ES2356196T5 - Uso de polidextrosa y galacto-oligosacárido para simular los atributos funcionales de lacto oligosacáridos humanos en lactantes alimentados con la fórmula - Google Patents

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DESCRIPCIÓN

Uso de polidextrosa y galacto-oligosacárido para simular los atributos funcionales de lacto oligosacáridos humanos en lactantes alimentados con la fórmula 5 Antecedentes de la invención

(1) Campo de la invención

10 La presente invención se relaciona con el uso de polidextrosa para simular los atributos funcionales de los oligosacáridos de la leche humana en lactantes.

(2) Descripción de la técnica relacionada

15 La microflora del intestino de los lactantes se establece rápidamente en las primeras pocas semanas luego del nacimiento. La naturaleza de esta colonización intestinal se determina inicialmente por la exposición temprana a las fuentes ambientales de microbios así como también la salud del lactante. Si el lactante es alimentado con mama o alimentado con fórmula también tiene una fuerte influencia en la población bacteriana intestinal.

20 En los lactantes alimentados con mama, por ejemplo, bifidobacterium spp; dominante entre las bacterias intestinales, con Streptococcus spp. y lactobacillus spp. Como contribuyentes menos comunes. En contraste, la microflora de los lactantes alimentados con fórmula es más diversa, conteniendo Bifidobacterium spp y Bacteroides spp así como también las especies más patógenas, Staphylococcus, Escherichia coli y Clostridia. Las varias especies de Bifidobacterium en las heces de los lactantes alimentados con mama y los lactantes alimentados con fórmula también difieren.

25 La Bifidobacteria se considera generalmente bacteria “benéfica” y se conoce por proteger contra la colonización por bacterias patógenas. Esto ocurre probablemente a través de la competencia para receptores de superficie celular, competición para nutrientes esenciales, producción de agentes antimicrobianos, y producción de compuestos inhibitorios tal como ácidos grasos de cadena corta (SCFA) que puede disminuir el PH fecal e inhibir bacterias potencialmente patógenas.

30 La Bifidobacteria también está asociada con la resistencia a infección del tracto gastrointestinal (GI) e infección respiratoria así como también una función inmune mejorada en niños y lactantes. Por lo tanto, la promoción del ambiente intestinal en el cual la Bifidobacteria domina se ha vuelto la meta en el desarrollo de formulaciones nutricionales para lactantes alimentados con fórmula.

35 La leche humana contiene un número de factores que pueden contribuir al crecimiento de la población de Bifidobacteria en la microflora del intestino de los lactantes. Entre estos factores esta una mezcla de complejo de más de 130 diferentes Oligosacáridos que alcanza niveles tan altos como 8-12 g/L en la leche transicional y madura. Kunz, et al., Oligosaccharides in Human Milk: Structure, Functional, and Metabolic Aspects, Ann. Rev. Nutr. 20: 699-722 (2000). Estos oligosacáridos son resistentes a la digestión enzimática en el tracto gastrointestinal superior y alcanzan el colon sano, donde ellos sirven como

40 sustratos para la fermentación en el colon.

Los oligosacáridos de HM se cree que elicitan un incremento en el número de Bifidobacteria en la flora del colon, junto con la reducción en el número de bacterias potencialmente patógenas. Kunz, et al.; Oligosaccharides in Human Milk: Structure, Functional, and Metabolic Aspects, Ann. Rev. Nutr. 20: 699-722 (2000); Newburg, Do the Binding Properties of

45 Oligosaccharides in Milk Protect Human Infants from Gastrointestinal Bacteria?, J. Nutr. 217:S980-S984 (1997). Una manera en que los oligosacáridos HM pueden incrementar el número de Bifidobacteria y reducir el número de bacteria potencialmente patógena es al actuar como receptores competitivos e inhibir la unión de los patógenos a la superficie celular. Rivero-Urgell, et al., Oligosaccharides: Application in Infant Food, Early Hum. Dev. 65(S):43-52 (2001).

50 Además de reducir el número de bacterias patógenas y promover la población de bifidobacterias, cuando los oligosacáridos HM se fermentan, ellos producen las SCFA tales como los ácidos acético, propiónico y butírico. Estos SCFA se cree que contribuyen al contenido calórico, sirven como una fuente de energía principal para el epitelio intestinal, estimulan el sodio y la absorción de agua en el colon, y mejoran la digestión del intestino delgado y la absorción. Además, los SCFA se cree que contribuyen a la salud gastrointestinal completa al modular el desarrollo gastrointestinal y la función inmune.

55 La fermentación de los oligosacáridos de HM también reduce el amonio fecal, la amina y las concentraciones de fenol, que han estado implicadas como componentes olorosos principales de las heces. Cummings & Macfarlane, The Control and Consequences of Bacterial Fermentation in the Human Colon, J. Appl. Bacteriol. 70:443-459 (1991); Miner & Hazen, Ammonia and Amines: Components of Swine-Building Odor ASAE 12:772-774 (1969); Spoelstra, Origin of Objectionable

60 Components in Piggery Wastes and the Possibility of Applying Indicator Components for Studying Odour Development, Agric. Environ. 5:241-260 (1980); O’Neill & Phillips, A Review of the Control of Odor Nuisance from Livestock Buildings: Part 3. Properties of the Odorous Substances which have been Identified in Livestock Wastes or in the Air Around them J. Agric. Eng. Res. 53:23-50 (1992).

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Como resultado de los oligosacáridos presentes en HM, el perfil de los SCFA de los infantes alimentados con mama es muy

5 diferente de aquella de un lactante alimentado con fórmula. Por ejemplo, los lactantes alimentados con mama no producen virtualmente butirato, con acetato comprendiendo aproximadamente el 96% de la producción total de los SCFA. Lifschitz, et al., Characterization of Carbohydrate Fermentation in Feces of Formula-Fed and Breast-Fed Infants, Pediatr. Res. 27:165169 (1990); Siigur, et al., Faecal Short-Chain Fatty Acids in Breast-Fed and Bottle-Fed Infants. Acta. Paediatr. 82:536-538 (1993); Edwards, et al., Faecal Short-Chain Fatty Acids in Breast-Fed and Formula-Fed Babies, Acta. Paediatr. 72:459-462

10 (1994); Parrett & Edwards, In Vitro Fermentation of Carbohydrates by Breast Fed and Formula Fed Infants, Arch. Dis. Child 76:249-253 (1997). En contraste, aunque los lactantes alimentados con fórmula también tienen acetato (74%) como los SCFA principales en las heces, ellos tienen considerables cantidades de propionato (23%) y cantidades pequeñas de butirato (3%) presentes también. Estas diferencias entre los perfiles de los SCFA de los lactantes alimentados con mama y los infantes alimentados con fórmula podrían afectar la energía, digestión, y salud total de los lactantes alimentados con

15 fórmula.

En razón de que la leche de vaca y las fórmulas para lactantes comercialmente disponibles que están basadas en leche de vaca suministran solamente cantidades en trazas de oligosacáridos, los prebióticos son utilizados a menudo para suplementar la dieta de los infantes alimentados con fórmula. Los prebióticos se han definido como “ingredientes de

20 alimentos no digeribles que afectan benéficamente el hospedero al estimular selectivamente el crecimiento y/o la actividad de una o un número ilimitado de bacterias en el colon que puede promover la salud del huésped”. Gibson, G.R. & Roberfroid, M.B., Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota-Introducing the Concept of Probiotics, J. Nutr. 125:1401-1412 (1995). Los prebióticos comunes incluyen fructo-oligosacárido, gluco-oligosacárido, galacto-oligosacárido, y somalto-oligosacárido, xilo-oligosacárido y lactulosa.

25 Se ha descrito la incorporación de varios ingredientes prebióticos en fórmulas para lactantes. Por ejemplo, la solicitud de patente U.S. Número 200300072865 de Bindels, et al., describe una fórmula para lactantes con un contenido de proteína mejorado y al menos un prebiótico. El componente prebiótico puede ser lacto-N-tetaosa, lacto-N-fuco-pentaosa, lactulosa (LOS), lactosacarosa, rafinosa, galacto-oligosacárido (GOS), fructo-oligosacárido (FO), oligosacáridos derivados de los

30 polisacáridos de la soya, oligosacáridos a base de manosa, arabino-oligosacáridos xilo-oligosacáridos, isomaltooligosacáridos, glucanos, sialil-oligosacáridos, y fluco-oligosacáridos.

De manera similar, la solicitud de patente U.S. No. 20040191234 de Haschke describe un método para mejorar la respuesta inmune que comprende administrar al menos un prebiótico. El prebiótico puede ser un oligosacárido producido de glucosa,

35 galactosa, xilosa, maltosa, sacarosa, lactosa, almidón, xilano, hemicelulosa, inulina, o una mezcla de los mismos. El prebiótico puede estar presente en un cereal para lactantes.

Desafortunadamente, sin embargo, existen muchas desventajas en la administración de los prebióticos anteriores para lactantes formulados. Aunque ellos pueden afectar benéficamente la población de probióticos en el intestino, ellos no 40 producen un perfil de SCFA que sea similar a aquel del lactante alimentado con mama. Adicionalmente, la fermentación de muchos de estas sustancias prebióticas ocurre a una velocidad muy rápida, lo que a menudo produce exceso de gas, distensión abdominal, meteorismo y diarrea. Por lo tanto, la elección de las sustancias prebióticas en fórmulas para lactantes se debe hacer con la meta de maximizar los beneficios potenciales y minimizar los efectos colaterales indeseados.

45 De acuerdo con esto, sería benéfico suministrar una sustancia prebiótica que estimula a los atributos funcionales de los oligosacáridos de leche de humanos en lactantes, tal como un incremento en la población y especies de bacterias benéficas en el intestino de los lactantes y la producción de un perfil de SCFA similar a aquel de un lactante alimentado con mama. Adicionalmente, la sustancia prebiótica debe ser bien tolerada en lactantes y no debe producir u originar exceso de gas, distensión abdominal, meteorismo o diarrea.

50 Resumen de la Invención

La presente invención se define en las reivindicaciones finales.

55 En resumen, por lo tanto, la presente invención se dirige primero al uso novedoso de polidextrosa (PDX y GOS) en la elaboración de una fórmula para lactantes para simular los atributos funcionales de los oligosacáridos de la leche humana al incrementar la producción de acetato y disminuir la producción de butirato para producir un perfil de ácido graso de cadena corta en los lactantes alimentados con fórmula similar a aquella producida en los lactantes alimentados con mama, y al disminuir la velocidad de proporción de la fermentación de los prebióticos dentro del intestino de un lactante alimentado con

60 fórmula.

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La presente invención también se dirige a una fórmula para lactantes que comprende PDX y GOS en donde la cantidad total de PDX y GOS en la fórmula para lactantes está entre 1.0 g/L y 10.0 g/L, para ser administrada diariamente.

El PDX y GOS se puede utilizar en la elaboración de una fórmula para lactantes para incrementar la población y especies de 5 bacterias benéficas en un lactante alimentado con fórmula.

El PDX y GOS se puede utilizar en la elaboración de una fórmula para lactantes para producir un perfil de ácido graso de cadena corta (SCFA) en un lactante alimentado con fórmula que sea similar a aquella de un lactante alimentado con mama. Específicamente, el PDX y el GOS pueden originar el perfil de SCFA para que tenga un nivel creciente de acetato y una

10 disminución en butirato.

El PDX y el GO se pueden utilizar en la elaboración de una fórmula para lactantes para disminuir la tasa y la proporción de la fermentación de los prebióticos dentro del intestino de un lactante alimentado con fórmula. Más particularmente, la invención reduce la producción de gas total así como también la producción de dióxido de carbono dentro del intestino del

15 lactante.

Entre las varias ventajas encontradas a ser logradas con la presente invención, es bien tolerada en lactantes y simula los atributos funcionales de los oligosacáridos de la leche humana en lactantes, tal como una población creciente y especies de bacterias benéficas en el intestino del lactante, la optimización de las características de las heces, y la producción de un

20 perfil SCFA similar a aquel del lactante alimentado con mama.

Breve descripción de los dibujos

Para un entendimiento más completo de la presente invención, se hace referencia ahora a las siguientes descripciones 25 tomadas en conjunto con los dibujos que la acompañan.

La figura 1 ilustra la producción total de SCFA durante la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS.

La figura 2 ilustra cambios de pH durante la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS. 30 La figura 3 ilustra la proporción relativa de producción de ácido acético en la fermentación de GOS, LOS, PDX2 y FOS.

La figura 4 ilustra la proporción relativa de producción de ácido propiónico en la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS.

35 La figura 5 ilustra la proporción relativa de producción de ácido butírico en la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS.

La figura 6 ilustra la proporción relativa de ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico y a producción total de SCFA en la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS.

40 La figura 7 ilustra la producción total de SCFA durante la fermentación de varias combinaciones de carbohidratos prebióticos.

La figura 8 ilustra los cambios de pH durante la fermentación de varias combinaciones de carbohidratos prebióticos.

45 La figura 9 ilustra la producción total de SCFA durante la fermentación de diferentes combinaciones de PDX y GOS.

La figura 10 ilustra la concentración de ácido acético producido durante la fermentación de diferentes combinaciones de PDX y GOS.

50 La figura 11 ilustra las concentraciones de ácido propiónico producidas durante la fermentación de diferentes combinaciones de PDX y GOS.

La figura 12 ilustra la concentración de ácido butírico producida durante la fermentación de diferentes combinaciones de PDX y GOS. 55 La figura 13 ilustra la formación de gases como volumen total durante la fermentación de GOS, LOS, PDX2 y FOS.

La figura 14 ilustra la formación de gases como concentración de dióxido de carbono durante la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS. 60

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La figura 15 ilustra la formación de gases como concentración de hidrógeno durante la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS. La figura 16 ilustra la formación de gases como concentración de disulfuro de hidrogeno durante la fermentación del GOS, LOS, PDX2 y FOS.

5 La figura 17 es el resumen del efecto prebiótico de la leche humana FOS, LOS, GOS, PDX, y varias combinaciones de los mismos en la micro flora fecal.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

10 Se hará ahora referencia en detalle a las realizaciones de la invención, de los cuales se establecen uno o más ejemplos adelante. Cada ejemplo se suministra por vía de explicación de la invención, no una limitación de la invención. De hecho, será evidente para aquellos expertos en la técnica que varias modificaciones y variaciones se pueden hacer en la presente invención sin apartarse del alcance de la invención. Por ejemplo, las características ilustradas o descritas como parte de una realización, se pueden utilizar como otra realización para producir una realización adicional.

15 Así, se pretende que la presente invención cubra tales modificaciones y variaciones por estar dentro del alcance de las reivindicaciones finales. Otros objetos, características y aspectos de la presente invención se describen o son obvios de la siguiente descripción detallada. Se debe entender por una persona medianamente versada en la materia que la presente discusión es una descripción de realizaciones de ejemplos solamente, y no pretende imitar los aspectos más amplios de la

20 presente invención.

Definiciones

Tal como se utiliza aquí, el término “prebiótico” significa un ingrediente de alimento no digerible que afecta benéficamente el

25 huésped al estimular selectivamente el crecimiento y/o la actividad de uno o un número limitado de bacterias en el colon que puede mejorar la salud del huésped.

El término “probiótico” significa un microorganismo con baja o ninguna patogenicidad que ejerce efectos benéficos en la salud del huésped.

30 Como se utilizan aquí, el término “lactante” significa un humano que es menor de aproximadamente un año.

Una “cantidad terapéuticamente efectiva” como se utiliza en la presente solicitud, significa una cantidad que suministra un efecto prebiótico en el sujeto.

35 El término “simular”, como se utiliza aquí significa que tiene o produce una semejanza sintomática.

Los términos “atributos funcionales” significan cualquier cualidad o característica inherente que origine al que haga que algo ocurra. Ejemplos de atributos funcionales de los oligosacáridos de la leche humana en la presente invención puede incluir el

40 incremento de la población y de las especies de bacterias benéficas, la producción de un perfil de SCFA que es alto en ácido acético y bajo en ácido butírico, y la producción de una tasa lenta y una proporción baja de fermentación de prebióticos en el intestino.

Cómo se utilizan aquí el término “fórmula para lactantes” significa una composición que satisface los requisitos de nutrientes

45 de un lactante y que es un sustituto de la leche humana. En los Estados Unidos, el contenido de una fórmula para lactantes es dictado por las reglamentaciones federales establecidas el 21 C.F.R. secciones 100, 106 y 107. Estas reglamentaciones definen los macronutrientes, las vitaminas, los minerales, y otros niveles de ingredientes en un esfuerzo para estimular las propiedades nutricionales y otras de la leche humana de mama.

50 Invención

De acuerdo con la presente invención se ha descubierto un uso novedoso del PDX y GOS en la elaboración de una fórmula para lactantes para simular los atributos funcionales de los oligosacáridos o de la leche humana en lactantes alimentados con fórmula. La administración del PDX y GOS suministra un efecto benéfico en la población y especies de probióticos,

55 produce un perfil SCFA que es similar a aquel de los lactantes alimentados con mama y es físicamente bien tolerado por los lactantes.

El PDX es un carbohidrato no digerible que se ha sintetizado de glucosa aleatoriamente reticulada y sorbitol. Esta no es digerida en el tracto GI superior y es solamente parcialmente fermentada en el tracto GI inferior, elaborando un ingrediente

60 benéfico para la salud digestiva. Los beneficios fisiológicos del PDX incluyen una masa fecal creciente un tiempo de tránsito reducido, un pH fecal más bajo y una concentración reducida de sustancias que producen putrefacción en el colon. En adultos, la digestión de PDX también ha mostrado ayudar en la promoción y el crecimiento de bacterias benéficas en el intestino y la producción de los SCFA.

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El PDX se ha identificado como una sustancia prebiótica para adultos basada en sus funciones en el tracto GI. Por ejemplo,

5 la solicitud de patente U.S. No. 20040062758 de Mayra-Makinen, et al. Se relaciona con una composición que comprende un probiótico y uno o más prebióticos, donde el prebiótico puede ser GOS, palatinose-oligosacárido, oligosacáridos de frijol de soya, genti-oligosacáridos, xilooligómeros, almidón no degradable, lactosacarosa, LOS, lactitol, manitol, o PDX. De manera similar, la patente U.S. No. 4,859,488 de Kan se relaciona con un alimento líquido que comprende PDX y oligosacáridos que son útiles para curar la constipación.

10 El PDX no ha sido, sin embargo, identificado como prebiótico que suministre los beneficios de la presente invención y se pueda administrar a lactantes. La microflora del intestino de los lactantes es bien conocida por ser mucho menos desarrollada que aquella de los adultos. Aunque la microflora del humano adulto consiste de más de 1013 microorganismos y aproximadamente 500 especies, la microflora del intestino de un lactante contiene tan solo una fracción de aquellos

15 microorganismos, tanto en número absoluto como en diversidad de especies. En razón a que las poblaciones bacterianas y las especies varían inmensamente entre el intestino de un lactante y un adulto, no se puede asumir que una sustancia prebiótica que tenga un efecto benéfico en los adultos también tendría un efecto benéfico en lactantes.

En los adultos, la digestión de PDX ha mostrado que incrementa la producción de acetato y butirato. En razón a que el

20 butirato no se nota en niveles apreciables en los infantes alimentados con mama, y se ha asociado con aspectos dañinos si produce niveles significativos en el intestino del lactante, del PDX no sería considerado generalmente apropiado para la nutrición de los lactantes con base en sus efectos observados en el sistema GI de los adultos. Así, fue sorprendente e inesperado que el PDX se metabolizara de hecho primariamente a acetato y propionato, con poca formación de butirato. Así, no solo el PDX tiene un impacto positivo en la población y especies de bacterias benéficas en el tracto intestinal de los

25 lactantes, si no que el PDX también crea un perfil SCFA que es muy similar a aquel de los lactantes alimentados con mama y sería extremadamente bien tolerado por los lactantes.

Una referencia particular que se relaciona con el PDX en el contexto de la administración de los lactantes de hecho enseña lo contrario de la presente invención. La solicitud de patente U.S. No. 20030157146 de Rautonen, asevera que el PDX

30 puede estimular el sistema inmune de los lactantes. En esa aplicación, sin embargo, el solicitante describe que el PDX de hecho disminuye la población de Bifidobacteria en el intestino del lactante (Rautonen App., para. 0074). El solicitante justifica este resultado al hacer notar que “una abundancia de Bifidobacteria puede originar también menos efectos fisiológicos deseables tales como las enfermedades bacterianas entéricas y la inmunosupresión”. (Rautonen App., para. 0069).

35 En razón a que la referencia enseña que el PDX de hecho disminuye la población de bifidobacteria en el intestino del lactante, está en conflicto directo con la enseña de la presente solicitud. Adicionalmente, la referencia no demuestra que el PDX incremente la producción de acetato, disminuya la producción de butirato o disminuya la tasa de fermentación de los prebióticos dentro del intestino del lactante.

40 De acuerdo con el uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva PDX y GOS se debe administrar al lactante con el propósito de simular los atributos funcionales de los oligosacáridos de la leche humana. Una cantidad terapéuticamente efectiva del PDX puede estar entre 1.0 g/L y 10.0 g/L, para ser administrada diariamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de PDX puede estar entre 2.0 g/L y 8.0 g/L, para ser administrada

45 diariamente.

El PDX está comercialmente disponible de una variedad de fuentes. Por ejemplo, el STA-LITE ® PDX está disponible en bolsas de 5 lb de Honeyville Grain, Inc., localizado en Salt lake City, UT. Alternativamente, Litesse® Ultra™ PDX esta comercialmente disponible de Danisco Sweeteners, Ltd., localizado en el Reino Unido.

50 El PDX es bien adecuado para la incorporación en una fórmula para lactantes, en razón a que este contiene solamente 1 Cal/g, comparados con los 4 Cal/g para los prebióticos típicos. También es altamente soluble y de sabor neutro. Por lo tanto, su adición a la fórmula para lactantes no cambiará las características físicas o de sabor de la composición.

55 De acuerdo con el uso de la invención, el PDX y el GOS se suplementan en la fórmula para lactantes que es entonces para alimentar a un lactante.

La fórmula para lactantes para uso en la presente invención es preferiblemente nutricionalmente completa y típicamente contiene tipos adecuados y cantidades de lípido, carbohidratos, proteína, vitaminas y minerales. La cantidad de lípido o

60 grasa puede típicamente variar desde aproximadamente 3 a aproximadamente 7 g/100 Kcal. La cantidad de proteína típicamente puede variar desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 g/100 Kcal. La cantidad de carbohidrato típicamente puede variar desde aproximadamente 8 a aproximadamente 12 g/100 Kcal. Las fuentes de proteínas pueden ser cualquiera utilizada en la técnica, por ejemplo, leche no grasa, proteína de suero, caseína, proteína de caseína, proteína de soya, proteína hidrolizada, aminoácidos, y similares. Las fuentes de carbohidrato pueden ser cualquiera utilizada en la técnica, por ejemplo, lactosa, glucosa, sólidos de jarabe de maíz, maltodextrinas, sacarosa, almidón, sólidos de melaza de

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5 arroz, y similares. Las fuentes de lípido pueden ser cualquiera utilizada en la técnica, por ejemplo, aceites vegetales tales como, aceite de palma, aceite de frijol de soya, palmoleína, aceite de coco, aceite de triglicérido de cadena media, aceite de girasol alto oleico, aceite de alazor alto oleico, y similares.

De manera conveniente, se puede utilizar una fórmula para lactantes comercialmente disponible. Por ejemplo, Enfalac,

10 Enfamil®, Enfamil® Formula Prematuro, Enfamil® con Hierro, Lactofree®, Nutramigen®, Pregestimil®, o ProSobee® (disponible de Mead Johnson & Company, Evansville, IN, U.S.A.) se puede suplementar con niveles adecuados de PDX y utilizarse en la práctica de la invención.

En una realización del uso de la presente invención, y el PDX y el GOS se deben administrar en combinación con otro

15 prebiótico. El prebiótico seleccionado puede ser cualquier prebiótico conocido en la técnica. Ejemplos de prebióticos incluyen, pero no están limitados a: FOS, inulina, gluco-oligosacárido, isomalto-oligosacárido, silo-oligosacárido, oligosacáridos de frijol de soya, quito-oligosacárido, gentio-oligosacárido, mano-oligosacárido, LOS, lactosacarosa, rafinosa, arabino-oligosacárido, glucanos, sialil-oligosacárido, y fuco-oligosacárido.

20 En el uso de la presente invención, el PDX se va administrar en combinación con GOS. El GOS es una mezcla de oligosacáridos que consiste de D-glucosa y D-galactosa. Algunas veces se denomina como trans-galacto-oligosacárido. Se produce de D-lactosa mediante β-galactosidasa, que se puede obtener de Aspergillus oryzae. Se ha sugerido que el GOS incrementa la absorción de calcio y evita la perdida de hueso en adultos. El GOS se ha identificado como un prebiótico que es útil para la administración a lactantes en la solicitud de patente U.S. No. 20030072865 de Bindels, et al.

25 En una realización del uso de la presente invención, el PDX y el GOS se deben administrar en una proporción de PDX: GOS de entre 9:1 y 1:9. En otra realización, la proporción de PDX: GOS se puede estar entre 5:1 y 1:5. En aun otra realización, la proporción de PDX: GOS puede estar entre 1:3 y 3:1. En una realización particular, la proporción del PDX al GOS puede ser de aproximadamente 5:5. En otra realización particular la proporción de PDX a GOS puede ser de aproximadamente 8:2.

30 Una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de PDX: GOS puede estar entre 1.0 g/L y 10.0 g/L, para ser administrada diariamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación PDX: GOS puede estar entre 2.0 g/L y 8.0 g/L para ser administrada diariamente. En una realización particular, una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de PDX: GOS puede ser de aproximadamente 2 g/L de PDX a 2 g/L de GOS, para ser

35 administrada diariamente.

En otra realización específica del uso de la presente invención, el PDX y el GOS tienen que ser administrados en combinación con LOS. El LOS es un disacárido semisintético formado de D-galactosa y D-fructosa y unido por un enlace βglucosídico. Este es resistente a la hidrólisis por las enzimas digestivas humanas, pero se fermenta en el intestino delgado.

40 Es altamente soluble y tiene un sabor dulce. El LOS se ha identificado como un prebiótico que es útil para la administración a lactantes en la solicitud de patente U.S. No. 20030072865 de Bindels, et al. El LOS está comercialmente disponible de una variedad de fuentes.

En esta realización, la combinación de PDX: GOS: LOS se puede administrar en una proporción de aproximadamente

45 50:33:17. Alternativamente, la proporción de la combinación PDX: GOS: LOS puede ser de aproximadamente 1:1:1. En una realización particular, la proporción de PDX: GOS: LOS puede ser de aproximadamente 1:1.5:1.

La cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de PDX: GOS: LOS puede estar entre aproximadamente 1.0 g/L y

10.0 g/L, para ser administrada diariamente. En otra realización, la cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de

50 PDX: GOS: LOS puede estar entre aproximadamente 2.0 g/L y 8.0 g/L, para ser administrada diariamente. En una realización, la cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de PDX: GOS: LOS puede ser aproximadamente 2 g/L de PDX, 2 g/L de GOS y 2 g/L de LOS, para ser administrada diariamente. En una realización particular, una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de PDX: GOS: LOS puede ser de aproximadamente 2 g/L de PDX, 1.32 g/L y

2.6 g/L de LOS, para ser administrada diariamente. En otra realización, una cantidad terapéuticamente efectiva de la

55 combinación de PDX: GOS: LOS puede ser de aproximadamente 4 g/L de PDX, 2.64 g/L de GOS y 3.6 g/L de LOS, para ser administrado diariamente.

En una realización de la invención, el PDX y el GOS se pueden combinar con uno o más probióticos para la administración a un lactante. Cualquier probiótico conocido en la técnica será aceptable en esta realización. En una realización particular, en

60 el probiótico se selecciona el grupo que consiste de Bifidobacteriums spp, o Lactobacillius spp. En una realización, el probiótico es Lactobacillius rhamnosus GG (LGG). En otra realización el probiótico es Bifidobacterium lactis. En una realización específica, el probiótico es Bifidobacterium lactis Bb-12, disponible de Chr. Hansen Biosystems, localizado en Milwaukee, WI.

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En otras realizaciones del uso de la presente invención, la fórmula del lactante puede contener otros agentes activos tales

5 como ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LCPUFA). Los LCPUFA adecuados, incluyen, pero no están limitados a, ácido α-linoleico, ácido γ-linoleico, ácido linoleico, ácido linolenico, ácido eicosapentanoico (EPA), ácido araquidónico (ARA) y docosahexanoico (DHA). En una realización, el PDX y el GOS se deben administrar en combinación con DHA. En otra realización, el PDX y el GOS se deben administrar en combinación con el ARA. En otra realización, el PDX y el GOS se deben administrar en combinación tanto con el DHA como el ARA. La fórmula para lactantes comercialmente disponible que

10 contiene DHA, ARA, a una combinación de los mismos se puede suplementar con PDX y GOS y se utiliza en la presente invención. Por ejemplo, el Enfamil® LIPIL®, que contiene niveles efectivos de DHA y ARAm, está comercialmente disponible y se puede suplementar con LGG y utilizar en la presente invención.

En una realización, tanto el DHA como el ARA se deben administrar en combinación con el PDX y el GOS. En esta

15 realización, la proporción y peso del ARA: DHA es típicamente de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 9:1. Alternativamente, esta proporción puede ser de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 4:1. En aún otra alternativa, la proporción puede ser desde aproximadamente 2:3 a aproximadamente 2:1. En una realización particular la proporción es aproximadamente 2:1.

20 La cantidad efectiva de DHA en una realización de la presente invención es típicamente de aproximadamente 3 mg por Kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 150 mg por kg de peso de cuerpo por día. En una realización de la invención, la cantidad es de aproximadamente 6 mg por kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 100 mg por kg de peso de cuerpo por día. En otra realización la totalidad es de aproximadamente 10 mg por kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 60 mg por kg de peso de cuerpo por día. En aún otra realización la cantidad es de aproximadamente 15

25 mg por kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 30 mg por kg de peso de cuerpo por día.

La cantidad efectiva de ARA en una realización de la presente invención es típicamente de aproximadamente 5 mg por kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 150 mg por kg de peso de cuerpo por día. En una realización de esta invención, la cantidad varía desde aproximadamente 10 mg por kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 120 mg

30 por kg de peso de cuerpo por día. En otra realización, la cantidad varía desde aproximadamente 15 mg por kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 90 mg por kg de peso de cuerpo por día. En aún otra realización, la cantidad varía desde aproximadamente 20 mg por kg de peso de cuerpo por día a aproximadamente 60 mg por kg de peso de cuerpo por día.

La cantidad de DHA en fórmulas para lactantes para uso con la presente invención típicamente varía desde

35 aproximadamente 5 mg/100Kcal a aproximadamente 80 mg/100Kcal. En una realización de la presente invención esta varía desde aproximadamente 10 mg/100Kcal a aproximadamente 50 mg/100Kcal; y en otra realización desde aproximadamente 15 mg/100Kcal a aproximadamente 20 mg/100Kcal. En una realización particular de la presente invención, la cantidad de DHA es aproximadamente 17 mg/100Kcal.

40 La cantidad de ARA en fórmulas para lactantes para uso con la presente invención típicamente varía desde aproximadamente 10 mg/100Kcal a aproximadamente 100 mg/100Kcal. En una realización de la presente invención, la cantidad de ARA varía desde aproximadamente 15 mg/100Kcal a aproximadamente 70 mg/100Kcal. En otra realización la cantidad de ARA varía desde aproximadamente 20 mg/100Kcal a aproximadamente 40 mg/100Kcal. En una realización particular de la presente invención, la cantidad de ARA es aproximadamente 34 mg/100Kcal.

45 La fórmula para lactantes suplementada con aceites que contienen DHA y ARA para uso con la presente invención se puede hacer utilizando técnicas estándar conocidas en el arte. Por ejemplo, ellas se pueden agregar a la fórmula al reemplazar una cantidad equivalente de un aceite, tal como aceite de girasol alto oleico, normalmente presente en la fórmula. Como otro ejemplo, los aceites que contienen DHA y ARA se pueden agregar a la fórmula al reemplazar la cantidad

50 equivalente del resto de la mezcla de grasa total normalmente presente en la fórmula sin DHA y ARA.

La fuente de DHA y ARA puede ser cualquier fuente conocida en el arte. En una realización de la presente invención, las fuentes de DHA y ARA son aceites de célula simple tal como se enseña en las Patentes U.S. No. 5, 374,567; 5, 550,156; y 5, 397,591. Sin embargo, la presente invención no está limitada a tales aceites, el DHA y el ARA pueden estar en forma

55 natural y refinada.

En una realización, la fuente de DHA y ARA está sustancialmente libre de ácido eicosapentanoico (ETA). Por ejemplo, en una realización de la presente invención la fórmula para lactantes contiene menos de aproximadamente 16 mg EPA/1100Kcal; en otra realización menos de aproximadamente 10 mg de EPA/100Kcal; y aún en otra realización de menos

60 de aproximadamente 5 mg de EPA/100Kcal. Una realización particular no contiene sustancialmente EPA. Otra realización está libre de EPA ya que aún cantidades en trazas de EPA están ausentes de la fórmula.

imagen8

La fórmula para lactantes de la presente invención se puede preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica. En una realización, el PDX se suministra en forma de polvo. Este se puede mezclar con agua y otros ingredientes de fórmula para lactantes en un tanque de mezcla de GOS y/o LOS se puede suministrar en forma de polvo o líquido. La mezcla puede

5 ser pasteurizada, homogeneizada y secada por rociado para elaborar un polvo terminado o en conserva o alambicada en retorta para elaborar un producto líquido.

En la presente invención, los lactantes se alimentan con fórmula. En una realización el lactante se alimenta con fórmula desde el nacimiento. En otra realización, el infante se alimenta con mama desde el nacimiento hasta una edad que es de

10 menos de un año, y se alimentan con fórmula posteriormente, tiempo en el cual el suplemento con PDX y GOS inicia.

Los oligosacáridos de leche humana pueden incrementar la población y las especies de bacterias benéficas en el tracto intestinal, tiene un perfil SCFA que es alto en acetato y muy bajo en butirato, y son lentamente fermentados, evitando la producción de gases en exceso. Como se verá en los ejemplos, la administración del PDX, sola o en combinación con otros 15 prebióticos, se puede utilizar para incrementar la población y especies de bacterias benéficas en el tracto intestinal, puede preferencialmente cambiar la producción de SCFA hacia más acetato y producción de propionato, limitando de esta manera la producción de butirato, y pueden hacer más lenta la tasa de fermentación en el intestino de tal manera que se limita a la producción de gas, minimizando la incomodidad del lactante. Así, la administración del PSX sola o en combinación con uno

o más de otros prebióticos, puede simular los atributos funcionales de los oligosacáridos de leche humana en lactantes 20 alimentados con fórmula.

Los siguientes ejemplos describen varias realizaciones de la presente invención. Otra realización dentro del alcance de las reivindicaciones aquí será evidente para una persona experta en la técnica de las consideraciones de la especificación o la práctica de la invención tal como se describe aquí. Se pretende que la especificación, junto con los ejemplos, sea

25 considerados solo de ejemplo, siendo el alcance de la invención el indicado por la reivindicaciones que siguen a los ejemplos. En los ejemplos, todos los porcentajes se dan con base en peso a menos que se indique otra cosa.

Ejemplo 1

30 Este ejemplo ilustra el modelo de fermentación fecal in vitro utilizado en la presente invención. El modelo de fermentación fecal in vitro semeja la acción de la microbiota del colon de los lactantes. Durante la fermentación, los carbohidratos son consumidos y se producen los SCFA y gases. Después de la fermentación, se puede lograr un análisis del efecto de los prebióticos sobre la población y las especies de microorganismos presentes.

35 Los carbohidratos individuales que fueron estudiados se establecen en la Tabla 1.

Tabla 1: Carbohidratos Individuales

GOS: Vivinal GOS: Deb. No. 00026961 Ingredientes Borculo Domo: recibidos 09/17/02; pureza 95.1%

LOS: Anhídrido de Lactulosa Morinaga: MLC-A(F), Lote. No. FRDL 020926; Morinaga Milk Industry Co. Ltd; recibido 10/4/02; pureza 97%

PDX: Sta-Lite III PDX: Lote No. DZ2K 0351913; A.E. Staley

FOS: Raftilosa P95 Fructo-Oligosacáridos; Lote No. PCAB 022B02; Raffinerie Notre-Dame/Orafti SA; recibido 9/6/02; Pureza 95,1%

PDX2: Litesse® UltraTM PDX: polímero de alto peso molecular, MAX 22000 MW; Danisco; Lote No. V360201

INU: Raftiline® H.P: inulina de cadena larga DP ≥ 23 (Lote No. hptoh11oh1; Orafti B.V.; recibido octubre 2002; D.S. 96.9%, Inulina 99,9% , Sacarosa + Fructosa + Glucosa 0,1%)

40 Las muestras fecales fueron recolectadas de lactantes saludables con edades entre 2,5-13 meses. Se corrieron cinco grupos experimentales, utilizando diferentes combinaciones de carbohidratos prebióticos en cada grupo de fermentación. Doce nenes se reclutaron para el grupo de una y dos fermentaciones, 17 nenes para el grupo de 3 fermentaciones, 19 nenes para el grupo de 4 fermentaciones y 23 nenes para el grupo de 5 fermentaciones. En los grupos 1-3, solo 5 nenes fueron capaces de donar una muestra aceptable. Los nenes reclutados para la primera fermentación fueron 4, 4, 4, 6, 6, 6,

45 8, 8, 9, 9, 9, y 10 meses de edad, para la segunda fermentación 3, 4, 6, 6, 6, 7, 8, 9, 10, 10, 12 y 13 meses de edad, y para la tercera fermentación 2, 2, 5, 3, 4, 4, 4, 4,5, 5, 5, 6, 6, 6, 9, 9, 10, 10 y 11 meses de edad. Las edades de los nenes cuyas muestras se utilizaron en la fermentación fueron las del grupo de 1: 6, 8, 9, 9, 9 meses; Grupo 2: 4, 8, 10, 12, 13 meses; y Grupo 3: 2, 5, 5, 6, 10, 11 meses. En el Grupo de fermentación 4, 10 nenes (de los cuales un nene dos veces) fueron capaces de donar una muestra aceptable. Los donadores para el grupo de fermentación 4 fueron 2, 2, 5, 4, 5, 7, 9, 10, 11 y 15 meses de edad. Para el grupo de fermentación 5, 12 nenes fueron capaces de donar muestras, de los cuales se

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5 seleccionaron los 4 donadores más jóvenes. Así, los donadores fueron de 5, 6, 6, 5 y 6,5 meses de edad.

La fermentación fecal in vitro se efectuó de acuerdo con el método Karppinen.

Karppinen S., et al., In Vitro Fermentation of Polisaccharides of Rye, Wheat, and Oat Brans and Inulin by Human Faecal 10 Bacteria, J. Sci. Food Agric. 80: 1469-76 (2000).

En el presente estudio, 100 mg de muestras de carbohidratos se pesaron en botellas de 50 ml y se hidrataron utilizando 2 ml de amortiguador de carbonato-fosfato a un pH de 6,9. Las muestras se mantuvieron durante toda la noche bajo condiciones anaeróbicas a 5ºC hasta la preparación del inoculo. Se preparó una suspensión fecal (12,5%, peso/volumen) bajo 15 condiciones estrictamente anaeróbicas en el mismo amortiguador al agrupar las heces frescas de los lactantes. Se dosificaron ocho ml de suspensión a las muestras de sustrato y las botellas fueron cerradas en la cámara anaeróbica dando la concentración de suspensión fecal final de 10% (peso/volumen). Las muestras se incubaron a 37ºC duran te 1, 2, 4, 8 y 24 horas. Se prepararon muestras de 0 horas de manera similar a los tubos de centrifugación y congelados rápidamente utilizando nitrógeno líquido. Los blancos fecales sin carbohidratos agregados se inocularon en todos los experimentos de

20 fermentación.

La fermentación se terminó al retirar las botellas del baño con agua y colocarlas sobre hielo excepto antes de la medición del gas, cuando las muestras fueron mantenidas a temperatura de ambiente para el muestreo inmediato. El volumen de gas se midió y la muestra de gas (5 ml) se inyectó en una botella con espacio superior nitrogenada. La botella se colocó sobre

25 hielo después del muestreo. La muestra de fermentación se transfirió a un tubo de centrifugación, se midió el pH y se extrajo una alícuota (2 ml) de la suspensión para análisis en SCFA y se congeló rápidamente con nitrógeno líquido.

Ejemplo 2

30 Este ejemplo ilustra los materiales y métodos necesarios para determinar la efectividad de la polidextrosa como un prebiótico para infantes alimentados con fórmula, especialmente, este ejemplo ilustra los materiales y métodos necesarios para analizar los SCFA y los gases.

Los SCFA se extrajeron con dietil éter y se analizaron con cromatografía de gas como se describió por Karppinen, et al.

35 Karppinen S. et al., In Vitro Fermentation of Polysaccharides of Rye, Wheat, and Oat Brans and Inulin by Human Faecal Bacteria, J. Sci. Food Agric. 80: 1469-76 (2000). Se analizaron gases (hidrogeno, dióxido de carbono, metano, sulfuro de hidrogeno, y oxígeno como un control de calidad) isotérmicamente, a 30ºC utilizando la técnica de espacio superior estática mediante cromatografía de gas de acuerdo con Karppinen, et al. Id.

40 Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra el efecto del PDX sobre el perfil SCFA in vitro producido por la microbiota del colon de los lactantes. Las Figuras 1 y 2 ilustran que la tasa de fermentación varía entre diferentes prebióticos. La producción del SCFA total (una suma de los ácidos acéticos, propiónico, y butírico) se muestra en la Figura 1. Una disminución en el pH, mostrada en la Figura 2,

45 es también una indicación de la producción de SCFA.

Como se puede ver en las figuras, el PDX2 es un carbohidrato lentamente fermentable, mientras que los FOS, GOS, y LOS fueron fermentados rápida y completamente. La tasa de fermentación del PDX2 fue comparable con las fibras de dieta con cereal. No solo se fermento el PDX2 a la más lenta tasa inicial, sino que la proporción de fermentación estuvo solamente

50 ligeramente por encima del blanco fecal. En contraste, la tasa de fermentación del FOS fue tan rápida que esta se consumió casi completamente dentro de los primeros puntos temporales de muestreo y se produjo la más alta cantidad de los SCFA entre los prebióticos probados.

Como se mostró en la Figura 3-5, la fermentación PDX2 resultó en la más alta producción de propionato y la más baja

55 producción de butirato después de 24 horas. El acetato fue aun el SCFA más alto producido durante la fermentación del PDX, aunque la tasa inicial fue mucho más inferior que aquellas de los otros sustratos. La tasa inicial de la producción de propionato proveniente de PDX2 fue similar a aquella de los otros sustratos, pero se encontraron niveles mayores al final de la fermentación. En contraste, la fermentación del FOS, GOS y LOS mostró concentraciones crecientes de acetato y butirato y disminuyó la concentración de propionato. Como resultado, la proporción relativa combinada de acetato y propionato fue

60 mucho mayor para PDX2 que para FOS, LOS, o GOS. Estos resultados también se pueden ver en la Figura 6. Estos resultados demuestran que el PDX2 fue el sustrato que menos produce butirato y el único sustrato para incrementar la proporción de propionato.

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Estos resultados están de acuerdo con el estudio in vitro conducido por Wang, X, & Gibson, G, R, Effects of the in Vitro

5 Fermentation of Oligofructose and Inulin by Bacteria Growing in the Human Large Intestine, J, Appl, Bacteriol 75: 373-380 (1993), en la cual una suspensión fecal de donadores adultos se utilizó en la fermentación de varios carbohidratos. Sin embargo, la mayor producción de propionato proveniente del PDX in vitro no se mostró in vivo en un ensayo clínico con adultos Chinos Jie, Z., et al., Studies on the Effects of Polidextrose Intake on Physiological Functions in Chinese People, Am.

J. Clin. Nutr. 72: 1503-09 (2000), en el cual tres diferentes concentraciones de PDX podían incrementar los niveles de

10 butirato y acetato, pero no la proporción de propionato. La mayor producción de butirato proveniente de GOS y FOS también se ha mostrado con las ratas asociadas a la flora fecal humana (Djouzi, Z, et al., Compared Effects of Three Oligosacchardies on Metabolism of Intestinal Microflora in Rats Inoculated with a Human Faecal Flora, Br, J. Nutr. 78: 31324 (1997).

15 Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra el ejemplo de combinaciones de prebióticos sobre la tasa de fermentación in vitro por la microbiota del colon de lactantes. Varias combinaciones de carbohidratos prebióticos se seleccionaron en un intento por lograr una tasa deseable de fermentación microbiana in vitro. En este ejemplo, las combinaciones de sustratos se compararon con su tasa

20 de fermentación (producción SCFA total) y los cambios en pH, mostrados en las Figuras 7-8.

La adición de PDX a la preparación de GOS hizo más lenta tasa de fermentación de la combinación medida mediante la producción de SCFA total (Fig. 7). De manera similar, la adición de PDX a la preparación de LOS hizo lenta la tasa de fermentación de la combinación. La adición de PDX al LOS o GOS también dio como resultado una disminución más

25 moderada en el PH, como se muestra en la Figura 8. Esta tasa más lenta de acidificación de contenido de heces pudo llegar a menor irritación del recubrimiento intestinal o de la región anal, incrementando la tolerancia en lactantes. La disminución más lenta en el pH mediante PDX es consistente con la producción de SCFA más lenta y la tasa de fermentación in vitro total comparada con el GOS y el LOS. Estos resultados demuestran que el PDX se puede utilizar para hacer más lenta la tasa de fermentación de las mezclas de PDX y los prebióticos tradicionales tales como el GOS o LOS.

30 El efecto de la proporción de PDX: GOS sobre la producción del SCFA total, acetato, propionato y butirato también se estudió (Figuras 9-12). La Figura 9 demuestra que la proporción PDX: GOS de 8:2 condujo a una tasa más lenta de producción de SCFA total que lo que produjo la proporción de PDX: GOS de 5:5. La Figura 9 confirma que la proporción de PDX: GOS de 8:2 produjo menos SCFA total que una proporción de 5:5 o 1:9. Así, estos resultados demuestran que una

35 menor cantidad de PDX en la mezcla de PDX: GOS dio como resultado una tasa más lenta de fermentación in vitro. La adición del PDX al GOS también tuvo la tendencia de disminuir la tasa de producción de acetato y butirato, pero tuvo poco impacto en la tasa total y la producción de propionato final.

Ejemplo 5

40 Este ejemplo ilustra el efecto del PDX en la producción de gas in vitro por la microbiota del colon de los lactantes. La producción de gas total, medida como el volumen total por botella de fermentación, fue aproximadamente igual al GOS, LOS y FOS, mostrado en la figura 13. En contraste, el PDX da como resultado una producción de gas total inferior durante la fermentación por la microbiota bacteriana fecal. La producción de gas total inferior vista en PDX también indica que esta se

45 fermenta más lentamente que los otros productos estudiados.

Además de la producción de gas total, la producción de dióxido de carbono es una medida importante de la tolerancia de los lactantes a los prebióticos de dieta. El producto de gas principal de todos los prebióticos probados fue dióxido de carbono. Se produjo en 3-y 44-76-veces mayor cantidad de hidrogeno o disulfuro de hidrogeno, respectivamente.

50 En total, la producción de dióxido de carbono fue a más baja para PDX cuando se comparó con el FOS, GOS y LOS (Fig 14). El dióxido de carbono fue el gas principal producido durante la fermentación del FOS, GOS y LOS, mostrando niveles máximos entre 320-380µmol. En contraste, el PDX mosto niveles más bajos de formación de Dióxido de carbono (200pmol). La formación de hidrogeno proveniente de PDX por microbiota fecal de lactantes fue inferior (un tercio) que la producción de

55 dióxido de carbono, y considerablemente menos que los niveles de hidrogeno producidos de FOS, GOS y LOS (Figura 15). La formación de disulfuro de hidrogeno proveniente de PDX fue 1:44 comparada con la formación de hidróxido de carbono y la producción de disulfuro de hidrogeno máxima fue de aproximadamente el mismo nivel que la concentración para todos los prebióticos ensayados (Figura 16). La deformación de dióxido de carbono comprada con la formación de hidrógeno (1000veces) y metano (10 veces) fue también mostrada por Wang y Gibson. Wang, X. & Gibson, G.R., Effects of the In Vitro

60 Fermentation of Oligofructose and Inulin by Bacteria Growing in the Human Large Intestine, J. Appl. Bacteriol. 75:373-380 (1993). En razón a que no se observó metanogénesis en el presente estudio, se presume que el disulfuro de hidrogeno se formó de hidrogeno primario. Levitt, et al., Gas Metabolism in the Large Intestine, CRC Press, Boca Raton 131-154 (1995). Es posible que el hidrógeno no se detectara debido a su metabolismo adicional a gas secundario, disulfuro de hidrogeno, en puntos de tiempo posteriores.

imagen11

5 Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra los materiales y métodos necesarios para determinar el efecto del PDX sobre la población y especies de microbiota provenientes de colon de lactante. En resumen, el ejemplo utiliza un modelo de intestino de lactante para evaluar ciertos compuestos prebióticos. El modelo de in vitro de intestino de infantes utilizados, que se basó en un modelo de adulto, 10 estaba comprendido de dos frascos de vidrio de 100 ml, dispuestos en serie para representar las regiones próximas y distantes del colon de lactante. El flujo de alimentos se controló a una taza que semeja en cantidad en tiempo de paso más corto en el intestino de infante, comparado con el intestino de adulto. Para modelar las diferencias se in vivo en pH dentro del colon, el recipiente 1 (v1) se controló un pH de 5.2 y el recipiente 2 (v2) se controla un pH de 6.7. La temperatura se controló a 37°C mediante un baño de agua circulante. Los recipientes de alimento y cultivo se agitaron magnéticamente y se

15 mantuvieron bajo una atmosfera anaeróbica al hacer fluir nitrógeno libre de oxígeno (15ml/min).

Una vez que el sistema se inoculó con una suspensión fecal de lactante, los dos recipientes fermentadores se dejaron durante 24 horas en modo de tanda. Esto permitió que las poblaciones bacterianas se equilibraran en su nuevo ambiente y se incrementara la densidad. El flujo de alimento fue entonces arrancado y el fermentador corrió en modo de cultivo continuo

20 durante el resto del experimento. La tasa de flujo de alimentos se controló a 11,11 ml/h. En este estudio, los fermentadores corrieron durante 12 días, 6 días en los cuales fueron alimentados con fórmula de lactante Enfalac (Mead Johnson Nutritionals, Evansville, IN) y 6 días adicionales en los que se alimentaron con combinación de Enfalac y el prebiótico agregado o prebiótico.

25 Las muestras de 5ml fueron entonces tomadas asépticamente de V1 y V2 y preparadas para procedimiento de enumeración microbiano con cultivo independice fluorescencia incito hibridación (FISH) y microscopia para la identificación y enumeración de las especies bacterianas específicas. Utilizar el FISH permite la determinación precisa del efecto de los prebióticos sobre las poblaciones bacterianas específicas en las regiones próxima y distante del colon de lactante.

30 Los prebióticos se agregaron a la alimentación individuamente o en combinaciones, a una concentración total de 7.5 g/l (0.75% p/v). Se utilizaron los siguientes oligosacáridos:

Tabla 2. Prebióticos probados

Prebióticos

Tipo Fabricante

Lactulosa (LOS)

Melaza Morinaga Milk Ind. Co. Ltd., Japan

Gagcalacto oligosacárido (GOS)

Polvo E0002 Suministrada por Mead Johnson

Polidextrosa (PDX)

Polvo “Litesse Ultra” Danisco

Fructo-oligosacárido

Polvo Raftilose®P95 Orafti

35 Los lactantes donantes se seleccionaron cuidadosamente he idealmente con una edad de 2-4 meses, el alimento con fórmula (exclusivamente donde fue posible), saludable y si ningún tratamiento antibiótico resiente. Se prefirió una edad mínima de 12 meses en la medida en que la microbiota del intestino del infante se establece hacia esta edad.

Tabla 3. Información de los donantes

Código del donante

Edad Alimento Corrida de fermentación

KB

16 semanas SMA Gold F1

JS

13 semanas Cow & Gate F2

F

19 semanas SMA Gold y alimentado con mama F3

AE

9 ½ semanas alimentado con mama F4

AE

14 semanas alimentado con mama F5

La flora microbiana del intestino del lactante para las pruebas de fermentaciones suministro de heces de lactantes recientemente vaciadas. Se requirió usualmente una muestra fecal de al menos 3.5g. La muestra fecal se retuvo en el pañal el cual, inmediatamente luego de la remoción del infante, se colocó por el cuidador en un jarro anaeróbico con un paquete de gas anaeróbico abierto. Este se recolecto y proceso tan pronto como fue posible (usualmente en el tiempo de una hora).

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En el laboratorio, las heces se removieron del pañal y se pesaron. Se prepararon 10% de suspensión fecal (p/v) al homogenizar las muestras en una solución anóxica y precalentada (durante toda la noche en el gabinete anaeróbico) 1x PBS, utilizando un estómago artificial a tasa media durante 120 segundos.

5 Cada uno de los recipientes fermentadores es inoculado con 5 ml de la suspensión fecal al 10% de p/v. Una alícuota de la suspensión fecal (muestra S) también se tomó para análisis.

Una muestra de 375µl de la suspensión fecal (muestra S) o de cada muestra fermentadora se requirió el duplicado para los

10 conteos bacterianos mediante el FISH. Cada muestra se fijó al mezclarla completamente en 1.125ml fríos, solución de paraformaldehido filtrado 4% (p/v) en PBS Ph7,2) y se almacenos a 4°C durante toda la noche (o al menos 4 horas).

La muestra fija se centrifugo a 13.000 xg durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. Los glóbulos fueron lavados dos veces al suspenderlos en 1 ml de uno por PBS frío, filtrado, cada vez paletizando las células mediante centrifugación y

15 descartando el sobrenadante. El lóbulo fue finamente resuspendido completamente en 150µl de PBS filtrado; 150µl de 96% (v/v) de etanol que luego es entonces mezclado en el pozo. La preparación de la célula fue entonces almacenada a -20°C duran al menos una hora antes del procesamiento adicional.

La etapa de hibridización, 16µl de preparación de célula (llevada a temperatura ambiente) se mezcló con 200µl de

20 amortiguador de hibridización filtrado, precalentado 2x (30.3 mM Tris-HCl pH 7.2, 1.4 mM NaCl) que contiene 15.1 ml/l 10% (p/v) SDS. Esta mezcla se calentó a la temperatura de hibridización apropiada y luego se mezcló con la sonda (50 ng/µl) en la proporción de 9:1, respectivamente. La reparación de la hibridización fue entonces regresada al horno de hibridización para incubar durante toda la noche.

25 Finalmente, las preparaciones de célula hibridizada se recolectaran en filtros de 0.2 µm para observación microscópica. Dependiendo de la densidad celular, entre 5µl y 100µl de la preparación de la célula se agregó al amortiguador del lavado filtrado, precalentado (a temperatura de hibridización) (5-7 ml 20mM de Tris-HCl pH 7.2, 0.9 M NaCl). 20 µl de DAPI (4’, 6diamidino-2-fenilhindol) también se agregó a la mezcla para teñir todas las celular y obtener los conteos totales de célula para cada muestra. Luego este se filtró al vacío sobre un filtro de policarbonato de 0.2m y se colocó en una lámina de

30 microscopio. Para minimizar el desvanecimiento del tinte fluorescente, se colocó una gota de SlowFade™ (sondas moleculares) sobre el filtro se cubrió con una funda de cubierta; las láminas fueron entonces almacenadas en la oscuridad a 4°C hasta uso. Las bacterias etiquetadas con una sonda fluorescente Cy3 fueron contadas utilizando un microscopio fluorescente (Leitz, Wetzlar, Alemania) a 550nm; se utilizó luz UV para contar las bacterias teñidas de DAPI. Las bacterias se contaron en al menos 15 campos tomados aleatoriamente y los promedios de estas se utilizaron para estimar el número

35 de celular por ml de muestra original aparte.

Para comparación, se corrieron las pruebas de fermentación como se lista adelante

Tabla 4. Corridas de fermentación

Corrida de fermentación

Sustancias de prueba

F1

FOS

F2

Leche Humana PDX

F3

GOS

F4

1:1 LOS:GOS 1:1 PDX:LOS

F5

LOS 1:1 PDX:GOS

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra el efecto del PDX sobre la población y especies de bacterias en el intestino del lactante. En la corrida de fermentación 1 (F1), se agregó FOS al alimento de fórmula y se corrió en un sistema fermentador. El FOS, que ha sido

45 tradicionalmente considerado un buen ingrediente prebiótico dio como resultado un incremento en la Bifidobacteria y Clostridia y disminución en Lactobacilli y Bacteroides en V1. La adición de FOS al alimento de fórmula no dio como restado cambio en los niveles de bifidobacteria y lactobicili y un incremento en los Clostridia y Bacteroides en V2.

En F2, el PDX y leche humana fueron corridas en sistemas fermentadores paralelos. Las muestras de leche humana se 50 suministraron en una crujida de maternidad y almacenada congelada. Estas fueron muestras recientes de leche de varios volúmenes provenientes de varios donantes. El alimento de leche humana fue corrido sin dilución o adición de lactosa con el fin de mantener los niveles comparables de oligosacáridos y otros nutrientes. Hubo insuficiente leche humana para correr este fermentador durante 12 días, en paralelo con el fermentador PDX. Las muestras más frecuentes fueron por lo tanto tomadas en los días 0, 4, 6 y 8. Con propósitos comparativos, se tomaron muestras adicionales del fermentador PDX en el

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5 día 8, y también en el día 11.

Como se esperaría, la leche humana promovió un buen crecimiento de bacterias benéficas, tanto de bifidobacteria como de lactobacilli y se disminuyeron los niveles de Clostridia, como se muestra en la Figura 17. La bifidobacteria y el lactobacilli claramente incrementaron la población en ambos recipientes. Los números de bacteroides permanecieron a un nivel similar

10 en toda la fermentación.

Los resultados de la adición de PDX a la alimentación de la fórmula también fueron favorables, con un incremento marcado de lactobacilli y una disminución tanto de Clostridia como de bacteroides en ambos recipientes (Figura 17).

15 En F3, se agregó GOS al alimento de fórmula y se corrió en un sistema fermentador. La adición de GOS al alimento de fórmula tubo poco efecto aparente sobre el lactobacilli en cualquier recipiente, pero incremento la bifidobacteria en V1 y V2, y disminuyo la clostridia y el Bacteroides en V1 pero no en V2.

La combinación de LOS:GOS (1:1) corrió contra PDX:LOS 1:1 en un sistema fermentador en paralelo durante F4. La

20 combinación de LOS:GOS fue efectiva para incrementar los números de lactobacilli en ambos recipientes y de bifidobacteria en V1, y disminuir el bacteroides en V1. La Clostridia disminuyo en V2 pero se incrementó en V1.

La suplementación del alimento de fórmula con una combinación de 1:1 de PDX:LOS dio como resultado un incremento en Lactobacilli en V1, pero una ligera disminución en bifidobacteria en cada recipiente. La Clostridia tendió a disminuir en

25 ambos recipientes en los cuales disminuyeron los bacteroides principalmente en V2.

En F5, el LOS se suplemento en el alimento de fórmula y se corrió en un sistema fermentador paralelo contra una combinación 1:1de PDX y GOS. La adición de LOS al alimento de fórmula incrementó el Lactobacilli en ambos recipientes. Sin embargo, la Clostridia también se incrementó en V2 y la Bifidobacteria disminuyo en ambos recipientes. Aunque que las

30 bacteroides disminuyeron en V1 este no se mantuvo en V2. La adición de PDX:GOS al alimento de fórmula incremento los niveles de bifidobacteria y lactobacilli en ambos recipientes, pero también origino que se incrementara los niveles de Clostridia. Los niveles de bacteroides se incrementaron solamente en V2.

En total, la bifidobacteria se incrementó en proporción a la población bacteriana total en V1 con leche humana, GOS, FOS,

35 PDX y combinación de PDX:GOS. En V2, el GOS, la combinación de PDX:GOS y la combinación de LOS:GOS condujeron a un incremento en la bifidobacteria. La Clostridia disminuyo en proporción a la población total en V1 con Leche Humana, GOS y PDX, y se incrementó en V2 con leche humana, PDX y combinación de LOS:GOS.

En V1, el lactobacilli mostró un incremento luego de la suplementación con LOS, PDX, leche humana o combinaciones de

40 PDX, mientras que se observaron en V2 con combinaciones de LOS, PDX, leche humana, y GOS. Los incrementos en porcentaje de los lactobacilli fueron particularmente marcados con PDX y combinación de PDX:GOS y la combinación de LOS:GOS en V2.

En total, el PDX fue efectivo para incrementar el lactobacilli y disminuir los niveles de Clostridia y bacteroides con solo un

45 ligero incremento en la bifidobacteria en V1. La combinación de PDX:GOS también lucio favorable para la bifidobacteria, la cual se incrementó entre las bacterias totales (aunque no como un porcentaje de los 4 grupos) e incremento el lactobacilli a un pH de 5.2, pero también tuvo un efecto desfavorable de incrementar el número de bacteroides.

Cuando se probó la leche humana en el sistema de modelo diseñado por los inventores, la bifidobacteria y los niveles de

50 bifidobacteria y lactobacilli se incrementaron en número mientras que el de Clostridia disminuyó en número. Este efecto es más consistentemente duplicado con PDX y con GOS, solo en combinación con LOS o PDX. El FOS, que es otro carbohidrato que es habitualmente utilizado en varias fórmulas para lactantes, que se probó y no produjo los mismos resultados deseables.

55 Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra una realización de una fórmula para lactante de la presente invención.

imagen14

Tabla 5: Información de nutriente para fórmula de lactante

Ingrediente

Por 10.000 L

Sólidos de suero de leche desmineralizada

534.337 kg

Mezcla de grasa

339.695 kg

Sólidos de leche sin grasa

191.234 kg

Lactosa

136.321 kg

Sólidos de melaza de galacto-oligosacárido

35.096 kg

Polidextrosa

22.222 kg

Citrato de potasio

7.797 kg

Mono y Diglicéridos

7.233 kg

Aceite de ácido araquidónico de célula simple

6.486 kg

Fosfato de calcio, tribásico

4.185 kg

Ácido ascórbico

1.403.323 g

Ascorbato de sodio

1.1.68.402 g

Inositol

407.029 g

Taurina

402.962 g

Sólidos de jarabe de maíz

188.300 g

Niacimadina

89.857 g

Pantotenato de calcio

42.433 g

Vitamina B12

23.613 g

Titulación con biotina

23.613 g

Tiamina HCL

8.022 g

Piridoxina HCL

6.176 g

Ácido fólico

2.260 g

Concentrado de lecitina

3.694 kg

Aceite de ácido docosahexanoico de célula única

3.243 kg

Carragenina

2.826 kg

Cloruro de calcio

2650 kg

Cloruro de sodio

1410 kg

Maltodextrina

484.199 g

Ácido libre CMP

151.951 g

Ácido libre AMP

33.944 g

Sal de disodio GMP

18.347 g

Sal de disodio UMP

7559 g

Sulfato ferroso

0.620 kg

Citrato de sodio

0.455 kg

Tocoferil acetato, DL-Alpha

160.882 g

imagen15

Aceite de soya

139.612 g

Vitamina A Palmitato

17.253 g

Concentrado de Colecalciferol

5.715 g

Vitamina k, Fitonadional liquida

0.538 g

Sulfato de Zinc

214.255 g

Selenito de sodio

51.112 g

Sulfato cúprico

22.885 g

Lactosa

12.659 g

Sulfato de Manganeso

3.119 g

Agua desfluorizada

10.311.900 kg

El LOS se genera cuando la lactosa se calienta a alta temperatura. Por lo tanto, en esta realización el producto contiene LOS innato. El nivel de LOS innato en el producto es de aproximadamente 2 g/L. 5 Ejemplo 9 Este ejemplo ilustra otra realización de una fórmula para lactante de la presente invención. Tabla 6: Información de nutrientes para la fórmula de lactante 10

Ingrediente

Por 10.000 L

Sólidos de suero de leche desmineralizada

534.337 kg

Mezclas de grasas

339.695 kg

Sólidos de leche sin grasas

191.234 kg

Lactosa

142.000 kg

Sólido de melaza galacto-oligosacáridos

23.164 kg

Polidextrosa

22.222 kg

Sólido de melaza lactulosa

10.353 kg

Citrato de potasio

7.797kg

Mono y diglicérido

7.233 kg

Aceite de ácido araquidónico de célula simple

6.486 kg

Fosfato de calcio, tribásico

4.185 kg

Ácido ascórbico

1,403.323 g

Ascorbato de sodio

1,168.402 g

Inositol

407.929 g

Taurina

402.962

Sólidos de melaza de maíz

1,88.300 g

Niacinamida

89.857 g

Pantotenato de calcio

42.443 g

Vitamina B12

23.613 g

imagen16

Titulación con biotina

23.613 g

Tiamina HCl

8.022 g

Piridoxina HCl

6.176 g

Ácido Fólico

2.260 g

Concentrado de lecitina

3.694 kg

Aceite de ácido docosahexanoico de célula simple

3.243 kg

Carragenina

2.826 kg

Cloruro de calcio

2.650 kg

Cloruro de sodio

1.410 kg

Maltodextrina

484.199 g

Ácido libre, CMP

151.951 g

Ácido libre, AMP

33.944 g

Sal de disodio, GMP

18.347 g

Sal de disodio, UMP

7.559 g

Sulfato Ferroso

0.620 kg

Citrato de Sodio

0.455 kg

Tocoferil acetato, DL-Alfa

160.882 g

Aceite de soya

139.612g

Vitamina A Palmitato

17.253 g

Concentrado de colecalciferol

5.715 g

Vitamina K, fitonadiona liquida

0.538 g

Sulfato de Zinc

214.225 g

Selenito de Sodio

51.112 g

Sulfato cúprico

22.885

Lactosa

12.659

Sulfato de Manganeso

3.119 g

Agua, desfluorizada

10,311.900 kg

El LOS se genera cuando la lactosa se calienta a alta temperatura. Por lo tanto, en esta realización el producto contiene tanto LOS agregado como innato. El nivel total de LOS en el producto, que incluye tanto como el LOS agregado como innato, es de aproximadamente 2.6 g/L.

5 Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra aún otra realización de una fórmula para lactante de la presente invención.

10 Tabla 7: Información de nutriente para fórmula de lactante

Ingrediente

Por 10.000 L

Sólidos de suero de leche desmineralizada

534.337 kg

Mezcla de grasa

339.695 kg

imagen17

Sólidos de leche sin grasa

191.234 kg

Lactosa

119.321 kg

Sólido de melaza de galacto-oligosacáridos

46.327 kg

Polidextrosa

44.444 kg

Sólido de melaza de lactulosa

20.706 kg

Citrato de potasio

7.797 kg

Mono y diglicéridos

7.233 kg

Aceite de ácido araquinodónico de célula simple

6.486 kg

Fosfato de calcio, Tribásico

4.185 kg

Ácido ascórbico

1,403.323 g

Ascorbato de sodio

1,168.402 g

Inositol

407,029 g

Taurina

402.962 g

Sólidos de jarabe de maíz

188.300

Niacinamida

89.857 g

Pantotenato de calcio

42.443 g

Vitamina B12

23.613 g

Titulación con biotina

23.613 g

Tiamina HCl

8.022 g

Piridoxina HCl

6.176 g

Ácido Fólico

2.260 g

Concentrado de lecitina

3.694 kg

Aceite de ácido docosahexanoico de célula simple

3.243 kg

Carragenina

2.826 kg

Cloruro de calcio

2.650 kg

Cloruro de sodio

1.410 kg

Maltodextrina

484.199

Ácido libre, CMP

151.951 g

Ácido libre, AMP

33.944 g

Sal de disodio, GMP

18.347 g

Sal de disodio, UMP

7.559 g

Sulfato Ferroso

0.620 kg

Citrato de Sodio

0.455 kg

Tocoferil acetato, DL-Alfa

160.882 g

Aceite de soya

39.612 g

Vitamina A Palmitato

17.253 g

Concentrado de colecalciferol

5.715 g

imagen18

Fitonadiona liquida, Vitamina K

0.538 g

Sulfato de Zinc

214.225 g

Selenito de Sodio

51.112 g

Sulfato cúprico

22.885 g

Lactosa

12.659 g

Sulfato de Manganeso

3.119 g

Agua, desfluorizada

10,325.600 kg

El LOS se genera cuando la lactosa se calienta a una alta temperatura. Por lo tanto, esta realización el producto contiene tanto LOS agregado como innato. El nivel total de LOS en el producto, que incluye tanto el LOS agregado como innato es de aproximadamente 3.6 g/L

Claims (10)

1. imagen1

   Reivindicaciones

   1. Uso de polidextrosa (“PDX”) y galacto-oligosacárido (“GOS”) en la elaboración de una fórmula para lactante para simular los atributos funcionales de los oligosacáridos de la leche humana al incrementar la producción de acetato y

   5 disminuir de butirato para producir un perfil de ácido graso de cadena corta en un lactante alimentado con fórmula similar a aquella producida en un lactante alimentado mama, y al disminuir la tasa y extensión de fermentación de prebióticos dentro del intestino de un lactante alimentado con fórmula.
2. 2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cantidad de PDX en la fórmula para lactantes está entre 1.0 10 g/L y g/L, para ser administrada diariamente.
3. 3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cantidad de PDX en la fórmula para lactantes está entre 2.0 g/L y 8.0 g/L de PDX para ser administrada diariamente.

   15 4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proporción de PDX:GOS está entre 9:1 y 1:9
4. 5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proporción de PDX:GOS está entre 5:1 y 1:5
5. 6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proporción de PDX:GOS está entre 3:1 y 1:3 20

6. 7.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proporción de PDX:GOS es de aproximadamente 5:5

7. 8.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proporción de PDX:GOS es aproximadamente 8:2

   25 9. Una fórmula para lactantes que comprende PDX y GOS, en donde la cantidad de PDX presente en la fórmula para lactantes es de aproximadamente 2.0g/L, y la cantidad de GOS presente en la fórmula para lactantes es de aproximadamente 2.0 g/L, para ser administrado diariamente.
8. 10. Una fórmula para lactante que comprende PDX y GOS, en donde la cantidad total de PDX y GOS en la fórmula 30 para lactante está entre 1.0 g/L y 10.0 g/L, para ser administrado diariamente.
9. 11. La fórmula para lactante de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la proporción de PDX a GOS está entre 9:1 y 1:9

   35 12. La fórmula para lactante de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la fórmula comprende además al menos un ácido graso poliinsaturado de cadena larga.
10. 13. La fórmula para lactante de acuerdo con la reivindicación 12, en donde al menos un ácido graso poliinsaturado de

    cadena larga se selecciona del grupo que consiste de ácido docosahexanoico, ácido araquidónico y ácido 40 eicosapentaenoico.

    20