ES2359545A1 - Fructufuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa. - Google Patents
Fructufuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa. Download PDFInfo
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Abstract
Fructofuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa.La presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso de la célula, para la obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se refiere a un método para la obtención de dicho producto enzimático, al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por dicho método. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz de producir fructooligosacáridos como por ejemplo 6-kestosa y 1-kestosa.
Description
Fructofuranosidasa mejorada genéticamente para
la obtención del prebiótico 6-kestosa.
La presente invención se refiere a una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada
de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha
secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido
Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la
sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la
posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere a un vector
que comprende dicha secuencia nucleotídica, al producto de expresión
de dicha secuencia nucleotídica o a la célula que los comprende en
cualquiera de sus combinaciones. Por otra parte, la presente
invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso
del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso
de la célula, para la obtención de un producto enzimático con
actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de
expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en
Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se
refiere a un método para la obtención de un producto enzimático con
actividad fructofuranosidasa. Por último la presente invención se
refiere al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa
obtenible por dicho método así como a un método para la obtención de
oligosacáridos. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz
de producir fructooligosacáridos. Más preferiblemente, los
fructooligosacáridos tienen enlaces \beta-1,2, y
\beta-2,6 y aún más preferiblemente, son
6-kestosa y 1-kestosa.
Las moléculas prebióticas líderes en el mercado
europeo son los fructooligosacáridos (FOS) (Sangeetha et al.,
2005. Trends Food Sci. Technol. 16: 442-457).
Los FOS, resisten la digestión en la parte superior del tracto
intestinal, se metabolizan por las bacterias endógenas del colon y
estimulan su crecimiento (Rao, 1998. J. Nutr. 80:
1442S-1445S). Los efectos de estas moléculas sobre
la persona que los consume son muy variados: reducción de los
episodios de diarreas causadas por rotavirus; mejora de los síntomas
de la intolerancia a la lactosa; control del estreñimiento por
aumento de la masa fecal; aumento de la absorción de calcio, y en
consecuencia una reducción del riesgo de osteoporosis; disminución
de la capacidad mutagénica de ciertas enzimas microbianas como la
nitro-reductasa, asociadas con el cáncer de colon;
posible reducción de enfermedades relacionadas con dislipemias,
etc.
Los FOS que se comercializan actualmente
pertenecen a la serie ^{1}F, están formados por moléculas de
fructosa unidas por enlaces \beta,2-1, con una
molécula de glucosa en un extremo (Yun, 1996. Enzyme Microb.
Technol., 19: 107-117); se abrevian como GF_{n},
donde n está por lo general comprendido entre 2 y 4 unidades
de fructosa (1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa).
Hay interés industrial en la búsqueda de nuevos FOS con actividad
prebiótica mejorada. Los fructooligosacáridos de la serie ^{6}F,
consisten en moléculas de fructosa unidas por enlaces
\beta,2-6, con una molécula de glucosa en el
extremo no reductor. Generalmente se obtienen mediante hidrólisis
ácida a partir del polímero levano. Por vía sintética, se ha
descrito la formación de FOS de la serie ^{6}F como producto
minoritario en la formación de 1-kestosa a partir de
la levansacarasa de Zymomonas mobilis (M. Bekers et
al., 2002. Process Biochem., 38: 701-706).
Es conocido que el uso de una fructofuranosidasa
de la levadura Schwanniomyces occidentalis (también conocida
como Debaryomyces occidentalis) para la producción de FOS,
que produce principalmente 6-kestosa, y
1-kestosa como producto secundario (WO/2007/074187).
Utilizando como sustrato sacarosa a 600 g L^{-1} se obtuvo un
nivel de producción máximo de FOS a las 24 h de reacción, y fue de
101 g L^{-1} de los 76 g L^{-1} son 6-kestosa,
con una conversión total de sacarosa del 64%,
(Álvaro-Benito et al., 2007. J. Biotechnol.,
132(1): 75-81).
Por tanto, a pesar ser conocidos métodos de
producción de oligosacáridos prebióticos, debido a la importancia
industrial de los mismos, la mejora de su producción, mediante un
proceso eficaz y viable industrialmente, es un aspecto pendiente de
resolver en la actualidad.
La presente invención se refiere a una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica derivada
de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde dicha
secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido
Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la
sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la
posición 232. Asimismo, la presente invención se refiere a un vector
que comprende dicha secuencia nucleotídica, al producto de expresión
de dicha secuencia nucleotídica o a la célula que los comprende en
cualquiera de sus combinaciones. Por otra parte, la presente
invención se refiere al uso de dicha secuencia nucleotídica, al uso
del vector de expresión, al uso del producto de expresión o al uso
de la célula, para la obtención de un producto enzimático con
actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de
expresión. Preferiblemente el sistema heterólogo se expresa en
Saccharomyces cerevisiae. Además, la presente invención se
refiere a un método para la obtención de un producto enzimático con
actividad fructofuranosidasa. Por último la presente invención se
refiere al producto enzimático con actividad fructofuranosidasa
obtenible por dicho método así como a un método para la obtención de
oligosacáridos. Preferiblemente dicho producto enzimático es capaz
de producir fructooligosacáridos. Más preferiblemente, los
fructooligosacáridos tienen enlaces \beta-1,2, y
\beta-2,6 y aún más preferiblemente, son
6-kestosa y 1-kestosa. El producto
enzimático de la presente invención presenta una alta actividad
específica, siendo candidatos idóneos para generar
6-kestosa como principal producto de
transglicosilación.
\newpage
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la industria biotecnológica y, en particular, en el sector
agroalimentario dedicado a la obtención de oligosacáridos
prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en
productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y
alimentos para animales. También se relaciona con el campo de la
industria farmacéutica y cosmética.
En la presente invención, los productos
enzimáticos nuevos producen aproximadamente 6 veces más
6-kestosa que la proteína nativa (sin modificar) en
las mismas condiciones. Este aumento se relaciona con la
modificación de la posición 196 de la proteína nativa (cuyo código
genético no es el estándar), donde se sustituye el aminoácido Serina
por Leucina (S196L) y con la sustitución de la posición Asparragina
52 por Serina (N52S) y Prolina 232 por Valina (P232V). Es decir,
debido a la lectura del código genético del microorganismo S.
occidentalis, en la posición 196 de dicha secuencia
aminoacídica, hay una Serina. Cuando la secuencia nucleotídica que
codifica para esta secuencia aminoacídica, procedente de S.
occidentalis, se expresa en un sistema heterólogo que interpreta
el código genético estándar, se inserta una Leucina en la posición
196 en el proceso de traducción. Esta secuencia con Leucina en la
posición 196 es la que ha sido citada en el documento de patente
WO/2007/074187. En la presente invención se demuestra que dicha
secuencia con una Leu en la posición 196 es mucho más efectiva en la
producción de 6-kestosa que una secuencia que tiene
Serina en dicha posición (al igual que en la proteína nativa) cuando
son expresadas ambas en un sistema heterólogo de expresión. Además,
la sustitución del aminoácido Asparragina en la posición 52 por
Serina (N52S) y la sustitución de Prolina en la posición 232 por
Valina (P232V), en la secuencia que tiene una Leucina en la posición
196, mejora significativamente la eficacia en la producción del
prebiótico 6-kestosa.
Por tanto, un aspecto de la presente invención
se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una
secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces
occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la
sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en
la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el
aminoácido valina en la posición 232.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere a la secuencia nucleotídica según la
reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 2.
La secuencia de aminoácidos puede estar codificada por cualquier
secuencia nucleotídica cuya transcripción origine un ARN mensajero y
su posterior traducción a la secuencia de aminoácidos. Debido a que
el código genético es degenerado, un mismo aminoácido puede ser
codificado por diferentes codones (tripletes), por ello, la misma
secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas
secuencias de nucleótidos. Una realización más preferida se refiere
a la secuencia nucleotídica, donde dicha secuencia, que codifica
para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3.
La secuencia SEQ ID NO: 2 corresponde a la
secuencia SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde
dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido
Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere a la secuencia nucleotídica, donde la secuencia
aminoacídica es SEQ ID NO: 4. Según una realización más preferida de
la secuencia nucleotídica, dicha secuencia nucleotídica, que
codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO:
5.
La secuencia SEQ ID NO: 4 corresponde a la
secuencia SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces occidentalis, donde
dicha secuencia aminoacídica presenta la sustitución del aminoácido
Prolina por el aminoácido valina en la posición 232.
En adelante, para hacer referencia a cualquiera
de las secuencias nucleotídicas descritas en los párrafos
anteriores, se puede usar la expresión "secuencia nucleotídica de
la presente invención" o "secuencia nucleotídica de la
invención".
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de
la invención. En adelante, para referirse al vector de expresión, se
puede emplear la expresión "vector de la presente invención" o
"vector de la invención".
El término "vector de expresión" se refiere
a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un
determinado huésped y, como el término lo indica, puede servir de
vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido
fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de
ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención,
el vector puede comprender la secuencia nucleotídica de la invención
que, fusionadas al mismo puede replicarse en el huésped adecuado.
Los vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o
vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se
correspondan con la definición realizada de vector. Preferiblemente
el vector de expresión es capaz de expresarse en un microorganismo
tipo levadura. Más preferiblemente el vector es un vector de la
serie pYES o pYC, capaces de expresarse en la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
Otro aspecto de la presente invención es el
producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la invención,
o del vector de la invención. El término "producto de la
expresión" tal como se entiende en la presente invención hace
referencia a cualquier producto resultante de la expresión de la
secuencia de nucleótidos de la invención. Así pues, como producto
resultante de la expresión de la secuencia se entiende, por ejemplo,
el ARN que se obtiene de la transcripción de la secuencia, el ARN
procesado, la proteína resultante de la traducción del ARN
modificada postraduccionalmente o no, o posteriores modificaciones
de la secuencia nucleotídica en el interior de la célula siempre que
la secuencia resultante tenga su origen en la secuencia original
transferida o no pierda la característica funcional que la
caracteriza en la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención es una
célula que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, o el
vector de la invención o el producto de expresión de la secuencia
nucleotídica de la invención, o cualquiera de las combinaciones de
secuencia nucleotídica, vector de expresión o producto de expresión.
En adelante, para referirse a dicha célula, se puede emplear la
expresión "célula de la presente invención" o "célula de la
invención". El término "célula" tal como se entiende en la
presente invención hace referencia a una célula procariótica o
eucariótica. Así pues, el término célula comprende, al menos, una
célula diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se incluye
en esta definición un protoplasto (célula de una planta que carece
de pared celular).
La célula transformada con un vector que
comprende la secuencia nucleotídica de la invención, puede
incorporar la secuencia en alguno de los ADN de la célula; nuclear,
mitocondrial y/o cloroplástico, o permanecer como parte de un vector
que posee su propia maquinaria para autoreplicarse. La selección de
la célula que ha incorporado cualquiera de las secuencias de la
invención se lleva a cabo por medio de la adición de antibióticos al
medio de cultivo o por medio de la no adición al medio de cultivo de
algún aminoácido esencial para el metabolismo de dicha célula. En el
primer caso, la resistencia de estas células a sustancias como los
antibióticos está producida por la síntesis de moléculas codificadas
por una secuencia comprendida en la secuencia del vector. En el
segundo caso, las células transformadas con el vector de la
invención deben ser auxótrofas para un determinado aminoácido
esencial y el vector de expresión debe comprender al menos una
secuencia que codifique para dicho aminoácido.
Un aspecto más de la presente invención es el
uso de la secuencia nucleotídica de la invención, del vector de la
invención, de la célula de la invención, o del producto de expresión
de la secuencia nucleotídica de la invención, para la obtención de
un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un
sistema heterólogo de expresión.
El término "producto enzimático con actividad
fructofuranosidasa" se refiere a una enzima identificada cuya
actividad es identificada con el número EC 3.2.1.26, es decir, dicho
número ha sido asignado por la Enzyme Commission number de
acuerdo a las reacciones químicas que cataliza (IUBMB Enzyme
Nomenclature, CAS Registry Number
9001-42-7). La enzima capaz de
llevar a cabo este tipo de reacción química se denomina
Beta-fructofuranosidasa
(\beta-fructofuranosidasa) o alternativamente
invertasa o sacarasa. Dicha enzima es capaz de hidrolizar la
sacarosa en fructosa y glucosa. Esta enzima también es capaz de
catalizar reacciones fructotransferasa (transfructosidasa).
El término "sistema heterólogo de
expresión" tal como se emplea en la presente invención hace
referencia a un sistema de expresión que comprende las herramientas
necesarias para que la secuencia nucleotídica, el vector o la célula
de la invención pueda transcribirse y traducirse en una secuencia
aminoacídica, donde dicho sistema de expresión es capaz de
expresarse en una especie distinta de la especie Schwanniomyces
occidentalis o de una especie cuyo código genético sea diferente
del código genético estándar.
La expresión de la secuencia nucleotídica de la
invención mediante dicho sistema de expresión heterólogo es
importante ya que, de expresarse en un sistema capaz de expresar
dicha secuencia en el organismo Schwanniomyces occidentales,
el codón CUG que, según el código genético corresponde a Leucina,
daría lugar a una secuencia aminoacídica diferente ya que según el
código genético 12 (Alternative Yeast Nuclear Code), dicho
triplete codifica para el aminoácido Serina.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere al uso de la secuencia nucleotídica de la
invención, del vector de la invención, de la célula de la invención,
o del producto de expresión de la secuencia nucleotídica de la
invención, donde el sistema heterólogo expresa dicha secuencia
nucleotídica en al menos una célula huésped de Saccharomyces
cerevisiae.
Además, el producto enzimático de la invención o
las células de S cerevisiae, productoras de dicho producto,
pueden usarse como tal o de manera inmovilizada, acopladas física o
químicamente a un material portador.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para la obtención de un producto enzimático con
actividad fructofuranosidasa que comprende:
a) modificar la secuencia nucleotídica que
codifica para SEQ ID NO: 1 de tal forma que se obtenga una secuencia
nucleotídica que codifique para una secuencia aminoacídica que
presente la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido
Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina
por el aminoácido valina en la posición 232,
b) insertar al menos una secuencia nucleotídica
obtenida en el paso (a) en un vector de expresión capaz de expresar
dicha secuencia nucleotídica en un microorganismo que pertenece a
una especie diferente de Schwanniomyces occidentalis
(mediante dicho sistema heterólogo de expresión),
c) transformar el producto obtenido en el paso
(b) al menos en una célula de dicho microorganismo, y
d) cultivar la célula obtenida en el paso (c) en
un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las levaduras
transformadas o del sistema heterólogo seleccionado.
La transformación a la que se hace referencia en
el paso (c) del método se lleva a cabo por medio de técnicas que
forman parte del conocimiento general común, como por ejemplo,
transformación genética mediada por electroporación, mediante
acetato de litio, etc. Mediante estas técnicas se puede conseguir
introducir, de forma estable, un vector que incluye cualquiera de
las secuencias de la invención, de forma que, tras sucesivas
divisiones de la célula, la secuencia incorporada sigue
expresándose.
El medio de cultivo adecuado para el crecimiento
de las levaduras transformadas o del sistema heterólogo seleccionado
es conocido por el experto en la materia y dependerá del tipo de
levadura transformada (teniendo en cuenta también las auxotrofías)
así como del vector de expresión. En los ejemplos de la presente
invención se emplea un medio de cultivo con galactosa donde se
activa la expresión del gen introducido ya que dicha secuencia
nucleotídica se ha colocado bajo el control del promotor GAL.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere el método para la obtención de un producto
enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde además comprende
el paso e); recuperar el producto enzimático con actividad
fructofuranosidasa del medio de cultivo y/o de las células del
microorganismo. Dicho producto enzimático puede ser excretado por
las células al medio de cultivo en el que están creciendo. El
producto también puede recuperarse del interior de las células que
lo producen mediante cualquier técnica que permita la lisis de
dichas células o mediante cualquier técnica conocida en el estado de
la técnica que permita la salida de dicho producto enzimático de
las
células.
células.
El producto enzimático crudo, resultado del
anterior método de la invención, puede ser utilizado industrialmente
para la obtención de oligosacáridos sin requerir etapas de
separación o purificación posteriores. No obstante, se puede
proceder a la recuperación de dicho producto enzimático del medio de
cultivo y/o de las células, pues la enzima objeto de la invención se
libera extracelularmente de forma parcial. Así pues, en la presente
invención, el producto enzimático puede encontrarse tanto en la
suspensión de células con el medio de cultivo, como en la fracción
celular o en la fracción libre de células. Mediante métodos
convencionales, el experto en la materia escogerá el producto
enzimático de partida más apropiado a cada procedimiento industrial,
es decir, crudo o con más o menos nivel de purificación. La
recuperación del producto enzimático con actividad
fructofuranosidasa se lleva a cabo mediante técnicas que forma parte
del conocimiento general común y por tanto, están disponibles a un
experto en la materia. Por ejemplo, el aislamiento o recuperación
del producto enzimático se lleva a cabo por ejemplo, pero sin
limitarse, mediante precipitación de dicho producto con
fraccionamiento salino, precipitación por calor, precipitación
isoeléctrica, con disolventes orgánicos o con polímeros, con acetona
fría o mediante cromatografía.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere al método para la obtención de un producto
enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde la secuencia
aminoacídica del paso (a) es SEQ ID NO: 2. Otra realización más
preferida de la presente invención es el método, donde dicha
secuencia nucleotídica, que codifica para la secuencia aminoacídica
SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere al método para la obtención de un producto
enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde la secuencia
aminoacídica del paso (a) es SEQ ID NO: 4. Una realización más
preferida es el método, donde dicha secuencia nucleotídica, que
codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO:
5.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere al método para la obtención de un producto
enzimático con actividad fructofuranosidasa, donde el microorganismo
que pertenece a una especie diferente de Schwanniomyces
occidentalis del paso (b) es Saccharomyces
cerevisiae.
Según otra realización preferida del método para
la obtención de un producto enzimático con actividad
fructofuranosidasa, el cultivo de la célula según el paso (c) se
lleva a cabo a una temperatura de entre 28 y 30ºC.
En adelante, para referirse a cualquiera de los
métodos para la obtención de un producto enzimático con actividad
fructofuranosidasa, descrito en párrafos anteriores, puede usarse la
expresión "método de la presente invención" o "método de la
invención".
Otro aspecto de la presente invención es el
producto enzimático con actividad fructofuranosidasa obtenible por
el método de la invención. Según una realización preferida, el
producto enzimático tiene actividad transfructosidasa en presencia
de uno o varios sustratos glucídicos. El sustrato glucídico se
selecciona de entre sacarosa, glucosa, fructosa,
6-kestosa o 1-kestosa.
Preferiblemente el sustrato glucídico es sacarosa.
Otra realización preferida se refiere al
producto enzimático, donde los productos resultantes de la actividad
transfructosidasa son fructooligosacáridos. Una realización más
preferida se refiere al producto eznimático donde los productos
resultantes de la actividad transfructosidasa son
fructooligosacáridos con enlaces \beta-1,2, y
\beta-2,6. Según otra realización aún más
preferida, los fructooligosacáridos con enlaces
\beta-1,2, y \beta-2,6 son
6-kestosa y 1-kestosa. Además de la
actividad fructofuranosidasa, el producto enzimático de la invención
tiene actividad transfructosidasa. Los productos resultantes de la
actividad transfructosidasa son, entre otros, fructooligosacáridos
de la serie ^{6}F (en particular 6-kestosa) y muy
minoritariamente de la serie ^{1}F (en particular
1-kestosa).
\newpage
En adelante, para referirse a cualquiera de los
productos enzimáticos con actividad fructofuranosidasa obtenible por
el método de la invención, descrito en párrafos anteriores, puede
usarse la expresión "producto enzimático de la presente
invención" o "producto enzimático de la invención".
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para la obtención de oligosacáridos que comprende:
a) poner en contacto, in vitro, el
producto enzimático de la invención con al menos un sustrato
glucídico, e
b) incubar la mezcla descrita en el paso
(a).
La incubación de la mezcla del paso (b) se lleva
a cabo mediante condiciones óptimas para una enzima
fructofuranosidasa. Un ejemplo de dichas condiciones se muestra en
la tabla 5 de los ejemplos de la presente invención.
Una realización preferida se refiere al método
para la obtención de oligosacáridos, que además comprende el paso
c); recuperar los oligosacáridos obtenidos tras la incubación
descrita en el paso (b).
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Con la intención de complementar la descripción
que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor
entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con
algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter
ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:
Fig. 1. Muestra el análisis por
MALDI-TOF de la Fructofuranosidasa de S.
occidentalis .
Se muestra la intensidad relativa (intensidad
[u.a; unidades de cuentas]) de los péptidos trípticos ionizados
frente a la masa/carga (m/z) de los mismos. El sobrenadante de la
digestión con tripsina se analizó en un espectrómetro de masas
MALDI-TOF modelo Autoflex de Bruker equipado con
reflector, empleando HCCA (ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico)
como matriz en condiciones de saturación.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 2. Muestra la actividad de la enzima
fructofuranosidasa extracelular valorada en S. cerevisiae
SoINV-Leu en medio de cultivo rico YPGal.
La levadura se precultivó en el medio mínimo
SC(U)D y se creció en YPGal con agitación constante a
200 rpm y 30ºC durante 28 h. Se representa el crecimiento del
cultivo en UD0660 nm (círculos) y la actividad valorada en el medio
extracelular, en U (cuadrados). La actividad se ensayó sobre
sacarosa al 5%.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3 Muestra el perfil de productos
obtenidos tras la incubación de sacarosa con la enzima purificada
(F-2) de SoINV-Ser.
Las condiciones de reacción son las indicadas en
el texto y las condiciones de análisis mediante HPLC y los nombres
de los compuestos son los mismos que en la tabla 5. El análisis
corresponde a las 6 h de reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4. Muestra el perfil de productos
obtenidos tras la incubación de sacarosa con la enzima purificada
(F-2) de SoINV-Leu.
Las condiciones de reacción son las indicadas en
el texto y las condiciones de análisis mediante HPLC y los nombres
de los compuestos son los mismos que en la tabla 5. El análisis
corresponde a las 72 h de reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 5. Muestra la comparación del % total de
FOS producido a lo largo de 75 h de reacción por la
fructofuranosidasa de S. occidentalis .
Fructofuranosidasa expresada en el organismo
donante (triángulos), la fructofuranosidasa expresada en S.
cerevisiae, SoINV-Ser (cuadrados) y
SoINV-Leu (rombos).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 6. Muestra el máximo nivel de producción
de los FOS (6-kestosa y 1-kestosa)
obtenido por la SoINV de S. occidentalis (SoI) y la expresada
en S. cerevisiae que incluye Serina (196S) o Leucina (196L)
en la posición 196 de la proteína nativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 7. Muestra el máximo nivel de producción
de los FOS (6-kestosa y 1-kestosa)
obtenido por diferentes secuencias que codifican para diferentes
fructofuranosidas.
En la figura se representa SoINV de S.
occidentalis (SoI) y la expresada en S. cerevisiae que
incluye Serina (196S), o Leucina (196L) en la posición 196 y de esta
última que incluye, además, Serina en la posición 52 en lugar de
Asparragina (196L N52S) o Valina en la posición 232 en lugar de
Prolina (196L P232V).
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante,
realizados por los inventores que describen la modificación de la
secuencia amininoacídica original (SEQ ID NO: 1) y expresión de las
fructofuranosidasas modificadas de S. occidentalis en un
sistema heterólogo así como su uso para la producción de FOS.
La Fructofuranosidasa con actividad
fructosiltransferasa de S. occidentalis se se purificó a
partir del medio extracelular de esta levadura tal y como se
describió anteriormente (Álvaro-Benito et
al., 2007. J. Biotechnol., 132(1):
75-81). La proteína purificada se digirió con
tripsina y analizó por espectrometría de masas
MALDI-TOF en el Servicio de Proteómica del Centro de
Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC). El
resultado del análisis se muestra en la Fig 1. El análisis de los
péptidos trípticos fue compatible con la secuencia del gen
codificante descrito en el documento de patente WO/2007/074187 salvo
en lo referente al fragmento de 2005.023 m/z, marcado con una flecha
en la Fig 1. La secuencia aminoacídica de dicho fragmento tríptico
marcado con una flecha en la figura 1, fue determinada por
espectrometría seguida de electrospray-trampa iónica
y se corresponde una secuencia donde en la posición 196 de la
proteína nativa hay una Serina en lugar de una Leucina tal y como
correspondería con la lectura estándar del código genético, y con la
secuencia citada en dicho documento de patente WO/2007/074187. Es
decir, debido a la lectura del código genético del microorganismo
S. occidentalis, en la posición 196 de dicha secuencia
aminoacídica, hay una Serina. Cuando la secuencia nucleotídica que
codifica para esta secuencia aminoacídica, procedente de S.
occidentalis, se expresa en un sistema heterólogo que interpreta
el código genético estándar, se inserta una Leucina en la posición
196 en el proceso de traducción.
La Serina que ocupa la posición 196 no parece
formar parte, a priori, de los motivos estructurales
implicados en la reacción catalizada por la enzima de S.
occidentalis. De hecho, esta posición está ocupada por el
aminoácido Glutámico en otras fructosiltransferasas, como en la
levansucrasa de Bacillus subtilis (Meng y Fütterer, 2003. Nat
Struct Biol., 10(11): 935-41) o la de
Gluconoazetobacter diazotrophicus (C.
Martínez-Fleites et al., 2005. Biochem J.,
15: 19-27).
Se amplificó el gen codificante (1.6 kb) de la
actividad fructofuranosidasa de S. occidentalis ATCC26077,
utilizando la técnica estándar de PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa), ADN genómico de la levadura y oligonucleótidos
dirigidos hacia la secuencia de los extremos de la fase de lectura
abierta (ORF) del gen, ya depositada en las bases de datos
(secuencia de acceso número X17604). Se obtuvo la secuencia SEQ ID
NO: 1, descrita en el documento de patente WO/2007/074187. En la
amplificación se utilizaron los oligonucleótidos descritos en la
Tabla 1.
En negrita se muestra la secuencia de corte de
la enzima de restricción BamHI y XbaI utilizada para
el posterior clonaje del fragmento amplificado. Las secuencias se
muestran de 5' a 3'.
El producto amplificado se insertó en el
plásmido pstBlue1 (pstBlue1; Perfectly cloning vector;
Novagen) y su integridad se comprobó por secuenciación utilizando
oligonucleótidos dirigidos hacia la secuencia de la
Fructofuranosidasa utilizando la metodología estándar (Servicio de
secuenciación del SIDI, UAM). A tenor de que en la posición 196 de
la proteína nativa, según se determinó por espectrometría de masas,
hay una Serina en lugar de una Leucina, se indujo en ella el cambio
del triplete CTG (596-598) por TCA
(596-598) utilizando PCR y los oligonucleótidos 196S
Fw y 196S Rv que figuran en la Tabla 2.
La Serina 196 se sustituyó también por
Glutámico, realizando el cambio del triplete CTG
(596-598) por GAA (596-598); se
utilizó PCR y los oligonucleótidos 196E Fw y 196E Rv que figuran en
la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En negrita se resalta el triplete sustituido.
Las secuencias se muestran de 5' a 3'.
Además, utilizando una metodología similar a la
anteriormente descrita se sustituyeron distintos residuos
aminoacídicos de la secuencia aminoacídica de la proteína
SoINV-Leu (SEQ ID NO: 1), es decir, se sustituyeron
algunos aminoácidos de la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Se
llevaron a cabo las siguientes sustituciones:
- Asparragina por Serina de la posición 52. Para
hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término N52S.
La secuencia aminoacídica que presenta esta modificación es SEQ ID
NO: 2.
- Prolina por Valina en la posición 232. Para
hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término P232V.
La secuencia aminoacídica que presenta esta modificación es SEQ ID
NO: 4.
Para la sustitución de la posición 52 ó 232 de
la proteína SoINV-Leu196 se utilizó PCR, y como ADN
molde el gen codificante para la fructofuranosidasa de S.
occidentalis que contiene Leucina en la posición 196 incluido en
el vector pYES2.0 obtenido tal y como se describe en el apartado
correspondiente de la presente solicitud. Cada reacción incluía: 5U
(1 \mul) de High Fidelity Plus TM (Roche), 10 \mul del tampón
para esta enzima 5x, 1 \mul de dNTs 40 mM, 1 \mul del ADN
descrito, 1 \mul de cada uno de los oligonucleótidos cebadores que
se muestran en la tabla 3.
En negrita se resalta el triplete sustituido.
Las secuencias se muestran de 5' a 3'.
- Triptófano por Tirosina en la posición 47.
Para hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término
W47Y.
- Asparragina por Serina en la posición 49. Para
hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término
N49S.
- Lisina por Fenilalanina en la posición 181.
Para hacer referencia a esta sustitución se puede usar el término
K181F.
En el clonaje y amplificación de los productos
de PCR se utilizó la cepa de Escherichia coli DH5\alpha
[(F'I EndA1, hsdR17 (rk-mk-) supE44
thi-1 recA1 gyrA (Naf) relA1
\Delta(laclZYA-argF) U169 deoR
(\varphi80dlac\Delta(lacZ)M15)] que fue crecida y
transformada siguiendo la metodología estándar.
El gen codificante para la fructofuranosidasa de
S. occidentalis incluido en el vector pstBlue1, que contiene
Leucina, Serina o Glutámico en la posición 196 o que contiene
Leucina en la posición 196 más Serina, Valina, Tirosina, Serina o
Fenilalanina en las posiciones 52, 232, 47, 49 y 181,
respectivamente, se obtuvo digiriendo con BamHI y XbaI
y se fusionó al vector bifuncional (Escherichia coli,
Saccharomyces cerevisiae) pYES2.0 (Invitrogen) previamente
linearizado con estas mismas enzimas de restricción. Este plásmido
incluye como marcador bacteriano el gen que confiere resistencia a
ampicilina, el origen de replicación del plásmido de 2 \mum de
levadura, el promotor de S. cerevisiae regulable por
galactosa pGAL1 y URA3 como marcador de selección.
La construcción obtenida en E. coli,
SoINV-pYES2 Leu 196 (SoINV-Leu), Ser
196 (SoINV-Ser), o Glu 196
(SoINV-Glu) así como SoINV-Leu con
las modificaciones N52S, P232V, W47Y, N49S o K181F, se verificaron
por PCR y posterior secuenciación; se incluyeron en la cepa de S.
cerevisiae EUROSCARF YIL162w [BY4741; Mat a; his3\Delta1;
leu2\Delta0; met15\Delta0; ura3\Delta0; YIL162w::kanMX4]
(accession code Y02321) utilizando la metodología estándar de
transformación por acetato de litio. En ausencia del plásmido
recombinante, esta cepa de S. cerevisiae es incapaz de
utilizar sacarosa como fuente de carbono por la deleción del gen
YIL162w. Se seleccionaron clones URA3, que fueron verificados por
PCR utilizando oligonucleótidos dirigidos hacia el gen codificante
de la fructofuranosidasa de S. occidentalis y análisis
electroforéticos en geles de agarosa. Se comprobó la inclusión del
gen seleccionado y su funcionalidad por crecimiento positivo de los
clones seleccionados en placas de medio mínimo utilizando sacarosa
como única fuente de carbono SC(U)Suc (YNB: Yeast
Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v), sacarosa 2%, 50
\mug/ml His y Met y 100 \mug/ml Leu. Agar 3%) y Antimicina A (2
\mug/ml) como agente bloqueante de la posible utilización de los
aminoácidos como fuente de carbono.
La producción de actividad fructofuranosidasa se
analizó en cultivos de S. cerevisiae que incluían la
construcción SoINV-Leu, SoINV-Glu ó
SoINV-Ser, así como SoINV-Leu con
las modificaciones N52S, P232V, W47Y, N49S o K181F, crecidos en
medio mínimo glucosa para levaduras SC(U)D (YNB:
Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v),
glucosa 2%, 50 \mug/ml His y Met y 100 \mug/ml Leu). Los
cultivos se realizaron en matraces de vidrio incubados a una
temperatura comprendida entre 28-30ºC y una
agitación orbital constante de 100-250 rpm. Las
condiciones óptimas para el crecimiento fueron 30ºC y 200 rpm.
Estos cultivos fueron empleados para inocular
los medios utilizados para la expresión del gen bajo el control del
promotor pGAL1, inoculados en todos los casos a 0,4UDO 660 nm y
utilizando el medio mínimo de inducción SC(U)G (YNB:
Yeast Nitrogen Base w/o Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v),
galactosa 2%, 50 \mug/ml His y Met y 100 \mug/ml Leu), o el
medio rico YPGal (extracto de levadura 1%, galactosa 2%,
bactopeptona 1%).
Se fueron obteniendo muestras de los cultivos a
distintos tiempos, se centrifugaron y fueron separadas la fracción
extracelular, Sn, y la fracción celular, C, que es tratada con el
agente Yeast Buster (Novagen) siguiendo las recomendaciones del
fabricante. Se valoró la actividad fructofuranosidasa tanto en la
fracción celular (C) como en la libre de células (Sn).
Se ensayó la actividad fructofuranosidasa
valorando la liberación de glucosa sobre sacarosa al 5%. Se usó un
ensayo colorimétrico y la metodología estándar. La glucosa liberada
se cuantificó utilizando la reacción acoplada de la glucosa
oxidasa-peroxidasa: 0.4 ml de la solución a valorar
se mezcló con 0.1 ml de solución A:B (20:1) (A: 0.85 U/ml glucosa
oxidasa, 0.40 U/ml peroxidasa en tampón fosfato sódico pH 5; B:
O-Dianisidina 0.6%). Se incubó 30 minutos a 37ºC y
cuantificó espectrofotométricamente a 450 nm. Se utilizó una curva
patrón de glucosa (1 a 100 \mug/ml). La unidad de actividad
fructofuranosidasa se define en \mug glucosa valorada/ml de enzima
y min de reacción en las condiciones descritas.
La tabla 4 muestra los niveles de actividad
fructofuranosidasa asociada a la fracción celular y extracelular de
S. cerevisiae que expresa las construcciones mencionadas
anteriormente.
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\vskip1.000000\baselineskip
No se valoró actividad fructofuranosidasa en el
medio extracelular ni en la fracción asociada a células cuando se
empleó la cepa de S. cerevisiae
SoINV-Glu.
En la Fig. 2 se muestra la evolución de la
actividad fructofuranosidasa valorada en el medio de cultivo del
organismo que expresan SoINV-Leu crecido en medio
rico YPGal. En los organismos crecidos en medio mínimo
SC(U)G se observó menor actividad fructofuranosidasa
que en los crecidos en medio rico YPGal; se obtuvieron valores de
actividad que oscilaron entre el 30-40% de los
obtenidos en el medio rico tanto para la fracción celular (c) como
para la extracelular (sn). Se obtuvo aproximadamente 25 veces más
actividad extracelular con la construcción SoINV-Ser
que en la SoINV-Leu.
\vskip1.000000\baselineskip
A tenor de que en la fracción extracelular hay
siempre un menor contenido de proteínas totales que en el celular,
para la purificación de las enzimas expresadas en S.
cerevisiae se partió de 1000 ml de fracción extracelular de los
microorganismos. Se utilizó el siguiente método:
1º) Concentración de la fracción extracelular
utilizando un sistema de filtración tangencial (filtro de 30 kDa)
seguida de diálisis frente a HCl-Tris 20 mM pH 7
(tampón A) durante 2,5 horas a una temperatura de 22ºC
(Fracción-1, F-1).
\newpage
2º) Cromatografía de intercambio iónico a pH
7.0. Se aplicaron 50 ml de la muestra a una columna de 20 ml de
intercambio iónico de DEAE-Sephacel equilibrada con
tampón A. La elución se llevó a cabo utilizando un gradiente de NaCl
de 0 a 0,5 M. La fracción eluida a 0.1 M de sal presentaba la
actividad fructofuranosidasa, ésta se dializó frente a tampón A, y
concentro mediante filtros Amicon 10 kDa
(Fracción-2; F-2).
La purificación fue valorada analizando las
proteínas presentes tras cada uno de los pasos de la purificación en
geles de poliacrilamida SDS-PAGE y tinción con azul
de Coomassie.
La actividad fructofuranosidasa de la enzima
purificada se ensayó utilizando sacarosa como sustrato siguiendo el
procedimiento previamente descrito.
Se ensayó la actividad de transglicosilación de
la proteína urificada (F-2) de las cepas de S.
cerevisiae que portan la construcción SoINV-Leu
y SoINV-Ser crecidas en medio rico YPGal. Se
prepararon reacciones utilizando una alta concentración de sacarosa
(1M=342 g/l), para favorecer la formación de enlaces glicosídicos en
detrimento de la reacción de hidrólisis, y una actividad enzimática
final en la mezcla de reacción de aproximadamente 0,3 U. La Fig 3
muestra el cromatograma de la mezcla de reacción a las 6 horas
obtenido con la construcción SoINV-Ser. La enzima
presenta actividad de hidrólisis y de transferencia. Se forman
fructosa (pico 1) y glucosa (pico 2) como productos hidrolíticos, y
dos trisacáridos: uno mayoritario (pico 5), identificado como
6-kestosa
[\beta-D-Fru-(2\rightarrow6)-\beta-D-Fru-(2\rightarrow1)-\alpha-D-Glu]
y otro minoritario (pico 4), identificado como
1-kestosa
[\beta-D-Fru-(2\rightarrow1)-\beta-D-Fru-(2\rightarrow1)-\alpha-D-Glu].
La sacarosa no hidrolizada se corresponde con el pico 3.
En la tabla 5 se muestra la composición (en g/l)
de los carbohidratos presentes en la mezcla de reacción a lo largo
de 72 horas de incubación a 50ºC. La relación molar
6-kestosa/1-kestosa alcanza un valor
máximo de 6.9 a las 4 horas de reacción para
SoINV-Ser. En el punto de máxima producción de FOS
(6 horas), se obtuvieron 25,48 g/l de FOS, lo que corresponde a un
porcentaje del 8,72% de FOS respecto al total de carbohidratos en la
mezcla de reacción para una conversión de sacarosa del 47%.
Utilizando la enzima nativa expresada en S. occidentalis y
las mismas condiciones de ensayo se obtuvieron 21,55 g/l de FOS, lo
que representa un 6,21% de FOS respecto al total de carbohidratos en
la mezcla para una conversión de sacarosa del 62,9%.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima SoINV-Ser, que tiene
la misma secuencia aminoacídica que la proteína de partida,
expresada en el organismo heterólogo se comporta de una forma
bastante similar a como lo hace la enzima nativa expresada en S.
occidentalis.
Se ensayó la actividad de transglicosilación de
la enzima SoINV-Leu. Se preparó una reacción
utilizando, como anteriormenete, una concentración de sacarosa de
342 g/l y una actividad enzimática final en la mezcla de reacción de
aproximadamente 0.3 U. La Fig. 4 muestra el cromatograma de la
mezcla de reacción a las 72 horas. El perfil de los productos
generados es muy similar al obtenido con SoINV-Ser
pero la relación 6-kestosa/1-kestosa
es de aproximadamente 60 y el nivel de fructooligosacáridos
producido es mayor al obtenido previamente, ya sea utilizando la
enzima nativa expresada en S. occidentalis o en S.
cerevisiae (SoINV-Ser).
En la tabla 6 se muestra la composición (en g/l)
de los carbohidratos presentes en la mezcla de reacción a lo largo
de 120 horas de incubación a 45ºC. La relación molar
6-kestosa/1-kestosa es
aproximadamente 60 en el punto de máxima producción de FOS (72 horas
de reacción), aquí se obtuvieron 66,85 g/l de FOS, lo que
corresponde a un porcentaje del 20,57% de FOS respecto al total de
carbohidratos en la mezcla para una conversión de sacarosa del
48,2%. Transcurridas 120 horas de reacción, se siguen obteniendo
63,99 g/l de FOS. El porcentaje total (p/p) de fructooligosacáridos
fue del 19,81%, valor referido al peso total de carbohidratos en el
medio.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig 5 muestra la comparación del porcentaje
de FOS totales producidos por las distintas enzimas evaluadas en
este apartado con respecto al tiempo de reacción.
La Fig 6 muestra el nivel de FOS producido por
los organismos utilizados. La nueva enzima que contiene Leucina en
la posición 196 produce aproximadamente 2.5 veces más
6-kestosa que la proteína nativa que contiene Serina
en esta posición.
Utilizando una metodología similar a la
anteriormente descrita se sustituyeron distintos residuos
aminoacídicos de la proteína SoINV-Leu y se valoró
la actividad transferasa de las proteínas obtenidas. Las
sustituciones Asparragina por Serina de la posición 52 y Prolina por
Valina de la 232 dieron lugar a nuevas proteínas con una actividad
transferasa mejorada, se obtuvieron niveles máximos de producción de
6-kestosa unas 6 veces superiores a los obtenidos
con la proteína de partida expresada en S. occidentalis.
La tabla 7 y la Fig 7 muestran los resultados de
producción obtenidos con estas nuevas enzimas y la enzima de partida
(SoI).
En negrita se resaltan los resultados más
significativos.
Se crecieron las cepas de S. cerevisiae
que portan el gen codificante para la fructofuranosidasa
SoINV-Leu196 que incluye las sustituciones en la
posición 49 Asparragina por Serina y en la 181 Lisina por
Fenilalanina. Se utilizó medio rico YPGal y la metodología descrita
en apartados anteriores de la presente invención. La actividad
enzimática se purificó y se valoró tal como se ha descrito en otros
apartados. Se utilizó como sustrato sacarosa a 342 g/l. El ensayo se
llevó a cabo a 45ºC con agitación de 200 rpm durante 155 h. Se
recogieron fracciones a distintos tiempos de la reacción y los
productos generados se analizaron mediante HPLC tal y como se ha
descrito anteriormente. En el máximo de producción de FOS se obtuvo
26,18 g/l y 0,42 g/l de 6-kestosa y
1-kestosa para la enzima que incluye la sustitución
N49S, y 39,5 g/l y 0,77 g/l de 6-kestosa y
1-kestosa para la que porta la sustitución K181F.
Por tanto las sustituciones del residuo 47 Triptófano por Tirosina
(W47Y), del residuo 49 Asparragina por Serina (N49S) y del residuo
181 Lisina por Fenilalanina (K181F) dieron lugar a nuevas enzimas
con una actividad transferasa disminuida.
A continuación se especifican los detalles de
algunos de los métodos o procedimientos necesarios para obtener los
resultados descritos en la presente invención.
Para la producción de la enzima de S.
occidentalis se empleo un medio basado en inulina. Previamente
se creció la levadura en 50 ml de medio YPD (Extracto de levadura
1%, Peptona 2% y glucosa 2%) durante 16 horas. Se utilizaron
matraces de vidrio de 250 ml incubados a 200 rpm y 29ºC. Todo el
volumen se transfirió a 1 L de medio basado en inulina (2% peptona,
2% inulina) y se creció durante 72 horas en las mismas condiciones
descritas. Se recogieron fracciones cada 6 horas y se separaron las
células (C) del sobrenadante (Sn) por centrifugación. Se determinó
la actividad fructorfuranosidasa como se describe anteriormente. Se
obtuvo un máximo de actividad enzimática en el medio extracelular
del organismo de 15 a 20 U a las 48 horas de cultivo.
El producto liberado y valorado en el apartado
correspondiente de la presente invención fue empleado para la
producción de FOS utilizando como sustrato sacarosa a 342 g/l en
tampón Acetato sódico 100 mM pH 5,2. El ensayo se realizó a 45ºC y
una agitación de 200 rpm durante 72 h. Se recogieron fracciones a
distintos tiempos de la reacción y los productos generados se
analizaron mediante HPLC tal y como se describió anteriormente. El
máximo de producción de FOS se obtuvo a las 12 h de reacción
llegando a producirse unos 21,25 g/l; la hidrólisis de sacarosa fue
prácticamente total tras 48 h de reacción.
La cepa de S. cerevisiae
SoInv-Leu se creció en medio mínimo
SC(U)Gal (YNB: Yeast Nitrogen Base w/o
Aminoacids, DIFCO al 0.7% (p/v), galactosa 2%, 50 \mug/ml His
y Met y 100 ug/ml Leu) con agitación de 250 rpm durante 48 h. Se
alcanzó un máximo de crecimiento de 2,4 unidades a D0660 nm, que
coincide prácticamente con el máximo de actividad fructofuranosidasa
valorada en tanto en la fracción celular (0,4 U) como en la
extracelular (0,15 U).
Se valoró la actividad fructofuranosidasa
asociada a la fracción celular y extracelular de distintos clones de
S. cerevisiae SoInv-Leu crecidos en medio
rico. Los cultivos se precrecieron en medio mínimo
SC(U)D hasta saturación, posteriormente las células se
pasaron a medio rico, YPGal (1% Yeast Extract, 1% Peptona y 2%
Galactosa) hasta obtener una densidad óptica inicial de 0,4 unidades
a D0660 nm. Se analizó la actividad fructofuranosidasa de las
fracciones asociadas a las células (C) y del medio extracelular (Sn)
según se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron valores máximos de
actividad asociados a la fracción celular y extracelular
comprendidos entre 0,95-0,45 U y
0,47-0,37 U, respectivamente, para los distintos
clones analizados.
Para la sustitución de la posición 196 (al igual
que el resto de posiciones descritas en la presente invención) de la
proteína nativa se utilizó PCR, y como ADN molde el gen codificante
para la fructofuranosidasa de S. occidentalis incluido en el vector
pstBlue1 obtenido tal y como se describe en el apartado
correspondiente. Cada reacción incluía: 5U (1 \mul) de High
Fidelity Plus TM (Roche), 10 \mul del tampón para esta enzima 5 x,
1 \mul de dNTs 40 mM, 1 \mul del ADN descrito, 1 \mul de cada
uno de los oligonucleótidos cebadores y H_{2}O hasta un volumen
final de 50 \mul. Esta mezcla de reacción se incubó: a) 3 minutos
a 94ºC, b) 20 ciclos de 94ºC 1 minuto, 55ºC 30 segundos y 72ºC 7,5
minutos, y c) 1 ciclo de 72ºC 5 minutos. El producto se analizó en
gel de agarosa. El producto resultado de la amplificación se incubó
con la enzima de restricción DpnI durante 1-2
horas en la siguiente mezcla de reacción: 40 \mul del producto de
la amplificación, 4 \mu de H_{2}O y 5 \mul de solución tampon
Tango 10x junto con 1 \mul (10U) de la enzima. El resultado de la
reacción se empleó para transformar E. coli, seleccionando en
placas de LB con ampicilina y comprobando la sustitución del
triplete CTG por TCA (o del los tripletes correspondientes a las
sustituciones deseadas) por secuenciación utilizando la metodología
estándar (SIDI, UAM).
Con independencia del medio de crecimiento
utilizado, para valorar la actividad fructofuranosidasa asociada a
la fracción celular, la fracción extracelular se retiró por
centrifugación (5 min a 5000 x g) y posterior decantación. El
precipitado celular se pesó e incubó con el reactivo comercial
Yeast Buster en una proporción 1:5 (p:v) utilizando agitación
constante durante 20 minutos y 20ºC. La suspensión se centrifugó
durante 10 minutos a 5000 x g. La fracción soluble obtenida, libre
de precipitado, se utilizó directamente para la determinación de
actividad fructofuranosidasa siguiendo la metodología anteriormente
descrita.
<110> Universidad Autónoma de Madrid
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fructofuranosidasa mejorada
genéticamente para la obtención del prebiótico
6-kestosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1595.27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Schwanniomyces
occidentalis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia SEQ ID NO: 1 que presenta
la sustitución del aminoácido asparragina por el aminoácido serina
en la posición 52.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1608
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica que codifica
para SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia SEQ ID NO: 1 que presenta
la sustitución del aminoácido prolina por el aminoácido valina en la
posición 232.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1608
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica que codifica
para SEQ ID NO: 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador con la secuencia reconocida
por la enzima de restricción BamHI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador con la secuencia reconocida
por la enzima de restricción XbaI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido directo empleado en
la sustitución del triplete CTG por TCA del gen codificante para la
Fructofuranosidasa de S. occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido reverso empleado en
la sustitución del triplete CTG por TCA del gen codificante para la
Fructofuranosidasa de S. occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido directo empleado en
la sustitución del triplete CTG por GAA del gen codificante para la
Fructofuranosidasa de S. occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido reverso empleado en
la sustitución del triplete CTG por GAA del gen codificante para la
Fructofuranosidasa de S. occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido directo empleado en
la sustitución del triplete que codifica para el aminoácido de la
posición 52 por el triplete AGT que codifica para el aminoácido
serina del gen que codifica para la fructofuranosidasa de S.
occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido reverso empleado en
la sustitución del triplete que codifica para el aminoácido de la
posición 52 por el triplete AGT que codifica para el aminoácido
serina del gen que codifica para la fructofuranosidasa de S.
occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido directo empleado en
la sustitución del triplete que codifica para el aminoácido de la
posición 232 por el triplete GTC que codifica para el aminoácido
valina del gen que codifica para la fructofuranosidasa de S.
occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido reverso empleado en
la sustitución del triplete que codifica para el aminoácido de la
posición 232 por el triplete GTC que codifica para el aminoácido
valina del gen que codifica para la fructofuranosidasa de S.
occidentalis.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Secuencia nucleotídica que codifica para una
secuencia aminoacídica derivada de SEQ ID NO: 1 de Schwanniomyces
occidentalis, donde dicha secuencia aminoacídica presenta la
sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en
la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el
aminoácido valina en la posición 232.
2. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO:
2.
3. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 2, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica
para SEQ ID NO: 2, es SEQ ID NO: 3.
4. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 1, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO:
4.
5. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 4, donde dicha secuencia nucleotídica, que codifica
para SEQ ID NO: 4, es SEQ ID NO: 5.
6. Vector de expresión que comprende la
secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
7. Producto de expresión de la secuencia
nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o del
vector de expresión según la reivindicación 6.
8. Célula que comprende la secuencia
nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el
vector de expresión según la reivindicación 6, el producto de
expresión según la reivindicación 7, o cualquiera de sus
combinaciones.
9. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la obtención de un
producto enzimático con actividad fructofuranosidasa mediante un
sistema heterólogo de expresión.
10. Uso del vector de expresión según la
reivindicación 6, para la obtención de un producto enzimático con
actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de
expresión.
11. Uso de la célula según la reivindicación 7,
para la obtención de un producto enzimático con actividad
fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de expresión.
12. Uso del producto de expresión según la
reivindicación 8, para la obtención de un producto enzimático con
actividad fructofuranosidasa mediante un sistema heterólogo de
expresión.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
9 a 12, donde el sistema heterólogo expresa dicha secuencia
nucleotídica en Saccharomyces cerevisiae.
14. Método para la obtención de un producto
enzimático con actividad fructofuranosidasa que comprende:
- a)
- modificar la secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1 de tal forma que se obtenga una secuencia nucleotídica que codifique para una secuencia aminoacídica que presente la sustitución del aminoácido Asparragina por el aminoácido Serina en la posición 52 y/o la sustitución del aminoácido Prolina por el aminoácido valina en la posición 232,
- b)
- insertar al menos una secuencia nucleotídica obtenida en el paso (a) en un vector de expresión capaz de expresar dicha secuencia nucleotídica en un microorganismo que pertenece a una especie diferente de Schwanniomyces occidentalis,
- c)
- transformar el producto obtenido en el paso (b) al menos en una célula de dicho microorganismo, y
- d)
- cultivar la célula obtenida en el paso (c) en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las levaduras transformadas o del sistema heterólogo seleccionado.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Método según la reivindicación 14, donde
además comprende:
- e)
- recuperar el producto enzimático con actividad fructofuranosidasa del medio de cultivo y/o de las células del microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID
NO: 2.
\newpage
17. Método según la reivindicación 16, donde
dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 2, es SEQ
ID NO: 3.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID
NO: 4.
19. Método según la reivindicación 14, donde
dicha secuencia nucleotídica, que codifica para SEQ ID NO: 4, es SEQ
ID NO: 5.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, donde el microorganismo que pertenece a
una especie diferente de Schwanniomyces occidentalis es
Saccharomyces cerevisiae.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20, donde el cultivo de la célula según el
paso (c) se lleva a cabo a una temperatura de entre 28 y 30ºC.
22. Producto enzimático con actividad
fructofuranosidasa obtenible por el método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 21.
23. Producto enzimático según la reivindicación
22, donde dicho producto tiene actividad transfructosidasa en
presencia de uno o varios sustratos glucídicos.
24. Producto enzimático según la reivindicación
23, donde los productos resultantes de la actividad
transfructosidasa son fructooligosacáridos.
25. Producto enzimático según la reivindicación
24, donde los fructooligosacáridos tienen enlaces
\beta-1,2, y \beta-2,6.
26. Producto enzimático según la reivindicación
25, donde los productos son 6-kestosa y
1-kestosa.
27. Método para la obtención de oligosacáridos
que comprende:
- a)
- poner en contacto, in vitro, el producto enzimático según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 con al menos un sustrato glucídico, e
- b)
- incubar la mezcla descrita en el paso (a).
\vskip1.000000\baselineskip
28. Método para la obtención de oligosacáridos
según la reivindicación 27, que además comprende:
- c)
- recuperar los oligosacáridos obtenidos tras la incubación descrita en el paso (b).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930929A ES2359545B1 (es) | 2009-10-24 | 2009-10-24 | Fructufuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930929A ES2359545B1 (es) | 2009-10-24 | 2009-10-24 | Fructufuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2359545A1 true ES2359545A1 (es) | 2011-05-24 |
| ES2359545B1 ES2359545B1 (es) | 2012-04-02 |
Family
ID=43971725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200930929A Active ES2359545B1 (es) | 2009-10-24 | 2009-10-24 | Fructufuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2359545B1 (es) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007074187A1 (es) * | 2005-12-26 | 2007-07-05 | Universidad Autónoma de Madrid | Nueva actividad fructofuranosidasa para la obtención del oligosacárido prebiótico 6-kestosa |
-
2009
- 2009-10-24 ES ES200930929A patent/ES2359545B1/es active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007074187A1 (es) * | 2005-12-26 | 2007-07-05 | Universidad Autónoma de Madrid | Nueva actividad fructofuranosidasa para la obtención del oligosacárido prebiótico 6-kestosa |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALVARO-BENITO M. ET AL. Characterization of a ß-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis with transfructosylating activity yielding the prebiotic 6-kestose. 2007.Journal of Biotechnology. Vol.132 (1), páginas 75-81. * |
| KLEIN R.D. Cloning and sequence analysis of the gene encoding invertase from the yeast Schwanniomyces occidentalis.1989. Current Genetics. Vol.16, páginas 145-152. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2359545B1 (es) | 2012-04-02 |
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| FG2A | Definitive protection |
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