ES2356322T3 - Un vector híbrido adenovirus-alfavirus para la administración eficaz y expresión de genes terapéuticos en células tumorales. - Google Patents
Un vector híbrido adenovirus-alfavirus para la administración eficaz y expresión de genes terapéuticos en células tumorales. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un vector híbrido adenoviral de expresión génica caracterizado porque comprende, orientados en dirección 5'' a 3'', al menos los siguientes elementos: i. una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus; ii. una primera secuencia no codificante de relleno; iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido; iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral, que comprende al menos una secuencia codificante de al menos un gen exógeno de interés, v. una secuencia de poliadenilación, y vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral; preferentemente se refiere a un vector híbrido adenoviral que comprende como gen exógeno de interés el gen terapéutico interleucina de mamífero IL-12, y más preferentemente aún, interleucina humana hIL-12; así como al uso del vector híbrido en un procedimiento para transferir material genético a una célula, especialmente una célula tumoral y preferentemente que expresa AFP, y a su uso para inducir una respuesta inmune contra antígenos extraños.
Description
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a vectores de expresión génica derivados de adenovirus, para la obtención de 5 productos terapéuticos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN
Uno de los principales problemas de la terapia convencional del cáncer es la falta de especificidad tumoral, lo que causa con frecuencia serios efectos secundarios y limita la dosis terapéutica. Aunque la terapia génica se mantiene como una promesa de gran potencial para la terapia del cáncer, también se enfrenta a un problema específico: dirigir la 10 expresión transgénica al sitio del tumor. Varios estudios sugieren que cuando los vectores virales se administran de manera intralesional, aunque la expresión transgénica está esencialmente confinada a un área adyacente al tracto de la aguja, también puede ocurrir en otros tejidos. Por lo tanto un objetivo importante en la terapia génica del cáncer es dirigir la expresión de los genes terapéuticos a los tumores a través de la administración específica al tejido neoplásico ("objetivo tejido") y/o activación específica ("objetivo transcripcional") en el tejido neoplásico, sin afectar a las células 15 sanas. El "objetivo tejido" se puede conseguir creando un vector dirigido mediante modificaciones de las interacciones receptor-ligando, permitiendo la infección de las células que expresan un receptor específico. El objetivo transcripcional se puede conseguir usando un promotor específico de tumor para controlar la expresión transgénica. Se han usado en estudios previos, distintos promotores específicos de tumores. Sin embargo tienen una limitación esencial, qué es que no conducen a un nivel elevado de expresión génica, y por tanto limitan la actividad antitumoral. 20
Una revisión de los últimos avances en el desarrollo de vectores virales para terapia génica se puede encontrar en Lundstrom K. "Latest development in viral vectors for gene therapy"; Trends in Biotechnology, 2003, 21:118-122.
Entre los vectores virales usados en la actualidad se encuentran los alfavirus. Los alfavirus son virus envueltos que contienen una molécula de una hebra simple de ARN positiva, como genoma. Se han diseñado y construido vectores de expresión derivados de los alfavirus Sindbis Virus (SIN), Semliki Forest Virus (SFV), y virus de encefalitis 25 equina de Venezuela (VEE). Los vectores de alfavirus están basados en el uso de moléculas de ARN autoreplicativas derivadas de genomas de alfavirus, en las que las secuencias 5' y 3' necesarias para la replicación y el gen de la replicasa (Rep) se han mantenido, mientras que se han suprimido los genes que codifican para las proteínas virales estructurales y se han sustituido por un transgen. Después de la transfección de estos vectores en una célula, Rep será traducida y copiará el vector ARN en una hebra de ARN negativo, que será usada como molde para la amplificación del 30 vector de ARN. Rep también puede reconocer un promotor subgenómico en la hebra de ARN negativo, de la cual hará un ARN subgenómico más pequeño, que puede ser traducido para producir proteínas heterólogas a niveles elevados. Los vectores de alfavirus se pueden usar directamente como ARN cuando son transcritos in vitro a partir de un promotor procariótico, tal como SP6 o T7, o bien como ADN cuando la secuencia del replicón se coloca bajo un promotor eucariótico tal como CMV. El vector de ARN puede ser empaquetado en partículas virales por cotransfección del mismo 35 en células, junto con uno o más ARNs "ayudantes" que codifican para las proteínas estructurales virales. Los vectores de alfavirus tienen varias propiedades que los hacen atractivos para la terapia génica: un tropismo muy amplio, baja inmunogenicidad y un alto nivel de expresión de proteínas heterólogas. Esta expresión es, sin embargo, transitoria debido a la inducción de apoptosis en las células cuando tiene lugar la replicación. En el documento: Rayner J.O., Dryga S.A., Kamrud K.I. "Alphavirus vectors and vaccination"; Rev. Med. Virol. 2002;12 279-296, se describe el desarrollo de 40 vectores de expresión basados en alfavirus para su uso en el campo de las vacunas.
Otro tipo de vectores virales son los basados en adenovirus. Existe amplia bibliografía sobre el uso de adenovirus, que se han desarrollado para superar algunos de los inconvenientes de la terapia génica y como fuente para crear vectores de expresión. Un documento que recoge los últimos avances en vectores adenovirales es: Volpers C, Kochanek S. "Adenoviral vectors for gene transfer and therapy"; J Gene. Med. 2004; 6: S164-S171. Los adenovirus 45 tienen la ventaja de poseer una alta eficacia de transducción y capacidad de persistir en forma episomal. Sin embargo, la expresión de proteínas adenovirales induce fuertes respuestas inmunes, que limitan la duración de la expresión del transgén y causan toxicidad a las células infectadas por el vector. Se han desarrollado adenovirus vacíos para superar estos problemas. Dichos adenovirus vacíos están desprovistos de todos los genes adenovirales (las únicas secuencias conservadas son las dos secuencias terminales repetidas invertidas y las señales de empaquetamiento), y por lo tanto, 50 las células transducidas no expresan ningún producto adenoviral y no provocan una respuesta inmune contra el vector. En suma, la eliminación de todos los genes adenovirales deja suficiente sitio para alojar grandes casetes de expresión y es por ello, por lo que a los adenovirus vacíos se les llama también vectores adenovirales de alta capacidad. Un documento que describe aspectos concretos de los vectores adenovirales, relacionados con la supresión de todas las secuencias codificantes de proteínas virales es el trabajo de Morsy MA et al. "An adenoviral vector deleted for all viral 55 coding sequences results in enhanced safety and extended expression of a leptin transgene"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:7866–7871. El documento Schiedner G et al. "Variables Affecting In Vivo Performance of High-Capacity Adenovirus Vectors"; J. Virol. 2002, 76:1600–1609 describe el uso de ADN de relleno en los vectores de expresión basados en adenovirus vacíos, mostrando que la presencia de dicho ADN de relleno es esencial para conseguir un
incremento considerable de la expresión génica; y en general, que el diseño de vectores basados en adenovirus de alta capacidad (vacíos) puede variar sustancialmente el grado de expresión y la duración de la expresión de un gen.
Por otra parte el documento US-5.981.225 describe un vector para transferencia de genes basado en adenovirus, que comprende secuencias terminales invertidas repetidas (ITR), al menos una secuencia de señal de empaquetamiento y un gen adenoviral VAII y/o un gen adenoviral VAII; y comprende un gen extraño al adenovirus 5 operativamente unido a un promotor funcional en células diana para adenovirus.
El documento US-5.985.846 describe un vector de transferencia génica que comprende secuencias terminales invertidas repetidas (ITR) de adenovirus y partículas recombinantes de adenovirus que contienen dichas secuencias.
El documento US-6.566.093 describe vectores de ADNc derivado de alfavirus que consisten en ADN complementario de al menos parte del ARN de un alfavirus, esencial para la replicación del alfavirus, y ADNc heterólogo, 10 por ejemplo, ADNc que codifica una sustancia deseada. Dicha sustancia deseada puede ser una proteína o polipéptido biológicamente activo, así como una proteína o polipéptido inmunogénico o antigénico, o una proteína o polipéptido terapéuticamente activo, o un RNA terapéuticamente activo.
El objetivo de la presente invención es mejorar la expresión transgénica y la inducción de apoptosis en células tumorales mediada por vectores híbridos in vitro e in vivo. Un objetivo adicional es mejorar la eficacia de la terapia de 15 tumores en modelos animales mediante vectores híbridos.
Un objetivo adicional es además conseguir un método de terapia génica, en particular para el tratamiento del cáncer, mediante el uso de vectores híbridos.
Los objetivos de la presente invención se consiguen combinando en un único vector:
- una elevada capacidad de infección, por medio del uso de un sistema de liberación de adenovirus, 20
- un nivel elevado de expresión transgénica y la inducción de apoptosis, mediante el uso de un vector derivado de un alfavirus, tal como el SFV, y
- una especificidad tumoral mediante el uso de un promotor específico de tumores.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere en primer lugar a un vector híbrido adenoviral de expresión génica que 25 comprende, al menos los siguientes elementos, orientados en dirección 5’ a 3’:
i. una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus;
ii. una primera secuencia no codificante de relleno;
iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido; 30
i. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es parcialmente complementaria de un ARN alfaviral, que comprende al menos una secuencia codificante de un gen exógeno de interés en donde dicha cadena de ADNc comprende:
a. una secuencia 5’ necesaria para la replicación del alfavirus,
b. una secuencia que codifica las proteínas no estructurales requeridas para la replicación del ARN 35 alfaviral,
c. al menos un promotor subgenómico del alfavirus, y
d. una secuencia 3’ necesaria para la replicación del alfavirus;
iv. una secuencia de poliadenilación, y
v. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral. 40
De manera más específica, la presente invención se refiere a la construcción de un vector híbrido adenoviral, que comprende como elemento iv una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, que es la secuencia de un replicón recombinante de SFV, bajo el control transcripcional de un promotor específico de tumor (elemento iii.), que es el promotor de alfa-fetoproteína (AFP). En esta construcción, un transgén puede ser insertado en el replicón de SFV, dirigido por el promotor subgenómico de SFV. Después de la infección de las células tumorales con este vector híbrido, 45 el ARNm del replicón de SFV es transcrito a partir del promotor específico de tumor, y las proteínas no estructurales - nsPs - que constituyen el gen de la replicasa del SFV son traducidas a partir de dicho ARNm del replicón de SFV. Dichas proteínas nsPs - replicasa viral - inician la replicación del ARNm del replicón de SFV, para generar el ARN
subgenómico de SFV. Consecuentemente, el transgén puede ser expresado a un nivel elevado a partir del ARN subgenómico de SFV. Todo este proceso de replicación viral dará lugar a la producción de apoptosis en las células infectadas. En el caso de que este híbrido infecte células no tumorales, el ARNm del replicón de SFV no será transcrito a partir del promotor específico de tumor, el cual no será activo en estas células. Por lo tanto, no se producirá expresión del transgén, y no se producirá apoptosis en células normales infectadas por el vector híbrido. 5
Además, la presente invención se refiere a un método para obtener dicho vector híbrido adenoviral, que comprende ensamblar mediante técnicas de ingeniería genética los elementos i. a vi. del vector híbrido adenoviral definido anteriormente.
La presente invención se refiere también al uso de dicho vector híbrido para transferir material genético a una célula, y más particularmente para introducir y expresar genes extraños en células eucarióticas que puedan ser células 10 diana para adenovirus.
De manera preferida la transferencia de material genético tiene como consecuencia la inducción de una respuesta inmune contra antígenos extraños en dicha célula.
La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende dicho vector híbrido adenovirus-alfavirus y su uso en el tratamiento terapéutico del cáncer, que comprende administrar a un sujeto dicha 15 composición farmacéutica.
La presente invención se refiere también a un método de tratamiento del cáncer mediante el uso del vector híbrido definido anteriormente, que comprende administrar a un sujeto dicho vector híbrido.
La presente invención se refiere a un vector híbrido adenoviral de expresión génica caracterizado porque comprende al menos los siguientes elementos orientados en dirección 5’ a 3’: 20
i. una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus;
ii. una primera secuencia no codificante de relleno;
iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido;
iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es parcialmente complementaria de un ARN 25 alfaviral, que comprende al menos una secuencia que codifica un gen exógeno de interés en donde dicha cadena de ADNc comprende:
a. una secuencia 5’ necesaria para la replicación del alfavirus,
b. una secuencia que codifica las proteínas no estructurales requeridas para la replicación del ARN alfaviral,
c. al menos un promotor subgenómico del alfavirus, y 30
d. una secuencia 3’ necesaria para la replicación del alfavirus;
v. una secuencia de poliadenilación; y
vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral.
La naturaleza del elemento i. en el vector híbrido alfavirus-adenovirus de la presente invención, es decir, la naturaleza de la cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y 35 una secuencia señal para el empaquetamiento () del adenovirus, no es un aspecto crítico para la presente invención y puede proceder de cualquier serotipo de adenovirus. Dichos serotipos son bien conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo Ad12 (subgénero A), Ad3 y Ad7 (subgénero B), Ad2 y Ad5 (subgénero C), Ad8 (subgénero D), Ad4 (subgénero E), Ad40 (subgénero F), y otros adenovirus no humanos conocidos que pueden proceder de especies como cerdo, ovejas, vacas y aves. Por lo tanto dicha primera secuencia terminal invertida repetida que puede contener 40 aproximadamente entre 100 y 500 bp en longitud, puede variar según el serotipo de adenovirus utilizado. Del mismo modo, la secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus puede variar según el serotipo de adenovirus utilizado.
Según una realización particular preferida dicho vector adenoviral de expresión génica comprende un elemento i. que tiene la SEQ ID NO: 1, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: 1 para realizar la 45 misma función.
La naturaleza del elemento ii. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. Dicho elemento ii., que tiene como función aumentar el tamaño total de la construcción, puede ser cualquier secuencia no codificante de relleno. Preferentemente dicha secuencia es una secuencia no codificante
humana. De manera más preferida aún dicha secuencia no codificante de relleno es la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana (HPRT).
De manera preferente, el vector híbrido adenoviral definido comprende además un elemento vii. que es una segunda secuencia no codificante de relleno, localizada entre el elemento v. y el elemento vi. definidos anteriormente.
La naturaleza del elemento iii. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico 5 de la misma. De manera preferida el promotor específico de tejido iii. es un promotor específico de tumores. Como ejemplos se pueden citar como promotor específico de tumores, los promotores AFP, telomerasa TERT, PAP ("pancreatic associated protein"), E2F y HIF.
Según una realización particular preferida de la invención, el promotor específico de tumores tiene la secuencia SEQ ID NO: 7, que corresponde al promotor/potenciador AFP, (AFP p+e) o la secuencia SEQ ID NO: 15 correspondiente 10 a telomerasa TERT, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con la secuencia SEQ ID NO: 7 o con la secuencia SEQ ID NO: 15, para realizar la misma función, respectivamente.
La naturaleza del elemento iv. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. Preferentemente las secuencias alfavirales del elemento iv. se derivan del virus Semliki Forest (SFV). Sin embargo se podrían usar otras secuencias alfavirales derivadas de cualquiera de las especies pertenecientes a la 15 familia Togaviridae, por ejemplo SIN, RRV y VEE.
Dicha cadena iv. de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es parcialmente complementaria de un ARN alfaviral comprende preferentemente, (además de una secuencia que codifica al menos un gen exógeno de interés):
a) una secuencia 5’ necesaria para la replicación del alfavirus,
b) una secuencia codificante de las proteínas no estructurales necesarias para la replicación del ARN alfaviral, 20
c) al menos un promotor subgenómico del alfavirus, y
d) una secuencia 3’ necesaria para la replicación del alfavirus;
De manera preferida el elemento iv. forma un replicón funcionalmente controlado por el promotor iii., y donde a su vez el promotor subgenómico alfaviral comprendido en iv.c) controla funcionalmente la expresión del gen exógeno de interés. 25
Según una realización particular especialmente preferida, las secuencias a) a c) del elemento iv. en su conjunto, tienen una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 3 (SFV 5'-rep-Psg) o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: 3 para realizar la misma función, y SEQ ID NO: 4 (SFV 5'-rep-Psg-enh) o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: 4 para realizar la misma función.
Según una realización particular especialmente preferida, el elemento iv.d) tiene la secuencia SEQ ID NO: 30 (SFV3'), o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: para realizar la misma función.
En el elemento iv. del vector híbrido alfavirus-adenovirus de la presente invención, el gen exógeno de interés es preferentemente un gen terapéutico o un gen reportero, o una combinación de ambos. Sin que deba considerarse limitante, el gen terapéutico se selecciona preferentemente entre interleucina de mamífero - IL-12 -, el factor estimulante de colonias GMCSF, interferón alfa y timidin-kinasa del virus herpes simple (tk). 35
El gen exógeno de interés en el elemento iv. puede ser además un gen reportero. Sin que deba considerarse limitante, el gen reportero puede ser uno seleccionado entre el LacZ, Luciferasa, tk y GFP.
De manera especialmente preferida el gen terapéutico es interleucina de mamífero IL-12, de forma más preferente aún el gen terapéutico es interleucina humana, hIL-12.
El vector híbrido adenoviral de expresión génica puede incluir en el elemento iv en serie uno o varios 40 subconjuntos de (promotor subgenómico + gen exógeno de interés).
La naturaleza del elemento v. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. De manera preferida el elemento v. es una secuencia de poliadenilación de SV40. De manera especialmente preferida dicha secuencia de poliadenilación de SV40 es la secuencia SEQ ID NO: 6, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con la secuencia SEQ ID NO: 6 para realizar la misma función. 45
La naturaleza del elemento vi. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención, no es un aspecto crítico de la misma. Según una realización preferida dicho vector adenoviral de expresión génica comprende una secuencia terminal invertida repetida como elemento vi. que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: 2 para poder realizar la misma función.
La naturaleza del elemento vii. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. La segunda secuencia no codificante de relleno puede ser cualquiera. Preferentemente es una secuencia no codificante humana, y de manera especialmente preferida es una secuencia procedente del cósmido humano C346.
El vector híbrido adenoviral de expresión génica de la presente invención puede tener una longitud variable, y tiene preferentemente una longitud comprendida entre 27 y 38 kilobases. 5
Según una realización particular preferida el vector híbrido adenoviral comprende ITR 5´, como primera secuencia terminal invertida repetida; HPRT, región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana como primera secuencia de relleno; AFP (p+e), promotor específico de tumores; una secuencia replicón de SFV que contiene mIL-12, interleucina-12 de ratón; SV40 PoliA, secuencia de poliadenilación de SV40; C346, cósmido C346 genómico humano como segunda secuencia de relleno, y ITR 3´ como segunda secuencia terminal invertida repetida. 10
Según una realización particular adicional preferida el vector híbrido adenoviral comprende ITR 5´ como primera secuencia terminal invertida repetida; HPRT, región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana como primera secuencia de relleno; AFP (p+e), promotor específico de tumores; una secuencia replicón de SFV que contiene LacZ; SV40 PoliA, secuencia de poliadenilación de SV40; C346, cósmido C346 genómico humano como segunda secuencia de relleno, y ITR 3´ como segunda secuencia terminal invertida repetida. 15
Según una realización adicional particularmente preferida el vector híbrido adenoviral comprende ITR 5´ como primera secuencia terminal invertida repetida; HPRT, región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana como primera secuencia de relleno; AFP (p+e), promotor específico de tumores; una secuencia replicón de SFV que contiene hIL-12, interleucina-12 humana; SV40 PoliA, secuencia de poliadenilación de SV40; C346, cósmido C346 genómico humano como segunda secuencia de relleno, y ITR 3' como segunda secuencia terminal invertida repetida. 20
Según una realización particular preferida de la presente invención, el vector híbrido adenoviral de expresión génica tiene la secuencia SEQ ID NO: 8, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: 8 para realizar la misma función.
Según una realización particular adicional preferida de la presente invención, el vector híbrido adenoviral de expresión génica tiene la secuencia SEQ ID NO: 9, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: 25 9 para realizar la misma función.
Según una realización particular adicional preferida de la presente invención el vector híbrido adenoviral de expresión génica tiene la secuencia SEQ ID NO: 10, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID NO: 10 para realizar la misma función.
Además la presente invención se refiere a un método para obtener dicho vector híbrido adenoviral, que 30 comprende ensamblar mediante técnicas de ingeniería genética los elementos i. a vi., o i. a vii., del vector híbrido adenoviral definido anteriormente.
La presente invención se refiere también al uso de dicho vector híbrido para transferir material genético a una célula, y más particularmente para introducir y expresar genes extraños en células eucarióticas que puedan ser células diana para adenovirus. Dicho uso comprende administrar a un sujeto dicho vector híbrido. 35
La infección de células tumorales con un vector híbrido adenoviral según la invención, tiene como consecuencia que el ARNm del replicón del alfavirus SFV sea transcrito a partir del promotor específico de tumor, con lo que se traducirá el gen Rep y se amplificará el ARN de SFV. Rep también producirá un ARN subgenómico de SFV, a partir del cual será expresado el gen terapéutico o reportero en niveles elevados. El producto del gen terapéutico secretado por las células infectadas activará los inmunocitos en el sitio de infección. Además, la replicación de SFV inducirá apoptosis 40 en las células infectadas, conduciendo a la liberación de antígenos de tumor por las células apoptóticas, que pueden ser tomados por células presentadoras de antigenos (APCs), activando de este modo la respuesta inmune contra el tumor. Sin embargo, si este vector híbrido infecta células no-tumorales, el ARNm del replicón SFV no será transcrito y por tanto no habrá expresión transgénica y no se producirá apoptosis.
De manera preferida las células tumorales se infectan con un vector híbrido adenoviral según la invención, de 45 modo que el ARNm del replicón de SFV sea transcrito a partir del promotor específico de tumor AFP, con lo que se traducirá el gen Rep y se amplificará el ARN de SFV. Rep también producirá un ARN subgenómico de SFV, a partir del cual será expresado mIL-12 o hIL-12 a niveles elevados. mIL-12 o hIL-12 secretadas por células infectadas activarán los inmunocitos en el sitio de infección. Además, la replicación de SFV inducirá apoptosis en las células infectadas, conduciendo a la liberación de antígenos de tumor por las células apoptóticas, que pueden ser tomados por células 50 presentadoras de antígenos, APCs, activando de este modo la respuesta inmune contra el tumor. Sin embargo, si este vector híbrido infecta células no tumorales, el ARNm del replicón de SFV no será transcrito y por tanto no habrá expresión transgénica y no se producirá apoptosis.
La presente invención tiene como objeto adicional el uso de un vector híbrido adenoviral definido anteriormente en un procedimiento para transferir material genético a una célula, preferentemente, una célula tumoral, y que 55 comprende administrar a un sujeto dicho vector híbrido. De modo más preferido aún dicha célula es una célula tumoral
que expresa AFP.
Además, la presente invención también tiene como objeto el uso de un vector híbrido adenoviral definido para preparar un medicamento eficaz en el tratamiento de tumores, así como su uso para inducir una respuesta inmune contra antígenos extraños. Dicho uso comprende administrar a un sujeto dicho medicamento.
Además, la presente invención también tiene como objeto adicional una composición farmacéutica, que 5 comprende al menos un vector híbrido adenoviral definido según la presente invención y el uso de la misma en un procedimiento para el tratamiento de tumores, o para inducir una respuesta inmune frente a antígenos extraños. De manera especialmente preferida dicha composición farmacéutica comprende un vector híbrido adenoviral según la presente invención, en el que el gen exógeno de interés es la interleucina de mamífero, IL-12, preferentemente interleucina humana hIL-12. Dicho uso comprende administrar a un sujeto la composición farmacéutica que comprende 10 dicho vector híbrido.
La presente invención se refiere también a un método de tratamiento del cáncer mediante el uso del vector híbrido de acuerdo con la presente invención, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto de dicho vector híbrido.
Por lo tanto según realizaciones preferidas de la presente invención, se ha elegido el AFP (p+e) como promotor 15 específico de tumores, se han construido dos vectores híbridos adenovirales en los cuales el replicón SFV está controlado por el promotor AFP, y el gen reportero LacZ y el gen terapéutico IL-12 son insertados bajo el control del promotor subgenómico de SFV, respectivamente - Ad/AFP-SFV-LacZ y Ad/AFP-SFV-mIL-12 -, y como vectores control se han preparado dos vectores vacíos adenovirales que llevan LacZ y IL-12 de ratón directamente controlados por el promotor AFP - Ad/AFP-LacZ y Ad/AFP-mIL12-. Se ha mostrado que el vector híbrido de la presente invención funciona 20 de manera más eficaz que los vectores control que se han venido utilizando hasta el momento.
De acuerdo con la presente invención se ha mostrado que el vector Ad/AFP-SFV-mIL-12 puede ser un vector útil en terapia de tumores HCC (hepatocarcinoma) que expresan AFP.
Se ha mostrado también que el uso de otros promotores de tumores como el promotor telomerasa - TERT - que es ampliamente activado en la mayor parte de los tumores malignos, para controlar SFV puede convertir el uso de un 25 vector híbrido como el de la presente invención, en una estrategia general para el tratamiento de todo tipo de cáncer.
Además, de manera ventajosa, el vector híbrido de la presente invención funciona específicamente con células tumorales y mata células tumorales sin necesidad de incorporar un gen terapéutico. Y adicionalmente, se muestra que ventajosamente, el vector híbrido de la presente invención cuando incluye un gen terapéutico como IL-12 induce una potente actividad antitumoral. 30
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. (A) muestra el diagrama de un vector híbrido según una realización de la invención, Ad-SFV, que contiene una secuencia de adenovirus vacío en la que se ha insertado un replicón SFV bajo el control del promotor/potenciador AFP (AFP (p+e), y que contiene el gen heterólogo mIL-12, el cual está colocado bajo el control del promotor subgenómico SFV (Pr sg). Figura 1 (B) muestra la actividad antitumoral del vector híbrido según la invención: 35 después de infección de células tumorales de HCC con este vector híbrido (derecha), gracias a la presencia en el vector híbrido del replicón de SFV que comprende mIl-12, se producirá la expresión de mIL-12 a niveles elevados, lo cual activará los inmunocitos en el sitio de infección. Además, la replicación de SFV inducirá apoptosis en las células infectadas. Sin embargo, si este vector híbrido infecta células no tumorales, el ARNm del replicón SFV no será transcrito y por tanto no habrá expresión transgénica ni se producirá apoptosis. En esta figura: 40
- ITR, secuencias adenovirales terminales invertidas repetidas;
- , señal de empaquetamiento adenoviral;
- HPRT y C346, secuencias de ADN de relleno procedentes de la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana o del cósmido humano C346, respectivamente;
- PoliA, señal de poliadenilación (por ejemplo, de SV40); 45
- APCs, células presentadoras de antígeno.
La Figura 2 muestra la estructura de los vectores híbridos adenovirales vacíos y vectores adenovirales vacíos. AFP-SFV-lacZ y AFP-SFV-mIL-12 son vectores de adenovirus híbridos, en los que la secuencia del replicón de SFV está bajo control del promotor/potenciador AFP (AFP(p+e))y los genes heterólogos LacZ o mIL-12 han sido clonados bajo el control del promotor subgenómico de SFV (Pr sg), respectivamente. AFP-lacZ y AFP-mIL-12 son vectores 50 adenovirales que contienen LacZ o mIL-12 dirigidos directamente por AFP (p+e). SFV nsp1-4, proteínas no estructurales de SFV.
La Figura 3 muestra La expresión específica de mIL-12 in vitro en células de hepatocarcinoma que expresan AFP, HCC, (A), y no derivadas de HCC (B) después de la infección con los vectores híbridos de Ad-SFV: AFP-mIL-12 (AFP-12), AFP-SFV-mIL-12 (AFP-SFV-12) o con el vector control AdCMVmIl-12 (CMV-12). Se ensayaron diferentes multiplicidades de infección "moi" (10, 100 y 1000). Hep3B, Huh-7, HepG2 y PLC/PRF/5: líneas de HCC; Hela, A549, MHC1, SK-Hep-1 y Clon 9: líneas no derivadas de HCC. En B solo se muestra la expresión correspondiente a moi 1000. 5
La Figura 4 muestra la expresión específica de -gal en 4 líneas celulares de HCC (Hep3B, Huh-7, HepG2 y PLC/PRF/5) después de la infección in vitro con el vector híbrido AFP-SFV-lacZ o con el vector control AFP-LacZ a diferentes "moi" (10, 100, ó 1000).
La Figura 5 muestra el análisis de la expresión de -gal en líneas celulares de HCC infectadas con AFP-LacZ y AFP-SFV-LacZ. Microfotografías de células infectadas con AFP-LacZ (A-C) o AFP-SFV-LacZ (D-F) y teñidas con X-Gal. 10 A y D, Hep3B; B y E, Huh7; C y F, HepG2.
La Figura 6 muestra la cinética de la expresión de IL-12 en líneas celulares de HCC Hep3B (A) y Huh-7 (B), infectadas in vitro con vectores adenovirales AFP-mIL-12 (AFP-12) o AFP-SFV-mIL-12 (AFP-SFV-12), a una "moi" de 1000.
La Figura 7 muestra la inducción de muerte celular después de la infección de líneas celulares de HCC - Hep3B 15 (A) y McA-RH7777 (B) - in vitro con los vectores AFP-IL-12 (AFP-12), AFP-SFV-IL-12 (AFP-SFV-12), AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ, o vector control Ad/CMVmIL-12 (CMV-12). La supervivencia celular se muestra como el porcentaje de células vivas en pocillos infectados, comparado con las células vivas en pocillos control no infectados.
La Figura 8 muestra La expresión de SFV Rep en células HCC - Hep3B (A-D) y Huh-7 (E y F) - después de infección con vectores AFP-mIL-12 (A y B) o AFP-SFV-mIL-12 (C-F), a "moi" de 1000. Dos días después de la infección 20 las células fueron fijadas y analizadas por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para Rep. Las células que expresan Rep fueron visualizadas en un microscopio de fluorescencia con un filtro FITC (A, C, y E) mientras que los núcleos teñidos con DAPI en todas las células fueron visualizados con un filtro UV (B, D, y F).
La Figura 9 muestra La transferencia génica con los vectores híbridos vacíos in vivo. (A-D), Eficiencia de la transferencia génica e inducción de apoptosis en tumores Huh-7. Tumores Huh-7 humanos establecidos en ratones 25 inmunodeficientes "nude" fueron tratados por inyección intratumoral con los vectores de AFP-LacZ (n=4), o AFP-SFV-LacZ (n=4) a 1x1010 partículas virales/animal. Tres días después de la administración del virus los ratones fueron sacrificados y secciones del tumor fueron analizadas para estudiar la expresión del transgén por tinción con X-Gal (A-B) o para estudiar la inducción de apoptosis mediante TUNEL (C-D). A, C; Microfotografías de tumores que recibieron AFP-LacZ. B, D; Microfotografías de tumores que recibieron AFP-SFV-LacZ. (E-G), Especificidad de la expresión génica con 30 los vectores híbridos vacíos. Ratones Balb/c sanos fueron inyectados por vía intravenosa con 1x1010 partículas virales de los vectores AFP-LacZ (E), AFP-SFV-LacZ (F) o Ad/CMV-LacZ (G). Se muestran micrografías de cortes de tejido hepático tomados tres días tras la inoculación y teñidos con X-Gal.
La Figura 10 muestra el tratamiento de tumores de HCC con vectores híbridos. Tumores HCC ortotópicos fueron establecidos mediante implantación de células McH-RH7777 en el hígado de rata. Cuando el tumor alcanzó un 35 tamaño de 7-10 mm de diámetro, los animales fueron tratados con 1011 (A-C) o con 2 x1011 (D-G) partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o solución salina como control. El tamaño del tumor fue medido a los días 15 y 30 después de la administración de solución salina (A y E), AFP-mIL-12 (B y F) o AFP-SFV-mIL-12 (C y G). G; Índice de supervivencia de animales.
La Figura 11 muestra el estudio de toxicidad en ratas inoculadas con vectores que expresan IL-12. Se 40 determinó el nivel de las transaminasas (GPT, GOLT, y GGTL) (A) o de IL-12 (B) en el suero de ratas que portaban tumores HCC en hígado y que habían sido inoculadas intratumoralmente con los vectores de adenovirus AFP-SFV-IL-12, AFP-SFV-mIL-12, de alfavirus SFV-IL-12 o con suero salino. La medición se hizo a los 4 y 8 días tras el tratamiento.
La Figura 12 muestra la tinción con hematoxilina/eosina de secciones hepáticas de ratas tratadas con los vectores híbridos adenovirales. Se trataron ratas portadoras de tumores de HCC mediante inyección intratumoral con 45 suero salino (A), con los vectores adenovirales de AFP-IL-12 (B), o AFP-SFV-IL-12 (C), o con partículas virales de SFV-IL-12 (D). A los tres días tras el tratamiento se sacrificaron los animales, se extrajeron los hígados, se fijaron con formol y se obtuvieron secciones que se tiñeron con hematoxilina/eosina. Las flechas negras indican zonas con hepatocitos eosinófilos.
Las Figuras 13A y 13B muestran los mapas de restricción de los plásmidos pGL3/AFP y pBS/mIL-12 50 respectivamente.
Las Figuras 14A y 14B muestran los mapas de restricción de los plásmidos pTGC3001 y pTGC3011 respectivamente.
Las Figuras 15A y 15B muestran los mapas de restricción de los plásmidos pTGC3012 y pTGC3013 respectivamente. 55
La Figura 16 muestra el mapa de restricción del plásmido pTGC3014.
MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Plásmidos
pGEM-T “easy” y pCMVb fueron adquiridos de Promega, U.S.A y pBS-SK+ de Stratagene, U.S.A. pSTK120 fue donado por el Dr. Kochanek (Universidad de Ulm, Alemania). pBK-SFV-1 y pBK-SFV-3 han sido descritos en Berglund P. 5 et al. "Enhancing immune responses using suicidal DNA vaccines". Nature Biotechnology 1998, 16:562-565. pGL3/AFP y pBS/mIL-12 (Yonglian Sun, Cheng Qian, Dacheng Peng and Jesús Prieto. 2000. Gene transfer to liver cancer cells of B7-1 in addition to IL-12 changes immunoeffector mechanisms and suppress Th1 cytokine production induced by IL-12 alone. Human Gene Therapy 11:127-138) fueron producidos en nuestro laboratorio.
Para la construcción de pGL3/AFP, las regiones del promotor/potenciador de AFP (p+e) se obtuvieron mediante 10 amplificación por PCR de ADN genómico humano. Los iniciadores ("primers") utilizados para la amplificación del promotor de AFP (AFP pro) fueron CTCTAGATTTTCTGCCCCAAAGAGCTC y CGGGATCCTGTTATTGGCAGTGGTGGAA. Los iniciadores utilizados para la amplificación del potenciador de AFP (AFP "enhancer") fueron CGGAATTCGCCTGTCATACAGCTAATAA y CTCTAGACTGTCAAATAAGTGG CCTGG. Las secuencias del promotor (217 pares de bases) y del potenciador (785 pares de bases) se clonaron en plásmidos pGEM-15 T. Posteriormente se realizó una confirmación de los fragmentos amplificados mediante secuenciación. El promotor AFP se retiró del plásmido pGEM-T/AFP-p mediante restricción con Xba I/BamHI y se empalmó con extremos romos en un plásmido pGL3-basic digerido con Sma I. De este modo se obtuvo un plásmido pGL3/AFP-p. El potenciador de AFP se retiró del plásmido pGEM-T/AFP-e mediante restricción con Xba I/Eco RI y se empalmó con extremos romos en el plásmido pGL3/AFP-p digerido con Nhe I, para obtener finalmente el plásmido pGL3/AFP. 20
Líneas celulares y cultivos de tejidos
Las líneas celulares de HCC humanos Hep3B, PLC/PRF/5, HepG2 y SK-Hep-1, la línea celular Hela de adenocarcinoma epitelial cervical humano, la línea celular A549 de carcinoma de pulmón humano, la línea celular 293 de riñón de embrión humano, las líneas celulares de HCC de rata McA-RH7777, MHC1, y el Clon 9 de hepatocito normal de rata y la línea celular de HCC de ratón Hepa1-6, fueron obtenidas de la ATCC. Las células 293 que expresan Cre 25 recombinasa (293Cre4) fueron obtenidas de Merck Research Laboratories. Las células Hep3B, PLC/PRF/5, Hela, SK-Hep-1, Clon 9, Huh-7 y Hepa1-6 fueron crecidas en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por calentamiento y penicilina/estreptomicina. Las células HepG2 y A549 fueron crecidas en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% inactivado por calentamiento y penicilina/estreptomicina. Las células McH-RH7777 y MHC1 fueron crecidas en medio DMEM suplementado con suero de caballo al 20% y FBS al 5% FBS. Las células 30 293Cre4 fueron crecidas en medio DMEM suplementado con FBS al 10% y 0.4 mg/ml de G418.
Animales
Ratones hembras BALB/c inmunodeficientes "nude" de siete semanas de edad fueron adquiridos a Charles Rivers Laboratories (Barcelona, Spain). Ratas Buffalo macho de 4-6 semanas fueron obtenidas de CIFA (Instalación de Animales de la Universidad de Navarra). Ratones y ratas se mantuvieron en condiciones habituales en CIFA. Los 35 ratones "nude" fueron alimentados con dieta irradiada y agua tratada en autoclave. La manipulación de los ratones "nude" se realizó siempre bajo en campana de flujo laminar. Todos los procedimientos con animales fueron realizados de acuerdo con protocolos y recomendaciones estandard para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Construcción de vectores
Construcción de casetes de expresión AFP-SFV 40
La secuencia 5´ terminal de SFV (1-292 nt) fue amplificada por PCR usando el plásmido pBK-SFV-1 (que contiene la secuencia completa del replicón de SFV) como molde. El cebador 1 contenía un sitio de restricción Spe I en el extremo 5´ terminal (subrayado) seguido de 50 nt de la secuencia del promotor de AFP y los primeros 20 nt de la secuencia de SFV (en cursiva) 5’-ACT AGT TAA CAG GCA TTG CCT GAA AAG AGT ATA AAA GAA TTTCAG CAT GAT TTT CCA TGG CGG ATG TGT GAC ATA C-3’. El cebador 2 contenía un sitio de restricción Xho I (subrayado) 45 seguido de 19 nt de la secuencia de SFV (en cursiva): 5’-CTC GAG GAT ATC CAA GAT GAG TGT GT-3’. Se generó un fragmento de DNA de 342bp mediante PCR y se clonó directamente en el plásmido pGEM-T-easy, originando pGEM-Te-SFV-1. La ausencia de errores de PCR en este plásmido se confirmó mediante secuenciación. El fragmento de 342 bp se extrajo de pGEM-Te-SFV-1 por digestión con Spe I y Xho I, y fue clonado en pGL3/AFP digerido con las mismas enzimas para dar pGL3/AFP-SFV-1, el cual posee el promotor (217bp y el potenciador (785bp) de AFP completos 50 seguidos de la secuencia 5' terminal de SFV (SFV-1, que comprende 292bp). Se obtuvo un casete AFP-SFV-1 (1342bp) a partir de pGL3/AFP-SFV-1 mediante digestión con Mlu I/ Xho I, se trató con Klenow y se clonó en pBS-SK+ digerido con EcoR V, generando pBS/AFP-SFV1. El polyA tardío de SV40 (262bp) fue extraído de pGL3/AFP mediante digestión con Xba I/BamH I, romizado con Klenow e insertado en el sitio Sal I de pBS/AFP-SFV1, romizado también con Klenow, dando lugar a pBS/AFP-SFV-1-pA. Se insertó un "polylinker" que contenía los sitios únicos Apa I y Nru I, entre los sitios 55 Bam HI y Xma I, en pBS/AFP-SFV-1-pA. La secuencia 3' terminal de SFV que comprende 7985bp fue extraída mediante
digestión con Spe I/Eco RV de pBK-SFV-1, se romizó con Klenow y se insertó en la posición EcoR V de pBS/AFP-SFV-1-pA, dando lugar a pBS/AFP-SFV-pA.
El gen reportero LacZ se obtuvo a partir de pCMVb mediante digestión con Not I, se trató con Klenow y se insertó en el sitio BamH I de pBS/AFP-SFV-pA tratado con klenow para formar pBS/AFP-SFV-lacZ-pA. Se separó de pBS/mIL-12 un casete mIL-12, que contenía los genes que codifican para las subunidades p35 y p40 unidas por un sitio 5 interno de entrada al ribosoma (IRES), mediante digestión con Spe I/Xho I, se trató con Klenow y se insertó en la posición BamHI de pBS/AFP-SFV-pA, también tratada previamente con Klenow, generándose el plásmido pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA.
Construcción de vectores híbridos vacíos adenovirales
Cuatro vectores adenovirales vacíos han sido construidos, como se muestra en la Figura 2. AFP-SFV-LacZ y 10 AFP-SFV-mIL-12 contienen una secuencia del replicón recombinante SFV, dirigida por el promotor y potenciador AFP. En estos vectores el gen reportero LacZ o el gen terapéutico mIL-12 fueron clonados bajo el control del promotor subgenómico de SFV, respectivamente. AFP-lacZ y AFP-mIL-12 también son vectores de adenovirus vacíos, que contienen genes LacZ y mIL-12, dirigidos directamente por el promotor/potenciador AFP, respectivamente. A continuación se describe el proceso seguido para la construcción de estos vectores. Con objeto de generar un vector de 15 adenovirus con suficiente espacio de clonaje para albergar el casete de expresión de AFP-SFV-IL-12 se procedió a modificar el plásmido pSTK120 que contiene la secuencia de un adenovirus vacío. Para ello se eliminó un fragmento de 9 kb del plásmido pSTK120 mediante digestión con Apa I. Además en este nuevo plásmido se insertó un "polylinker" que contenía los sitios Asc I y Sbf I dando lugar a pTGC3001. Éste plásmido contiene la ITR izquierda, la señal de empaquetamiento, ADN de relleno procedente de HPRT y C346, y la ITR derecha. El casete AFP-SFV-LacZ se separó 20 mediante digestión con Apa I de pBS/AFP-SFV-lacZ-pA y se insertó en el sitio Apa I de pTGC3001, dando lugar a pTGC3011. De manera similar, el casete AFP-SFV-mIL-12 fue liberado de pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA por digestión con BssH II, tratado con Klenow e insertado en el sitio Asc I de pTGC3001, también tratado con Klenow para generar pTGC3012.
Construcción de vectores control 25
Construcción del vector adenoviral vacío AFP-LacZ
La secuencia del potenciador/promotor de AFP (AFPp+e) se separó de pGL3/AFP por digestión con Mlu I/Xho I,se trató con Klenow y se insertó en pCMVb, el cual había sido previamente digerido por EcoRI /Xho I y tratado con Klenow. De este modo el promotor temprano inmediato de CMV fue eliminado de pCMVb y sustituido por AFP (p+e) generándose pAFPb. A continuación se extrajo el casete AFP-LacZ (5077 bp) de pAFPb mediante digestión con Xba 30 I/Nar I se trató con Klenow y se insertó en el sitio Swa I de pSTK120, también romizado con Klenow, dando lugar a pTGC3013.
Construcción del vector adenoviral vacío AFP-mIL-12
El casete mIL-12 se extrajo de pBS/mIL-12 mediante digestión por Xho I/Spe I, y se insertó en pGL3/AFP previamente digerido con Xho I/Xba I, lo cual eliminó el gen luciferasa de este último plásmido y dio lugar a pAFP-mIL-35 12. El casete AFP-mIL-12 (3760 bp) fue extraído a partir de pAFP-mIL-12 mediante digestión con BamH I/Sca I, tratado con Klenow e insertado en pSTK120 digerido por Swa I, y tratado también con Klenow para generar pTGC3014.
Recuperación de los vectores adenovirales vacíos
Después de la digestión con Pme I, extracción con fenol/cloroformo, y precipitación con etanol, se transfectaron 2 g de ADN de pTGC3011, pTGC3012, pTGC3013, o pTGC3014 en células 293Cre4, respectivamente. Tras la 40 transfección, las células fueron infectadas con el virus "ayudante" AdLC8cluc. A continuación se llevaron a cabo los pasos de amplificación y preparación a gran escala, como se ha descrito previamente (Philip Ng., Robin J. Parks, and Frank L. Graham. Preparation of helper-dependent adenoviral vectors. Methods in Molecular Medicine, Vol. 69, Gene Therapy Protocols, 2nd. Ed. 69, 371-88, 2002; H. Zhou, L. Pastore, A. L. Beaudet. Helper-dependent adenoviral vectors. Methods in Enzymology, vol, 346, 177-198, 2002; Hillgenberg M., et al. System for efficient helper-dependent minimal 45 adenovirus constructions and rescue. Hum Gene Ther., 12; 643-657, 2001). Todas las preparaciones de vectores fueron purificadas dos veces por centrifugación en gradiente de CsCl. Los vectores de ADN purificados se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción, y no mostraron reordenamientos de secuencias. El título del adenovirus vacío y la contaminación por el virus "ayudante" se evaluaron mediante PCR cuantitativa. La proporción de las partículas virales totales frente a las unidades infecciosas (iu) fue 20:1. La contaminación por partículas de virus "ayudante" fue 50 aproximadamente del 0.5-1%.
PCR cuantitativa
Para determinar el grado de contaminación por el virus "ayudante" se diseñaron una sonda y cebadores para PCR cuantitativa de la región Ad5 E4, mediante el programa TaqMan (TaqMan Probe #2) y fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd (cebador) y Applied Biosystems (sonda). Para determinar el título de los adenovirus vacíos, se 55 diseñaron sondas y cebadores para PCR cuantitativa de secuencias de LacZ y IL-12 de ratón, mediante el programa
TaqMan program (TaqMan Probe #2), y fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd (cebador) y Applied Biosystems (sonda). Para determinar la contaminación por Ad de tipo silvestre, se diseñaron sondas y cebadores para PCR cuantitativa de la región E1 de Ad5 mediante el programa TaqMan program (TaqMan Probe #2), y fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd (cebador) y Applied Biosystems (sonda).
Experimentos "in vitro" 5
Expresión transgénica en células infectadas con vectores adenovirales vacíos
Las líneas celulares derivadas de HCC (Hep3B, Huh7, HepG2 y PLC/PRF/5) y las líneas celulares no derivadas de HCC (A549, Hela, MHC1, y Clon 9) o derivadas de HCC pero que no expresan AFP (SK-Hep-1) fueron infectadas con cada uno de los 4 vectores adenovirales vacíos (AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ, AFP-mIL-12, o AFP-SFV-mIL-12) a "moi" 1000, 100, ó 10 (partícula/célula), respectivamente. Tres adenovirus de primera generación (Ad/CMV-mIL-12, 10 Ad/CMV-LacZ, Ad/AFP-LacZ) fueron usados como control. Se recogieron en pocillos por duplicado los sobrenadantes de las células infectadas con los vectores mIL-12, y los lisados de las células infectadas con vectores LacZ, , para la determinación de mIL-12 y -galactosidasa (-gal), respectivamente. Las células infectadas con vectores LacZ fueron también teñidas con X-gal. El nivel de mIL-12 (p70) fue medido con un kit ELISA (Pharmingen, San Diego, CA). El nivel de -gal fue medido con un kit ELISA (Roche,). La cinética de expresión de IL-12 fue evaluada en células de HCC 15 (Hep3B y Huh7) después de la infección con AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o con el vector control Ad/CMV-mIL-12 a "moi" de 1000. Los sobrenadantes se recogieron diariamente hasta los 5 días postinfección.
Análisis de la especificidad de la expresión transgénica usando vectores híbridos Ad-SFV in vitro
Para examinar la especificidad de la expresión transgénica con los vectores recombinantes descritos anteriormente, se infectaron 4 líneas celulares de HCC humanas (Hep3B, HepG2, Huh-7 y PLC/PRF/5) y 5 líneas 20 celulares humanas no derivadas de HCC (Hela, A549, , MHC1, y Clon 9) o derivadas de HCC que no expresaban AFP (SK-Hep-1) con AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12 o Ad-CMVmIL-12 como control positivo, a diferentes "mois" (10, 100, ó 1000). Después de dos días de la infección, el sobrenadante fue recogido y se determinó la cantidad de mIL-12 en el mismo. Los resultados se muestran en la Figura 3 (A) y (B). No se observó expresión de mIL-12 en las células HCC humanas cuando se infectaron con AFP-mIL-12 a "moi" 10 ó 100, y sólo a "moi" 1000 se pudo observar un nivel muy 25 bajo de mIL-12 en algunas líneas celulares (Figura 3A). En contraste, la infección de estas células con AFP-SFV-mIL-12 a "mois" 10, 100, ó 1000 dio como resultado la expresión de mIL-12 en un modo dependiente de la dosis (Figura 3A). El nivel de expresión de mIL-12 en células infectadas con "moi" 10 de AFP-SFV-mIL-12, fue comparable al nivel obtenido en células infectadas con AFP-mIL-12 a moi 1000. Además, el nivel de mIL-12 en células de HCC infectadas con AFP-SFV-mIL-12 a diferentes "mois" fue comparable al obtenido con el vector control AdCMVmIL-12. Sin embargo, la 30 infección de células que no expresan AFP con AFP-mIL-12 o AFP-SFV-mIL-12, no produjo niveles detectables de mIL-12, incluso cuando se usó la "moi" más elevada (1000) (Figura 3B). En estas células, sólo el vector control Ad-CMV-mIl-12 fue capaz de producir un alto nivel de expresión de mIL-12.
Por otro lado, se infectaron 4 líneas celulares de HCC (Hep3B, Huh-7, HepG2 y PLC/PRF/5) con vectores híbridos de LacZ - AFP-lacZ, o AFP-SFV-lacZ - a diferentes "mois" (10, 100, ó 1000), y se determinó la expresión 35 específica de -gal. Datos similares se observaron también en este caso, cuyos resultados se muestran en la Figura 4.
En la Figura 5 se muestran microfotografías de células de HCC infectadas con los vectores vacíos adenovirales de AFP-lacZ y AFP-SFV-lacZ, seguidas de tinción con X-gal. La infección de células de HCC con AFP-lacZ dio como resultado un bajo nivel de expresión en las células infectadas, las cuales mostraron una tinción débil. En contraste, la infección de células HCC con AFP-SFV-lacZ produjo un alto nivel de expresión de -gal que se tradujo en una fuerte 40 tinción con X-gal. Este dato indica que un vector híbrido Ad-SFV que lleva un replicón SFV bajo el control del promotor AFP, puede dar lugar en alto grado a una fuerte expresión transgénica en células tumorales que expresan AFP.
Cinética de la expresión de mIL-12 en células de HCC in vitro
Para estudiar la producción de mIL-12 a diferentes tiempos tras la infección con los vectores híbridos de Ad-SFV, 2 líneas celulares de HCC (Hep3B y Huh-7) fueron infectadas con AFP-mIL-12 o con AFP-SFV-mIL-12, y los 45 sobrenadantes fueron recogidos diariamente hasta 5 días después de la infección. La Figura 6 muestra los resultados obtenidos para la expresión transgénica tras la infección de las células mencionadas. Dichos resultados muestran que hay un aumento constante de la expresión de mIL-12 del día 1 al día 4 post-infección en células infectadas con AFP-SFV-mIL-12 (Figura 6). Sin embargo en el día 5 después de la infección el nivel de mIL-12 se redujo ligeramente. En las células infectadas con AFP-mIL-12, los niveles de expresión fueron muy bajos y sólo se observó un ligero aumento de la 50 producción de mIL-12 a lo largo del tiempo.
Ensayo de citotoxicidad - ensayo de proliferación celular mediante incorporación de MTT.
Células de HCC (Hep3B, Huh7, MCH-RH7777, Hep1-6) fueron infectadas con AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ, AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o Ad/CMV-mIL-12 a "moi" 1000. Cinco días después de la infección, se determinó la supervivencia celular mediante un ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazolio) Mosmann, T. 55 (1983) J. Immunol. Meth. 65, 55-63; Tada, H. et al. (1986) J. Immunol. Meth. 93, 157-65. Brevemente, las células se
lavaron una vez con PBS, y se añadieron por cada pocillo 200 µl de solución de colorante MTT recién preparada (en bandejas de 48-pocillos). Las células fueron crecidas adicionalmente durante 3-4 horas, seguido de la adición de 500 µl de tampón de solubilización. Se tomaron 100 µl de cada muestra para la medida en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm.
Inducción de muerte celular después de infección de células HCC con vectores híbridos Ad-SFV in vitro 5
Se ha descrito que la replicación de vectores SFV induce la muerte celular mediada por apoptosis en la mayoría de las células de origen vertebrado. Para analizar si también es este el caso de células HCC infectadas con vectores híbridos de Ad-SFV, se infectaron células Hep3B y Huh-7 con estos vectores y se determinó la supervivencia celular en el día 5 después de la infección. Como se muestra en la Figura 7, la supervivencia a este tiempo postinfección fue menor del 20% en células infectadas con AFP-SFV-mIL-12, o con AFP-SFV-lacZ. Sin embargo, la infección de las 10 mismas células con AFP-mIL-12, o AFP-lacZ, o con el vector control AdCMVmIL-12, no afectó a la supervivencia de las células. Estos resultados indican que hay replicación de SFV en células infectadas con vectores AFP-SFV.
Detección de SFV Rep mediante inmunofluorescencia
Células de HCC (Hep3B, Huh7, MCH-RH7777) fueron sembradas sobre cubreobjetos de vidrio, en bandejas de 6- pocillos (1x105 células/pocillo), e infectadas con AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o Ad/CMV-mIL-12 a "moi" 1000. Dos 15 días después de la infección las placas fueron lavadas dos veces con PBS, y las células fueron fijadas con metanol a –20°C durante 6 min. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces con PBS y se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 30 min con PBS que contenía 0.5% gelatina y 0.25% BSA para bloquear las uniones no específicas. A continuación el tampón bloqueante fue reemplazado por el anticuerpo primario (MAb anti-replicasa) diluido 1:10 en tampón bloqueante, y fue incubado a RT durante 30 min. Las células fueron lavadas de nuevo 3 veces con PBS-0.25% 20 BSA, e incubadas durante 30 minutos a RT con el anticuerpo secundario (suero de conejo antiratón conjugado con FITC, Sigma) diluido 1:250 en tampón bloqueante. Finalmente, las células fueron lavadas 3 veces con PBS-0.25%BSA, una vez con agua, y dispuestas sobre portaobjetos de vidrio usando medio de montaje Vecta-Shield con Dapi para teñir los núcleos celulares.
Expresión de SFV Rep en células de HCC infectadas con vectores híbridos Ad-SFV in vitro 25
La expresión de SFV Rep fue examinada en células de HCC infectadas con vectores híbridos Ad-SFV mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal específico para esta proteína. La Figura 8 muestra que las células HCC infectadas con AFP-SFV-mIL-12 o AFP-SFV-lacZ mostraron una fuerte tinción citoplásmica para Rep. Las células infectadas con AFP-mIL-12 o AFP-lacZ no mostraron ninguna tinción.
Experimentos in vivo 30
Inducción de xeno-injertos de HCC y estudio de la eficacia y especificidad de la transferencia génica in vivo.
Células Huh7 fueron recogidas y lavadas dos veces con un medio exento de suero. 2 x 106 células fueron resuspendidas en 100 µl de suero salino e inyectadas subcutáneamente (s.c.) en el flanco derecho de ratones inmunodeficientes Balb/c ("nude") . Cuatro semanas después de la inoculación de las células, y cuando los nódulos tumorales alcanzaron 6-8 mm de diámetro, se inyectaron intratumoralmente 1x1010 partículas virales de AFP-LacZ (n=4) 35 o de AFP-SFV-LacZ (n=4) diluidos en 80 µl de suero salino. Los animales control (n=3) fueron inyectados intratumoralmente con 80 µl de suero salino. Los ratones fueron sacrificados a día 3 ó 6 después de la inoculación En ese momento se extrajeron los tumores y el hígado de cada animal, se sumergieron en O.C.T. (Sakura, Holand), y se congelaron a -80°C. Los tejidos congelados fueron cortados y colocados en portaobjetos de vidrio para ser teñidos con X-gal o analizados por TUNEL. Para estudiar la especificidad de la infección con el vector híbrido in vivo se inyectaron 40 por vía intravenosa ratones Balb/c normales con AFP-LacZ (n=4), AFP-SFV-LacZ (n=4) o Ad/CMV-LacZ a razón de 1010 partículas virales/ratón. Al tercer día tras la inoculación se sacrificaron los animales y se recogieron los órganos principales para analizar la expresión de LacZ mediante tinción con X-gal.
Eficacia de la transferencia génica de los vectores híbridos Ad-SFV en xeno-injertos HCC humanos en ratones inmunodeficientes "nude". 45
Para estudiar la eficacia de la transducción de vectores híbridos vacíos in vivo, se usó un modelo de HCC humano basado en células Huh7 que pueden expresar AFP. Las células Huh7 fueron inoculadas subcutáneamente en ratones inmunodeficientes "nude" Balb/c, y tras la generación de nódulos tumorales a los 30 días, los animales fueron inyectados intratumoralmente con 1x1010 partículas virales de AFP-SFV-LacZ o AFP-LacZ como control. Los ratones fueron sacrificados 3 ó 6 días después de la inyección del virus, y tanto el tumor como el hígado se recogieron y se 50 analizaron por tinción con X-gal. Como se muestra en la Figura 9A, hay una débil expresión transgénica en secciones de tumores de animales que han recibido AFP-lacZ. En contraste, hay una fuerte expresión de LacZ en secciones de tumores de animales que habían recibido AFP-AFV-LacZ (Figura 9B). No se observó expresión transgénica en secciones de hígado de animales que recibieron o bien AFP-lacZ o AFP-AFV-lacZ, indicando que los vectores probablemente quedaron confinados en el sitio de inoculación (datos no mostrados). Con objeto de estudiar si los 55 vectores híbridos Ad-SFV inducen apoptosis en las células tumorales infectadas se analizaron secciones de los tumores tratados mediante la técnica de TUNEL. No se observó apoptosis en las muestras procedentes de ratones inoculados
con AFP-LacZ (Figura 9C). Sin embargo se observó una abundante cantidad de células apoptóticas en los tumores de los animales que habían recibido AFP-SFV-LacZ (Figura 9D). Estos datos indican que los vectores híbridos de Ad-SFV no sólo inducen expresión génica de forma específica en tumores sino que además inducen muerte celular selectiva por apoptosis en estas mismas células.
Especificidad de los vectores híbridos Ad-SFV in vivo. 5
Para demostrar la especificidad de los vectores híbridos, se administraron 1010 partículas virales de AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ o del vector control Ad/CMV-LacZ por vía intravenosa en ratones Balb/c. Tres días tras la administración de los vectores se analizó la expresión de -galactosidasa en hígado. Como se muestra en la Figura 9 (E-F) ni AFP-LacZ ni AFP-SFV-LacZ fueron capaces de inducir expresión detectable del transgén en el hígado. Sin embargo en aquellos animales que recibieron Ad/CMV-LacZ se observó una alta proporción de células positivas para -10 galactosidasa en secciones del tejido hepático (Figura 9G). Estos datos confirman que la expresión mediada por los vectores híbridos es específica de células del tumor.
Inducción de HCC ortotópico y terapia génica in vivo.
5 x 105 células McA-RH7777 fueron inoculadas en el lóbulo izquierdo del hígado de ratas Buffalo. 10 días después de la inoculación de las células tumorales se observó la aparición de un único nódulo de tumor de 7-10 mm de 15 diámetro en cada animal. Los tumores fueron tratados con 1011 ó 2x1011 partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o con suero salino como control. Dos y 4 semanas después del tratamiento, los animales fueron anestesiados y sometidos a laparotomía para observar la evolución del tumor. Asimismo se analizó la supervivencia de los animales. El tamaño de los tumores de determinó mediante la medida de la longitud y anchura de cada nódulo y aplicando la fórmula: Volumen de tumor = (longitud en mm) X (anchura en mm) 2 X 0.5236 (Janik et al., 1975). 20
Eficacia del tratamiento en HCC ortotópico en ratas Buffalo
Para investigar la eficacia antitumoral del vector híbrido de Ad-SFV que lleva interleucina-12, tumores de HCCs ortotópicos fueron establecidos en ratas mediante la implantación de células McH-RH7777 de rata en el hígado. Este modelo fue elegido porque se ha demostrado que las células McH-RH7777 expresan AFP. En un primer experimento los animales fueron tratados con una única inyección intratumoral de 1x1011 partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-25 mIL-12, o con suero salino como control (Figura 10A-C). Los animales que recibieron AFP-mIL-12 mostraron un tamaño de tumor reducido comparado con los animales control, que sufrieron una aumento constante del tamaño del tumor a lo largo del experimento (Figura 10A-B). Sin embargo, el tratamiento con AFP-SFV-mIL-12 dio como resultado una regresión completa del tumor en 1 de 4 ratas tratadas, estabilización de la enfermedad en 2, y ausencia de respuesta en 1 animal (Figura 10C). Con objeto de comprobar si dosis mayores del vector híbrido podían aumentar el efecto 30 antitumoral se ha realizado un segundo experimento en el que los animales han sido tratados intratumoralmente con una dosis de 2 x 1011 partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o con suero salino como control (Figura 10 D-G). Al igual que en el experimento anterior los animales que recibieron el vector AFP/IL-12 experimentaron una ligera respuesta antitumoral que se tradujo en una única remisión completa, 4 animales con tumores con crecimiento más lento que los controles y 7 animales en los que no hubo respuesta, de un total de 12 animales tratados (Figura 10E). Sin 35 embargo, el tratamiento con el vector AFP/SFV-IL-12 tuvo un efecto mucho más potente, induciendose regresión tumoral completa en 4 animales (33%), regresión tumoral parcial en 6 animales (50%), retraso en el crecimiento tumoral en 2 animales (16%) y ausencia total de respuesta en otros 2 animales (16%) de un total de 12 animales tratados (Figura 10F). En este segundo estudio el vector AFP/SFV-IL-12 permitió la supervivencia del 50% de los animales tratados, frente a un 0% de supervivencia en los animales tratados con AFP-IL-12o con suero salino (Figura 10G). 40
Estudio de toxicidad in vivo: determinación de niveles de transaminasas e Il-12 en suero, y estudios histológicos en hígado
Se tomaron muestras de sangre de las ratas tratadas intratumoralemente con los vectores adenovirales AFP-SFV-IL-12 o AFP-IL-12 a dosis de 2 x 1011, o con suero salino, a los 4 y 8 días postinoculación. También se incluyeron en este estudio ratas inoculadas con 108 partículas del alfavirus SFV-IL-12. Se separó el suero de la sangre mediante 45 centrifugación a 2000 rpm durante 15 minutos. La determinación de los niveles de transaminasas se hizo mediante un analizador automático Hitachi 911 Automatic Analyzer (Boehringer Mannheim, Alemania). Los niveles de IL-12 se determinaron mediante ELISA. El estudio histológico se realizó mediante la extracción del hígado en los animales inoculados tres días tras el tratamiento. Se fijó el órgano en formol, se procesó incluyéndolo en parafina y se realizaron cortes de 6 micras con un microtomo. Estos cortes se tiñeron con hematoxilina/eosina. 50
Estudio de la toxicidad de los vectores híbridos de Ad-SFV en rata
Para evaluar la toxicidad asociada con la administración del vector híbrido de AFP-SFV-IL-12 se determinaron los niveles de transaminasas (GOT, GPT y GGTL) en el suero de las ratas tratadas por vía intratumoral con 2 x 1011 partículas virales de los diferentes vectores (ver apartado anterior). En este estudio se incluyó además un grupo de ratas inoculadas también intratumoralmente con 108 partículas virales del vector alfaviral SFV-IL-12 (Figura 11A). Las ratas 55 que habían sido inoculadas con los vectores adenovirales de AFP-SFV-IL-12 o de AFP-IL-12 mostraron niveles de transaminasas muy bajos, que eran muy similares a los de los animales control que habían sido inoculados con suero salino. Sin embargo, los niveles de transaminasas en los animales tratados con las partículas de SFV-IL-12 fueron
significativamente más altos que en los otros grupos (p<0.05). En este estudio también se determinó el nivel de IL-12 presente en el suero de los animales a los mismos tiempos. No se detectó IL-12 en el suero de los animales que habían sido inoculados con los vectores de Ad AFP-SFV-IL-12 o AFP-IL-12 o con suero salino (Figura 11B), indicando que la expresión del transgén en estos vectores está restringida a los tumores y sugiriendo que la toxicidad del vector híbrido de Ad-SFV es muy baja. El tratamiento con las partículas virales de SFV-IL-12, sin embargo, indujo altos niveles séricos 5 de IL-12 a tiempos cortos, lo cual podría producir toxicidad hepática. Finalmente, el estudio de toxicidad se completó con un análisis histológico de secciones hepáticas teñidas con hematoxilina/eosina procedentes de ratas tratadas intratumoralmente con los mismos vectores y a las mismas dosis ya descritas (Figura 12). Este estudio mostró que no había diferencias histológicas entre las ratas que recibieron suero salino y aquellas que recibieron los vectores adenovirales de AFP-SFV-IL-12 o de AFP-IL-12. Sin embargo en secciones hepáticas de ratas tratadas con las 10 partículas virales de SFV-IL-12 si se observaron zonas con hepatocitos eosinófilos así como fusiones de estos hepatocitos, indicando un cierto grado de toxicidad (flechas negras, Figura 12D).
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Proyecto de Biomedicina CIMA S.L.
<120> UN VECTOR HÍBRIDO ADENOVIRUS-ALFAVIRUS PARA LA ADMINISTRACIÓN 15
EFICAZ Y EXPRESIÓN DE GENES TERAPÉUTICOS EN CÉLULAS TUMORALES
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 438 20
<212> DNA
<213> Adenovirus
<400> 1
aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60
agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120 25
tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180
ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240
tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc 360
ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg 420 30
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<210> 2
<211> 161
<212> DNA
<213> Adenovirus 35
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<212> DNA
<213> Virus Semliki Forest (SFV)
<400> 3
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<213> Virus Semliki Forest (SFV)
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taccaacata cgcggttcgg tacccccgcc ccgtgtactc ccctaccgtg atcgaaagat 5880
tctcaagccc cgatgtagca atcgcagcgt gcaacgaata cctatccaga aattacccaa 5940 15
cagtggcgtc gtaccagata acagatgaat acgacgcata cttggacatg gttgacgggt 6000
cggatagttg cttggacaga gcgacattct gcccggcgaa gctccggtgc tacccgaaac 6060
atcatgcgta ccaccagccg actgtacgca gtgccgtccc gtcacccttt cagaacacac 6120
tacagaacgt gctagcggcc gccaccaaga gaaactgcaa cgtcacgcaa atgcgagaac 6180
tacccaccat ggactcggca gtgttcaacg tggagtgctt caagcgctat gcctgctccg 6240 20
gagaatattg ggaagaatat gctaaacaac ctatccggat aaccactgag aacatcacta 6300
cctatgtgac caaattgaaa ggcccgaaag ctgctgcctt gttcgctaag acccacaact 6360
tggttccgct gcaggaggtt cccatggaca gattcacggt cgacatgaaa cgagatgtca 6420
aagtcactcc agggacgaaa cacacagagg aaagacccaa agtccaggta attcaagcag 6480
cggagccatt ggcgaccgct tacctgtgcg gcatccacag ggaattagta aggagactaa 6540 25
atgctgtgtt acgccctaac gtgcacacat tgtttgatat gtcggccgaa gactttgacg 6600
cgatcatcgc ctctcacttc cacccaggag acccggttct agagacggac attgcatcat 6660
tcgacaaaag ccaggacgac tccttggctc ttacaggttt aatgatcctc gaagatctag 6720
gggtggatca gtacctgctg gacttgatcg aggcagcctt tggggaaata tccagctgtc 6780
acctaccaac tggcacgcgc ttcaagttcg gagctatgat gaaatcgggc atgtttctga 6840 30
ctttgtttat taacactgtt ttgaacatca ccatagcaag cagggtactg gagcagagac 6900
tcactgactc cgcctgtgcg gccttcatcg gcgacgacaa catcgttcac ggagtgatct 6960
ccgacaagct gatggcggag aggtgcgcgt cgtgggtcaa catggaggtg aagatcattg 7020
acgctgtcat gggcgaaaaa cccccatatt tttgtggggg attcatagtt tttgacagcg 7080
tcacacagac cgcctgccgt gtttcagacc cacttaagcg cctgttcaag ttgggtaagc 7140 35
cgctaacagc tgaagacaag caggacgaag acaggcgacg agcactgagt gacgaggtta 7200
gcaagtggtt ccggacaggc ttgggggccg aactggaggt ggcactaaca tctaggtatg 7260
ggtagaggg ctgcaaaagt atcctcatag ccatggccac cttggcgagg gacattaagg 7320
cgtttaagaa attgagagga cctgttatac acctctacgg cggtcctaga ttggtgcgtt 7380
aatacacaga attctgatta tagcgcacta ttatagcacc atgaattaca tccctacgca 7440
aacgttttac ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc cgtccttggc cgttgcaggc 7500 5
cactccggtg gctcccgtcg t 7521
<210> 5
<211> 841
<212> DNA
<213> Virus Semliki Forest (SFV) 10
<400> 5
attacatccc tacgcaaacg ttttacggcc gccggtggcg cccgcgcccg gcggcccgtc 60
cttggccgtt gcaggccact ccggtggctc ccgtcgtccc cgacttccag gcccagcaga 120
tgcagcaact catcagcgcc gtaaatgcgc tgacaatgag acagaacgca attgctcctg 180
ctaggcctcc caaaccaaag aagaagaaga caaccaaacc aaagccgaaa acgcagccca 240 15
agaagatcaa cggaaaaacg cagcagcaaa agaagaaaga caagcaagcc gacaagaaga 300
agaagaaacc cggaaaaaga gaaagaatgt gcatgaagat tgaaaatgac tgtatcttcg 360
tatgcggcta gccacagtaa cgtagtgttt ccagacatgt cgggcaccgc actatcatgg 420
gtgcagaaaa tctcgggtgg tctgggggcc ttcgcaatcg gcgctatcct ggtgctggtt 480
gtggtcactt gcattgggct ccgcagataa gttagggtag gcaatggcat tgatatagca 540 20
agaaaattga aaacagaaaa agttagggta agcaatggca tataaccata actgtataac 600
ttgtaacaaa gcgcaacaag acctgcgcaa ttggccccgt ggtccgcctc acggaaactc 660
ggggcaactc atattgacac attaattggc aataattgga agcttacata agcttaattc 720
gacgaataat tggattttta ttttattttg caattggttt ttaatatttc caaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 25
a 841
<210> 6
<211> 260
<212> DNA
<213> Virus SV40 30
<400> 6
agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat gagtttggac 60
aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 120
ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 180
ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 240 35
aatgtggtaa aatcgataag 260
<210> 7
<211> 940
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7 5
aattcgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa attagttttg 60
aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt ggcttcacag 120
acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg ctgtgaactc 180
tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acacatagat tgaggattgt ttgctgttag 240
catacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt tgctgttctt 300 10
catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc tacaataact 360
gtctgcaagc ttatgattcc caaatatcta tctctagcct caatcttgtt ccagaagata 420
aaaagtagta ttcaaatgca catcaacgtc tccacttgga gggcttaaag acgtttcaac 480
atacaaaccg gggagttttg cctggaatgt ttcctaaaat gtgtcctgta gcacataggg 540
tcctcttgtt ccttaaaatc taattacttt tagcccagtg ctcatcccac ctatggggag 600 15
atgagagtga aaagggagcc tgattaataa ttacactaag tcaataggca tagagccagg 660
actgtttggg taaactggtc actttatctt aaactaaata tatccaaaac tgaacatgta 720
cttagttact aagtctttga ctttatctca ttcataccac tcagctttat ccaggccact 780
tatttgacag tctagctagc ccctagattt tctgccccaa agagctctgt gtccttgaac 840
ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa atgtcccatt ttcaacctaa 900 20
ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta 940
<210> 8
<211> 28892
<212> DNA
<213> Quimérico 25
<220>
<221> 5' ITR
<222> (1)..(438)
<223> Primera secuencia terminal invertida repetida y señal de
empaquetamiento 30
<220>
<221> Relleno
<222> (439)..(10990)
<223> Primera secuencia no codificante de relleno
<220> 35
<221> AFP(p+e)
<222> (10991)..(11930)
<223> Promotor de alfa feto proteína (AFP). Incluye la región del
promotor (p) y del potenciador (e)
<220>
<221> SFV 5
<222> (12257)..(19366)
<223> Región del replicón procedente del virus SFV
<220>
<221> mIL-12
<222> (19389)..(21722) 10
<223> Secuencia correspondiente al gen de la interleucina-12 (IL12) de
ratón (Gen exógeno)
<220>
<221> PoliA
<222> (22621)..(22880) 15
<223> Secuencia de poliadenilación derivada del virus SV40
<220>
<221> Relleno
<222> (22881)..(28731)
<223> Segunda secuencia no codificante de relleno 20
<220>
<221> 3' ITR
<222> (28732)..(28892)
<223> Segunda secuencia terminal invertida repetida
<400> 8 25
aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60
agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120
tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180
ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240
tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300 30
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc 360
ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg 420
ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta 480
attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg 540
tatgggcata aagggtttta atgggatagt gaaaatgtct ataataatac ttaaatggct 600 35
gcccaatcac ctacaggatt gatgtaaaca tggaaaaggt caaaaacttg ggtcactaaa 660
atagatgatt aatggagagg atgaggttga tagttaaatg tagataagtg gtcttattct 720
caataaaaat gtgaacataa ggcgagtttc tacaaagatg gacaggactc attcatgaaa 780
cagcaaaaac tggacatttg ttctaatctt tgaagagtat gaaaaattcc tattttaaag 840
gtaaaacagt aactcacagg aaataccaac ccaacataaa atcagaaaca atagtctaaa 900
gtaataaaaa tcaaacgttt gcacgatcaa attatgaatg aaattcacta ctaaaattca 960 5
cactgatttt gtttcatcca cagtgtcaat gttgtgatgc atttcaattg tgtgacacag 1020
gcagactgtg gatcaaaagt ggtttctggt gcgacttact ctcttgagta tacctgcagt 1080
cccctttctt aagtgtgtta aaaaaaaagg gggatttctt caattcgcca atactctagc 1140
tctccatgtg ctttctagga aacaagtgtt aacccacctt atttgtcaaa cctagctcca 1200
aaggactttt gactccccac aaaccgatgt agctcaagag agggtatctg tcaccagtat 1260 10
gtatagtgaa aaaagtatcc caagtcccaa cagcaattcc taaaaggagt ttatttaaaa 1320
aaccacacac acctgtaaaa taagtatata tcctccaagg tgactagttt taaaaaaaca 1380
gtattggctt tgatgtaaag tactagtgaa tatgttagaa aaatctcact gtaaccaagt 1440
gaaatgaaag caagtatggt ttgcagagat tcaaagaaaa tataagaaaa cctactgttg 1500
ccactaaaaa gaatcatata ttaaatatac tcacacaata gctcttcagt ctgataaaat 1560 15
ctacagtcat aggaatggat ctatcactat ttctattcag tgctttgatg taatccagca 1620
ggtcagcaaa gaatttatag ccccccttga gcacacagag ggctacaatg tgatggcctc 1680
ccatctcctt catcacatct cgagcaagac gttcagtcct acagaaataa aatcaggaat 1740
ttaatagaaa gtttcataca ttaaacttta taacaaacac ctcttagtca ttaaacttcc 1800
acaccaacct gggcaatata gtgagacccc atgcctgcaa aaaaaaaaaa attagccagg 1860 20
catggtagca tgtacctgta gtcccagcta cttgagaggt gaggtgggaa aatcacttta 1920
gtgcaggatg ttgaggctgg agtgaactgt gattgtgcca ctgcactcca gcctggacaa 1980
tagagcaaga ccttgtctca aaaaaatgca ttaaaaattt tttttaaatc ttccacgtat 2040
cacatccttt gccctcatgt ttcataaggt aaaaaatttg ataccttcaa aaaaaccaag 2100
cataccacta tcataatttt ttttaaatgc aaataaaaac aagataccat tttcacctat 2160 25
cagactggca ggttctgatt aaatgaaatt ttctggataa tatacaatat taagagagac 2220
tgtagaaact gggccagtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gctgggtaac 2280
atggcgaacc ctgtttctac aaaataaaaa tattagctgg gagtggtggc gcacacctat 2340
agtcccagct actcaggagg ctgaggtgga aggatcgctt gaacccagga ggttgagact 2400
gcagtgaact gtgatcattc tgctgcactg caccccagcc tgggcaacag agaccttgtc 2460 30
tcaaaaaaaa aaaaaaaaga gacaaattgt gaagagaaag gtactctcat ataacatcag 2520
gagtataaaa tgattcaact tcttagagga aaatttggca ataccaaaat attcaataaa 2580
ctctttcccc ttgacccaga aattccactt gaataaagct gaacaagtac caaacatgta 2640
aaagaatgtt tcttctagta cagtcggtaa gaacaaaata gtgtctatca atagtggact 2700
ggttaaatca gttatggtat ctccataaga cagaatgcta tgcaaccttt aaaatatatt 2760 35
agatagctct agacacacta atattaaaag tgtccaataa catttaaaac tatactcata 2820
cgttaaaata taaatgtata tatgtacttt tgcatatagt atacatgcat aggccagtgc 2880
ttgagaagaa atgtgtacag aaggctgaaa ggagagaact ttagtcttct tgtttatggc 2940
ctccatagtt agaatatttt ataacacaaa tattttgata ttataatttt aaaataaaaa 3000
cacagaatag ccagacatac aatgcaagca ttcaatacca ggtaaggttt ttcactgtaa 3060
ttgacttaac agaaaatttt caagctagat gtgcataata ataaaaatct gaccttgcct 3120 5
tcatgtgatt cagccccagt ccattaccct gtttaggact gagaaatgca agactctggc 3180
tagagttcct tcttccatct cccttcaatg tttactttgt tctggtccct acagagtccc 3240
actataccac aactgatact aagtaattag taaggccctc ctcttttatt tttaataaag 3300
aagattttag aaagcatcag ttatttaata agttggccta gtttatgttc aaatagcaag 3360
tactcagaac agctgctgat gtttgaaatt aacacaagaa aaagtaaaaa acctcatttt 3420 10
aagatcttac ttacctgtcc ataattagtc catgaggaat aaacaccctt tccaaatcct 3480
cagcataatg attaggtatg caaaataaat caaggtcata acctggttca tcatcactaa 3540
tctgaaaaag aaatatagct gtttcaatga gagcattaca ggatacaaac atttgattgg 3600
attaagatgt taaaaaataa ccttagtcta tcagagaaat ttaggtgtaa gatgatatta 3660
gtaactgtta actttgtagg tatgataatg aattatgtaa gaaaacaaca ggccgggcgg 3720 15
gttggttcac acgtgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcaggcaga ctgcctgagc 3780
tcaggagttc gagaccagcc tgggcaacac ggtgaaatcc cgtctctact aaaaatacaa 3840
aaaaattagc cgggtgtggt gacacatgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc 3900
aggagaatca cttgaacctg ggaggtgaag gttgcagtga gccaagatgg caccacttca 3960
ctccagcctg ggaaacagag caagactctg tctctgagct gagatggcac cacttcactc 4020 20
cagcctggga aacagagcaa gactctgtct caaaaaaaac aaaacacaca aacaaaaaaa 4080
caggctgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggtg 4140
gatcacctga ggtcaggagt tccagaccag ccttgtcaac atggtgaaac ctccccccgc 4200
cgtctctact aaaaatacaa aaattagcca ggcgtggtgg caggagcctg taatcccagc 4260
tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgtacccaga aggcagaggt tgcactgagc 4320 25
tgagatggca ccattgcact ccagcctggg ggacaagagc gagatttcgt ctttaaaaaa 4380
caaaaacaaa acaaaaaacc atgtaactat atgtcttagt catcttagtc aagaatgtag 4440
aagtaaagtg ataagatatg gaatttcctt taggtcacaa agagaaaaag aaaaatttta 4500
aagagctaag acaaacgcag caaaatcttt atatttaata atattctaaa catgggtgat 4560
gaacatacgg gtattcatta tactattctc tccacttttg agtatgtttg aaaatttagt 4620 30
aaaacaagtt ttaacacact gtagtctaac aagataaaat atcacactga acaggaaaaa 4680
ctggcatggt gtggtggctc acacttgtaa tcccagtgct ttgggaggct gagacaggag 4740
agttgcttga ggccaggagt tcaagaccga catggggaat gtagcaagac cccgtcccta 4800
caaaaaactt tgtaaaaatt tgccaggtat ggtggtgcat acctgtagtc ccagctactc 4860
gggaggcgga ggcagaagga atcacttgag cccaggagtt tgaggctgca gtgagctacg 4920 35
atcataccac agcactccag cgtggacaac agagtaagac cctatctcaa aaacaaaaca 4980
aaacaaaaca aacaaaaaaa accacaagaa aaactgctgg ctgatgcagc ggctcatgcc 5040
tgtaatccca gtattttggg aggcccaggt gggcgtatca cctgaggtca ggagttagag 5100
accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaat tagccaggca 5160
tgtggcacgc gcctgtagtc ccagttactg ggaggctgaa gcaggaggat cacctgagcc 5220
cgggaggtgg aggttgcagt gagccgagat cacaccactg cactccagcc tgggtgacac 5280 5
agcaataccc tacctcaaaa taaaaaagaa aaagaaaaga aaagttgctg tccccgctac 5340
cccaatccca aatccaaaca gcctctctca tctcacagta agggggaaaa atcacccaaa 5400
aaagctaagt gatcttttga aaacccaaac tcttagaagt ctaagattat tatagtcaac 5460
tcatgaagtg tcatcataaa agatactcta atattattta agtagaacca catattggtt 5520
gtcttggtat gtctagcccc tggcatacaa aatatttaat aacactgata tggtacctgt 5580 10
gatgtgaaaa tgtactatga gtacagcttt ataaatacta tatatgtacc tatatacaga 5640
aaaaaataca acaaaatcat aaaagcactt atctttgaaa gaggagttac agcaatttta 5700
tttagttctt tattgctttg ctatatattc taaatttttt tcaatgaata tatatcactt 5760
ttaaaaaaat tcaatggtct ttcttataaa ttatctttgg cagcatgcgt ttttatatat 5820
acatataaaa tgtatgggaa atttttaaag gatacattaa attaaagcaa aatatacaaa 5880 15
caaaaaatca gaatacaaaa agataaaaag attgggaagg gagggaggga gtaaggagga 5940
agggtgggtg ggtatagaga aatataccaa ataatggtaa gaagtggggt cttgacactt 6000
tctacacttt ttttaaataa aaaaaatttt tttctctctc tttttttttt ttagagacga 6060
agtctcgcta tgttgcccag gctggtcttg aactcctggg atcaagagat cctcctgcct 6120
cagcctccca aggtgcttgg attacaggtg tgagccacca cgcctggtca ctttctacac 6180 20
tttaatatat atattttttc attttcaatg tcatttttat tagttaattt ataataccca 6240
ttcaccatta tattcaaagt ctatttgaag aaataaacca gaaagaatga aatactctag 6300
ctcacatgct attcaatact aaattacctt tcaaatcaca ttcaagaagc tgatgattta 6360
agctttggcg gtttccaata aatattggtc aaaccataat taaatctcaa tatatcagtt 6420
agtacctatt gagcatctcc ttttacaacc taagcattgt attaggtgct taaatacaag 6480 25
cagcttgact tttaatacat ttaaaaatac atatttaaga cttaaaatct tatttatgga 6540
attcagttat attttgaggt ttccagtgct gagaaatttg aggtttgtgc tgtctttcag 6600
tccccaaagc tcagttctga gttctcagac tttggtggaa cttcatgtat tgtcaggttg 6660
gcccgtaata cctgtgggac aacttcagcc cctgtgcaca tggccaggag gctggttgca 6720
aacattttca ggtaggtgga ccaggacatg cccctggtca tggccaggtg gaggcatagt 6780 30
gctatacagc aggcagaagt caatattgat ttgtttttaa agaaacatgt actactttca 6840
taagcagaaa aaatttctat tcttggggga aaagattatg ccagatcctc taggattaaa 6900
tgctgatgca tctgctaaac cttcacatat cagaacatat ttactataga aagaatgaaa 6960
atgggacatt tgtgtgtcac ctatgtgaac attccaaaaa tattttacaa caactaagta 7020
ttttataaat tttatgaact gaaatttagt tcaagttcta ggaaaataca aaccttgcta 7080 35
gatattataa aaatgataca atatatattc atttcaggct catcagaata tatctgttat 7140
cacttgacaa gaatgaaaat gcaccatttt gtagtgcttt aaaatcagga agatccagag 7200
tactaaaaat gacttcttcc ttgaagctta ctcaccaact tcctcccagt tactcactgc 7260
ttctgccaca agcataaact aggacccagc cagaactccc ttgaaatata cacttgcaac 7320
gattactgca tctatcaaaa tggttcagtg cctggctaca ggttctgcag atcgactaag 7380
aatttgaaaa gtcttgttta tttcaaagga agcccatgtg aattctgccc agagttcatc 7440 5
ccagatatgc agtctaagaa tacagacaga tcagcagaga tgtattctaa aacaggaatt 7500
ctggcaatat aacaaattga tttccaatca aaacagattt acataccata cttatgtcaa 7560
gaagttgttt tgttttattg catcctagat tttatttttt tgatttatgg tttactttaa 7620
gcataaaaaa tttgtcaata caactcttcc caaaaggcat aaacaaaaat tcataaaact 7680
tgcatcactt gagatacttc aggtatgaat tcacaacttt gttacaactt actatatata 7740 10
tgcacacata tatatatatt tgggtatatt gggggggttc taatttaaga aatgcataat 7800
tggctataga cagacagttg tcagaacttg gcaatgggta cgtgcaggtt cattatacca 7860
agtctacttg tagttgttca aaatgtatca taatacaagg ccgggcgagg tcgtcacgcc 7920
tgtaatccca gcattttggg aggctaaggc aggaggattg cttgaggtca ggagtttgtg 7980
accagcctgg gcaacagagc aagaccctgt ctccaaaaag aaaaaaaata attttttaca 8040 15
aaataaaaac aaaatgtatc atcagacgaa attaaataag aggcaattca tttaaatgac 8100
aacttttccc agcttgacat ttaacaaaaa gtctaagtcc tcttaattca tatttaatga 8160
tcaaatatca aatactaatt tttttttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt 8220
cgcccaggct ggagtgcagt ggcgcgatcc tggctcactg caagctccgc ctcccgggtt 8280
cacgccattc tcctgcctca gcctcccgag tagctgggat tacagacatg cgccaccacg 8340 20
cccggctaat tttgtatttt tagtagagat ggggtttctc catgttggtc aggctggtct 8400
tgaatttccc acctcaggtg atctgcctgc ctcagcctca caaagcagta gctgggacta 8460
caggcaccca ccaccacact tggttaattc ttttgtattt tttttgtaaa gacgggattt 8520
caccatgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgatctcat gatccgcccg cctcagcctc 8580
ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccccgcccgg ccatcaaata ctaattctta 8640 25
aatggtaagg acccactatt cagaacctgt atccttatca ctaatatgca aatatttatt 8700
gaatacttac tatgtcatgc atactagaga gagttagata aatttgatac agctaccctc 8760
acagaactta cagtgtaata gatggcatga catgtacatg agtaactgtg aacagtgtta 8820
aattgctatt taaaaaaaaa gacggctggg cgctgtggct catgcctgta atcccagcac 8880
tttgggaggc caaggcaagt tgatcgctcg aggtcaagag ttcgagacca gcctggccaa 8940 30
cgtggtaaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaaaaaa attagccagg catggtggca 9000
caggcctgta atcccagcta ctagggaggc tgagacatgg agaactgctt gaatccagga 9060
ggcagaggtt acagtgagcc gagatcatac cactacactc cagcctgagt gacagagcga 9120
gactcctgtc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagatacagg ttaagtgtta tggtagttga 9180
agagagaact caaactctgt ctcagaagcc tcacttgcat gtggaccact gatatgaaat 9240 35
aatataaata ggtataattc aataaatagg aacttcagtt ttaatcatcc caaacaccaa 9300
aacttcctat caaacaggtc caataaactc aatctctata agagctagac agaaatctac 9360
ttggtggcct ataatcttat tagcccttac ttgtcccatc tgatattaat taaccccatc 9420
taatatggat tagttaacaa tccagtggct gctttgacag gaacagttgg agagagttgg 9480
ggattgcaac atattcaatt atacaaaaat gcattcagca tctaccttga ttaaggcagt 9540
gtgcaacaga atttgcagga gagtaaaaga atgattataa atttacaacc cttaaagagc 9600 5
tatagctggg cgtggtggct catgcctgta aatcccagca ctttgggagg ctgaggcggg 9660
tggatcacct gaggccagaa gttcaagacc agcctagcca acatggcgaa accctgtctc 9720
tacaaaaaat acaaaaatta gccgggtgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagttacttg 9780
ggaggccgag gcaggagaat cgcttgaacc taggaggtgg aggctgcagt gagccgagat 9840
tgtgccactg cactccactt cagcctgggc gacaagagca agactccgtc acaaaaaaaa 9900 10
aaaaaaaaaa aaagcttaaa atctagtggg aaaggcatat atacatacaa ctaactgtat 9960
agcataataa agctcataat ctgtaacaaa atctaattcg acaagcccag aaacttgtga 10020
tttaccaaaa acagttatat atacacaaaa agtaaaccta gaacccaaag ttacccagca 10080
ccaatgattc tctccctaag cagtatcaag tttaaagcag tgattacatt ctactgccta 10140
gattgtaaac tgagtaaagg agaccagcac ctttctgcta ctgaactagc acagccgtgt 10200 15
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attatttgtg acttggtgtt gcatgtggtt attatcaaca ccttctgaaa gaacaactac 10320
ctgctcaggc tgccataaca aaataccaca gactgagtga cttaacagaa acttatttct 10380
cacagttttg gaggctggga agtccaaaat taaggtacct gcaaggtagg tttcaatctc 10440
aggcctcttc tttggcttga aggtcttcta actgtgtgct cacatgacct cttctaacaa 10500 20
gctctctggt gtctcttttt tttttttttt cttttttgag acagagtctc actctgtcac 10560
ccaggctgga gtacagtggc acaatctggg ctcactgcaa cctccaactc ccgggttcaa 10620
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agctaatttt tgtattttta gtagagatgg tgtttcacta cattggccag gctggtctca 10740
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agccactgcg cccgtcctgg tgtcttttca tataagggca ctaatccaat cagacctggg 10860
cccggcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg 10920
gccgctctag aactagtgga tcgggcccga gctctcgcga ccgggctgca ggaattcgat 10980
cgcgtgctag aattcgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa 11040
attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt 11100 30
ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg 11160
ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acacatagat tgaggattgt 11220
ttgctgttag catacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt 11280
tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc 11340
tacaataact gtctgcaagc ttatgattcc caaatatcta tctctagcct caatcttgtt 11400 35
ccagaagata aaaagtagta ttcaaatgca catcaacgtc tccacttgga gggcttaaag 11460
acgtttcaac atacaaaccg gggagttttg cctggaatgt ttcctaaaat gtgtcctgta 11520
gcacataggg tcctcttgtt ccttaaaatc taattacttt tagcccagtg ctcatcccac 11580
ctatggggag atgagagtga aaagggagcc tgattaataa ttacactaag tcaataggca 11640
tagagccagg actgtttggg taaactggtc actttatctt aaactaaata tatccaaaac 11700
tgaacatgta cttagttact aagtctttga ctttatctca ttcataccac tcagctttat 11760 5
ccaggccact tatttgacag tctagctagc ccctagattt tctgccccaa agagctctgt 11820
gtccttgaac ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa atgtcccatt 11880
ttcaacctaa ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta ctagttaaca 11940
ggcattgcct gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat tttccatggc ggatgtgtga 12000
catacacgac gccaaaagat tttgttccag ctcctgccac ctccgctacg cgagagatta 12060 10
accacccacg atggccgcca aagtgcatgt tgatattgag gctgacagcc cattcatcaa 12120
gtctttgcag aaggcatttc cgtcgttcga ggtggagtca ttgcaggtca caccaaatga 12180
ccatgcaaat gccagagcat tttcgcacct ggctaccaaa ttgatcgagc aggagactga 12240
caaagacaca ctcatcttgg atatcggcag tgcgccttcc aggagaatga tgtctacgca 12300
caaataccac tgcgtatgcc ctatgcgcag cgcagaagac cccgaaaggc tcgtatgcta 12360 15
cgcaaagaaa ctggcagcgg cctccgggaa ggtgctggat agagagatcg caggaaaaat 12420
caccgacctg cagaccgtca tggctacgcc agacgctgaa tctcctacct tttgcctgca 12480
tacagacgtc acgtgtcgta cggcagccga agtggccgta taccaggacg tgtatgctgt 12540
acatgcacca acatcgctgt accatcaggc gatgaaaggt gtcagaacgg cgtattggat 12600
tgggtttgac accaccccgt ttatgtttga cgcgctagca ggcgcgtatc caacctacgc 12660 20
cacaaactgg gccgacgagc aggtgttaca ggccaggaac ataggactgt gtgcagcatc 12720
cttgactgag ggaagactcg gcaaactgtc cattctccgc aagaagcaat tgaaaccttg 12780
cgacacagtc atgttctcgg taggatctac attgtacact gagagcagaa agctactgag 12840
gagctggcac ttaccctccg tattccacct gaaaggtaaa caatccttta cctgtaggtg 12900
cgataccatc gtatcatgtg aagggtacgt agttaagaaa atcactatgt gccccggcct 12960 25
gtacggtaaa acggtagggt acgccgtgac gtatcacgcg gagggattcc tagtgtgcaa 13020
gaccacagac actgtcaaag gagaaagagt ctcattccct gtatgcacct acgtcccctc 13080
aaccatctgt gatcaaatga ctggcatact agcgaccgac gtcacaccgg aggacgcaca 13140
gaagttgtta gtgggattga atcagaggat agttgtgaac ggaagaacac agcgaaacac 13200
taacacgatg aagaactatc tgcttccgat tgtggccgtc gcatttagca agtgggcgag 13260 30
ggaatacaag gcagaccttg atgatgaaaa acctctgggt gtccgagaga ggtcacttac 13320
ttgctgctgc ttgtgggcat ttaaaacgag gaagatgcac accatgtaca agaaaccaga 13380
cacccagaca atagtgaagg tgccttcaga gtttaactcg ttcgtcatcc cgagcctatg 13440
gtctacaggc ctcgcaatcc cagtcagatc acgcattaag atgcttttgg ccaagaagac 13500
caagcgagag ttaatacctg ttctcgacgc gtcgtcagcc agggatgctg aacaagagga 13560 35
gaaggagagg ttggaggccg agctgactag agaagcctta ccacccctcg tccccatcgc 13620
gccggcggag acgggagtcg tcgacgtcga cgttgaagaa ctagagtatc acgcaggtgc 13680
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actaggaaat tacgtagttc tgtccccgca gaccgtgctc aagagctcca agttggcccc 13800
cgtgcaccct ctagcagagc aggtgaaaat aataacacat aacgggaggg ccggcggtta 13860
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cgagaaagtc agagctgaaa gaactgacgc cgagtacgtg ttcgacgtag ataaaaaatg 14100
ctgcgtcaag agagaggaag cgtcgggttt ggtgttggtg ggagagctaa ccaacccccc 14160
gttccatgaa ttcgcctacg aagggctgaa gatcaggccg tcggcaccat ataagactac 14220 10
agtagtagga gtctttgggg ttccgggatc aggcaagtct gctattatta agagcctcgt 14280
gaccaaacac gatctggtca ccagcggcaa gaaggagaac tgccaggaaa tagttaacga 14340
cgtgaagaag caccgcggga aggggacaag tagggaaaac agtgactcca tcctgctaaa 14400
cgggtgtcgt cgtgccgtgg acatcctata tgtggacgag gctttcgctt gccattccgg 14460
tactctgctg gccctaattg ctcttgttaa acctcggagc aaagtggtgt tatgcggaga 14520 15
ccccaagcaa tgcggattct tcaatatgat gcagcttaag gtgaacttca accacaacat 14580
ctgcactgaa gtatgtcata aaagtatatc cagacgttgc acgcgtccag tcacggccat 14640
cgtgtctacg ttgcactacg gaggcaagat gcgcacgacc aacccgtgca acaaacccat 14700
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tcccttgtat gcccctgcgt cggagcacgt gaatgtactg ctgacgcgca ctgaggatag 14940
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gggtaacttt acggccacat tggaagaatg gcaagaagaa cacgacaaaa taatgaaggt 15060
gattgaagga ccggctgcgc ctgtggacgc gttccagaac aaagcgaacg tgtgttgggc 15120 25
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caccataatt acagcattta aggaggacag agcttactct ccagtggtgg ccttgaatga 15240
aatttgcacc aagtactatg gagttgacct ggacagtggc ctgttttctg ccccgaaggt 15300
gtccctgtat tacgagaaca accactggga taacagacct ggtggaagga tgtatggatt 15360
caatgccgca acagctgcca ggctggaagc tagacatacc ttcctgaagg ggcagtggca 15420 30
tacgggcaag caggcagtta tcgcagaaag aaaaatccaa ccgctttctg tgctggacaa 15480
tgtaattcct atcaaccgca ggctgccgca cgccctggtg gctgagtaca agacggttaa 15540
aggcagtagg gttgagtggc tggtcaataa agtaagaggg taccacgtcc tgctggtgag 15600
tgagtacaac ctggctttgc ctcgacgcag ggtcacttgg ttgtcaccgc tgaatgtcac 15660
aggcgccgat aggtgctacg acctaagttt aggactgccg gctgacgccg gcaggttcga 15720 35
cttggtcttt gtgaacattc acacggaatt cagaatccac cactaccagc agtgtgtcga 15780
ccacgccatg aagctgcaga tgcttggggg agatgcgcta cgactgctaa aacccggcgg 15840
catcttgatg agagcttacg gatacgccga taaaatcagc gaagccgttg tttcctcctt 15900
aagcagaaag ttctcgtctg caagagtgtt gcgcccggat tgtgtcacca gcaatacaga 15960
agtgttcttg ctgttctcca actttgacaa cggaaagaga ccctctacgc tacaccagat 16020
gaataccaag ctgagtgccg tgtatgccgg agaagccatg cacacggccg ggtgtgcacc 16080 5
atcctacaga gttaagagag cagacatagc cacgtgcaca gaagcggctg tggttaacgc 16140
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gtcagccttt aagggagcag caacaccagt gggcacaatt aaaacagtca tgtgcggctc 16260
gtaccccgtc atccacgctg tagcgcctaa tttctctgcc acgactgaag cggaagggga 16320
ccgcgaattg gccgctgtct accgggcagt ggccgccgaa gtaaacagac tgtcactgag 16380 10
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ggagttgctc aatgatgacg tggagctgac cacagacttg gtgagagtgc acccggacag 16620
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aggtacgaaa ttcaaccagg ctgctattga tatggcagag atactgacgt tgtggcccag 16740
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cagatccaaa tgtccggtga acgattccga ttcatcaaca cctcccagga cagtgccctg 16860
cctgtgccgc tacgcaatga cagcagaacg gatcgcccgc cttaggtcac accaagttaa 16920
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gtgtgacatc gactcgatct acgagccaat ggctcccata gtagtgacgg ctgacgtaca 17220
ccctgaaccc gcaggcatcg cggacctggc ggcagatgtg caccctgaac ccgcagacca 17280 25
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atatattttc tcctcggaca ctggcagcgg acatttacaa caaaaatccg ttaggcagca 17580 30
caatctccag tgcgcacaac tggatgcggt ccaggaggag aaaatgtacc cgccaaaatt 17640
ggatactgag agggagaagc tgttgctgct gaaaatgcag atgcacccat cggaggctaa 17700
taagagtcga taccagtctc gcaaagtgga gaacatgaaa gccacggtgg tggacaggct 17760
cacatcgggg gccagattgt acacgggagc ggacgtaggc cgcataccaa catacgcggt 17820
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cagagcgaca ttctgcccgg cgaagctccg gtgctacccg aaacatcatg cgtaccacca 18060
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ggccgccacc aagagaaact gcaacgtcac gcaaatgcga gaactaccca ccatggactc 18180
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atatgctaaa caacctatcc ggataaccac tgagaacatc actacctatg tgaccaaatt 18300
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ggttcccatg gacagattca cggtcgacat gaaacgagat gtcaaagtca ctccagggac 18420
gaaacacaca gaggaaagac ccaaagtcca ggtaattcaa gcagcggagc cattggcgac 18480
cgcttacctg tgcggcatcc acagggaatt agtaaggaga ctaaatgctg tgttacgccc 18540 10
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ggagaggtgc gcgtcgtggg tcaacatgga ggtgaagatc attgacgctg tcatgggcga 19020
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ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 22860 10
aatgtggtaa aatcgataag gatctcgacc tcgagggggg gcccggtacc caattcgccc 22920
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ctctggctgc ccagcaggct gaagctgggg ttgttggcca ggggcacttg tgttcccatc 23040
gcagcgggca cttgtgcctc ccaatcagat ggcctctgaa ggcaggcctg gccagaaggt 23100
gagtgctgct gaacgctatt atccacttgg ctgaggggtg ttttccccga aactgctgtg 23160 15
gtcacagctg ctgccgctgt gacccatgca gcattgttga acgcagtggg cattcttggc 23220
acactaggcc gtctgagctg gtggggactc aaggactggg tgcccaggga gctgggacag 23280
aacccaggca ggggcacttc tggtggggtg gccttggggc tctgcatatg ctggcagaca 23340
gagtcaagtc tgcccagggg agtctggcct gagtgtgaga ggatgggaca ctgggggctg 23400
gaggtgaaaa ttccttgccg cttccccaga gttggtgaga tcactcccat gccctcgcag 23460 20
ctctggtgcc tggtgagtgg gatcattcct ggactcagat tgttctgaag aagcccagtt 23520
ctgggtggca tcaagtgctt gctagatggg gggcttgcct tgatccggct acacttggag 23580
gtgacttgtt cttggacggc tacatacaga aagagagaag tggggatgag ttccaaaggc 23640
atcctcgact tcggctgtgg ccaccggagg gtagctcctg gcccaacacg gacttctcac 23700
ctcccgccct tggctctcta ctgagctccc ccctgctccc caattcctcg ccattcccct 23760 25
catttctctg ccctcagcct ggactgcagt tcttctggga agctgcccca actccctagg 23820
tctgtgctca ccaagagcag atcacactgg actgaaatgc cagctgattt gtctcttcaa 23880
gaaaattgga agctcctgga ggtcagggtc catgtctgct tttacactca gtgctctgta 23940
tgcaggcctg gcactgccca ccctttgaca ggtggtgcat attttgtaga aggaaggaag 24000
gggccaggtg gggtgggctg ggctggtggc gggagctagc tcagcctctt agattctcta 24060 30
cccgatggat gtgacctggg acagcaagtg agtgtggtga gtgagtgcag acggtgcttt 24120
gttcccctct tgtctcatag cctagatggc ctctgagccc agatctgggg ctcagacaac 24180
atttgttcaa ctgaacggta atgggtttcc tttctgaagg ctgaaatctg ggagctgaca 24240
ttctggactc cctgagttct gaagagcctg gggatggaga gacacggagc agaagatgga 24300
aggtagagtc ccaggtgcct aagatgggga atacatctcc cctcattgtc atgagagtcc 24360 35
actctagctg atatctactg tggccaatat ctaccggtac ttttttgggg tggacactga 24420
gtcatgcagc agtcttatgg tttacccaag gtcaggtagg ggagacagtg cagtcagagc 24480
acaagcccag tgtgtctgac ccacccaaga atccatgctc gtatctacaa aaatgatttt 24540
ttctcttgta atggtgccta ggttctttta ttatcatggc atgtgtatgt ttttcaacta 24600
ggttacaatc tggccttata aggttaacct cctggaggcc accagccttc ctgaaacttg 24660
tctgtgctgt ccctgcaact ggagtgtgcc tgatgtggca ctccagcctg gacaagtggg 24720 5
acacagactc cgctgttatc aggcccaaag atgtcttcca taagaccaga agagcaatgg 24780
tgtagaggtg tcatgggcta caataaagat gctgacctcc tgtctgaggg caagcagcct 24840
cttctggccc tcagacaaat gctgagtgtt cccaagacta ccctcggcct ggtccaatct 24900
catcccactg gtgcgtaagg gttgctgaac tcatgacttc ttggctagcc tgcaacctcc 24960
acggagtggg aactacatca ggcattttgc taactgctgt atcctaggcc aataaatgtt 25020 10
gatcacattt atagctgcca tggtagggtg gggacccctg ctatctatct gtggaggctc 25080
tgggagcccc tgacacaaac tttctgaagc agagcctccc caaccccttt tccattccct 25140
atacctgaca gatggcccag gaacccatta gaaatggaag gtcactgcag cagtatgtga 25200
atgtgcgtgt gggagaaggg caggatcaga gccctggggg tgtggcagcc cccaagtgat 25260
tctaatccag atcctagggt tgtttccctg tcccattgaa atagctgctt taaggggcct 25320 15
gactcaggga aatcagtctc ttgaattaag tggtgatttt ggagtcattt agaccaggcc 25380
ttcaattggg atcctgctct tagagttgga tgaattattt aactgatttt cagatctcct 25440
ctttctcaat gctttcagaa gcacagtaac tgcttactct gaaatgaatt ctcaccccac 25500
ttccacatat gcaccccttg cccacccctt tgggaacact ggccttaact gcttaccttc 25560
aaatggactc atctgttggg agatatatgc attctgccgt tcaggggtca ttgccataag 25620 20
acctgatctc tgttcctctt gctaaacaga agatgaaaaa gacaaattag attacagcta 25680
ccaattaata attagcctta ggatcgctgc gtggggacct aggacttggc tttggtgcag 25740
cagaaagcat gaataaacac accagcatac actcgcatgc atgccccacc ctctcgagca 25800
aaattccaca ggtataaata aagtaagatt ctgcacctgg gttaaaaaca caactgcaac 25860
agcatagaat ggggcaggag agacagaact taatagcaag agcacacaga aaaaagtttt 25920 25
aggcattttg gatgtccatc tgctcaggat gggtcagcag tgagatgcgg tcaccaaaag 25980
aacaaatgta acattaggct gcattaatag aagcagagta tgtagaagga gggaggtgac 26040
agtcctatgc taactctgcc ttggccagac tatacccaca ggagtctggg catgccagtc 26100
tcagggagac ccagacagac tggctgcatt cagaggatgg taagtaatga gagtggggat 26160
tggacttcaa actacccaga caaagaatgg ctgagcaagc caaggatgct gtggctgggg 26220 30
cagagcagac tgtgggctat gtagtggtgg atacctagcc tctgcagggc tgtcataggg 26280
aaaggacatt gagaagagga ctgaggcttg ttcctggtgg tcctggcatg aacggccaga 26340
tgatcacatg gtcaggtgga cacagtctcc aacactggga gtagccaaac acttactgcc 26400
aacctcccgc ccttctcctg actagttgca gcataggcaa ttgggaggag cttcctgtct 26460
ccatctgaaa gctggctggg tgggcagggg gaggagcgag ccaagtttca aggccgcagt 26520 35
ttcagcactc agtctgggat cggctcaagg agcaaagggg aagaacatag ccaggaggga 26580
ataacatgaa ggcccccaga cccagaaaag gcatgacttg ctctgagacc ctcagccggt 26640
tggtgtcagg ttgtgactcg gatccaggtc tgactcccag tccagtgctt gaagcctcac 26700
cccacacagt gaggggagcc cggccatctc tgctcaactg ctgccatctc tctccccttc 26760
tcaaccacca aggcagctct gtctgggagc acaagctcca agtccacttt ctggtctgtg 26820
tcccccccaa gatgccagag gacttgcctc tacaacacgg gctgcccgtg cagtgcctgc 26880 5
ttttccagca aagggcttct gggaaccctt ctctgcactc agtggggctg gtgggagtgg 26940
ggcggggtag cgacccagtg cttgggactg tgcccagctc tcaggcctgg cagcagttcc 27000
tggccttggt tcctgccaag gcagagagga caaacacatg gcaccgggaa gactacacca 27060
gaagcgattc caccagactg gggtttgctt ttctatcccg cccttagcct gcttcctgtc 27120
ctggtccctg cctccccctc cactggagct gccgtgtggg cagtgagggg ctgtttctca 27180 10
gctgccctat ggagctgccc tctccctgcc aaagcattgg caaggcggca aggggtgggg 27240
gtggggatgg ggggtgggat ctgccttctc aagctctcat tatactgagc acgtctcacc 27300
cattatttta tgtcatctag caacacccca tgtggacact gaggagcatg ggggtcacat 27360
gaccactgcc caaggccaca ccatccggat ctgcctgaga tggtcagggt tggcagccat 27420
ttctgaaggc agtcctttcg ctttggctct tcttgtacca gtctcaggac atcagggcag 27480 15
aagatctaca gtccccagct tactgatgtg acagcagagg ctcagagagg ttaaatgact 27540
tgcccaaggt gacacggcta agaagtacag tatctcctaa ctgcagacca ggtgcttctg 27600
ctgcttctgg ggacagattc ctgcgtggct ggctaggtct aaacggtcct taactccatc 27660
cccaccggtt gctgcattag tttcatcaaa taacacagtt gtacagaggt aggggttcag 27720
gggcaggggc agatggaggc tggagagtgt gactaaggaa acagcagggg aagtgcggta 27780 20
aagtccgaag ggagggacgg aaagagaaag ccaagcccag gggcgtgcca gacaaaagga 27840
aaggccacgc cggggcaggg caggcttcag cgggtgctgg ggcgtcttca tcccgggaag 27900
cacacattcc agaggacccc ggagtctaat ggaaaagctg gccagcctat cactatggaa 27960
actgccaagg ccacacagcg ctgctgacac ccagcctggg tgccggtggc cagctctgca 28020
ggatcttcaa gtctggggtg ccaccagcaa gcgacggtcc tccatgggct cttcacctta 28080 25
cggcagtgtc cagaggcacc gccagtcctc tgctcctatg ctggtcctgc tgtccctggc 28140
aaaaggagcc agagcattct ctccaggcct cccgaggagg ctgcttcctt tgttttgcag 28200
atggaggctc ccatcctttg ttctgaatca atgtgctcca aagataagcc ccaagaaaac 28260
agttgttgcc ttttgacact gacaattaga atcgttggaa aatggagaaa acaggaaatg 28320
gcaaatggtt tcagtgacca ggaggaaacc gtgcctgaaa gttgctgctt agtgactggg 28380 30
acactcgctt tctgctctct tatgaaggac agcctaggcc gtgtggcctt ttataaacaa 28440
agctatgaag gggtcgtcaa attttctagg gctgcaactg tggcactacg tcctgttgtg 28500
ccaggtgaca ctgacaagca gcactgagtt ctatgcaagc ccaggtgtgc ttctctcatg 28560
gtgaccccca gagaactaag gcccagctct tcctctgtca cacccctccc agcccccact 28620
gtcagacaag ggaccacatt cacagacagt ctcagccaag atggcaacct tggaagtcct 28680 35
ggggatgcct ttctagaagc tcgcgcccct aggggccggc cttaattaaa tcaagcttat 28740
cgataccgtc gagacctcga gggggggcat cactccgccc taaaacctac gtcacccgcc 28800
ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca 28860
atccaaaata aggtatatta ttgatgatgt tt 28892
<210> 9
<211> 29511 5
<212> DNA
<213> Quimérico
<220>
<221> 5' ITR
<222> (1)..(438) 10
<223> Primera secuencia terminal invertida repetida y señal de
empaquetamiento
<220>
<221> Relleno
<222> (439)..(10905) 15
<223> Primera secuencia no codificante de relleno
<220>
<221> AFP(p+e)
<222> (10906)..(11845)
<223> Promotor de alfa feto proteína (AFP). Incluye la región del 20
promotor (p) y del potenciador (e)
<220>
<221> SFV
<222> (12175)..(19281)
<223> Región del replicón procedente del virus SFV 25
<220>
<221> LacZ
<222> (19325)..(22397)
<223> Secuencia correspondiente al gen LacZ de Escherichia coli (Gen
exógeno como gen reportero) 30
<220>
<221> PoliA
<222> (23295)..(23554)
<223> Secuencia de poliadenilación derivada del virus SV40
<220> 35
<221> Relleno
<222> (23555)..(29350)
<223> Segunda secuencia no codificante de relleno
<220>
<221> 3' ITR
<222> (29351)..(29511) 5
<223> Segunda secuencia terminal invertida repetida
<400> 9
aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60
agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120
tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180 10
ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240
tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc 360
ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg 420
ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta 480 15
attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg 540
tatgggcata aagggtttta atgggatagt gaaaatgtct ataataatac ttaaatggct 600
gcccaatcac ctacaggatt gatgtaaaca tggaaaaggt caaaaacttg ggtcactaaa 660
atagatgatt aatggagagg atgaggttga tagttaaatg tagataagtg gtcttattct 720
caataaaaat gtgaacataa ggcgagtttc tacaaagatg gacaggactc attcatgaaa 780 20
cagcaaaaac tggacatttg ttctaatctt tgaagagtat gaaaaattcc tattttaaag 840
gtaaaacagt aactcacagg aaataccaac ccaacataaa atcagaaaca atagtctaaa 900
gtaataaaaa tcaaacgttt gcacgatcaa attatgaatg aaattcacta ctaaaattca 960
cactgatttt gtttcatcca cagtgtcaat gttgtgatgc atttcaattg tgtgacacag 1020
gcagactgtg gatcaaaagt ggtttctggt gcgacttact ctcttgagta tacctgcagt 1080 25
cccctttctt aagtgtgtta aaaaaaaagg gggatttctt caattcgcca atactctagc 1140
tctccatgtg ctttctagga aacaagtgtt aacccacctt atttgtcaaa cctagctcca 1200
aaggactttt gactccccac aaaccgatgt agctcaagag agggtatctg tcaccagtat 1260
gtatagtgaa aaaagtatcc caagtcccaa cagcaattcc taaaaggagt ttatttaaaa 1320
aaccacacac acctgtaaaa taagtatata tcctccaagg tgactagttt taaaaaaaca 1380 30
gtattggctt tgatgtaaag tactagtgaa tatgttagaa aaatctcact gtaaccaagt 1440
gaaatgaaag caagtatggt ttgcagagat tcaaagaaaa tataagaaaa cctactgttg 1500
ccactaaaaa gaatcatata ttaaatatac tcacacaata gctcttcagt ctgataaaat 1560
ctacagtcat aggaatggat ctatcactat ttctattcag tgctttgatg taatccagca 1620
ggtcagcaaa gaatttatag ccccccttga gcacacagag ggctacaatg tgatggcctc 1680 35
ccatctcctt catcacatct cgagcaagac gttcagtcct acagaaataa aatcaggaat 1740
ttaatagaaa gtttcataca ttaaacttta taacaaacac ctcttagtca ttaaacttcc 1800
acaccaacct gggcaatata gtgagacccc atgcctgcaa aaaaaaaaaa attagccagg 1860
catggtagca tgtacctgta gtcccagcta cttgagaggt gaggtgggaa aatcacttta 1920
gtgcaggatg ttgaggctgg agtgaactgt gattgtgcca ctgcactcca gcctggacaa 1980
tagagcaaga ccttgtctca aaaaaatgca ttaaaaattt tttttaaatc ttccacgtat 2040 5
cacatccttt gccctcatgt ttcataaggt aaaaaatttg ataccttcaa aaaaaccaag 2100
cataccacta tcataatttt ttttaaatgc aaataaaaac aagataccat tttcacctat 2160
cagactggca ggttctgatt aaatgaaatt ttctggataa tatacaatat taagagagac 2220
tgtagaaact gggccagtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gctgggtaac 2280
atggcgaacc ctgtttctac aaaataaaaa tattagctgg gagtggtggc gcacacctat 2340 10
agtcccagct actcaggagg ctgaggtgga aggatcgctt gaacccagga ggttgagact 2400
gcagtgaact gtgatcattc tgctgcactg caccccagcc tgggcaacag agaccttgtc 2460
tcaaaaaaaa aaaaaaaaga gacaaattgt gaagagaaag gtactctcat ataacatcag 2520
gagtataaaa tgattcaact tcttagagga aaatttggca ataccaaaat attcaataaa 2580
ctctttcccc ttgacccaga aattccactt gaataaagct gaacaagtac caaacatgta 2640 15
aaagaatgtt tcttctagta cagtcggtaa gaacaaaata gtgtctatca atagtggact 2700
ggttaaatca gttatggtat ctccataaga cagaatgcta tgcaaccttt aaaatatatt 2760
agatagctct agacacacta atattaaaag tgtccaataa catttaaaac tatactcata 2820
cgttaaaata taaatgtata tatgtacttt tgcatatagt atacatgcat aggccagtgc 2880
ttgagaagaa atgtgtacag aaggctgaaa ggagagaact ttagtcttct tgtttatggc 2940 20
ctccatagtt agaatatttt ataacacaaa tattttgata ttataatttt aaaataaaaa 3000
cacagaatag ccagacatac aatgcaagca ttcaatacca ggtaaggttt ttcactgtaa 3060
ttgacttaac agaaaatttt caagctagat gtgcataata ataaaaatct gaccttgcct 3120
tcatgtgatt cagccccagt ccattaccct gtttaggact gagaaatgca agactctggc 3180
tagagttcct tcttccatct cccttcaatg tttactttgt tctggtccct acagagtccc 3240 25
actataccac aactgatact aagtaattag taaggccctc ctcttttatt tttaataaag 3300
aagattttag aaagcatcag ttatttaata agttggccta gtttatgttc aaatagcaag 3360
tactcagaac agctgctgat gtttgaaatt aacacaagaa aaagtaaaaa acctcatttt 3420
aagatcttac ttacctgtcc ataattagtc catgaggaat aaacaccctt tccaaatcct 3480
cagcataatg attaggtatg caaaataaat caaggtcata acctggttca tcatcactaa 3540 30
tctgaaaaag aaatatagct gtttcaatga gagcattaca ggatacaaac atttgattgg 3600
attaagatgt taaaaaataa ccttagtcta tcagagaaat ttaggtgtaa gatgatatta 3660
gtaactgtta actttgtagg tatgataatg aattatgtaa gaaaacaaca ggccgggcgg 3720
gttggttcac acgtgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcaggcaga ctgcctgagc 3780
tcaggagttc gagaccagcc tgggcaacac ggtgaaatcc cgtctctact aaaaatacaa 3840 35
aaaaattagc cgggtgtggt gacacatgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc 3900
aggagaatca cttgaacctg ggaggtgaag gttgcagtga gccaagatgg caccacttca 3960
ctccagcctg ggaaacagag caagactctg tctctgagct gagatggcac cacttcactc 4020
cagcctggga aacagagcaa gactctgtct caaaaaaaac aaaacacaca aacaaaaaaa 4080
caggctgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggtg 4140
gatcacctga ggtcaggagt tccagaccag ccttgtcaac atggtgaaac ctccccccgc 4200 5
cgtctctact aaaaatacaa aaattagcca ggcgtggtgg caggagcctg taatcccagc 4260
tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgtacccaga aggcagaggt tgcactgagc 4320
tgagatggca ccattgcact ccagcctggg ggacaagagc gagatttcgt ctttaaaaaa 4380
caaaaacaaa acaaaaaacc atgtaactat atgtcttagt catcttagtc aagaatgtag 4440
aagtaaagtg ataagatatg gaatttcctt taggtcacaa agagaaaaag aaaaatttta 4500 10
aagagctaag acaaacgcag caaaatcttt atatttaata atattctaaa catgggtgat 4560
gaacatacgg gtattcatta tactattctc tccacttttg agtatgtttg aaaatttagt 4620
aaaacaagtt ttaacacact gtagtctaac aagataaaat atcacactga acaggaaaaa 4680
ctggcatggt gtggtggctc acacttgtaa tcccagtgct ttgggaggct gagacaggag 4740
agttgcttga ggccaggagt tcaagaccga catggggaat gtagcaagac cccgtcccta 4800 15
caaaaaactt tgtaaaaatt tgccaggtat ggtggtgcat acctgtagtc ccagctactc 4860
gggaggcgga ggcagaagga atcacttgag cccaggagtt tgaggctgca gtgagctacg 4920
atcataccac agcactccag cgtggacaac agagtaagac cctatctcaa aaacaaaaca 4980
aaacaaaaca aacaaaaaaa accacaagaa aaactgctgg ctgatgcagc ggctcatgcc 5040
tgtaatccca gtattttggg aggcccaggt gggcgtatca cctgaggtca ggagttagag 5100 20
accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaat tagccaggca 5160
tgtggcacgc gcctgtagtc ccagttactg ggaggctgaa gcaggaggat cacctgagcc 5220
cgggaggtgg aggttgcagt gagccgagat cacaccactg cactccagcc tgggtgacac 5280
agcaataccc tacctcaaaa taaaaaagaa aaagaaaaga aaagttgctg tccccgctac 5340
cccaatccca aatccaaaca gcctctctca tctcacagta agggggaaaa atcacccaaa 5400 25
aaagctaagt gatcttttga aaacccaaac tcttagaagt ctaagattat tatagtcaac 5460
tcatgaagtg tcatcataaa agatactcta atattattta agtagaacca catattggtt 5520
gtcttggtat gtctagcccc tggcatacaa aatatttaat aacactgata tggtacctgt 5580
gatgtgaaaa tgtactatga gtacagcttt ataaatacta tatatgtacc tatatacaga 5640
aaaaaataca acaaaatcat aaaagcactt atctttgaaa gaggagttac agcaatttta 5700 30
tttagttctt tattgctttg ctatatattc taaatttttt tcaatgaata tatatcactt 5760
ttaaaaaaat tcaatggtct ttcttataaa ttatctttgg cagcatgcgt ttttatatat 5820
acatataaaa tgtatgggaa atttttaaag gatacattaa attaaagcaa aatatacaaa 5880
caaaaaatca gaatacaaaa agataaaaag attgggaagg gagggaggga gtaaggagga 5940
agggtgggtg ggtatagaga aatataccaa ataatggtaa gaagtggggt cttgacactt 6000 35
tctacacttt ttttaaataa aaaaaatttt tttctctctc tttttttttt ttagagacga 6060
agtctcgcta tgttgcccag gctggtcttg aactcctggg atcaagagat cctcctgcct 6120
cagcctccca aggtgcttgg attacaggtg tgagccacca cgcctggtca ctttctacac 6180
tttaatatat atattttttc attttcaatg tcatttttat tagttaattt ataataccca 6240
ttcaccatta tattcaaagt ctatttgaag aaataaacca gaaagaatga aatactctag 6300
ctcacatgct attcaatact aaattacctt tcaaatcaca ttcaagaagc tgatgattta 6360 5
agctttggcg gtttccaata aatattggtc aaaccataat taaatctcaa tatatcagtt 6420
agtacctatt gagcatctcc ttttacaacc taagcattgt attaggtgct taaatacaag 6480
cagcttgact tttaatacat ttaaaaatac atatttaaga cttaaaatct tatttatgga 6540
attcagttat attttgaggt ttccagtgct gagaaatttg aggtttgtgc tgtctttcag 6600
tccccaaagc tcagttctga gttctcagac tttggtggaa cttcatgtat tgtcaggttg 6660 10
gcccgtaata cctgtgggac aacttcagcc cctgtgcaca tggccaggag gctggttgca 6720
aacattttca ggtaggtgga ccaggacatg cccctggtca tggccaggtg gaggcatagt 6780
gctatacagc aggcagaagt caatattgat ttgtttttaa agaaacatgt actactttca 6840
taagcagaaa aaatttctat tcttggggga aaagattatg ccagatcctc taggattaaa 6900
tgctgatgca tctgctaaac cttcacatat cagaacatat ttactataga aagaatgaaa 6960 15
atgggacatt tgtgtgtcac ctatgtgaac attccaaaaa tattttacaa caactaagta 7020
ttttataaat tttatgaact gaaatttagt tcaagttcta ggaaaataca aaccttgcta 7080
gatattataa aaatgataca atatatattc atttcaggct catcagaata tatctgttat 7140
cacttgacaa gaatgaaaat gcaccatttt gtagtgcttt aaaatcagga agatccagag 7200
tactaaaaat gacttcttcc ttgaagctta ctcaccaact tcctcccagt tactcactgc 7260 20
ttctgccaca agcataaact aggacccagc cagaactccc ttgaaatata cacttgcaac 7320
gattactgca tctatcaaaa tggttcagtg cctggctaca ggttctgcag atcgactaag 7380
aatttgaaaa gtcttgttta tttcaaagga agcccatgtg aattctgccc agagttcatc 7440
ccagatatgc agtctaagaa tacagacaga tcagcagaga tgtattctaa aacaggaatt 7500
ctggcaatat aacaaattga tttccaatca aaacagattt acataccata cttatgtcaa 7560 25
gaagttgttt tgttttattg catcctagat tttatttttt tgatttatgg tttactttaa 7620
gcataaaaaa tttgtcaata caactcttcc caaaaggcat aaacaaaaat tcataaaact 7680
tgcatcactt gagatacttc aggtatgaat tcacaacttt gttacaactt actatatata 7740
tgcacacata tatatatatt tgggtatatt gggggggttc taatttaaga aatgcataat 7800
tggctataga cagacagttg tcagaacttg gcaatgggta cgtgcaggtt cattatacca 7860 30
agtctacttg tagttgttca aaatgtatca taatacaagg ccgggcgagg tcgtcacgcc 7920
tgtaatccca gcattttggg aggctaaggc aggaggattg cttgaggtca ggagtttgtg 7980
accagcctgg gcaacagagc aagaccctgt ctccaaaaag aaaaaaaata attttttaca 8040
aaataaaaac aaaatgtatc atcagacgaa attaaataag aggcaattca tttaaatgac 8100
aacttttccc agcttgacat ttaacaaaaa gtctaagtcc tcttaattca tatttaatga 8160 35
tcaaatatca aatactaatt tttttttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt 8220
cgcccaggct ggagtgcagt ggcgcgatcc tggctcactg caagctccgc ctcccgggtt 8280
cacgccattc tcctgcctca gcctcccgag tagctgggat tacagacatg cgccaccacg 8340
cccggctaat tttgtatttt tagtagagat ggggtttctc catgttggtc aggctggtct 8400
tgaatttccc acctcaggtg atctgcctgc ctcagcctca caaagcagta gctgggacta 8460
caggcaccca ccaccacact tggttaattc ttttgtattt tttttgtaaa gacgggattt 8520 5
caccatgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgatctcat gatccgcccg cctcagcctc 8580
ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccccgcccgg ccatcaaata ctaattctta 8640
aatggtaagg acccactatt cagaacctgt atccttatca ctaatatgca aatatttatt 8700
gaatacttac tatgtcatgc atactagaga gagttagata aatttgatac agctaccctc 8760
acagaactta cagtgtaata gatggcatga catgtacatg agtaactgtg aacagtgtta 8820 10
aattgctatt taaaaaaaaa gacggctggg cgctgtggct catgcctgta atcccagcac 8880
tttgggaggc caaggcaagt tgatcgctcg aggtcaagag ttcgagacca gcctggccaa 8940
cgtggtaaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaaaaaa attagccagg catggtggca 9000
caggcctgta atcccagcta ctagggaggc tgagacatgg agaactgctt gaatccagga 9060
ggcagaggtt acagtgagcc gagatcatac cactacactc cagcctgagt gacagagcga 9120 15
gactcctgtc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagatacagg ttaagtgtta tggtagttga 9180
agagagaact caaactctgt ctcagaagcc tcacttgcat gtggaccact gatatgaaat 9240
aatataaata ggtataattc aataaatagg aacttcagtt ttaatcatcc caaacaccaa 9300
aacttcctat caaacaggtc caataaactc aatctctata agagctagac agaaatctac 9360
ttggtggcct ataatcttat tagcccttac ttgtcccatc tgatattaat taaccccatc 9420 20
taatatggat tagttaacaa tccagtggct gctttgacag gaacagttgg agagagttgg 9480
ggattgcaac atattcaatt atacaaaaat gcattcagca tctaccttga ttaaggcagt 9540
gtgcaacaga atttgcagga gagtaaaaga atgattataa atttacaacc cttaaagagc 9600
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tggatcacct gaggccagaa gttcaagacc agcctagcca acatggcgaa accctgtctc 9720 25
tacaaaaaat acaaaaatta gccgggtgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagttacttg 9780
ggaggccgag gcaggagaat cgcttgaacc taggaggtgg aggctgcagt gagccgagat 9840
tgtgccactg cactccactt cagcctgggc gacaagagca agactccgtc acaaaaaaaa 9900
aaaaaaaaaa aaagcttaaa atctagtggg aaaggcatat atacatacaa ctaactgtat 9960
agcataataa agctcataat ctgtaacaaa atctaattcg acaagcccag aaacttgtga 10020 30
tttaccaaaa acagttatat atacacaaaa agtaaaccta gaacccaaag ttacccagca 10080
ccaatgattc tctccctaag cagtatcaag tttaaagcag tgattacatt ctactgccta 10140
gattgtaaac tgagtaaagg agaccagcac ctttctgcta ctgaactagc acagccgtgt 10200
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ctgctcaggc tgccataaca aaataccaca gactgagtga cttaacagaa acttatttct 10380
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gctctctggt gtctcttttt tttttttttt cttttttgag acagagtctc actctgtcac 10560
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cagctaataa ttgaccataa gacaattaga tttaaattag ttttgaatct ttctaatacc 10980 10
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aacggaatca gaattacatc aatgcaaaag cattgctgtg aactctgtac ttaggactaa 11100
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cactgctatc tatttttctc aaccactcac atggctacaa taactgtctg caagcttatg 11280 15
attcccaaat atctatctct agcctcaatc ttgttccaga agataaaaag tagtattcaa 11340
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catgttgata ttgaggctga cagcccattc atcaagtctt tgcagaaggc atttccgtcg 12060
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cacctggcta ccaaattgat cgagcaggag actgacaaag acacactcat cttggatatc 12180 30
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caggcgatga aaggtgtcag aacggcgtat tggattgggt ttgacaccac cccgtttatg 12540
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ttacaggcca ggaacatagg actgtgtgca gcatccttga ctgagggaag actcggcaaa 12660
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cacctgaaag gtaaacaatc ctttacctgt aggtgcgata ccatcgtatc atgtgaaggg 12840 5
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acgaggaaga tgcacaccat gtacaagaaa ccagacaccc agacaatagt gaaggtgcct 13320
tcagagttta actcgttcgt catcccgagc ctatggtcta caggcctcgc aatcccagtc 13380
agatcacgca ttaagatgct tttggccaag aagaccaagc gagagttaat acctgttctc 13440 15
gacgcgtcgt cagccaggga tgctgaacaa gaggagaagg agaggttgga ggccgagctg 13500
actagagaag ccttaccacc cctcgtcccc atcgcgccgg cggagacggg agtcgtcgac 13560
gtcgacgttg aagaactaga gtatcacgca ggtgcagggg tcgtggaaac acctcgcagc 13620
gcgttgaaag tcaccgcaca gccgaacgac gtactactag gaaattacgt agttctgtcc 13680
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gtcctactac catgtggatc ggccattccg gtccctgagt ttcaagcttt gagcgagagc 13860
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cacggaccgt cgctgaacac cgacgaggag aactacgaga aagtcagagc tgaaagaact 13980
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ctgaagatca ggccgtcggc accatataag actacagtag taggagtctt tggggttccg 14160
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ggggtatacg ccgtaaggca gaaggtgaat gaaaatccct tgtatgcccc tgcgtcggag 14820
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gaatggcaag aagaacacga caaaataatg aaggtgattg aaggaccggc tgcgcctgtg 15000 5
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gcgcgatcgt aatcacccga gtgtgatcat ctggtcgctg gggaatgaat caggccacgg 20700
cgctaatcac gacgcgctgt atcgctggat caaatctgtc gatccttccc gcccggtgca 20760
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cgtggatgaa gaccagccct tcccggctgt gccgaaatgg tccatcaaaa aatggctttc 20880
gctacctgga gagacgcgcc cgctgatcct ttgcgaatac gcccacgcga tgggtaacag 20940
tcttggcggt ttcgctaaat actggcaggc gtttcgtcag tatccccgtt tacagggcgg 21000
cttcgtctgg gactgggtgg atcagtcgct gattaaatat gatgaaaacg gcaacccgtg 21060
gtcggcttac ggcggtgatt ttggcgatac gccgaacgat cgccagttct gtatgaacgg 21120 35
tctggtcttt gccgaccgca cgccgcatcc agcgctgacg gaagcaaaac accagcagca 21180
gtttttccag ttccgtttat ccgggcaaac catcgaagtg accagcgaat acctgttccg 21240
tcatagcgat aacgagctcc tgcactggat ggtggcgctg gatggtaagc cgctggcaag 21300
cggtgaagtg cctctggatg tcgctccaca aggtaaacag ttgattgaac tgcctgaact 21360
accgcagccg gagagcgccg ggcaactctg gctcacagta cgcgtagtgc aaccgaacgc 21420
gaccgcatgg tcagaagccg ggcacatcag cgcctggcag cagtggcgtc tggcggaaaa 21480 5
cctcagtgtg acgctccccg ccgcgtccca cgccatcccg catctgacca ccagcgaaat 21540
ggatttttgc atcgagctgg gtaataagcg ttggcaattt aaccgccagt caggctttct 21600
ttcacagatg tggattggcg ataaaaaaca actgctgacg ccgctgcgcg atcagttcac 21660
ccgtgcaccg ctggataacg acattggcgt aagtgaagcg acccgcattg accctaacgc 21720
ctgggtcgaa cgctggaagg cggcgggcca ttaccaggcc gaagcagcgt tgttgcagtg 21780 10
cacggcagat acacttgctg atgcggtgct gattacgacc gctcacgcgt ggcagcatca 21840
ggggaaaacc ttatttatca gccggaaaac ctaccggatt gatggtagtg gtcaaatggc 21900
gattaccgtt gatgttgaag tggcgagcga tacaccgcat ccggcgcgga ttggcctgaa 21960
ctgccagctg gcgcaggtag cagagcgggt aaactggctc ggattagggc cgcaagaaaa 22020
ctatcccgac cgccttactg ccgcctgttt tgaccgctgg gatctgccat tgtcagacat 22080 15
gtataccccg tacgtcttcc cgagcgaaaa cggtctgcgc tgcgggacgc gcgaattgaa 22140
ttatggccca caccagtggc gcggcgactt ccagttcaac atcagccgct acagtcaaca 22200
gcaactgatg gaaaccagcc atcgccatct gctgcacgcg gaagaaggca catggctgaa 22260
tatcgacggt ttccatatgg ggattggtgg cgacgactcc tggagcccgt cagtatcggc 22320
ggaattccag ctgagcgccg gtcgctacca ttaccagttg gtctggtgtc aaaaataata 22380 20
ataaccgggc aggggggatc ccgggtaatt aattgaatta catccctacg caaacgtttt 22440
acggccgccg gtggcgcccg cgcccggcgg cccgtccttg gccgttgcag gccactccgg 22500
tggctcccgt cgtccccgac ttccaggccc agcagatgca gcaactcatc agcgccgtaa 22560
atgcgctgac aatgagacag aacgcaattg ctcctgctag gcctcccaaa ccaaagaaga 22620
agaagacaac caaaccaaag ccgaaaacgc agcccaagaa gatcaacgga aaaacgcagc 22680 25
agcaaaagaa gaaagacaag caagccgaca agaagaagaa gaaacccgga aaaagagaaa 22740
gaatgtgcat gaagattgaa aatgactgta tcttcgtatg cggctagcca cagtaacgta 22800
gtgtttccag acatgtcggg caccgcacta tcatgggtgc agaaaatctc gggtggtctg 22860
ggggccttcg caatcggcgc tatcctggtg ctggttgtgg tcacttgcat tgggctccgc 22920
agataagtta gggtaggcaa tggcattgat atagcaagaa aattgaaaac agaaaaagtt 22980 30
agggtaagca atggcatata accataactg tataacttgt aacaaagcgc aacaagacct 23040
gcgcaattgg ccccgtggtc cgcctcacgg aaactcgggg caactcatat tgacacatta 23100
attggcaata attggaagct tacataagct taattcgacg aataattgga tttttatttt 23160
attttgcaat tggtttttaa tatttccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 23220
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacta gatcctcgaa tcaagcttat 23280 35
cgataccgtc gactagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga taagatacat 23340
tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 23400
ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 23460
caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa 23520
gtaaaacctc tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatctc gacctcgagg gggggccctg 23580
taccgggctc tgcctgaggc tctggctgcc cagcaggctg aagctggggt tgttggccag 23640 5
gggcacttgt gttcccatcg cagcgggcac ttgtgcctcc caatcagatg gcctctgaag 23700
gcaggcctgg ccagaaggtg agtgctgctg aacgctatta tccacttggc tgaggggtgt 23760
tttccccgaa actgctgtgg tcacagctgc tgccgctgtg acccatgcag cattgttgaa 23820
cgcagtgggc attcttggca cactaggccg tctgagctgg tggggactca aggactgggt 23880
gcccagggag ctgggacaga acccaggcag gggcacttct ggtggggtgg ccttggggct 23940 10
ctgcatatgc tggcagacag agtcaagtct gcccagggga gtctggcctg agtgtgagag 24000
gatgggacac tgggggctgg aggtgaaaat tccttgccgc ttccccagag ttggtgagat 24060
cactcccatg ccctcgcagc tctggtgcct ggtgagtggg atcattcctg gactcagatt 24120
gttctgaaga agcccagttc tgggtggcat caagtgcttg ctagatgggg ggcttgcctt 24180
gatccggcta cacttggagg tgacttgttc ttggacggct acatacagaa agagagaagt 24240 15
ggggatgagt tccaaaggca tcctcgactt cggctgtggc caccggaggg tagctcctgg 24300
cccaacacgg acttctcacc tcccgccctt ggctctctac tgagctcccc cctgctcccc 24360
aattcctcgc cattcccctc atttctctgc cctcagcctg gactgcagtt cttctgggaa 24420
gctgccccaa ctccctaggt ctgtgctcac caagagcaga tcacactgga ctgaaatgcc 24480
agctgatttg tctcttcaag aaaattggaa gctcctggag gtcagggtcc atgtctgctt 24540 20
ttacactcag tgctctgtat gcaggcctgg cactgcccac cctttgacag gtggtgcata 24600
ttttgtagaa ggaaggaagg ggccaggtgg ggtgggctgg gctggtggcg ggagctagct 24660
cagcctctta gattctctac ccgatggatg tgacctggga cagcaagtga gtgtggtgag 24720
tgagtgcaga cggtgctttg ttcccctctt gtctcatagc ctagatggcc tctgagccca 24780
gatctggggc tcagacaaca tttgttcaac tgaacggtaa tgggtttcct ttctgaaggc 24840 25
tgaaatctgg gagctgacat tctggactcc ctgagttctg aagagcctgg ggatggagag 24900
acacggagca gaagatggaa ggtagagtcc caggtgccta agatggggaa tacatctccc 24960
ctcattgtca tgagagtcca ctctagctga tatctactgt ggccaatatc taccggtact 25020
tttttggggt ggacactgag tcatgcagca gtcttatggt ttacccaagg tcaggtaggg 25080
gagacagtgc agtcagagca caagcccagt gtgtctgacc cacccaagaa tccatgctcg 25140 30
tatctacaaa aatgattttt tctcttgtaa tggtgcctag gttcttttat tatcatggca 25200
tgtgtatgtt tttcaactag gttacaatct ggccttataa ggttaacctc ctggaggcca 25260
ccagccttcc tgaaacttgt ctgtgctgtc cctgcaactg gagtgtgcct gatgtggcac 25320
tccagcctgg acaagtggga cacagactcc gctgttatca ggcccaaaga tgtcttccat 25380
aagaccagaa gagcaatggt gtagaggtgt catgggctac aataaagatg ctgacctcct 25440 35
gtctgagggc aagcagcctc ttctggccct cagacaaatg ctgagtgttc ccaagactac 25500
cctcggcctg gtccaatctc atcccactgg tgcgtaaggg ttgctgaact catgacttct 25560
tggctagcct gcaacctcca cggagtggga actacatcag gcattttgct aactgctgta 25620
tcctaggcca ataaatgttg atcacattta tagctgccat ggtagggtgg ggacccctgc 25680
tatctatctg tggaggctct gggagcccct gacacaaact ttctgaagca gagcctcccc 25740
aacccctttt ccattcccta tacctgacag atggcccagg aacccattag aaatggaagg 25800 5
tcactgcagc agtatgtgaa tgtgcgtgtg ggagaagggc aggatcagag ccctgggggt 25860
gtggcagccc ccaagtgatt ctaatccaga tcctagggtt gtttccctgt cccattgaaa 25920
tagctgcttt aaggggcctg actcagggaa atcagtctct tgaattaagt ggtgattttg 25980
gagtcattta gaccaggcct tcaattggga tcctgctctt agagttggat gaattattta 26040
actgattttc agatctcctc tttctcaatg ctttcagaag cacagtaact gcttactctg 26100 10
aaatgaattc tcaccccact tccacatatg caccccttgc ccaccccttt gggaacactg 26160
gccttaactg cttaccttca aatggactca tctgttggga gatatatgca ttctgccgtt 26220
caggggtcat tgccataaga cctgatctct gttcctcttg ctaaacagaa gatgaaaaag 26280
acaaattaga ttacagctac caattaataa ttagccttag gatcgctgcg tggggaccta 26340
ggacttggct ttggtgcagc agaaagcatg aataaacaca ccagcataca ctcgcatgca 26400 15
tgccccaccc tctcgagcaa aattccacag gtataaataa agtaagattc tgcacctggg 26460
ttaaaaacac aactgcaaca gcatagaatg gggcaggaga gacagaactt aatagcaaga 26520
gcacacagaa aaaagtttta ggcattttgg atgtccatct gctcaggatg ggtcagcagt 26580
gagatgcggt caccaaaaga acaaatgtaa cattaggctg cattaataga agcagagtat 26640
gtagaaggag ggaggtgaca gtcctatgct aactctgcct tggccagact atacccacag 26700 20
gagtctgggc atgccagtct cagggagacc cagacagact ggctgcattc agaggatggt 26760
aagtaatgag agtggggatt ggacttcaaa ctacccagac aaagaatggc tgagcaagcc 26820
aaggatgctg tggctggggc agagcagact gtgggctatg tagtggtgga tacctagcct 26880
ctgcagggct gtcataggga aaggacattg agaagaggac tgaggcttgt tcctggtggt 26940
cctggcatga acggccagat gatcacatgg tcaggtggac acagtctcca acactgggag 27000 25
tagccaaaca cttactgcca acctcccgcc cttctcctga ctagttgcag cataggcaat 27060
tgggaggagc ttcctgtctc catctgaaag ctggctgggt gggcaggggg aggagcgagc 27120
caagtttcaa ggccgcagtt tcagcactca gtctgggatc ggctcaagga gcaaagggga 27180
agaacatagc caggagggaa taacatgaag gcccccagac ccagaaaagg catgacttgc 27240
tctgagaccc tcagccggtt ggtgtcaggt tgtgactcgg atccaggtct gactcccagt 27300 30
ccagtgcttg aagcctcacc ccacacagtg aggggagccc ggccatctct gctcaactgc 27360
tgccatctct ctccccttct caaccaccaa ggcagctctg tctgggagca caagctccaa 27420
gtccactttc tggtctgtgt cccccccaag atgccagagg acttgcctct acaacacggg 27480
ctgcccgtgc agtgcctgct tttccagcaa agggcttctg ggaacccttc tctgcactca 27540
gtggggctgg tgggagtggg gcggggtagc gacccagtgc ttgggactgt gcccagctct 27600 35
caggcctggc agcagttcct ggccttggtt cctgccaagg cagagaggac aaacacatgg 27660
caccgggaag actacaccag aagcgattcc accagactgg ggtttgcttt tctatcccgc 27720
ccttagcctg cttcctgtcc tggtccctgc ctccccctcc actggagctg ccgtgtgggc 27780
agtgaggggc tgtttctcag ctgccctatg gagctgccct ctccctgcca aagcattggc 27840
aaggcggcaa ggggtggggg tggggatggg gggtgggatc tgccttctca agctctcatt 27900
atactgagca cgtctcaccc attattttat gtcatctagc aacaccccat gtggacactg 27960 5
aggagcatgg gggtcacatg accactgccc aaggccacac catccggatc tgcctgagat 28020
ggtcagggtt ggcagccatt tctgaaggca gtcctttcgc tttggctctt cttgtaccag 28080
tctcaggaca tcagggcaga agatctacag tccccagctt actgatgtga cagcagaggc 28140
tcagagaggt taaatgactt gcccaaggtg acacggctaa gaagtacagt atctcctaac 28200
tgcagaccag gtgcttctgc tgcttctggg gacagattcc tgcgtggctg gctaggtcta 28260 10
aacggtcctt aactccatcc ccaccggttg ctgcattagt ttcatcaaat aacacagttg 28320
tacagaggta ggggttcagg ggcaggggca gatggaggct ggagagtgtg actaaggaaa 28380
cagcagggga agtgcggtaa agtccgaagg gagggacgga aagagaaagc caagcccagg 28440
ggcgtgccag acaaaaggaa aggccacgcc ggggcagggc aggcttcagc gggtgctggg 28500
gcgtcttcat cccgggaagc acacattcca gaggaccccg gagtctaatg gaaaagctgg 28560 15
ccagcctatc actatggaaa ctgccaaggc cacacagcgc tgctgacacc cagcctgggt 28620
gccggtggcc agctctgcag gatcttcaag tctggggtgc caccagcaag cgacggtcct 28680
ccatgggctc ttcaccttac ggcagtgtcc agaggcaccg ccagtcctct gctcctatgc 28740
tggtcctgct gtccctggca aaaggagcca gagcattctc tccaggcctc ccgaggaggc 28800
tgcttccttt gttttgcaga tggaggctcc catcctttgt tctgaatcaa tgtgctccaa 28860 20
agataagccc caagaaaaca gttgttgcct tttgacactg acaattagaa tcgttggaaa 28920
atggagaaaa caggaaatgg caaatggttt cagtgaccag gaggaaaccg tgcctgaaag 28980
ttgctgctta gtgactggga cactcgcttt ctgctctctt atgaaggaca gcctaggccg 29040
tgtggccttt tataaacaaa gctatgaagg ggtcgtcaaa ttttctaggg ctgcaactgt 29100
ggcactacgt cctgttgtgc caggtgacac tgacaagcag cactgagttc tatgcaagcc 29160 25
caggtgtgct tctctcatgg tgacccccag agaactaagg cccagctctt cctctgtcac 29220
acccctccca gcccccactg tcagacaagg gaccacattc acagacagtc tcagccaaga 29280
tggcaacctt ggaagtcctg gggatgcctt tctagaagct cgcgccccta ggggccggcc 29340
ttaattaaat caagcttatc gataccgtcg agacctcgag ggggggcatc actccgccct 29400
aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct 29460 30
cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatgtt t 29511
<210> 10
<211> 28191
<212> DNA
<213> Quimérico 35
<220>
<221> 5' ITR
<222> (1)..(438)
<223> Primera secuencia terminal invertida repetida y señal de
empaquetamiento
<220> 5
<221> Relleno
<222> (439)..(10990)
<223> Primera secuencia no codificante de relleno
<220>
<221> TERT 10
<222> (10991)..(11285)
<223> Promotor de la telomerasa (TERT)
<220>
<221> SFV
<222> (11556)..(18665) 15
<223> Región del replicón procedente del virus SFV
<220>
<221> mIL-12
<222> (18688)..(21021)
<223> Secuencia correspondiente al gen de la interleucina-12 (IL12) de 20
ratón
<220>
<221> PoliA
<222> (21920)..(22179)
<223> Secuencia de poliadenilación derivada del virus SV40 25
<220>
<221> Relleno
<222> (22180)..(28030)
<223> Segunda secuencia no codificante de relleno
<220> 30
<221> 3' ITR
<222> (28031)..(28191)
<223> Segunda secuencia terminal invertida repetida
<400> 10
aaacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60 35
agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120
tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180
ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240
tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggccgc 360
ggggactttg accgtttacg tggagactcg cccaggtgtt tttctcaggt gttttccgcg 420 5
ttccgggtca aagttggcgt tttgatatca agcttatcga taccgtcaaa caagtcttta 480
attcaagcaa gactttaaca agttaaaagg agcttatggg taggaagtag tgttatgatg 540
tatgggcata aagggtttta atgggatagt gaaaatgtct ataataatac ttaaatggct 600
gcccaatcac ctacaggatt gatgtaaaca tggaaaaggt caaaaacttg ggtcactaaa 660
atagatgatt aatggagagg atgaggttga tagttaaatg tagataagtg gtcttattct 720 10
caataaaaat gtgaacataa ggcgagtttc tacaaagatg gacaggactc attcatgaaa 780
cagcaaaaac tggacatttg ttctaatctt tgaagagtat gaaaaattcc tattttaaag 840
gtaaaacagt aactcacagg aaataccaac ccaacataaa atcagaaaca atagtctaaa 900
gtaataaaaa tcaaacgttt gcacgatcaa attatgaatg aaattcacta ctaaaattca 960
cactgatttt gtttcatcca cagtgtcaat gttgtgatgc atttcaattg tgtgacacag 1020 15
gcagactgtg gatcaaaagt ggtttctggt gcgacttact ctcttgagta tacctgcagt 1080
cccctttctt aagtgtgtta aaaaaaaagg gggatttctt caattcgcca atactctagc 1140
tctccatgtg ctttctagga aacaagtgtt aacccacctt atttgtcaaa cctagctcca 1200
aaggactttt gactccccac aaaccgatgt agctcaagag agggtatctg tcaccagtat 1260
gtatagtgaa aaaagtatcc caagtcccaa cagcaattcc taaaaggagt ttatttaaaa 1320 20
aaccacacac acctgtaaaa taagtatata tcctccaagg tgactagttt taaaaaaaca 1380
gtattggctt tgatgtaaag tactagtgaa tatgttagaa aaatctcact gtaaccaagt 1440
gaaatgaaag caagtatggt ttgcagagat tcaaagaaaa tataagaaaa cctactgttg 1500
ccactaaaaa gaatcatata ttaaatatac tcacacaata gctcttcagt ctgataaaat 1560
ctacagtcat aggaatggat ctatcactat ttctattcag tgctttgatg taatccagca 1620 25
ggtcagcaaa gaatttatag ccccccttga gcacacagag ggctacaatg tgatggcctc 1680
ccatctcctt catcacatct cgagcaagac gttcagtcct acagaaataa aatcaggaat 1740
ttaatagaaa gtttcataca ttaaacttta taacaaacac ctcttagtca ttaaacttcc 1800
acaccaacct gggcaatata gtgagacccc atgcctgcaa aaaaaaaaaa attagccagg 1860
catggtagca tgtacctgta gtcccagcta cttgagaggt gaggtgggaa aatcacttta 1920 30
gtgcaggatg ttgaggctgg agtgaactgt gattgtgcca ctgcactcca gcctggacaa 1980
tagagcaaga ccttgtctca aaaaaatgca ttaaaaattt tttttaaatc ttccacgtat 2040
cacatccttt gccctcatgt ttcataaggt aaaaaatttg ataccttcaa aaaaaccaag 2100
cataccacta tcataatttt ttttaaatgc aaataaaaac aagataccat tttcacctat 2160
cagactggca ggttctgatt aaatgaaatt ttctggataa tatacaatat taagagagac 2220 35
tgtagaaact gggccagtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gctgggtaac 2280
atggcgaacc ctgtttctac aaaataaaaa tattagctgg gagtggtggc gcacacctat 2340
agtcccagct actcaggagg ctgaggtgga aggatcgctt gaacccagga ggttgagact 2400
gcagtgaact gtgatcattc tgctgcactg caccccagcc tgggcaacag agaccttgtc 2460
tcaaaaaaaa aaaaaaaaga gacaaattgt gaagagaaag gtactctcat ataacatcag 2520
gagtataaaa tgattcaact tcttagagga aaatttggca ataccaaaat attcaataaa 2580 5
ctctttcccc ttgacccaga aattccactt gaataaagct gaacaagtac caaacatgta 2640
aaagaatgtt tcttctagta cagtcggtaa gaacaaaata gtgtctatca atagtggact 2700
ggttaaatca gttatggtat ctccataaga cagaatgcta tgcaaccttt aaaatatatt 2760
agatagctct agacacacta atattaaaag tgtccaataa catttaaaac tatactcata 2820
cgttaaaata taaatgtata tatgtacttt tgcatatagt atacatgcat aggccagtgc 2880 10
ttgagaagaa atgtgtacag aaggctgaaa ggagagaact ttagtcttct tgtttatggc 2940
ctccatagtt agaatatttt ataacacaaa tattttgata ttataatttt aaaataaaaa 3000
cacagaatag ccagacatac aatgcaagca ttcaatacca ggtaaggttt ttcactgtaa 3060
ttgacttaac agaaaatttt caagctagat gtgcataata ataaaaatct gaccttgcct 3120
tcatgtgatt cagccccagt ccattaccct gtttaggact gagaaatgca agactctggc 3180 15
tagagttcct tcttccatct cccttcaatg tttactttgt tctggtccct acagagtccc 3240
actataccac aactgatact aagtaattag taaggccctc ctcttttatt tttaataaag 3300
aagattttag aaagcatcag ttatttaata agttggccta gtttatgttc aaatagcaag 3360
tactcagaac agctgctgat gtttgaaatt aacacaagaa aaagtaaaaa acctcatttt 3420
aagatcttac ttacctgtcc ataattagtc catgaggaat aaacaccctt tccaaatcct 3480 20
cagcataatg attaggtatg caaaataaat caaggtcata acctggttca tcatcactaa 3540
tctgaaaaag aaatatagct gtttcaatga gagcattaca ggatacaaac atttgattgg 3600
attaagatgt taaaaaataa ccttagtcta tcagagaaat ttaggtgtaa gatgatatta 3660
gtaactgtta actttgtagg tatgataatg aattatgtaa gaaaacaaca ggccgggcgg 3720
gttggttcac acgtgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcaggcaga ctgcctgagc 3780 25
tcaggagttc gagaccagcc tgggcaacac ggtgaaatcc cgtctctact aaaaatacaa 3840
aaaaattagc cgggtgtggt gacacatgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc 3900
aggagaatca cttgaacctg ggaggtgaag gttgcagtga gccaagatgg caccacttca 3960
ctccagcctg ggaaacagag caagactctg tctctgagct gagatggcac cacttcactc 4020
cagcctggga aacagagcaa gactctgtct caaaaaaaac aaaacacaca aacaaaaaaa 4080 30
caggctgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggcgggtg 4140
gatcacctga ggtcaggagt tccagaccag ccttgtcaac atggtgaaac ctccccccgc 4200
cgtctctact aaaaatacaa aaattagcca ggcgtggtgg caggagcctg taatcccagc 4260
tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgtacccaga aggcagaggt tgcactgagc 4320
tgagatggca ccattgcact ccagcctggg ggacaagagc gagatttcgt ctttaaaaaa 4380 35
caaaaacaaa acaaaaaacc atgtaactat atgtcttagt catcttagtc aagaatgtag 4440
aagtaaagtg ataagatatg gaatttcctt taggtcacaa agagaaaaag aaaaatttta 4500
aagagctaag acaaacgcag caaaatcttt atatttaata atattctaaa catgggtgat 4560
gaacatacgg gtattcatta tactattctc tccacttttg agtatgtttg aaaatttagt 4620
aaaacaagtt ttaacacact gtagtctaac aagataaaat atcacactga acaggaaaaa 4680
ctggcatggt gtggtggctc acacttgtaa tcccagtgct ttgggaggct gagacaggag 4740 5
agttgcttga ggccaggagt tcaagaccga catggggaat gtagcaagac cccgtcccta 4800
caaaaaactt tgtaaaaatt tgccaggtat ggtggtgcat acctgtagtc ccagctactc 4860
gggaggcgga ggcagaagga atcacttgag cccaggagtt tgaggctgca gtgagctacg 4920
atcataccac agcactccag cgtggacaac agagtaagac cctatctcaa aaacaaaaca 4980
aaacaaaaca aacaaaaaaa accacaagaa aaactgctgg ctgatgcagc ggctcatgcc 5040 10
tgtaatccca gtattttggg aggcccaggt gggcgtatca cctgaggtca ggagttagag 5100
accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaat tagccaggca 5160
tgtggcacgc gcctgtagtc ccagttactg ggaggctgaa gcaggaggat cacctgagcc 5220
cgggaggtgg aggttgcagt gagccgagat cacaccactg cactccagcc tgggtgacac 5280
agcaataccc tacctcaaaa taaaaaagaa aaagaaaaga aaagttgctg tccccgctac 5340 15
cccaatccca aatccaaaca gcctctctca tctcacagta agggggaaaa atcacccaaa 5400
aaagctaagt gatcttttga aaacccaaac tcttagaagt ctaagattat tatagtcaac 5460
tcatgaagtg tcatcataaa agatactcta atattattta agtagaacca catattggtt 5520
gtcttggtat gtctagcccc tggcatacaa aatatttaat aacactgata tggtacctgt 5580
gatgtgaaaa tgtactatga gtacagcttt ataaatacta tatatgtacc tatatacaga 5640 20
aaaaaataca acaaaatcat aaaagcactt atctttgaaa gaggagttac agcaatttta 5700
tttagttctt tattgctttg ctatatattc taaatttttt tcaatgaata tatatcactt 5760
ttaaaaaaat tcaatggtct ttcttataaa ttatctttgg cagcatgcgt ttttatatat 5820
acatataaaa tgtatgggaa atttttaaag gatacattaa attaaagcaa aatatacaaa 5880
caaaaaatca gaatacaaaa agataaaaag attgggaagg gagggaggga gtaaggagga 5940 25
agggtgggtg ggtatagaga aatataccaa ataatggtaa gaagtggggt cttgacactt 6000
tctacacttt ttttaaataa aaaaaatttt tttctctctc tttttttttt ttagagacga 6060
agtctcgcta tgttgcccag gctggtcttg aactcctggg atcaagagat cctcctgcct 6120
cagcctccca aggtgcttgg attacaggtg tgagccacca cgcctggtca ctttctacac 6180
tttaatatat atattttttc attttcaatg tcatttttat tagttaattt ataataccca 6240 30
ttcaccatta tattcaaagt ctatttgaag aaataaacca gaaagaatga aatactctag 6300
ctcacatgct attcaatact aaattacctt tcaaatcaca ttcaagaagc tgatgattta 6360
agctttggcg gtttccaata aatattggtc aaaccataat taaatctcaa tatatcagtt 6420
agtacctatt gagcatctcc ttttacaacc taagcattgt attaggtgct taaatacaag 6480
cagcttgact tttaatacat ttaaaaatac atatttaaga cttaaaatct tatttatgga 6540 35
attcagttat attttgaggt ttccagtgct gagaaatttg aggtttgtgc tgtctttcag 6600
tccccaaagc tcagttctga gttctcagac tttggtggaa cttcatgtat tgtcaggttg 6660
gcccgtaata cctgtgggac aacttcagcc cctgtgcaca tggccaggag gctggttgca 6720
aacattttca ggtaggtgga ccaggacatg cccctggtca tggccaggtg gaggcatagt 6780
gctatacagc aggcagaagt caatattgat ttgtttttaa agaaacatgt actactttca 6840
taagcagaaa aaatttctat tcttggggga aaagattatg ccagatcctc taggattaaa 6900 5
tgctgatgca tctgctaaac cttcacatat cagaacatat ttactataga aagaatgaaa 6960
atgggacatt tgtgtgtcac ctatgtgaac attccaaaaa tattttacaa caactaagta 7020
ttttataaat tttatgaact gaaatttagt tcaagttcta ggaaaataca aaccttgcta 7080
gatattataa aaatgataca atatatattc atttcaggct catcagaata tatctgttat 7140
cacttgacaa gaatgaaaat gcaccatttt gtagtgcttt aaaatcagga agatccagag 7200 10
tactaaaaat gacttcttcc ttgaagctta ctcaccaact tcctcccagt tactcactgc 7260
ttctgccaca agcataaact aggacccagc cagaactccc ttgaaatata cacttgcaac 7320
gattactgca tctatcaaaa tggttcagtg cctggctaca ggttctgcag atcgactaag 7380
aatttgaaaa gtcttgttta tttcaaagga agcccatgtg aattctgccc agagttcatc 7440
ccagatatgc agtctaagaa tacagacaga tcagcagaga tgtattctaa aacaggaatt 7500 15
ctggcaatat aacaaattga tttccaatca aaacagattt acataccata cttatgtcaa 7560
gaagttgttt tgttttattg catcctagat tttatttttt tgatttatgg tttactttaa 7620
gcataaaaaa tttgtcaata caactcttcc caaaaggcat aaacaaaaat tcataaaact 7680
tgcatcactt gagatacttc aggtatgaat tcacaacttt gttacaactt actatatata 7740
tgcacacata tatatatatt tgggtatatt gggggggttc taatttaaga aatgcataat 7800 20
tggctataga cagacagttg tcagaacttg gcaatgggta cgtgcaggtt cattatacca 7860
agtctacttg tagttgttca aaatgtatca taatacaagg ccgggcgagg tcgtcacgcc 7920
tgtaatccca gcattttggg aggctaaggc aggaggattg cttgaggtca ggagtttgtg 7980
accagcctgg gcaacagagc aagaccctgt ctccaaaaag aaaaaaaata attttttaca 8040
aaataaaaac aaaatgtatc atcagacgaa attaaataag aggcaattca tttaaatgac 8100 25
aacttttccc agcttgacat ttaacaaaaa gtctaagtcc tcttaattca tatttaatga 8160
tcaaatatca aatactaatt tttttttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt 8220
cgcccaggct ggagtgcagt ggcgcgatcc tggctcactg caagctccgc ctcccgggtt 8280
cacgccattc tcctgcctca gcctcccgag tagctgggat tacagacatg cgccaccacg 8340
cccggctaat tttgtatttt tagtagagat ggggtttctc catgttggtc aggctggtct 8400 30
tgaatttccc acctcaggtg atctgcctgc ctcagcctca caaagcagta gctgggacta 8460
caggcaccca ccaccacact tggttaattc ttttgtattt tttttgtaaa gacgggattt 8520
caccatgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgatctcat gatccgcccg cctcagcctc 8580
ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccccgcccgg ccatcaaata ctaattctta 8640
aatggtaagg acccactatt cagaacctgt atccttatca ctaatatgca aatatttatt 8700 35
gaatacttac tatgtcatgc atactagaga gagttagata aatttgatac agctaccctc 8760
acagaactta cagtgtaata gatggcatga catgtacatg agtaactgtg aacagtgtta 8820
aattgctatt taaaaaaaaa gacggctggg cgctgtggct catgcctgta atcccagcac 8880
tttgggaggc caaggcaagt tgatcgctcg aggtcaagag ttcgagacca gcctggccaa 8940
cgtggtaaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaaaaaa attagccagg catggtggca 9000
caggcctgta atcccagcta ctagggaggc tgagacatgg agaactgctt gaatccagga 9060 5
ggcagaggtt acagtgagcc gagatcatac cactacactc cagcctgagt gacagagcga 9120
gactcctgtc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagatacagg ttaagtgtta tggtagttga 9180
agagagaact caaactctgt ctcagaagcc tcacttgcat gtggaccact gatatgaaat 9240
aatataaata ggtataattc aataaatagg aacttcagtt ttaatcatcc caaacaccaa 9300
aacttcctat caaacaggtc caataaactc aatctctata agagctagac agaaatctac 9360 10
ttggtggcct ataatcttat tagcccttac ttgtcccatc tgatattaat taaccccatc 9420
taatatggat tagttaacaa tccagtggct gctttgacag gaacagttgg agagagttgg 9480
ggattgcaac atattcaatt atacaaaaat gcattcagca tctaccttga ttaaggcagt 9540
gtgcaacaga atttgcagga gagtaaaaga atgattataa atttacaacc cttaaagagc 9600
tatagctggg cgtggtggct catgcctgta aatcccagca ctttgggagg ctgaggcggg 9660 15
tggatcacct gaggccagaa gttcaagacc agcctagcca acatggcgaa accctgtctc 9720
tacaaaaaat acaaaaatta gccgggtgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagttacttg 9780
ggaggccgag gcaggagaat cgcttgaacc taggaggtgg aggctgcagt gagccgagat 9840
tgtgccactg cactccactt cagcctgggc gacaagagca agactccgtc acaaaaaaaa 9900
aaaaaaaaaa aaagcttaaa atctagtggg aaaggcatat atacatacaa ctaactgtat 9960 20
agcataataa agctcataat ctgtaacaaa atctaattcg acaagcccag aaacttgtga 10020
tttaccaaaa acagttatat atacacaaaa agtaaaccta gaacccaaag ttacccagca 10080
ccaatgattc tctccctaag cagtatcaag tttaaagcag tgattacatt ctactgccta 10140
gattgtaaac tgagtaaagg agaccagcac ctttctgcta ctgaactagc acagccgtgt 10200
aaaccaacaa ggcaatggca gtgcccaact ttctgtatga atataagtta catctgtttt 10260 25
attatttgtg acttggtgtt gcatgtggtt attatcaaca ccttctgaaa gaacaactac 10320
ctgctcaggc tgccataaca aaataccaca gactgagtga cttaacagaa acttatttct 10380
cacagttttg gaggctggga agtccaaaat taaggtacct gcaaggtagg tttcaatctc 10440
aggcctcttc tttggcttga aggtcttcta actgtgtgct cacatgacct cttctaacaa 10500
gctctctggt gtctcttttt tttttttttt cttttttgag acagagtctc actctgtcac 10560 30
ccaggctgga gtacagtggc acaatctggg ctcactgcaa cctccaactc ccgggttcaa 10620
gtgattctca tgcctcaccc tcccgagtag cttggatgac aggagcccgc taccacaccc 10680
agctaatttt tgtattttta gtagagatgg tgtttcacta cattggccag gctggtctca 10740
aactcctgac ctcgtgatcc acccaccttg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggtgtg 10800
agccactgcg cccgtcctgg tgtcttttca tataagggca ctaatccaat cagacctggg 10860 35
cccggcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg 10920
gccgctctag aactagtgga tcgggcccga gctctcgcga ccgggctgca ggaattcgat 10980
cgcgtgctag ctgcgctgtc ggggccaggc cgggctccca gtggattcgc gggcacagac 11040
gcccaggacc gcgcttccca cgtggcggag ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc 11100
cttcaccttc cagctccgcc tcctccgcgc ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg 11160
tccccggccc agccccctcc gggccctccc agcccctccc cttcctttcc gcggccccgc 11220 5
cctctcctcg cggcgcgagt ttcaggcagc gctgcgtcct gctgcgcacg tgggaagccc 11280
tggcctggcg gatgtgtgac atacacgacg ccaaaagatt ttgttccagc tcctgccacc 11340
tccgctacgc gagagattaa ccacccacga tggccgccaa agtgcatgtt gatattgagg 11400
ctgacagccc attcatcaag tctttgcaga aggcatttcc gtcgttcgag gtggagtcat 11460
tgcaggtcac accaaatgac catgcaaatg ccagagcatt ttcgcacctg gctaccaaat 11520 10
tgatcgagca ggagactgac aaagacacac tcatcttgga tatcggcagt gcgccttcca 11580
ggagaatgat gtctacgcac aaataccact gcgtatgccc tatgcgcagc gcagaagacc 11640
ccgaaaggct cgtatgctac gcaaagaaac tggcagcggc ctccgggaag gtgctggata 11700
gagagatcgc aggaaaaatc accgacctgc agaccgtcat ggctacgcca gacgctgaat 11760
ctcctacctt ttgcctgcat acagacgtca cgtgtcgtac ggcagccgaa gtggccgtat 11820 15
accaggacgt gtatgctgta catgcaccaa catcgctgta ccatcaggcg atgaaaggtg 11880
tcagaacggc gtattggatt gggtttgaca ccaccccgtt tatgtttgac gcgctagcag 11940
gcgcgtatcc aacctacgcc acaaactggg ccgacgagca ggtgttacag gccaggaaca 12000
taggactgtg tgcagcatcc ttgactgagg gaagactcgg caaactgtcc attctccgca 12060
agaagcaatt gaaaccttgc gacacagtca tgttctcggt aggatctaca ttgtacactg 12120 20
agagcagaaa gctactgagg agctggcact taccctccgt attccacctg aaaggtaaac 12180
aatcctttac ctgtaggtgc gataccatcg tatcatgtga agggtacgta gttaagaaaa 12240
tcactatgtg ccccggcctg tacggtaaaa cggtagggta cgccgtgacg tatcacgcgg 12300
agggattcct agtgtgcaag accacagaca ctgtcaaagg agaaagagtc tcattccctg 12360
tatgcaccta cgtcccctca accatctgtg atcaaatgac tggcatacta gcgaccgacg 12420 25
tcacaccgga ggacgcacag aagttgttag tgggattgaa tcagaggata gttgtgaacg 12480
gaagaacaca gcgaaacact aacacgatga agaactatct gcttccgatt gtggccgtcg 12540
catttagcaa gtgggcgagg gaatacaagg cagaccttga tgatgaaaaa cctctgggtg 12600
tccgagagag gtcacttact tgctgctgct tgtgggcatt taaaacgagg aagatgcaca 12660
ccatgtacaa gaaaccagac acccagacaa tagtgaaggt gccttcagag tttaactcgt 12720 30
tcgtcatccc gagcctatgg tctacaggcc tcgcaatccc agtcagatca cgcattaaga 12780
tgcttttggc caagaagacc aagcgagagt taatacctgt tctcgacgcg tcgtcagcca 12840
gggatgctga acaagaggag aaggagaggt tggaggccga gctgactaga gaagccttac 12900
cacccctcgt ccccatcgcg ccggcggaga cgggagtcgt cgacgtcgac gttgaagaac 12960
tagagtatca cgcaggtgca ggggtcgtgg aaacacctcg cagcgcgttg aaagtcaccg 13020 35
cacagccgaa cgacgtacta ctaggaaatt acgtagttct gtccccgcag accgtgctca 13080
agagctccaa gttggccccc gtgcaccctc tagcagagca ggtgaaaata ataacacata 13140
acgggagggc cggcggttac caggtcgacg gatatgacgg cagggtccta ctaccatgtg 13200
gatcggccat tccggtccct gagtttcaag ctttgagcga gagcgccact atggtgtaca 13260
acgaaaggga gttcgtcaac aggaaactat accatattgc cgttcacgga ccgtcgctga 13320
acaccgacga ggagaactac gagaaagtca gagctgaaag aactgacgcc gagtacgtgt 13380 5
tcgacgtaga taaaaaatgc tgcgtcaaga gagaggaagc gtcgggtttg gtgttggtgg 13440
gagagctaac caaccccccg ttccatgaat tcgcctacga agggctgaag atcaggccgt 13500
cggcaccata taagactaca gtagtaggag tctttggggt tccgggatca ggcaagtctg 13560
ctattattaa gagcctcgtg accaaacacg atctggtcac cagcggcaag aaggagaact 13620
gccaggaaat agttaacgac gtgaagaagc accgcgggaa ggggacaagt agggaaaaca 13680 10
gtgactccat cctgctaaac gggtgtcgtc gtgccgtgga catcctatat gtggacgagg 13740
ctttcgcttg ccattccggt actctgctgg ccctaattgc tcttgttaaa cctcggagca 13800
aagtggtgtt atgcggagac cccaagcaat gcggattctt caatatgatg cagcttaagg 13860
tgaacttcaa ccacaacatc tgcactgaag tatgtcataa aagtatatcc agacgttgca 13920
cgcgtccagt cacggccatc gtgtctacgt tgcactacgg aggcaagatg cgcacgacca 13980 15
acccgtgcaa caaacccata atcatagaca ccacaggaca gaccaagccc aagccaggag 14040
acatcgtgtt aacatgcttc cgaggctggg caaagcagct gcagttggac taccgtggac 14100
acgaagtcat gacagcagca gcatctcagg gcctcacccg caaaggggta tacgccgtaa 14160
ggcagaaggt gaatgaaaat cccttgtatg cccctgcgtc ggagcacgtg aatgtactgc 14220
tgacgcgcac tgaggatagg ctggtgtgga aaacgctggc cggcgatccc tggattaagg 14280 20
tcctatcaaa cattccacag ggtaacttta cggccacatt ggaagaatgg caagaagaac 14340
acgacaaaat aatgaaggtg attgaaggac cggctgcgcc tgtggacgcg ttccagaaca 14400
aagcgaacgt gtgttgggcg aaaagcctgg tgcctgtcct ggacactgcc ggaatcagat 14460
tgacagcaga ggagtggagc accataatta cagcatttaa ggaggacaga gcttactctc 14520
cagtggtggc cttgaatgaa atttgcacca agtactatgg agttgacctg gacagtggcc 14580 25
tgttttctgc cccgaaggtg tccctgtatt acgagaacaa ccactgggat aacagacctg 14640
gtggaaggat gtatggattc aatgccgcaa cagctgccag gctggaagct agacatacct 14700
tcctgaaggg gcagtggcat acgggcaagc aggcagttat cgcagaaaga aaaatccaac 14760
cgctttctgt gctggacaat gtaattccta tcaaccgcag gctgccgcac gccctggtgg 14820
ctgagtacaa gacggttaaa ggcagtaggg ttgagtggct ggtcaataaa gtaagagggt 14880 30
accacgtcct gctggtgagt gagtacaacc tggctttgcc tcgacgcagg gtcacttggt 14940
tgtcaccgct gaatgtcaca ggcgccgata ggtgctacga cctaagttta ggactgccgg 15000
ctgacgccgg caggttcgac ttggtctttg tgaacattca cacggaattc agaatccacc 15060
actaccagca gtgtgtcgac cacgccatga agctgcagat gcttggggga gatgcgctac 15120
gactgctaaa acccggcggc atcttgatga gagcttacgg atacgccgat aaaatcagcg 15180 35
aagccgttgt ttcctcctta agcagaaagt tctcgtctgc aagagtgttg cgcccggatt 15240
gtgtcaccag caatacagaa gtgttcttgc tgttctccaa ctttgacaac ggaaagagac 15300
cctctacgct acaccagatg aataccaagc tgagtgccgt gtatgccgga gaagccatgc 15360
acacggccgg gtgtgcacca tcctacagag ttaagagagc agacatagcc acgtgcacag 15420
aagcggctgt ggttaacgca gctaacgccc gtggaactgt aggggatggc gtatgcaggg 15480
ccgtggcgaa gaaatggccg tcagccttta agggagcagc aacaccagtg ggcacaatta 15540 5
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cgactgaagc ggaaggggac cgcgaattgg ccgctgtcta ccgggcagtg gccgccgaag 15660
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cgctacccag tttgcagtcg tgtgacatcg actcgatcta cgagccaatg gctcccatag 16500
tagtgacggc tgacgtacac cctgaacccg caggcatcgc ggacctggcg gcagatgtgc 16560
accctgaacc cgcagaccat gtggacctcg agaacccgat tcctccaccg cgcccgaaga 16620
gagctgcata ccttgcctcc cgcgcggcgg agcgaccggt gccggcgccg agaaagccga 16680
cgcctgcccc aaggactgcg tttaggaaca agctgccttt gacgttcggc gactttgacg 16740 25
agcacgaggt cgatgcgttg gcctccggga ttactttcgg agacttcgac gacgtcctgc 16800
gactaggccg cgcgggtgca tatattttct cctcggacac tggcagcgga catttacaac 16860
aaaaatccgt taggcagcac aatctccagt gcgcacaact ggatgcggtc caggaggaga 16920
aaatgtaccc gccaaaattg gatactgaga gggagaagct gttgctgctg aaaatgcaga 16980
tgcacccatc ggaggctaat aagagtcgat accagtctcg caaagtggag aacatgaaag 17040 30
ccacggtggt ggacaggctc acatcggggg ccagattgta cacgggagcg gacgtaggcc 17100
gcataccaac atacgcggtt cggtaccccc gccccgtgta ctcccctacc gtgatcgaaa 17160
gattctcaag ccccgatgta gcaatcgcag cgtgcaacga atacctatcc agaaattacc 17220
caacagtggc gtcgtaccag ataacagatg aatacgacgc atacttggac atggttgacg 17280
ggtcggatag ttgcttggac agagcgacat tctgcccggc gaagctccgg tgctacccga 17340 35
aacatcatgc gtaccaccag ccgactgtac gcagtgccgt cccgtcaccc tttcagaaca 17400
cactacagaa cgtgctagcg gccgccacca agagaaactg caacgtcacg caaatgcgag 17460
aactacccac catggactcg gcagtgttca acgtggagtg cttcaagcgc tatgcctgct 17520
ccggagaata ttgggaagaa tatgctaaac aacctatccg gataaccact gagaacatca 17580
ctacctatgt gaccaaattg aaaggcccga aagctgctgc cttgttcgct aagacccaca 17640
acttggttcc gctgcaggag gttcccatgg acagattcac ggtcgacatg aaacgagatg 17700 5
tcaaagtcac tccagggacg aaacacacag aggaaagacc caaagtccag gtaattcaag 17760
cagcggagcc attggcgacc gcttacctgt gcggcatcca cagggaatta gtaaggagac 17820
taaatgctgt gttacgccct aacgtgcaca cattgtttga tatgtcggcc gaagactttg 17880
acgcgatcat cgcctctcac ttccacccag gagacccggt tctagagacg gacattgcat 17940
cattcgacaa aagccaggac gactccttgg ctcttacagg tttaatgatc ctcgaagatc 18000 10
taggggtgga tcagtacctg ctggacttga tcgaggcagc ctttggggaa atatccagct 18060
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tctccgacaa gctgatggcg gagaggtgcg cgtcgtgggt caacatggag gtgaagatca 18300 15
ttgacgctgt catgggcgaa aaacccccat atttttgtgg gggattcata gtttttgaca 18360
gcgtcacaca gaccgcctgc cgtgtttcag acccacttaa gcgcctgttc aagttgggta 18420
agccgctaac agctgaagac aagcaggacg aagacaggcg acgagcactg agtgacgagg 18480
ttagcaagtg gttccggaca ggcttggggg ccgaactgga ggtggcacta acatctaggt 18540
atgaggtaga gggctgcaaa agtatcctca tagccatggc caccttggcg agggacatta 18600 20
aggcgtttaa gaaattgaga ggacctgtta tacacctcta cggcggtcct agattggtgc 18660
gttaatacac agaattctga ttggatctcg aggtcgacgg tatcgataag cttgggctgc 18720
aggtcgatcg actctagagg atcgatcccc accatgggtc aatcacgcta cctcctcttt 18780
ttggccaccc ttgccctcct aaaccacctc agtttggcca gggtcattcc agtctctgga 18840
cctgccaggt gtcttagcca gtcccgaaac ctgctgaaga ccacagatga catggtgaag 18900 25
acggccagag aaaaactgaa acattattcc tgcactgctg aagacatcga tcatgaagac 18960
atcacacggg accaaaccag cacattgaag acctgtttac cactggaact acacaagaac 19020
gagagttgcc tggctactag agagacttct tccacaacaa gagggagctg cctgccccca 19080
cagaagacgt ctttgatgat gaccctgtgc cttggtagca tctatgagga cttgaagatg 19140
taccagacag agttccaggc catcaacgca gcacttcaga atcacaacca tcagcagatc 19200 30
attctagaca agggcatgct ggtggccatc gatgagctga tgcagtctct gaatcataat 19260
ggcgagactc tgcgccagaa acctcctgtg ggagaagcag acccttacag agtgaaaatg 19320
aagctctgca tcctgcttca cgccttcagc acccgcgtcg tgaccatcaa cagggtgatg 19380
ggctatctga gctccgcctg agaattccgc ccctctccct cccccccccc taacgttact 19440
ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata 19500 35
ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt 19560
cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa 19620
gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag 19680
cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca 19740
cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc 19800
aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat 19860 5
tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta 19920
aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat 19980
aatatggcca caaccatggg tcctcagaag ctaaccatct cctggtttgc catcgttttg 20040
ctggtgtctc cactcatggc catgtgggag ctggagaaag acgtttatgt tgtagaggtg 20100
gactggactc ccgatgcccc tggagaaaca gtgaacctca cctgtgacac gcctgaagaa 20160 10
gatgacatca cctggacctc agaccagaga catggagtca taggctctgg aaagaccctg 20220
accatcactg tcaaagagtt tctagatgct ggccagtaca cctgccacaa aggaggcgag 20280
actctgagcc actcacatct gctgctccac aagaaggaaa atggaatttg gtccactgaa 20340
attttaaaaa atttcaaaaa caagactttc ctgaagtgtg aagcaccaaa ttactccgga 20400
cggttcacgt gctcatggct ggtgcaaaga aacatggact tgaagttcaa catcaagagc 20460 15
agtagcagtt cccctgactc tcgggcagtg acatgtggaa tggcgtctct gtctgcagag 20520
aaggtcacac tggaccaaag ggactatgag aagtattcag tgtcctgcca ggaggatgtc 20580
acctgcccaa ctgccgagga gaccctgccc attgaactgg cgttggaagc acggcagcag 20640
aataaatatg agaactacag caccagcttc ttcatcaggg acatcatcaa accagacccg 20700
cccaagaact tgcagatgaa gcctttgaag aactcacagg tggaggtcag ctgggagtac 20760 20
cctgactcct ggagcactcc ccattcctac ttctccctca agttctttgt tcgaatccag 20820
cgcaagaaag aaaagatgaa ggagacagag gaggggtgta accagaaagg tgcgttcctc 20880
gtagagaaga catctaccga agtccaatgc aaaggcggga atgtctgcgt gcaagctcag 20940
gatcgctatt acaattcctc atgcagcaag tgggcatgtg ttccctgcag ggtccgatcc 21000
tagaattcat tgatccacta ggatcccggg taattaattg aattacatcc ctacgcaaac 21060 25
gttttacggc cgccggtggc gcccgcgccc ggcggcccgt ccttggccgt tgcaggccac 21120
tccggtggct cccgtcgtcc ccgacttcca ggcccagcag atgcagcaac tcatcagcgc 21180
cgtaaatgcg ctgacaatga gacagaacgc aattgctcct gctaggcctc ccaaaccaaa 21240
gaagaagaag acaaccaaac caaagccgaa aacgcagccc aagaagatca acggaaaaac 21300
gcagcagcaa aagaagaaag acaagcaagc cgacaagaag aagaagaaac ccggaaaaag 21360 30
agaaagaatg tgcatgaaga ttgaaaatga ctgtatcttc gtatgcggct agccacagta 21420
acgtagtgtt tccagacatg tcgggcaccg cactatcatg ggtgcagaaa atctcgggtg 21480
gtctgggggc cttcgcaatc ggcgctatcc tggtgctggt tgtggtcact tgcattgggc 21540
tccgcagata agttagggta ggcaatggca ttgatatagc aagaaaattg aaaacagaaa 21600
aagttagggt aagcaatggc atataaccat aactgtataa cttgtaacaa agcgcaacaa 21660 35
gacctgcgca attggccccg tggtccgcct cacggaaact cggggcaact catattgaca 21720
cattaattgg caataattgg aagcttacat aagcttaatt cgacgaataa ttggattttt 21780
attttatttt gcaattggtt tttaatattt ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 21840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aactagatcc tcgaatcaag 21900
cttatcgata ccgtcgacta gagtcggggc ggccggccgc ttcgagcaga catgataaga 21960
tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 22020 5
gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 22080
aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa 22140
agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaaa atcgataagg atctcgacct cgaggggggg 22200
cccggtaccc aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgcccctgca gggggccctg 22260
taccgggctc tgcctgaggc tctggctgcc cagcaggctg aagctggggt tgttggccag 22320 10
gggcacttgt gttcccatcg cagcgggcac ttgtgcctcc caatcagatg gcctctgaag 22380
gcaggcctgg ccagaaggtg agtgctgctg aacgctatta tccacttggc tgaggggtgt 22440
tttccccgaa actgctgtgg tcacagctgc tgccgctgtg acccatgcag cattgttgaa 22500
cgcagtgggc attcttggca cactaggccg tctgagctgg tggggactca aggactgggt 22560
gcccagggag ctgggacaga acccaggcag gggcacttct ggtggggtgg ccttggggct 22620 15
ctgcatatgc tggcagacag agtcaagtct gcccagggga gtctggcctg agtgtgagag 22680
gatgggacac tgggggctgg aggtgaaaat tccttgccgc ttccccagag ttggtgagat 22740
cactcccatg ccctcgcagc tctggtgcct ggtgagtggg atcattcctg gactcagatt 22800
gttctgaaga agcccagttc tgggtggcat caagtgcttg ctagatgggg ggcttgcctt 22860
gatccggcta cacttggagg tgacttgttc ttggacggct acatacagaa agagagaagt 22920 20
ggggatgagt tccaaaggca tcctcgactt cggctgtggc caccggaggg tagctcctgg 22980
cccaacacgg acttctcacc tcccgccctt ggctctctac tgagctcccc cctgctcccc 23040
aattcctcgc cattcccctc atttctctgc cctcagcctg gactgcagtt cttctgggaa 23100
gctgccccaa ctccctaggt ctgtgctcac caagagcaga tcacactgga ctgaaatgcc 23160
agctgatttg tctcttcaag aaaattggaa gctcctggag gtcagggtcc atgtctgctt 23220 25
ttacactcag tgctctgtat gcaggcctgg cactgcccac cctttgacag gtggtgcata 23280
ttttgtagaa ggaaggaagg ggccaggtgg ggtgggctgg gctggtggcg ggagctagct 23340
cagcctctta gattctctac ccgatggatg tgacctggga cagcaagtga gtgtggtgag 23400
tgagtgcaga cggtgctttg ttcccctctt gtctcatagc ctagatggcc tctgagccca 23460
gatctggggc tcagacaaca tttgttcaac tgaacggtaa tgggtttcct ttctgaaggc 23520 30
tgaaatctgg gagctgacat tctggactcc ctgagttctg aagagcctgg ggatggagag 23580
acacggagca gaagatggaa ggtagagtcc caggtgccta agatggggaa tacatctccc 23640
ctcattgtca tgagagtcca ctctagctga tatctactgt ggccaatatc taccggtact 23700
tttttggggt ggacactgag tcatgcagca gtcttatggt ttacccaagg tcaggtaggg 23760
gagacagtgc agtcagagca caagcccagt gtgtctgacc cacccaagaa tccatgctcg 23820 35
tatctacaaa aatgattttt tctcttgtaa tggtgcctag gttcttttat tatcatggca 23880
tgtgtatgtt tttcaactag gttacaatct ggccttataa ggttaacctc ctggaggcca 23940
ccagccttcc tgaaacttgt ctgtgctgtc cctgcaactg gagtgtgcct gatgtggcac 24000
tccagcctgg acaagtggga cacagactcc gctgttatca ggcccaaaga tgtcttccat 24060
aagaccagaa gagcaatggt gtagaggtgt catgggctac aataaagatg ctgacctcct 24120
gtctgagggc aagcagcctc ttctggccct cagacaaatg ctgagtgttc ccaagactac 24180 5
cctcggcctg gtccaatctc atcccactgg tgcgtaaggg ttgctgaact catgacttct 24240
tggctagcct gcaacctcca cggagtggga actacatcag gcattttgct aactgctgta 24300
tcctaggcca ataaatgttg atcacattta tagctgccat ggtagggtgg ggacccctgc 24360
tatctatctg tggaggctct gggagcccct gacacaaact ttctgaagca gagcctcccc 24420
aacccctttt ccattcccta tacctgacag atggcccagg aacccattag aaatggaagg 24480 10
tcactgcagc agtatgtgaa tgtgcgtgtg ggagaagggc aggatcagag ccctgggggt 24540
gtggcagccc ccaagtgatt ctaatccaga tcctagggtt gtttccctgt cccattgaaa 24600
tagctgcttt aaggggcctg actcagggaa atcagtctct tgaattaagt ggtgattttg 24660
gagtcattta gaccaggcct tcaattggga tcctgctctt agagttggat gaattattta 24720
actgattttc agatctcctc tttctcaatg ctttcagaag cacagtaact gcttactctg 24780 15
aaatgaattc tcaccccact tccacatatg caccccttgc ccaccccttt gggaacactg 24840
gccttaactg cttaccttca aatggactca tctgttggga gatatatgca ttctgccgtt 24900
caggggtcat tgccataaga cctgatctct gttcctcttg ctaaacagaa gatgaaaaag 24960
acaaattaga ttacagctac caattaataa ttagccttag gatcgctgcg tggggaccta 25020
ggacttggct ttggtgcagc agaaagcatg aataaacaca ccagcataca ctcgcatgca 25080 20
tgccccaccc tctcgagcaa aattccacag gtataaataa agtaagattc tgcacctggg 25140
ttaaaaacac aactgcaaca gcatagaatg gggcaggaga gacagaactt aatagcaaga 25200
gcacacagaa aaaagtttta ggcattttgg atgtccatct gctcaggatg ggtcagcagt 25260
gagatgcggt caccaaaaga acaaatgtaa cattaggctg cattaataga agcagagtat 25320
gtagaaggag ggaggtgaca gtcctatgct aactctgcct tggccagact atacccacag 25380 25
gagtctgggc atgccagtct cagggagacc cagacagact ggctgcattc agaggatggt 25440
aagtaatgag agtggggatt ggacttcaaa ctacccagac aaagaatggc tgagcaagcc 25500
aaggatgctg tggctggggc agagcagact gtgggctatg tagtggtgga tacctagcct 25560
ctgcagggct gtcataggga aaggacattg agaagaggac tgaggcttgt tcctggtggt 25620
cctggcatga acggccagat gatcacatgg tcaggtggac acagtctcca acactgggag 25680 30
tagccaaaca cttactgcca acctcccgcc cttctcctga ctagttgcag cataggcaat 25740
tgggaggagc ttcctgtctc catctgaaag ctggctgggt gggcaggggg aggagcgagc 25800
caagtttcaa ggccgcagtt tcagcactca gtctgggatc ggctcaagga gcaaagggga 25860
agaacatagc caggagggaa taacatgaag gcccccagac ccagaaaagg catgacttgc 25920
tctgagaccc tcagccggtt ggtgtcaggt tgtgactcgg atccaggtct gactcccagt 25980 35
ccagtgcttg aagcctcacc ccacacagtg aggggagccc ggccatctct gctcaactgc 26040
tgccatctct ctccccttct caaccaccaa ggcagctctg tctgggagca caagctccaa 26100
gtccactttc tggtctgtgt cccccccaag atgccagagg acttgcctct acaacacggg 26160
ctgcccgtgc agtgcctgct tttccagcaa agggcttctg ggaacccttc tctgcactca 26220
gtggggctgg tgggagtggg gcggggtagc gacccagtgc ttgggactgt gcccagctct 26280
caggcctggc agcagttcct ggccttggtt cctgccaagg cagagaggac aaacacatgg 26340 5
caccgggaag actacaccag aagcgattcc accagactgg ggtttgcttt tctatcccgc 26400
ccttagcctg cttcctgtcc tggtccctgc ctccccctcc actggagctg ccgtgtgggc 26460
agtgaggggc tgtttctcag ctgccctatg gagctgccct ctccctgcca aagcattggc 26520
aaggcggcaa ggggtggggg tggggatggg gggtgggatc tgccttctca agctctcatt 26580
atactgagca cgtctcaccc attattttat gtcatctagc aacaccccat gtggacactg 26640 10
aggagcatgg gggtcacatg accactgccc aaggccacac catccggatc tgcctgagat 26700
ggtcagggtt ggcagccatt tctgaaggca gtcctttcgc tttggctctt cttgtaccag 26760
tctcaggaca tcagggcaga agatctacag tccccagctt actgatgtga cagcagaggc 26820
tcagagaggt taaatgactt gcccaaggtg acacggctaa gaagtacagt atctcctaac 26880
tgcagaccag gtgcttctgc tgcttctggg gacagattcc tgcgtggctg gctaggtcta 26940 15
aacggtcctt aactccatcc ccaccggttg ctgcattagt ttcatcaaat aacacagttg 27000
tacagaggta ggggttcagg ggcaggggca gatggaggct ggagagtgtg actaaggaaa 27060
cagcagggga agtgcggtaa agtccgaagg gagggacgga aagagaaagc caagcccagg 27120
ggcgtgccag acaaaaggaa aggccacgcc ggggcagggc aggcttcagc gggtgctggg 27180
gcgtcttcat cccgggaagc acacattcca gaggaccccg gagtctaatg gaaaagctgg 27240 20
ccagcctatc actatggaaa ctgccaaggc cacacagcgc tgctgacacc cagcctgggt 27300
gccggtggcc agctctgcag gatcttcaag tctggggtgc caccagcaag cgacggtcct 27360
ccatgggctc ttcaccttac ggcagtgtcc agaggcaccg ccagtcctct gctcctatgc 27420
tggtcctgct gtccctggca aaaggagcca gagcattctc tccaggcctc ccgaggaggc 27480
tgcttccttt gttttgcaga tggaggctcc catcctttgt tctgaatcaa tgtgctccaa 27540 25
agataagccc caagaaaaca gttgttgcct tttgacactg acaattagaa tcgttggaaa 27600
atggagaaaa caggaaatgg caaatggttt cagtgaccag gaggaaaccg tgcctgaaag 27660
ttgctgctta gtgactggga cactcgcttt ctgctctctt atgaaggaca gcctaggccg 27720
tgtggccttt tataaacaaa gctatgaagg ggtcgtcaaa ttttctaggg ctgcaactgt 27780
ggcactacgt cctgttgtgc caggtgacac tgacaagcag cactgagttc tatgcaagcc 27840 30
caggtgtgct tctctcatgg tgacccccag agaactaagg cccagctctt cctctgtcac 27900
acccctccca gcccccactg tcagacaagg gaccacattc acagacagtc tcagccaaga 27960
tggcaacctt ggaagtcctg gggatgcctt tctagaagct cgcgccccta ggggccggcc 28020
ttaattaaat caagcttatc gataccgtcg agacctcgag ggggggcatc actccgccct 28080
aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac tccaccccct 28140 35
cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatgtt t 28191
<210> 11
<211> 5844
<212> DNA
<213> Plásmido
<220> 5
<221> MCS
<222> (1)..(25)
<223> Sitio múltiple de clonaje
<220>
<221> AFP enhancer 10
<222> (26)..(820)
<223> Potenciador AFP
<220>
<221> AFP pro
<222> (828)..(1054) 15
<223> Promotor AFP
<400> 11
ggtaccgagc tcttacgcgt gctagaattc gcctgtcata cagctaataa ttgaccataa 60
gacaattaga tttaaattag ttttgaatct ttctaatacc aaagttcagt ttactgttcc 120
atgttgcttc tgagtggctt cacagactta tgaaaaagta aacggaatca gaattacatc 180 20
aatgcaaaag cattgctgtg aactctgtac ttaggactaa actttgagca ataacacaca 240
tagattgagg attgtttgct gttagcatac aaactctggt tcaaagctcc tctttattgc 300
ttgtcttgga aaatttgctg ttcttcatgg tttctctttt cactgctatc tatttttctc 360
aaccactcac atggctacaa taactgtctg caagcttatg attcccaaat atctatctct 420
agcctcaatc ttgttccaga agataaaaag tagtattcaa atgcacatca acgtctccac 480 25
ttggagggct taaagacgtt tcaacataca aaccggggag ttttgcctgg aatgtttcct 540
aaaatgtgtc ctgtagcaca tagggtcctc ttgttcctta aaatctaatt acttttagcc 600
cagtgctcat cccacctatg gggagatgag agtgaaaagg gagcctgatt aataattaca 660
ctaagtcaat aggcatagag ccaggactgt ttgggtaaac tggtcacttt atcttaaact 720
aaatatatcc aaaactgaac atgtacttag ttactaagtc tttgacttta tctcattcat 780 30
accactcagc tttatccagg ccacttattt gacagtctag ctagccccta gattttctgc 840
cccaaagagc tctgtgtcct tgaacataaa atacaaataa ccgctatgct gttaattatt 900
ggcaaatgtc ccattttcaa cctaaggaaa taccataaag taacagatat accaacaaaa 960
ggttactagt taacaggcat tgcctgaaaa gagtataaaa gaatttcagc atgattttcc 1020
atattgtgct tccaccactg ccaataacag gatcgggctc gagatctgcg atctaagtaa 1080 35
gcttggcatt ccggtactgt tggtaaagcc accatggaag acgccaaaaa cataaagaaa 1140
ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat ggaaccgctg gagagcaact gcataaggct 1200
atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta cagatgcaca tatcgaggtg 1260
gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg tccgttcggt tggcagaagc tatgaaacga 1320
tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg aaaactctct tcaattcttt 1380
atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg cgcccgcgaa cgacatttat 1440 5
aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc atttcgcagc ctaccgtggt gttcgtttcc 1500
aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaagc tcccaatcat ccaaaaaatt 1560
attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt cgatgtacac gttcgtcaca 1620
tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtgc cagagtcctt cgatagggac 1680
aagacaattg cactgatcat gaactcctct ggatctactg gtctgcctaa aggtgtcgct 1740 10
ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc tcgcatgcca gagatcctat ttttggcaat 1800
caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat tccatcacgg ttttggaatg 1860
tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg tcttaatgta tagatttgaa 1920
gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat tacaagattc aaagtgcgct gctggtgcca 1980
accctattct ccttcttcgc caaaagcact ctgattgaca aatacgattt atctaattta 2040 15
cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc tctaaggaag tcggggaagc ggttgccaag 2100
aggttccatc tgccaggtat caggcaagga tatgggctca ctgagactac atcagctatt 2160
ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg gtaaagttgt tccatttttt 2220
gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg gcgttaatca aagaggcgaa 2280
ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc ggttatgtaa acaatccgga agcgaccaac 2340 20
gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca tagcttactg ggacgaagac 2400
gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag tctctgatta agtacaaagg ctatcaggtg 2460
gctcccgctg aattggaatc catcttgctc caacacccca acatcttcga cgcaggtgtc 2520
gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg ccgttgttgt tttggagcac 2580
ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg ccagtcaagt aacaaccgcg 2640 25
aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac cgaaaggtct taccggaaaa 2700
ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc ataaaggcca agaagggcgg aaagatcgcc 2760
gtgtaattct agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat 2820
gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt 2880
gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat 2940 30
tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa 3000
aacctctaca aatgtggtaa aatcgataag gatccgtcga ccgatgccct tgagagcctt 3060
caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac 3120
tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc gcttcctcgc 3180
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 3240 35
cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 3300
gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 3360
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 3420
gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3480
ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3540
aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3600 5
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3660
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3720
gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3780
ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3840
ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3900 10
agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3960
ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 4020
aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 4080
tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 4140
cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 4200 15
tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 4260
cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 4320
ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 4380
gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 4440
gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 4500 20
gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 4560
gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 4620
tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 4680
aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 4740
cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 4800 25
caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 4860
cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 4920
ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 4980
aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 5040
tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 5100 30
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 5160
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 5220
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 5280
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 5340
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 5400 35
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 5460
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 5520
cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcccattc gccattcagg ctgcgcaact 5580
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagcccaag ctaccatgat 5640
aagtaagtaa tattaaggta cgggaggtac ttggagcggc cgcaataaaa tatctttatt 5700
ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gtactaacat acgctctcca 5760 5
tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg caagtgcagg 5820
tgccagaaca tttctctatc gata 5844
<210> 12
<211> 2334
<212> DNA 10
<213> Mus musculus
<400> 12
tcgaggtcga cggtatcgat aagcttgggc tgcaggtcga tcgactctag aggatcgatc 60
cccaccatgg gtcaatcacg ctacctcctc tttttggcca cccttgccct cctaaaccac 120
ctcagtttgg ccagggtcat tccagtctct ggacctgcca ggtgtcttag ccagtcccga 180 15
aacctgctga agaccacaga tgacatggtg aagacggcca gagaaaaact gaaacattat 240
tcctgcactg ctgaagacat cgatcatgaa gacatcacac gggaccaaac cagcacattg 300
aagacctgtt taccactgga actacacaag aacgagagtt gcctggctac tagagagact 360
tcttccacaa caagagggag ctgcctgccc ccacagaaga cgtctttgat gatgaccctg 420
tgccttggta gcatctatga ggacttgaag atgtaccaga cagagttcca ggccatcaac 480 20
gcagcacttc agaatcacaa ccatcagcag atcattctag acaagggcat gctggtggcc 540
atcgatgagc tgatgcagtc tctgaatcat aatggcgaga ctctgcgcca gaaacctcct 600
gtgggagaag cagaccctta cagagtgaaa atgaagctct gcatcctgct tcacgccttc 660
agcacccgcg tcgtgaccat caacagggtg atgggctatc tgagctccgc ctgagaattc 720
cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 780 25
tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 840
cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 900
ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 960
caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 1020
ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 1080 30
cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 1140
aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 1200
tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 1260
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat gggtcctcag 1320
aagctaacca tctcctggtt tgccatcgtt ttgctggtgt ctccactcat ggccatgtgg 1380 35
gagctggaga aagacgttta tgttgtagag gtggactgga ctcccgatgc ccctggagaa 1440
acagtgaacc tcacctgtga cacgcctgaa gaagatgaca tcacctggac ctcagaccag 1500
agacatggag tcataggctc tggaaagacc ctgaccatca ctgtcaaaga gtttctagat 1560
gctggccagt acacctgcca caaaggaggc gagactctga gccactcaca tctgctgctc 1620
cacaagaagg aaaatggaat ttggtccact gaaattttaa aaaatttcaa aaacaagact 1680
ttcctgaagt gtgaagcacc aaattactcc ggacggttca cgtgctcatg gctggtgcaa 1740 5
agaaacatgg acttgaagtt caacatcaag agcagtagca gttcccctga ctctcgggca 1800
gtgacatgtg gaatggcgtc tctgtctgca gagaaggtca cactggacca aagggactat 1860
gagaagtatt cagtgtcctg ccaggaggat gtcacctgcc caactgccga ggagaccctg 1920
cccattgaac tggcgttgga agcacggcag cagaataaat atgagaacta cagcaccagc 1980
ttcttcatca gggacatcat caaaccagac ccgcccaaga acttgcagat gaagcctttg 2040 10
aagaactcac aggtggaggt cagctgggag taccctgact cctggagcac tccccattcc 2100
tacttctccc tcaagttctt tgttcgaatc cagcgcaaga aagaaaagat gaaggagaca 2160
gaggaggggt gtaaccagaa aggtgcgttc ctcgtagaga agacatctac cgaagtccaa 2220
tgcaaaggcg ggaatgtctg cgtgcaagct caggatcgct attacaattc ctcatgcagc 2280
aagtgggcat gtgttccctg cagggtccga tcctagaatt cattgatcca ctag 2334 15
<210> 13
<211> 2336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13 20
ctgcagacca tgggtccagc gcgcagcctc ctccttgtgg ctaccctggt cctcctggac 60
cacctcagtt tggccagaaa cctccccgtg gccactccag acccaggaat gttcccatgc 120
cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa 180
actctagaat tttacccttg cacttctgaa gagattgatc atgaagatat cacaaaagat 240
aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca ttggagttaa ccaagaatga gagttgccta 300 25
aattccagag agacctcttt cataactaat gggagttgcc tggcctccag aaagacctct 360
tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt tatgaagact tgaagatgta ccaggtggag 420
ttcaagacca tgaatgcaaa gcttctgatg gatcctaaga ggcagatctt tctagatcaa 480
aacatgctgg cagttattga tgagctgatg caggccctga atttcaacag tgagactgtg 540
ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata 600 30
cttcttcatg ctttcagaat tcgggcagtg actattgata gagtgacgag ctatctgaat 660
gcttcctaac tgcagaaggg cgaattccag cacactggcg gccgttacta ggggctgcag 720
gaattccgcc cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga 780
ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa 840
tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc 900 35
tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc 960
ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg 1020
cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa agcggcacaa 1080
ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc 1140
gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 1200
gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc 1260 5
ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaaccat 1320
gggtcaccag cagttggtca tctcttggtt ttccctggtt tttctggcat ctcccctcgt 1380
ggccatatgg gaactgaaga aagatgttta tgtcgtagaa ttggattggt atccggatgc 1440
ccctggagaa atggtggtcc tcacctgtga cacccctgaa gaagatggta tcacctggac 1500
cttggaccag agcagtgagg tcttaggctc tggcaaaacc ctgaccatcc aagtcaaaga 1560 10
gtttggagat gctggccagt acacctgtca caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct 1620
cctgctgctt cacaaaaagg aagatggaat ttggtccact gatattttaa aggaccagaa 1680
agaacccaaa aataagacct ttctaagatg cgaggccaag aattattctg gacgtttcac 1740
ctgctggtgg ctgacgacaa tcagtactga tttgacattc agtgtcaaaa gcagcagagg 1800
ctcttctgac ccccaagggg tgacgtgcgg agctgctaca ctctctgcag agagagtcag 1860 15
aggggacaac aaggagtatg agtactcagt ggagtgccag gaggacagtg cctgcccagc 1920
tgctgaggag agtctgccca ttgaggtcat ggtggatgcc gttcacaagc tcaagtatga 1980
aaactacacc agcagcttct tcatcaggga catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt 2040
gcagctgaag ccattaaaga attctcggca ggtggaggtc agctgggagt accctgacac 2100
ctggagtact ccacattcct acttctccct gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag 2160 20
caagagagaa aagaaagata gagtcttcac ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg 2220
caaaaatgcc agcattagcg tgcgggccca ggaccgctac tatagctcat cttggagcga 2280
atgggcatct gtgccctgca gttagatatc aagcttatcg ataccgtcga cctcga 2336
<210> 14
<211> 3057 25
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 14
atggatcccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 60
cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 120 30
cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gctttgcctg gtttccggca 180
ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc ctgaggccga tactgtcgtc 240
gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca tctacaccaa cgtaacctat 300
cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc cgacgggttg ttactcgctc 360
acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga cgcgaattat ttttgatggc 420 35
gttaactcgg cgtttcatct gtggtgcaac gggcgctggg tcggttacgg ccaggacagt 480
cgtttgccgt ctgaatttga cctgagcgca tttttacgcg ccggagaaaa ccgcctcgcg 540
gtgatggtgc tgcgttggag tgacggcagt tatctggaag atcaggatat gtggcggatg 600
agcggcattt tccgtgacgt ctcgttgctg cataaaccga ctacacaaat cagcgatttc 660
catgttgcca ctcgctttaa tgatgatttc agccgcgctg tactggaggc tgaagttcag 720
atgtgcggcg agttgcgtga ctacctacgg gtaacagttt ctttatggca gggtgaaacg 780 5
caggtcgcca gcggcaccgc gcctttcggc ggtgaaatta tcgatgagcg tggtggttat 840
gccgatcgcg tcacactacg tctgaacgtc gaaaacccga aactgtggag cgccgaaatc 900
ccgaatctct atcgtgcggt ggttgaactg cacaccgccg acggcacgct gattgaagca 960
gaagcctgcg atgtcggttt ccgcgaggtg cggattgaaa atggtctgct gctgctgaac 1020
ggcaagccgt tgctgattcg aggcgttaac cgtcacgagc atcatcctct gcatggtcag 1080 10
gtcatggatg agcagacgat ggtgcaggat atcctgctga tgaagcagaa caactttaac 1140
gccgtgcgct gttcgcatta tccgaaccat ccgctgtggt acacgctgtg cgaccgctac 1200
ggcctgtatg tggtggatga agccaatatt gaaacccacg gcatggtgcc aatgaatcgt 1260
ctgaccgatg atccgcgctg gctaccggcg atgagcgaac gcgtaacgcg aatggtgcag 1320
cgcgatcgta atcacccgag tgtgatcatc tggtcgctgg ggaatgaatc aggccacggc 1380 15
gctaatcacg acgcgctgta tcgctggatc aaatctgtcg atccttcccg cccggtgcag 1440
tatgaaggcg gcggagccga caccacggcc accgatatta tttgcccgat gtacgcgcgc 1500
gtggatgaag accagccctt cccggctgtg ccgaaatggt ccatcaaaaa atggctttcg 1560
ctacctggag agacgcgccc gctgatcctt tgcgaatacg cccacgcgat gggtaacagt 1620
cttggcggtt tcgctaaata ctggcaggcg tttcgtcagt atccccgttt acagggcggc 1680 20
ttcgtctggg actgggtgga tcagtcgctg attaaatatg atgaaaacgg caacccgtgg 1740
tcggcttacg gcggtgattt tggcgatacg ccgaacgatc gccagttctg tatgaacggt 1800
ctggtctttg ccgaccgcac gccgcatcca gcgctgacgg aagcaaaaca ccagcagcag 1860
tttttccagt tccgtttatc cgggcaaacc atcgaagtga ccagcgaata cctgttccgt 1920
catagcgata acgagctcct gcactggatg gtggcgctgg atggtaagcc gctggcaagc 1980 25
ggtgaagtgc ctctggatgt cgctccacaa ggtaaacagt tgattgaact gcctgaacta 2040
ccgcagccgg agagcgccgg gcaactctgg ctcacagtac gcgtagtgca accgaacgcg 2100
accgcatggt cagaagccgg gcacatcagc gcctggcagc agtggcgtct ggcggaaaac 2160
ctcagtgtga cgctccccgc cgcgtcccac gccatcccgc atctgaccac cagcgaaatg 2220
gatttttgca tcgagctggg taataagcgt tggcaattta accgccagtc aggctttctt 2280 30
tcacagatgt ggattggcga taaaaaacaa ctgctgacgc cgctgcgcga tcagttcacc 2340
cgtgcaccgc tggataacga cattggcgta agtgaagcga cccgcattga ccctaacgcc 2400
tgggtcgaac gctggaaggc ggcgggccat taccaggccg aagcagcgtt gttgcagtgc 2460
acggcagata cacttgctga tgcggtgctg attacgaccg ctcacgcgtg gcagcatcag 2520
gggaaaacct tatttatcag ccggaaaacc taccggattg atggtagtgg tcaaatggcg 2580 35
attaccgttg atgttgaagt ggcgagcgat acaccgcatc cggcgcggat tggcctgaac 2640
tgccagctgg cgcaggtagc agagcgggta aactggctcg gattagggcc gcaagaaaac 2700
tatcccgacc gccttactgc cgcctgtttt gaccgctggg atctgccatt gtcagacatg 2760
tataccccgt acgtcttccc gagcgaaaac ggtctgcgct gcgggacgcg cgaattgaat 2820
tatggcccac accagtggcg cggcgacttc cagttcaaca tcagccgcta cagtcaacag 2880
caactgatgg aaaccagcca tcgccatctg ctgcacgcgg aagaaggcac atggctgaat 2940 5
atcgacggtt tccatatggg gattggtggc gacgactcct ggagcccgtc agtatcggcg 3000
gaattccagc tgagcgccgg tcgctaccat taccagttgg tctggtgtca aaaataa 3057
<210> 15
<211> 336
<212> DNA 10
<213> Homo sapiens
<400> 15
ctgcgctgtc ggggccaggc cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gcccaggacc 60
gcgcttccca cgtggcggag ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc 120
cagctccgcc tcctccgcgc ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc 180 15
agccccctcc gggccctccc agcccctccc cttcctttcc gcggccccgc cctctcctcg 240
cggcgcgagt ttcaggcagc gctgcgtcct gctgcgcacg tgggaagccc tggccgatgg 300
gctcgacgca cgtgggcgca cgtgggcgca cgtggg 336
Claims (37)
- REIVINDICACIONES1. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica que comprende al menos los siguientes elementos, orientados en dirección 5’ a 3’:i. una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus; 5ii. una primera secuencia no codificante de relleno;iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido;iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es parcialmente complementaria de un ARN alfaviral, que comprende al menos una secuencia codificante de al menos un gen exógeno de interés, en donde dicha cadena de ADNc comprende: 10a) una secuencia 5’ necesaria para la replicación del alfavirus,b) una secuencia que codifica las proteínas no estructurales requeridas para la replicación del ARN alfaviral,c) al menos un promotor subgenómico del alfavirus, yd) una secuencia 3’ necesaria para la replicación del alfavirus;v. una secuencia de poliadenilación; y 15vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral.
- 2. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 1, que comprende además un elemento vii que es una segunda secuencia no codificante de relleno, entre el elemento v y el elemento vi.
- 3. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 1, en donde el elemento ii es una secuencia no codificante de relleno humana. 20
- 4. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 1 ó 3, en donde el elemento ii es la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana (HPRT).
- 5. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el elemento i tiene la SEQ ID NO: 1.
- 6. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 1, en donde el elemento iii es un 25 promotor específico de tumores.
- 7. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 6, en donde el elemento iii es un promotor específico de tumores seleccionado entre AFP, telomerasa TERT, PAP, E2F y HIF.
- 8. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 1, en donde el elemento iii es un promotor específico de tumores que tiene una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 7, correspondiente a AFP p+e, 30 y SEQ ID NO: 15, correspondiente a telomerasa TERT.
- 9. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el elemento iv comprende una secuencia derivada del virus Semliki Forest (SFV).
- 10. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 1, en donde las secuencias a) a c) del elemento iv en su conjunto tienen una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. 35
- 11. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 1 ó 10, caracterizado porque el elemento iv d) tiene la secuencia SEQ ID NO: 5..
- 12..Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el gen exógeno de interés está seleccionado entre uno o más genes terapéuticos, uno o más genes reporteros, o combinaciones de ellos. 40
- 13. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 12, en donde el gen exógeno de interés es el gen terapéutico interleucina de mamífero IL-12.
- 14. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 12, en donde el gen exógeno de interés es el gen terapéutico interleucina humana hIL-12.
- 15. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 12, en donde el gen exógeno de 45interés es un gen terapéutico seleccionado entre los genes factor estimulante de colonias (GMCSF), interferón-alfa y timidin-kinasa del virus de herpes simple (HSV-TK).
- 16. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 10, en donde el elemento iv comprende en serie uno o varios subconjuntos de (promotor subgenómico + gen exógeno de interés).
- 17. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según la reivindicación 12, en donde el gen exógeno de 5 interés es un gen reportero seleccionado entre LacZ, Luciferasa, timidin kinasa del virus de herpes simple HSV-TK y GFP.
- 18. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en donde el elemento iv forma un replicón funcionalmente controlado por el promotor iii, y en donde el promotor subgenómico alfaviral comprendido en iv.c) controla funcionalmente la expresión del gen exógeno de interés. 10
- 19. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el elemento v es una secuencia de podiladenilación de SV40.
- 20. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el elemento v tiene la secuencia SEQ ID NO: 6.
- 21. Un vector adenoviral de expresión génica según la reivindicación 2, en donde la segunda secuencia no 15 codificante de relleno es C346.
- 22. Un vector adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el elemento vi tiene la secuencia SEQ ID NO: 2.
- 23. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende: 20i. una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus;ii. una primera secuencia no codificante de relleno, que es la región intron de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana (HPRT);iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido, que es el promotor AFP, 25iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es parcialmente complementaria a un ARN alfaviral derivado del virus SFV, que comprende una secuencia que codifica un gen exógeno de interés que es hIL-12 , en donde dicha cadena de ADNc comprende:a) una secuencia 5’ necesaria para la replicación del alfavirus,b) una secuencia que codifica las proteínas no estructurales requeridas para la replicación del ARN alfaviral, 30c) al menos un promotor subgenómico del alfavirus, yd) una secuencia 3’ necesaria para la replicación del alfavirus;v. una secuencia de poliadenilación de SV40,vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral yvii. una segunda secuencia no codificante de relleno, que es C346 genómico humano, colocada entre el elemento v 35 y el elemento vi.
- 24. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:i. una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus; 40ii. una primera secuencia no codificante de relleno, que es la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana (HPRT);iii. una secuencia que corresponde a un promotor específico de tejido, que es el promotor AFP,iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es parcialmente complementaria de un ARN alfaviral derivado del virus SFV, que comprende una secuencia que codifica un gen exógeno de interés, 45 seleccionado entre mIL-12 y LacZ, en donde dicha cadena de ADNc comprende:a) una secuencia 5’ necesaria para la replicación del alfavirus,b) una secuencia que codifica las proteínas no estructurales requeridas para la replicación del ARN alfaviral,c) al menos un promotor subgenómico del alfavirus, yd) una secuencia 3’ necesaria para la replicación del alfavirus;v. una secuencia de poliadenilación de SV40, 5vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral, yvii. una segunda secuencia no codificante de relleno, que es C346 genómico humano, colocada entre el elemento v y el elemento vi.
- 25. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho vector tiene una longitud comprendida entre 27 y 38 kilobases. 10
- 26. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho vector tiene la secuencia SEQ ID NO: 8.
- 27. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en donde dicho vector tiene la secuencia SEQ ID NO: 9.
- 28. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en donde 15 dicho vector tiene la secuencia SEQ ID NO: 10.
- 29. Uso de un vector híbrido adenoviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 anteriores en un procedimiento in vitro para transferir material genético a una célula, en donde dicha célula no es una célula de una línea germinal humana.
- 30. Uso según la reivindicación 29, en donde dicha célula es una célula tumoral. 20
- 31. Uso según la reivindicación 30, en donde dicha célula es una célula tumoral que expresa AFP.
- 32. Uso de un vector híbrido adenoviral definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores .
- 33. Un vector híbrido adenoviral definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para su uso en el tratamiento de tumores. 25
- 34. Uso de un vector híbrido adenoviral definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune contra un antígeno extraño.
- 35. Un vector híbrido adenoviral definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para su uso en la inducción de una respuesta inmune frente a antígenos extraños.
- 36. Una composición farmacéutica, que comprende al menos un vector híbrido adenoviral definido según 30 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
- 37. Una composición farmacéutica, que comprende al menos un vector híbrido adenoviral definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en donde el gen exógeno de interés es hIL-12.
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