ES2357553T3 - Anticuuerpo anti-cd4 trx1 que no disminuye el número de células y sus usos. - Google Patents
Anticuuerpo anti-cd4 trx1 que no disminuye el número de células y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo anti-CD4 humanizado que no disminuye el número de células que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, teniendo la cadena ligera las tres CDRs de la cadena ligera KASQSVDYDGDSYMN, VASNLES y QQSLQDPPT, y teniendo la cadena pesada las tres CDRs de la cadena pesada AYVIS, EIYPGSGSSYYNEKFKG y SGDGSRFVY, teniendo el anticuerpo una porción Fc no glicosilada.
Description
Anticuerpo anti-CD4 TRX1 que no
disminuye el número de células y sus usos.
La presente invención es aplicable a la
inhibición, la prevención o la mejora de una respuesta inmune frente
a un(os) antígeno(s). Tal inhibición, prevención o
mejora de una respuesta inmune frente a un(os)
antígeno(s) incluye inducir una tolerancia hacia
el(los) antígeno(s). Esta invención también se refiere
a la inducción de la tolerancia y/o a la prevención o a la
inhibición de la activación y la proliferación de los linfocitos T
y, más particularmente, a la inducción de la tolerancia en un
primate.
La tolerancia hacia un antígeno o un tejido
extraños, o hacia un antígeno o un tejido propios es un estado en el
que un sistema inmunitario maduro, por lo demás normal, es incapaz
de responder agresivamente de forma específica contra ese
antígeno/tejido, el cual es tratado, por lo tanto, como un
tejido/componente corporal normal (no enfermo), sin embargo, al
mismo tiempo, puede responder agresivamente contra antígenos/tejidos
extraños o enfermos, hacia los que no se ha vuelto específicamente
tolerante por el procedimiento natural de autotolerancia o creando
un entorno tolerante-permisivo in vivo. D2
(Isaacs y col., Clin. Exp. Inmmunology 1997; 110; págs.
158-166) describe un anticuerpo
anti-CD4 humanizado que no disminuye el número de
células, pero que muestra una toxicidad grave de la dosis inicial
después de la administración.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un anticuerpo anti-CD4
humanizado que no disminuye el número de células, que comprende una
cadena ligera y una cadena pesada, teniendo la cadena ligera las
tres CDRs de la cadena ligera KASQSVDYDGDSYMN, VASNLES y QQSLQDPPT y
teniendo la cadena pesada las tres CDRs de la cadena pesada AYVIS,
EIYPGSGSSYYNEKFKG y SGDGSRFVY, teniendo el anticuerpo una porción Fc
no glicosilada.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención se proporcionan usos para dichos anticuerpos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un procedimiento para inducir tolerancia
en un primate por medio del uso de dichos anticuerpos mediante el
uso de un régimen de dosificación que induce dicha tolerancia en un
primate.
La Figura 1 muestra las secuencias de
aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de un ejemplo del
anticuerpo TRX1, así como las regiones CDRs y de armazón de las
cadenas pesada y ligera.
La Figura 2 muestra las secuencias de
aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de una realización del
anticuerpo TRX1 presente, así como las regiones CDRs y de armazón de
las cadenas pesada y ligera.
La Figura 3 muestra las secuencias de
aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de otro ejemplo del
anticuerpo TRX1, así como las regiones CDRs y de armazón de las
cadenas pesada y ligera.
La Figura 4 muestra las secuencias de
aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de una segunda
realización del anticuerpo TRX1 presente, así como las regiones CDRs
y de armazón de las cadenas pesada y ligera.
La Figura 5 muestra la respuesta inmune frente a
antivenina en los primeros 68 días (es decir, la fase de tolerancia)
de un estudio de grupos de mandriles a los que se suministró
antivenina sola o junto con el anticuerpo TRX1.
La Figura 6 muestra la respuesta inmune frente a
antivenina, subsiguiente a un estímulo con antivenina y con glóbulos
rojos de oveja, en grupos de mandriles a los que se había
suministrado antivenina sola o junto con el anticuerpo TRX1, 68 días
antes del estímulo.
La Figura 7 muestra la respuesta inmune frente a
antivenina, posterior a cada uno de los tres estímulos con
antivenina, en grupos de mandriles a los que se había suministrado
antivenina sola o junto con el anticuerpo TRX1, 68 días antes del
primer estímulo.
La Figura 8 es un diagrama que representa la
respuesta inmune frente a glóbulos rojos de oveja, después de la
inducción de la tolerancia con TRX1 hacia la antivenina.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para inducir la
tolerancia en un primate hacia un(os) antígeno(s)
mediante el uso de un anticuerpo de la presente invención, tal y
como se describe más adelante. El anticuerpo se administra en una
cantidad y de acuerdo con un régimen de dosificación que es eficaz
para inducir tolerancia en un primate. El anticuerpo es un
anticuerpo que cuando está presente en una reacción mixta de
linfocitos (MLR) primaria comparada con una reacción mixta de
linfocitos en ausencia del anticuerpo, reduce la cantidad de células
que son positivas para CD4 y CD25 (células CD4^{+} CD25^{+}), lo
que es el resultado de la reacción mixta de linfocitos. En una
realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo que reduce la
cantidad de tales células CD4^{+}
CD25^{+} en al menos el 40% y preferiblemente en al menos el 60% y aún más preferiblemente en al menos el 70%.
CD25^{+} en al menos el 40% y preferiblemente en al menos el 60% y aún más preferiblemente en al menos el 70%.
De aquí en adelante, bajo la referencia
"compuesto" se entiende que son los anticuerpos de la presente
invención.
En una realización preferida, tal compuesto
produce una población de células que inhibe una reacción mixta de
linfocitos (MLR) primaria (realizada con células que no se han
expuesto previamente al compuesto) reduciendo el número de células
CD4^{+} CD25^{+} producidas en la MLR primaria. En una
realización preferida, hay por lo menos una reducción del 10% y
preferiblemente por lo menos una reducción del 20%. Los protocolos
para realizar las reacciones mixtas de linfocitos descritas
anteriormente, se describen en el Ejemplo 5.
Además, en una realización preferida, el
compuesto es un compuesto que reduce la cantidad de células
CD4^{+} CD25^{+} producidas en una reacción mixta de linfocitos
primaria y genera una población de células en tal reacción mixta de
linfocitos primaria que inhibe una reacción mixta de linfocitos
secundaria. En una realización preferida, las células se generan en
una reacción mixta de linfocitos primaria que se realiza en
presencia del compuesto, cuyas células, cuando se añaden a la
reacción mixta de linfocitos secundaria, reducen preferentemente el
número de células CD4^{+} CD25^{+} generadas en tal reacción
mixta de linfocitos secundaria, en comparación con una reacción
mixta de linfocitos secundaria en ausencia de las células añadidas
en al menos el 20%, más preferiblemente en al menos el 35%, y más
preferiblemente en al menos el 50%.
Una inhibición de una MLR primaria o secundaria
de tal población de células se comprueba por una reducción de la
cantidad de células CD4^{+} CD25^{+}, producidas en la MLR,
comparada con la MLR realizada en ausencia de tal población de
células.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la
presente invención, un primate se trata con un compuesto que tiene
las características tal y como se han descrito anteriormente
(reducción de la cantidad de células CD4^{+} CD25^{+} producidas
en una MLR primaria in vitro, generando tal MLR primaria una
población de células que reduce la cantidad de células CD4^{+}
CD25^{+} producidas in vitro, en una MLR primaria y/o
secundaria y que realiza preferentemente tal reducción en ambas
MLRs, primaria y secundaria).
En una realización, las células generadas en la
MLR primaria en presencia del compuesto, son células que cuando se
añaden a una MLR secundaria (comparada con una MLR secundaria sin
las células añadidas) reducen y/o eliminan la generación de una o
varias citocinas; en particular, una o varias entre
IL-2, IL-4 e IL-12
en la MLR secundaria. Generalmente tal reducción de por lo menos una
entre IL-2, IL-4 e
IL-12 es de al menos el 40%, preferiblemente de al
menos el 60%.
Por tanto, un compuesto preferido es uno que
genera a células en una MLR primaria que en una MLR secundaria,
comparada con el testigo, reduce la producción de células CD4^{+}
CD25^{+}, o de una o varias o todas (preferiblemente todas) entre
IL-2, IL-4 e IL-12 y
reduce preferiblemente la producción a la vez de tales células y de
tales citocinas.
En esta memoria se describe una detección o una
prueba en la que los linfocitos T se exponen in vitro a
un(os) material(es) o a un(os)
compuesto(s) bajo unas condiciones que estimulan y provocan
que los linfocitos T proliferen, efectuándose dicha exposición en
presencia de un(os) compuesto(s) que se va a someter a
ensayo para estudiar su capacidad para inducir tolerancia. El ensayo
de proliferación de los linfocitos T puede ser una reacción mixta de
los linfocitos o un ensayo en el cual se provoca que los linfocitos
T proliferen mediante una estimulación no específica del antígeno, a
través del receptor de los linfocitos T (TCR) o un componente del
complejo del TCR, por ejemplo, un componente CD3. Típicamente, un
anticuerpo monoclonal anti-CD3 se utiliza para
estimular a los linfocitos T y provocar que proliferen. Además de la
estimulación a través del complejo de TCR, las señales
coestimuladoras a veces se proporcionan mediante la adición de
anticuerpos que se unen a moléculas coestimuladoras, tales como
CD28. Los linfocitos T que se han incitado a proliferar, en
presencia y en ausencia del compuesto que se va a someter a ensayo,
se examinan para determinar un subconjunto de linfocitos T que sea
positivo para CD4 (CD4^{+}) y positivo para CD25 (CD25^{+}),
para determinar si la presencia del compuesto inhibía la producción
de tal subconjunto de linfocitos T.
El ensayo in vitro que se utiliza para
someter a ensayo un(os) compuesto(s) para estudiar la
actividad que induce tolerancia, es preferiblemente una reacción
mixta de linfocitos (MLR). Las reacciones mixtas de linfocitos se
conocen en general en la técnica y un protocolo para las mismas se
describe en el Ejemplo 5.
La población de células producida en el ensayo
inicial se puede someter a ensayo a continuación en al menos un
ensayo más en donde los linfocitos T se estimulan in vitro
para proliferar, para determinar si tal población de células inhibe
la producción de células CD4^{+} CD25^{+}.
Al menos uno de los ensayos adicionales puede
ser una reacción mixta de linfocitos (una reacción mixta de
linfocitos primaria o secundaria) o un ensayo en el que se estimula
a los linfocitos T para proliferar como respuesta a una estimulación
no específica del antígeno, a través del receptor de los linfocitos
T (TCR) o un componente del complejo de TCR o con una coestimulación
que imita una estimulación específica del antígeno a través de
TCR.
Un protocolo para tal ensayo se describe en el
Ejemplo 5.
La detección o el ensayo puede implicar tanto el
ensayo inicial para determinar si el compuesto, en un ensayo in
vitro para estudiar la proliferación de los linfocitos T, tal
como una MLR, reduce la producción de las células CD4^{+}
CD25^{+}, como un ensayo subsiguiente para determinar si las
células producidas en el primer ensayo inhiben la producción de
células CD4^{+} CD25^{+} en un segundo ensayo de proliferación
de los linfocitos T, tal como una MLR primaria y/o secundaria y,
particularmente, una MLR secundaria y/o la producción de citocina en
una MLR secundaria.
El anticuerpo es uno que provoca la reducción de
la producción de células CD4^{+} CD25^{+} en el ensayo inicial y
produce una población de células en el mismo, que reduce la
producción de tal subconjunto de linfocitos T en un segundo ensayo,
tal y como se ha descrito anteriormente en esta memoria, y/o que
reduce la producción de citocinas y, en particular, una o varias
entre IL-2, IL-4 e IL12 en un
segundo ensayo.
El anticuerpo es un compuesto que cuando está
presente en un ensayo de proliferación de linfocitos T, tal como una
reacción mixta de linfocitos primaria (MLR), comparada con una
reacción mixta de linfocitos en ausencia del compuesto, reduce la
cantidad de células que son positivas para CD4 y CD25 (células
CD4^{+} CD25^{+}), que son el resultado de la reacción mixta de
linfocitos. En una realización preferida, el compuesto es un
compuesto que reduce la cantidad de tales células CD4^{+}
CD25^{+} en al menos el 60% y aún más preferiblemente en al menos
el 70%.
Además, en una realización preferida, el
compuesto seleccionado es un compuesto que reduce la cantidad de
células CD4^{+} CD25^{+} producidas en una reacción mixta de
linfocitos primaria y genera una población de células en tal
reacción mixta de linfocitos primaria que inhibe una reacción mixta
de linfocitos secundaria. En una realización preferida, las células
se generan en una reacción mixta de linfocitos primaria que se
realiza en presencia del compuesto, cuyas células cuando se añaden a
la reacción mixta de linfocitos secundaria reducen preferentemente
las células CD4^{+} CD25^{+} generadas en tal reacción mixta de
linfocitos secundaria, (comparada con una reacción mixta de
linfocitos secundaria en ausencia de las células añadidas) en al
menos el 20%, más preferiblemente en al menos el 35% y más
preferiblemente en al menos el 50%. En una realización preferida,
tales células en la MLR secundaria, comparadas con un testigo,
reducen la producción de por lo menos una entre
IL-2, IL-4 e IL-12
en al menos el 60%.
Una inhibición de una MLR primaria o secundaria
a través de tal población celular se muestra por una reducción de la
cantidad de células CD4^{+} CD25^{+} producidas en la MLR,
comparada con la MLR realizada en ausencia de tal población celular,
y en relación con la MLR secundaria, se puede mostrar por la
reducción de las células CD4^{+} CD25^{+} o una producción
reducida de las citocinas y preferiblemente por ambas.
Tal y como se emplea en esta memoria, el término
"tolerar" o "tolerante" en relación con un antígeno
significa que, sin requerir un nivel terapéutico o eficaz de un
inmunosupresor, el primate no produce una respuesta inmune adversa
frente al antígeno, durante un periodo de tiempo, después de
interrumpir el tratamiento, incluso cuando se estimula
posteriormente con el antígeno y/o cuando el antígeno sigue estando
presente en el primate, pero es capaz de proporcionar una respuesta
inmune contra otros antígenos.
El(los) antígeno(s) hacia el que
se induce la tolerancia, puede ser un antígeno propio o un antígeno
extraño.
El antígeno extraño puede ser uno o varios entre
los siguientes tipos de antígenos:
(i) un antígeno extraño presente en el tejido o
en las células trasplantadas, incluyendo el tejido o las células
presentes en un órgano, en donde el trasplante puede ser alogénico o
xenogénico;
(ii) un agente terapéutico (que también incluye
agentes terapéuticos utilizados para la prevención de la enfermedad)
que produce una respuesta inmune en un primate, en donde la
respuesta inmune disminuye la capacidad del agente para actuar como
agente terapéutico. Tales agentes incluyen, pero no están limitados
a los mismos, vehículos de entrega, tales como vectores utilizados
en la terapia génica; agentes activos tales como proteínas
suministradas al primate, tal como proteínas recombinantes tales
como anticuerpos monoclonales, enzimas, factores de coagulación y
algunos fármacos de molécula pequeña, o proteínas producidas a
partir de un agente suministrado al primate, como en la terapia
génica.
Los antígenos extraños hacia los cuales se
induce tolerancia, de acuerdo con la presente invención, no son
antígenos extraños tales como los presentes en bacterias, hongos,
virus, etc. que provocan enfermedad, que infectan un hospedador, es
decir, la expresión antígeno extraño no incluye un antígeno extraño
como parte de un organismo que infecta un primate y provoca una
enfermedad o un trastorno.
De acuerdo con un aspecto, un primate se trata
para producir tolerancia hacia un(os) antígeno(s)
tratando al primate con el anticuerpo CD4 en una cantidad y durante
un tiempo que sea eficaz para proporcionar dicha tolerancia, estando
presente el anticuerpo en el primate en un momento en el que dicho
antígeno también está presente en el primate, dando como resultado
con tal tratamiento que el primate sea tolerante hacia el antígeno.
Tal anticuerpo CD4 tiene las características descritas anteriormente
cuando se somete a ensayo in vitro en una MLR (reduce la
cantidad de células CD4^{+} CD25^{+} producidas en una MLR
primaria, y la población celular producida en la MLR primaria cuando
se somete a ensayo in vitro en por lo menos una MLR primaria
o secundaria reduce la cantidad de células CD4^{+} CD25^{+}
producidas en la misma).
El anticuerpo CD4 es un anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
El anticuerpo CD4 se administra a un primate en
una cantidad y durante un tiempo eficaz para inducir tolerancia
hacia un antígeno extraño o propio y preferiblemente hacia un
antígeno extraño.
De acuerdo con una realización preferida, el
anticuerpo CD4 se administra durante un periodo de tiempo para
mantener en el primate unos niveles apropiados de tal anticuerpo
durante un periodo de tiempo que sea suficiente para inducir la
tolerancia.
El anticuerpo se administra generalmente en una
dosis inicial de por lo menos aproximadamente 40 mg, preferiblemente
de al menos aproximadamente 50 mg y más preferiblemente en una
cantidad de al menos aproximadamente 70 mg.
En una realización preferida, la dosis inicial
es de al menos 400 mg, preferiblemente de al menos aproximadamente
500 mg y en una realización particular, en una cantidad de al menos
aproximadamente 700 mg.
La dosis inicial se puede administrar en una o
en varias dosis durante un periodo de veinticuatro horas y
preferiblemente en una dosis para veinticuatro horas.
Tal y como se emplea en esta memoria en
referencia a una cantidad de dosificación, una dosis es la cantidad
total de anticuerpo administrado durante un periodo de tiempo de
veinticuatro horas, incluso si se administra más de una vez en las
24 horas.
En la mayoría de los casos, después de la dosis
inicial, el anticuerpo CD4 se administra en una o varias dosis
complementarias durante varios días, administrándose cada dosis
complementaria en una o varias dosis en un periodo de tiempo de
veinticuatro horas. La(s) dosis complementaria(s) se
proporciona generalmente en una cantidad tal que los niveles séricos
del anticuerpo vuelvan a los que se habían conseguido con la dosis
inicial.
En una realización preferida, la dosis o las
dosis complementarias mínimas es una cantidad que es por lo menos
igual a las cantidades descritas anteriormente y que pueden ser
idénticas o no a la dosis suministrada como dosis original o
inicial. Así, una dosis complementaria es generalmente de al menos
40 mg, preferiblemente por lo menos 50 mg y más preferiblemente por
lo menos 70 mg. Tal y como se ha descrito anteriormente, en una
realización preferida, la(s) dosis complementaria(s)
es de al menos 400 mg, preferiblemente de al menos 500 mg y en una
realización particular, de al menos 700 mg. En algunos casos, la
dosis o las dosis complementarias pueden ser inferiores a la
cantidad mínima.
Si hay más de una de una dosis complementaria,
cada una de dichas dosis complementarias adicionales durante un
periodo de 24 horas, puede ser igual o diferente que otra dosis
complementaria.
El número de dosis complementarias variará, pero
en una realización preferida, hay generalmente por lo menos una
dosis complementaria y en la mayoría de los casos no hay más de
siete dosis complementarias, es decir, el número total de dosis no
excede generalmente las ocho dosis.
El período total durante el cual se administra
el anticuerpo, generalmente no excede de cuatro semanas y más
preferentemente no excede de tres semanas. En muchos casos, se puede
conseguir la tolerancia usando una dosis inicial y una o varias
dosis complementarias durante un período de tiempo que no exceda las
dos semanas.
Aunque, de acuerdo con la presente invención, la
tolerancia inicial hacia un(os) antígeno(s) se puede
conseguir en un primate en un período de no más de cuatro semanas,
en algunos casos, pueden ser necesarios tratamientos periódicos
complementarios con el anticuerpo para mantener la tolerancia.
Tal y como se ha descrito anteriormente, por lo
menos un anticuerpo CD4 se suministra en una cantidad que es al
menos suficiente para inducir tolerancia en un primate frente hacia
un(os) antígeno(s) y en una realización preferida,
hacia un antígeno extraño. La cantidad grande está limitada por
supuesto, por cuestiones de seguridad. En general, la dosificación
diaria de anticuerpo sería generalmente menor de 6000 mg.
El número de dosis complementarias y el
intervalo de tiempo entre las mismas se determinará, en parte, por
la semi-vida de por lo menos un anticuerpo CD4.
Aunque la presente invención no debe estar limitada de tal modo, se
cree que el anticuerpo CD4 se debe suministrar inicialmente en una
cantidad tal que se consigan unos niveles séricos de anticuerpo que
excedan la cantidad requerida para saturar todo los CD4 del primate
que se va a tratar, suministrándose las dosis complementarias en
espacios de tiempo suficientes para mantener tal exceso durante un
período que induzca una tolerancia en el primate hacia
el(los) antígeno(s).
El anticuerpo CD4 es un anticuerpo CD4 que tiene
una función efectora reducida (es decir, lítica) comparada con una
IgG1 humana. El anticuerpo tiene una porción Fc que no está
glicosilada y que tiene una unión reducida con el receptor de
Fc.
\newpage
El anticuerpo CD4 con una función efectora
reducida es un anticuerpo CD4 que no disminuye el número de células.
Tal y como se emplea en esta memoria, "un anticuerpo CD4 que no
disminuye el número de células" es un anticuerpo CD4 que
disminuye menos del 50% de las células CD4 y preferiblemente menos
del 10% de las células CD4.
En el tratamiento de un primate y
particularmente de un ser humano, el anticuerpo CD4 se puede emplear
conjuntamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una
composición que contiene un anticuerpo CD4 puede incluir otros
ingredientes, por ejemplo, agentes estabilizadores y/o a otros
agentes activos.
El uso de un anticuerpo CD4 para inducir
tolerancia hacia un(os) antígeno(s) en un primate de
acuerdo con la presente invención, proporciona una tolerancia hacia
uno o varios antígenos y el primate es capaz de responder
inmunológicamente a otros antígenos. De este modo, a este respecto,
el primate se vuelve tolerante hacia uno o varios antígenos, y el
sistema inmunitario es capaz de proporcionar una respuesta inmune
contra otros antígenos extraños, por lo que el primate no está
inmunodeprimido.
En la realización preferida en la que se induce
la tolerancia hacia un antígeno, el anticuerpo CD4 se administra al
primate antes, conjuntamente o posteriormente al antígeno que se va
a suministrar al primate. En una realización preferida, al primate
se suministra el anticuerpo CD4 en un momento en el que el
anticuerpo está presente en el primate. En una realización
particularmente preferida, el anticuerpo CD4 se suministra al
primate antes de que el primate entre en contacto con el antígeno,
hacia el cual se va a inducir tolerancia en el primate o al cabo de
algunas horas o menos de un día después de que esto ocurra. En una
realización preferida, el anticuerpo se administra al primate no más
de dos días antes de que el primate reciba el antígeno,
preferentemente, no más de un día antes.
Tal y como se ha indicado anteriormente en esta
memoria, en una realización, en un primate se induce tolerancia
hacia una proteína terapéutica que se va a utilizar para tratar el
primate. Tal proteína terapéutica puede ser un anticuerpo
terapéutico (con excepción del anticuerpo CD4), dicho anticuerpo
terapéutico puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo
humanizado, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo no humano; una
enzima tal como una utilizada para la terapia sustitutiva; una
hormona; un factor de coagulación; una proteína producida en la
terapia génica; un vehículo de entrega para la terapia génica tal
como un vector utilizado en la terapia génica (por ejemplo, un
vector de adenovirus).
El(los) antígeno(s)
extraño(s) puede estar presente en un órgano trasplantado, o
en células trasplantadas utilizadas en la terapia celular, o en
otros trasplantes de tejido, tal como la piel.
El tratamiento de un primate, en particular, un
ser humano, para inducir tolerancia hacia en el primate hacia
un(os) antígeno(s) extraño(s) por medio del uso
de un anticuerpo CD4, se puede conseguir en algunos casos sin una
terapia complementaria, tal como un trasplante de médula ósea para
promover la aceptación de un antígeno extraño y/o la disminución del
número de linfocitos T y/o la inmunosupresión.
En algunos casos, la terapia complementaria
también se puede emplear. Por ejemplo, como parte de un
procedimiento de trasplante se puede utilizar la inmunosupresión con
un inmunosupresor apropiado, pero con el empleo la presente
invención, la inmunosupresión crónica no es requerida. Además, si se
utiliza después o durante el procedimiento de inducción de la
tolerancia, en algunos casos, el inmunosupresor se puede utilizar
con una cantidad menor que la cantidad requerida para proporcionar
para una inmunosupresión eficaz.
El anticuerpo es un anticuerpo TRX1, tal y como
se describe en las reivindicaciones y tal anticuerpo se emplea
preferiblemente con el régimen de dosificación tal y como se ha
descrito anteriormente en esta memoria.
Al anticuerpo se hace referencia a veces a
continuación en esta memoria, como TRX1. El término "molécula"
o "anticuerpo" incluye TRX1. El término "TRX1" incluye el
anticuerpo mostrado en la Figura 2 y en una figura de la Figura 4, y
los que son idénticos al mismo, que se pueden producir, por ejemplo,
por tecnología recombinante.
Como ejemplos representativos pero que no son
limitativos, de tales anticuerpos equivalentes a TRX1, se pueden
mencionar:
1) los anticuerpos humanizados que se unen al
mismo epítopo que TRX1;
2) los anticuerpos humanizados que tienen las
mismas CDRs que TRX1 pero que tienen un armazón humanizado diferente
y/o una región constante humana diferente;
3) los anticuerpos humanizados que se unen al
mismo epítopo que TRX1 en donde uno o varios aminoácidos de una o
varias CDRs de TRX1 se han cambiado (preferible pero no
necesariamente, una sustitución de aminoácidos conservadora) y en
donde el armazón puede tener el mismo armazón que TRX1 o tener un
armazón humanizado diferente o en el que se han cambiado uno o
varios de los aminoácidos de la región del armazón de TRX1 y/o en el
que la región constante puede ser la misma o diferente de TRX1;
4) los anticuerpos humanizados que se unen al
mismo epítopo que TRX1 en donde el anticuerpo no se une a la región
Fc del receptor;
5) los anticuerpos humanizados que se unen al
mismo epítopo que TRX1 en donde sus CDRs no incluyen un sitio de
glicosilación;
6) los anticuerpos humanizados que se unen al
mismo epítopo que TRX1 y que no se unen a la región Fc del receptor
y las CDRs no incluyen un sitio de glicosilación;
7) un anticuerpo quimérico que se une al mismo
epítopo que TRX1; y
8) un anticuerpo de múrido que se une al mismo
epítopo que TRX1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos que son equivalentes a TRX1 se
pueden utilizar de manera semejante y para los mismos fines que
TRX1.
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden utilizar en un método para tratar un animal, en particular un
ser humano, especialmente para el uso en la inhibición, la mejora o
la reducción de una respuesta inmune frente a un antígeno, el cual
puede ser un antígeno extraño o un antígeno propio, incluyendo la
inducción de la tolerancia hacia un antígeno. Los anticuerpos se
pueden utilizar para inhibir, mejorar o reducir una respuesta inmune
frente a un antígeno presentado por la clase I y/o a un antígeno
presentado por la clase II. Los anticuerpos se pueden utilizar para
inhibir, mejorar o reducir una respuesta inmune a tales antígenos.
En el caso de un trasplante, por ejemplo, los antígenos del complejo
principal de histocompatibilidad (MHC) de la clase I y de la clase
II y los antígenos del complejo menor de histocompatibilidad o no
MHC, se pueden presentar. Además de los antígenos de trasplante, los
anticuerpos se pueden utilizar para inhibir, mejorar o reducir una
respuesta inmune frente a proteínas globulares, glicoproteínas tales
como inmunoglobulinas, materiales transportados sobre partículas,
tales como proteínas del polen, polipéptidos destinados al uso
terapéutico tales como el interferón, la
interleucina-2 o el factor de necrosis tumoral, o
terapias hormonales sustitutivas, tales como la hormona
luteinizante, sus análogos y sus antagonistas. Otros antígenos
específicos contra los que se puede inhibir, mejorar o reducir una
respuesta inmune incluyen análogos de péptidos sintéticos de agentes
terapéuticos proteicos que se emplean para ayudar en el bloqueo del
receptor, y aloantígenos. Los aloantígenos pueden ser responsables
del rechazo de tejido extraño en trasplantes de tejido o injertos de
piel. El término "antígeno" tal y como se emplea en esta
memoria, es un compuesto o un material que induce una respuesta
inmune en un animal, en particular en un ser humano. La respuesta
inmune puede ser una respuesta de los linfocitos T, la cual puede
estar acompañada o no, por una respuesta humoral.
Los anticuerpos de la presente invención inhiben
y/o alteran la activación y la proliferación de los linfocitos T y
el solicitante ha encontrado que tal inhibición se puede efectuar
cuando se añade la molécula o el anticuerpo, tanto antes como
después de un agente que estimula la activación de los linfocitos
T.
Los anticuerpos de la presente invención tienen
la característica de unirse a un epítopo de un antígeno de CD4
(linfocitos T humanos positivos para CD4), pero se debe entender,
sin embargo, que aunque se cree que el anticuerpo actúa a través de
la unión a un antígeno de CD4 en los linfocitos T, el anticuerpo
puede actuar mediante la unión a un antígeno de CD4 sobre otras
células; p. ej., monocitos. Consecuentemente, la capacidad de tales
moléculas o anticuerpos para inhibir y/o alterar la activación o la
proliferación de los linfocitos T, se puede efectuar o no a través
de la unión a células positivas para CD4, aunque el solicitante cree
actualmente que el mecanismo de acción implica la unión de la
molécula o del anticuerpo a células positivas para CD4.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un método para prevenir y/o inhibir una
respuesta inmune en curso en pacientes humanos, mediante la
administración al paciente del anticuerpo, de aquí en adelante
designado TRX1.
Aunque los solicitantes no desean limitar la
invención a ninguna consideración teórica, se cree que el mecanismo
que posibilita que el anticuerpo monoclonal de esta invención inhiba
o evite o reduzca o mejore la gravedad de una respuesta inmune, e
inhiba y/o altere la activación y la proliferación de los linfocitos
T efectores, es el hecho de que el anticuerpo TRX1 disminuye la
densidad de CD4 expresado en las superficies de los linfocitos T que
son capaces de participar en una reacción inmune, y disminuye de
este modo el número de linfocitos T funcionales, CD4 ^{+} y
efectores; y/o afecta a la transducción de la señal y disminuye de
este modo el número de linfocitos T funcionales, CD4 ^{+} y
efectores. Se cree que estos mecanismos de acción son responsables
no sólo de la prevención de respuestas inmunes, sino también de la
reducción de la gravedad de respuestas inmunes en curso. Además, el
anticuerpo TRX1 inhibe la actividad celular de los linfocitos T
citotóxicos (del inglés, "natural killer", NK) in vitro.
Esto es pertinente a la presente invención porque se cree que un
mecanismo citotóxico no restringido al MHC, tal como la actividad de
los linfocitos T citotóxicos, está implicado en la enfermedad de
rechazo inverso (del inglés, "graft versus host disease").
El término "inhibir", tal y como se emplea
en esta memoria a lo largo de esta solicitud, significa la
prevención o la inhibición o la reducción de la gravedad, o la
mejora de una respuesta inmune frente a uno o varios antígenos. El
antígeno puede ser un antígeno extraño o un antígeno propio. El
término "injerto" tal y como se emplea en esta memoria para los
fines de esta solicitud, significará cualquiera y todos los
trasplantes, incluyendo pero sin estar limitados a los mismos, el
alotrasplante y el xenotrasplante. Dicho trasplante puede incluir a
modo de ejemplo, pero sin estar limitado a los mismos, el trasplante
de células, de médula ósea, de tejido, de órganos, de huesos,
etc.
La expresión "respuesta(s)
inmune(s)" tal y como se emplea en esta memoria, significa
respuestas inmunes dependientes de la activación y de la
proliferación de los linfocitos T, que incluye los efectos celulares
y los anticuerpos dependientes de los linfocitos T, que se pueden
producir como una respuesta, a modo de ejemplo y no como una
limitación: a (i) los injertos, (ii) a la enfermedad de rechazo
inverso, y (iii) a los autoantígenos resultantes de enfermedades
autoinmunes, que incluyen a modo de ejemplo pero no están limitadas
a las mismas, la artritis reumatoide, el lupus sistémico, la
esclerosis múltiple, la diabetes mellitus, etc.
En una realización preferida, el anticuerpo no
se une a los receptores de Fc a través de la región Fc del
anticuerpo y las CDRs no incluyen un sitio de glicosilación.
La región constante de la cadena pesada no
incluye un sitio de glicosilación. Un ejemplo de una secuencia de la
cadena pesada que incluye un sitio de glicosilación se muestra en
las Figuras 1D y 1F y en las Figuras 3D y 3F. Un ejemplo de una
secuencia de la cadena pesada que no incluye un sitio de
glicosilación, se muestra en las Figuras 2D y 2F y en las Figuras 4D
y 4F.
El término "anticuerpo", tal y como se
emplea en esta memoria, incluye anticuerpos monoclonales, así como
anticuerpos preparados por técnicas recombinantes, es decir,
anticuerpos humanizados.
Otra realización de la presente invención
proporciona un método para tratar un paciente que va a recibir o que
ha recibido un trasplante de un injerto con una cantidad eficaz de
TRX1.
En una realización, el anticuerpo es TRX1 que es
un anticuerpo humanizado que incluye regiones constantes modificadas
de un anticuerpo humano y el armazón de la cadena pesada y ligera, y
las regiones de las CDRs, en donde las regiones del armazón de las
regiones variables de la cadena pesada y ligera se corresponden con
las regiones del armazón de la región variable de la cadena ligera y
pesada de un anticuerpo humano, y las CDRs obtenidas a partir de un
anticuerpo monoclonal de ratón designado NSM4.7.2.4. Un ejemplo de
un anticuerpo TRX1 se muestra en la Figura 1. La Figura 1A muestra
las secuencias de aminoácidos y de ADN para la cadena ligera de
TRX1. La Figura 1B muestra la secuencia de ácido nucleico de la
cadena ligera de TRX1. La Figura 1C muestra la secuencia de
aminoácidos de la cadena ligera de TRX1 con las CDRs destacadas. La
Figura 1D muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN para la
cadena pesada de TRX1 que incluye un sitio de glicosilación. La
Figura 1E muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de
TRX1. La Figura 1F muestra las secuencias de aminoácidos de la
cadena pesada de TRX1 que incluyen un sitio de glicosilación, con
las CDRs destacadas. Se entiende que TRX1 de la Figura 1 no forma
parte de la invención.
Otro ejemplo de TRX1 es un anticuerpo humanizado
que incluye regiones constantes modificadas de un anticuerpo humano
y las regiones del armazón de las cadenas pesada y ligera y de las
CDRs, en donde las regiones del armazón de las regiones variables de
las cadenas pesada y ligera se corresponden con las regiones del
armazón de la región variable de las cadenas pesada y ligera de un
anticuerpo humano, y las CDRs obtenidas a partir de un anticuerpo
monoclonal de ratón designado NSM 4.7.2.4. Este ejemplo del
anticuerpo TRX1 se muestra en la Figura 3. La Figura 3A muestra las
secuencias de aminoácidos y de ADN de la cadena ligera de TRX1. La
Figura 3B muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera
de TRX1. La Figura 3C muestra la secuencia de aminoácidos de la
cadena ligera de TRX1 con las CDRs destacadas. La Figura 3D muestra
las secuencias de aminoácidos y de ADN de la cadena pesada de TRX1
que incluye un sitio de glicosilación. La Figura 3E muestra la
secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de TRX1. La Figura 3F
muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de TRX1,
que incluyen un sitio de glicosilación, con las CDRs destacadas. Se
entenderá que TRX1 de la Figura 3 no forma parte de la
invención.
Una realización del anticuerpo TRX1 de la
invención se muestra en la Figura 2. La Figura 2A muestra las
secuencias de aminoácidos y de ADN de la cadena ligera. La Figura 2B
muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera. La
Figura 2C muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera
con las CDRs destacadas. La Figura 2D muestra las secuencias de
aminoácidos y de ADN de la cadena pesada. La Figura 2E muestra la
secuencia de nucleótidos de la cadena pesada. La Figura 2F muestra
las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada con las CDRs
destacadas.
Otra realización del anticuerpo TRX1 de la
invención se muestra en la Figura 4. La Figura 4A muestra las
secuencias de ADN y de aminoácidos de la cadena ligera. La Figura 4B
muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera. La
Figura 4C muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera
con las CDRs destacadas. La Figura 4D muestra las secuencias de
aminoácidos y de ADN de la cadena pesada. La Figura 4E muestra la
secuencia de nucleótidos de la cadena pesada. La Figura 4F muestra
las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada con las CDRs
destacadas.
En las figuras, el residuo de aminoácidos 1 es
el primer aminoácido, en cada una de las cadenas pesada y ligera,
después de la secuencia líder. También es el primer residuo en FR1
en las secuencias.
La preparación del anticuerpo humanizado TRX1
adecuado para los fines de la presente invención, debe ser evidente
para los expertos en la materia a partir de las enseñanzas de esta
memoria. Tal anticuerpo se puede preparar mediante técnicas
recombinantes conocidas por los expertos en la materia.
\newpage
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden utilizar para inhibir una respuesta inmune en un animal
administrando el anticuerpo en una cantidad eficaz para inhibir tal
respuesta inmune.
Por ejemplo, en algunos casos, el tratamiento
con un agente terapéutico incluye una respuesta inmune contra el
agente terapéutico. Como ejemplos representativos de tales agentes
terapéuticos, se pueden mencionar anticuerpos monoclonales tales
como ReoPro y OKT3, las enzimas para la terapia sustitutiva, tales
como, pero no limitado a las mismas, glucocerebrosidasa para la
enfermedad de Gaucher y factores de coagulación tales como el factor
VIII, y productos de la terapia génica y vehículos de entrega para
la terapia génica, tales como vectores obtenidos a partir de
adenovirus.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, el anticuerpo de la invención se administra a un paciente
que se va a tratar con dicho agente terapéutico, administrándose el
anticuerpo en una cantidad eficaz para inhibir la respuesta inmune
contra el agente terapéutico. El anticuerpo se puede administrar
antes, conjuntamente con o posteriormente a la administración del
agente terapéutico. El método de administración depende de una
diversidad de factores, que incluyen, pero no están limitados a los
mismos, la indicación específica, el agente terapéutico específico y
el programa de dosificación óptimo, si se administra antes de la
administración del agente terapéutico, el anticuerpo se administra
desde aproximadamente 1 hora antes hasta aproximadamente 10 días
antes de la administración del agente terapéutico, preferiblemente
desde aproximadamente 1 hora antes hasta aproximadamente 24 horas
antes de la administración del agente terapéutico. Si se administra
después de la administración del agente terapéutico, el anticuerpo
se administra desde aproximadamente 1 hora después hasta
aproximadamente 10 días después de la administración del agente
terapéutico, preferiblemente desde aproximadamente 1 hora después
hasta aproximadamente 24 horas después de la administración del
agente terapéutico.
La cantidad de anticuerpo administrado, el
programa de dosificación y el número de veces que se administra el
anticuerpo, son dependientes del agente terapéutico y del régimen
utilizados para tratar un paciente con el agente terapéutico.
En general, el anticuerpo se puede utilizar en
una cantidad desde aproximadamente 0,1 miligramos hasta 3 gramos por
dosis.
El anticuerpo de la presente invención también
se puede utilizar para inhibir una respuesta inmune contra un
antígeno propio y/o un anticuerpo extraño, p. ej., contra un
trasplante (por ejemplo, rechazo del trasplante) y/o para inhibir o
mejorar una respuesta inmune de un injerto contra un hospedador.
El anticuerpo de la presente invención también
se puede utilizar para inhibir una respuesta inmune contra productos
de la terapia génica así como una respuesta inmune contra los
vehículos de entrega en la terapia génica, tales como vectores
obtenidos a partir de adenovirus, que limitan la eficacia de la
terapia génica.
Por tanto, una respuesta inmune frente a un
antígeno en un hospedador, se puede inhibir, mejorar o reducir
administrando el anticuerpo TRX1 de la invención, junto con el
antígeno. A un paciente se puede suministrar un trasplante de
tejido, tal como un trasplante de órgano o un trasplante de médula
ósea y se puede administrar el anticuerpo TRX1 de la invención junto
con el trasplante para inhibir el rechazo del mismo. También, se
puede inducir la tolerancia hacia un antígeno que ya posee el
paciente. La tolerancia específica a largo plazo se puede inducir
hacia un antígeno propio o hacia antígenos para tratar enfermedades
autoinmunes.
La presencia persistente o periódica del
antígeno es necesaria para mantener la tolerancia. Un injerto de
tejido, por ejemplo, proporciona el antígeno para mantener la
tolerancia hacia el mismo. En el caso de antígenos extraños ajenos,
tales como alérgenos, los "recordatorios" del antígeno se
pueden proporcionar a intervalos regulares.
El anticuerpo se puede administrar in
vivo de acuerdo con la presente invención, para inhibir la
activación y la proliferación de los linfocitos T y disminuir la
densidad de la expresión funcional de CD4 en la superficie celular
y/o para afectar a la transducción de la señal de tal modo que se
reduce la funcionalidad de los linfocitos T CD4^{+} y/o el número
de linfocitos T CD4^{+}.
Por tanto, por ejemplo, en un procedimiento
in vivo, tales anticuerpos se administran para evitar y/o
inhibir una respuesta inmune y de tal modo inhibir la activación y
la proliferación de los linfocitos T.
El anticuerpo se puede administrar ex
vivo de acuerdo con la presente invención, para disminuir la
densidad de la expresión funcional de CD4^{+} en la superficie
celular y/o para afectar a la transducción de la señal, reduciendo
de este modo la funcionalidad de los linfocitos T CD4^{+} y/o el
número de células CD4^{+} de las células del donante. A modo de
ejemplo y no como limitación, en un procedimiento ex vivo,
tales anticuerpos se infundirían en la médula ósea del donante antes
del trasplante para evitar la aparición brusca de la enfermedad de
rechazo inverso después del trasplante.
El anticuerpo se administra generalmente en un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Como ejemplos representativos
de tales vehículos, se pueden mencionar la solución salina normal,
los tampones, etc. Tales vehículos farmacéuticos son bien conocidos
en la técnica y la selección de un vehículo adecuado se estima que
está dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de
las enseñanzas contenidas en esta memoria.
El anticuerpo TRX1 de la presente invención se
puede administrar in vivo por vía intravenosa, subcutánea o
mediante administración intramuscular, etc.
Tal y como se ha indicado anteriormente, el
anticuerpo TRX1 de la presente invención se administra in
vivo en una cantidad eficaz para inhibir una respuesta inmune
contra un(os) antígeno(s). La expresión "una
cantidad eficaz" para los fines de esta solicitud, debe
significar la cantidad de anticuerpo capaz de producir el efecto
deseado. En general, dicho anticuerpo se administra en una cantidad
de al menos 0,1 miligramo por dosis. Se debe entender que se podrían
utilizar cantidades menores. Además, después del tratamiento
inicial, las cantidades descritas anteriormente en esta memoria, se
pueden reducir para tratamientos subsiguientes, si los hay.
El anticuerpo TRX1 de la presente invención se
puede emplear para inducir tolerancia hacia un antígeno. El término
"tolerancia", tal y como se emplea en esta memoria, significa
que sigue habiendo una falta de respuesta de los linfocitos T contra
un antígeno después de interrumpir el tratamiento con el anticuerpo,
incluso en el caso de estimulación. Si es necesario, sin embargo, se
pueden suministrar dosis del anticuerpo de recuerdo o como refuerzo
para mantener dicha tolerancia.
Las técnicas de la presente invención para
inhibir la activación de los linfocitos T se pueden emplear de forma
aislada o conjuntamente con otras técnicas, fármacos o compuestos
para inhibir la activación de los linfocitos T o para inhibir el
rechazo de un injerto o la enfermedad de rechazo inverso, o para
tratar diferentes enfermedades autoinmunes. Los ejemplos pueden
incluir fármacos tales como rapamicina y ciclosporina, u otros
compuestos inmunomoduladores que incluyen anticuerpos monoclonales
dirigidos contra moléculas coestimuladoras, tales como CD2, CD8 y
CD28, así como anticuerpos monoclonales dirigidos contra moléculas
de adhesión.
Los anticuerpos de la presente invención también
se pueden emplear en un método para seleccionar o determinar la
presencia de células positivas para CD4 en una muestra, tal como una
muestra de sangre, por ejemplo. En dicho método, una muestra se pone
en contacto con el anticuerpo, y se determina la presencia de
células positivas para CD4, y/o a continuación, las células
positivas para CD4 se pueden seleccionar o aislar desde la
muestra.
El anticuerpo de la invención se emplea para
inducir una tolerancia hacia un(os) antígeno(s) en un
primate (en particular un ser humano).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se describe ahora en relación con
los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una genoteca de ADNc se construyó a partir del
hibridoma de ratón NSM 4.7.2.4 usando el sistema del plásmido
Superscript (Gibco/BRL, número de catálogo 82485A) según el
protocolo sugerido por el fabricante. Los ADNc de las cadenas pesada
y ligera se clonaron a partir de la genoteca mediante la hibridación
del ADN, usando como sondas los ADNc de los genes de las cadenas
pesada y ligera procedentes del hibridoma de rata YTS 177.
Los ADNc de los genes de las cadenas pesada y
ligera de rata de YTS 177 se aislaron a partir del vector de
expresión pHA Pr-1 en forma de fragmentos BamHI/SalI
y se marcaron con ^{32}P y se utilizaron independientemente para
escrutar la genoteca de ADNc de NSM 4.7.2.4. usando técnicas
convencionales de biología molecular (Sambrook, y col., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2001); Ausubel, y
col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, Nueva York (2001).) El análisis de las secuencias de los
ADNc obtenidos a partir de la genoteca de ADNc de NSM 4.7.2.4
confirmó que la cadena pesada de NSM 4.7.2.4 era de la subclase
gamma-1 de ratón y la cadena ligera de NSM 4.7.2.4
era kappa. Las regiones V de las cadenas ligera y pesada de NSM
4.7.2.4 (VH y VL, respectivamente) se reorganizaron con las regiones
humanas de VH y de VL con el "mejor ajuste" o con la similitud
de secuencia más elevada, en las regiones del armazón con las de
ratón. Para la cadena ligera, se empleó el anticuerpo humano HSIGKAW
(procedente de EMBL) con una similitud de secuencia del 79% (LA
Spatz y col., 1990 J. Immunol. 144: 2821-8).
La secuencia HSIGKAW VL es:
D inicio del armazón 1
Q cambia a G
Para la cadena pesada, se utilizó el anticuerpo
humano A32483 (procedente de GenBank) con una similitud de secuencia
del 74% (Larrick, y col., Biochem. Biophys. Res. Comm.,
volumen 160, págs. 1250-1256 (1989)). La secuencia
de VH de A32483 es:
Q inicio del armazón 1
Para el proceso de humanización, se escogió el
clon de la cadena ligera anti-CD4, 77.53.1.2 (tamaño
del inserto 1 kb) y el clon de la cadena pesada
anti-CD4, 58.59.1 (tamaño del inserto 1,7 kb),
procedentes de la genoteca de ADNc y los insertos se aislaron a
partir del vector pSport como fragmentos SalI/NotI y se clonaron
dentro del vector M13mp18 para producir un ADN monocatenario para la
secuenciación y como molde para la mutagénesis. La humanización de
NSM 4.7.2.4 se realizó mediante mutagénesis dirigida al sitio del
ADNc de ratón usando un equipo de reactivos de Amersham
International (RPN 1523) según el protocolo sugerido por el
fabricante.
La mutagénesis de las regiones del armazón del
gen VL se realizó usando cinco oligonucleótidos con una longitud en
el intervalo de 29 hasta 76 bases. Los oligos utilizados eran:
Los oligos se fosforilaron y se realizó una
mutagénesis en tres etapas usando no más de dos oligos en cada
etapa, para introducir cambios según el siguiente procedimiento:
(1) Reasociación de los oligos mutantes
fosforilados con el molde de ADNss
(2) Polimerización
(3) Filtración para eliminar el ADN
monocatenario
(4) Hacer una mella en la hebra no mutante con
NciI
(5) Digestión de la hebra no mutante con
ExoIII
(6) Repolimerización del ADN con hendidura
(7) Transformación de JM101 competentes
(8) Secuenciación de los clones
\vskip1.000000\baselineskip
Las mutaciones se confirmaron con la
secuenciación del ADN monocatenario usando los cebadores de M13, -20
y -40 y también los cebadores mutágenos número 1999 y 2000.
Un sitio SalI en el extremo 5' de la región
variable se cambió a HindIII enlazando los oligos número 2334 y 2335
para permitir la clonación de la región variable como un fragmento
HindIII/KpnI dentro de la región constante de la cadena ligera de
CAMPATH-1 H.
La mutagénesis de las regiones del armazón del
gen VH se realizó usando cinco oligonucleótidos con una longitud en
el intervalo de 24 a 75 bases. Los oligos utilizados eran:
La mutagénesis fue realizada tal y como se ha
descrito anteriormente para la cadena ligera, empleando de nuevo no
más de dos oligos a la vez para introducir los cambios. Las
mutaciones se confirmaron mediante la secuenciación del ADN
monocatenario usando los cebadores de M13 -20 y -40, así como los
cebadores mutágenos nº 2002 y nº 2004.
El cebador nº 2002 se utilizó para corregir un
error del marco de lectura en el clon de partida 58.59.1.
El cebador nº 2380 se utilizó para corregir la
mutación extra añadida por el nº 2004 que se había dejado pasar en
la primera secuenciación.
Como con la cadena ligera, el sitio 5' SalI de
la cadena pesada se había cambiado a HindIII empleando el enlazador
de los oligos nº 2334 y nº 2335 para permitir la clonación de la
región variable de la cadena pesada como un fragmento HindIII/SpeI
(sitio introducido por el cebador nº 2007) en la región constante de
la cadena pesada de CAMPATH-1H.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron las siguientes muestras de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la región constante humana de la
cadena pesada gamma-1 se clonó en pUC18 (obtenido a
partir de Martin Sims, Wellcome Foundation Ltd).
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena pesada reorganizada de NSM 4.7.2.4 que
contiene las regiones del armazón humanas y la región constante
gamma 1 de ratón.
Un sitio SalI en la cadena pesada reorganizada
de CD4 se alteró para formar un sitio HindIII. El gen de la región
variable se escindió mediante digestión con HindIII/SpeI y se ligó
con el gen de la región constante en el plásmido 1990 para dar una
cadena pesada humanizada completa (plásmido 2486). El gen de la
cadena pesada se cortó fuera de este plásmido con HindIII/EcoRI y se
ligó con el vector de expresión pEE6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplearon las siguientes muestras de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la cadena ligera de
CAMPATH-1H se clonó en M13mp18 en el sitio de
restricción de SalI/BamHI.
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena ligera reformada de NSM 4.7.2.4
contiene las regiones del armazón humanas y la región constante
kappa de ratón. Un sitio de KpnI ya se había introducido entre las
porciones variable y constante de este gen.
Un sitio de restricción KpnI se introdujo en el
gen de la cadena ligera de CAMPATH 1H correspondiente al sitio en el
plásmido 2197 y se introdujo un sitio EcoRI en el extremo 3' de la
región constante. El gen de la región constante se escindió de este
plásmido (2502) mediante digestión con HindIII/KpnI.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Mientras tanto, un sitio SalI en el plásmido
2197 se cambió por un sitio HindIII (esta etapa se tuvo que repetir
porque la primera vez se había introducido inadvertidamente una
mutación por desplazamiento del marco de lectura). El plásmido nuevo
(2736) se digirió con HindIII/KpnI. El fragmento de la región
variable de CD4 se clonó en un plásmido que contenía el gen de la
región constante kappa, procedente del plásmido 2502, para
proporcionar una cadena ligera humanizada completa (plásmido 2548).
El gen de la cadena ligera se eliminó por corte de este plásmido con
HindIII/EcoRI y se ligó con el vector de expresión pEE12 para
proporcionar el plásmido 2798.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la cadena pesada se escindió del
vector pEE6 mediante digestión con SalI/BglII y se clonó en el
vector pEE12 de la cadena ligera que se había digerido con
BamHI/SalI.
La estructura artificial del vector final se
comprobó mediante digestiones de restricción con HindIII, EcoRI,
SalI, BamHI, BglII y SpeI para estudiar la presencia de los
fragmentos esperados, incluyendo la cadena pesada de 700 pb, la
cadena pesada de 1400 pb, el fragmento de 2300 pb de pEE6 y el
fragmento de 7000 pb de pEE12.
El vector pEE12 se linealizó mediante digestión
con SalI y se transfirió a las células NSO mediante electroporación,
siguiendo un protocolo convencional (Celltech 1991) salvo que el
medio de selección se había modificado levemente, basándose en IMDM
en vez de DMEM. Los transfectantes se seleccionaron en medio que
carecía de glutamina, suplementado con FCS dializado,
ribonucleósidos, ácido glutámico y asparagina, tal y como estaba
recomendado.
Las mezclas de la transfección se cultivaron en
tres placas de 96 pocillos, y de 36 pocillos en los que había
crecimiento que se sometieron a ensayo, 5 eran fuertemente positivos
para la producción de las cadenas pesada y ligera humanas (otros 18
eran positivos para una u otra, o débilmente positivos para
ambas).
Un clon, designado SDG/B7B.A.7 se seleccionó y
se almacenó congelado, pero no se ha realizado una caracterización
adicional en este anticuerpo de tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a una inquietud sobre los efectos
secundarios de otros anticuerpos de CD4, notificados en diferentes
ensayos clínicos, se consideró deseable evitar la posibilidad de
atraer a los receptores de Fc. La IgG4 humana se cree que tiene una
capacidad mínima para unirse a Fc o para activar el complemento. Sin
embargo, los experimentos han mostrado que atrae a los receptores de
Fc en algunos individuos (Greenwood y col., Eur. J. Immunol.,
volumen. 23, págs. 1098-1104, 1993), y estudios
clínicos con una variante humana de IgG4 para
CAMPATH-1H han mostrado una capacidad para destruir
células in vivo (Isaacs y col., Clin. Exp. Immunol.,
volumen. 106, págs. 427-433 (1996)). Para eliminar
la posibilidad de unión a los receptores de Fc, se prepararon
estructuras artificiales con mutaciones en la región constante de la
cadena pesada de IgG1.
TRX 1 tiene las mutaciones Leu^{236} a Ala y
Gly^{238} a Ala, tal y como se muestra en las Figuras 1D y 1E y en
las Figuras 3D y 3E. Estos residuos concretos fueron elegidos porque
se había previsto que rompían al máximo la unión a los tres tipos de
receptores humanos de Fc en IgG. Cualquier mutación es suficiente
para reducir la unión a Fc\gammaRI (Woof y col., Mol.
Immunol, volumen 332, págs. 563-564,1986; Duncan
y col., Nature, volumen 332, págs. 563-564,
1988; Lund y col., J. Immunol, volumen 147, págs.
2657-2662, 1991) o Fc\gammaRII (Lund y col., 1991;
Sarmay y col., Mol. Immunol., volumen 29, págs.
633-639, 1992) mientras que Gly^{238} a Ala tiene
el mayor efecto sobre la unión a Fc\gammaRIII (Sarmay y col.,
1992).
Se emplearon las siguientes muestras de ADN.
Región V_{H} humanizada de NSM 4.7.2.4 clonada
en el vector de expresión pEE6 en un sitio de restricción de
HindIII/SpeI. El plásmido 2555 se mutó a continuación mediante
mutagénesis dirigida al sitio, de modo que el residuo del aminoácido
Asn^{101} se cambió por Asp^{101}, tal y como se muestra en las
Figuras 1D y 1E y en las Figuras 3D y 3E. El plásmido resultante es
el plásmido 2555 Mut.
\vskip1.000000\baselineskip
Región V_{H} humanizada de NSM 4.7.2.4 unida a
las regiones constantes kappa humanas para proporcionar un fragmento
de aproximadamente 700 pb clonado en el vector de expresión pEE12 en
HindIII/EcoRI.
\vskip1.000000\baselineskip
Cadena pesada humana de IgG1 asociada con la
región V_{H} humanizada de CD18, que tiene las mutaciones
Leu^{236} a Ala y Gly^{238} a Ala, así como un sitio de
restricción de SpeI introducido en la región del armazón 4, clonada
en pUC18.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El fin del sitio de restricción de SpeI es
permitir la separación y la recombinación de diferentes regiones
variables.
El gen de la región V_{H} de CD18 se escindió
del plásmido FM 4260 mediante digestión con SpeI y HindIII y el
vector restante, que ahora tenía solamente la región constante
relevante de la cadena pesada, se purificó usando "Geneclean".
Se ligó con el ADN de la región V_{H} humanizada de NSM 4.7.2.4
que se había aislado a partir del plásmido 2555 Mut de la misma
forma. El producto se utilizó para transformar células "Sure" y
en las colonias se comprobó la presencia del inserto esperado
completo de la cadena pesada de1400 pb.
El inserto completo de la región V_{H} y de la
región contante se escindió del vector pUC mediante digestión con
HindIII y EcoRI. El fragmento de 1400 pb se purificó usando Qiaexil
(Qiagen) y a continuación se ligó a su vez en el vector pEE6, que se
había cortado previamente con las mismas enzimas.
La siguiente etapa era escindir los genes de la
cadena pesada de CD4 del vector pEE6 y clonarlos en pEE12, que ya
contenía el gen humanizado de la cadena ligera de CD4 (plásmido
2798). El vector pEE6 se digirió con SalI y BglII y el vector pEE12
se digirió con SalI y BamHI para crear los sitios apropiados para la
religación.
En la estructura artificial final del vector
final se comprobó mediante digestión con las enzimas de restricción
HindIII, EcoRI, SalI y SpeI, la presencia del fragmento esperado, es
decir, la cadena ligera de 700 pb, la cadena pesada de 1400 pb, el
fragmento de 2300 pb de pEE6 y el fragmento de 7000 pb de pEE12.
El vector pEE12 se linealizó mediante digestión
con SalI y se transfectó en células NSO mediante electroporación,
como más arriba. Las mezclas de la transfección se cultivaron en
seis placas de 96 pocillos, y de 90 pocillos en los que había
crecimiento y que se sometieron a ensayo, todos eran positivos para
la producción de cadenas pesada y ligera humanas. En esta etapa, una
muestra del ADN del vector pEE12 se digirió con SalI, se precipitó
con etanol y se transfirió al Centro de Anticuerpos Terapéuticos
(TAC, del inglés "Therapeutic Antibody Centre").
\vskip1.000000\baselineskip
Las células NSO se obtuvieron directamente a
partir del ECACC (clon CB1782, número de entrada 85110503). Un banco
de células primario (BCP) se preparó en el Centro de Anticuerpos
Terapéuticos, hospital de Churchill, Oxford, Inglaterra.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pEE12 se transfectó en células NSO
procedentes del BCP mediante electroporación, tal y como se ha
descrito anteriormente. Se transfectó un total de 2 x 10^{7}
células con 80 \mug del ADN linealizado del plásmido, con un
volumen final de 2,0 ml. La mezcla de transfección se extendió en
doce placas de 96 pocillos y se alimentaron con medio selectivo
según el protocolo convencional ("The Cell Tech Glutamine
Synthetase Gene Expression System", versión 2 - Expresión de
células de mieloma, revisión 6.) Seis placas recibieron medio
selectivo que contenía metionina sulfoximina 10 mM (MSX).
\vskip1.000000\baselineskip
El material sobrenadante del cultivo se purificó
usando un sistema de cromatografía "Biopilot" (Pharmacia) en
tres etapas, del modo siguiente:
- (1)
- Cromatografía de afinidad en una columna Fast Flow de proteína A-Sefarosa
- (2)
- Cromatografía de intercambio iónico sobre Fast Flow de S-Sefarosa
- (3)
- Cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex 20.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto purificado se filtró y se reunió en
un biocontenedor único.
A lo largo del procedimiento de purificación, se
tomaron precauciones para asegurar que el sistema permanecía
aséptico. Todos los tampones y los reactivos se hicieron pasar a
través de un filtro de membrana de 0,2 micras y el producto
purificado también se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 micras
antes de ser reunido. Después de procesar un lote de anticuerpos, el
sistema cromatográfico completo y las columnas se esterilizaron con
NaOH 0,5 M, se lavaron con PBS estéril y se almacenaron en etanol al
20%. Antes de utilizarlo de nuevo, el etanol se eliminó por lavado
con PBS estéril y se realizó una operación completa de la prueba.
Las muestras de los tampones y del material eluido de la columna se
comprobaron para determinar si había un nivel de la endotoxina.
\vskip1.000000\baselineskip
La región constante de la cadena pesada humana
gamma 1 (IgG1) se amplificó a partir del ADNc de leucocitos humanos
(ADNc de QUICK-Clone® número de cat.
7182-1, Clontech), usando el conjunto de cebadores
siguiente y se clonó en pCR-Script (Stratagene). El
plásmido que contenía la región constante de la cadena pesada humana
gamma 1 en pCR-Script, se denominó
pHC\gamma-1.
Las mutaciones que no se unían a Fc
(Leu^{236}Ala, Gly^{238}Ala) se realizaron en la región
constante de la cadena pesada mediante mutagénesis dirigida al
sitio, empleando el siguiente cebador y el equipo de reactivos para
mutagénesis dirigida al sitio Transformer® de Clontech (nº de cat.
K1600-1). El plásmido que contenía la región
constante mutante que no se unía a Fc de la cadena pesada humana de
gamma 1 en pCR-Script se denominó
pHC\gamma-1 Fcmut.
La región constante de la cadena ligera humana
kappa se amplificó a partir de ADNc de leucocitos humanos (ADNc de
QUICK-Clone® nº de cat. 7182-1,
Clontech), empleando el grupo de cebadores siguientes y se clonó en
pCR-Script (Stratagene). El plásmido que contenía la
región constante de la cadena ligera humana kappa en
pCR-Script se denominó
pLC\kappa-1
Las regiones variables de las cadenas pesada y
ligera se construyeron a partir de un grupo de oligonucleótidos
sintéticos complementarios y parcialmente solapantes que abarcaban
las regiones variables completas. El grupo de oligonucleótidos para
cada región variable, se muestra más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la purificación mediante HPLC y de la
eliminación de los disolventes orgánicos, los oligonucleótidos se
resuspendieron en TE pH 8,0 y se fosforilaron. A continuación se
combinó una parte alícuota de cada oligonucleótido en el grupo de la
región variable respectiva, en cantidades equimolares. Las mezclas
de oligonucleótidos se calentaron a 68ºC durante 10 minutos y se
dejaron enfriar lentamente hasta temperatura ambiente. Los
oligonucleótidos reasociados se extendieron a continuación para
producir fragmentos de ADN de la región variable bicatenaria. Para
la extensión, se añadieron dNTPs hasta tener una concentración final
de 0,25 mM, seguido de un volumen apropiado de 5X el tampón de la
polimerasa de ADN de T4 [acetato de Tris 165 mM, pH 7,9, acetato de
sodio 330 mM, acetato de magnesio 50 mM, 500 (g/ml de BSA, DTT 2,5
mM] y 4 unidades de polimerasa de ADN de T4. La mezcla se incubó a
37ºC durante 1 hora, seguido de una inactivación térmica de la
polimerasa de ADN de T4 a 65ºC durante 5 minutos.
El ADN bicatenario se precipitó en etanol y se
resuspendió en el mismo volumen de TE a pH 8,0. Un volumen apropiado
de 5X el tampón de la ligasa de ADN de T4 [Tris-HCl
250 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 50 mM, ATP 5 mM, DTT 5 mM, 25% en p/v de
polietilenglicol-8000], se añadió a continuación al
ADN bicatenario, seguido de 2 unidades de ligasa de ADN de T4 y la
mezcla se incubó durante 1 hora a 37ºC para ligar los fragmentos
extendidos. A continuación se termoinactivó la ligasa de ADN de T4 a
65ºC durante 10 minutos. Los fragmentos de ADN de la región variable
se extrajeron entonces con fenol, se precipitaron en etanol y se
resuspendieron en TE, pH 8,0 y se clonaron en
pCR-Script (Stratagene). El plásmido resultante que
contenía la región variable de la cadena pesada se designó
pHV-1 y el plásmido que contenía la región variable
de la cadena ligera se designó pLV-1.
Los vectores de expresión finales de la cadena
ligera y pesada se construyeron pcADN 3.1 (Invitrogen). Para el
vector de expresión de la cadena pesada, la región constante mutada
de Fc se libera a partir del plásmido pHC-1 Fcmut
mediante digestión con SpeI y EcoRI y se aisló mediante
electroforesis en gel de agarosa. La región variable de la cadena
pesada se libera del plásmido pHV-1 mediante
digestión con HindIII y SpeI y se aisló mediante electroforesis en
gel de agarosa. Los dos fragmentos en cantidades equimolares se
ligaron en los sitios de HindIII/EcoRI de pcADN3.1(+) (Invitrogen)
empleando técnicas convencionales de biología molecular. El vector
de expresión resultante de la cadena pesada de TRX1 se denominó
pTRX1/HC.
De forma similar, para el vector de expresión de
la cadena ligera, la región constante de la cadena ligera se liberó
del plásmido pLC-1 mediante digestión con KpnI e
HindIII seguido de una purificación en gel de agarosa. La región
variable de la cadena ligera se liberó de pLV-1
mediante digestión con EcoRI y KpnI seguido de una purificación en
gel de agarosa. Los dos fragmentos de la cadena ligera en cantidades
equimolares se ligaron en los sitios de EcoRI/HindIII de pcADN3.1(-)
(Invitrogen) empleando técnicas convencionales de biología
molecular, dando como resultado el vector de expresión de la cadena
ligera de TRX1, pTRX1/LC.
Para la producción del anticuerpo TRX1, los
plásmidos de expresión de la cadena ligera de TRX1 y de la cadena
pesada de TRX1 se cotransfectaron en células CHO empleando técnicas
convencionales de biología molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo humanizado mostrado en las Figuras
2A, 2C, 2D y 2F se produce por un procedimiento similar al del
Ejemplo 1. El anticuerpo humanizado es un anticuerpo no
glicosilado.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo humanizado, tal y como se muestra
en las Figuras 4A, 4C, 4D y 4F se produce mediante un procedimiento
similar al del Ejemplo 1. El anticuerpo humanizado es un anticuerpo
no glicosilado.
\vskip1.000000\baselineskip
Una reacción mixta de linfocitos (MLR) se empleó
para generar linfocitos humanos cebados para reconocer antígenos
ajenos humanos de histocompatibilidad. Para generar esta reacción,
se aislaron linfocitos humanos de la sangre periférica procedente de
sangre completa heparinizada de dos individuos diferentes (donante A
y donante B) empleando la centrifugación en gradiente de densidad de
Ficoll o un método similar. Los linfocitos del donante B se
ajustaron a 10^{7}/ml en medio RPMI 1640 sin suero pero que
contenía 50 \mug/ml de mitomicina C. Las células se incubaron a
37ºC durante 30 minutos y a continuación se retiraron del medio por
lavado con mitomicina C en tres centrifugaciones en RPMI 1640 con
10% de plasma del donante A. Las células del donante A, que no se
habían tratado con mitomicina C, se ajustaron a 4 x 10^{6}/ml en
RPMI 1640 con 10% de plasma del donante A. Después del lavado, los
linfocitos tratados con mitomicina C procedentes del donante B, se
ajustaron a 4 x 10^{6}/ml en RPMI con 10% del plasma del donante
A. Se combinaron volúmenes iguales de las células del donante A y
del donante B y se colocaron dentro de matraces para el cultivo de
tejido, de tamaño adecuado para el compuesto que se iba a someter a
ensayo ("compuesto del ensayo"). Los matraces con y sin el
compuesto del ensayo se incubaron a continuación a 37ºC en 5% de
CO_{2} al aire, durante
7-10 días. Ésta es la reacción mixta de linfocitos primaria.
7-10 días. Ésta es la reacción mixta de linfocitos primaria.
Se puede observar que las células en la MLR
primaria se activaron y comenzaron a dividirse entre los días
3-7 y después de un período de proliferación activa,
las células volverán a un estado más inactivo. La duración del mismo
puede variar, sin embargo, las células volverán generalmente a estar
inactivas entre los días 7-10. Una vez que las
células parecen estar inactivas, las células procedentes de los
matraces de la MLR primaria, con y sin el compuesto del ensayo, se
pueden recuperar por centrifugación y resuspender en RPMI 1640 con
10% de plasma del donante A, con 4 x 10^{6}/ml. Los PBL de nuevo
aporte se pueden preparar mediante centrifugación en gradiente de
densidad de Ficoll, procedentes de sangre completa heparinizada del
donante B y se inactivan de nuevo con mitomicina C, las células del
donante B inactivadas se ajustaron a 4x10^{6}/ml en RPMI 1640 con
10% de plasma del donante A. Para la segunda MLR, se mezclaron
volúmenes iguales de células de la MLR primaria (células procedentes
de la MLR primaria que se había realizado en ausencia del compuesto
del ensayo) con células del donante B inactivadas con mitomicina
C.
Si las células de la MLR primaria (células
obtenidas a partir de una MLR que se había realizado en ausencia del
compuesto del ensayo) se marcan con CSFE, un colorante fluorescente
verde que se importa dentro de las células vivas, en donde actúa
sobre una enzima y reacciona a continuación con proteínas celulares,
el número de divisiones celulares experimentadas en el tiempo por
las células marcadas, se refleja en la reducción de la coloración
verde asociada con cada célula. Si las células de la MLR marcadas
con CFSE se estimulan en una MLR secundaria a la que se han añadido
células obtenidas a partir de la MLR primaria tratada con el
compuesto del ensayo, en una relación de 2:1 a 10:1 de MLR frente a
las células de la MLR obtenidas a partir del compuesto del ensayo,
una inhibición de la proliferación de las células de la MLR marcadas
con CFSE se observará en la MLR secundaria en el plazo de
3-4 días desde la estimulación, en comparación con
la proliferación de las células de la MLR marcadas con CFSE,
estimuladas en la MLR secundaria en ausencia de las células
obtenidas a partir del compuesto de ensayo.
Las células producidas en la MLR primaria y en
la MLR secundaria (así como las células proporcionadas en las MLRs
testigo) se analizaron para estudiar la presencia de células
CD4^{+} CD25^{+}, tal y como se ha descrito anteriormente.
Cuando se sometió a ensayo TRX1 tal y como se ha
descrito anteriormente, comparado con el testigo, las células
CD4^{+} CD25^{+} se redujeron en más del 60% en la MLR primaria
y en más del 20% en la MLR secundaria, y en la MLR secundaria,
comparada con el testigo, la producción de IL-2,
IL-4 e IL-12 se eliminó
esencialmente y la producción de IL-5,
IL-13, IFN gamma y TNF alfa se redujo en más del
50%.
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de la tolerancia inmunológica
específica hacia el antígeno en primates no humanos mediante el uso
del anticuerpo monoclonal anti-CD4 que no redunde el
número de células, TRX1, se mostró en el siguiente estudio. Los
mandriles (Papio anubus) se dividieron aleatoriamente en
siete grupos de tres animales. Los siete grupos comprendían cuatro
grupos experimentales designados grupos 4, 6, 7 y 8 y tres grupos
testigo designados grupos 1, 5 y 9. El estudio comprendía 2 fases,
una fase de inmunización/inducción de la tolerancia, seguida de una
fase de estimulación.
Para la fase de inmunización/inducción de la
tolerancia del estudio, los grupos 4, 6, 7 y 8 fueron inmunizados
con 3 dosis del antígeno 1 (10 mg/kg en solución salina), una dosis
cada uno de los días siguientes, el día 0, el día 4 y el día 8. El
antígeno 1 es IgG de caballo agregada de forma polivalente
(Antivenina) suministrado por vía intravenosa (i. v.) en la primera
dosis y por vía subcutánea (SC) en todas las dosis siguientes.
Durante esta fase del protocolo: los grupos 4, 6, 7 y 8 también
recibieron 4 dosis i. v. del anticuerpo monoclonal no reducido
anti-CD4, TRX1, del modo siguiente: el grupo 4
recibió 4 dosis de 20 mg/kg el día -1, el día 4, el día 8 y el día
12; el grupo 6 recibió 1 mg/kg de TRX 1 el día 1, el día 3, el día 8
y el día 12; el grupo 7 recibió 10 mg/kg el día -1, el día 3, el día
8 y el día 12. El grupo 8 recibió 40 mg/kg el día -1, el día 3, el
día 8, y el día 12.
Los grupos testigo 1 y 5 fueron tratados del
modo siguiente durante la fase de inmunización/inducción de la
tolerancia del protocolo: el grupo 1 recibió 3 dosis de antígeno 1,
con 10 mg/kg, una dosis cada uno de los días siguientes, día 0, día
4 y el día 8. El grupo 5 recibió 4 dosis i. v. del anticuerpo TRX1,
con 20 mg/kg, una dosis cada uno de los días siguientes, día -1, día
4, día 8 y día 12. El grupo 9 recibió cuatro dosis i.v. del
anticuerpo TRX 1, con 40 mg/kg, una dosis cada uno de los días
siguientes, día -1, día 4, día 8 y día 12.
La sangre fue recogida antes de cada inyección
del antígeno 1 y/o de TRX1 y después una vez a la semana, para
determinar el nivel sérico de TRX1 mediante ELISA, los efectos
farmacodinámicos del tratamiento con TRX1 sobre el nivel de
subgrupos de linfocitos circulantes, así como el porcentaje de
ocupación del receptor CD4 mediante citometría de flujo, y la
respuesta de los anticuerpos de mandril frente al antígeno 1
mediante ELISA.
La respuesta inmune frente a la antivenina
durante los primeros 68 días del estudio para los grupos 1, 4, 6, 7
y 8, tal y como se midió en el título de anticuerpos, se muestra en
la Figura 5.
La fase de estimulación del estudio se inició
una vez que los niveles séricos de TRX 1 alcanzaron niveles
indetectables. Para la fase de estimulación, se estimularon todos
los animales en todos los grupos (día 68) con el antígeno 1 (10
mg/kg, SC) y el antígeno 2 (1,7 ml/kg). El antígeno 2 es una
solución salina al 10% de glóbulos rojos de oveja, suministrados por
vía intravenosa en una dosis. Las estimulaciones con el antígeno 1
se repitieron el día 95 y el día 135 en los grupos testigo 5 y 9 y
en los grupos del ensayo 4 y 8. La sangre se recogió antes de cada
estimulación para determinar los niveles séricos del antígeno 1,
TRX1, y la respuesta de los anticuerpos de mandril frente al
antígeno 1 y al antígeno 2.
La Figura 6 muestra la respuesta inmune a la
antivenina, según se midió en el título de anticuerpos, para todos
los grupos después de la primera estimulación (días
68-95). La Figura 7 muestra la respuesta inmune a la
antivenina, según se midió en el título de anticuerpos, para los
grupos 1, 4, 5, 8 y 9, después de la estimulación 1, de la
estimulación 2 y de la estimulación 3.
Los resultados de la respuesta inmune de los
grupos 1, 4 y 5 frente a los glóbulos rojos de las ovejas se
muestran en la Figura 8.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Cambrige University Technical
Services Limited
\hskip1cmIsis Innovation Limited
\hskip1cmTolerRx, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo TRX1 y sus usos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> WPP84098
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> UK 0114517.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-06-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/345,194
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-10-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/373,470
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/373,471
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> UK 0122724.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-09-2001
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctttacag ttactgagca caca
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgatgtgtg ctcagtaact gtaa
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctgggtga ggcaggcacc tggacagggc cttgagtgga tgggagagat tt
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagggcagg gtcacaatga ctagagacac atccaccagc acagtctaca tggaactcag
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcctgagg tctgaggaca ctgcggtcta ttactgtgca aga
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaagggac actagtcact gtgt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcactgccta tgttataagc tgggtgaggc aggcacctg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactctaacca tggaatggat ctggatcttt ctcctcatc
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactagtcaca gtctcctcag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcattt acccggagac ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgtgcccag cacctgaact cgcgggggca ccgtcagtct tcctccccc
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaccaagg tggaaatcaa acgaac
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttctaa cactctcccc tgttg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacctcca ccgaacgtcg gagggtcctg aagactttgc tgacagtaat agactgcaac
\hfill60
Claims (27)
1. Un anticuerpo anti-CD4
humanizado que no disminuye el número de células que comprende una
cadena ligera y una cadena pesada, teniendo la cadena ligera las
tres CDRs de la cadena ligera KASQSVDYDGDSYMN, VASNLES y QQSLQDPPT,
y teniendo la cadena pesada las tres CDRs de la cadena pesada AYVIS,
EIYPGSGSSYYNEKFKG y SGDGSRFVY, teniendo el anticuerpo una porción Fc
no glicosilada.
2. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, que tiene una región constante de la cadena pesada
gamma 1 humana.
3. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es una IgG1 humana.
4. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente las
regiones de armazón de las cadenas pesada y ligera de las Figuras 2
ó 4.
5. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 4, que comprende adicionalmente la región constante
de la cadena pesada de las Figuras 2 ó 4.
6. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 5, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo
humanizado idéntico al anticuerpo humanizado mostrado en la Figura
2.
7. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 5, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo
humanizado idéntico al anticuerpo humanizado mostrado en la Figura
4.
8. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo incluye
CDRs que están exentas de un sitio de glicosilación.
9. Uso de un anticuerpo de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la preparación de
un medicamento para la inducción de la tolerancia hacia al menos un
antígeno en un primate, en donde dicho anticuerpo reduce la cantidad
de células CD4^{+} CD25^{+} producidas en una reacción mixta de
linfocitos primaria in vitro y genera en dicha reacción mixta
de linfocitos primaria, una población celular que reduce al menos
uno de (x) la cantidad de células CD4^{+} CD25^{+} producidas
in vitro en al menos una reacción mixta de linfocitos
primaria y secundaria, e (y) la cantidad de al menos una de
IL-2, IL-4 e IL-12
en una reacción mixta de linfocitos secundaria.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en
donde el compuesto reduce la cantidad de células CD4^{+}
CD25^{+} en una reacción mixta de linfocitos primaria en al menos
el 40%.
11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en
donde el compuesto reduce la cantidad de células CD4^{+}
CD25^{+} en una reacción mixta de linfocitos primaria en al menos
el 60%.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en
donde dicha población celular producida en la reacción mixta de
linfocitos primaria reduce la cantidad de células CD4^{+}
CD25^{+} producidas en una reacción mixta de linfocitos
secundaria.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en
donde las células CD4^{+} CD25^{+} producidas en la reacción
mixta de linfocitos secundaria se reducen en al menos el 20%.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
donde las células CD4^{+} CD25^{+} producidas en la reacción
mixta de linfocitos secundaria se reducen en al menos el 35%.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
donde en la reacción mixta de linfocitos secundaria la generación de
al menos una de IL-2, IL-4 e
IL-12 se reduce en al menos el 40%.
16. Uso de un anticuerpo de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la
preparación de un medicamento para la inducción de la tolerancia
hacia al menos un antígeno en un primate, mediante la administración
del anticuerpo, o de un fragmento del mismo, al primate en una
cantidad y durante un tiempo eficaces para inducir la tolerancia
hacia al menos un antígeno, estando presente dicho anticuerpo o
fragmento en dicho primate cuando dicho antígeno está presente en
dicho primate y administrándose en una dosis inicial de al menos 40
mg, induciendo dicho tratamiento una tolerancia hacia dicho, al
menos uno, antígeno, siendo el anticuerpo un anticuerpo que en una
reacción mixta de linfocitos primaria in vitro, reduce la
cantidad de células CD4^{+} CD25^{+} producidas en dicha
reacción mixta de linfocitos.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en
donde la dosis inicial es de al menos 70 mg.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 17, en
donde la dosis inicial es de al menos 400 mg.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en
donde la dosis inicial es de al menos 500 mg.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en
donde dicho anticuerpo se administra en al menos una dosis
complementaria y dicha dosis complementaria es de al menos 40
mg.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en
donde dicho, al menos uno, antígeno es un antígeno extraño.
22. Una composición que comprende:
- (a)
- un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8; y
- (b)
- un vehículo farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Uso de un anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la
preparación de un medicamento para inducir la tolerancia hacia un
antígeno en un paciente.
24. Uso de un anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la
preparación de un medicamento para inhibir una respuesta inmune en
un paciente.
25. Uso de un anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la
preparación de un medicamento para inhibir el rechazo de un injerto
en un paciente humano.
26. Uso de acuerdo con la reivindicación 25, en
donde dicho injerto es un órgano.
27. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-8, para uso en un método de
inducción de la tolerancia tal y como se ha definido en cualquiera
de las reivindicaciones 9-21 y 23, o de inhibición
tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones
24-26.
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