ES2359512T3 - Promotores inducibles por calor de tetrahymena y su uso. - Google Patents
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Abstract
Promotor inducible por calor de la familia de proteínas de choque térmico del ciliado Tetrahymena thermophila, según el cual el promotor tiene la secuencia de nucleótidos de ID Sec. Nº 1 o sus fragmentos eficaces como promotor.
Description
La presente invención aborda campos de la biología molecular recombinante; el tema principal son los promotores fuertes inducibles para uso en la síntesis de productos en sistemas biológicos.
Tetrahymena es un organismo unicelular eucariota ciliado perteneciente al Reino Protozoa y que tiene dos núcleos, un micronúcleo de línea germinal diploide, transcripcionalmente silencioso (MIC) y un macronúcleo somático poliploide, transcripcionalmente activo (MAC). En 1923, cuando el laureado Nobel André Lwoff logró el crecimiento de Tetrahymena en cultivo puro, se estableció la base para explotar este Alveolata como un organismo modelo. Los descubrimientos trascendentes realizados en Tetrahymena son el descubrimiento de los motores de dineína, los telómeros, la catálisis mediada por ARN, la telomerasa y la función de las histona acetiltransferasas en la regulación de la transcripción. En las últimas décadas se han desarrollado técnicas de biología molecular para alterar el genoma y el proteoma de Tetrahymena: los procedimientos de transfección de ADN varían desde la microinyección en el MAC, pasando por la electroporación en el MAC hasta el bombardeo biolístico del MIC y el MAC. Están disponibles plásmidos episomales basados en un replicón de ADNr, así como técnicas knock-out/in basadas en recombinación homóloga. Se ha realizado expresión heteróloga a nivel de proteínas de especies relacionadas y también se han silenciado proteínas endógenas por medio de una novedosa técnica ribosómica antisentido. Se ha demostrado el potencial biotecnológico de Tetrahymena en numerosas publicaciones, demostrando rápido crecimiento, alta biomasa, fermentación en equipos convencionales de bacterias/levaduras, mejoramiento de la producción, existencia de medios baratos y químicamente definidos.
Hasta ahora, se han caracterizado sólo unas pocas secuencias de ADN de promotores activos de Tetrahymena útiles para trabajar en biología molecular. Estos comprenden el más bien débil y además dependiente del ciclo celular promotor de histona1 y beta tubulina2 y también los promotores de metalotioneína inducibles por metales pesados.3,4 Las metalotioneínas; que son reguladas por incremento tras el estrés, son proteínas de unión a metales que desempeñan una función en la desintoxicación de la célula. En Tetrahymena se conocen metalotioneínas, cuyos promotores pueden ser inducidos bastante bien por la presencia de cadmio, cobre, cinc (la inducción decrece en este orden) pero apenas con otros factores de estrés como los peróxidos o el calor. Como los metales pesados son tóxicos, inhiben el crecimiento de las células y dan lugar (en concentraciones más elevadas) a la muerte celular, sería favorable un sistema diferente con un menor impacto en la salud del sistema y un inductor que pueda eliminarse sin que queden trazas. Además, debido al fuerte impacto que tienen los cationes de los metales pesados sobre el medio ambiente, la eliminación del medio contaminado consume mucho tiempo y recursos. Como el esfuerzo financiero en los procesos de bioproducción comercial debe ser mínimo, los promotores de metalotioneínas no parecen ser el sistema inducible de elección
Las proteínas de choque térmico, HSP, son proteínas de respuesta al estrés evolutivamente conservadas con múltiples funciones de protección dentro de la célula. Estas proteínas son ubicuas, se encuentran en todo los organismos eucariotas estudiados hasta la fecha y son inducibles mediante calor, estrés, así como por una diversidad de otros agentes externos. Por consiguiente, las células responden a estos inductores, tales como las temperaturas elevadas de crecimiento, sintetizando altos niveles de HSP y reduciendo de manera coordinada la tasa de síntesis de otras proteínas celulares. Las HSP se dividen en varios grupos en base al tamaño. Su aparición en Tetrahymena ha sido descrita hace más de 20 años, también.5 En Tetrahymena thermophila se han descrito cuatro proteínas pertenecientes a la familia de HSP70 (Nº de acceso AK29100) y HSP90 (Nº de acceso AAD41357) y se han caracterizado en términos de secuencias parciales de aminoácidos,6 pero aún no se han dilucidado las secuencias del promotor activo.
La regulación de las HSP en otros sistemas ha sido estudiada extensamente por varios autores y se ha demostrado que la fuerza del promotor no es la única responsable del nivel de expresión de proteínas: para HSP70 de Drosophila se sabe que también las regiones 3' no traducidas de las transcripciones del gen de hsp70 son responsables de regular el nivel de síntesis de proteína o de ARNm en la célula tanto en estado inducido como no inducido. En la región del promotor se encuentra un elemento de choque térmico HSE en posición 5' al inicio ATG de los genes de choque térmico eucariotas.7 Esta región incluye las secuencias nGAAn y nTTCn, repetidas al menos dos veces en orientación cabeza a cabeza o cola a cola. El número y la orientación de los HSE en los genes HSP difieren entre especies, pero la unión de un factor positivo de transactivación, el factor de choque térmico (HSF) a los elementos de choque térmico es aproximadamente cien veces superior que el de cualquier otro factor de transcripción de mamífero conocido a su sitio de unión respectivo, convirtiendo a estos promotores en los más fuertes conocidos hasta el momento.
Por consiguiente, los promotores de HSP de diversos organismos han sido usados en sistemas de expresión heterólogos para muchas proteínas. 8,9
Como los genomas de los organismos no sólo varían en su utilización de codones sino también en su contenido de AT, es obvio que los promotores de especies menos relacionadas no funcionarán si se intercambian entre estos sistemas. En el reino de los protistas, los genomas son muy ricos en AT y, como se señaló anteriormente, sólo algunos promotores han sido caracterizados. Se ha descubierto que los promotores muy conocidos y ampliamente utilizados de levaduras, E. coli, mamíferos y virus no funcionan en los ciliados (observación no publicada propia).
Sin embargo, la presente divulgación muestra que los promotores de la familia de proteínas de choque térmico de Tetrahymena pueden utilizarse para la expresión controlada de genes externos en niveles elevados. El promotor inducible por calor según la invención tiene la secuencia de nucleótidos de ID Sec. Nº 1, denominado también promotor HSP90, o sus fragmentos eficaces como promotor.
La presente invención también está dirigida a la utilización de los promotores inducibles por calor según la invención para la expresión de proteínas homólogas y/o heterólogas en el ciliado Tetrahymena thermophila.
Puede resultar de preferencia que el promotor inducible por calor según la invención esté integrado en un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de la proteína de interés. Este vector contiene de preferencia la secuencia terminadora de β-tubulina 2 de Tetrahymena thermophila adyacente a la posición 3' de la secuencia codificadora de la proteína de interés.
Estos promotores son inducibles sólo por calor y no necesitan la adición de sustancias químicas. La inducción del producto es múltiple. El nivel de fondo de actividad de transcripción es bajo con lo que se demuestra que son promotores ideales tanto para productos tóxicos como letales y por otra parte sirven como herramientas muy útiles para desactivaciones y activaciones condicionales. Durante la fermentación, el proceso de síntesis puede detenerse fácilmente simplemente bajando la temperatura: las células se recuperarán y la biosíntesis podrá volver a inducirse nuevamente. Esto ofrece rendimientos más altos que otros sistemas: como fermentación continua es un procedimiento bien establecido para ciliados y como el estrés térmico puede extraerse del cultivo fácilmente, el ciclo de producción puede repetirse una y otra vez. En el ejemplo que se presenta a continuación los ARNm heterólogos producidos son más estables que los ARNm de HSP endógenos: esto se consigue mediante el uso de un terminador 3' de β-tubulina 2 de T. thermophila. Por esta razón el ARNm del gen diana está todavía presente y se traduce en la fase de recuperación del cultivo. Estas propiedades de la invención dan lugar a un proceso de producción nuevo y eficiente hasta el momento no descrito.
Figura 1
La Figura 1 muestra el plásmido de expresión utilizado para verificar la biosíntesis de proteínas del gen extraño dirigida por secuencias de diferentes promotores activos. El vector consiste en una estructura central bacteriana para amplificación en E. coli (sector gris oscuro), un origen específico de T. thermophila (sector gris claro) para estabilidad del plásmido en T. thermophila, una casete de selección a base de neomicina (flecha blanca) para identificación de los ciliados transformados y un marco de lectura abierto de una proteína informadora (flecha negra) seguido por la secuencia terminadora de β-tubulina 2 de T. thermophila (sector blanco). Las secuencias del promotor putativo (sector negro) pueden clonarse en este vector por medio de cortes únicos con endonucleasas de restricción XhoI y EcoRV.
Figura 2
Transferencia Western de diferentes productos transformados de T. thermophila que muestran expresión de EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) recombinante tras la inducción.
Carril 1: control positivo, carril 2: control negativo de 1.000 células (tipo natural), carril 3: 1.000 células pPT HSP90 no inducidas, carril 4: 1.000 células pPT HSP90 inducidas durante 4 horas, carril 5: 1.000 células pPT MTT no inducidas, carril 6: 1.000 células pPT MTT inducidas durante 4 horas.
La invención se describirá a continuación con más detalle por medio de los siguientes ejemplos.
La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos del promotor HSP90 (ID Sec. Nº 1)
El siguiente ejemplo se proporciona para ilustrar las formas de realización de la presente invención pero no pretende limitar su alcance.
Cultivo y transformación de Tetrahymena
Todas las cepas utilizadas se obtuvieron de Tetrahymena thermophila y han sido descritas anteriormente en detalle. La transformación de las células de T. thermophila se realizó con modificaciones según se publicaron con anterioridad.10,11 El cultivo se llevó a cabo a 30 ºC. La expresión del gen diana se indujo por choque térmico a 41 ºC (HSP) o por adición de Cd2+ (MTT1) 20 nM.
Clonación de las regiones del promotor HSP, secuencias codificadoras y construcción del vector
La ID Sec. Nº 1 se amplificó a partir de ADN genómico de T. thermophila por medio de dos cebadores HSP90_D ATATCTCGAGAGCATGCTTTTTCATGTACTATTCC y HSP90_I ATCCATTTCTTATGATATATAATTAATTGC, las bases subrayadas corresponden a la extensión de los cebadores. El fragmento obtenido por pcr se sometió a electroforesis en gel, se purificó, se cortó por medio de XhoI y se unió en el vector pPT Cilian, dando un vector pPT HSP90 funcional de Tetrahymena, que expresa un gen que codifica EGFP bajo el control de la secuencia citada anteriormente. La región 3’ de la sdc del gen de EGFP está adyacente a la secuencia terminadora del gen de βtubulina 2 de T. thermophila (véase Figura 1). Se construyó un vector de control (pPT MTT1) utilizando el promotor MTT1 de la misma manera por medio del par de cebadores MTT1_D ATATCTCGAGGATAAGTAATATATTTAGTGCACAATGTTTGAATG y MTT1_I ATCCATTATTTTAAGTTTAGATTTATTATTTATTTTATTAG.
Detección de EGFP
Se hicieron hervir los productos transformados recogidos de T. thermophila en tampón de muestra con SDS y se sometieron a electroforesis en gel en presencia de SDS. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y la EGFP se detectó por medio de un primer anticuerpo específico seguido por un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante en combinación con Pierce SuperSignal en un raytest AIDA.
Expresión inducible, heteróloga de una proteína informadora bajo el control de HSP90 de T. thermophila
Para probar si el promotor HSP identificado es capaz de expresar genes extraños, se separaron cultivos celulares de
T. thermophila en crecimiento exponencial transfectados con pPT HSP90; la mitad se cultivó a 30 ºC, la otra mitad se sometió a choque térmico. Se indujo la expresión del gen extraño dirigida por el promotor MTT1 en células transformadas con pPT MTT1 mediante la adición de cadmio.
La Figura 2 muestra una transferencia Western de lisados celulares de estos cultivos. Sólo las células transformadas con pPT muestran bandas detectables que migran en el mismo peso molecular que el control. El control de tipo natural (carril 2) está completamente blanco. Resulta evidente una fuerte inducción de la expresión por calor (carril 4) o por cadmio (carril 6) en comparación con las células no inducidas (carriles 3 y 5). Además las células no inducidas muestran actividad basal muy baja en ambos sistemas de promotores.
De los datos que se muestran en la figura 2 se puede concluir, que la actividad del promotor de ID Sec. Nº 1 (HSP90) puede ser controlada tan rigurosamente como la actividad del promotor MTT1 ya publicada y que es comparativamente fuerte.
Por consiguiente, los promotores inducibles por calor según la invención pueden ser usados en todas las aplicaciones biotecnológicas, como las enumeradas para el promotor MTT1 en 12, y aún sigue siendo superior y favorable debido a su capacidad de inducción no tóxica.
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- REIVINDICACIONES1. Promotor inducible por calor de la familia de proteínas de choque térmico del ciliado Tetrahymena thermophila, según el cual el promotor tiene la secuencia de nucleótidos de ID Sec. Nº 1 o sus fragmentos eficaces como promotor.5 2. Uso del promotor inducible por calor de la reivindicación 1 para la expresión de proteínas heterólogas en el ciliado Tetrahymena thermophila.
- 3. Uso según la reivindicación 2, según el cual el promotor inducible por calor está integrado en un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de la proteína de interés.
- 4. Uso según la reivindicación 2 y/o 3, según el cual el vector contiene la secuencia terminadora de β-tubulina 2 de 10 Tetrahymena thermophila adyacente a la posición 3’ de la secuencia codificadora de la proteína de interés.
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