ES2357458T3 - Utilización de sondas oligonucleotídicas y procedimiento para la tipificación genómica de los sistemas eritrocitarios. - Google Patents

Abstract

Utilización de por lo menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas modificadas con amino en el extremo 5', caracterizada porque presentan una longitud de secuencia comprendida entre 18 y 20 nucleótidos que contienen en o en la proximidad al centro de la secuencia de la sonda el SNP específico para cada uno de los alelos diana que pertenecen al locus genómico X, seleccionados de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb que pueden hibridar específicamente con cada uno de dichos alelos; estando dichas sondas caracterizadas porque están acopladas a una microesfera marcada con por lo menos una sustancia fluorescente y porque comprenden o están constituidas por lo menos por un conjunto de secuencias de oligonucleótidos indicadas en la siguiente tabla: Sonda Conjunto de sondas Número de conjunto k K NC Kpb Kpa NC Jsb Jsa NC Lua Lub NC s S NC Coa Cob NC Fya Fyb NC Jka Jkb NC TTAACCgAACgCTgAgAC (SEC ID nº:17) TTAACCgAATgCTgAgAC (SEC ID nº: 18) CTATCCCAAAgCTAAggC (SEC ID nº:19) ATCACTTCACggCTgTTCCA (SEC ID nº:20) TCACTTCATggCTgTTCCAg (SEC ID nº:21) AACTCTACAgggCTCTTCgA (SEC ID nº:221 ggCTgCCTCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:23) ggCTgCCCCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:24) gCCAgCCACgCgTgTCACTA (SEC ID nº:25) TCgCCCCCgCCTAgCCTC (SEC ID nº:26) TCgCCCCCACCTAgCCTC (SEC ID nº:27) TAgCCTCCTCCAAgACTA (SEC ID nº:28) TAggAgAAACgggACAACTT (SEC ID nº:29) AggAgAAATgggACAACTTg (SEC ID nº:30) TCggATAAAAgAgACCACTg (SEC ID nº:31) AACCAgACggCggTCCAggA (SEC ID nº:32) CAACCAgACggTggTCCAgg (SEC ID nº:33) AgCCACACTggggACCTggA (SEC ID nº:34) GAgACTATggTgCCAACCTg (SEC ID nº:35) TggAgACTATgATgCCAACC (SEC ID nº:36) GAggCTATCCTgACAAgCTT (SEC ID nº:37) AgTAgATgTCCTCAAATg (SEC ID nº:38) AgTAgATgTTCTCAAATg (SEC ID nº:39) CgTgggATTTCTTCAgAgg (SEC ID nº:40) en la que dichos conjuntos de sondas oligonucleotídicas se utilizan a las temperaturas de hibridación específicas indicadas en la tabla siguiente: Número de conjunto THIBRIDACIÓN 1 45ºC 2 54ºC 3 54ºC 4 45ºC 5 54ºC 6 64ºC 7 54ºC 8 37ºC para la identificación y tipificación de por lo menos un SNP del par alélico X siguiente seleccionado de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para la tipificación genómica de sistemas eritrocitarios, y a la utilización de sondas oligonucleotídicas. Se dan asimismo a conocer kits de diagnóstico relacionados.

La tipificación del grupo sanguíneo se ha realizado tradicionalmente con técnicas de aglutinación utilizando diversos procedimientos tales como tecnología de microplacas de fase sólida/líquida, columnas, tubos y portaobjetos con 5 antisueros comerciales tanto policlonales como monoclonales.

Las diversas técnicas de aglutinación que pueden aplicarse en todos los laboratorios competentes presentan una sensibilidad y especificidad apropiada en la utilización clínica para la mayoría de los casos.

Sin embargo, debido a las limitaciones en la hemaglutinación, resulta habitual en la actualidad en los laboratorios de referencia complementar y apoyar la tipificación serológica del grupo sanguíneo con técnicas moleculares y en muchos 10 casos constituyen el único procedimiento alternativo que puede solucionar los problemas complejos.

Existen diversas aplicaciones en la práctica de la medicina de transfusión.

La mayoría de las aplicaciones clínicas responden apropiadamente a la exigencia de realizar una tipificación correcta del grupo sanguíneo del paciente en un corto periodo de tiempo y en relación con sujetos inmunizados de manera múltiple con patologías autoinmunitarias, con pacientes transfundidos inmediatamente antes de la prueba del grupo 15 sanguíneo y/o pacientes dependientes de transfusión tales como pacientes talasémicos (ref.1 Castilho L. et al. 2002; ref.2 Montalvo L. et al. 2004). En estos casos, la tipificación con procedimientos clásicos podría resultar de difícil aplicación. Para la primera categoría de pacientes, surgen dificultades debido a la presencia de anticuerpos que se adhieren a los eritrocitos que requieren análisis adicionales y diferentes procedimientos de tipificación en la parte del laboratorio para análisis inmunohematológicos, prolongando considerablemente el tiempo de análisis que resulta 20 valioso en situaciones de urgencia. En la segunda categoría de pacientes transfundidos inmediatamente antes de la prueba del grupo sanguíneo, el problema se debe a la presencia de cantidades masivas de eritrocitos transfundidos del donante en la circulación del paciente, imposibilitando la aplicación de los procedimientos clásicos. Por tanto, en este caso, una tipificación correcta del fenotipo de RH del paciente y de otros antígenos de glóbulos rojos comunes (por ejemplo, K/k; Fya/Fyb; Jka/Jkb; S/s) frente a los que el desarrollo de anticuerpos puede presentar un significado clínico 25 relevante, es extremadamente útil para confirmar la naturaleza de los anticuerpos identificados tanto en el suero como adheridos a los eritrocitos y en consecuencia para proporcionar el mejor apoyo a la transfusión posible para el paciente.

Existen otras aplicaciones interesantes de la tipificación molecular de sistema eritrocitarios. Estas incluyen la confirmación y a veces la única fuente de resolución en casos de antígenos con expresión débil tales como el antígeno 30 D (sistema RH) o el antígeno FyX (sistema Duffy); la caracterización de formas nulas; la determinación de D-cigosidad no posible de otra forma y la resolución en casos de variantes de ABO.

Otra aplicación importante se refiere asimismo a la posibilidad de confirmar, con técnicas moleculares, la tipificación de eritrocitos raros de pacientes o donantes de sangre que son negativos para los antígenos de alta incidencia. Una persona que presenta un fenotipo raro puede inmunizarse frente al antígeno restante tras la transfusión, el embarazo y 35 en un menor grado el trasplante de órganos. La inmunización frente a un antígeno de alta incidencia también puede complicar considerablemente la detección de anticuerpos del grupo sanguíneo adicionales. La presencia de anticuerpos que presentan diferentes especificidades hace que el proceso de identificación resulte laborioso y complicado y que el hallazgo de unidades sanguíneas compatibles resulte extremadamente problemático.

La posibilidad de congelar unidades de sangre tipificadas en el momento en el que se necesitan facilita 40 considerablemente el tratamiento del paciente, sin tener que recurrir a la tipificación al azar de un alto número de donantes en condiciones de urgencia, también con el riesgo de no encontrar la unidad compatible. Podrían congelarse y aislarse unidades de sangre poco comunes para pacientes en riesgo. Además, también debe considerarse que las diferencias étnicas entre donante y paciente podrían crear problemas mayores, especialmente si el paciente requiere un régimen de transfusión a largo plazo. 45

Para este fin, la utilización de técnicas moleculares solucionará el problema del alto coste de los antisueros poco comunes y a veces, para algunas especificidades, también resuelve el problema tanto de falta de como de reactividad débil de estos antisueros fácilmente perecederos tales como los antisueros específicos para el sistema Dombrock (ref. 3 Reid et al. 2002).

Una importante ventaja de los métodos de ADN consiste en la posibilidad de obtener una cantidad de ADN útil a partir 50 tanto de sangre periférica, incluso a partir de cantidades mínimas, como de otras fuentes biológicas. Además, si las muestras de ADN se conservan apropiadamente, son estables a lo largo de un periodo de tiempo largo. El trabajo con ADN en medicina de transfusión presenta también la considerable ventaja de no estar limitado porque la muestra deba procesarse inmediatamente tal como requiere la serología clásica.

Se han desarrollado diversas técnicas aplicadas en el campo de la medicina de transfusión para todas estas 55 aplicaciones posibles. En particular, para la genotipificación del grupo sanguíneo, las técnicas más comunes utilizadas en laboratorios de inmunohematología son PCR-RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) y PCR-

SSP (cebadores específicos de secuencia).

Se han desarrollado recientemente nuevos procedimientos tales como PCR-ELISA, PCR en tiempo real, análisis de minisecuenciación de SNP (ref.4 Ferri EG et al., 2006) y tecnología de micromatrices (ref. 5 Denomme G. et al., 2005). Esta última tecnología en particular surge de la necesidad de tipificar un mayor número de muestras con respecto a otras técnicas disponibles que presentaban un bajo rendimiento. 5

Desde luego, el principio de esta técnica no es totalmente nuevo. Las técnicas de transferencia de tipo Southern, por ejemplo, proporcionan el análisis de un gran número de muestras mediante hibridación de fragmentos de ADN pero por medio de electroforesis. La principal diferencia subyace en el tipo de material utilizado como soporte de hibridación; se han reemplazado las membranas de hibridación porosas por un soporte de vidrio o silicio no poroso o microesferas marcadas con fluorescencia (ref. 6 Petrik J. 2001). Estos cambios han permitido que los volúmenes de reactivos se 10 reduzcan considerablemente, mejorando la cinética de hibridación, miniaturizando el proceso completo, aumentando el rendimiento y permitiendo la posibilidad de someter a prueba varios analitos al mismo tiempo en una única reacción. Todos estos cambios revolucionarios reducen considerablemente el tiempo del operario, la laboriosidad y el coste.

En los últimos años se ha desarrollado una variedad de aplicaciones de la tecnología de micromatrices. Esta tecnología se aplica tanto en análisis genéticos como en serología. 15

La tecnología de micromatrices, tal como se aplica en este caso, se caracteriza por una fase de amplificación de la región de ADN diana, seguida por desnaturalización, hibridación con sondas específicas complementarias al polimorfismo diana y detección de fluorescencia y análisis de datos por medio de citometría de flujo tras el marcaje adecuado con ficoeritrina-estreptavidina. Con la tecnología de micromatrices utilizando un soporte de hibridación sólido, es posible tipificar antígenos de los sistemas ABO y RH así como también antígenos de alta incidencia y 20 clínicamente significativos. Esta tecnología también se ha aplicado a la tipificación genómica de antígenos plaquetarios (ref. 7 Beiboer S. et al., 2005). Además, la utilización de técnicas de aglutinación implica alto coste en el caso de examen en masa para antígenos de eritrocitos de alta incidencia con el fin de obtener donantes negativos, ya que la disponibilidad de reactivos de tipificación comerciales es muy limitada, y también la realización de la tipificación con antisueros resulta problemática debido a una escasa fiabilidad. 25

Una de las principales ventajas de las técnicas basadas en ADN es la sustitución de sueros de tipificación por oligonucleótidos sintetizados a bajo coste.

Las nuevas tecnologías parecen dirigirse actualmente a la automatización y simplificación y los nuevos instrumentos se modifican para acelerar el proceso. Este último concepto es descriptivo de dosificaciones de citometría de flujo múltiple basada en microesferas. Mediante el acoplamiento de diversos anticuerpos purificados o sondas oligonucleotídicas con 30 distintos conjuntos de microesferas fluorescentes, es posible obtener sistemas de análisis muy eficaces que permiten la captura de numerosos analitos a partir de una muestra única. La cuantificación aprovecha el potencial resolutivo multiparamétrico de la citometría de flujo y la capacidad de los sistemas de procesamiento de las señales digitales que procesan los miles de señales fluorescentes generadas por las microesferas (ref. 8 Kellar KL et al., 2003; ref. 9 Kettman JR et al., 1998). 35

Más específicamente, las microesferas están constituidas con polímeros sintéticos y cada conjunto de microesferas se caracteriza por una intensidad de fluorescencia específica. Resultan disponibles diversas fuentes comerciales de microesferas fluorescentes tales como Bangs Laboratories (Fishers, IN), Duke Scientific (Palo Alto, CA), Luminex Corporation (Austin, TX), Polysciences (Warrington, PA), Seradyn (Indianapolis, IN) y Sperotech (Libertyville, IL) que ofrecen microesferas con diferentes dimensiones y características de fluorescencia. Luminex Corporation, por ejemplo, 40 produce 100 microesferas que difieren en la intensidad de fluorescencia creada por la incorporación de diferentes razones de dos fluorocromos que emiten a diferentes longitudes de onda (ref. 10 Fulton RF et al., 1997). Se utiliza un citómetro de flujo compacto (Luminex 100) con dos fuentes de láser proyectado para la detección de las microesferas y la cuantificación de la fluorescencia. Se ha producido una matriz de 100 microesferas con colorantes que emiten a 658 y 712 nm tras la estimulación con un láser de diodo rojo a 635 nm para complementar el sistema de láser del citómetro 45 (ref. 11 Earley MC et al. 2002). Este sistema de perfilado de analitos múltiple (Lab-MAP™) se utilizó para el análisis múltiple de diversos polimorfismos de nucleótidos simples (SNP) (ref. 12 Colinas et al., 2000; ref. 13 Dunbar SA et al., 2000). Los SNP son la fuente de variabilidad más abundante en el genoma humano, lo que es importante para la identificación de patologías particulares o para dilucidar la predisposición a desarrollar una enfermedad particular o responder a una cierta terapia farmacológica (ref. 8 Kellar KL, 2003). Los SNP representan también la base molecular 50 de los polimorfismos de numerosos sistemas de antígenos.

El documento WO 2006/079925 A (3 de agosto de 2006) da a conocer un conjunto de sondas oligonucleotídicas Jka y Jkb y una sonda de control negativo NS (p. 16) que presenta la misma secuencia que las sondas Jka y Jkb de la presente solicitud. Dicho conjunto de sondas se utiliza para la identificación y tipificación de un SNP correspondiente al par alélico Jka/Jkb (pág. 5, pág. 10 l. 15-19, pág. 11-12). Este documento da a conocer asimismo microesferas 55 marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente que presenta grupos carboxílicos en la superficie y acopladas con el conjunto de sondas (perlas de Luminex: especialmente pág. 14 I. 15 a pág. 15, pág. 17).

Se ha establecido un procedimiento de tipificación del grupo sanguíneo molecular que utiliza sondas oligonucleotídicas específicas que, cuando se modifican adecuadamente, se acoplan a una matriz de microesferas fluorescentes, lo que

no presenta las desventajas de las técnicas de tipificación conocidas.

Utilizando el procedimiento según la invención, se produce una reducción considerable en el coste de reactivos y el tiempo del operario.

Desde el punto de vista de su aplicación, el procedimiento es particularmente ventajoso para la tipificación a gran escala de muestras de sangre y puede facilitar la identificación de un fenotipo poco común para pacientes 5 aloinmunizados y sujetos que pertenecen a minorías étnicas. Más específicamente, en la presente invención, tras identificar el polimorfismo Xa y Xb en relación con cada uno de los sistemas objeto del estudio, se diseñaron sondas oligonucleotídicas que podían hibridar, a una cierta temperatura, de una manera sumamente específica, en el sitio polimórfico de interés. Estas sondas han proporcionado excelentes resultados en cuanto a especificidad y eficacia del proceso de hibridación (temperatura de hibridación/polimorfismo/longitud de sonda seleccionados). 10

Las características y ventajas del procedimiento y las fases experimentales establecidas en el contexto de la presente invención y utilizadas en el presente procedimiento de tipificación son las siguientes:

- Aplicación del procedimiento de matrices en suspensión de Luminex a la genotipificación de sistemas de grupo sanguíneo.

- Identificación de pares de cebadores específicos para amplificar la región genómica que contiene el 15 polimorfismo de un solo nucleótido de interés (véase la tabla 1).

- Identificación de condiciones de PCR: misma cantidad y razones de concentración tanto para los cebadores como los tampones utilizados y ciclos de amplificación iguales para todos los sistemas estudiados.

- Diseño de las sondas oligonucleotídicas: diseñadas complementarias a la secuencia amplificada por el cebador biotinilado, con localización del polimorfismo de interés en o en la proximidad al centro de la sonda (la 20 posición polimórfica está marcada en negrita en la tabla 2). Los cambios con respecto a la posición central se determinan mediante la adición y/o eliminación de nucleótidos del extremo 5’ y/o 3’ de la sonda para aumentar la eficacia de hibridación y obtener un mejor apareamiento de sonda-diana o para aumentar la especificidad (ref. 14 Dunbar SA et al., 2005; ref. 15 Dunbar SA. et al., 2006).

- Hibridación directa de las sondas diseñadas con el producto de PCR, que contiene el polimorfismo objeto del 25 estudio, a una temperatura de hibridación específica definida para cada sistema estudiado, en la que la temperatura de hibridación específica está representada entre paréntesis (véase la tabla 2).

Tabla 1

Sistema

Alelos diana Nombre del cebador Secuencia (5’-3’)

KELL

K/k PCR1 K5F ref.16 TTTAgTCCTCACTCCCATgCTTCC (SEC ID nº:1)

K6R ref 16

TATCACACAggTgTCCTCTCTTCC (SEC ID nº:2)

Kpa/Kpb PCR2

KpF TgAggCCAggAgAAAAgCA (SEC ID nº:3)

KpR

TgACCATCTggAAgAgCTTgC (SEC ID nº:4)

Jsa/Jsb PCR2

JsF AACTTTgCCATgCTCCTgg (SEC ID nº:5)

JsR

GCCTTgACACTTgCATACCT (SEC ID nº:6)

LUTHERAN

Lua/Lub PCR3 Lu91mF CTgAggAgCgCTgggACACCCgg (SEC ID nº:7)

Lu92R ref.18

CCCCgggTgTCgTgCATT (SEC ID nº:8)

MNS

S/s PCR4 SsF ref.17 AAgACTgACACATTACCTCA (SEC ID nº:9)

SsR

AACATACCTggTACAgTgAA (SEC ID nº:10)

COLTON

Coa/Cob PCR5 CoF3 TATAAATAggCCCAgCCCAg (SEC ID nº:11)

CoR3

CCAgCgACACCTTCACgTT (SEC ID nº:12)

DUFFY

Fya/Fyb PCR6 Duffy-F2 CTTCCggTgTAACTCTgATgg (SEC ID nº:13)

Duffy-R3

CATCCAgCAggTTACAggAgT (SEC ID nº:14)

KIDD

Jka/Jkb PCR7 JK-781 F3 ref.19 CATgCTgCCATAggATCATTgC (SEC ID nº:15)

JK-943 R3 ref.19

gAgCCAggAggTgggTTTgC (SEC ID nº:16)

ref. 16 Lee, 1997 ref. 17 Hashmi, 2005 ref. 18 El Nemer, 1997 ref. 19 Irshaid, 1998.

Tabla 2

Alelos diana

Sonda AmC12-5’ INTER. DE THIB. Especificidad de microesferas/región N.

K/k

TTAACCgAACgCTgAgAC (SEQ ID NO 17) 45-50ºC (45ºC) K-088

TTAACCgAATgCTgAgAC (SEQ ID NO 18)

k-089

CTATCCCAAAgCTAAggC (SEQ ID NO 19)

NC-086

Kpa/Kpb

ATCACTTCACggCTGTTCCA (SEQ ID NO 20) 52-56ºC (54ºC) Kpa-072

TCACTTCATggCTgTTCCAg (SEQ ID NO 21)

Kpb-073

AACTCTACAgggCTCTTCgA (SEQ ID NO 22)

NC-051

Jsa/Jsb

GgCTgCCTCgCCTgTgACAA (SEQ ID NO 23) 52-56ºC (54ºC) Jsa-053

GgCTgCCCCgCCTgTgACAA (SEQ ID NO 24)

Jsb-055

GCCAgCCACgCgTgTCACTA (SEQ ID NO 25)

NC-064

Lua/Lub

TCgCCCCCgCCTAgCCTC (SEQ ID NO 26) 43-47ºC (45ºC) Lua-063

TCgCCCCCACCTAgCCTC (SEQ ID NO 27)

Lub-065

TAgCCTCCTCCAAgACTA (SEQ ID NO 28)

NC-064

S/s

TAggAgAAACgggACAACTT (SEQ ID NO 29) 50-54ºC (54ºC) S-084

AggAgAAATgggACAACTTg (SEQ ID NO 30)

s-085

TCggATAAAAgAgACCACTg (SEQ ID NO 31)

NC-087

Coa/Cob

AACCAgACggCggTCCAggA (SEQ ID NO 32) 62-66ºC (64ºC) Coa-074

CAACCAgACggTggTCCAgg (SEQ ID NO 33)

Cob-078

AgCCACACTggggACCTggA (SEQ ID NO 34)

NC-080

Fya/Fyb

GAgACTATggTgCCAACCTg (SEQ ID NO 35) 52-56ºC (54ºC) Fya-066

TggAgACTATgATgCCAACC (SEQ ID NO 36)

Fyb-067

GAggCTATCCTgACAAgCTT (SEQ ID NO 37)

NC-069

Jka/Jkb

AgTAgATgTCCTCAAATg (SEQ ID NO 38) 37º-40ºC (37ºC) Jka-064

AgTAgATgTTCTCAAATg (SEQ ID NO 39)

Jkb-076

CgTggATTTCTTCAgAgg (SEQ ID NO 40)

NC-073

Los sistemas eritrocitarios y los alelos relativos que codifican para antígenos comunes, poco comunes y de alta incidencia, analizados en el contexto de la presente invención, se indican en la tabla 1.

Se aplicó entonces la tecnología Xmap de Luminex utilizando una matriz de microesferas en suspensión para 5 determinar los polimorfismos relacionados con antígenos eritrocitarios con el fin de aplicar, en este campo de investigación, las potencialidades de un procedimiento versátil que proporciona un instrumento rápido, preciso y eficaz especialmente para la gestión de examen en masa. Este procedimiento se aprovecha el proceso de hibridación entre sondas de captura oligonucleotídicas sintéticas acopladas a microesferas fluorescentes y el ADN diana amplificado por PCR, utilizando cebadores específicos que permiten la ampliación del locus genómico que contiene el polimorfismo de 10 nucleótidos de interés.

El procedimiento según la presente invención se estableció y sometió a prueba con muestras de ADN de fenotipo y/o genotipo conocido (homocigotas o heterocigotas para los antígenos eritrocitarios de interés); la tipificación de los antígenos de baja incidencia (tales como Kpa, Jsa, Lua y Cob) llevada a cabo con técnicas de aglutinación serológicas y/o técnicas moleculares, tales como PCR-SSP, no se conocía para todas las muestras sometidas a prueba. El 15 procedimiento es robusto en su capacidad de identificación con precisión, en un nivel genómico, del polimorfismo para los sistemas eritrocitarios sometidos a prueba y es tolerante con respecto a la cantidad, calidad y fuente del material que va a tipificarse. Las tablas 3-10 indican los valores de las razones alélicas para cada sistema estudiado de todas las muestras sometidas a prueba.

Tras la extracción del ADN, no es necesario determinar la concentración de ADN en el espectrofotómetro, 20 reduciéndose así considerablemente el tiempo del operario.

A diferencia de otros procedimientos con micromatrices aplicados a la tipificación de sistemas plaquetarios o eritrocitarios, el proceso de hibridación específica tiene lugar en suspensión.

A partir de un estudio de la bibliografía reciente, se ha revelado que el procedimiento específico en cuestión se aplica en diversos campos de investigación tales como genotipificación en el campo de la microbiología y virología (ref. 20 25 Deregt D. et al. 2006; ref. 21 Schmitt et al., 2006; ref. 22 Diaz M. et al., 2005). Con respecto al formato de micromatrices que utiliza un soporte sólido, la ventaja de la tecnología de matrices en suspensión se refiere a la rapidez de la adquisición de datos, la buena sensibilidad y especificidad y la posibilidad de multiplexación.

Un objeto de la presente descripción se refiere por tanto a conjuntos de sondas oligonucleotídicas modificadas con amino en el extremo 5’, caracterizadas porque presentan una longitud de secuencia comprendida entre 18 y 20 30 nucleótidos y que contienen el SNP específico para cada uno de los alelos diana que pertenecen al locus genómico X, seleccionados de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb y Jka/Jkb en o en la proximidad al

centro de dicha sonda, que pueden hibridar específicamente con cada uno de dichos alelos; estando caracterizadas dichas sondas porque están acopladas a una micropartícula marcada con por lo menos una sustancia fluorescente y porque comprenden o están constituidas por lo menos un conjunto de secuencias oligonucleotídicas indicadas en la tabla siguiente:

Sonda

Conjunto de sondas Número de conjunto de sondas

k K NC

TTAACCgAACgCTgAgAC (SEC ID nº:17) TTAACCgAATgCTgAgAC (SEC ID nº:18) CTATCCCAAAgCTAAggC (SEC ID nº:19) 1

Kpb Kpa NC

ATCACTTCACggCTgTTCCA (SEC ID nº:20) TCACTTCATggCTgTTCCAg (SEC ID nº:21) AACTCTACAgggCTCTTCgA (SEC ID nº:22) 2

Jsb Jsa NC

ggCTgCCTCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:23) ggCTgCCCCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:24) gCCAgCCACgCgTgTCACTA (SEC ID nº:25) 3

Lua Lub NC

TCgCCCCCgCCTAgCCTC (SEC ID nº:26) TCgCCCCCACCTAgCCTC (SEC ID nº:27) TAgCCTCCTCCAAgACTA (SEC ID nº:28) 4

s S NC

TAggAgAAACgggACAACTT (SEC ID nº:29) AggAgAAATgggACAACTTg (SEC ID nº:30) TCggATAAAAgAgACCACTg (SEC ID nº:31) 5

Coa Cob NC

AACCAgACggCggTCCAggA (SEC ID nº:32) CAACCAgACggTggTCCAgg (SEC ID nº:33) AgCCACACTggggACCTggA (SEC ID nº:34) 6

Fya Fyb NC

GAgACTATggTgCCAACCTg (SEC ID nº:35) TggAgACTATgATgCCAACC (SEC ID nº:36) gAggCTATCCTgACAAgCTT (SEC ID nº:37) 7

Jka Jkb NC

AGTAGATGTCCTCAAATG (SEC ID nº:38) AGTAGATGTTCTCAAATG (SEC ID nº:39) CGTGGATTTCTTCAGAGG (SEC ID nº:40) 8

5

Dichas sondas están conjugadas preferentemente con una modificación de C12 de ligador de amino en el extremo 5’.

La invención se refiere a la utilización de por lo menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas tal como se definen en la tabla anterior, para la identificación y tipificación de por lo menos un SNP del par alélico siguiente X seleccionado de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb.

Según otras formas de realización de la invención, es posible utilizar uno o más de los conjuntos de sondas 10 oligonucleotídicas según la invención en la misma mezcla de hibridación (por ejemplo los conjuntos de sondas oligonucleotídicas para los alelos Kpa/Kpb y Jsa/Jsb o todos los conjuntos de sondas juntos).

En la presente forma de realización, la utilización de los conjuntos de sondas oligonucleotídicas se realiza a intervalos de temperatura de hibridación específicos indicados en la tabla siguiente:

Número de conjunto

INTERVALO DE THIBRIDACIÓN

1

45-50ºC, preferentemente 45ºC

2

52-56ºC, preferentemente 54ºC

3

62-56ºC, preferentemente 54ºC

4

43-47ºC, preferentemente 45ºC

5

50-54ºC, preferentemente 54ºC

6

62-66ºC, preferentemente 64ºC

7

52-56ºC, preferentemente 54ºC

8

37-40ºC, preferentemente 37ºC

15

La invención se refiere asimismo a micropartículas marcadas con por lo menos una sustancia fluorescente que presenta grupos carboxílicos en la superficie, caracterizadas porque están acopladas con por lo menos un conjunto de sondas tal como se definió anteriormente.

Otro objetivo de la presente invención consiste en un procedimiento para la identificación y tipificación de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) del sistema eritrocitario X en individuos heterocigotos y homocigotos, que 20 comprende las siguientes fases:

a) extraer ADN de una muestra biológica;

b) amplificar por PCR el locus genómico que comprende el SNP del sistema eritrocitario de interés, por medio de por lo menos un par de cebadores específico para un alelo seleccionado de entre:

Alelos diana

Secuencia del cebador (5’-3’)

K/k

Directo: TTTAgTCCTCACTCC.CATgCTTCC (SEC ID nº:1)

Inverso: TATCACACAggTgTCCTCTCTTCC (SEC ID nº:2)

Kpa/Kpb

Directo: TgAggCCAggAgAAAAgCA (SEC ID nº:3)

Inverso: TgACCATCTggAAgAgCTTgC (SEC ID nº:4)

Jsa/Jsb

Directo: AACTTTgCCATgCTCCTgg (SEC ID nº:5)

Inverso: gCCCTTgACACTTgCATACCT (SEC ID nº:6)

Lua/Lub

Directo: CTgAggAgCgCTgggACACCCgg (SEC ID nº:7)

Inverso: CCCCgggTgTCgTgCATT (SEC ID nº:8)

S/s

Directo: AAgACTgACACATTACCTCA (SEC ID nº:9)

Inverso: AACATACCTggTACAgTgAA (SEC ID nº:10)

Coa/Cob

Directo: TATAAATAggCCCAgCCCAg (SEC ID nº:11)

Inverso: CCAgCgACACCTTCACgTT (SEO ID NO:12)

Fya/Fyb

Directo: CTTCCggTgTAACTCTgATgg (SEC ID nº:13)

Inverso: CATCCAgCAggTTACAggAgT (SEC ID nº:14)

Jka/Jkb

Directo: CATgCTgCCATAggATCATTgC (SEC ID nº:15)

Inverso: gAgCCAggAggTgggTTTgC (SEC ID nº:16)

en el que por lo menos un cebador (directo o inverso) está marcado en el extremo 5’ con biotina para obtener productos de PCR biotinilados; las sondas oligonucleotídicas son complementarias a la secuencia de ADN 5 amplificada por el cebador biotinilado;

c) hibridar los productos de PCR biotinilados obtenidos en la fase b) con por lo menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas tal como se describió anteriormente y marcar con estreptavidina-ficoeritrina a la temperatura de hibridación específica para cada sistema tal como se ilustra a continuación:

Sonda

Conjunto de sondas Intervalo de THIBRIDACIÓN

k

TTAACCgAACgCTgAgAC (SEC ID nº:17)

K

TTAACCgAATgCTgAgAC (SEC ID nº:18) 45-50ºC

NC

CTATCCCAAAgCTAAggC (SEC ID nº:19) preferentemente 45ºC

Kpb

ATCACTTCACggCTgTTCCA (SEC ID nº:20)

Kpa

TCACTTCATggCTgTTCCAg (SEC ID nº:21) 52-56ºC

NC

AACTCTACGgggCTCTTCgA (SEC ID nº:22) preferentemente 54ºC

Jsb

ggCTgCCTCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:23)

Jsa

ggCTgCCCCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:24) 52-56ºC

NC

gCCAgCCACgCgTgTCACTA (SEC ID nº:25) preferentemente 54ºC

Lua

TCgCCCCCgCCTAgCCTC (SEC ID nº:26)

Lub

TCgCCCCCACCTAgCCTC (SEC ID nº:27) 43-47ºC

NC

TAgCCTCCTCCAAgACTA (SEC ID nº:28) preferentemente 45ºC

s

TAggAgAAACgggACAACTT (SEC ID nº:29)

S

AggAgAAATgggACAACTTg (SEC ID nº:30) 50-54ºC

NC

TCggATAAAAgAgACCACTg (SEC ID nº:31) preferentemente 54ºC

Coa

AACCAgACggCggTCCAggA (SEC ID nº:32)

Cob

CAACCAgACggTggTCCAgg (SEC ID nº:33) 62-66ºC

INC

AgCCACACTggggACCTggA (SEC ID nº:34) preferentemente 64ºC

Fya

GAgACTATggTgCCAACCTg (SEC ID nº:35)

Fyb

TggAgACTATgATgCCAACC (SEC ID nº:36) 52-56ºC

NC

gAggCTATCCTgACAAgCTT (SEC ID nº:37) preferentemente 54ºC

Jka

AgTAgATgTCCTCAAATg (SEC ID nº:38)

Jkb

AgTAgATgTTCTCAAATg (SEC ID nº:39) 37-40ºC

NC

CgTggATTTCTTCAgAgg (SEC ID nº:40) preferentemente 37ºC

10

d) detectar la fluorescencia con un instrumento basado en citometría de flujo, detectando la fluorescencia emitida por las microesferas específicas utilizando preferentemente un instrumento Luminex 100. La figura 1 representa un ejemplo del software del instrumento tras el análisis de la fluorescencia de las muestras.

El procedimiento adoptado aprovecha el sistema Xmap™ de Luminex puesto que utiliza una matriz de microesferas fluorescentes acopladas covalentemente en el laboratorio con las sondas complementarias específicas para el análisis 15 de los polimorfismos de los sistemas eritrocitarios anteriores y el citómetro de flujo Luminex 100 (Luminex Corporation). La amplificación de la fase b) en el caso de polimorfismos de los alelos Kpa/Kpb y Jsa/Jsb del sistema KELL se lleva a cabo preferentemente mediante PCR múltiple.

La descripción se refiere a un kit de diagnóstico para la identificación y tipificación de por lo menos un SNP de los sistemas eritrocitarios, objeto del estudio, para identificar el carácter heterocigoto y homocigoto de las muestras, que comprende los componentes siguientes:

a) uno o más pares de cebadores para la amplificación por PCR del locus genómico que comprende el SNP del par X seleccionado de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb, 5 seleccionándose dicho par de cebadores de:

Alelos diana

Secuencia del cebador (5’-3’)

K/k

Directo: TTTAgTCCTCACTCCCATgCTTCC (SEC ID nº:1)

Inverso: TATCACACAggTgTCCTCTCTTCC (SEC ID nº:2)

Kpa/Kpb

Directo: TgAggCCAggAgAAAAgCA (SEC ID nº:3)

Inverso: TgACCATCTggAAgAgCTTgC (SEC ID nº:4)

Jsa/Jsb

Directo: AACTTTgCCATgCTCCTgg (SEC ID nº:5)

Inverso: gCCCTTgACACTTgCATACCT (SEC ID nº:6)

Lua/Lub

Directo: CTgAggAgCgCTgggACACCCgg (SEC ID nº:7)

Inverso: CCCCgggTgTCgTgCATT (SEC ID nº:8)

S/s

Directo: AAgACTgACACATTACCTCA (SEC ID nº:9)

Inverso: AACATACCTggTACAgTgAA (SEC ID nº:10)

Coa/Cob

Directo: TATAAATAggCCCAgCCCAg (SEC ID nº:11)

Inverso: CCAgCgACACCTTCACgTT (SEC ID nº:12)

Fya/Fyb

Directo: CTTCCggTgTAACTCTgATgg (SEC ID nº:13)

Inverso: CATCCAgCAGGTTACAggAgT (SEC ID nº:14)

Jka/Jkb

Directo: CATgCTgCCATAggATCATTgC (SEC ID nº:15)

Inverso: gAgCCAggAggTgggTTTgC (SEC ID nº:16)

b) al menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas tal como se definió anteriormente, pudiendo hibridar dichas sondas con dicho SNP.

Preferentemente, el conjunto de cebadores tal como se definió anteriormente utilizado en las reacciones de PCR 10 múltiple según la presente descripción son:

- K5F/K6R, SsF/SsR, Duffy-F2/Duffy-R3 y JK-781-F3/JK-943-R3;

- KpF/KpR, JsF/JsR, Lu91mF/Lu92R y CoF3/CoR3.

La presente invención se describirá a continuación a título ilustrativo y no limitativo según sus formas de realización preferidas, haciendo referencia particular a las tablas y la figura adjunta en la que: 15

la figura 1 representa el análisis del sistema Colton en el que se analiza la fluorescencia de las tres microesferas de interés (microesferas 74, 78, 80); se muestran los códigos de identificación de las muestras (columna “muestra”); el valor obtenido para cada microesfera es el valor de fluorescencia emitida a partir de la microesfera acoplada a su vez con las sondas relativas según la invención; la columna “acontecimientos” se refiere al número de microesferas totales de modo que se analizan por lo menos 100 acontecimientos 20 (microesferas) para cada clasificación de microesferas.

EJEMPLO: Tipificación genómica del sistema eritrocitario X por medio del sistema de micromatrices en suspensión que utiliza sondas oligonucleotídicas complementarias al SNP específico acopladas a una matriz de microesferas marcadas con fluorescencia.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS 25

Muestras

Se recogieron 7 ml de sangre periférica de la muestra que iba a analizarse en tubos de ensayo que contenían la disolución de EDTA como anticoagulante. Se conservaron las muestras a -20ºC hasta el momento de la prueba. Se utilizaron alícuotas de 200 μl de sangre completa para la extracción del ADN con un kit comercial (QIAamp, Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá), según las instrucciones del productor. 30

Las muestras sometidas a prueba se indican en las tablas relacionadas (tablas 3-10).

Reactivos

Se adquirieron las microesferas COOH xMAP Multi-Analyte de Luminex Corporation (microesferas carboxiladas, L100-C1XX-O1-Austin, TX, EE.UU.).

Las microesferas (5,6 μm de diámetro) presentan grupos de superficie funcionales carboxílicos para la unión covalente 35

con diferentes analitos que, en el contexto de la presente invención, son sondas oligodesoxirribonucleotídicas modificadas con amino (AmC12) en el extremo 5’. El productor clasificó las microesferas de poliestireno (comercializadas) por medio de citometría de flujo teniendo en cuenta el perfil de emisión en la longitud de onda del rojo/infrarrojo de cada clasificación de microesferas.

Resultan disponibles 100 microesferas puesto que cada región específica incorpora dos fluoróforos en una razón de 5 intensidad precisa entre sí que emiten a diferentes longitudes de onda (rojo e infrarrojo), lo que permite su distinción. De hecho, cada clasificación de microesferas distinta presenta características espectrales únicas y su propia distribución de intensidad de fluorescencia que puede analizarse mediante el instrumento de análisis. Se utilizaron diversas regiones en este estudio: véase la tabla 2. Todas las regiones diferentes de microesferas numeradas desde 1 hasta 100 proceden del mismo material de partida y difieren sólo en cuanto a las cantidades de colorantes 10 rojos/infrarrojos.

Se obtuvieron ácido 2-N-morfolinoetanosulfónico (MES), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), SAPE (100X disolución madre de estreptavidina-ficoeritrina 0,5 mg/ml) de Sigma, Pierce y One Lambda, Inc. respectivamente. Los siguientes tampones de One Lambda Inc, tampón de lavado LABType y tampón con SAPE LABType, se utilizaron respectivamente para la etapa de lavado tras la fase de hibridación y para diluir la disolución 15 madre de SAPE.

Diseño de las sondas

Todos los oligonucleótidos utilizados para el acoplamiento covalente con las microesferas se modificaron en el extremo 5’ durante la síntesis, por medio del modificador de amino (AmC12). El polimorfismo de los diversos sistemas estudiados en el diseño de las sondas se localizó preferentemente en o en la proximidad al centro de la sonda 20 (posición de polimorfismo específica - tabla 2).

La longitud de la sonda está comprendida entre 18 y 20 nucleótidos y se seleccionan complementarios a la secuencia amplificada por el cebador biotinilado, basándose en las secuencias genómicas depositadas.

Se utiliza un conjunto de sondas para cada sistema que va a analizarse, que comprende: dos sondas específicas para los alelos del sistema objeto del estudio; una sonda no específica utilizada como control negativo (NC), puesto que se 25 ha diseñado específicamente cambiando, con respecto a la secuencia de la sonda específica, seis nucleótidos de modo que no presenta la posibilidad de aparearse con el ADN diana. Esta sonda se utiliza sólo para evaluar la señal de fluorescencia de fondo, controlar que todas las etapas de lavado se han llevado a cabo correctamente y confirmar indirectamente la señal positiva o negativa de las sondas específicas:

- Sonda Xa y sonda Xb: de desde 18 hasta 20 nucleótidos con modificación por AmC12 en el extremo 5’: éstas 30 son las sondas específicas para el polimorfismo implicado; el polimorfismo de los diversos sistemas estudiados se localizaba preferentemente en o en la proximidad al centro de la sonda (posición de polimorfismo específica - tabla 2).

- Sonda de control negativo (NC): de desde 18 hasta 20 nt con modificación por AmC12 en el extremo 5’ que difiere de la sonda específica de alelo en modificaciones de seis nucleótidos de modo que se obtiene una 35 sonda que no puede hibridar con el polimorfismo específico (ref. 13 Dunbar et al., 2000).

Surgen diversos problemas durante la identificación de estas sondas, que no todas las combinaciones de temperatura de hibridación/producto de PCR/longitud de sonda y posiciones de polimorfismos pudieron superar.

Basándose en el polimorfismo específico de los alelos K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb del sistema Kell, cada uno caracterizado por un cambio de un único nucleótido y por la secuencia genómica relativa depositada, en experimentos preliminares, 40 fue posible identificar las sondas complementarias de 18 nt con el polimorfismo específico en una posición central y acoplarlas a las microesferas fluorescentes desarrolladas (L100-CDEV1-01 (Luminex)). La temperatura de hibridación utilizada para los experimentos prelimitares fue de 45ºC.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

K/ k: las sondas de 18 nt, el polimorfismo central y el producto de PCR obtenido a partir de un par de 45 cebadores descritos en la bibliografía (Lee, 1997) proporcionaron resultados con buena especificidad en la tipificación de las muestras sometidas a prueba con tipificación serológica conocida, efectuada a una temperatura de 45ºC.

Kpa/ Kpb: las sondas de 18 nt, el polimorfismo central y el producto de PCR obtenido a partir de un par de cebadores descritos en la bibliografía (ref. 16 Lee, 1997) no proporcionaron señal de hibridación a una 50 temperatura de 45ºC.

Se efectuaron entonces experimentos de hibridación adicionales variando sólo la temperatura de hibridación (entre 50ºC y 54ºC) y manteniendo las mismas sondas y el mismo producto de PCR. Incluso la temperatura de 37ºC no permitió distinguir los alelos específicos.

En este punto, se modificó el producto de PCR diseñando, con los programas disponibles (Primer Express, Applied Biosystems; OligoAnalyzer 3.0, Integrated DNA Technologies), nuevos pares de cebadores para acortar el producto amplificado final, favoreciendo así la fase de hibridación (ref. 14 Dunbar et al., 2005). Se utilizaron sondas de 20 nt con la posición del polimorfismo ajustada, es decir, ya no ubicada sólo en el centro de la secuencia de la sonda.

Los resultados muestran una señal específica que puede obtenerse cambiando tanto el producto de PCR como la 5 longitud de las sondas a una cierta temperatura (54ºC).

Una vez que se había encontrado la combinación adecuada para obtener una alta especificidad, se acoplaron las sondas con las microesferas xMAP® Multi-Analyte microesferas (L100-C1XX01 COOH). Sistema Duffy (Fya/Fyb) y sistema Colton (Coa/Cob): las sondas de 20 nt, el polimorfismo no sólo en una posición central y el producto de PCR obtenido a partir de un par de cebadores diseñados directamente con programas informatizados no proporcionaron 10 buenos resultados en cuanto a la especificidad en la fase de hibridación llevada a cabo a temperaturas comprendidas entre 45ºC y 54ºC.

En este caso, se amplificó el producto de PCR utilizando los pares de cebadores según la invención, es decir, se diseñaron diferentes cebadores.

Con el fin de distinguir el alelo Coa, se utilizaron dos sondas de 20 nt con el polimorfismo de interés situado en una 15 posición diferente. Tras diversas pruebas a diferentes temperaturas, se obtuvieron resultados específicos con la secuencia indicada en la tabla 2.

Sistema MNS (S/s): del par de cebadores para la amplificación, sólo la secuencia específica del cebador directo (SsF) se obtuvo de la bibliografía (ref. 17 Hashmi et al., 2005). El cebador inverso se diseñó ex novo con la ayuda de programas informatizados, tal como se describió anteriormente. Se obtuvieron sondas de 20 nt, con el polimorfismo en 20 el centro de las sondas específicas; además, para el alelo s, también se sometieron a prueba sondas de 18 nt, 19 nt y 21 nt a diversas temperaturas.

Se obtuvo una señal distintiva específica en la fase de hibridación con la sonda de 20 nt a una temperatura de 54ºC.

Sistema Lutheran (Lua/Lub): se utilizó sólo la secuencia del cebador inverso descrita en la bibliografía para la fase de amplificación específica (Elnemer et al., 1997). El cebador directo se decidió ex novo. Se utilizaron sondas de 18 nt y 25 20 nt con el polimorfismo en el centro.

Se obtuvo una señal específica en la fase de hibridación a una temperatura de 45ºC con sondas de 18 nt.

Con el fin de obtener una hibridación específica a una temperatura de 54ºC, también se intentó utilizar sondas de 20 nt pero sin ningún resultado.

Acoplamiento de las sondas oligonucleotídicas con las microesferas marcadas con fluorescencia 30

Las diversas sondas oligonucleotídicas modificadas en el extremo 5’ se conjugaron, en reacciones separadas, con diferentes clasificaciones de microesferas carboxiladas, según el protocolo de acoplamiento sugerido por Luminex Corporation (Oligonucleotide Coupling Protocol).

Se microcentrifugó una alícuota de cada región específica que contenía 5x106 microesferas a 10.000 rpm durante 2 minutos, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 50 μl de tampón MES 0,1 M, a pH 4,5. Entonces 35 se añadieron a la mezcla 0,2 nanomoles de sondas oligonucleotídicas modificadas con amino.

Entonces se añadió una disolución acuosa de 1-metil-3-(3-dimetilaminopropil-carbodiimida HCl (EDC; 10 mg/ml) a la mezcla de microesferas/oligonucleótidos y se incubó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Se repitió una vez más la adición de EDC y la incubación. Tras una incubación total de 1 hora, se lavaron las microesferas con 1 ml de Tween-20 al 0,02%. Se eliminó la disolución de lavado por centrifugación, se 40 repitió la etapa de lavado con 1 ml de SDS al 0,1% y se resuspendió la mezcla final en 100 μl de TE (tampón de elución-QIAGEN), a pH 8 y se conservó en la oscuridad a 4ºC. Antes de su utilización, las microesferas se llevaron hasta temperatura ambiente durante 5 minutos. Las microesferas acopladas, así obtenidas, presentan una concentración teórica esperada de 50.000 microesferas/μl.

Amplificación del ADN diana 45

En la tabla 1 se describen los cebadores utilizados para la amplificación de todos los sistemas en cuestión. Los cebadores se utilizaron para la amplificación del locus específico en examen.

Se sintetizó por lo menos un cebador de cada par de cebadores con modificación con Biotina TEG en el extremo 5’, para marcar la hebra diana del amplicón y detectar la hibridación de la sonda específica con el ADN diana, según las indicaciones de Luminex Corporation (síntesis y purificación y modificación de cebadores y sondas mediante Primm). 50

Se llevó a cabo la PCR con 0,5 μM de cebador, 2-0,5 μl de ADN genómico (25-100 ng), 0,2 mM de dNTP, 1 mM de MgCl2 (a partir de 25 mM de Applied Biosystem), 1X tampón de PCR (a partir de 10X de Applied Biosystem) y 0,5 U de Taq (GoTaq Promega). El volumen de reacción final es igual a 20 μl.

Se utilizó un termociclador Mastercycler epgradient S (Eppendorf) para los ciclos térmicos utilizando los parámetros siguientes: 2 minutos de desnaturalización de ADN inicial a 94ºC, seguido por 35 ciclos a 94ºC durante 20 segundos, 60ºC durante 20 segundos, 72ºC durante 30 segundos, con una fase de elongación final a 72ºC durante 5 minutos. Los productos de amplificación obtenidos pueden visualizarse mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Reacciones de PCR múltiple 5

Se establecieron 2 reacciones de PCR múltiple, con el fin de minimizar la laboriosidad y el tiempo de manipulación. Las PCR se dividieron en dos reacciones múltiples separadas: PCR (I) y PCR (II) (véase la tabla a continuación) partiendo de la base de la frecuencia de utilización en el laboratorio y, por tanto, de la utilidad de las reacciones, es decir PCR (I) amplifica los sistemas para los que se someten a prueba las muestras de manera rutinaria; PCR (II) amplifica los sistemas que se someten a prueba con menos frecuencia. 10

Alelos diana

Secuencia del cebador (5’-3’)

K/k PCR (I)

Directo: TTTAgTCCTCACTCCCATgCTTCC

Inverso: TATCACACAggTgTCCTCTCTTCC

Kpa/Kpb PCR (II)

Directo: TgAggCCAggAgAAAAgCA

Inverso: TgACCATCTggAAgAgCTTgC

Jsa/Jsb PCR (II)

Directo: AACTTTgCCATgCTCCTgg

Inverso: gCCCTTgACACTTgCATACCT

Lua/Lub PCR (II)

Directo: CTgAggAgCgCTgggACACCCgg

Inverso: CCCCgggTgTCgTgCATT

S/s PCR (I)

Directo: AAgACTgACACATTACCTCA

Inverso: AACATACCTggTACAgTgAA

Coa/Cob PCR (II)

Directo: TATAAATAggCCCAgCCCAg

Inverso: CCAgCgACACCTTCACgTT

Fya/Fyb PCR (I)

Directo: CTTCCggTgTAACTCTgATgg

Inverso: CATCCAgCAggTTACAggAgT

Jka/Jkb PCR (I)

Directo: CATgCTgCCATAggATCATTgC

Inverso: gAgCCAggAggTgggTTTgC

La PCR se lleva a cabo con 0,3 μM de cada cebador, 4 μL de ADN genómico (100-400 ng), 0,2 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCl2 (a partir de 25 mM de Applied Biosystem), 1,5 X tampón de PCR (a partir de 10X de Applied Biosystem) y 4 U de Taq (GoTaq Promega). El volumen de reacción final es igual a 50 μL. Los parámetros de la PCR siguen siendo los mismos que para las reacciones de PCR individuales. 15

Hibridación

Tras la amplificación del ADN, se transfirieron 4 μl de cada reacción de amplificación a microplacas de 96 pocillos y se diluyeron con 13 μl de tampón TE. Se sellaron entonces con película adhesiva y se calentaron hasta la desnaturalización a 99ºC durante 10 minutos con la utilización de un termociclador precalentado.

La hibridación de los productos de PCR con las tres sondas para cada sistema objeto del estudio (dos sondas 20 específicas y un control negativo) se efectúa diluyendo las sondas individuales, en el tampón de hibridación suministrado por One Lambda, Inc. (tampón de hibridación LABType), a una concentración final de 150 microesferas por microlitro. Las microesferas acopladas, tal como se describió anteriormente, presentan una recuperación teórica de 50.000 microesferas por microlitro.

Tras la desnaturalización de los productos de PCR, se añadieron a cada muestra 33 μl de microesferas diluidas en 25 disolución de hibridación.

Se mezclaron las muestras y se transfirió rápidamente la microplaca al termociclador precalentado hasta la temperatura de hibridación óptima específica para cada sistema tal como se indica en la tabla 2.

La hibridación se lleva a cabo durante 15 minutos e inmediatamente después se añaden 100 μl de tampón de lavado (tampón de lavado LABType - One lambda Inc.). 30

Se llevaron a cabo las etapas de lavado a temperatura ambiente mediante centrifugación (2.800 rpm durante 5 minutos) con eliminación del sobrenadante mediante inversión manual de la placa. Se lavan las muestras un total de tres veces.

Se incuban a continuación las muestras durante 5 minutos, a la misma temperatura de hibridación, con 50 μl de una disolución recién preparada de IX SAPE (0,5 mg/l de estreptavidina-R-ficoeritrina) en un tampón de dilución 35 suministrado por One Lambda Inc. (tampón con SAPE LABType).

Al final de la incubación, se añadieron rápidamente 100 μl de tampón de lavado LABType a cada pocillo (One Lambda, Inc). Volvieron a sedimentarse las microesferas mediante centrifugación y se retiró el sobrenadante mediante inversión. Entonces se resuspendió cada muestra en 80 μl de tampón Sheath Fluid suministrado por Luminex. La placa estaba

preparada para analizarse en el instrumento basado en citómetro de flujo.

Si no es posible analizar las muestras inmediatamente, puede conservarse la placa de análisis a +4ºC en la oscuridad, hasta un máximo de 24 horas.

Adquisición y análisis de los datos

Se analizaron las muestras utilizando un dispositivo LAB Scan™100 (Luminex Corporation, Austin, TX). 5

El Instrumento está provisto de dos fuentes de láser de las que una es un láser de diodo rojo a 635 nm que excita los fluorocromos rojos e infrarrojos y la otra es un láser a 532 nm que excita el fluorocromo indicador ficoeritrina (PE).

Cada microesfera presenta una dirección espectral única que el instrumento puede identificar.

Para cada adquisición de datos se monitorizan dos parámetros, el recuento y la intensidad de fluorescencia media (MFI). 10

El recuento para cada microesfera (región específica individual) debe ser de por lo menos 100. La intensidad de fluorescencia media (MFI) representa la fluorescencia de indicador promedio para las esferas contadas, tal como se describió anteriormente.

Determinación de la razón alélica:

La intensidad de fluorescencia, generada por el software Luminex representa la MFI de cada microesfera (o sonda 15 acoplada con la microesfera) para cada muestra.

Para cada sistema estudiado, se calculó la razón alélica con el fin de obtener un valor numérico que, cuando se analiza partiendo de la base del valor umbral de referencia, permite distinguir entre muestras homocigotas para cada alelo o muestras heterocigotas, tal como se indica en las tablas 3-10 (ref. 7 Beiboer et al. 2005).

Con el fin de definir la razón alélica para cada sistema, se sometieron a prueba muestras con una tipificación conocida 20 obtenida con hemaglutinación y/o PCR-SSP.

Se obtiene el valor de la razón para cada sistema a partir de la razón entre la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la sonda Xa, que se prevé que es el alelo más frecuente en la populación caucásica, y la suma de MFI de ambos alelos (Xa y Xb) del sistema implicado, tal como se indica en la fórmula siguiente:

(MFIa - MFINC) / (MFIa - MFINC + MFIb - MFINC) 25

Los valores de MFI específica de alelo menos el valor de MFI generado por la sonda de control negativo (NC) se utilizan en la fórmula para cada muestra. Partiendo de la base de las muestras sometidas a prueba, fue posible definir una razón alélica para cada sistema. Los datos obtenidos se indican en las tablas 3-10 y en la tabla 11 acumulativa a continuación en la presente memoria.

Entonces se procesan los datos de fluorescencia sin procesar registrados por el instrumento. En este caso, en el 30 programa de análisis creado en Excel, se establecieron las fórmulas matemáticas necesarias para obtener automáticamente, para cada sonda específica (alelo Xa y alelo Xb), los valores de fluorescencia menos el valor del control negativo (por ejemplo, MFI de sonda Xa - MFI de sonda NC). Entonces se utiliza este valor de MFI corregido para calcular la razón alélica de cada muestra individual tal como se describió anteriormente. A continuación en la presente memoria se proporciona un ejemplo de forma de hoja de cálculo preparada en Excel para el análisis de los 35 datos.

Hoja de cálculo:

Fecha:

ID MFI MFIAlelo-MFINC Razón alélica s/(S+s) Genotipificación

S s NC S s

084 085 087

1A

144597

1B

144596

1C

144595

1D

144594

1E

144591

1F

144590

1G

144589

1H

144588

En la formulación de la tabla, la conclusión automática de la tipificación se basó en las razones alélicas de referencia. La tipificación no puede concluirse automáticamente si la razón alélica obtenida no está dentro de los intervalos de punto de corte establecidos. En este caso, aparece un mensaje de advertencia automático. 40

Los resultados obtenidos para cada muestra también se confirman sólo si la fluorescencia producida por la sonda de control negativo no supera el valor de 100 y si la suma de los valores de fluorescencia de las sondas específicas es superior a cuatro veces el valor del control negativo de la muestra (MFIa+MFIb > 4xMFINC). Estas fórmulas también se incluyeron en Excel.

El análisis de los datos es fácil, rápido y no requiere software de aplicación complicado. 5

A continuación se proporciona una lista de las tablas (3-10) de las razones alélicas obtenidas a partir de las muestras individuales sometidas a prueba, mientras que la tabla 11 indica los valores de razón alélica utilizados como intervalo de referencia (punto de corte), obtenidos del promedio de las razones de las muestras individuales más y/o menos dos desviaciones estándar

Las razones alélicas de las muestras individuales: 10

Tabla 3

N.º

Razón alélica Genotipo

a/(a+b)

1

1,000 Coa/Coa Coa/Coa > 0,941

2

1,000 Coa/Coa

3

0,995 Coa/Coa

4

0,992 Coa/Coa

5

0,990 Coa/Coa

6

0,989 Coa/Coa

7

0,984 Coa/Coa

8

0,984 Coa/Coa

9

0,984 Coa/Coa

10

0,984 Coa/Coa

11

0,984 Coa/Coa

12

0,980 Coa/Coa

13

0,980 Coa/Coa

14

0,979 Coa/Coa

15

0,978 Coa/Coa

16

0,976 Coa/Coa

17

0,976 Coa/Coa

18

0,976 Coa/Coa

19

0,975 Coa/Coa

20

0,973 Coa/Coa

21

0,973 Coa/Coa

22

0,972 Coa/Coa

23

0,971 Coa/Coa

24

0,971 Coa/Coa

25

0,970 Coa/Coa

26

0,970 Coa/Coa

27

0,969 Coa/Coa

28

0,968 Coa/Coa

29

0,968 Coa/Coa

30

0,967 Coa/Coa

31

0,967 Coa/Coa

32

0,966 Coa/Coa

33

0,966 Coa/Coa

34

0,966 Coa/Coa

35

0,965 Coa/Coa

36

0,965 Coa/Coa

37

0,965 Coa/Coa

38

0,964 Coa/Coa

39

0,964 Coa/Coa

40

0,963 Coa/Coa

41

0,963 Coa/Coa

42

0,963 Coa/Coa

43

0,962 Coa/Coa

44

0,962 Coa/Coa

45

0,962 Coa/Coa

46

0,961 Coa/Coa

47

0,961 Coa/Coa

48

0,960 Coa/Coa

49

0,960 Coa/Coa

50

0,959 Coa/Coa

51

0,958 Coa/Coa

52

0,958 Coa/Coa

53

0,958 Coa/Coa

54

0,958 Coa/Coa

55

0,958 Coa/Coa

56

0,956 Coa/Coa

57

0,954 Coa/Coa

58

0,954 Coa/Coa

59

0,950 Coa/Coa

60

0,948 Coa/Coa

61

0,946 Coa/Coa

62

0,944 Coa/Coa

63

0,923 Coa/Coa

64

0,747 Coa/Cob 0,652 < Coa/Cob < 0,754

65

0,723 Coa/Cob

66

0,717 Coa/Cob

67

0,712 Coa/Cob

68

0,704 Coa/Cob

69

0,701 Coa/Cob

70

0,690 Coa/Cob

71

0,675 Coa/Cob

72

0,663 Coa/Cob

73

0,106 Cob/Cob Cob/Cob < 0,116

74

0,009 Cob/Cob

75

0,007 Cob/Cob

76

0,002 Cob/Cob

77

0,002 Cob/Cob

Tabla 4

N.º

Razón alélica Genotipo

b/(a+b)

1

0,996 Fyb/Fyb Fyb/Fyb > 0,931

2

0,996 Fyb/Fyb

3

0,996 Fyb/Fyb

4

0,994 Fyb/Fyb

5

0,993 Fyb/Fyb

6

0,992 Fyb/Fyb

7

0,992 Fyb/Fyb

8

0,991 Fyb/Fyb

9

0,990 Fyb/Fyb

10

0,986 Fyb/Fyb

11

0,985 Fyb/Fyb

12

0,984 Fyb/Fyb

13

0,984 Fyb/Fyb

14

0,983 Fyb/Fyb

15

0,981 Fyb/Fyb

16

0,981 Fyb/Fyb

17

0,981 Fyb/Fyb

18

0,980 Fyb/Fyb

19

0,978 Fyb/Fyb

20

0,976 Fyb/Fyb

21

0,975 Fyb/Fyb

22

0,974 Fyb/Fyb

23

0,974 Fyb/Fyb

24

0,974 Fyb/Fyb

25

0,972 Fyb/Fyb

26

0,971 Fyb/Fyb

27

0,971 Fyb/Fyb

28

0,970 Fyb/Fyb

29

0,969 Fyb/Fyb

30

0,968 Fyb/Fyb

31

0,968 Fyb/Fyb

32

0,967 Fyb/Fyb

33

0,966 Fyb/Fyb

34

0,965 Fyb/Fyb

35

0,965 Fyb/Fyb

36

0,965 Fyb/Fyb

37

0,963 Fyb/Fyb

38

0,960 Fyb/Fyb

39

0,959 Fyb/Fyb

40

0,958 Fyb/Fyb

41

0,958 Fyb/Fyb

42

0,956 Fyb/Fyb

43

0,953 Fyb/Fyb

44

0,949 Fyb/Fyb

45

0,948 Fyb/Fyb

46

0,946 Fyb/Fyb

47

0,945 Fyb/Fyb

48

0,944 Fyb/Fyb

49

0,939 Fyb/Fyb

50

0,935 Fyb/Fyb

51

0,930 Fyb/Fyb

52

0,929 Fyb/Fyb

53

0,920 Fyb/Fyb

54

0,888 Fya/Fyb 0,752 < Fya/Fyb < 0,902

55

0,888 Fya/Fyb

56

0,871 Fya/Fyb

57

0,868 Fya/Fyb

58

0,862 Fya/Fyb

59

0,862 Fya/Fyb

60

0,860 Fya/Fyb

61

0,854 Fya/Fyb

62

0,851 Fya/Fyb

63

0,841 Fya/Fyb

64

0,831 Fya/Fyb

65

0,819 Fya/Fyb

66

0,817 Fya/Fyb

67

0,816 Fya/Fyb

68

0,812 Fya/Fyb

69

0,808 Fya/Fyb

70

0,792 Fya/Fyb

71

0,788 Fya/Fyb

72

0,787 Fya/Fyb

73

0,787 Fya/Fyb

74

0,779 Fya/Fyb

75

0,772 Fya/Fyb

76

0,772 Fya/Fyb

77

0,070 Fya/Fya Fya/Fya < 0,050

78

0,049 Fya/Fya

79

0,041 Fya/Fya

80

0,040 Fya/Fya

81

0,034 Fya/Fya

82

0,032 Fya/Fya

83

0,029 Fya/Fya

84

0,025 Fya/Fya

85

0,025 Fya/Fya

86

0,024 Fya/Fya

87

0,024 Fya/Fya

88

0,018 Fya/Fya

89

0,017 Fya/Fya

90

0,016 Fya/Fya

91

0,016 Fya/Fya

92

0,016 Fya/Fya

93

0,016 Fya/Fya

94

0,015 Fya/Fya

95

0,014 Fya/Fya

96

0,013 Fya/Fya

97

0,012 Fya/Fya

98

0,010 Fya/Fya

99

0,009 Fya/Fya

100

0,007 Fya/Fya

101

0,007 Fya/Fya

102

0,006 Fya/Fya

103

0,006 Fya/Fya

104

0,002 Fya/Fya

105

0,002 Fya/Fya

106

0,000 Fya/Fya

107

0,000 Fya/Fya

108

0,000 Fya/Fya

Tabla 5

N.º

Razón alélica Genotipo

a/(a+b)

1

1,000 Jka/Jka Jka/Jka > 0,870

2

1,000 Jka/Jka

3

1,000 Jka/Jka

4

0,988 Jka/Jka

5

0,975 Jka/Jka

6

0,974 Jka/Jka

7

0,960 Jka/Jka

8

0,954 Jka/Jka

9

0,942 Jka/Jka

10

0,942 Jka/Jka

11

0,939 Jka/Jka

12

0,938 Jka/Jka

13

0,934 Jka/Jka

14

0,934 Jka/Jka

15

0,930 Jka/Jka

16

0,930 Jka/Jka

17

0,924 Jka/Jka

18

0,924 Jka/Jka

19

0,923 Jka/Jka

20

0,921 Jka/Jka

21

0,921 Jka/Jka

22

0,920 Jka/Jka

23

0,920 Jka/Jka

24

0,919 Jka/Jka

25

0,917 Jka/Jka

26

0,913 Jka/Jka

27

0,913 Jka/Jka

28

0,911 Jka/Jka

29

0,910 Jka/Jka

30

0,910 Jka/Jka

31

0,909 Jka/Jka

32

0,909 Jka/Jka

33

0,907 Jka/Jka

34

0,907 Jka/Jka

35

0,906 Jka/Jka

36

0,906 Jka/Jka

37

0,902 Jka/Jka

38

0,895 Jka/Jka

39

0,873 Jka/Jka

40

0,269 Jka/Jkb 0,175 < Jka/Jkb < 0,260

41

0,256 Jka/Jkb

42

0,243 Jka/Jkb

43

0,240 Jka/Jkb

44

0,239 Jka/Jkb

45

0,233 Jka/Jkb

46

0,221 Jka/Jkb

47

0,221 Jka/Jkb

48

0,218 Jka/Jkb

49

0,215 Jka/Jkb

50

0,212 Jka/Jkb

51

0,212 Jka/Jkb

52

0,210 Jka/Jkb

53

0,209 Jka/Jkb

54

0,206 Jka/Jkb

55

0,204 Jka/Jkb

56

0,203 Jka/Jkb

57

0,203 Jka/Jkb

58

0,200 Jka/Jkb

59

0,197 Jka/Jkb

60

0,193 Jka/Jkb

61

0,184 Jka/Jkb

62

0,016 Jkb/Jkb Jkb/Jkb < 0,016

63

0,014 Jkb/Jkb

64

0,014 Jkb/Jkb

65

0,014 Jkb/Jkb

66

0,013 Jkb/Jkb

67

0,011 Jkb/Jkb

68

0,010 Jkb/Jkb

69

0,009 Jkb/Jkb

70

0,009 Jkb/Jkb

71

0,009 Jkb/Jkb

72

0,009 Jkb/Jkb

73

0,009 Jkb/Jkb

74

0,008 Jkb/Jkb

75

0,008 Jkb/Jkb

76

0,007 Jkb/Jkb

77

0,007 Jkb/Jkb

78

0,004 Jkb/Jkb

79

0,004 Jkb/Jkb

80

0,001 Jkb/Jkb

81

0,001 Jkb/Jkb

82

0,001 Jkb/Jkb

83

0,000 Jkb/Jkb

84

0,000 Jkb/Jkb

85

0,000 Jkb/Jkb

86

0,000 Jkb/Jkb

87

0,000 Jkb/Jkb

88

0,000 Jkb/Jkb

89

0,000 Jkb/Jkb

90

0,000 Jkb/Jkb

91

0,000 Jkb/Jkb

92

0,000 Jkb/Jkb

93

0,000 Jkb/Jkb

94

0,000 Jkb/Jkb

Tabla 6

N.º

Razón alélica Genotipo

b/(a+b)

1

1,000 Jsb/Jsb Jsb/Jsb > 0,831

2

1,000 Jsb/Jsb

3

1,000 Jsb/Jsb

4

1,000 Jsb/Jsb

5

1,000 Jsb/Jsb

6

1,000 Jsb/Jsb

7

1,000 Jsb/Jsb

8

1,000 Jsb/Jsb

9

1,000 Jsb/Jsb

10

1,000 Jsb/Jsb

11

1,000 Jsb/Jsb

12

0,993 Jsb/Jsb

13

0,993 Jsb/Jsb

14

0,991 Jsb/Jsb

15

0,990 Jsb/Jsb

16

0,988 Jsb/Jsb

17

0,987 Jsb/Jsb

18

0,986 Jsb/Jsb

19

0,984 Jsb/Jsb

20

0,983 Jsb/Jsb

21

0,983 Jsb/Jsb

22

0,979 Jsb/Jsb

23

0,979 Jsb/Jsb

24

0,978 Jsb/Jsb

25

0,973 Jsb/Jsb

26

0,973 Jsb/Jsb

27

0,972 Jsb/Jsb

28

0,972 Jsb/Jsb

29

0,971 Jsb/Jsb

30

0,967 Jsb/Jsb

31

0,966 Jsb/Jsb

32

0,964 Jsb/Jsb

33

0,962 Jsb/Jsb

34

0,960 Jsb/Jsb

35

0,955 Jsb/Jsb

36

0,953 Jsb/Jsb

37

0,953 Jsb/Jsb

38

0,949 Jsb/Jsb

39

0,949 Jsb/Jsb

40

0,949 Jsb/Jsb

41

0,948 Jsb/Jsb

42

0,946 Jsb/Jsb

43

0,944 Jsb/Jsb

44

0,940 Jsb/Jsb

45

0,932 Jsb/Jsb

46

0,931 Jsb/Jsb

47

0,930 Jsb/Jsb

48

0,929 Jsb/Jsb

49

0,929 Jsb/Jsb

50

0,923 Jsb/Jsb

51

0,916 Jsb/Jsb

52

0,908 Jsb/Jsb

53

0,900 Jsb/Jsb

54

0,899 Jsb/Jsb

55

0,899 Jsb/Jsb

56

0,897 Jsb/Jsb

57

0,896 Jsb/Jsb

58

0,894 Jsb/Jsb

59

0,893 Jsb/Jsb

60

0,893 Jsb/Jsb

61

0,893 Jsb/Jsb

62

0,891 Jsb/Jsb

63

0,891 Jsb/Jsb

64

0,887 Jsb/Jsb

65

0,886 Jsb/Jsb

66

0,885 Jsb/Jsb

67

0,879 Jsb/Jsb

68

0,877 Jsb/Jsb

69

0,877 Jsb/Jsb

70

0,875 Jsb/Jsb

71

0,868 Jsb/Jsb

72

0,857 Jsb/Jsb

73

0,853 Jsb/Jsb

74

0,852 Jsb/Jsb

75

0,852 Jsb/Jsb

76

0,845 Jsb/Jsb

77

0,838 Jsb/Jsb

78

0,835 Jsb/Jsb

79

0,830 Jsb/Jsb

80

0,828 Jsb/Jsb

81

0,545 Jsa/Jsb 0,509 < Jsa/Jsb < 0,562

82

0,526 Jsa/Jsb

Tabla 7

N.º

Razón alélica Genotipo

k/(K+k)

1

0,830 kk

2

0,828 kk

3

0,807 kk

4

0,807 kk

5

0,792 kk

6

0,790 kk

7

0,787 kk

8

0,783 kk

9

0,775 kk

10

0,773 kk

11

0,772 kk

12

0,772 kk

13

0,771 kk

14

0,770 kk

15

0,769 kk

16

0,767 kk

17

0,764 kk

18

0,763 kk

19

0,763 kk

20

0,759 kk

21

0,759 kk

22

0,759 kk

23

0,757 kk

24

0,756 kk

25

0,754 kk

26

0,754 kk

27

0,752 kk

28

0,748 kk

29

0,748 kk

30

0,748 kk

31

0,744 kk

32

0,743 kk

33

0,742 kk

34

0,741 kk

35

0,737 kk

36

0,735 kk

37

0,732 kk

38

0,731 kk

39

0,729 kk

40

0,729 kk

41

0,726 kk

42

0,726 kk

43

0,726 kk

44

0,724 kk

45

0,723 kk

46

0,722 kk

47

0,721 kk

48

0,710 kk

49

0,710 kk

50

0,710 kk

51

0,709 kk

52

0,709 kk

53

0,708 kk

54

0,708 kk

55

0,706 kk

56

0,704 kk

57

0,699 kk

58

0,697 kk

59

0,697 kk

60

0,696 kk

61

0,695 kk

62

0,695 kk

63

0,692 kk

64

0,692 kk

65

0,691 kk

66

0,690 kk

67

0,683 kk

68

0,681 kk

69

0,680 kk

70

0,679 kk

71

0,673 kk

72

0,673 kk

73

0,672 kk

74

0,669 kk

75

0,668 kk

76

0,665 kk

77

0,664 kk

78

0,656 kk

79

0,653 kk

80

0,549 kk 0,502 < K/k < 0,550

81

0,537 kk

82

0,535 kk

83

0,531 kk

84

0,531 kk

85

0,527 kk

86

0,521 kk

87

0,520 kk

88

0,518 kk

89

0,517 kk

90

0,504 kk

91

0,025 KK K/K < 0,036

92

0,022 KK

93

0,006 KK

94

0,004 KK

Tabla 8

N.º

Razón alélica Genotipo

b/(b+a)

1

0,953 Kpb/Kpb Kpb/Kpb > 0,867

2

0,951 Kpb/Kpb

3

0,950 Kpb/Kpb

4

0,947 Kpb/Kpb

5

0,946 Kpb/Kpb

6

0,945 Kpb/Kpb

7

0,943 Kpb/Kpb

8

0,943 Kpb/Kpb

9

0,942 Kpb/Kpb

10

0,942 Kpb/Kpb

11

0,940 Kpb/Kpb

12

0,939 Kpb/Kpb

13

0,937 Kpb/Kpb

14

0,934 Kpb/Kpb

15

0,933 Kpb/Kpb

16

0,932 Kpb/Kpb

17

0,930 Kpb/Kpb

18

0,929 Kpb/Kpb

19

0,928 Kpb/Kpb

20

0,928 Kpb/Kpb

21

0,927 Kpb/Kpb

22

0,926 Kpb/Kpb

23

0,925 Kpb/Kpb

24

0,925 Kpb/Kpb

25

0,924 Kpb/Kpb

26

0,923 Kpb/Kpb

27

0,921 Kpb/Kpb

28

0,921 Kpb/Kpb

29

0,921 Kpb/Kpb

30

0,919 Kpb/Kpb

31

0,918 Kpb/Kpb

32

0,916 Kpb/Kpb

33

0,915 Kpb/Kpb

34

0,915 Kpb/Kpb

35

0,915 Kpb/Kpb

36

0,914 Kpb/Kpb

37

0,912 Kpb/Kpb

38

0,912 Kpb/Kpb

39

0,912 Kpb/Kpb

40

0,911 Kpb/Kpb

41

0,911 Kpb/Kpb

42

0,911 Kpb/Kpb

43

0,909 Kpb/Kpb

44

0,909 Kpb/Kpb

45

0,908 Kpb/Kpb

46

0,908 Kpb/Kpb

47

0,908 Kpb/Kpb

48

0,905 Kpb/Kpb

49

0,905 Kpb/Kpb

50

0,905 Kpb/Kpb

51

0,900 Kpb/Kpb

52

0,897 Kpb/Kpb

53

0,893 Kpb/Kpb

54

0,893 Kpb/Kpb

55

0,890 Kpb/Kpb

56

0,890 Kpb/Kpb

57

0,889 Kpb/Kpb

58

0,888 Kpb/Kpb

59

0,888 Kpb/Kpb

60

0,888 Kpb/Kpb

61

0,86 Kpb/Kpb

62

0,882 Kpb/Kpb

63

0,882 Kpb/Kpb

64

0,882 Kpb/Kpb

65

0,880 Kpb/Kpb

66

0,872 Kpb/Kpb

67

0,862 Kpb/Kpb

68

0,862 Kpb/Kpb

69

0,853 Kpb/Kpb

70

0,357 Kpa/Kpb 0,342 < Kpa/Kpb < 0,364

71

0,349 Kpa/Kpb

72

0,025 Kpa/Kpa Kpa/Kpa < 0,031

73

0,005 Kpa/Kpa

74

0,004 Kpa/Kpa

75

0,003 Kpa/Kpa

Tabla 9

N.º

Razón alélica Genotipo

s/(S+s)

1

1,000 ss s/s > 0,860

2

0,992 ss

3

0,990 ss

4

0,989 ss

5

0,981 ss

6

0,979 ss

7

0,979 ss

8

0,978 ss

9

0,977 ss

10

0,976 ss

11

0,972 ss

12

0,967 ss

13

0,964 ss

14

0,961 ss

15

0,958 ss

16

0,956 ss

17

0,955 ss

18

0,954 ss

19

0,951 ss

20

0,948 ss

21

0,947 ss

22

0,946 ss

23

0,945 ss

24

0,944 ss

25

0,944 ss

26

0,943 ss

27

0,942 ss

28

0,941 ss

29

0,939 ss

30

0,938 ss

31

0,936 ss

32

0,936 ss

33

0,932 ss

34

0,929 ss

35

0,928 ss

36

0,925 ss

37

0,922 ss

38

0,920 ss

39

0,918 ss

40

0,909 ss

41

0,909 ss

42

0,908 ss

43

0,895 ss

44

0,887 ss

45

0,885 ss

46

0,883 ss

47

0,879 ss

48

0,879 ss

49

0,878 ss

50

0,878 ss

51

0,880 ss

52

0,073 ss 0,014 < S/s < 0,059

53

0,052 ss

54

0,050 ss

55

0,047 ss

56

0,045 ss

57

0,038 ss

58

0,036 ss

59

0,035 ss

60

0,034 ss

61

0,034 ss

62

0,034 ss

63

0,033 ss

64

0,033 ss

65

0,032 ss

66

0,032 ss

67

0,032 ss

68

0,032 ss

69

0,032 ss

70

0,031 ss

71

0,030 ss

72

0,030 ss

73

0,029 ss

74

0,016 ss

75

0,009 SS S/S < 0,009

76

0,008 SS

77

0,007 SS

78

0,007 SS

79

0,006 SS

80

0,006 SS

81

0,005 SS

82

0,005 SS

83

0,004 SS

84

0,004 SS

85

0,004 SS

86

0,004 SS

87

0,003 SS

88

0,003 SS

89

0,002 SS

90

0,002 SS

91

0,002 SS

92

0,002 SS

93

0,002 SS

94

0,001 SS

95

0,001 SS

96

0,001 SS

97

0,000 SS

Tabla 10

N.º

Razón alélica Genotipo

b/(a+b)

1

1,000 Lub/Lub Lub/Lub < 0,880

2

1,000 Lub/Lub

3

1,000 Lub/Lub

4

1,000 Lub/Lub

5

1,000 Lub/Lub

6

1,000 Lub/Lub

7

1,000 Lub/Lub

8

0,998 Lub/Lub

9

0,986 Lub/Lub

10

0,985 Lub/Lub

11

0,980 Lub/Lub

12

0,970 Lub/Lub

13

0,969 Lub/Lub

14

0,958 Lub/Lub

15

0,957 Lub/Lub

16

0,956 Lub/Lub

17

0,956 Lub/Lub

18

0,950 Lub/Lub

19

0,949 Lub/Lub

20

0,947 Lub/Lub

21

0,947 Lub/Lub

22

0,947 Lub/Lub

23

0,947 Lub/Lub

24

0,946 Lub/Lub

25

0,945 Lub/Lub

26

0,944 Lub/Lub

27

0,942 Lub/Lub

28

0,941 Lub/Lub

29

0,940 Lub/Lub

30

0,940 Lub/Lub

31

0,939 Lub/Lub

32

0,938 Lub/Lub

33

0,936 Lub/Lub

34

0,933 Lub/Lub

35

0,932 Lub/Lub

36

0,930 Lub/Lub

37

0,928 Lub/Lub

38

0,927 Lub/Lub

39

0,925 Lub/Lub

40

0,922 Lub/Lub

41

0,912 Lub/Lub

42

0,910 Lub/Lub

43

0,907 Lub/Lub

44

0,907 Lub/Lub

45

0,901 Lub/Lub

46

0,901 Lub/Lub

47

0,899 Lub/Lub

48

0,898 Lub/Lub

49

0,892 Lub/Lub

50

0,872 Lub/Lub

51

0,651 Lua/Lub 0,540 < Lua/Lub < 0,695

52

0,627 Lua/Lub

53

0,575 Lua/Lub

54

0,301 Lua/Lua Lua/Lua < 0,307

55

0,291 Lua/Lua

56

0,289 Lua/Lua

Tabla 11

Sistema

Razón alélica para la determinación del genotipo*

MNS

s/s > 0,860 0,059 > S/s > 0,014 S/S < 0,009

Duffy

Fyb/ Fyb > 0,931 0,902 > Fya/ Fyb > 0,752 Fya/ Fya > 0,050

Kell

Kpb/Kpb > 0,867 0,364 > Kpa/Kpb > 0,342 Kpa/Kpa < 0,031

Jsb/Jsb > 0,831 0,562

0,562 > Jsa/Jsb > 0,509 Jsa/Jsa < N D **

k/k > 0,647

0,550 > K/k > 0,502 K/K < 0,036

Lu

Lub/Lub > 0,880 0,695 > Lua/Lub > 0,540 Lua/Lua < 0,307

Co

Coa/Coa > 0,941 0,754 > Coa/Cob > 0,652 Cob/Cob < 0,116

Jk

Jka/Jka > 0,870 0,260 > Jka/Jkb > 0,175 Jkb/Jkb < 0,016

* intervalos de referencia obtenidos a partir del promedio de las razones alélicas de las muestras individuales más y/o menos dos desviaciones estándar ** muestras de Jsa/Jsa no disponibles

BIBLIOGRAFÍA

1) Castilho L. et al. Transfusion 2002; 42(2):232-240 5

2) Montalvo L. et al. Transfusion 2004; 44(5):694-702

3) Reid ME. Vox Sanguinis 2002; 83(1): 91-93

4) Ferri G. et al. Journal of Forensic Sciences 2006; 51:357-360

5) Denomme G. et al. Transfusion 2005; 45: 660-666

6) Petrik J. Vox Sanguinis 2001; 80: 1-11

7) Beiboer S. et al. Transfusion 2005; 45:667-679

8) Kellar KL. et al., J. Immunol. Methods 2003; 279(1-2): 277-285

9) Kettman JR et al. Cytometry 1998; 33(2): 234-243 5

10) Fulton RF et al. Clinical Chemistry 1997; 43(9): 1749-1756

11) Earley MC et al. Cytometry 2002; 50(5): 239-242

12) Colinas RF et al. Clinical Chemistry 2000; 46 (7): 996-998

13) Dunbar SA et al. Clinical chemistry 2000; 46 1498-1500

14) Dunbar SA et al. 2005; Methods Mol Med 114: 147-71 10

15) Dunbar SA et al. 2006; Clinica Chimica Acta (363) 71-82

16) Lee et al. 1997; Vox Sanguinis 73 (1): 1-11

17) Hashmi et al. 2005; Transfusion 45: 680-688

18) El Nemer W. et al. 1997; Blood 89 (12): 4608-4616

19) Irshaid et al. 1998; British Journal of Haematology 102: 1010-1014 15

20) Deregt D. et al. 2006; Journal of virological Methods 136:7-23

21) Schmitt M. et al. 2006; J. Clin Microbiol (44) 2: 504-512

22) Diaz M. JCM Agosto de 2005; (43) 3662-3672

LISTADO DE SECUENCIAS

20

<110> Fondazione IRCSS Ospedale Maggiore Policlinico Mangiagalli e Regina Elena

<120> PROCEDIMIENTO PARA LA TIPIFICACIÓN GENÓMICA DE SISTEMAS ERITROCITARIOS, SONDAS OLIGONUCLEOTÍDICAS Y KITS DE DIAGNÓSTICO RELACIONADOS

25

<130> PCT 93967

<150> MI2007A000504

<151> 13-03-2007

30

<160> 40

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1 35

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 40

<223> Cebador directo K5F

<400> 1

tttagtcctc actcccatgc ttcc 24 45

<210> 2

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial 50

<220>

<223> Cebador inverso K6R

<400> 2

tatcacacag gtgtcctctc ttcc 24 5

<210> 3

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial 10

<220>

<223> Cebador directo KpF

<400> 3 15

tgaggccagg agaaaagca 19

<210> 4

<211> 21 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso KpR 25

<400> 4

tgaccatctg gaagagcttg c 21

30

<210> 5

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

35

<220>

<223> Cebador directo JSF

<400> 5

40

aactttgcca tgctcctgg 19

<210> 6

<211> 20

<212> ADN 45

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso JSR

50

<400> 6

gccttgacac ttgcatacct 20

<210> 7 55

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 60

<223> Cebador directo LU91mF

<400> 7

ctgaggagcg ctgggacacc cgg 23 65

<210> 8

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 5

<223> Cebador inverso Lu92R

<400> 8

ccccgggtgt cgtgcatt 18 10

<210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 15

<220>

<223> Cebador directo SsF

<400> 9 20

aagactgaca cattacctca 20

<210> 10

<211> 20 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso SsR 30

<400> 10

aacatacctg gtacagtgaa 20

35

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

40

<220>

<223> Cebador directo coF3

<400> 11

45

tataaatagg cccagcccag 20

<210> 12

<211> 19

<212> ADN 50

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso CoR3

55

<400> 12

ccagcgacac cttcacgtt 19

<210> 13 60

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 65

<223> Cebador directo Duffy-F2

<400> 13

cttccggtgt aactctgatg g 21

<210> 14 5

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 10

<223> Cebador inverso Duffy R3

<400> 14

catccagcag gttacaggag t 21 15

<210> 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial 20

<220>

<223> Cebador directo JK-78-F3

<400> 15 25

catgctgcca taggatcatt gc 22

<210> 16

<211> 20 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso JK-943-R3 35

<400> 16

gagccaggag gtgggtttgc 20

40

<210> 17

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

45

<220>

<223> Secuencia de sonda k

<400> 17

50

ttaaccgaac gctgagac 18

<210> 18

<211> 18

<212> ADN 55

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de sonda K

60

<400> 18

ttaaccgaat gctgagac 18

<210> 19 65

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo

5

<400> 19

ctatcccaaa gctaaggc 18

<210> 20 10

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15

<223> Secuencia de sonda Kpb

<400> 20

atcacttcac ggctgttcca 20 20

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 25

<220>

<223> Secuencia de sonda Kpa

<400> 21 30

tcacttcatg gctgttccag 20

<210> 22

<211> 20 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo 40

<400> 22

aactctacgg ggctcttcga 20

45

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

50

<220>

<223> Secuencia de sonda Jsb

<400> 23

55

ggctgcctcg cctgtgacaa 20

<210> 24

<211> 20

<212> ADN 60

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de sonda Jsa

65

<400> 24

ggctgccccg cctgtgacaa 20

<210> 25

<211> 20

<212> ADN 5

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo

10

<400> 25

gccagccacg cgtgtcacta 20

<210> 26 15

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20

<223> Secuencia de sonda Lua

<400> 26

tcgcccccgc ctagcctc 18 25

<210> 27

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial 30

<220>

<223> Secuencia de sonda Lub

<400> 27 35

tcgcccccac ctagcctc 18

<210> 28

<211> 18 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo 45

<400> 28

tagcctcctc caagacta 18

50

<210> 29

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

55

<220>

<223> Secuencia de sonda s

<400> 29

60

taggagaaac gggacaactt 20

<210> 30

<211> 20

<212> ADN 65

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de sonda S

<400> 30

5

aggagaaatg ggacaacttg 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN 10

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo

15

<400> 31

tcggataaaa gagaccactg 20

<210> 32 20

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 25

<223> Secuencia de sonda Coa

<400> 32

aaccagacgg cggtccagga 20 30

<210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial 35

<220>

<223> Secuencia de sonda Cob

<400> 33 40

caaccagacg gtggtccagg 20

<210> 34

<211> 20 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo 50

<400> 34

agccacactg gggacctgga 20

55

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

60

<220>

<223> Secuencia de sonda Fya

<400> 35

65

gagactatgg tgccaacctg 20

<210> 36

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

5

<220>

<223> Secuencia de sonda Fyb

<400> 36

10

tggagactat gatgccaacc 20

<210> 37

<211> 20

<212> ADN 15

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo

20

<400> 37

gaggctatcc tgacaagctt 20

<210> 38 25

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 30

<223> Secuencia de sonda Jka

<400> 38

agtagatgtc ctcaaatg 18 35

<210> 39

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial 40

<220>

<223> Secuencia de sonda Jkb

<400> 39 45

aggtaggatg gttctcaaat g 21

<210> 40

<211> 18 50

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de control negativo 55

<400> 40

cgtggatttc ttcagagg 18

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. Utilización de por lo menos un conjunto de sondas oligonucleotídicas modificadas con amino en el extremo 5’, caracterizada porque presentan una longitud de secuencia comprendida entre 18 y 20 nucleótidos que contienen en o en la proximidad al centro de la secuencia de la sonda el SNP específico para cada uno de los alelos diana que pertenecen al locus genómico X, seleccionados de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, 5 Jka/Jkb que pueden hibridar específicamente con cada uno de dichos alelos; estando dichas sondas caracterizadas porque están acopladas a una microesfera marcada con por lo menos una sustancia fluorescente y porque comprenden o están constituidas por lo menos por un conjunto de secuencias de oligonucleótidos indicadas en la siguiente tabla:

   Sonda

   Conjunto de sondas Número de conjunto

   k K NC

   TTAACCgAACgCTgAgAC (SEC ID nº:17) TTAACCgAATgCTgAgAC (SEC ID nº: 18) CTATCCCAAAgCTAAggC (SEC ID nº:19) 1

   Kpb Kpa NC

   ATCACTTCACggCTgTTCCA (SEC ID nº:20) TCACTTCATggCTgTTCCAg (SEC ID nº:21) AACTCTACAgggCTCTTCgA (SEC ID nº:221 2

   Jsb Jsa NC

   ggCTgCCTCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:23) ggCTgCCCCgCCTgTgACAA (SEC ID nº:24) gCCAgCCACgCgTgTCACTA (SEC ID nº:25) 3

   Lua Lub NC

   TCgCCCCCgCCTAgCCTC (SEC ID nº:26) TCgCCCCCACCTAgCCTC (SEC ID nº:27) TAgCCTCCTCCAAgACTA (SEC ID nº:28) 4

   s S NC

   TAggAgAAACgggACAACTT (SEC ID nº:29) AggAgAAATgggACAACTTg (SEC ID nº:30) TCggATAAAAgAgACCACTg (SEC ID nº:31) 5

   Coa Cob NC

   AACCAgACggCggTCCAggA (SEC ID nº:32) CAACCAgACggTggTCCAgg (SEC ID nº:33) AgCCACACTggggACCTggA (SEC ID nº:34) 6

   Fya Fyb NC

   GAgACTATggTgCCAACCTg (SEC ID nº:35) TggAgACTATgATgCCAACC (SEC ID nº:36) GAggCTATCCTgACAAgCTT (SEC ID nº:37) 7

   Jka Jkb NC

   AgTAgATgTCCTCAAATg (SEC ID nº:38) AgTAgATgTTCTCAAATg (SEC ID nº:39) CgTgggATTTCTTCAgAgg (SEC ID nº:40) 8

   10

   en la que dichos conjuntos de sondas oligonucleotídicas se utilizan a las temperaturas de hibridación específicas indicadas en la tabla siguiente:

   Número de conjunto

   THIBRIDACIÓN

   1

   45ºC

   2

   54ºC

   3

   54ºC

   4

   45ºC

   5

   54ºC

   6

   64ºC

   7

   54ºC

   8

   37ºC

   para la identificación y tipificación de por lo menos un SNP del par alélico X siguiente seleccionado de entre K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb, Lua/Lub, S/s, Coa/Cob, Fya/Fyb, Jka/Jkb. 15
3. 2. Procedimiento para la identificación y tipificación de por lo menos un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) del sistema eritrocitario X en individual heterocigotos y homocigotos, que comprende las fases siguientes:

   a) extraer ADN de una muestra biológica;

   b) amplificar por PCR el locus genómico que comprende el SNP del sistema eritrocitario de interés, por medio de por lo menos un par de cebadores específico para un alelo diana seleccionado de entre: 20

   Alelos diana

   Secuencia del cebador (5’-3’)

   K/k

   Directo: TTTAgTCCTCACTCCCATgCTTCC (SEC ID nº:1)

   Inverso: TATCACACAggTgTCCTCTCTTCC (SEC ID nº:2)

   Kpa/Kpb

   Directo: TgAggCCAggAgAAAAgCA (SEC ID nº:3)

   Inverso: TgACCATCTggAAgAgCTTgC (SEC ID nº:4)

   Jsa/Jsb

   Directo: AACTTTgCCATgCTCCTgg (SEC ID nº:5)

   Inverso: gCCCTTgACACTTgCATACCT (SEC ID nº:6)

   Lua/Lub

   Directo: CTgAggAgCgCTgggACACCCgg (SEC ID nº:7)

   Inverso: CCCCgggTgTCgTgCATT (SEC ID nº:8)

   S/s

   Directo: AAgACTgACACATTACCTCA (SEC ID nº:9)

   Inverso: AACATACCTggTACAgTgAA (SEC ID nº:10)

   Coa/Cob

   Directo: TATAAATAggCCCAgCCCAg (SEQ ID NO.11)

   Inverso: CCAgCgACACCTTCACgTT (SEC ID nº: 12)

   Fya/Fyb

   Directo: CTTCCggTgTAACTCTgATgg (SEC ID nº:13)

   Inverso: CATCCAgCAggTTACAggAgT (SEC ID nº:14)

   Jka/Jkb

   Directo: CATgCTgCCATAggATCATTgC (SEC ID nº: 15)

   Inverso: gAgCCAggAggTgggTTTgC (SEC ID nº:16)

   en el que por lo menos un cebador está marcado en el extremo 5’ con biotina para obtener los productos de PCR biotinilados;

   c) hibridar los productos de PCR biotinilados obtenidos en la fase b) utilizando por lo menos un conjunto de 5 sondas oligonucleotídicas según la reivindicación 1 y marcando con estreptavidina-ficoeritrina a la temperatura específica para cada sistema tal como se indica en la tabla siguiente:

   Sonda

   Conjunto de sondas THIBRIDACIÓN

   k K NC

   TTAACCgAACgCTgAgAC TTAACCgAATgCTgAgAC CTATCCCAAAgCTAAggC 45ºC

   Kpb Kpa NC

   ATCACTTCACggCTgTTCCA TCACTTCATggCTgTTCCAg AACTCTACggggCTCTTCgA 54ºC

   Jsb Jsa NC

   ggCTgCCTCgCCTgTgACAA ggCTgCCCCgCCTgTgACAA gCCAgCCACgCgTgTCACTA 54ºC

   Lua Lub NC

   TCgCCCCCgCCTAgCCTC TCgCCCCCACCTAgCCTC TAgCCTCCTCCAAgACTA 45ºC

   s S NC

   TAggAgAAACgggACAACTT AggAgAAATgggACAACTTg TCggATAAAAgAgACCACTg 54ºC

   Coa Cob NC

   AACCAgACggCggTCCAggA CAACCAgACggTggTCCAgg AgCCACACTggggACCTggA 64ºC

   Fya Fyb NC

   gAgACTATggTgCCAACCTg TggAgACTATgATgCCAACC gAggCTATCCTgACAAgCTT 54ºC

   Jka Jkb NC

   AgTAgATgTCCTCAAATg AgTAgATgTTCTCAAATg CgTggATTTCTTCAgAgg 37ºC

   e) revelar la fluorescencia con un instrumento basado en un citómetro de flujo.