20 + 1 % BSA pH 7,8 y se incubó durante 1 hora, se lavó en MB + 0,05 % 10 de Tween-20 + 1 % BSA pH 7,8 y se incubó durante 1 hora con anti-apo A-I monoclonal de ratones (Perimmune Inc, clon 10-A8) a una concentración de 1 μg/ml en MB + 0,05 % de Tween-20 + 1 % BSA pH 7,8. Las placas se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratón IgG unido a peroxidasa de rábano picante. Las placas se lavaron de nuevo y se desarrollaron usando comprimidos de OPD y H2O 2, la reacción se detuvo usando 1 M H2SO4. El resultado se compare con un estándar basado en concentraciones conocidas de apo A-I y derivados, 15 respectivamente. No se observó ningún efecto de disolución de Apo A-I en plasma de ratones para el estándar.

Los resultados, mostrados en la Figura 14, verifican que el tiempo de eliminación en plasma de la construcción Trip A Apo A-I se incrementa en al menos 3 veces comparado con el tiempo de eliminación de Apo Al nativa. Los datos preliminares indican que el tiempo de eliminación para Trip A FN Apo A-I es al menos el mismo que para Trip A Apo A-l. Estos datos conjuntamente con los datos de unión a cubilina y datos de unión a DMPC 20 documentan que las construcciones de acuerdo con la invención son fuertes candidatos para tratar las enfermedades mencionadas en la presente solicitud.

Ejemplo 9 Plásmidos

La construcción de acuerdo con la invención se puede fabricar usando los plásmidos descritos más delante. 25

Inserción de una secuencia de engarce Trip-A-AI

Las construcciones que contienen el engarce básico, con las mutaciones mencionadas, se construyó como se hizo la construcción sin engarce. Es decir mediante amplificación por PCR de Apo A-I (y la secuencia de engarce) y la inserción en el plásmido pT7FxH6-Trip-A. El cebador inverso era el mismo que el usado para la construcción de pT7H6FxTrip-A-AI, mientras que los cebadores directos usados fueron: 30

PT7H6FX-Trip-A-FN(-2)-AI:

5'-CGC GGATCC TCG GGT CAG GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC -3' Desafortunadamente todos los clones aislados tenían las G mutadas anteriormente subrayadas una T, indicando una secuencia defectuosa del cebador.

PT7H6FX-Trip-A-TN-AI-Bam-S

5'- cgc gga tcc aag gtg cac atg aag gat gaa ccc ccc cag agc ccc-3' 35

Las mutaciones mencionadas se corrigieron mediante mutagénesis dirigida al sitio usando el kit QuickChange de Stratagene y los siguientes cebadores:

pT7H6FX-Trip-FN-AI:

5'-acg gtc tcc ctg aag gga acc tcg ggt cag gat g-3'

5'-cat cct gac ccg agg ttc cct tca ggg aga ccg t-3' 40

pT7H6FX-Trip-A-TN-AI

5'-acg gtc tcc ctg aag gga acc aag gtg cac atg aag g-3'

5' -cct tca tgt gca cct tgg ttc cct tca ggg aga ccg t-3'

Eliminación del sitio de unión a heparina de Trip-A

Como una derivación adicional de las construcciones, el sitio de unión a heparina de la secuencia Trip-A 45 (Lorentsen RH, Graversen JH, et al. Biochemical Journal (2000), 347 p 83 - 87, se mutó usando el kit de

mutagénesis dirigida al sitio de Stratagene y el siguiente conjunto de cebadores:

Para la mutación de Lisina 9 de Trip-A:

5'-cca acc cag aag ccc aag gcg aat gta aat gcc-3'

5' -gtg ttc aca aca tct gcc ttg gca ttt aca atc-3'

Para la mutación de Lisina 15 de Trip-A: 5

5'-ggc att tac aat cgc ctt ggg ctt ctg ggt tgg-3'

5'-cca acc cag aag ccc aag gcg att gta aat gcc-3'

Estas mutaciones se planean para que se realicen en todos los derivados de Trip-A-apo- AI, posiblemente todos ellos. generando mutantes dobles K9A, K15A de los derivados trip-A, llamados TripA-FN-AI-K9AK15A, TripA-TN-AI-K9AK15A y TripA-AI-K9AK15A. 10

Además del truncamiento del N-terminal también se puede eliminar la afinidad a heparina sin eliminar la trimerización. Véase Holtet et al. Protein Science (1997), Lorentsen et al. Biochem. Journal (2000), Nielsen et al. FEBS (1997) y Nielsen et al Acta Cryst D. (2000). El resto N- terminal se localizaría después de preferencia entre Val 16 y Met 22.

Construcción del plásmido expresión para Hp-α-A-I 15

Primero el plásmido pT7H6Fx-Hp(alfa) (Figura 10H) se construyó como sigue:

A parir de una genoteca de ADNc (hígado fetal de Clontech) la secuencia Hp-se amplificó mediante PCR usando el siguiente conjunto de cebadores:

Cebador de polaridad negativa: 5'-cac aag ctt tcc gct aga tct ctg cac tgg gtt agc cgg att ctt ggg -3' Cebador de polaridad positiva: 5'-ggt gga tcc atc gag ggt agg ggt gtg gac tca ggc aat gat gtc acg g-3' - 3' 20

El producto de PCR contenía las siguientes características:

Sitio BamH 1- - secuencia Hp alfa - sitio Bglll - sitio Hind III.

En la secuencia Hp-alfa el Puente de disulfuro de cisteína con la cadena beta de Hp se mutó a una alanina.

El producto se digirió con BamH I e Hind III y se insertó en el plásmido pT7H6FX, que se secuenció se 25 secuenció. Un producto de PCR que codifica Apo Al humana se usó usando el cebador de sentido contrario estándar también se preparó para preparar pT7H6-Ubi-Fx-ApoAI y pT7H6Fx-TripA-AI. Mientras que el cebador positivo usado como cebador positivo en la construcción de pT7H6FX-TripA-AI. Proporcionando el producto de PCR con las siguientes características:

Sitio BamH I – secuencia Apo Al - sitio Hind III, este producto se digirió con BamH I y Hind III y se insertó 30 en el plásmido anteriormente digerido con Bgl ll e Hind III. El plásmido pT7H6FX- Hp(alfa)- Apo Al se secuenció y la expresión se ensayó en E. coli.

pT7H6 TripA-apoAI (Figura 7):

El plásmido comprende el plásmido pT7H6FxtripA descrito en el documento WO 98/56906 como ejemplo no. 1. 35

La expresión está gobernada por el promotor de T7. El plásmido además comprende una secuencia H6 que es una etiqueta de afinidad de hexa-His para uso en purificación. Después de esto se inserta una secuencia de reconocimiento de Factor Xa (IQGR).

- SPGT es una secuencia de conexión al módulo de trimerización posterior. Esta secuencia se ha insertado debido a que proporciona la oportunidad de cortar la hebra de ADN con Bgl II y Kpn I. 40

- Trip A es el módulo de trimerización de tetranectina. GS es otra secuencia de conexión, que proporciona una oportunidad de cortar conh Bam. HI.

Finalmente el plásmido comprende el ADNc de apoliproteína A-I humana. Que codifica los aminoácidos 25 -267 de la apolipoproteína A-I humana. La proteína expresada y purificada corresponde a la SEQ ID NO 3.

pT7H6TripA-apoA1-de143 (Figura 8):

El plásmido comprende las secuencias como anets, pero la parte de apolipoproteína se ha reemplazado con ADNc que codifica los aminoácidos 68 - 267 de la apolipoproteína A-I humana. La proteína expresada y purificada corresponde a la SEQ ID NO 4.

pT7H6UbiFxApoAI (Figura 5): 5

El plásmido básico se ha descrito en Ellgaard et al (1997). El plásmido comprende las siguientes secuencias:

- La expresión está gobernada por el promotor de T7

- H6: etiqueta de afinidad de hexa-His para la purificación de la construcción de proteína

- Ubi: ADNc que codifica la ubiquitina humana insertada para estabilizar la proteína en E. coli. 10

- FX: secuencia de reconocimiento para el Factor Xa

- ADN que codifica dos restos de Gly, necesario para la escisión óptima por el Factor Xa.

- ApoAI: ADNc que codifica los aminoácidos 25 - 267 de la apolipoproteína A-I humana

La proteína expresada y purificada corresponde a la SEQ ID NO 1.

pT7H6UbiFXCysApoAI (Figura 6): 15

Como anteriormente, pero después que la secuencia que codifica dos restos de glicina pero antes que la secuencia de apolipoproteína A-I que codifica un resto de cisteína se haya insertado. La proteína expresada y purificada corresponde a la SEQ ID NO 2.

PT7H6FXCysApoAI (Figura 9):

El plásmido comprende las siguientes secuencias: 20

- La expresión está gobernada por el promotor de T7

- H6: etiqueta de afinidad de hexa-His para la purificación de la construcción de proteína

- FX: secuencia de reconocimiento para el Factor Xa

- ADN que codifica dos restos de Gly, necesario para la escisión óptima por el Factor Xa.

- ADN que codifica un resto de cisteína 25

- ApoAI: ADNc que codifica los aminoácidos 25 - 267 de la apolipoproteína A-I humana

La proteína expresada y purificada corresponde a la SEQ ID NO 2.

Además los ejemplos de los plásmidos para la expresión de construcciones de apolipoproteínas de acuerdo con la invención se desvelan en la Figura 10 A a G conjuntamente con las correspondientes secuencias de aminoácidos de las proteínas expresadas y purificadas, que se desvelan en el listado de secuencias. 30

REFERENCIAS

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Tschemper et al. 1980. Gene, 10: 157.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Proteopharma ApS

<120> Análogo de apolipoproteínas 25

<130> P 459 PC00

<150> DK PA2000 01682

<151> 2000-11-10

<150> DK PA 2001 00057

<151> 2001-01-15 30

<150> US 60/264.022

<151> 2001-01-26

<160> 14

<170> Patentln version 3.1

<210> 1 35

<211> 243

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 5

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (1)

<223> N-terminal Cys

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 10

<222> (2) .. (244)

<223> Aminoácido no 25 a 267 de Apo AI humana

<400> 2

<210> 3

<211> 301

<212> PRT

<213> Hamo sapiens

5

<220>

<221> misc_característica

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (301)

<223> Apo AI madura

<400> 3

<210> 4

<211> 258

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (258)

<223> Aminoácido 68 - 267 de Apo AI humana

<400> 4

15

<210> 5

<211> 301

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (9) .. (9) 10

<223>

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (15).. (15)

<223> 15

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (301)

<223> Apo-AI madura

<400> 5 20

<210> 6

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (61) 10

<223> Engarce

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (62).. (304)

<223> Apo-AI madura 15

<400> 6

<210> 7

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (57).. (61)

<223> Engarce basado en fibronectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 15

<222> (62).. (304)

<223> Apo-AI madura

<400> 7

<210> 8

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 5

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 10

<222> (57).. (61)

<223> Engarce basado en fibronectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (62).. (304) 15

<223> Apo-AI madura

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (13).. (13)

<223> 20

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (19).. (19)

<223>

<400> 8 25

<210> 9

<211> 306

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (58) 5

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (63)

<223> Engarce 10

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (64).. (606)

<223> Apo-AI madura

<400> 9 15

<210> 10

<211> 306

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (57).. (63) 10

<223> Engarce basado en tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (64).. (306)

<223> Apo-AI madura 15

<400> 10

<210> 11

30 <211> 306

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (57).. (63) 10

<223> Engarce basado en tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (64).. (306)

<223> Apo-AI madura 15

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (13).. (13)

<223>

<220> 20

<221> MUTÁGENO

<222> (19).. (19)

<223>

<400> 11

<210> 12

<211> 51

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<300>

<302> Módulo de trimerización

<309>

<310> Documento WO 98/56906 10

<311> 1998-06-11

<312> 1998-12-17

<313> (1) .. (51)

<400> 12

<210> 13

<211> 58

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

5 <221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (4)

<223> Secuencia de engarce

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (5) .. (56)

<223> TTSE modificado

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 15

<222> (57).. (58)

<223> Engarce

<400> 13

<210> 14

<211> 329

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (86)

<223> Restos de Hp(alfa) residues

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

50 <222> (87).. (329)

<223> Apo A-I

<400> 14

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Proteopharma ApS

30

<120> Análogos de apolipoproteínas 5

<130> Documento16278EP00

<160> 39

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 243 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (1)

<223> N-terminal Cys

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (2) .. (244)

<223> Aminoácido no 25 a 267 de Apo AI humana

<400> 2

<210> 3

<211> 301

<212> PRT

<213> Hamo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

5 <222> (59).. (301) 10

<223> Apo AI madura

<400> 3

<210> 4

<211> 258

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (258)

<223> Aminoácido 68 - 267 de Apo AI humana

<400> 4

<210> 5

<211> 301

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (58) 5

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (9) .. (9)

<220> 10

<221> MUTÁGENO

<222> (15).. (15)

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (301) 15

<223> Apo-AI madura

<400> 5

<210> 6

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (61) 10

<223> Engarce

5 <220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (62).. (304)

<223> Apo-AI madura 15

<400> 6

<210> 7

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (57).. (61)

<223> Engarce basado en fibronectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 15

<222> (62).. (304)

<223> Apo-AI madura

<400> 7

<210> 8

<211> 304

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220> 10

<221> MUTÁGENO

<222> (13).. (13)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (19).. (19) 15

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (57).. (61)

<223> Engarce basado en fibronectina

<220> 20

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (62).. (304)

<223> Apo-AI madura

<400> 8

25

<210> 9

<211> 306

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (58)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina 10

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (59).. (63)

<223> Engarce

<220> 15

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (64).. (306)

<223> Apo-AI madura

<400> 9

<210> 10

<211> 306

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (57).. (63) 10

<223> Engarce basado en tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (64).. (306)

<223> Apo-AI madura 15

<400> 10

<210> 11

<211> 306

<212> PRT

<213> Homo sapiens

50 <220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 5

<222> (1 ).. (56)

<223> Módulo de trimerización de tetranectina

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (13).. (13) 10

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (19).. (19)

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 15

<222> (57).. (63)

<223> Engarce basado en tetranectina

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (64).. (306) 20

<223> Apo-AI madura

<400> 11

<210> 12

<211> 51

<212> PRT

<213> Hamo sapiens 5

<300>

<302> Módulo de trimerización

<310> Documento WO 98/56906

<311> 1998-06-11

<312> 1998-12-17

<313> (1) .. (51)

<400> 12

<210> 13 5

<211> 58

<212> PRT

<213> Hamo sapiens

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA 10

<222> (1 ).. (4)

<223> Secuencia de engarce

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (5) .. (56) 15

<223> TTSE modificado

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (57).. (58)

<223> Engarce 20

<400> 13

<210> 14

<211> 329

<212> PRT

<213> Hamo sapiens 5

<220>

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (1 ).. (86)

<223> Restos de Hp(alfa)

<220> 10

<221> MISC_ CARACTERÍSTICA

<222> (87).. (329)

<223> Apo A-I

<400> 14

<210> 15

<211> 267

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 15

<210> 16

<211> 267

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<400> 16

<210> 17

<211> 267

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis 5

<400> 17

<210> 18

<211> 265

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 18

5

<210> 19

<211> 265

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 19

<210> 20

<211> 266

<212> PRT

<213> Canis familiaris 5

<400> 20

<210> 21

<211> 206

<212> PRT

<213> Oryctolagus cuniculus 5

<400> 21

<210> 22

<211> 265

<212> PRT

<213> Tupaia glis belangeri

<400> 22 5

<210> 23

<211> 264

<212> PRT

<213> Mus musculus 5

<400> 23

<210> 24

<211> 259

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus 5

<400> 24

<210> 25

<211> 241

<212> PRT

<213> Erinaceus europaeus 5

<400> 25

<210> 26

<211> 264

<212> PRT

<213> Gallus gallus 5

<400> 26

<210> 27

<211> 264

<212> PRT

<213> Coturnix japonica

<400> 27 5

<210> 28

<211> 264

<212> PRT

<213> Anas platyrhynchos 5

<400> 28

<210> 29

<211> 262

<212> PRT

<213> Oncorhynchus mykiss 5

<400> 29

<210> 30

<211> 262

<212> PRT

<213> Salmo trutta 5

<400> 30

<210> 31

<211> 258

<212> PRT

<213> Salmo salar 5

<400> 31

<210> 32

<211> 262

<212> PRT 5

<213> Brachydanio rerio

<400> 32

<210> 33

<211> 260

<212> PRT

<213> Sparus aurata 5

<400> 33

<210> 34

<211> 396

<212> PRT

<213> Hamo sapiens 5

<400> 34

<210> 35

<211> 429

<212> PRT

<213> Macaca sp. 5

<400> 35

<210> 36

<211> 395

<212> PRT

<213> Mus sp. 5

<400> 36

<210> 37

<211> 401

<212> PRT

<213> Babeen sp. 5

<400> 37

<210> 38

<211> 382

<212> PRT

<213> Sus sp. 5

<400> 38

<210> 39

<211> 391

55 <212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 39

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una construcción de apolipoproteínas para uso como un medicamento que tiene la fórmula general

   apo-A-X,

   - en la que apo-A es un componente de apolipoproteína seleccionado entre el grupo que consiste en apolipoproteína Al, apolipoproteína AII, apolipoproteína AIV, un análogo, o su variante que comparte al menos 70 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por 5

   SEQ ID NO 15:

   y

   y (i) X es una proteína heteróloga que comprende más de 200 aminoácidos, con la condición que cuando la construcción consiste en exactamente dos apolipoproteínas nativas idénticas están ligadas C-terminal a N-terminal,

   o 5

   (ii) X es un resto heterólogo que es un módulo de oligomerización,

   en la que la construcción tiene un incremento de semivida en plasma comparada con la apolipoproteína de tipo salvaje; y en la que el análogo o variante es capaz de provocar la misma respuesta fisiológica que la apolipoproteína-A-I, A-II o A-IV.
2. 2. La construcción de la reivindicación 1, que comprende además un espaciador entre el componente apo-A y X. 10
3. 3. La construcción de la reivindicación 2, en la que el espaciador comprende un péptido espaciador.
4. 4. La construcción de la reivindicación 3, en la que el péptido espaciador comprende al menos dos aminoácidos, tal como al menos tres aminoácidos, por ejemplo al menos cinco aminoácidos, tal como al menos diez aminoácidos, por ejemplo al menos 15 aminoácidos, tal como al menos 20 aminoácidos, por ejemplo al menos 30 aminoácidos, tal como al menos 40 aminoácidos, por ejemplo al menos 50 aminoácidos, tal como al menos 60 aminoácidos, por 15 ejemplo al menos 70 aminoácidos, tal como al menos 80 aminoácidos, tal como al menos 90 aminoácidos tal como aproximadamente 100 aminoácidos.
5. 5. La construcción de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el espaciador está unido al componente de apo-A y X mediante enlaces covalentes.
6. 6. La construcción de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el espaciador es esencialmente no inmunógeno, y / 20 o es propenso a la escisión proteolítica y / o no comprende ningún resto de cisteína.
7. 7. La construcción de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la estructura tridimensional del espaciador es lineal o sustancialmente lineal.
8. 8. La construcción de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el péptido espaciador comprende la secuencia de aminoácidos GTKVHMK de tetranectina, secuencia de aminoácidos PGTSGQQPSVGQQ y GTSGQ de la hebra de 25 conexión 3 de fibronectina humana, PKPSTPPGSS de la región de articulación de IgG3 de tipo murino, SGGTSGSTSGTGST, AGSSTGSSTGPGSTT o GGSGGAP.
9. 9. La construcción de la reivindicación 1, en la que la proteína o péptido comprende al menos una proteína de mamífero.
10. 10. La construcción de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la proteína de mamífero es una proteína humana. 30
11. 11. La construcción de la reivindicación 9, en la que la proteína comprende al menos una proteína seleccionada entre el grupo que comprende albúmina, más de preferencia albúmina sérica, el fragmento de serina proteasa de plasminógeno u otra serina proteasa modificada por ingeniería genética mediante rotura de la triada catalítica, y la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas.
12. 12. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el componente X comprende al menos una 5 apolipoproteína A-I, apolipoproteína A-II, apolipoproteína A-IV, Apolipoproteína E, su análogo o variante que comparte al menos 70 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en

    y
13. 13. La construcción de la reivindicación 9, en la que el péptido que constituye el componente X comprende más de 300 aminoácidos, por ejemplo más de 400 aminoácidos, tal como más de 500 aminoácidos, por ejemplo más de 5 600 aminoácidos, 5 tal como más de 700 aminoácidos, por ejemplo más de 800 aminoácidos, tal como más de 900 aminoácidos, por ejemplo más de 1000, 1250, 1500, 2000, o 2500 aminoácidos.
14. 14. La construcción de la reivindicación 1, en la que el módulo de oligomerización es un módulo de dimerización.
15. 15. La construcción de la reivindicación 1, en la que el módulo de oligomerización es un módulo de trimerización.
16. 16. La construcción de la reivindicación 1, en la que el módulo de oligomerización es un módulo de trimerización. 10
17. 17. La construcción de la reivindicación 1, en la que el módulo de oligomerización es de naturaleza no peptídica.
18. 18. La construcción de la reivindicación 15, en la que el módulo de trimerización comprende una secuencia de aminoácidos capaz de mediar el intercambio de reconocimiento entre cadena, trimerización y alineación de tres cadenas de polipéptidos.
19. 19. La construcción de la reivindicación 15, en la que el módulo de trimerización comprende el módulo de 15 trimerización de tetranectina.
20. 20. La construcción de la reivindicación 19, en la que el módulo de trimerización de tetranectina es capaz de formar un complejo estable con otro módulo de trimerización de tetranectina.
21. 21. La construcción de las reivindicaciones 19 a 21, en la que el módulo de trimerización que comprende dos módulos de trimerización de tetranectina unidos mediante un resto espaciador, que permite que los dos módulos 20 de trimerización de tetranectina tomen parte en una formación de complejo no siendo un tercer módulo de trimerización de tetranectina parte de la construcción de apolipoproteínas.
22. 22. La construcción de las reivindicaciones 19 a 21, en la que al menos un módulo de trimerización de tetranectina

    está seleccionada entre el grupo que consiste en tetranectina humana, tetranectina murina o lectina de tipo C de cartílago humano, bovino o de tiburón.
23. 23. La construcción de las reivindicaciones 19 a 22, en la que el módulo de trimerización de tetranectina comprende a secuencia que tiene al menos un 68 % de identidad con la secuencia de consenso de la SEQ ID NO 12.
24. 24. La construcción de la reivindicación 23, en la que el resto de cisteína nº 50 está sustituido por un resto de 5 serina, un resto de treonina, un resto de metionina.
25. 25. La construcción de la reivindicación 23, en la que el resto de cisteína nº 50 está sustituido por cualquier otro resto de aminoácido.
26. 26. La construcción de la reivindicación 1, que tiene una semivida de al menos la semivida de Apo Al, A-II o A-IV nativas, de preferencia al menos 2 veces mayor, más de preferencia al menos 3 veces mayor, tal como 4 veces, 10 más de preferencia al menos 5 veces mayor, tal como 6 veces, más de preferencia al menos 8 veces mayor, tal como al menos 10 veces.
27. 27. La construcción de la reivindicación 1, que tiene una afinidad de unión mayor a colesterol comparada con Apo A-I, A-II o A-IV nativas.
28. 28. La construcción de la reivindicación 1, capaz de unirse a un receptor seleccionado entre el grupo constituido por 15 cubilina, receptor de inactivador de clase B, tipo 1 (SR-B1), módulo 1 de unión a ATP (ABC1), Lecitina:colesterol aciltransferasa (LCAT), proteína de transferencia de ésteres de colesteril (CETP), proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP).
29. 29. La construcción de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene secuencia de aminoácidos que comparte al menos 70% de identidad de secuencia a una de las secuencias SEQ ID NO 3 a SEQ ID NO 11, o SEQ ID NO 14. 20
30. 30. Uso de medicamento como se define en las reivindicaciones 1 a 29 para la preparación de una composición farmacéutica.
31. 31. El uso de la reivindicación 30, para el tratamiento y / o prevención of arterosclerosis.
32. 32. El uso de la reivindicación 30, para la eliminación de las endotoxinas.
33. 33. El uso de la reivindicación 30, en el tratamiento de angina de pecho. 25
34. 34. El uso de la reivindicación 30, en el tratamiento de infarto de miocardio.
35. 35. El uso de la reivindicación 30, en el tratamiento de angina de pecho de placa.
36. 36. El uso de la reivindicación 30, en el tratamiento de angina de pecho inestable.
37. 37. El uso de la reivindicación 30, en el tratamiento de estenosis arterial tal como claudicación, estenosis de carótida o estenosis arterial cerebral. 30