ES2358015T3 - Oxidorreductasa. - Google Patents

Abstract

Oxidorreductasa, que reduce ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes ésteres de S-2-hidroxiácido, caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y una actividad específica de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo.

Description

La presente invención se refiere a una oxidorreductasa, a una secuencia de ADN aislada de la oxidorreductasa, a 5 una proteína de fusión basada en la oxidorreductasa y a un procedimiento para la obtención enantioselectiva de ésteres de S-2-hidroxiácido.

Los 2-hidroxiácidos y sus ésteres representan unidades estructurales básicas de síntesis quirales importantes a partir de los cuales pueden obtenerse una serie de compuestos obteniendo la quiralidad en el átomo C2, por ejemplo epóxidos, ésteres alquílicos, ésteres hidracinílicos, alfa-N-alcoxiaminoésteres o alfa-aminoésteres. 10

Hasta la fecha numerosos trabajos de investigación se han dedicado al desarrollo de métodos para preparar 2-hidroxiácidos enantioméricamente puros y sus ésteres, habiéndose considerado diferentes planteamientos químicos y biocatalíticos. Hasta la fecha aún no se ha logrado desarrollar procedimientos que satisfagan los requisitos de producción a nivel industrial. Especialmente en la producción de 2-hidroxiácidos y sus ésteres parece ser superior la introducción catalizada por enzimas del centro quiral de la síntesis mediante catalizadores químicos. 15

En el caso de los procedimientos catalizados por enzimas existen momentáneamente tres procedimientos diferentes. Una manera es la síntesis catalizada por oxinitrilasa de cianohidrinas quirales y su posterior hidrólisis, a menudo también catalizada por enzimas (Biotransformations in Organic Chemistry, A Textbook. 4ª edición, Springer (2000), K. Faber; Cyanhydrinformation). El inconveniente de este procedimiento es el uso del HCN tóxico.

Un procedimiento adicional es la resolución de racematos de ésteres de 2-hidroxiácido con ayuda de lipasas, por 20 ejemplo de Pseudomonas fluorescens (J. Org. Chem. 55, 812-815 (1991), Kinetic Resolution of 2-substituted Esters catalysed by a Lipase Ex. Pseudomonas fluorescens, Kalaritis, P. et al.). El inconveniente de este método es el rendimiento teórico de tan sólo el 50%.

Un procedimiento adicional es la síntesis de 2-hidroxiácidos quirales y sus ésteres mediante la reducción de 2-oxoácidos proquirales o sus ésteres. Se conocen las transformaciones con células de levadura completas o 25 células de Proteus vulgaris o Proteus mirabilis o procedimientos con enzimas aisladas. En el caso de las transformaciones con células de levadura completas se atribuyó la actividad enzimática reductora en los 2-oxoácidos a las enzimas lactato deshidrogenasa o malato deshidrogenasa (Ramesh N. Patel Stereoselective Biocatalyse, NY (2000), 14. Stereoselective Synthesis of Chiral Compounds Using Whole-Cell Biocatalysis, Paola D’Arrigo, Giuseppe Pedrocchi-Fantoni y Stefano Servi), mientras que en las reducciones realizadas con Proteus se cree que es 30 responsable de la reacción una proteína hierro-azufre dependiente de molibdeno de membrana (Eur J Biochem (1994); 222(3):1025-32, The (2R)-hydroxycarboxylate-viologen-oxidoreductase from Proteus vulgaris is a molybdenum-containing iron-sulphur protein, Trautwein T, Krauss F, Lottspeich F, Simon H.).

En procedimientos conocidos para la reducción de ésteres de 2-oxoácido se utilizan las enzimas aisladas (D/L)-lactato deshidrogenasa (documento US 5.686.275), (D/L)-dihidroxiisocaproato deshidrogenasa (documento US 35 6.033.882) o D-mandelato deshidrogenasa (Appl Environ Microbiol 2002 Feb; 68(2):947-51, Two forms of NAD-dependent D-mandelate dehydrogenase in Enterococcus faecalis IAM 10071. Tamura Y. et al 10), que también pueden clonarse, sobreexpresarse y obtenerse comercialmente. Estas enzimas son dependientes de NADH y no transforman los ésteres de 2-oxoácido. Además se conoce que las enzimas que reducen los 2-oxoácidos o sus ésteres, no transforman alcoholes secundarios. 40

Además se conocen procedimientos, en los que la coenzima NAD se regenera con formiato deshidrogenasa, por ejemplo a partir de Candida boidinii o también de manera recombinante a partir de Pseudomonas fluorescens (Biotechnology, Biotransformations I (Rehm y Reed) 9. Alcohol Dehydrogenases-Characteristics, Design of Reaction Conditions J. Peters, WILEY-VCH-Verlag, (1998)). A modo de ejemplo se menciona en este caso el procedimiento para la producción enzimática de ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico con ayuda de D-lactato deshidrogenasa de 45 Staphylococcus epidermidis (Industrial Biotransformations, Liese, K. Seelbach, C.Wandrey, WILEY-VCH-Verlag, (2000)). El inconveniente de la regeneración de coenzima con formiato deshidrogenasa es la reducida actividad específica de la formiato deshidrogenasa (de 4 a 10 U/mg) y los elevados costes para la producción de la enzima. Por esto, desde el punto de vista económico, es necesario usar la enzima varias veces, lo que da como resultado un control del proceso en comparación esencialmente más complicado y por consiguiente más caro. 50

El objetivo de la invención es remediar mediante una oxidorreductasa los inconvenientes mencionados de los procedimientos del estado de la técnica.

Este objetivo se soluciona según la invención mediante una oxidorreductasa, que reduce ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes ésteres de S-2-hidroxiácido, y caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y una actividad específica 55 de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo.

La invención se refiere entre otras cosas a oxidorreductasas, que pueden obtenerse por ejemplo a partir de Lactobacillus (L.) reuteri, L. kefiri, L. kandleri, L. parabuchneri, L. cellobiosus o L. fermentum.

La invención se refiere además a la oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri, que presenta la secuencia de 60 aminoácidos según la SEQ ID NO: 18, tal como se describe en el protocolo de secuencias adjunto.

Se prefieren oxidorreductasas que presentan del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. La

medición de la actividad específica de la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18 o sus derivados o análogos tiene lugar con el sistema de prueba descrito en el ejemplo 2.

La invención se refiere además a una oxidorreductasa, caracterizada porque presenta de 1 a 50 aminoácidos más o de 1 a 50 aminoácidos menos que la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18. Se prefieren oxidorreductasas en las que hay de 1 a 25 aminoácidos, especialmente de 2 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 3 5 a 10 aminoácidos más o menos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

La invención se refiere además a una oxidorreductasa que se caracteriza porque presenta la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces por un polímero soluble en agua. Un ejemplo de un polímero soluble en agua es polietilenglicol. La unión del polietilenglicol tiene lugar preferiblemente en el extremo N-terminal de la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18. La oxidorreductasa según 10 la SEQ ID NO: 18 también puede estar unida a un cuerpo sólido tal como polietileno, poliestireno, polisacárido, celulosa o derivado de celulosa.

La invención se refiere además a una proteína de fusión que se caracteriza porque representa la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18, y porque la oxidorreductasa está unida con un polipéptido adicional en el extremo N-terminal o carboxiterminal con un enlace peptídico. Las proteínas de fusión pueden 15 separarse por ejemplo más fácilmente de otras proteínas o se expresan en las células en mayores cantidades.

La invención se refiere además a un anticuerpo, que se une específicamente a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18. La producción de estos anticuerpos tiene lugar según métodos conocidos mediante inmunización de mamíferos adecuados tales como el caballo, el ratón, la rata o el cerdo, y la obtención posterior de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. 20

La invención se refiere también a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18.

La invención se refiere además a una secuencia de ácido desoxirribonucleico aislada (secuencia de ADN) de la oxidorreductasa, que cataliza la reducción de ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes ésteres de S-2-hidroxiácido, seleccionándose la secuencia de ADN del grupo que consiste en 25

a) SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria,

b) una secuencia de ADN, que se hibrida con la secuencia de ADN según a) o su hebra complementaria, teniendo lugar la hibridación en condiciones rigurosas, y

c) una secuencia de ADN, que debido a la degeneración del código genético codifica para una proteína, que se codifica mediante una o varias de las secuencias de ADN según a) o b). 30

La hibridación se describe por ejemplo por Sambrok y Russel en Molecular Cloning a laboratory Manual, tomo 1, capítulo 1, protocolo 30-32.

La invención se refiere además a una secuencia de ADN aislada que se caracteriza porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia de ADN SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria y codifica para una proteína, que presenta una actividad específica de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-35 fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Se prefieren secuencias de ADN que presentan del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, preferiblemente del 99% al 99,5% de identidad con la secuencia de ADN SEQ ID NO: 19.

La invención se refiere además a un vector de clonación, que contiene una o varias de las secuencias de ADN o de ácido nucleico mencionadas anteriormente. La invención se refiere además a un vector de expresión, que se 40 encuentra en una célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y contiene una o varias de las secuencias de ADN o de ácido nucleico mencionadas anteriormente, y está unido de manera adecuada con una secuencia de control de expresión.

La invención se refiere además a una célula huésped, que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y transformada o transfectada con uno de los vectores de expresión mencionados anteriormente. 45

Las identidades de las secuencias de ADN o la secuencia de aminoácidos mencionadas anteriormente se calculan sumando el número de los aminoácidos o bases de ácido nucleico que son idénticos con secuencias parciales de las respectivas proteínas o secuencias de ADN, dividido entre el número total de los aminoácidos o bases de ácido nucleico y multiplicado por cien.

Vectores de clonación adecuados son por ejemplo ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), el vector de 50 clonación pDrive (Qiagen), pS Blue, pET Blue, los vectores pET LIC (Novagen) así como los vectores de clonación TA-PCR (Invitrogene).

Vectores de expresión adecuados son por ejemplo pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL, pTrx).

Secuencias de control de expresión adecuadas son por ejemplo promotor trp-lac (tac), promotor trp-lac (trc), 55 promotor lac, promotor T7, promotor pL.

La oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri es un homodímero con un peso molecular determinado en gel de SDS de desde 30 hasta 35 kDa y con un peso molecular determinado con cromatografía de permeación en gel de desde 60 hasta 65 kDa. El óptimo de temperatura se encuentra en el intervalo de desde 55 ºC hasta 60 ºC y tiene un óptimo de pH de desde 6,5 hasta 7,0. La oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri presenta una buena estabilidad 60 frente a la temperatura y al pH y es estable en el intervalo de pH de desde 4,5 hasta 8,5 y en el intervalo de temperatura de desde 15 ºC hasta 50 ºC durante al menos 5 horas y muestra además un estabilidad elevada en disolventes orgánicos.

La enzima puede aislarse especialmente a partir de microorganismos del género Lactobacillus y puede detectarse en una prueba espectrofotométrica a través de la disminución de NADPH a 340 nm en presencia de un sustrato correspondiente, por ejemplo ácido etil-2-oxo-4-fenilbutírico o ácido etil-2-oxovaleriánico.

La oxidorreductasa según la invención de Lactobacillus reuteri se clonó y pudo sobreexpresarse en Escherichia (E.) coli con actividades de desde 10.000 U/g hasta 30.000 U/g de peso húmedo de E. coli. La enzima es por 5 consiguiente barata y está disponible en grandes cantidades. En las bases de datos no se encontró ninguna secuencia relacionada, sólo pudo suponerse una relación lejana con enzimas del grupo de las hidroxiacil-CoA deshidrogenasas.

En el caso de un procedimiento para la obtención de la oxidorreductasa a partir de Lactobacillus reuteri, se expresa el ADN, que codifica para la oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri, en un microorganismo procariota o eucariota 10 adecuado. Preferiblemente se transforma y expresa la oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri en una cepa de Escherichia coli, especialmente en células de Escherichia coli BL21star (DE3) (Invitrogen, n.º de catálogo C6010-03, derivada de E. coli BL21, con una copia cromosómica del gen de ARN polimerasa de T7 bajo el control del promotor lacUV5, sin ompT y Lon-proteasa, Bl21 star tiene una mutación en RNaseE (rne131).

La oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri puede obtenerse por ejemplo, cultivando células recombinantes de 15 Escherichia coli, induciendo la expresión de la oxidorreductasa y abriéndose posteriormente tras aproximadamente de 10 a 18 horas (h) las células mediante tratamiento por ultrasonidos o mediante molienda en húmedo con perlas de vidrio en un molino de bolas (Retsch, 10 min., 24 Hz). El extracto celular obtenido o bien puede usarse directamente o bien puede purificarse adicionalmente. Para ello el extracto celular por ejemplo se centrifuga y el sobrenadante obtenido se somete a una cromatografía de interacción hidrófoba, por ejemplo una cromatografía de 20 interacción hidrófoba en Butylsepharose Fast Flow (Pharmacia) y una permeación en gel posterior (Superdex 200 HR, Pharmacia).

La invención se refiere además a un procedimiento para la obtención enantioselectiva de éster de S-2-hidroxiácido, que se caracteriza porque se reduce un éster de 2-oxoácido en presencia de oxidorreductasa, NADPH y agua para dar el correspondiente éster de S-2-hidroxiácido y se aísla el éster de S-2-hidroxiácido formado. 25

El procedimiento según la invención presenta una vida útil elevada, una pureza enantiomérica de más del 94% de los ésteres de S-2-hidroxiácido quirales producidos y un rendimiento elevado con respecto a la cantidad utilizada del éster de 2-oxoácido.

Por el término “NADPH” se entiende nicotinamida adenin dinucleótido fosfato reducido. Por el término “NADP” se entiende nicotinamida adenin dinucleótido fosfato. 30

Por el término “éster de 2-oxoácido” se entienden por ejemplo compuestos de fórmula I

R2-C(O)-C(O)-O-R1 (I).

R1 representa

1. -alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado,

2. -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, 35 dos, tres o cuatro dobles enlaces,

3. -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es lineal o ramificado y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,

4. -arilo (C6-C14),

5. -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14), 40

6. -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

7. -cicloalquilo (C3-C7),

R2 representa

1. -alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado, 45

2. -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,

3. -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es lineal o ramificado y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,

4. -arilo (C6-C14), 50

5. -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),

6. -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

7. -cicloalquilo (C3-C7),

estando los restos mencionados anteriormente en 1. a 7. no sustituidos o de mono a trisustituidos 55 independientemente entre sí con

a) -OH,

b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,

c) -NO2,

d) -C(O)-O-alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o de mono a 60 trisustituidos con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

e) -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro.

Por el término “ésteres de S-2-hidroxiácido” deben entenderse compuestos de fórmula II

R2-C(OH)-C(O)-O-R1 (II),

estando el grupo -OH en configuración S con respecto al átomo de carbono, al que está unido y R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I.

Por el término arilo se entienden restos de carbono aromáticos con de 6 a 14 átomos de carbono en el anillo. Restos 5 -arilo (C6-C14) son por ejemplo fenilo, naftilo, por ejemplo 1-naftilo, 2-naftilo, bifenililo, por ejemplo 2-bifenililo, 3-bifenililo y 4-bifenililo, antrilo o fluorenilo. Los restos bifenililo, restos naftilo y especialmente restos fenilo son restos arilo preferidos. Por el término “halógeno” se entiende un elemento de la serie flúor, cloro, bromo o yodo. Por el término “-alquilo (C1-C20)” se entiende un resto de hidrocarburo, cuya cadena carbonada es lineal o ramificada y contiene de 1 a 20 átomos de carbono por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, 10 heptilo, octilo, nonenilo o decanilo.

Por el término “-cicloalquilo (C3-C7)” se entienden restos de hidrocarburo cíclicos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo.

El término “-heterociclo (C5-C14)” representa un anillo heterocíclico de 5 a 14 miembros monocíclico o bicíclico, que está parcialmente saturado o completamente saturado. Ejemplos de heteroátomos son N, O y S. Ejemplos de los 15 términos -heterociclo (C5-C14) son restos, que se derivan de pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxido, triazolona, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidindiona, triazoles, que están sustituidos con F, -CN, -CF3 o -C(O)-O-alquilo (C1-C4), 3-hidroxipirro-2,4-diona, 5-oxo-1,2,4-tiadiazoles, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, carbolina y derivados benzocondensados, ciclopenta, ciclohexa o cicloheptacondensados de 20 estos heterociclos. Se prefieren especialmente los restos 2- o 3-pirrolilo, fenilpirrolilo tal como 4- o 5-fenil-2-pirrolilo, 2-furilo, 2-tienilo, 4-imidazolilo, metilimidazolilo, por ejemplo 1-metil-2-, -4- o -5-imidazolilo, 1,3-tiazol-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-, 3- o 4-piridil-N-óxido, 2-pirazinilo, 2-, 4- o 5- pirimidinilo, 2-, 3- o 5-indolilo, 2-indolilo sustituido, por ejemplo 1-metil-, 5-metil-, 5-metoxi-, 5-benciloxi-, 5-cloro- o 4,5-dimetil-2-indolilo, 1-bencil-2- o -3-indolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo, ciclohepta[b]-5-pirrolilo, 2-, 3- o 4-quinolilo, 1-, 3- o 4-isoquinolilo, 1-oxo-1,2-dihidro-3-25 isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo, 2-benzotienilo, 2-benzoxazolilo o benzotiazolilo o dihidropiridinilo, pirrolidinilo, por ejemplo 2- o 3-(N-metilpirrolidinilo), piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrotienilo o benzodioxolanilo.

Compuestos preferidos de fórmula I son por ejemplo 2-oxovaleriato de etilo, 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo, piruvato de etilo, fenilglioxilato de etilo, ácido etil-2-oxo-3-fenilpropiónico, 8-cloro-6-oxooctanoato de etilo, 2-oxobutirato de etilo, 30 2-oxohexanoato de etilo, fenilglioxilato de metilo, 2-oxovaleriato de metilo, piruvato de metilo, 2-oxo-4-fenilbutirato de metilo, ácido metil-2-oxo-3-fenilpropiónico, 8-cloro-6-oxooctanoato de metilo, 2-oxobutirato de metilo o 2-oxo-hexanoato de metilo.

Los ésteres de S-2-hidroxiácido formados de manera correspondiente son por ejemplo S-2-hidroxivaleriato de etilo, S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, L-lactato de etilo o S-mandelato de etilo. 35

Oxidorreductasas adecuadas proceden por ejemplo de Lactobacillus reuteri. La oxidorreductasa puede utilizarse en el procedimiento según la invención o bien completamente purificada o bien parcialmente purificada o usarse contenida en células. Las células utilizadas pueden estar presentes a este respecto de manera nativa, permeabilizadas o lisadas. Preferiblemente se utiliza la oxidorreductasa clonada según la SEQ ID NO: 18.

La actividad volumétrica de la oxidorreductasa utilizada asciende a desde 250 Unidades/ml (U/ml) hasta 20000 U/ml, 40 de manera preferible aproximadamente 4000 U/ml. Por cada kg de compuesto de fórmula I que ha de transformarse se utilizan de 5000 a 250000 U de oxidorreductasa, de manera preferible aproximadamente de 10000 U a 50000 U. La unidad enzimática 1 U corresponde a este respecto a la cantidad de enzima necesaria para transformar 1 mol de 2-oxo-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo por cada minuto (min.).

La invención se refiere además a un procedimiento para la obtención enantioselectiva de éster de S-2-hidroxiácido, 45 que se caracteriza porque

a) se reduce un éster de 2-oxoácido en presencia de oxidorreductasa, NADPH y agua para dar el correspondiente éster de S-2-hidroxiácido,

b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con una deshidrogenasa y un cosustrato simultáneamente para dar NADPH, y 50

c) se aísla el éster de S-2-hidroxiácido quiral formado.

Deshidrogenasas adecuadas son por ejemplo alcohol deshidrogenasas de Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir o Lactobacillus brevis, necesitando estas enzimas NADPH como coenzima (documentos DE 19 610 984, EP 0 456 107, WO 97/32012).

Cosustratos adecuados para la alcohol deshidrogenasa utilizada son alcoholes tales como etanol, 2-propanol 55 (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol o 2-octanol.

Además la reducción de NADP puede realizarse también con las enzimas conocidas usadas para la regeneración de NADPH, por ejemplo con glucosa deshidrogenasa o formiato deshidrogenasa dependiente de NADPH (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). 60

El cosustrato adecuado para el procedimiento según la invención es, en caso de usar glucosa deshidrogenasa, glucosa. Cosustratos adecuados de la formiato deshidrogenasa son por ejemplo sales del ácido fórmico tales como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.

Preferiblemente se utiliza la alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus minor (documento DE 101 19274). La alcohol deshidrogenasa puede utilizarse en el procedimiento según la invención o bien completamente purificada o bien parcialmente purificada o pueden usarse células completas, que contienen la alcohol deshidrogenasa. Las células utilizadas pueden estar presentes a este respecto de manera nativa, permeabilizada o lisada. Por cada kg de compuesto de fórmula I que ha de transformarse se utilizan de 10.000 U a 200.000 U de alcohol deshidrogenasa, de 5 manera preferible aproximadamente de 25.000 U a 100.000 U. La unidad enzimática 1 U corresponde a este respecto a la cantidad de enzima necesaria para transformar 1 mol del cosustrato (por ejemplo 2-propanol) por cada minuto (min.).

Al agua se le añade preferiblemente un tampón, por ejemplo tampón fosfato de potasio, tampón Tris/HCl o tampón trietanolamina con un valor de pH de desde 5 hasta 10, preferiblemente un valor de pH de desde 6 hasta 9. La 10 concentración de tampón asciende a desde 10 mM hasta 150 mM, preferiblemente desde 90 mM hasta 110 mM, especialmente 100 mM. El tampón puede contener adicionalmente además iones para la estabilización o activación de ambas enzimas, por ejemplo iones magnesio para la estabilización de la alcohol deshidrogenasa de Lactobacillus minor.

La temperatura asciende en los procedimientos según la invención por ejemplo a desde aproximadamente 10 ºC 15 hasta 60 ºC, preferiblemente desde 30 ºC hasta 55 ºC.

Según una forma de realización preferida del procedimiento se realizan las reacciones en presencia de un disolvente orgánico.

Los disolventes orgánicos preferidos son por ejemplo dietil éter, terc-butilmetil éter, diisopropil éter, dibutil éter, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano. 20

La mezcla básica de reacción consiste, en el caso de utilizar disolventes adicionales, en una fase acuosa y una fase orgánica. La fase orgánica está formada por un disolvente adecuado en el que está disuelto el sustrato o por el propio sustrato insoluble en agua. La fase orgánica asciende a este respecto a desde aproximadamente el 5% hasta el 80% del volumen de reacción total, preferiblemente desde el 10% hasta el 40%.

El agua forma en el sistema de dos fases según la invención una primera fase líquida y el disolvente orgánico, forma 25 la segunda fase líquida. Dado el caso puede estar presente además una fase líquida adicional o sólida, que se genera por ejemplo por alcohol deshidrogenasa y/o oxidorreductasa no disuelta completamente o por el compuesto de fórmula I. Sin embargo, se prefieren dos fases líquidas sin fase sólida. Las dos fases líquidas se mezclan preferiblemente de manera mecánica, para que se generen grandes superficies entre las dos fases líquidas.

La concentración del cofactor NADPH con respecto a la fase acuosa asciende a desde 0,001 mM hasta 0,1 mM, 30 especialmente desde 0,005 mM hasta 0,02 mM.

Preferiblemente en el procedimiento según la invención se utiliza además un estabilizador adicional de la alcohol deshidrogenasa. Estabilizadores adecuados son por ejemplo glicerina, sorbitol o dimetilsulfóxido (DMSO).

Los compuestos de fórmula I se utilizan en el procedimiento según la invención en una cantidad de desde el 10% hasta el 60% con respecto al volumen total, preferiblemente desde el 15% hasta el 50%, especialmente desde el 35 20% hasta el 40%.

La cantidad del cosustrato para la regeneración de NADP para dar NADPH tal como isopropanol asciende a desde aproximadamente el 5% hasta el 50% con respecto al volumen total, preferiblemente desde el 10% hasta el 30%, especialmente desde el 15% hasta el 25%.

El procedimiento según la invención se realiza por ejemplo en un recipiente de reacción cerrado de vidrio o metal. 40 Para ello se pasan los componentes individualmente al recipiente de reacción y se agitan bajo una atmósfera de por ejemplo nitrógeno o aire. Según el sustrato y el compuesto de fórmula I utilizado el tiempo de reacción asciende a desde 1 hora hasta 48 horas, especialmente desde 2 horas hasta 24 horas.

A continuación se prepara la mezcla de reacción. Para ello se separa la fase acuosa, se filtra la fase orgánica. La fase acuosa puede extraerse dado el caso una vez más y tal como la fase orgánica seguir preparándose. Después 45 se elimina mediante evaporación dado el caso el disolvente de la fase orgánica transparente. Se obtiene así por ejemplo el producto S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo con una pureza enantiomérica de más del 94% y que está esencialmente libre del reactivo 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo. El rendimiento global del procedimiento asciende, tras la destilación del producto, a desde el 50% hasta el 95% con respecto a la cantidad de reactivo utilizada.

La invención se explica mediante los siguientes ejemplos: 50

Ejemplo 1 Examen de oxidorreductasas para la reducción de ésteres de 2-oxoácido en cepas del género Lactobacillus

Para el examen se cultivaron diferentes cepas del género Lactobacillus en el siguiente medio (datos en cada caso en g/l): glucosa (20), extracto de levadura (5), extracto de carne (10), hidrogenocitrato de diamonio (2), acetato de 55 sodio (5), sulfato de magnesio (0,2), sulfato de manganeso (0,05), hidrogenofosfato de dipotasio (2). Se esterilizó el medio a 121 ºC y se cultivaron las cepas del género Lactobacillus (en lo sucesivo abreviado como L.) sin regulación del pH adicional o alimentación de oxígeno.

A continuación se resuspendieron 125 mg de células con 800 l de tampón de disgregación (trietanolamina (TEA) 100 mM, pH 7,0), se mezclaron con 1 g de perlas de vidrio y se disgregaron durante 10 min. a 4 ºC en el molino de 60 bolas (Retsch). El sobrenadante obtenido tras 2 minutos (min.) de centrifugación a 12000 revoluciones por minuto (rpm) se utilizó en el examen de actividad y para determinar el exceso enantiomérico. Como sustratos se utilizaron 2-oxopentanoato de etilo y 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo.

Mezcla básica para el examen de actividad:

860 l

de KH2PO4/K2PO4 0,1 M pH = 7,0 MgCl2 1 mM

20 l

de NADPH/NADH (10 mM)

20 l

de lisado

100 l

de sustrato (100 mM)

Se observó la reacción 1 min. a 340 nm.

Mezcla básica para la determinación del valor de ee 5

20 l

de lisado

100 l

de NADH/NADPH (50 mM)

60 l

de sustrato (2-oxo-4-fenilbutirato de etilo 100 mM)

Se extrajeron con cloroformo las mezclas básicas para la determinación del ee tras 24 horas (h) y se analizó por medio de CG el exceso enantiomérico.

El exceso enantiomérico se calcula tal como sigue:

ee(%) = ((R-alcohol – S-alcohol)/(R-alcohol + S-alcohol)) x 100. 10

Tabla 1.

N.º DSMZ

Nombre Actividad de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en U/g de células del organismo huésped Actividad de 2-oxopentanoato de etilo en U/g de células del organismo huésped

NADH NADPH Valor ee NADH NADPH

20011

L. casei 0 0 --- 0 0

20019

L. curvatus var. Curvatus 0 0 --- 0 0

20184

L. farciminis 0 0 --- 0 0

20243

L. gasseri 0 0 --- 0 0

20249

L. alimentarius 0 0 --- 0 0

20494

L. sakei 0 0 --- 0 0

20555

L. salivarius var. Salivarius 0 0 --- 0 0

20557

L. jensenii 0 0 --- 0

20074

L. delbrueckii var. Delbrueckii 0 0 --- 0 0

20001

L. coryniformis var. Caryniformis 0 0 --- 0 0

20190

L. halotolerans 0 0 --- 0 0

20016

L. reuteri 0 12,3 94% de S 0 21,1

20003

L. bifermentans 0 0 --- 0 0

L. kefiri 0 2,5 26% de S 0 7,7

4864

L. oris 0 0 --- 0 0

20515

L. collinoides 2,6 3,4 26% de R 2,5 7,7

20014

L. minor 0 0 --- 0 0

20593

L. kandleri 3,6 3,6 32% de S 4,3 12,8

5705

L. parabuchneri 0 5,1 38% de S 0 11,3

20349

L. fructosas 0 0 --- 0 0

20055

L.cellobiosus 0 12,3 92% de S 0 13,3

20015

L. reuteri 0 12 96,6% de S 0 26

20049

L.fermentum 0 7,7 82% de S 0 6,8

20052

L.fermentum 0 0 --- 0 0

DSMZ representa la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig. 15

A partir de la tabla 1 se deduce que en el género Lactobacillus varias especies presentan una oxidorreductasa dependiente de NADPH con 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo o 2-oxopentanoato de etilo como sustrato.

Definición de las unidades enzimáticas: 1 U corresponde a la cantidad de enzima necesaria para transformar 1 mol de sustrato por min.

20

Ejemplo 2: Aislamiento de una oxidorreductasa dependiente de NADPH de Lactobacillus reuteri

Para aislar una oxidorreductasa dependiente de NADPH de Lactobacillus reuteri se cultivó el organismo tal como se describió en el ejemplo 1. Tras alcanzar la fase estacionaria se recogieron las células y se separaron del medio por

medio de centrifugación. La liberación de la enzima tuvo lugar mediante molienda en húmedo por medio de perlas de vidrio, pero también podría haberse conseguido con otros métodos de disgregación. Para ello se suspendieron 20 g de L. reuteri con 80 ml de tampón de disgregación (trietanolamina 100 mM, MgCl2 1 mM pH =7,0) y tras la adición de 80 ml de perlas de vidrio tuvo lugar la disgregación celular por medio del molino de bolas (Retsch, 10 min., 24 Hz). 5

Se ajustó entonces el producto bruto obtenido tras la centrifugación mediante la adición de 242 mg de (NH4)2SO4 a una concentración final de sulfato de amonio al 50% y se agitó durante 1 h a 4 ºC. A continuación se eliminó el sedimento por centrifugación a 12000 rpm durante 10 min. y se siguió purificando el sobrenadante obtenido por medio de FPLC. Se purificó la enzima con cromatografía de interacción hidrófoba en Butylsepharose Fast Flow (Pharmacia) y a continuación con permeación en gel (Superdex 200 HR, Pharmacia). Para ello se aplicó el 10 sobrenadamente tras la precipitación del sulfato de amonio directamente sobre una columna de Butylsepharose FF equilibrada con TEA 100 mM pH = 7,0 y (NH4)2SO4 1 M y se eluyó con un gradiente de sal lineal decreciente. A este respecto se eluyó la enzima con (NH4)2SO4 0 M. Se purificaron las fracciones activas y se concentraron por medio de ultrafiltración (límite de exclusión 10 kDa) hasta un volumen adecuado. Se determina la actividad enzimática de la oxidorreductasa en el sistema de prueba según el ejemplo 1, (mezcla básica para el examen de actividad) y la 15 determinación de la cantidad de proteína tuvo lugar según Lowry et al. Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265-275 o Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201-220). El cociente de actividad enzimática entre cantidad de proteína da como resultado la actividad específica, correspondiendo la transformación de 1 mol por min. a 1 unidad (U).

A continuación se purificó adicionalmente la preparación de enzima bruta por medio de permeación en gel (TEA 100 20 mM pH = 7,0, NaCl 0,15 M, MgCl2 1 mM) y simultáneamente se determinó el peso molecular de la enzima nativa. Se usaron como patrones de peso molecular catalasa (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina (69,8kDa) y ovoalbúmina (49,4 kDa).

Tabla de purificación 25

Tabla 2

Etapa de purificación

Volumen [ml] Actividad [U/ml] Actividad total [U] Actividad específica [U/mg] Rendimiento

Extracto bruto

20 9,3 186 0,25 100%

Precipitación de (NH4)2SO4

20 5,4 109 0,83 57%

Butylsepharose

1 20 20 54 10%

Permeación en gel

0,1 20 2 120 1,1%

El peso molecular determinado por medio de permeación en gel de la proteína en estado nativo asciende a 60 ± 5 kDa.

30

Ejemplo 3: Determinación de la secuencia N-terminal y determinación de un péptido interno tras digestión en gel

Se separó la preparación enzimática tras la permeación en gel en gel de dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS) y se pasó a una membrana de polivinilideno difluoruro (membrana de PVDF).

Se sometió la banda llamativa a aproximadamente de 30 a 35 kDa a una secuenciación N-terminal por medio de 35 Edman-Abbau (Procise 492 (PE-Biosystems)). Se obtuvo la siguiente secuencia N-terminal:

SEQ ID NO: 1

M K N I M I A G A G V L G S Q

40

Se redujo la banda de SDS-PAGE de la misma proteína con ditiotreitol, se sometió a carboximetilación y se digirió con endoproteinasa Lys-C. Se separaron los péptidos obtenidos a través de una columna de HPLC capilar de 300 m x 150 mm (Vydac RP18, LC Packings). Se recogieron manualmente 25 fracciones y se comprobaron por medio de MALDI EM (Voyager-DE STR (PE-Biosystems) para determinar la secuenciación de péptidos adecuados. Se secuenció la fracción 12 con MH+ = 1491,8 por medio de Edman-Abbau automático y proporcionó la siguiente 45 secuencia:

SEQ ID NO: 2

S D Y E R D L H L T D K

50

Ejemplo 4: Clonación de la enzima

4.1 Clonación de un fragmento génico específico de L. reuteri con ayuda de PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

Se extrajo el ADN cromosómico de las células de Lactobacillus reuteri según el método descrito en “Molecular cloning” de Manniatis y Sambrook. El ADN genómico resultante sirvió como matriz para la reacción en cadena de la 55 polimerasa directa (PCR) con cebadores degenerados. A este respecto se derivaron los cebadores en 5’ degenerados de la secuencia de aminoácidos N-terminal (SEQ ID NO: 1) y los cebadores en 3’ de la secuencia de

aminoácidos de un péptido interno (SEQ ID NO: 2) incluyendo el código genético universal (SEQ ID NO: 3, 4, 5 y 6). A continuación se enumeran constructos de cebadores

N = A, T, C o G; Y = T o C; R = A o G

5

Se produjeron los cebadores según procedimientos conocidos.

5’-Oligo 3:

ATGAARAAYATYATGATYGCHGGCGC

5’-Oligo 4: 10

ATGAARAAYATYATGATYGCHGGTGC

3’-Oligo 5:

RTGHARATCMCGTTCRTAATC

3’-Oligo 6:

RTGHARATCMCGTTCRTAGTC 15

Se realizó la amplificación en tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCI 50 mM, MgCl2 2,5 mM, mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) 1 mM, 30 pmol por cada cebador y 2,5 U de AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Tras una activación de la polimerasa AmpliTaq Gold (10 min., 94 ºC) y 35 ciclos siguientes de PCR (94 ºC, 60 s; 53 ºC, 45 s; 72 ºC, 60 s) se enfrió la reacción hasta 4ºC y se aplicó toda la mezcla básica de PCR sobre un 20 gel de agarosa al 1% para su análisis.

4.2 Subclonación del producto de amplificación de PCR

Se ligó un fragmento específico identificado de 200 pb del gen (S)-ADH de L. reuteri tras la purificación en gel (kit de extracción de agarosa Qiaex) en el vector de clonación TA pCR 2.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Tras la 25 transformación de 2 l de la mezcla básica de ligación en células Top 10F’ de E. coli se examinaron los ADN de las colonias generadas para determinar la presencia del plásmido pCR2.1 con fragmento de PCR de 200 pb integrado. Para ello se realizó un análisis de restricción con endonucleasa Eco RI. A continuación se secuenciaron clones positivos con los siguientes cebadores:

30

M13 rev: 5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’ y

M13 uni: 5’ TGTAAAACGACGGCCAGT 3’

con ayuda del secuenciador de ADN ABI.

El análisis de secuencias del fragmento génico de 159 pb de longitud (SEQ ID NO: 7) mostró un marco de lectura 35 abierto de 53 aminoácidos, en el que podían encontrarse de nuevo también los dos fragmentos de secuencia del extremo N-terminal y del péptido interno.

4.3 Clonación del segmento génico de longitud completa que codifica para (S)-ADH de L. reuteri

Basándose en la secuencia de nucleótidos del fragmento génico de 159 pb de longitud del ejemplo 4.2. se 40 construyeron pares de cebadores específicos para una reacción en cadena de la polimerasa inversa (iPCR) con la PCR anidada siguiente (SEQ ID NO: 8, 9, 10 y 11). A este respecto los cebadores 8 y 9 son complementarios al extremo 3’ del fragmento génico hallado, y los cebadores 10 y 11 son complementarios a la región en la proximidad del extremo 5’.

45

Oligo 8:

ATCCGGCTTTAATGTCAGCGT

Oligo 9:

CGACGGATTAAGGCGCTGAAAAG

Oligo 10: 50

CTACCTAATACGCCAGCACCAG

Oligo 11:

GCCAGCACCAGCAATCAT

Se digirió el ADN cromosómico de células de L. reuteri con endonucleasa Eco RI y se utilizó la religación con ligasa 55 de T4. Los fragmentos de ADN cromosómico circulares resultantes sirvieron como matriz para la iPCR. Se realizaron ciclos de amplificación posteriores de una reacción en cadena de la polimerasa en un tampón de PCR (véase el ejemplo 2), MgCl2 1 mM, con en cada caso 30 pmol de los cebadores 8 y 10, 25 ng del producto de religación como molde y 2,5 U de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Applied Biosystems):

60

Ciclo 1:

94 ºC, 10 min.

Ciclo 2 x 30:

94 ºC, 1 min.

57 ºC, 45 s

72 ºC, 1 min.

Ciclo 3:

72 ºC, 7 min.

4 ºC, ∞

A continuación se intensificó la señal de PCR mediante una PCR anidada. La concentración de MgCl2 óptima se encontraba en esta reacción a 2 mM y 2 l de la primera iPCR como molde. Mediante una PCR de gradiente se determinó el óptimo de temperatura para el par de cebadores 9 y 11 a 57 ºC. Eran necesarios ciclos de amplificación posteriores con ADN polimerasa AmpliTaq Gold, para poder detectar un producto de PCR específico de 1200 pb de 5 longitud:

Ciclo 1:

95 ºC, 10 min.

Ciclo 2 x 40:

95 ºC, 45 s

57 ºC, 1 min.

72 ºC, 90 s

Ciclo 3:

72 ºC, 7 min.

4 ºC, ∞

Se purificó la banda específica con una longitud de 1200 pb a través de un gel de agarosa al 1% por medio del kit de extracción de gel Qiaex (Qiagen, Hilden, Alemania) y se utilizó en una reacción de ligación con el vector de 10 clonación TA-PCR pCR2.1 (Invitrogen).

Tras la transformación de 2 l de la mezcla básica de ligación en células Top 10F’ de E. coli se examinaron los ADN de plásmido de las colonias resistentes a ampicilina generadas para determinar la presencia del plásmido pCR2.1 con fragmento de PCR de 1200 pb integrado. Para ello se realizó un análisis de restricción con endonucleasa Eco RI. A continuación se secuenciaron clones positivos con los cebadores M13 rev y M13 uni tal como se describió en 15 el punto 4.2.

El análisis de secuencias del fragmento de ADN de 1241 pb de longitud (SEQ ID NO: 12) mostró en la zona 5’-terminal un marco de lectura abierto de 148 aminoácidos. La secuencia de los primeros 15 aminoácidos N-terminales coincidía con la secuencia de aminoácidos C-terminal SEQ ID NO: 7 del punto 4.2. El análisis de la secuencia C-terminal del fragmento de ADN de 1241 pb de longitud mostró segmentos de ADN reguladores 20 intercalados en el extremo N-terminal del gen (S)-ADH de L. reuteri.

Basándose en la secuencia del fragmento de ADN de 1241 pb de longitud, cuya zona N-terminal (447 pb) representa una sección génica adicional de la oxidorreductasa de L. reuteri, se construyeron cebadores específicos para una reacción en cadena de la polimerasa inversa adicional (iPCR) con PCR anidada posterior (SEQ ID NO: 13 y 14). Los cebadores 13 y 14 son complementarios a la prolongación en 3’ del fragmento génico hallado. 25

Oligo 13:

CCAGAGGTGATTGAAGAAGCTAC

Oligo 14:

CCGGGAAATAAAGATGGTT 30

Se digirió el ADN cromosómico de células de L. reuteri con endonucleasa Afl III y se utilizó para la religación con ligasa de T4. Los fragmentos de ADN cromosómico circulares resultantes sirvieron como matriz para la iPCR. Se realizaron ciclos de amplificación posteriores de una reacción en cadena de la polimerasa en un tampón de PCR (véase el ejemplo 4.1), MgCl2 1 mM, con en cada caso 30 pmol de los cebadores 7a/9a, 25 ng del producto de 35 religación como molde y 2,5 U de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Applied Biosystems):

Ciclo 1:

94 ºC, 10 min.

Ciclo 2 x 30:

95 ºC, 1 min.

56 ºC, 45 s

72 ºC, 1:45 min.

Ciclo 3:

72 ºC, 7 min.

4 ºC, ∞

A continuación se intensificó la señal de PCR mediante una PCR anidada. La concentración de MgCl2 óptima se encontraba en esta reacción a 2 mM y se usaron 2 l de la primera iPCR como molde para la PCR anidada. Eran 40 necesarios ciclos de amplificación posteriores con ADN polimerasa AmpliTaq Gold, para poder detectar un producto de PCR específico de 950 pb de longitud:

Ciclo 1:

94 ºC, 10 min.

Ciclo 2 x 40:

94 ºC, 45 s

56 ºC, 1 min.

72 ºC, 1:45 min.

Ciclo 3:

72 ºC, 7 min.

4 ºC, ∞

Se purificó una banda específica con una longitud de 950 pb a través de un gel de agarosa al 1% por medio del kit de extracción de gel Qiaex (Qiagen) y se utilizó en una reacción de ligación con el vector de clonación TA-PCR pCR2.1 (Invitrogen).

Tras la transformación de 2 l de la mezcla básica de ligación en células Top 10F’ de E. coli se examinaron los ADN 5 de plásmido de las colonias resistentes a ampicilina generadas para determinar la presencia del plásmido pCR2.1 con fragmento de PCR de 950 pb integrado. Para ello se realizó un análisis de restricción con endonucleasa Eco RI. A continuación se secuenciaron clones positivos con los cebadores M13 rev y M13 uni tal como se describió en el punto 4.2.

El fragmento de ADN insertado en el vector pCR2.1 era de 822 pb de longitud y tenía en el extremo N-terminal un 10 marco de lectura abierto de 126 aminoácidos, que finalizaba con el codón de terminación y un lazo de terminación (SEQ ID NO: 15). El péptido en 5’ de 12 aminoácidos coincidía con el extremo C-terminal de la secuencia SEQ ID NO: 12. Por consiguiente el fragmento de ADN generado mediante iPCR de 822 pb obtuvo el extremo C-terminal del segmento génico que codifica para una oxidorreductasa de L. reuteri.

15

4.4 Síntesis del gen completo de una oxidorreductasa de L. reuteri por medio de PCR

Basándose en las secuencias SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 15 se construyeron cebadores específicos para una clonación posterior del gen de longitud completa en un sistema de expresión adecuado. A este respecto se modificó el cebador en 5’ con una secuencia de reconocimiento para Nde I y el cebador en 3’ con una secuencia de reconocimiento para Hind III (SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17) 20

Oligo 16:

GCGGAATTCCATATGAAGAATATCATGATTGCT

Oligo 17:

CCCAAGCTTAATGCTTCAGAAAATCTGG 25

El ADN genómico de las células de L. reuteri sirvió como matriz para la reacción en cadena de la polimerasa. Se amplificó en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0); KCI 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; en cada caso 30 pmol de cebador y 2,5 U de ADN polimerasa Platinum Pfx (Invitrogen)] con 300 ng de molde y con los siguientes ciclos de temperatura: 30

Ciclo 1:

94 ºC, 2 min.

Ciclo 2 x 30:

94 ºC, 15 s

58 ºC, 30 s

68 ºC, 75 s

Ciclo 3:

68 ºC, 7 min.

4 ºC, ∞

Se digirió el producto de PCR resultante tras la purificación a través de un gel de agarosa al 1% con Nde I y Hind III y se ligó en la estructura principal tratada con las mismas endonucleasas del vector pET21a (Novogene, Madison, EE.UU.). Tras la transformación de 2 l de la mezcla básica de ligación en células Top 10 F’ de E. coli se 35 comprobaron los ADN de plásmido de las colonias resistentes a ampicilina por medio de un análisis de restricción con endonucleasas Nde I y Hind III para determinar la exactitud de la ligación realizada. Se secuenció el constructo de expresión pET21-reut#10. El gen de oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri tiene un marco de lectura abierto de en total 882 pb (SEQ ID NO: 19) lo que corresponde a una proteína de 294 aminoácidos (SEQ ID NO: 18).

40

4.5 Producción de (S)-ADH recombinante en E. coli

Se transformaron células StarBL21 (De3) de Escherichia coli competentes (Invitrogen) con el producto de expresión que contiene el gen de la oxidorreductasa pET21-reut#10. Se cultivó la cepa en medio LB (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%) con ampicilina (50 g/ml), hasta que se alcanzó una densidad óptica medida a 500 nm de 0,5. Se indujo la expresión de la oxidorreductasa mediante la adición de isopropiltiogalactósido (IPTG) en una 45 concentración final de 1 mM. Tras 8 horas de inducción a 25ºC y 220 rpm se recogieron las células y se congelaron a -20ºC.

Para los ensayos siguientes para la caracterización bioquímica se mezclaron 100 mg de células con 600 l de tampón de disgregación y 600 l de perlas de vidrio y se disgregaron durante 10 min. por medio de un molino de bolas. Después se utilizó el lisado obtenido, diluido para las correspondientes mediciones. A este respecto el lisado 50 tenía una actividad con 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo de desde 2000 hasta 4000 U/ml.

Por tanto pudo expresarse la enzima con actividades de desde 10000 U/g hasta 30000 U/g de peso húmedo de E. coli. La enzima es por consiguiente barata y está disponible en grandes cantidades.

Ejemplo 5: Caracterización de la oxidorreductasa recombinante de L. reuteri

5.1 Óptimo de pH

Producción de los siguientes tampones de medición, todos 50 mM, y con MgCl2 1 mM con diferentes valores de pH

Tabla 3 5

Valor de pH

Sistema de tampones Valor de pH Sistema de tampones

4

Acetato de Na/ácido acético 7,5 KH2PO4/K2PO4

4,5

Acetato de Na/ácido acético 8 KH2PO4/K2PO4

5

Acetato de Na/ácido acético 8,5 KH2PO4/K2PO4

5,5

KH2PO4/K2PO4 9 Glicina/NaOH

6

KH2PO4/K2PO4 9,5 Glicina/NaOH

6,5

KH2PO4/K2PO4 10 Glicina/NaOH

7

KH2PO4/K2PO4 11 Glicina/NaOH

Dilución de la enzima según sea necesario (1:20)

Mezcla básica de medición (30 ºC):

870 l

de tampón de medición con pH variable

20 l

de NADPH 10 mM (8,6 mg/ml H2O)

10 l

de enzima diluida

2-3 min. de incubación

+ 100 l

de disolución de sustrato (2-oxo-4-fenilbutirato de etilo 100 mM)

Para determinar el óptimo de pH se determinó la reacción enzimática en el respectivo tampón expuesto en la tabla 3. 10 A este respecto pudo determinarse para la enzima según la invención un óptimo de pH de entre 6,5 y 7. En el intervalo de pH de desde 4,5 hasta 8 la enzima tiene un 80% de su actividad máxima, a valores de pH inferiores a 4,0 y superiores a 8,5 la actividad disminuye entonces rápidamente.

5.2 Estabilidad frente al pH 15

Se estudió la dependencia de la actividad de la enzima en caso de almacenamiento en tampones con diferentes valores de pH en el intervalo de pH de 4 a 11. Para ello se prepararon diferentes tampones (50 mM) en el intervalo de pH de 4 a 11 y se diluyó 1:200 en los mismos la enzima sobreexpresada en el ejemplo 4 y se incubó durante 30, 60 y 300 min. Todos los tampones contenían MgCl2 1 mM. A continuación se utilizaron de éstos 10 l en la prueba de actividad normal. El valor de partida es a este respecto el valor de medición que se obtiene directamente tras la 20 dilución de la enzima en tampón fosfato de calcio 50 mM pH = 7,0. Este valor correspondía en las condiciones predefinidas a una modificación de la extinción de 0,70 /min. y se estableció como valor del 100% y se compararon todos los valores de medición posteriores con este valor.

A este respecto se estableció que la oxidorreductasa recombinante de L. reuteri es estable en el intervalo de pH de desde 4,5 hasta 8,0 y puede incubarse durante al menos 5 h sin pérdida de actividad. En el caso de los valores de 25 pH de 4,0 y 9,0 se estableció tras 5 h una actividad residual del 50% o del 40%. Los valores de pH superiores a 9,5 conducen a una desactivación inmediata de la enzima.

5.3 Óptimo de temperatura

Para determinar la temperatura de prueba óptima se midió la actividad enzimática en el intervalo de temperatura de 30 desde 15 ºC hasta 70 ºC en la mezcla básica de medición convencional. Tal como puede observarse a partir de la tabla 5, la enzima tiene su actividad máxima a 55 ºC, a continuación la actividad disminuye rápidamente.

Tabla 4

Temperatura (ºC)

Actividad en U/ml de enzima no diluida Temperatura (ºC) Actividad en U/ml de enzima no diluida

15

385 45 2900

20

745 50 3200

25

1090 55 3800

30

1350 60 617

35

1860 65 180

40

2500 70 90

35

5.4 Estabilidad frente a la temperatura

De manera análoga a como se describió en el punto 5.2, se determinó la estabilidad frente a la temperatura para el intervalo de desde 15 ºC hasta 70 ºC. Para ello se incubó en cada caso una dilución 1:200 de la enzima purificada durante 60 min. y 180 min. a la respectiva temperatura y a continuación se midió a 30 ºC con la mezcla básica de

prueba anterior. También se recurrió en este caso como valor de partida al valor de medición, que se obtiene directamente tras la dilución de la enzima en tampón fosfato de calcio 50 mM pH = 7,0. También en este caso se estableció este valor como valor del 100%.

La enzima es a este respecto completamente estable en un intervalo de temperatura de desde 15 ºC hasta 50 ºC y no muestra tras 3 h de incubación ninguna pérdida de actividad. A 55 ºC tan sólo tras 30 min. ya no puede 5 detectarse ninguna actividad enzimática.

5.5 Espectro de sustratos/exceso enantiomérico

Se determinó el espectro de sustratos de la oxidorreductasa según la invención mediante la medición de la actividad enzimática con una serie de cetonas, oxoácidos así como sus ésteres. Para ello se usó la mezcla básica de 10 medición convencional (ejemplo 5.1) con diferentes sustratos. Se estableció la actividad con 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo como el 100% y se compararon todos los demás sustratos con la misma. La enzima no mostró ninguna actividad deshidrogenasa dependiente de NADP con respecto a (R) o (S)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo, (R) o (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato o (D) o (L)-lactato de etilo.

Para la determinación del valor de ee se realizaron para los sustratos seleccionados la siguiente mezcla básica de 15 reacción.

100 l

de NADPH (50 mM)

60 l

de sustrato (100 mM)

y de 1 a 2 unidades de oxidorreductasa.

Se extrajeron las mezclas básicas para la determinación del ee tras 24 h con cloroformo y se analizó por medio de CG el exceso enantiomérico del alcohol resultante. 20

Tabla 5.

Sustrato

Actividad relativa % Estereoselectividad Sustrato Actividad relativa % Estereoselectividad

Cetonas

Éster de 3-oxoácido

1-Fenil-2-propanona

3 nd 4-Cloroacetoacetato de etilo 16 56% de R

2-Cloro-1-(3-clorofenil)etan-1-ona

0 nd Acetoacetato de metilo 0,3 78% de S

Acetofenona

0 nd Ácido etil-8-cloro-6-oxooctanoico 190 94% de R

Caprilofenona

0 nd Ácido dimetil-3-oxo-1,8-octanodioico 42 Racemato al 50%

2-Octanona

1 Racemato al 50% 3-Oxovaleriato de etilo 1,3 nd

3-Octanona

4 nd

Acetona

0 nd

Ésteres de 2-oxoácido

2-Oxoácidos

2-Oxovaleriato de etilo

190 nd Ácido 2-oxovaleriánico 0 nd

2-Oxo-4-fenilbutirato de etilo

100 98% de S Ácido 2-oxo-3-fenilpropiónico 0,5 nd

Piruvato de etilo

2 99% de S Ácido 2-oxobutírico 0 nd

Fenilglioxilato de etilo

2

Oxidación

R-2-Hidroxi-4-fenilbutirato

0 nd 2-propanol 0 nd

S-2-Hidroxi-4-fenilbutirato

0 nd D-Lactato de etilo 0 nd

S-4-Cloro-3-hidroxibutirato

0 nd L-Lactato de etilo 0 nd

R-4-Cloro-3-

0 nd

hidroxibutirato

Tal como puede observarse a partir de la tabla 5 de la oxidorreductasa recombinante de Lactobacillus reuteri se reducen especialmente ésteres de 2-oxoácido de manera estereoselectiva para dar los correspondientes ésteres de 2-hidroxiácido. No se aceptaron como sustratos los correspondientes 2-oxoácidos, de la misma manera prácticamente no se redujeron las metilcetonas. Los ésteres de 3-oxoácido se reducen parcialmente, pero en la 5 mayoría de los casos no de manera estereoselectiva.

5.6 Estabilidad frente a disolventes

Para estudiar la estabilidad enzimática en caso de contacto con disolventes orgánicos se diluyó 1:400 la oxidorreductasa de L. reuteri con las mezclas de disolventes indicadas (en caso de disolventes orgánicos miscibles 10 con agua) y se incubó a temperatura ambiente. A continuación se utilizaron 10 l de la disolución enzimática en la mezcla básica de prueba convencional. También en este caso se estableció el valor de partida tras la dilución en el tampón (tampón fosfato de potasio 100 mM, pH = 7,0, MgCl2 1 mM) como el 100% y se compararon todos los demás valores con éste. En el caso de los disolventes orgánicos no miscibles con agua, la dilución tuvo lugar igualmente en tampón fosfato de potasio, se añadió el mismo volumen de disolvente orgánico a la mezcla básica y 15 se incubó la mezcla básica a temperatura ambiente en una termomezcladora a rpm = 170. La medición de la actividad tuvo lugar a partir de la fase acuosa.

Tabla 6.

Actividad

8 h 24 h Actividad 8 h 24 h

Tampón fosfato de potasio 100 mM pH =7 MgCl2 1 mM

72% 70% Acetato de etilo 0 0

Isopropanol al 5%

77% 77% Acetato de butilo 74% 12%

Isopropanol al 10%

86% 85% Dietil éter 32% 20%

Isopropanol al 20%

100% 100% MTBE 90% 81%

Isopropanol al 30%

0% 0 Diisopropil éter 94% 77%

EtOH al 5%

64% 65% Cloroformo 6% 0%

EtOH al 10%

68% 70% Hexano 115% 100%

EtOH al 20%

83% 80% Heptano 113% 100%

EtOH al 30%

77% 75% Ciclohexano 113% 100%

DSMO al 10%

80% 80%

DSMO al 20%

79% 80%

20

Tal como puede observarse a partir de la tabla 6 la oxidorreductasa de L. reuteri muestra una estabilidad sorprendentemente buena con respecto a disolventes orgánicos. Además la enzima, en disolventes orgánicos miscibles con agua, así como inmiscibles con agua, incluso se estabiliza en comparación con la incubación en tampón puro.

25

5.7 Determinación de Km y vmáx para NADPH y 2-oxopentanoato de etilo

Para determinar los valores de Km y vmáx de NADPH y 2-oxopentanoato de etilo se seleccionaron las siguientes mezclas básicas:

A. Variación del NADPH/concentración de sustrato constante 30

970 l

de disolución de 2-oxopentanoato de etilo en tampón fosfato de potasio pH =7,0

20 l

de NADPH (concentraciones de 200-5 M de concentración final)

10 l

de disolución enzimática (1:300)

B. Variación de la concentración de sustrato/NADPH constante

970 l

de disolución de 2-oxopentanoato de etilo en tampón fosfato de potasio pH =7,0 (concentraciones de desde 10 hasta 0,1 mM)

20 l

de NADPH (0,2 mM de concentración final)

10 l

de disolución enzimática (1:300)

Km Vmáx

NADPH

0,004 ± 0,0018 mM 3080 U/ml 18500 U/g de peso húmedo de E. coli

2-Oxopentanoato de etilo

0,18 ± 0,07 mM 3080 U/ml 18500 U/g de peso húmedo de E. coli

Como disolución enzimática se utilizó el lisado obtenido a partir de 0,1 g de células de E. coli recombinantes (600 l) diluido 1:300.

5.8 Transformaciones preparativas de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo

A. Regeneración de coenzima con alcohol deshidrogenasa secundaria de Thermoanerobium brockii 5

Para una mezcla básica preparativa se incubó una mezcla de 4 ml de tampón fosfato de potasio 100 mM, pH =7,0, 2 ml de isopropanol, 4 ml de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo, 0,064 mg de NADP, 1000 unidades de oxidorreductasa de L. reuteri y 10 mg de ADH de Thermoanerobium brockii (Fluka, aproximadamente 100 U con respecto a la oxidación de 2-propanol) durante 24 h a temperatura ambiente con mezclado permanente. Tras 24 h el sustrato 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo se había transformado completamente en 2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A este respecto se 10 formó el correspondiente S-alcohol en un 97%.

B. Regeneración de coenzima con alcohol deshidrogenasa secundaria (KRED 1004, Biocatalytics Inc, Pasadena)

Para una mezcla básica preparativa se incubó una mezcla de 4 ml de tampón fosfato de potasio 100 mM, pH =7,0, 2 15 ml de isopropanol, 4 ml de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo, 0,064 mg de NADP, 1000 unidades de oxidorreductasa de L. reuteri y 1 mg de KRED 1004 (Biocatalytics Inc, Pasadena) durante 2 h a temperatura ambiente con mezclado permanente. Tras 2 h el sustrato 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo se había transformado completamente en 2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. A este respecto se formó el correspondiente S-alcohol en un 98%.

20

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Juelich Enzyme Products GmbH

<120> Oxidorreductasa de Lactobacillus reuteri

5

<130> (TH)4061

<160> 19

<170> Patentln versión 3.1 10

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Lactobacillus reuteri 15

<400> 1

<210> 2 20

<211> 12

<212> PRT

<213> Lactobacillus reuteri

<220> 25

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(12)

<223>

<400> 2 30

<210> 3

<211> 26

<212> ADN 35

<213> artificial

<400> 3

40

<210> 4

<211> 26

<212> ADN

<213> artificial

45

<400> 4

<210> 5

<211> 21 50

<212> ADN

<213> artificial

<400> 5

55

<210> 6

<211> 21

<212> ADN

<213> artificial

5

<400> 6

<210> 7

<211> 159 10

<212> ADN

<213> Lactobacillus reuteri

<400> 7

15

<210> 8

<211> 21

<212> ADN

<213> artificial 20

<400> 8

<210> 9 25

<211> 23

<212> ADN

<213> artificial

<400> 9 30

<210> 10

<211> 22

<212> ADN 35

<213> artificial

<400> 10

40

<210> 11

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

45

<400> 11

<210> 12

<211> 1257 50

<212> ADN

<213> Lactobacillus reuteri

<400> 12

<210> 13

<211> 23 5

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 13

10

<210> 14

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial 15

<400> 14

<210> 15

<211> 822

<212> ADN

<213> Lactobacillus reuteri 5

<400> 15

10

<210> 16

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

15

<400> 16

<210> 17

<211> 28 20

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 17

25

<210> 18

<211> 294

<212> PRT

<213> Lactobacillus reuteri 30

<400> 18

<210> 19

<211> 885

<212> ADN 5

<213> Lactobacillus reuteri

<400> 19

10

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. Oxidorreductasa, que reduce ésteres de 2-oxoácido en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes ésteres de S-2-hidroxiácido, caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y una actividad específica de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. 5
3. 2. Oxidorreductasa según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.
4. 3. Oxidorreductasa según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18. 10
5. 4. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque puede obtenerse a partir de Lactobacillus (L.) reuteri, L. kefiri, L. kandleri, L. parabuchneri, L. cellobiosus o L. fermentum.
6. 5. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque presenta de 1 a 50 aminoácidos más o de 1 a 50 aminoácidos menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.
7. 6. Oxidorreductasa según la reivindicación 5, caracterizada porque presenta de 1 a 25 aminoácidos, 15 especialmente de 2 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 3 a 10 aminoácidos más o menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.
8. 7. Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces por un polímero soluble en agua. 20
9. 8. Oxidorreductasa según la reivindicación 7, caracterizada porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol.
10. 9. Proteína de fusión, caracterizada porque representa la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 y porque la oxidorreductasa está unida con un polipéptido adicional en el extremo N-terminal o carboxiterminal a través de un enlace peptídico. 25
11. 10. Anticuerpo, caracterizado porque se une específicamente a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18.
12. 11. Secuencia de ácido nucleico aislada, que codifica para la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 18.
13. 12. Secuencia de ADN aislada de una oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 9, seleccionándose la secuencia de ADN del grupo que consiste en

    a) SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria, 30

    b) una secuencia de ADN, que se hibrida con la SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria en condiciones rigurosas, y

    c) una secuencia de ADN, que debido a la degeneración del código genético codifica para una proteína, que también se codifica mediante una o varias de las secuencias de ADN según a) o b).
14. 13. Secuencia de ADN aislada, caracterizada porque presenta más de un 70% de identidad con la secuencia 35 de ADN SEQ ID NO: 19 o su hebra complementaria y codifica para una proteína, que presenta una actividad específica de más de 1 mol por mg, con respecto a la transformación de 2-oxo-4-fenilbutirato de etilo en S-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo.
15. 14. Secuencia de ADN aislada según la reivindicación 13, caracterizada porque presenta del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, preferiblemente del 99% al 99,5% de identidad con la secuencia de ADN 40 SEQ ID NO: 19.
16. 15. Vector de clonación, caracterizado porque presenta una o varias de las secuencias de ADN según las reivindicaciones 11 a 14.
17. 16. Vector de expresión, caracterizado porque presenta una o varias de las secuencias de ADN según las reivindicaciones 11 a 14 y está unido de manera adecuada con una secuencia de control de expresión. 45
18. 17. Célula huésped, que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 16.
19. 18. Procedimiento para la obtención enantioselectiva de éster de S-2-hidroxiácido, caracterizado porque se reduce un éster de 2-oxoácido en presencia de una oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 9, NADPH y agua para dar el correspondiente éster de S-2-hidroxiácido y se aísla el éster de S-2-50 hidroxiácido formado.
20. 19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque como éster de 2-oxoácido se utiliza un compuesto de fórmula I,

    R2-C(O)-C(O)-O-R1 (I)

    en la que 55

    R1 representa

    1. -alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado,
21. 2. -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,
22. 3. -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es lineal o ramificado y dado el caso contiene uno, dos, 60 tres o cuatro triples enlaces,
23. 4. -arilo (C6-C14),
24. 5. -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),
25. 6. -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o
26. 7. -cicloalquilo (C3-C7) y

    R2 representa

    1. -alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado, 5
27. 2. -alquenilo (C2-C20), en el que el alquenilo es lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,
28. 3. -alquinilo (C2-C20), en el que el alquinilo es lineal o ramificado y dado el caso contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces,
29. 4. -arilo (C6-C14), 10
30. 5. -alquil (C1-C8)-arilo (C6-C14),
31. 6. -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o
32. 7. -cicloalquilo (C3-C7),

    estando los restos mencionados anteriormente en 1. a 7. no sustituidos o de mono a trisustituidos 15 independientemente entre sí con

    a) -OH,

    b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo,

    c) -NO2,

    d) -C(O)-O-alquilo (C1-C20), en el que el alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o de mono a 20 trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

    e) -heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o está de mono a trisustituido con halógeno, hidroxilo, amino o nitro.
33. 20. Procedimiento para la obtención enantioselectiva de éster de S-2-hidroxiácido, caracterizado porque

    a) se reduce un éster de 2-oxoácido en presencia de una oxidorreductasa según una de las 25 reivindicaciones 1 a 9, NADPH y agua para dar el correspondiente éster de S-2-hidroxiácido,

    b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con una deshidrogenasa y un cosustrato simultáneamente para dar NADPH, y

    c) se aísla el éster de S-2-hidroxiácido quiral formado.
34. 21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque como éster de 2-oxoácido se utiliza un 30 compuesto de fórmula I según la reivindicación 19.
35. 22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque como deshidrogenasa se utiliza la alcohol deshidrogenasa de Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir o Lactobacillus brevis y como cosustrato se usa etanol, 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol o 2-octanol.
36. 23. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque como deshidrogenasa se utiliza la 35 glucosa deshidrogenasa y como cosustrato se utiliza glucosa o se utilizan la formiato deshidrogenasa dependiente de NADPH y como cosustrato una sal del ácido fórmico tal como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.
37. 24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque las reacciones se realizan en presencia de un disolvente orgánico. 40
38. 25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado porque como disolvente orgánico se utiliza dietil éter, terc-butilmetil éter, diisopropil éter, dibutil éter, acetato de butilo, heptano, hexano o ciclohexano.
39. 26. Procedimiento según la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque la fase orgánica asciende a del 5% al 80% del volumen de reacción total, preferiblemente del 10% al 40%.

    45