ES2357624T3 - Agentes de contraste para irm dotados de capacidad de respuesta independiente de la concentración. - Google Patents

Abstract

Método para la determinación in vivo, mediante el uso de la técnica de IRM, de parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un órgano, fluido o tejido del cuerpo de ser humano o animal, comprendiendo el método: - administrar a dicho ser humano o animal una cantidad eficaz desde el punto de vista de diagnóstico de un agente paramagnético de rotación lenta que responde a cambios del microentorno de dicho parámetro mediante cambios en la razón R2p/R1p, que se selecciona de - un complejo metálico paramagnético macromolecular dotado de al menos una molécula de agua lábil coordinada con el centro metálico y que tiene un valor de R de desde 1 hasta 10 ns y un valor de M de desde 0,01 hasta 1 μs, y - un sistema de tamaño nanométrico que atrapa un complejo metálico paramagnético a una concentración mínima de 5 mM, y que tiene un diámetro medio >= 5 nm, y - registrar una obtención de imágenes de IRM que responde a dicho parámetro mediante la medición de la razón R2p/R1p.

Description

La presente invención se refiere al campo de la obtención de imágenes de diagnóstico mediante el uso de técnicas de obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM). Más en particular, se refiere a un nuevo uso de una clase de agentes de contraste paramagnéticos en un método para la determinación in vivo de parámetros físicos o químicos de interés diagnóstico, independientemente de la concentración local del agente de contraste administrado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la actualidad está bien establecido que el potencial de los procedimientos de obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) puede aumentarse adicionalmente cuando esta modalidad de diagnóstico se aplica junto con la administración de agentes de contraste (AC), es decir, productos químicos que pueden promover cambios marcados en las tasas de relajación de los protones tisulares. Los AC para IRM se representan principalmente por complejos paramagnéticos, que contienen sobre todo iones de Gd(III), Fe(III) o Mn(II), que afectan a las tasas de relajación del agua en masa a través del intercambio de moléculas de agua en sus esferas de coordinación (Caravan P, et al. Chem Rev 1999, 99:2293-2352; the Chemistry of Contrast Agents in Medical Magnetic Resonance Imaging. Chichester, RU: John Wiley & Sons; 2001. págs. 45-120).

La eficacia de un complejo paramagnético se evalúa mediante su aumento de la relajación protónica o relaxividad (ri, i = 1, 2), que representa el aumento de la tasa de relajación protónica de una disolución acuosa que contiene una concentración 1 mM del agente paramagnético en comparación con la tasa de relajación protónica del agua neta. Para un complejo paramagnético, el aumento de la relajación protónica está principalmente gobernado por la elección del metal paramagnético, el tiempo de correlación rotacional del complejo y la accesibilidad del metal a las moléculas de agua circundantes, es decir el intercambio rápido de agua con la masa.

Están implicadas dos tasas de relajación características: R1 que se define como la inversa del tiempo de relajación longitudinal o tiempo de relajación espín-red T1, es decir 1/T1, y R2 que se define como la inversa del tiempo de relajación transversal o tiempo de relajación espín-espín T2, es decir 1/T2.

Cuanto mayor sea la relaxividad longitudinal (r1), más grande es el aumento de la señal detectado en las imágenes por RM ponderadas en T1 correspondientes y mejor es la diferenciación de contraste en las imágenes resultantes.

Existen algunos agentes de contraste cuya relaxividad está relacionada con, y puede depender de, las características físicas o químicas del microentorno en el que se distribuyen. Estos agentes se conocen como agentes de respuesta porque el contraste, en la imagen que promueven, responde a un parámetro físico o químico de interés diagnóstico. Se han notificado varios sistemas cuya relaxividad se hace dependiente del pH, la temperatura, PO2, actividad enzimática, concentraciones de iones y metabolitos (Jacques V, Top Curr Chem 2002, 221, 123-164).

Sin embargo, una propiedad de sensibilidad peculiar de este tipo no podría haberse explotado en la práctica porque las variaciones de T1 detectadas no pueden atribuirse claramente a un cambio en la relaxividad y, por consiguiente, a una variación en el parámetro físico o químico que está examinándose, si no se conoce la concentración real del complejo paramagnético. Para que sea eficaz, un agente de respuesta para IRM debe presentar su capacidad de respuesta de un modo independiente de la concentración. Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es un método de IRM y agentes que permitan superar esta desventaja.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Según el objetivo anterior, la presente invención se refiere a la identificación de una clase de agentes de respuesta cuyo uso permite la medición de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico independientemente de la concentración real del propio agente. En un aspecto diferente, la invención se refiere a un método de uso de dichos agentes para la determinación de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico, independientemente de la concentración absoluta del agente administrado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 se refiere a valores de R2p/R1p calculados como una función de la fuerza del campo magnético para un complejo de Gd(III) macromolecular (q = 1, r = 3 Ǻ, M = 200 ns) dotado de valores de R en el intervalo de 0,5-10 ns. Para la relajación electrónica, se han usado un valor de 2 de 2*1019 s-2 y un valor de V de 10 s (correspondiente a valores de 1S en el intervalo de 0,65-500 ns).

La figura 2a) se refiere a valores de R2p/R1p calculados como función de R para sistemas basados en Gd(III) dotados de valores de M en el intervalo de 0,05-1 s a 7 T.

La figura 2b) se refiere a valores de R2p/R1p calculados como función de M para sistemas basados en Gd(III) dotados de valores de R en el intervalo de 0,5-10 ns a 7 T.

La figura 3 muestra la estructura del aducto (Gd-1)4/avidina.

La figura 4 muestra la dependencia de la temperatura de la razón R2p/R1p para el aducto (Gd1)4/avidina a 7 T. Se incluye la fórmula del complejo Gd-1 en la sección experimental. Las barras notificadas hacen referencia a la desviación estándar de tres mediciones de disoluciones que contienen 0,125, 0,25, y 0,5 mM del complejo paramagnético.

La figura 5 notifica la dependencia del pH de la razón R2p/R1p para el aducto GdDOTP/poliarginina (razón molar = 10) a 14,1 T y 312 K. La concentración del complejo de Gd(III) fue de 0,5 mM (cuadrados negros) y 0,25 mM (cuadrados blancos).

La figura 6 muestra la estructura del aducto macromolecular de Gd-II.

La figura 7 notifica la dependencia del campo magnético de R1p (símbolos negros) y R2p (símbolos blancos) medidos a 25ºC y 600 MHz para una disolución que contiene el aducto de Gd-II ([Gd] = 1 mM). pH 7 (cuadrados), pH 10 (círculos), y pH 12 (triángulos).

La figura 8 notifica la dependencia de la razón R2p/R1p sobre la concentración de Gd(III) para el aducto macromolecular de Gd-II a cuatro valores de pH: pH 7 (cuadrados), pH 8,5 (círculos), pH 10 (triángulos), y pH 12 (rombos) (600 MHz, 25ºC).

La figura 9 muestra la dependencia del pH correspondiente de la razón R2p/R1p calculada a partir del punto de datos notificado en la figura 8.

La figura 10 notifica la dependencia de la temperatura de R1p (círculos) y R2p (cuadrados) medidos a 300 MHz para una disolución que contiene liposomas paramagnéticos (POPC/Chol/DSPEPEG, razón molar 55:40:5) que atrapa GdHPDO3A 200 mM. La concentración total del complejo de Gd(III) en la suspensión fue de 6,6 mM.

La figura 11 muestra la dependencia de la razón R2p/R1p sobre la concentración de liposomas (parte inferior del eje X) y Gd(III) (parte superior del eje X) para los liposomas paramagnéticos descritos en el ejemplo 4. Temperaturas: 298 K (cuadrados), 302 K (círculos), 307 K (triángulos superiores), y 312 K (rombos) (300 MHz).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Una clase de agentes de contraste que resuelve el problema al que se enfrenta la presente invención está representado por sistemas paramagnéticos de respuesta que responden a un parámetro físico o químico de interés diagnóstico en cuanto a que afectan a T1 y T2 de los protones de agua del disolvente, y en los que tal capacidad de respuesta de T1 y T2 a dicho parámetro sigue diferentes funciones de comportamiento. Para estos sistemas de respuesta, puede hacerse que la razón R2p/R1p sea independiente de la concentración real del propio agente mediante el mantenimiento de la dependencia funcional del mismo con respecto al parámetro de interés. Por consiguiente, mediante el uso de estos sistemas, puede obtenerse una determinación del parámetro de interés como independiente de la concentración del agente real mediante la medición de tal razón R2p/R1p.

En la presente invención, a menos que se indique lo contrario, con parámetro físico o químico de interés diagnóstico quiere decirse un parámetro seleccionado de: temperatura, pH, presión parcial de oxígeno (PO2) o dióxido de carbono (PCO2), concentración de ión o metabolito específico, o actividad enzimática específica.

Conociendo el valor de dicho(s) parámetro(s) físico(s) o químico(s), un experto en la técnica puede proporcionar fácilmente evaluaciones de diagnóstico de cualquier proceso fisiológico o metabólico de interés diagnóstico que se basa en dicho(s) parámetro(s).

Para protones acoplados de manera dipolar a un centro paramagnético, a fuerzas del campo magnético mayores de 0,2 T, los términos R2p y R1p (en los que R2p es la contribución paramagnética con respecto a la tasa de relajación transversal medida y R1p es la contribución paramagnética con respecto la tasa de relajación longitudinal medida) en presencia de un complejo de Gd(III) macromolecular se describen en las siguientes ecuaciones:

imagen1

en las que PM es la fracción molar de los protones móviles que interactúan de manera dipolar con el ión de Gd(III) (por ejemplo para una molécula de agua en la esfera de coordinación interna de Gd(III), imagen1

PM es igual a

con q = número de moléculas de agua coordinadas con Gd(III)), M es su tiempo de residencia medio, rH su distancia media desde el centro metálico, imagen1 H su frecuencia de Larmor (rad.s-1), y

C su tiempo de correlación molecular ( con R = tiempo de correlación rotacional o tiempo de reorientación y 1S = tiempo de relajación electrónica longitudinal). KDIP es un valor constante (3,887.10-42 m6.s-2) relacionado con la interacción dipolar entre los espines de electrón y nuclear.

A partir de las ecuaciones 1-2 puede obtenerse que para dicho agente macromolecular, la razón R2p/R1p es independiente de la concentración del propio agente, viéndose sólo afectado por los valores de M, R, 1S y H. Por consiguiente, para estos compuestos, los cambios en la razón R2p/R1p que actúan como indicador de un cambio en el parámetro de interés se relacionan sólo con un cambio en R y/o M y/o 1S en los que tales cambios tienen un efecto diferente sobre los valores de R2p y R1p.

Por tanto, un primer objetivo de la presente invención es el uso de un agente paramagnético de rotación lenta que responde a cambios de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico dado mediante cambios en la razón R2p/R1p para la preparación de composiciones de diagnóstico para la determinación de dicho parámetro en un órgano, fluido o tejido del cuerpo de ser humano o animal, mediante el uso de la IRM, de una manera que es independiente de la concentración absoluta de dicho agente administrado.

Un objetivo adicional de la presente invención es un método según la reivindicación 1 para la determinación in vivo, mediante el uso de IRM, de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un órgano, fluido o tejido del cuerpo de ser humano o animal, comprendiendo el método:

-administrar a dicho ser humano o animal una cantidad eficaz desde el punto de vista de

diagnóstico de un agente paramagnético de rotación lenta que responde a cambios del

microentorno de dicho parámetro mediante cambios en la razón R2p/R1p, y

-registrar una obtención de imágenes de IRM que responde a dicho parámetro, que es

independiente de la concentración real del agente administrado, mediante la medición de

dicha razón.

La expresión “cantidad eficaz desde el punto de vista de diagnóstico” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier cantidad del agente paramagnético de rotación lenta de la invención, o composición farmacéutica del mismo, que es suficiente para llevar a cabo su(s) fin(es) de diagnóstico previsto(s), es decir proporcionar imágenes altamente contrastadas y eficaces desde el punto de vista de diagnóstico que permitan la determinación del parámetro de interés.

Dichas dosificaciones se seleccionan obviamente por el profesional sanitario dependiendo del agente de corte administrado lentamente.

Según la presente invención con “agente o sistema paramagnético de rotación lenta” tal como se usa en el presente documento indistintamente, quiere decirse un agente o sistema paramagnético que tiene un valor de R  1 ns.

En un aspecto preferido de la invención dicho agente paramagnético de rotación lenta es un complejo metálico paramagnético macromolecular.

En otro aspecto, dicho sistema paramagnético de rotación lenta se representa como sistema paramagnético en el que el aumento de la relajación se genera por los efectos de susceptibilidad magnética.

Tales efectos, que se limitan estrictamente a la evolución transversal de la magnetización nuclear (es decir sólo afectan los valores de T2), se inducen mediante gradientes de campo magnético microscópico creados por las diferencias en la susceptibilidad magnética entre compartimentos (JL Boxerman, RM Weisskoff, BR Rosen “Susceptibility effects in Whole Body Experiments” en “Methods in Biomedical Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy” Ed. IR Young, John Wiley & Sons, Chichester, Vol. 1, pág. 654, 2000).

Esta contribución específica de T2 es dependiente directamente del cuadrado de la intensidad de los gradientes de campo magnético que son proporcionales a las diferencias de la susceptibilidad magnética y la fuerza del campo magnético, y se ven afectados por el tamaño relativo de los compartimentos. La diferencia de la susceptibilidad magnética entre los compartimentos puede aumentarse significativamente si se confina una concentración bastante alta de una especie paramagnética en un compartimento. Ejemplos típicos de sistemas paramagnéticos de rotación lenta que generan una efecto de T2 de susceptibilidad significativa se representan mediante compartimentos de tamaño nanométrico que contiene una cantidad bastante alta de un complejo metálico paramagnético.

Según la presente invención, a menos que se indique lo contrario, con la expresión “sistemas de tamaño nanométrico” quiere decirse un sistema que tiene un diámetro medio  5 nm. Preferiblemente, dichos sistemas atrapan el complejo metálico paramagnético a una concentración mínima de 5 mM.

Una lista no exhaustiva de sistemas de tamaño nanométrico que pueden atrapar complejos metálicos paramagnéticos incluye, por ejemplo, nanopartículas, microemulsiones, liposomas, cavidades proteicas y similares.

En otras palabras, como para todos los complejos metálicos paramagnéticos macromoleculares según la invención, para dichos sistemas de tamaño nanométrico la razón R2p/R1p es independiente de la concentración, viéndose sólo afectada por la fuerza del campo magnético, la cantidad del complejo atrapado y el tamaño del compartimento. En una realización de la invención, por consiguiente, el agente paramagnético de rotación lenta que presenta una razón R2p/R1p que responde a cambios del microentorno de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico se representa como sistema de tamaño nanométrico cuya tasa de relajación transversal se ve afectada por los efectos de susceptibilidad magnética para el que, además, el valor de R2p, y por consiguiente la razón R2p/R1p, es dependiente de un parámetro físico o químico o un proceso fisiológico o metabólico de interés diagnóstico.

Además del efecto de T2 selectivo que surge de los efectos de susceptibilidad magnética, puede hacerse que la razón R2p/R1p para un sistema de tamaño nanométrico sea dependiente del parámetro de interés actuando sobre R1p. Por ejemplo, este objetivo puede lograrse si el parámetro fisicoquímico afecta la permeabilidad al agua del compartimento que atrapa el complejo paramagnético.

Por tanto, en una realización, la presente invención se refiere a un método según la reivindicación 1 para la determinación in vivo, mediante el uso de IRM, de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un órgano, fluido o tejido del cuerpo de ser humano o animal, en el que se administra un sistema de tamaño nanométrico que atrapa un complejo metálico paramagnético que responde a cambios de un parámetro físico o químico dado o un proceso fisiológico o metabólico de interés diagnóstico mediante cambios en la razón R2p/R1p.

Tal como se dijo anteriormente, para la clase particular de agente paramagnético de rotación lenta de la invención, la razón R2p/R1p es independiente de la concentración real del propio agente, mientras que dicha razón sólo se ve afectada por valores de M, R, 1S, tamaño, permeabilidad al agua del compartimento y H.

Por tanto, desde un punto de vista diferente, puede decirse que la razón R2p/R1p medida para dichos agentes actúa como indicador de un cambio en el parámetro de interés porque los cambios que promueve dicho parámetro en los valores de R y/o M y/o 1S, y/o tamaño, y/o permeabilidad al agua del compartimento, a un valor de H dado, tienen un efecto diferente sobre los valores de R2p y R1p.

En particular, cuando el sistema paramagnético de rotación lenta usado en el método de la invención es un complejo metálico paramagnético macromolecular, la razón R2p/R1p medida actúa como indicador de un cambio en el parámetro de interés porque los cambios que promueve dicho parámetro en los valores de R y/o M y/o 1S, a un valor de H dado, tienen un efecto diferente sobre los valores de R2p y R1p.

Cuando, en una realización diferente, el sistema paramagnético de rotación lenta administrado es un sistema de tamaño nanométrico que atrapa un complejo metálico paramagnético, la razón R2p/R1p medida actúa como indicador de un cambio en el parámetro de interés porque los cambios que promueve dicho parámetro en el tamaño, y/o permeabilidad al agua del compartimento tienen un efecto diferente sobre los valores de R2p y R1p.

El método radiométrico para los agentes de respuesta según la presente invención se basa, por consiguiente, en la explotación del efecto diferencial tienen que los tiempos de correlación R, M y 1S sobre los valores de R1p y R2p para los complejos metálicos paramagnéticos de rotación lenta.

En un aspecto diferente, dicho método radiométrico se basa además en la explotación del efecto específico sobre valores de R2p provocados por la presencia de efectos de susceptibilidad magnética cuando los sistemas paramagnéticos de rotación lenta son sistemas de tamaño nanométrico que atrapan un complejo paramagnético.

Con el objetivo de definir cómo seleccionar de manera adecuada tales valores de R, M, 1S y H y, por consiguiente, cómo definir el complejo metálico paramagnético macromolecular que puede usarse ventajosamente en el método de la invención, se ha realizado una primera simulación teórica basada en las ecuaciones 1-2 que muestra que, a las fuerzas de los campos magnéticos usados en la IRM (0,2-7 T), la razón R2p/R1p comienza a ser sensible a la movilidad rotacional del complejo de Gd(III) (R) para valores de R mayores de 0,5 ns, en el que se prefieren los valores R mayores de 1 ns y se prefieren aún más valores mayores de 5 ns (figura 1).

Una vez que se establece la fuerza del campo magnético, los valores de R y M tienen un efecto opuesto sobre la razón R2p/R1p según puede obtenerse mirando a las simulaciones adicionales realizadas y notificadas en la figura 2 a) y b). En la simulación de la figura 2a) se han notificado los valores de R2p/R1p como función de R para sistemas basados en Gd(III) dotados de valores de M en el intervalo de 0,05-1 s a 7 T. En la simulación de la figura 2b) se han calculado valores de R2p/R1p como función de �M para sistemas basados en Gd(III) dotados de valores de R en el intervalo de 0,5-10 ns a 7 T. A partir de las 1 y 2, se desprende que R afecta a la razón R2p/R1p mediante su efecto sobre C y por consiguiente sobre TiM (i =1,2), mientras que M influye sobre R2p/R1p mediante el efecto limitante sobre Rip mediante el término (TiM + M).

Basándose en estos resultados, una clase de agentes de respuesta para su uso en el método de la invención puede comprender compuestos de complejos paramagnéticos macromoleculares dotados tanto de protones acoplados de manera dipolar como de valores de R  1 ns, siempre que su movilidad rotacional (R) y/o el tiempo de residencia medio M de los protones móviles acoplados de manera dipolar a su centro metálico y/o su tiempo de relajación electrónica longitudinal 1S sean dependientes del parámetro de interés. Para un compuesto dado, se conoce bien en la técnica que la dependencia de dichos valores de R, M, 1S del parámetro de interés puede verificarse fácilmente trazando la razón R2p/R1p con respecto a dicho parámetro: cuando se verifica una variación significativa de dicha razón con respecto al parámetro de interés, entonces R y/o M y/o 1S del compuesto sometido a prueba son dependientes de este parámetro.

Entre dichos agentes de respuesta, se prefieren particularmente compuestos de complejos metálicos paramagnéticos macromoleculares dotados de valores de R de desde 1 hasta 10 ns y valores de M de desde 0,01 hasta 1 s, según la reivindicación 1.

En la presente descripción, a menos que se indique lo contrario, con la expresión complejo paramagnético macromolecular quiere decirse un complejo metálico paramagnético dotado de una tasa de rotación lenta, es decir un complejo dotado de un valor de R mayor de 0,5 ns, en el que se prefieren valores de R mayores de 1 ns y se prefieren aún más valores de desde 5 hasta 10 ns.

La tasa de rotación lenta de los agentes de respuesta según la invención puede obtenerse controlando el tamaño molecular del sistema paramagnético, por ejemplo mediante la formación de enlaces covalentes o no covalentes con macromoléculas o sustratos endógenos que confieren al agente el peso molecular deseado.

Para agentes de respuesta de tamaño nanométrico de la invención, por ejemplo, los sistemas son nanopartículas con un diámetro medio  5 nm, que atrapan un complejo metálico paramagnético a una concentración mínima de 5 mM.

El complejo paramagnético atrapado en dicho sistema de tamaño nanométrico puede ser cualquier complejo metálico paramagnético de la técnica, sin ninguna limitación en lo que se refiere a su peso molecular.

En lo que respecta a los agentes de tamaño nanométrico que responden a la temperatura, un sistema preferido (para experimentos de obtención de imágenes realizados a campos magnéticos  3 T) puede representarse como un liposoma paramagnético dotado de las siguientes características: i) diámetro medio  150 nm, ii) permeabilidad al agua de la membrana liposómica  5.10-5 cm s-1, iii) concentración del complejo metálico paramagnético atrapado (con respecto al compartimento acuoso interno del liposoma)  50 mM. Preferiblemente, el complejo metálico paramagnético atrapado es un complejo de Gd(III).

En la presente descripción, con la expresión agente de contraste paramagnético o complejo paramagnético o complejo metálico paramagnético, tal como se usa en el presente documento indistintamente, quiere decirse cualquier complejo quelado con un ión metálico paramagnético bi y trivalente, que tiene preferiblemente un número atómico que oscila entre 20 y 31, 39, 42, 43, 44, 49, y entre 57 y 83 tal como, por ejemplo, Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Cr(3+), Eu(3+), Dy(3+), La(3+), Yb(3+) o Mn(2+) y Gd(3+), siendo este último incluso más preferido.

Más preferiblemente, el agente de respuesta de rotación lenta para su uso en el método de la invención es un complejo de Gd(III) macromolecular dotado de un valor de R entre 1 y 10 ns, un M de desde 0,01 hasta 1 s para el que, además, R y/o M son dependientes del parámetro de interés.

Por consiguiente, en un método preferido según la invención, se usa un complejo de Gd(III) que se mueve lentamente que tiene un valor de R de desde 1 hasta 10 ns y un M de desde 0,01 hasta 1 s y en el que R y/o M y/o 1S son dependientes del parámetro de interés.

En un método de la invención igualmente preferido, se usa un agente de tamaño nanométrico que se mueve lentamente que tiene un diámetro medio  5 nm y que atrapa un complejo paramagnético con una concentración igual o mayor que 5 mM para el que el tamaño del sistema y/o los efectos de susceptibilidad magnética son dependientes de un parámetro de interés diagnóstico.

Como referencia general, no exhaustiva, para los complejos metálicos paramagnéticos o los sistemas de tamaño nanométrico que atrapan un complejo metálico paramagnético según la invención, véase, por ejemplo, la sección experimental a continuación.

Los complejos paramagnéticos de la invención también pueden estar convenientemente en forma de sales fisiológicamente aceptables. Cationes preferidos de bases inorgánicas que pueden usarse adecuadamente para salificar los complejos de la invención comprenden iones de metales alcalinos o alcalinotérreos tales como potasio, sodio, calcio o magnesio.

Cationes preferidos de bases orgánicas comprenden, entre otros, aquellos de aminas primarias, secundarias y terciarias tales como etanolamina, dietanolamina, morfolina, glucamina, N-metilglucamina, N,N-dimetilglucamina. Aniones preferidos de ácidos inorgánicos que pueden usarse adecuadamente para salificar los complejos de la invención comprenden los iones de haloácidos tales como cloruros, bromuros, yoduros u otros iones tales como sulfato.

Aniones preferidos de ácidos orgánicos comprenden aquellos de los ácidos usados de manera rutinaria en técnicas farmacéuticas para la salificación de sustancias básicas tales como, por ejemplo, acetato, succinato, citrato, fumarato, maleato u oxalato.

Cationes y aniones preferidos de aminoácidos comprenden, por ejemplo, aquellos de taurina, glicina, lisina, arginina, ornitina o de ácidos aspártico y glutámico.

Un objetivo adicional de la presente invención es una composición de diagnóstico para su uso en la obtención de imágenes por RM de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico que comprende al menos un complejo o sistema paramagnético que se mueve lentamente dotado de un valor de R de desde 1 hasta 10 ns y un valor de M de desde 0,01 hasta 1 s para el que, además, la movilidad rotacional R y/o el tiempo de residencia medio M de los protones móviles acoplados de manera dipolar al centro metálico y/o el tiempo de relajación electrónica longitudinal 1S son dependientes de dicho parámetro de interés.

En una realización de la invención, dicha composición de diagnóstico comprende un sistema de tamaño nanométrico que atrapa una disolución 5 mM de un complejo paramagnético, que responde a cambios del microentorno de un parámetro físico o químico dado o un proceso fisiológico o metabólico de interés diagnóstico mediante cambios en la razón R2p/R1p y para el cual el tamaño del sistema y/o los efectos de susceptibilidad magnética son dependientes de un parámetro de interés diagnóstico.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

Se notifica una lista no limitativa de sistemas de rotación lenta preferidos de la invención en la siguiente sección, para mostrar mejor a modo de ejemplo el amplio potencial de aplicación de la presente invención.

Ejemplo 1

Como prueba de principio, se han investigado las propiedades de respuesta de un complejo de Gd(III) macromolecular frente a la temperatura, un parámetro cuya medición no invasiva in vivo es importante para fines o bien de diagnósticos o bien terapéuticos.

Entre varias posibilidades, se eligió el aducto formado por cuatro unidades de complejo 1 y avidina como sistema que se mueve lentamente. El complejo 1 es un derivado de GdDTPA que soporta sobre su superficie un resto de biotina. Se notifica a continuación la estructura de este complejo. GdDTPA es el ejemplo más representativo de agentes de contraste para IRM, ya comercializados con el nombre Magnevist. Avidina es una glicoproteína tetramérica (PM de aproximadamente 68 kDa) que une fuertemente (KA = 1015) (Green NM, Adv Prot Chem 1975, 29, 85-133) cuatro unidades de biotina (figura 3).

imagen1

Se sometió a prueba el protocolo R2p/R1p para la medición de temperatura en tres disoluciones

10 que contenían cantidades diferentes de aducto (Gd-1)4/avidina (en tampón PBS a pH 7,4). La concentración de Gd-1 en las tres disoluciones era de 0,125, 0,25, y 0,5 mM, respectivamente. Se midieron los valores de R1 y R2 para protones de agua a 7,05 T (correspondiente a una frecuencia de Larmor de protones de 300 MHz) para cada disolución en el intervalo de temperatura 298-318 K.

Se obtuvieron las contribuciones paramagnéticas de R1p y R2p a las tasas de relajación 15 observadas sustrayendo las contribuciones diamagnéticas correspondientes (Rid) medidas para cada temperatura en ausencia del agente paramagnético, es decir Rip = Ri - Rid.

En el intervalo de temperatura investigado, la razón R2p/R1p es lineal con una pendiente positiva de aproximadamente 0,35 unidades/grado (figura 4).

De manera importante, la desviación entre los valores de R2p/R1p para las tres disoluciones a una

20 temperatura dada es muy pequeña, demostrando así la validez de este enfoque. El aumento de valores de R2p/R1p con el aumento de la temperatura es el resultado de una participación significativa de R en la determinación de la tasa de relajación transversal. De hecho, los valores de R2p aumentan con la temperatura, mientras los valores de R1p muestran una tendencia opuesta. Esto significa que valores de M en el intervalo de temperatura considerado están probablemente en el medio entre T2M y T1M (T1M>M

25 >T2M).

Por el contrario, en ausencia de Avidina, la razón R2p/R1p para disoluciones que contienen una

concentración de Gd-1 de 0,125, 0,25, y 0,5 mM es de aproximadamente 1,3 y, además, no se ve

afectado en absoluto por cambios de temperatura.

Ejemplo 2

30 Como prueba de principio, se ha investigado la propiedad de respuesta de un complejo de Gd(III) macromolecular frente a pH, otro marcador in vivo de diagnostico importante.

En este caso, el sistema de rotación lenta elegido fue el aducto no covalente formado por Gd-

DOTP (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetrametilenofosfónico) y poliarginina. GdDOTP es

un complejo macrocíclico cargado negativamente que puede unirse, a través de fuerzas electrostáticas, a

35 compuestos cargados positivamente, incluyendo poliaminoácidos catiónicos como poliarginina. (Aime S, Angew Chem Int Ed 2003, 42, 4527-4529).

La esfera de coordinación interna de Gd-DOTP carece de moléculas de agua y, por tanto, se ha

explicado la relaxividad relativamente alta medida para este complejo en términos de una contribución de

segunda esfera grande que surge de la presencia de varias moléculas de agua estrechamente unidas a

40 los grupos fosfonato del quelato y, por tanto, acopladas de manera dipolar al ión de Gd(III).

En analogía a algunos otros poliaminoácidos catiónicos como polilisina, el movimiento de rotación de poliarginina es dependiente del pH debido al paso desde una estructura de rotación más rápida (a pH acido) debido a la repulsión de los grupos guanidina cargados positivamente hacia una estructura de hélice  de rotación más lenta y más rígida formada a pH básico cuando se desprotonan los

45 residuos de guanidina.

La afinidad de unión entre Gd-DOTP y poliarginina es tan fuerte (KA = 3.104 tal como se determina mediante mediciones relaxométricas) que es muy fácil preparar una disolución en la que el complejo paramagnético se une completamente al polímero.

Se sometió a prueba el protocolo R2p/R1p para la medición de pH en dos disoluciones que contenían cantidades diferentes de aducto de Gd-DOTP/poliarginina (en tampón HEPES 10 mM). La concentración del complejo de Gd(III) en las dos disoluciones fue de 0,25 y 0,5 mM, respectivamente, y la razón molar de Gd-DOTP/poliarginina fue de 10/1. Se midieron los valores de R1 y R2 para protones de agua a 14,1 T (correspondiente a una frecuencia de Larmor de protones de 600 MHz) y 312 K.

Se obtuvieron las contribuciones paramagnéticas R1p y R2p a las tasas de relajación observadas sustrayendo las contribuciones diamagnéticas correspondientes (Rid) medidas en cada valor de pH en ausencia del agente paramagnético.

El resultado mostrado en la figura 5 respalda fuertemente la aplicabilidad correcta del enfoque propuesto también para sistemas macromoleculares que no incluyen ninguna molécula de agua coordinada con el centro metálico, siempre que las tasas de relajación de dichos sistemas estén dominadas por la contribución de protones de agua acoplados de manera dipolar presentes en la segunda esfera de coordinación del centro metálico.

Ejemplo 3

Como prueba de principio adicional, se ha investigado la capacidad de respuesta al pH de un aducto covalente a base de Gd(III) macromolecular.

El sistema modelo se representa por un quelato de Gd(III) unido covalentemente, a través de un resto escuárico, a un esqueleto de poliornitina (Gd-II, figura 6).

Tal como ya se mencionó en el ejemplo 2, se sabe que poliaminoácidos básicos, como poliornitina, experimentan un cambio conformacional reversible controlado por pH desde una estructura “helicoidal al azar”, predominante a pH < 9 cuando se protonan los residuos de ornitina, hacia una estructura “pseudo-helicoidal ”, predominante a pH > 11 cuando se desprotonan los residuos de ornitina (GC Hammes, PB Roberts, J Am Chem Soc, 91, 1812, 1969). De manera interesante, se ha demostrado que la movilidad rotacional de las dos conformaciones son diferentes y se ha observado un valor de R más prolongado para la conformación “seudo-helicoidal ” estructuralmente ordenada y significativamente más rígida (véase, por ejemplo, S Aime, M Botta, SG Crich, G Giovenzana, G Palmisano, M Sisti, Chem Commun, 1577, 1999).

La figura 7 notifica la dependencia del campo magnético de R1p y R2p medida a tres valores de pH, 7, 10, y 12, de una disolución de Gd-II que contiene 1 mM de ión de Gd(III).

El aumento de R1p observado con el aumento de pH es una evidencia clara de la ralentización del movimiento reorientacional del complejo macromolecular provocada por el cambio conformacional del polímero. Un análisis cuantitativo detallado de los perfiles de R1p, realizado usando la teoría de SolomonBloembergen-Morgan, implementado con el modelo Lipari-Zsabo, indicó que tiempos reorientacionales tanto globales (Rg) como locales (Rl) para el aducto macromolecular eran dependientes del pH (se obtuvieron Rg de 1,0, 1,7, y 3,6 ns a pH 7, 10, y 12, respectivamente).

De manera interesante, los valores de R2p no son dependientes del campo magnético, porque están dominados por C y este último parámetro, en este caso, está dominado por R. Por esta razón, los valores de R2p se ven afectados significativamente por el pH de la disolución.

Para confirmar la independencia de la concentración de la razón R2p/R1p, se han medido las contribuciones paramagnéticas a las tasas de relajación a 14 T, 25ºC, y a cuatro valores de pH (7, 8,5, 10, y 12), como función de la concentración del ión de Gd(III). El resultado, notificado en las figuras 8 y 9, muestra claramente que la razón R2p/R1p es independiente de la concentración del agente macromolecular pero dependiente del parámetro de interés.

Ejemplo 4

Se han investigado las propiedades de respuesta frente a la temperatura de un liposoma que atrapa un complejo de Gd(III) como ejemplo de un sistema de respuesta de tamaño nanométrico según la invención. Se ha preparado el liposoma paramagnético hidratando una película lipídica delgada fabricada de una mezcla de lípidos (POPC/Chol/DSPE-PEG, razón molar 55:40:5 en el que POPC es 1-palmitoil-2oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, Chol es colesterol, y DSPE-PEG es 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(polietilenglicol)-2000) con una disolución 200 mM de Gd-HPDO3A (un agente de contraste comercializado como ProHance®). Tras una extrusión repetida con un filtro de 400 nm de diámetro, se ha dializado exhaustivamente la suspensión de liposoma frente a tampón Hepes isotónico con el fin de eliminar el complejo de Gd(III) no atrapado. El diámetro medio de liposoma tras la diálisis era de 260 nm.

La figura 10 notifica la dependencia de la temperatura de R2p y R1p para este sistema de tamaño nanométrico, medida a 7 T. Las dos contribuciones paramagnéticas muestran una tendencia opuesta con el aumento de la temperatura: R2p disminuye, mientras R1p aumenta.

Puede explicarse el comportamiento observado considerando que la contribución de R1p se

5 controla por la permeabilidad al agua de la membrana liposómica y, por esta razón, un aumento de temperatura conduce a un aumento de R1p. Por el contrario, efectos de susceptibilidad magnética, cuyo grado disminuye según aumenta la temperatura, dominan los valores de R2p.

Se ha demostrado la independencia de la concentración de la razón R2p/R1p midiendo valores de R2p y R1p de disoluciones que contienen cantidades diferentes de liposomas (y por consiguiente de 10 complejo de Gd(III), figura 11).

El comportamiento diferente mostrado por R1p y R2p frente a la temperatura hace que la razón R2p/R1p sea fuertemente dependiente de este parámetro (figura 12).

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para la determinación in vivo, mediante el uso de la técnica de IRM, de parámetro físico

   o químico de interés diagnóstico en un órgano, fluido o tejido del cuerpo de ser humano o animal, comprendiendo el método:

   -administrar a dicho ser humano o animal una cantidad eficaz desde el punto de vista de diagnóstico de un agente paramagnético de rotación lenta que responde a cambios del microentorno de dicho parámetro mediante cambios en la razón R2p/R1p, que se selecciona de

   -un complejo metálico paramagnético macromolecular dotado de al menos una molécula de agua lábil coordinada con el centro metálico y que tiene un valor de �R de desde 1 hasta 10 ns y un valor de �M de desde 0,01 hasta 1 s, y

   -un sistema de tamaño nanométrico que atrapa un complejo metálico paramagnético a una concentración mínima de 5 mM, y que tiene un diámetro medio  5 nm, y

   -registrar una obtención de imágenes de IRM que responde a dicho parámetro mediante la medición de la razón R2p/R1p.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que la razón R2p/R1p medida actúa como indicador de un cambio en el parámetro de interés.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1, en el que el metal del complejo o agente paramagnético es un lantánido o un ión de metal de transición.

4. 4.

   Método según la reivindicación 3, en el que el ión metálico se selecciona de Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Cr(3+), Eu(3+), Dy(3+), La(3+), Yb(3+) o Mn(2+) y Gd(3+).

5. 5.

   Método según la reivindicación 4, en el que el ión metálico es Gd(3+).

6. 6.

   Método según la reivindicación 1, en el que el complejo metálico paramagnético macromolecular es el aducto (Gd-1)4/avidina, o el aducto Gd-DOTP/poliarginina, o el aducto macromolecular de Gd-II.

7. 7.

   Método según la reivindicación 1, en el que el sistema paramagnético de tamaño nanométrico es una nanopartícula, una microemulsión, un liposoma o una cavidad proteica.

8. 8.

   Método según la reivindicación 1, en el que el sistema paramagnético de tamaño nanométrico es un liposoma que atrapa Gd-HPDO3A.

9. 9.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el parámetro físico o químico de interés diagnóstico se selecciona de temperatura, pH, presión parcial de oxígeno o dióxido de carbono, concentración de ión o metabolito específico, actividad enzimática específica.

10. 10.

    Uso de un agente paramagnético de rotación lenta que responde a un parámetro físico o químico dado de interés diagnóstico mediante cambios en la razón R2p/R1p y seleccionado de un complejo metálico paramagnético macromolecular dotado de al menos una molécula de agua lábil coordinada con el centro metálico y que tiene un R de desde 1 hasta 10 ns y un valor de M de desde 0,01 hasta 1 s, y un sistema de tamaño nanométrico que atrapa un complejo metálico paramagnético, a una concentración mínima de 5 mM, y que tiene un diámetro medio  5 nm, para la preparación de una composición de diagnóstico para su uso en la determinación de dicho parámetro en un órgano, fluido o tejido del cuerpo de ser humano o animal, mediante el uso de IRM, de una manera que es independiente de la concentración absoluta de dicho agente administrado.

11. 11.

    Compuesto seleccionado de los siguientes:

    -el aducto (Gd-1)4/avidina, en el que Gd-1 tiene la siguiente estructura

    imagen1

    -el aducto macromolecular de Gd-II.
12. 12. Compuestos según la reivindicación 11 para su uso como agentes de contraste.