ES2359806T3

ES2359806T3 - Vacunas contra la tos ferina acelulares y procedimientos de preparación de las mismas.

Info

Publication number: ES2359806T3
Application number: ES03078355T
Authority: ES
Inventors: John R. Vose; Raafat E. Fahim; Gail E.D. Jackson; Larry U.L. Tan; Andrew Herbert; Leslie Boux; Luis Barreto; John Thipphawong; Michael H. Klein
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2011-05-27
Anticipated expiration: 2016-05-02
Also published as: JP2004189751A; JPH11507805A; JP2010195829A; JPH11511735A; JP3789135B2; JP4589852B2; CN1915424A; JP2006008711A; JP4980868B2; JP3977420B2; US5877298A; JP2008138003A

Abstract

Utilización de la forma purificada de toxoide de la tos ferina, hemoaglutinina filamentosa, pertactina y aglutinógenos fimbriales de B. pertussis en la elaboración de una preparación de vacuna de combinación contra la enfermedad causada por B. pertussis, para la administración a una población humana en situación de riesgo de enfermedad causada por B. pertussis para proporcionar protección contra la enfermedad causada por B. pertussis en la que cada dosis humana única de la preparación de vacuna contiene los antígenos de tos ferina siguientes, a saber de 5 a 30 μg de nitrógeno de dicho toxoide de la tos ferina, 5 a 30 μg de nitrógeno de dicha hemoaglutinina filamentosa, 3 a 15 μg de nitrógeno de pertactina, y 1 a 10 μg de nitrógeno de aglutinógenos fimbriales 2 (Agg2) y 3 (Agg3) y en la que la relación en peso de Agg2 a Agg3 es de 1,5:1 a 2:1 y en la que dicha preparación de vacuna proporciona dicha protección contra la enfermedad causada por B. pertussis en por lo menos el 70% de los miembros de una población en situación de riesgo que se puede determinar por un ensayo de eficacia clínica y en la que dicha vacuna está sustancialmente exenta de aglutinógeno 1 fimbrial.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vacunas contra la tos ferina acelulares, a sus componentes y a su preparación.

Referencia a la solicitud relacionada

La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente US nº 08/501.743 en trámite presentada el 12 de julio de 1995, que a su vez es una continuación en parte de la solicitud de patente US nº 08/433.646 en trámite presentada el 4 de mayo de 1995.

Antecedentes de la invención

La tos ferina o coqueluche es una infección grave, del aparato respiratorio superior muy contagiosa producida por Bordetella pertussis. La Organización Mundial de la salud estima que existen 60 millones de casos de tos ferina al año y 0,5 a 1 millón de muertes asociadas (ref. 1). En la presente memoria se hace referencia a varias referencias entre paréntesis para describir completamente el estado de la técnica a la que corresponde la presente invención. Toda la información bibliográfica de cada cita se encuentra al final de la memoria. En las poblaciones sin vacunar, se ha observado una incidencia de tos ferina hasta del 80% en niños menores de 5 años (ref. 2). Aunque la tos ferina se considera generalmente que es una enfermedad de la infancia, existen pruebas crecientes de enfermedad clínica y asintomática en adolescentes y adultos (refs. 3, 4 y 5).

La introducción de vacunas con células completas compuestas de cantidades eficaces de organismos de B. pertussis inactivados química y térmicamente en la década de 1940 fue responsable de una reducción drástica en el número de casos de tos ferina producida por B. pertussis. Los índices de eficacia de las vacunas de células completas se han estimado en hasta el 95% dependiendo de la definición del caso (ref. 6). Aunque la infección con

B. pertussis proporciona inmunidad de larga duración, existen pruebas crecientes de disminución de la protección después de la inmunización con vacunas de células completas (ref. 3). Varios informes que citan una relación entre la vacunación antitosferínica con células completas, la reactogenicidad y efectos secundarios graves condujeron a una disminución de la aceptación de la vacuna y epidemias renovadas consgiuientes (ref. 7). Más recientemente se han desarrollado vacunas contra la tos ferina de componente definido.

Antígenos para vacunas contra la tos ferina definidas

Se han desarrollado varias vacunas contra la tos ferina acelulares e incluyen los antígenos de Bordetella pertussis. La toxina de la tos ferina (PT), la hemoaglutinina filamentosa (HAF), la proteína de la membrana externa de 69 kDa (pertactina) y los aglutinógenos fimbriales (véase la tabla 1 a continuación. Las tablas aparecen al final de la memoria).

Toxina de la tos ferina

La toxina de la tos ferina es una exotoxina que es un miembro de la familia A/B de las toxinas bacterianas con actividad de ADP-ribosiltransferasa (ref. 8). El resto A de estas toxinas presenta la actividad de ADPribosiltransferasa y la fracción B interviene en la unión de la toxina a los receptores celulares del huésped y la traslocación de A a su punto de acción. El PT se facilita asimismo la adherencia de B. pertussis a las células epiteliales ciliadas (ref. 9) y también desempeña una función en la invasión de macrófagos por B. pertussis (ref. 10).

Todas las vacunas contra la tos ferina acelulares tienen incluido PT, lo que se ha propuesto como un factor de virulencia principal y antígeno protector (refs. 11, 12). La infección natural con B. pertussis genera respuestas a PT tanto humorales como mediadas por las células (refs. 13 a 17). Los lactantes tienen anticuerpos anti-PT obtenidos a través de la placenta (refs. 16, 18) y los anticuerpos anti-PT que contiene el calostro humano resultaban eficaces en la protección pasiva de ratones contra la infección por aerosol (ref. 19). Una respuesta inmunitaria mediada por células (IMC) a subunidades PT se ha demostrado después de la inmunización con una vacuna acelular (ref. 20) y una repuesta IMC al PT se generó después de la vacunación con células completas (ref. 13). El PT inactivado químicamente en vacunas de células completas o de componente es protector en modelos animales y en seres humanos (ref. 21). Además, los anticuerpos monoclonales específicos para la subunidad S1 protegen contra la infección por B. pertussis (refs. 22 y 23).

Los principales efectos patofisiológicos del PT son debidos a su actividad de ADP-ribosiltransferasa. El PT cataliza la transferencia de la ADP-ribosa del NAD a la proteína de unión del nucleótido guanina G1, destruyendo así el sistema celular regulador de la adenilato ciclasa (ref. 24). PT además evita la migración de macrófagos y linfocitos a zonas de inflamación e interfiere con la fagocitosis mediada por neutrófilos y la destrucción de bacterias (ref. 25). Se han utilizado numerosos ensayos in vitro e in vivo para evaluar la actividad enzimática de S1 y/o PT, incluyendo la ribosilación con ADP de la transducina bovina (ref. 26), el ensayo de agrupamiento de células del ovario de hámster chino (CHO) (ref. 27), la sensibilización con histamina (ref. 28), la leucocitosis y la NAD glucohidrolasa. Cuando se exponen al PT, las células CHO desarrollan una morfología agrupada característica. Este fenómeno depende de la unión de PT y el posterior traslado y actividad de ADP-ribosiltransferasa de S1 y de este modo el ensayo de agrupamiento de células CHO se utiliza extensamente para probar la integridad y toxicidad de las holotoxinas del PT.

Hemoaglutinina filamentosa

La hemoaglutinina filamentosa es un polipéptido largo (220 kDa) inocuo que media en el acoplamiento de B. pertussis a células ciliadas del aparato respiratorio superior durante la colonización bacteriana (refs. 9, 29). La infección natural produce anticuerpos anti-HAF e inmunidad mediada por células (refs. 13, 15, 17, 30 y 31). Los anticuerpos anti-HAF se encuentran en el calostro humano y se transmiten también a través de la placenta (refs. 17, 18 y 19). La vacunación con vacunas contra la tos ferina con células completas o acelulares genera anticuerpos anti-HAF y vacunas acelulares que contienen HAF también provocan una respuesta IMC a HAF (refs. 20, 32). HAF es un antígeno protector en un modelo de prueba de provocación respiratorio en ratón después de la inmunización activa o pasiva (refs. 33, 34). Sin embargo, HAF solo no protege en el ensayo de potencia de la prueba de provocación intracerebral en el ratón (ref. 28).

Proteína de la membrana externa de 69 kDa (Pertactina)

La proteína de 69 kDa es una proteína de la membrana externa que fue identificada originalmente en B. bronchiseptica (ref. 35). Se demostró que es un antígeno protector contra B. bronchiseptica y se identificó posteriormente tanto en B. pertussis como en B. parapertussis. La proteína de 69 kDa se une directamente a células eucarióticas (ref. 36) y la infección natural con B. pertussis provoca una respuesta humoral anti-P.69 (ref. 14) y P.69 provoca también una respuesta inmunitaria mediada por células (refs. 17, 37, 38). La vacunación con vacunas de células completas o acelulares produce anticuerpos anti-P.69 (refs. 32, 39) y las vacunas acelulares producen P.69 IMC (ref. 39). La pertactina protege contra la prueba de provocación por aerosol con B. pertussis (ref. 40) y en combinación con HAF, protege en la prueba de provocación intracerebral contra B. pertussis (ref. 41). La transferencia pasiva de anticuerpos anti-P.69 policlonales o monoclonales también protege a los ratones contra la prueba de provocación por aerosol (referencia 42).

Aglutinógenos

Los serotipos de B. pertussis están definidos por sus fimbrias aglutinantes. La OMS recomienda que las vacunas de células completas incluyan aglutinógenos (Agg) de los tipos 1, 2 y 3 ya que no son protectores cruzados (ref. 43). Agg 1 no es fimbrial y se encuentra en todas las cepas de B. pertussis mientras que Agg de los serotipos 2 y 3 son fimbriales. La infección natural o la inmunización con vacunas de células completas o acelulares producen anticuerpos anti-Agg (refs. 15, 32). Una respuesta inmunitaria específica mediada por células puede generarse en ratones por Agg 2 y Agg 3 después de la infección con aerosol (ref. 17). Agg 2 y 3 son protectoras en ratones frente la prueba de provocación respiratoria y el calostro humano que contiene anti-aglutinógenos protegerá también en este ensayo (refs. 19, 44, 45).

Vacunas acelulares

La primera vacuna acelular desarrollada fue la vacuna de dos componentes PT + HAF (JNIH 6) de Sato et al. (ref. 46). Esta vacuna se preparó por purificación conjunta de PT y antígenos HAF procedentes del sobrenadante del cultivo de la cepa Tohama de B. pertussis, seguido de formación del toxoide en formalina. Las vacunas acelulares de varios fabricantes y de varias composiciones se han utilizado con éxito desde 1981 para inmunizar niños japoneses contra la tos ferina dando como resultado una drástica disminución del número de casos de la enfermedad (ref. 47). La vacuna JNIH 6 y una vacuna monocomponente del toxoide PT (JNIH 7) se probaron en una prueba clínica prolongada en Suecia en 1986. Los resultados iniciales indicaron menor eficacia que la eficacia publicada de una vacuna de células completas, pero los estudios siguientes han demostrado ser más eficaces contra la enfermedad más leve diagnosticada por procedimientos serológicos (refs. 48, 49, 50, 51). Sin embargo, había pruebas para la reversión a la toxicidad del PT inactivado con formalina en estas vacunas. Se observó también que estas vacunas protegen contra la enfermedad con preferencia a la infección.

Actualmente se están evaluando numerosas vacunas contra la tos ferina acelulares nuevas las cuales incluyen combinaciones de PT, HAF, P.69 y/o aglutinógenos y éstas se listan en la tabla 1. Se han utilizado varias técnicas de desintoxicación química para PT incluyendo la inactivación con formalina (ref. 46), glutaraldehído (ref. 52), peróxido de hidrógeno (ref. 53) y tetranitrometano (ref. 54).

Por lo tanto, las vacunas contra la tos ferina acelulares disponibles en el comercio actuales pueden no contener formulaciones apropiadas de antígenos apropiados en formas inmunógenas apropiadas para conseguir un nivel deseado de eficacia en una población humana sensible a la tos ferina.

La ref. 67 describe una nueva vacuna antitosferínica acelular (AP) de cinco componentes que contiene 10 μg de toxoide de la tos ferina, 5 μg de hemoaglutinina filamentosa, 5 μg de aglutinógenos 2 y 3 combinados y 3 μg de pertactina que fue evaluada en adultos y niños para seguridad pero no eficacia.

Sería deseable proporcionar vacunas contra la tos ferina acelulares eficaces que contengan cantidades relativas seleccionadas de antígenos seleccionados y procedimientos de producción de las mismas.

La presente invención proporciona la utilización de la forma purificada de toxoide de la tos ferina, hemoaglutinina filamentosa, pertactina y aglutinógenos fimbriales de B. pertussis en la elaboración de una preparación de vacuna de combinación contra la enfermedad causada por B. pertussis para la administración a una población humana en situación de riesgo de enfermedad causada por B. pertussis para proporcionar protección para la enfermedad causada por B. pertussis en la que cada dosis humana individual de preparación de la vacuna contiene los siguientes antígenos de tos ferina, a saber de 5 a 30 μg de nitrógeno de dicho toxoide de la tos ferina, 5 a 30 μg de nitrógeno de dicha hemoaglutinina filamentosa, de 3 a 15 μg de nitrógeno de pertactina y de 1 a 10 μg de nitrógeno de aglutinógenos 2 (Agg2) y 3 (Agg3) fimbrial y en la que la relación en peso de Agg2 a Agg3 es de 1,5:1 a 2:1 y en el que dicha preparación de la vacuna proporciona dicha protección a la enfermedad causada por B. pertussis en al menos el 70% de los miembros de una población en situación de riesgo determinable por una prueba de eficacia clínica y en la que dicha vacuna está sustancialmente exenta de aglutinógeno fimbrial 1.

La preparación inmunógena puede comprender por lo menos otro antígeno de Bordetella. Por lo menos otro antígeno de Bordetella puede ser hemoaglutinina filamentosa, la adenilato ciclasa de la proteína de la membrana externa de 69 kDa. La oligolipopolisacarido de Bordetella, las proteínas de la membrana externa y la toxina de la tos ferina o un toxoide de la misma, incluyendo los análogos genéticamente desintoxicados de la misma.

La preparación de la vacuna anterior puede comprender por lo menos otro inmunógeno de no Bordetella. Dicho otro inmunógeno no Bordetella puede ser el toxoide diftérico, el toxoide tetátnico, polisacáridos capsulares de Haemophilus, la proteína de la membrana externa de Haemophilus, el antígeno de la superficie de la hepatitis B, poliomelitis, paperas, sarampión y/o rubéola.

Las preparaciones de la vacuna pueden comprender además un adyuvante y dicho adyuvante puede ser fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, Quil A, QS21, fosfato cálcico, fosfato cálcico, hidróxido de zinc, un análogo de glucolípido, un éster octodecílico de un aminoácido o una lipoproteína.

Se describe una vacuna que puede comprender el toxoide de la tos ferina, hemoaglutinina filamentosa, la proteína de 69 kDa y aglutinógenos filamentosos de Bordetella en una relación en peso de aproximadamente 10:5:5:3 proporcionada por aproximadamente 10 μg de toxoide de la tos ferina, aproximadamente 5 μg de hemoaglutinina filamentosa, aproximadamente 5 μg de proteína de 69 kDa y aproximadamente 3 μg de aglutinógenos fimbriales en una sola dosis humana. Se describe una vacuna que puede comprender toxoide de la tos ferina, hemoaglutinina filamentosa, proteína de 69 kDa y aglutinógenos fimbriales en una relación en peso de aproximadamente 20:20:5:3 proporcionada por aproximadamente 20 μg de toxoide de la tos ferina, aproximadamente 20 μg de hemoaglutinina filamentosa, aproximadamente 5 μg de proteína de 69 kDa y aproximadamente 3 μg de aglutinógenos fimbriales en una sola dosis humana. Se describe una vacuna que puede comprender toxoide de la tos ferina, hemoaglutinina filamentosa, proteína de 69 kDa y aglutinógenos fimbriales en una relación en peso de aproximadamente 20:10:10:6 proporcionada por aproximadamente 20 μg de toxoide de la tos ferina, aproximadamente 10 μg de hemoaglutinina filamentosa, aproximadamente 10 μg de proteína de 69 kDa y aproximadamente 6 μg de aglutinógenos fimbriales en una sola dosis humana.

La extensión de la protección a la población humana en situación de riesgo proporcionada por la preparación de la vacuna de la invención puede ser por lo menos de aproximadamente 80%, preferentemente alrededor del 85%, para un caso de tos espasmódica de duración por lo menos de 21 días e infección bacteriana confirmada por cultivo. La extensión de la protección a la población humana en situación de riesgo puede ser por lo menos de aproximadamente 70% para el caso de tos ferina leve con una tos de por lo menos un día de duración.

El componente de aglutinógenos de la preparación de vacuna comprenderá aglutinógeno 2 fimbrial (Agg 2) y aglutinógeno 3 fimbrial (Agg 3) con preferencia sustancialmente exento de aglutinógeno 1. La relación en peso de Agg 2 a Agg3 puede ser de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 2:1.

La preparación de la vacuna en la presente memoria puede combinarse con el toxoide tetánico y el toxoide diftérico para proporcionar una vacuna de DTP. En una forma de realización, la vacuna contiene aproximadamente 15 Lfs de toxoide diftérico y aproximadamente 5 Lfs del toxoide tetánico.

Además, la preparación de vacuna puede comprender también un adyuvante, particularmente alumbre.

Pueden utilizarse en la preparación de una sola dosis humana de la preparación de la vacuna desde aproximadamente 30 μg de nitrógeno de pertactina y aproximadamente 1 a aproximadamente 10 μg de nitrógeno de los aglutinógenos fimbriales. En particular, la preparación de vacuna tal como se proporciona en la presente memoria ha sido seleccionada por el National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) del Gobierno de Estados Unidos para la evaluación en una prueba clínica doble a ciegas de eficacia humana, demostrando de este modo una base suficiente para los especialmente expertos en la materia de que las composiciones serán eficaces en algún grado en la prevención de la enfermedad indicada (tos ferina). El asunto de esta prueba, (que es una vacuna como la proporcionada en la presente memoria) ha cumplido con la responsabilidad de ser razonablemente predictiva de utilidad.

La presente invención se describirá a continuación únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia al dibujo adjunto en el que:

La figura 1 es un diagrama esquemático de flujo de un procedimiento para el aislamiento de una preparación de aglutinógeno de una cepa de Bordetella.

Haciendo referencia a la figura 1, se ilustra un diagrama de flujo de un procedimiento para preparar una preparación de aglutinógeno procedente de una cepa de Bordetella. Como se aprecia en la figura 1, una pasta de células de Bordetella que contiene los aglutinógenos, tal como la pasta de células de B. pertussis, se extrae, por ejemplo, con tampón que contiene urea, tal como fosfato potásico 10 mM, NaCl 150 mM y urea 4 M, para extraer selectivamente los aglutinógenos de la pasta celular para producir un primer sobrenadante (sp1) que contiene aglutinógenos y un primer precipitado residual (ppt1). El primer sobrenadante (sp1) se separa del primer precipitado residual (ppt1) tal como por centrifugación. El precipitado residual (ppt1) se descarta. El sobrenadante clarificado (sp1) puede concentrarse a continuación y filtrarse a través de membranas frente a, por ejemplo, fosfato potásico 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 al 0,1% utilizando, por ejemplo, un filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa.

El primer sobrenadante se incuba a continuación a una temperatura y durante un tiempo para producir un sobrenadante clarificado (sp2) que contiene aglutinógenos y un segundo precipitado de descarte (ppt2) que contiene contaminantes desprovistos de aglutinógeno. Las temperaturas apropiadas incluyen aproximadamente 50ºC a aproximadamente 100ºC, incluyendo de aproximadamente 75ºC a aproximadamente 85ºC y los tiempos de incubación apropiados incluyen de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 minutos. El sobrenadante clarificado se concentra a continuación, por ejemplo, mediante la adición de polietilenglicol de peso molecular de aproximadamente 8000 (PEG 8000) hasta una concentración final de aproximadamente 4,5 ± 0,2% y agitando suavemente durante un mínimo de aproximadamente 30 minutos para producir un tercer precipitado (ppt3) que puede recogerse por centrifugación. El sobrenadante restante sp3 se descarta.

Este tercer precipitado (ppt3) se extrae, por ejemplo, con un tampón que comprende fosfato potásico 10 mM/NaCl 150 mM para proporcionar la solución que contiene aglutinógeno fimbrial en bruto. Puede añadirse fosfato potásico 1 M a la solución fimbrial en bruto para hacerla aproximadamente 100 mM con respecto al fosfato potásico. Alternativamente, el sobrenadante clarificado de los aglutinógenos fimbriales tratados térmicamente puede purificarse sin precipitación por cromatografía con filtración en gel utilizando un gel tal como Sepharose CL6B. Los aglutinógenos fimbriales en la solución en bruto se purifican a continuación por cromatografía en columna, tal como, pasándolos a través de una columna de sílice PEI, para producir la preparación del aglutinógeno finmbrial en el ensayo rápido.

Este aglutinógeno fimbrial que contiene el ensayo rápido puede estar más concentrado y filtrado a través de membranas frente, por ejemplo, a un tampón que contiene fosfato potásico 10 mM/NaCl 150 mM utilizando una membrana NMWL de 100 a 300 kDa. La preparación de aglutinógeno puede esterilizarse por filtración a través de un filtro de membrana ≤ 0,22 μM, para proporcionar la preparación de aglutinógeno fimbrial purificado final que contiene aglutinógeno 2 y 3 fimbrial.

Una preparación de aglutinógeno de una cepa de Bordetella puede contener aglutinógeno 2 fimbrial (Agg 2) y aglutinógeno 3 fimbrial (Agg 3) sustancialmente exentos de aglutinógeno 1. La relación en peso de Agg 2 a Agg 3 puede ser de aproximadamente 1,5:1 a aproximadamente 2:1. Dichas preparaciones de aglutinógeno fimbrial pueden producirse por el procedimiento proporcionado en la presente memoria y descrito con detalle anteriormente. La preparación de la vacuna contiene toxina de tos ferina o un toxoide de la misma, incluyendo análogos genéticamente desintoxicados de PT como se describe, por ejemplo, en la ref. 68.

La preparación de la vacuna puede incluir además, inmunógenos de no Bordetella incluyendo el toxoide diftérico, el toxoide tetánico, polisacáridos capsulares de Haemophilus, proteína de la membrana externa de Haemophilus, antígeno de superficie de la hepatitis B, poliomelitis, paperas, sarampión y rubéola.

Cada uno de los antígenos de Bordetella es absorbido individualmente por el adyuvante (por ejemplo alumbre) para proporcionar producción conveniente y rápida de preparaciones de la vacuna que contienen cantidades relativas seleccionadas de antígenos para proporcionar protección en una extensión de por lo menos aproximadamente 70% de los miembros de una población en riesgo, preferentemente de por lo menos aproximadamente el 80% de dicha población.

En formas de realización específicas, las preparaciones de la vacuna presentan las características siguientes (μg de proteínas utilizadas en la presente memoria se basan en los resultados del análisis de Kjedahl realizados en concentrados purificados y se expresan en μg de nitrógeno de proteína) y todos pueden ser administrados por inyección intramuscular:

(a) CP10/5/5/3 DT

Una formulación del componente de la vacuna contra la tos ferina combinada con toxoides diftéricos y tetánicos se denominó CP10/5/5/3DT. Cada 0,5 ml de dosis humana de CP10/5/5/3DT se formuló para que contenga aproximadamente:

10 μg Toxoide de la tos ferina (PT) 5 μg Hemoaglutinina filamentosa (HAF) 5 μg Aglutinógenos 2 y 3 fimbriales (FIMB) 3 μg Proteína de la membrana externa de 69 kDa 15 Lf Toxoide diftérico 5 Lf Toxoide tetánico 1,5 mg Fosfato de aluminio 0,6% 2-fenoxietanol, como conservante

(b) CP20/20/5/3 DT

Otra formulación del componente de la vacuna contra la tos ferina combinada con toxoides diftéricos y tetánicos se denominó CP20/20/5/3DT. Cada 0,5 ml de dosis humana de CP20/20/5/3DT se formuló para que contenga aproximadamente:

20 μg Toxoide de la tos ferina (PT) 20 μg Hemoaglutinina filamentosa (HAF) 5 μg Aglutinógenos 2 y 3 fimbriales (FIMB) 3 μg Proteína de la membrana externa de 69 kDa 15 Lf Toxoide diftérico 5 Lf Toxoide tetánico 1,5 mg Fosfato de aluminio 0,6% 2-fenoxietanol, como conservante

c) CP10/5/5 DT

Una formulación del componente de la vacuna contra la tos ferina combinada con toxoides diftéricos y tetánicos se denominó CP10/5/5DT. Cada 0,5 ml de dosis humana de CP10/5/5DT se formuló para que contenga aproximadamente:

10 μg Toxoide de la tos ferina (PT) 5 μg Hemoaglutinina filamentosa (HAF) 5 μg Aglutinógenos 2 y 3 fimbriales (FIMB) 15 Lf Toxoide diftérico 5 Lf Toxoide tetánico 1,5 mg Fosfato de aluminio 0,6% 2-fenoxietanol, como conservante

(d) CP20/10/10/6 DT

Otra formulación del componente de la vacuna contra la tos ferina combinada con toxoides diftéricos y tetánicos se denominó CP20/10/10/6DT. Cada 0,5 ml de dosis humana de CP20/10/10/6DT se formuló para que contenga aproximadamente:

20 μg Toxoide de la tos ferina (PT) 10 μg Hemoaglutinina filamentosa (HAF) 10 μg Aglutinógenos 2 y 3 fimbriales (FIMB) 6 μg Proteína de la membrana externa de 69 kDa (69 kDa) 15 Lf Toxoide diftérico 5 Lf Toxoide tetánico 1,5 mg Fosfato de aluminio 0,6% 2-fenoxietanol, como conservante

Los demás inmunógenos de Bordetella, toxina de tos ferina (incluyendo sus análogos desintoxicados genéticamente, tal como se describe, por ejemplo, en Klein et al., patente US nº 5.085.862 asignada al cesionario de la misma, HAF

y la proteína de 69 kDa pueden producirse por varios procedimientos tales como los descritos a continuación:

Purificación de PT

El PT puede aislarse del sobrenadante del cultivo de una cepa de B. pertussis utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, puede utilizarse el procedimiento de Sekura et al. (ref. 55). El PT se aísla absorbiendo en primer lugar el sobrenadante del cultivo en una columna que contiene la matriz del gel con colorante-ligando, Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). El PT se eluye de esta columna mediante alto contenido en sal, tal como cloruro de magnesio 0,75 M y, después de eliminar la sal, se pasa a través de una columna de la matriz de afinidad fetuina-Sepharose compuesta por fetuina unida a Sepharose activada con bromuro de cianógeno. El PT se eluye de la columna con fetuina utilizando la sal de magnesio 4 M.

Alternativamente, puede utilizarse el procedimiento de Irons et al. (ref. 56). El sobrenadante del cultivo se absorbe en una columna Sepharose 4B activada con CNBr a la que se une por enlace covalente haptoglobina en primer lugar. El PT se une al absorbente a pH 6,5 y se eluye de la columna utilizando tampón Tris 0,1 M/NaCl 0,5 M mediante un cambio paso a paso a pH 10.

Alternativamente, puede utilizarse el procedimiento descrito en la patente US nº 4.705.686 concedida a Scott et al. el 10 de noviembre de 1987. En este procedimiento los sobrenadantes del cultivo o los extractos celulares de B. pertussis se pasan a través de una columna de una resina de intercambio aniónico de suficiente capacidad para absorber la endotoxina pero permiten que los antígenos de Bordetella fluyan a través o sino se separen de la endotoxina.

Alternativamente, puede purificarse PT utilizando cromatografía con perlita, tal como se describe en la patente EP 336736, asignada al cesionario de la misma.

Desintoxicación del PT

El PT se desintoxica para eliminar las actividades no deseadas que podrían producir reacciones secundarias de la vacuna final. Puede utilizarse cualquiera de una variedad de procedimientos convencionales de desintoxicación química, tal como el tratamiento con formaldehído, peróxido de hidrógeno, tetranitro-metano o glutaraldehído.

Por ejemplo, puede desintoxicarse PT con glutaraldehído utilizando una modificación del procedimiento descrito por Muñoz et al. (ref. 57). En este procedimiento de desintoxicación PT purificado se incuba en una solución que contiene solución salina tamponada con fosfato 0,01 M. La solución se prepara al 0,05% con glutaraldehído y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante dos horas, y a continuación se prepara 0,02 M con L-lisina. La mezcla se incuba más durante dos horas a temperatura ambiente y a continuación se dializa durante dos días frente a PBS 0,01 M. En una forma de realización específica, puede utilizarse el procedimiento de desintoxicación de la patente EP 336736. En resumen el PT puede desintoxicarse con glutaraldehído de la forma siguiente:

El PT purificado en fosfato potásico 75 mM a pH 8,0 que contiene cloruro sódico 0,22 M se diluye con un volumen igual de glicerol a concentraciones de proteína de aproximadamente 50 a 400 μg/ml. La solución se calienta a 37ºC y se desintoxica por adición de glutaraldehído a una concentración final de 0,5% (p/v). La mezcla se mantiene a 37ºC durante 4 h y a continuación se añade ácido aspártico (1,5 M) a una concentración final de 0,25 M. Se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora y a continuación se filtra a través de membranas con 10 volúmenes de fosfato potásico 10 mM a pH 8,0 que contiene cloruro sódico 0,15 M y glicerol al 5% para reducir el glicerol y eliminar el glutaraldehído. El toxoide PT se filtra estéril a través de una membrana de 0,2 μM.

Si se utilizan técnicas recombinantes para preparar la molécula mutante PT que no muestra ninguna o poca toxicidad, para su utilización como molécula toxoidada, la desintoxicación química no es necesaria.

Purificación de HAF

HAF puede purificarse en el sobrenadante del cultivo esencialmente tal como describe Cowell et al. (ref. 58). Los activadores de crecimiento, tal como las beta-ciclodextrinas metiladas, pueden utilizarse para aumentar el rendimiento de HAF en los sobrenadantes del cultivo. El sobrenadante del cultivo se aplica a una columna con hidroxiapatita. HAF se absorbe en la columna, pero PT no. La columna se lava intensamente con Triton X-100 para eliminar la endotoxina. HAF se eluye a continuación utilizando NaCl 0,5 M en fosfato sódico 0,1 M y, si es necesario, se pasa a través de una columna Sepharose con fetuina para eliminar el PT residual. La purificación adicional puede implicar el paso a través de una columna Sepharose CL-6B.

Alternativamente, HAF puede purificarse utilizando anticuerpos monoclonales contra el antígeno, cuando los anticuerpos se fijan a una columna de afinidad activada por CNBr (ref. 59).

Alternativamente, HAF puede purificarse utilizando cromatografía con perlita tal como se describe en la patente EP 336736 mencionada anteriormente.

Purificación de la proteína de la membrana externa de 69 kDa (pertactina)

La proteína de la membrana externa de 69 kDa (69K o pertactina) puede recuperarse de las células bacterianas en primer lugar inactivando las células con un agente bacteriostático tal como timerosal, tal como se describe en la patente EP 484621 publicada e incorporada en la presente como referencia a la misma. Las células inactivadas se ponen en suspensión en un medio acuoso, tal como PBS (pH 7 a 8) y se somete a extracción repetida a temperatura elevada (45 a 60ºC) con posterior enfriamiento a la temperatura ambiente o 4ºC. Las extracciones liberan la proteína 69 K de las células. El material que contiene la proteína 69 K se recoge por precipitación y se pasa a través de una columna Affi-gel Blue. La proteína 69 K se eluye con una concentración alta de sal, tal como cloruro de magnesio 0,5

M. Después de la diálisis se pasa a través de un soporte de cromatoenfoque.

Alternativamente, la proteína de 69 kDa puede purificarse en el sobrenadante de un cultivo de B. pertussis tal como se describe en la solicitud de PCT WO 91/15505, en nombre del cesionario de la misma.

Otros procedimientos de purificación apropiados de la proteína de la membrana externa de 69 kDa de B. pertussis se describen en la patente US nº 5.276.142, concedida a Gotto et al., el 4 de enero de 1984 y en la patente US nº 5.101.014, concedida a Burns el 31 de marzo de 1992.

Se realizaron numerosas pruebas clínicas en personas tal como se describe en la presente memoria para demostrar la seguridad, la no reactogenicidad y la utilidad de las vacunas de componentes para la protección contra la tos ferina. En particular, se obtuvieron las respuestas inmunitarias a cada uno de los antígenos contenidos en las vacunas (como se muestra, por ejemplo, en la tabla 3 a continuación). Se analizó una vacuna CP10/5/5/3DT contra la tos ferina acelular específica en una prueba clínica doble al azar, larga, controlada con placebo, multicentro, en una población humana en situación de riesgo para estimar la eficacia de la vacuna contra la tosferínica típica.

La definición del caso para la enfermedad de tosferínica típica fue:

Veintiún días o más de tos espasmódica, y bien B. pertussis confirmada por cultivo, o pruebas serológicas de infección específica de Bordetella indicadas por un aumento de anticuerpo de IgG o IgA al 100% en ELISA frente a HAF o PT en sueros emparejados, o si se carece de datos serológicos, el niño del estudio ha estado en contacto con un caso de B. pertussis confirmado por el cultivo en casa con comienzo de tos 28 días antes o después del comienzo de la tos en el niño del estudio.

Los resultados de este estudio demostraron que CP10/5/5/3DT es aproximadamente 85% de eficaz en la prevención de la tos ferina tal como se define en la definición del caso para la enfermedad de tos ferina típica descrita anteriormente. En el mismo estudio, una vacuna acelular antitosferínica de dos componentes que contiene solamente PT y HAF fue aproximadamente 58% eficaz y una vacuna contra la tos ferina de células completas fue aproximadamente 48% eficaz (véase la tabla 4 a continuación). Además, la vacuna de CP10/5/5/3DT previno la tos ferina leve definida como una tos de por lo menos un día de duración a una eficacia de aproximadamente 77%. En particular, el perfil de la respuesta inmunitaria obtenido fue sustancialmente el mismo que el obtenido después de la inmunización con vacunas contra la tos ferina de células completas de las que se informa que son muy eficaces contra la tos ferina.

Preparación y utilización de la vacuna

Por lo tanto, las composiciones inmunógenas adecuadas para ser utilizadas como vacunas, pueden prepararse a partir de los inmunógenos de Bordetella tal como se da a conocer en la presente memoria. La vacuna provoca una respuesta inmunitaria en un paciente que produce anticuerpos que pueden ser opsonizantes o bactericidas. El paciente a ser sometido a la prueba de provocación debería vacunarse con B. pertussis, dichos anticuerpos se unen a las bacterias y las inactivan. Además, los anticuerpos opsonizantes o bactericidas pueden proporcionar también protección por mecanismos alternativos.

Las composiciones inmunógenas que incluyen vacunas pueden prepararse como inyectables, como soluciones líquidas o emulsiones. Los inmunógenos de Bordetella pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con los inmunógenos. Dichos excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunógenas y las vacunas pueden contener además sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH o adyuvantes para aumentar la eficacia de las mismas. Las composiciones inmunógenas y las vacunas pueden administrarse por vía parenteral, por inyección subcutánea o intramuscular. Las preparaciones inmunógenas y las vacunas se administran de manera compatible con la formulación de la dosis, y en dicha cantidad serán terapéuticamente eficaces, inmunógenas y protectoras. La cantidad que debe administrarse depende del paciente que va a tratarse, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, y, si es necesario, para producir una respuesta inmunitaria mediada por células. Las cantidades exactas de ingrediente activo requeridas que deben administrarse dependen del criterio del médico de familia. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuadas son determinados fácilmente por un experto en la materia y pueden ser del orden de microgramos de los inmunógenos. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones sucesivas. La dosis puede depender también de la vía de administración y variará según el tamaño del hospedador.

La concentración de los inmunógenos en una composición inmunógena según la invención está comprendida en general entre aproximadamente 1 al 95%. Una vacuna que contiene material antigénico de solamente un patógeno es una vacuna monovalente. Las vacunas que contienen material antigénico de varios patógenos son las vacunas combinadas y también pertenecen a la presente invención. Dichas vacunas combinadas contienen, por ejemplo, material procedente de varios patógenos o de varias cepas del mismo patógeno, o procedente de combinaciones de varios patógenos.

La inmunogenicidad puede mejorarse significativamente si los antígenos se administran junto con adyuvantes, normalmente utilizados como solución del 0,005 al 0,5 por ciento en solución salina tamponada con fosfato. Los adyuvantes aumentan la inmunogenicidad de un antígeno pero ellos mismos no son necesariamente inmunógenos. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio de administración para producir un efecto prolongado que facilita una liberación lenta, mantenida del antígeno a las células del sistema inmunitario. Los adyuvantes pueden atraer también células del sistema inmunitario a un antígeno retardante y estimular dichas células para provocar respuestas inmunitarias.

Los agentes inmunoestimuladores o adyuvantes se han utilizado durante muchos años para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedador, por ejemplo, a las vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como lipopolisacáridos, normalmente son los componentes de las bacterias destruidas o atenuadas utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que por lo general no están unidos por enlace covalente a los antígenos y se formulan para aumentar las respuestas inmunitarias del hospedador. Por lo tanto, se han identificado adyuvantes que aumentan la respuesta inmunitaria a antígenos administrados vía parenteral. Algunos de estos adyuvantes son tóxicos, sin embargo, y pueden producir efectos secundarios indeseables, haciéndolos inadecuados para su utilización en seres humanos y muchos animales. De hecho, solamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (denominado en conjunto normalmente alumbre) se utilizan de forma rutinaria como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. La eficacia de la alumbre para aumentar las respuestas del anticuerpo a los toxoides diftérico y tetánico está bien demostrada y, más recientemente, una vacuna HBsAg se ha mejorado con alumbre. Aunque la utilidad del alumbre está muy demostrada para algunas aplicaciones tiene limitaciones. Por ejemplo, el alumbre es ineficaz para la vacunación contra la gripe e inconstantemente provoca una respuesta inmunitaria mediada por células. Los anticuerpos producidos por antígenos mejorados con alumbre son principalmente del isotipo IgG1 en el ratón, lo que puede no ser óptimo para la protección por algunos agentes de vacuna.

Una amplia gama de adyuvantes extrínsecos puede provocar potentes respuestas inmunitarias a los antígenos.Éstas incluyen saponinas acomplejadas para antígenos de proteínas de la membrana (complejos inmunoestimulantes), polímeros plurónicos con aceite mineral, micobacterias destruidas en aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos, tales como dipéptido de muramilo (DPM) y lipopolisacáridos (LPS), así como lípido A y liposomas.

Para provocar de manera eficaz respuestas inmunitarias humorales (RIH) e inmunidad mediada por células (IMC) los inmunógenos se emulsionan con frecuencia en adyuvantes. Muchos adyuvantes son tóxicos, produciendo granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, ACF), citólisis (saponinas y polímeros plurónicos) y pirogenicidad, artritis y uveítis anterior (LPS y MDP). Aunque FCA es un excelente adyuvante y se utiliza ampliamente en investigación, no está permitida su utilización en vacunas humanas o veterinarias debido a su toxicidad.

Las características deseables de los adyuvantes ideales incluyen:

(1): falta de toxicidad;

(2): capacidad para estimular una respuesta inmunitaria de larga duración;

(3): sencillez de preparación y estabilidad en el almacenamiento de larga duración;

(4): capacidad para producir tanto ICM como RIH contra antígenos administrados por varias vías;

(5): sinergia con otros adyuvantes;

(6): capacidad de interactuar selectivamente con poblaciones de células presentadoras del antígeno (CPA):

(7): capacidad para provocar específicamente respuestas inmunitarias apropiadas específicas de células de TH1

o TH2; y

(8): capacidad para aumentar selectivamente los niveles del isotipo del anticuerpo apropiado (por ejemplo, IgA) contra antígenos.

La patente US nº 4.855.283 concedida a Lockhoff et al., el 8 de agosto de 1989 da a conocer análogos de glucolípido que incluyen N-glucosilamidas, N-glucosilureas y N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales está sustituido en el resto del azúcar por un aminoácido, como inmunmoduladores o adyuvantes. Por lo tanto, Lockhoff et al. (patente US nº 4.855.283 y ref. 60) publicaron que los análogos de N-glucolípìdo que presentan similitudes estructurales con los glucolípidos naturales, tales como los glucoesfingolípidos y glucoglicerolípidos, son capaces de provocar potentes respuestas inmunitarias tanto en la vacuna del virus del herpes simple como la vacuna del virus de la pseudorrabia. Algunos glucolípidos se han sintetizado a partir de alquilaminas de cadena larga y ácidos grasos que están unidos directamente con los azúcares por el átomo de carbono anomérico, para imitar las funciones de los restos de lípido naturales.

La patente US nº 4.258.029 concedida a Moloney, asignada al cesionario de la misma, da a conocer que el hidrocloruro de octadecil tirosina (OTH) funciona como adyuvante cuando se acompleja con el toxoide tetánico y la vacuna del virus de la poliomielitis tipo I, II y III de formalina. Además, Nixon-George et al. (ref. 61), describieron que los ésteres de octadecilo de los aminoácidos aromáticos acomplejados con un antígeno de superficie de la hepatitis B recombinante, aumentó las respuestas inmunitarias del hospedador contra el virus de la hepatitis B.

Ejemplos

La descripción anterior describe generalmente la presente invención. Una comprensión más completa puede obtenerse haciendo referencia a los ejemplos específicos siguientes. Estos ejemplos se describen solamente a título de ilustración y no están orientadas a limitar el alcance de la invención. Los cambios en la forma y sustitución de los equivalentes se contemplan como circunstancias pueden sugerir o resultar conveniente. Aunque en la presente memoria se han utilizado expresiones específicas, dichas expresiones se proporcionan a título descriptivo y no limitativo.

Los procedimientos de la bioquímica de proteínas, la fermentación y la inmunología utilizados pero no descritos explícitamente en esta exposición y estos ejemplos, están ampliamente publicados en la bibliografía científica y están comprendidos dentro de la capacidad de los expertos en la materia.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la multiplicación de Bordetella pertussis.

Semilla patrón:

Cultivos de semilla patrón de una cepa de Bordetella pertussis se mantuvieron como lotes de semilla liofilizados, entre 2ºC y 8ºC.

Semilla de trabajo

El cultivo liofilizado se recuperó en medio Hornibrook y se utilizó para sembrar placas Bordet-Gengou agar-agar (BGA). El medio Hornibrook tiene la composición siguiente:

Componente Para 1 litro Hidrolizado de caseína (tratado con carbón activo) 10,0 g Ácido nicotínico 0,001 g Cloruro cálcico 0,002 g Cloruro sódico 5,0 g Cloruro de magnesio hexahidratado 0,025 g Cloruro potásico 0,200 g Fosfato de potasio dibásico 0,250 g Almidón 1,0 g Agua destilada hasta 1,0 litro

El pH se ajusta entre 6,9 ± 0,1 con solución al 1% de carbonato sódico. El medio se distribuye en tubos y se esteriliza por vaporizado en el autoclave durante 20 minutos y esterilización en el autoclave durante 20 minutos entre 121ºC y 124ºC. La semilla se subcultivó dos veces, en primer lugar en placas BGA y a continuación en agar-agar con componente de tos ferina (CPA). El agar-agar con componente de tos ferina (CPA) tiene la siguiente composición:

NaCl 2,5 g/l KH2PO4 0,5 g/l KCl 0,2 g/l MgCl2(H2O)6 0,1 g/l Tris base 1,5 g/l Casaminoácidos 10,0 g/l NaHglutamato 10,0 g/l HCl conc. hasta pH 7,2 Agar-agar 15,0 g/l Factores de crecimiento (CPGF) 10,0 ml/l

Factores de crecimiento con componente de tos ferina (CPGF) - 100 x tienen la siguiente composición:

L-cisteína HCl 4,0 g/l Niacina 0,4 g/l Ácido ascórbico 40,0 g/l Glutatión, reducido 15,0 g/l Fe2SO4·(H2O)7 1,0 g/l Dimetil- -ciclodextrina 100 g/l CaCl2·(H2O)2 2,0 g/l

El cultivo final se puso en suspensión en tampón de suspensión de semilla de tos ferina (CPSB), se distribuyó en alícuotas de 2 a 4 ml y se almacenó congelado entre -60ºC y -85ºC. El tampón de suspensión de la semilla de tos ferina (PSSB) tiene la composición siguiente:

Casaminoácidos 10,0 g/l Tris base 1,5 g/l Glicerol anhidro 100 ml/l HCl conc. hasta pH 7,2

Estas suspensiones en glicerol proporcionaron el material de partida para la preparación de la semilla de operación.

Procedimiento de cultivo

La propagación de la semilla de trabajo se realizó en botellas Roux de agar-agar con componente de tos ferina durante 4 a 7 días entre 34ºC y 38ºC. Después de este cultivo, se lavaron las células con caldo de cultivo de componente de tos ferina (CPB). Se observó en las muestras mediante tinción de Gram, la pureza y opacidad del cultivo.

Las células se transfirieron a matraces cónicos de 4 litros que contenían CPB y se incubaron entre 34ºC y 38ºC durante 20 a 26 horas con agitación. Se observaron las muestras mediante tinción de Gram y se comprobó la pureza del cultivo. Los matraces se mezclaron y se utilizó la suspensión para sembrar dos fermentadores que contenían CPB (volumen de partida de 10 litros a D.O.600 0,1-0,4). La semilla se cultivó hasta D.O.600 final de 5,0 a 10,0. En las muestras se analizó por tinción de Gram, la pureza del cultivo, por ELISA específicos para el antígeno y la esterilidad.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la purificación de antígenos a partir del cultivo de células de Bordetella pertussis.

Producción de caldo de cultivo y concentrados celulares

La suspensión bacteriana se cultivó en dos fermentadores de producción, entre 34ºC y 37ºC durante 35 a 50 horas. Se tomaron muestras en los fermentadores para pruebas de esterilidad del medio. La suspensión se alimentó a una centrifugadora de pila de discos de flujo continuo (12.000 x g) para separar las células del caldo de cultivo. Se recogieron las células para esperar la extracción del componente de fimbrias. El licor clarificado se pasó a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. El licor filtrado se concentró por ultrafiltración utilizando una membrana con límite de peso molecular nominal (NMWL) de 10 a 30 kDa. El concentrado se almacenó para esperar la separación y purificación de la toxina de la tos ferina (PT), la hemoaglutinina filamentosa (HAF) y los componentes de 69 kDa (pertactina).

Separación de los componentes del caldo de cultivo

Los componentes del caldo de cultivo (69 kDa, PT y HAF) se separaron y purificaron por cromatografía en perlita y las etapas de elución selectiva, esencialmente tal como se describe en la patente EP 336736 y la solicitud PCT WO 91/15505 publicada por los solicitantes, descrita anteriormente. Las operaciones de purificación específica efectuadas se describen a continuación.

Toxina de tos ferina (PT)

Se lavó la columna de perlita con Tris 50 mM, Tris 50 mM/Triton X-100 al 0,5% y tampones Tris 50 mM. La fracción PT se eluyó de la columna de perlita con tampón Tris 50 mM/NaCl 0,12 M.

La fracción PT procedente de la cromatografía de perlita se cargó en una columna de hidroxiapatita y a continuación se lavó con tampón de fosfato potásico 30 mM. Se eluyó el PT con tampón fosfato potásico 75 mM/NaCl 225 mM. La columna se lavó con fosfato de potasio 200 mM/NaCl 0,6 M para obtener la fracción de HAF que se descartó. Se añadió glicerol al PT purificado hasta 50% y la mezcla se almacenó entre 2ºC y 8ºC hasta la desintoxicación en una semana.

Hemoaglutinina filamentosa (HAF)

La fracción HAF se eluyó de la columna de perlita con Tris 50 mM/NaCl 0,6 M. Se purificó la hemoaglutinina filamentosa por cromatografía sobre hidroxiapatita. La fracción de HAF procedente de la columna de perlita se cargó en una columna con hidroxiapatita y a continuación se lavó con fosfato potásico 30 mM que contenía Triton X-100 al 0,5%, seguido de tampón de fosfato potásico 30 mM. La fracción de PT se eluyó con tampón de fosfato potásico 85 mM y se descartó. La fracción de HAF se eluyó con fosfato potásico 200 mM/NaCl 0,6 M y se almacenó entre 2ºC y 8ºC hasta la desintoxicación en una semana.

69 kDa (pertactina)

El concentrado de caldo de cultivo se diluyó con agua para inyectables (WFI) para conseguir una conductividad de 3 a 4 mS/cm y se cargó en una columna con perlita a una carga de 0,5 a 3,5 mg de proteína por ml de perlita. El ensayo (fracción componente de 69 kDa) se concentró por ultrafiltración utilizando una membrana NMWL de 10 a 30 kDa. Se añadió sulfato amónico al ensayo concentrado hasta 35% ± 3% (p/v) y la mezcla resultante se almacenó entre 2ºC y 8ºC durante 4 ± 2 días o se centrifugó (7.000 x g) inmediatamente. Se decantó el sobrenadante en exceso y se recogió el precipitado por centrifugación (7.000 x g). El sedimento de 69 kDa se almacenó congelado entre -20ºC y -30ºC o se disolvió en tampón Tris o fosfato y se utilizó inmediatamente.

La proteína de la membrana externa de 69 kDa obtenida por precipitación en sulfato de amonio al 35% (p/v) del compuesto de ensayo en perlita tratado se utilizó para la purificación. Se añadió sulfato amónico (100 ± 5 g por litro) a la fracción de 69 kDa y se agitó la mezcla durante por lo menos 2 horas entre 2ºC y 8ºC. Se centrifugó la mezcla

(7.000 x g) para recuperar el sobrenadante. Se añadió sulfato amónico (100 a 150 g por litro) al sobrenadante y la mezcla se agitó durante por lo menos 2 horas entre 2ºC y 8ºC. Se centrifugó la mezcla (7.000 x g) para recuperar el sedimento, que se disolvió en Tris 10 mM, HCl, pH 8. La fuerza iónica de la solución se ajustó a la equivalente de Tris HCl 10 mM (pH 8), que contenía sulfato amónico 15 mM.

Se aplicó la proteína de 69 kDa a la columna de hidroxiapatita conectada en tándem con una columna de Q-Sepharose. Se recogió la proteína de 69 kDa en el compuesto de ensayo, se calentó a reflujo en las columnas con Tris 10 mM, HCl (pH 8), que contenía sulfato amónico 15 mM y se mezcló con la proteína de 69 kDa en el compuesto de ensayo. La proteína de 69 kDa se filtró por diálisis con 6 a 10 volúmenes de fosfato potásico 10 mM (pH 8) que contenía NaCl 0,15 M en una membrana NMWL de 100 a 300 kDa. El ultrafiltrado se recogió y la proteína de 69 kDa en el ultrafiltrado concentrado.

La proteína de 69 kDa se intercambió el disolvente en Tris HCl 10 mM (pH 8) y se adsorbió en Q-Sepharose, se lavó con Tris HCl 10 mM (pH 8/sulfato de amonio 5 mM). La proteína de 69 kDa se eluyó con fosfato potásico 50 mM (pH 8). La proteína de 69 kDa se filtró por diálisis con 6 a 10 volúmenes de fosfato de potasio 10 mM (pH 8) que contenía NaCl 0,15 M en una membrana NMWL de 10 a 30 kDa. La proteína de 69 kDa se filtró estéril a través de un filtro ≤ 0,22 μm. La masa estéril se almacenó entre 2ºC y 8ºC y se realizó la adsorción en tres meses.

Aglutinógenos fimbriales

Se purificaron los aglutinógenos de la pasta celular después de la separación del caldo de cultivo. La pasta celular se diluyó hasta una fracción de 0,05 volúmenes de células en un tampón que contenía fosfato potásico 10 mM, NaCl 150 mM y urea 4 M, y se mezcló durante 30 minutos. El lisado celular se clarificó por centrifugación (12.000 x g), a continuación se concentró y se filtró por diálisis frente a fosfato potásico 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 al 0,1% utilizando un filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa.

Se calentó el concentrado a 80ºC durante 30 min y a continuación se volvió a clarificar por centrifuagción (9.000 x g). Se añadió PEG 8000 al sobrenadante clarificado hasta una concentración final de 4,5% ± 0,2% y se agitó suavemente durante un mínimo de 30 minutos. El precipitado resultante se recogió por centrifugación (17.000 x g) y el sedimento se extrajo con fosfato de potasio 10 mM/tampón NaCl 150 mM para proporcionar una solución de aglutinógeno fimbrial en bruto. Los aglutinógenos fimbriales se purificaron por paso sobre sílice PEI. La solución en bruto se preparó con 100 mM con respecto al fosfato de potasio utilizando tampón de fosfato de potasio 1 M y se pasó a través de una columna de sílice PEI.

El compuesto de ensayo de las columnas se concentró y se filtró por diálisis frente a tampón fosfato de potasio 10 mM/NaCl 150 mM utilizando filtro de membrana NMWL de 100 a 300 kDa. La masa estéril se almacena entre 2ºC y 8ºC y se lleva a cabo la adsorción en tres meses. La preparación del aglutinógeno fimbrial contenía Agg 2 fimbrial y Agg 3 fimbrial en una relación en peso de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2:1 y se observó que estaba sustancialmente exento de Agg 1.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe la toxoidación de los antígenos purificados de Bordetella pertussis, PT y HAF.

El PT, preparado en forma pura como se describe en el Ejemplo 2 se convirtió en vacuna ajustando la concentración de glutaraldehído en la solución de PT a 0,5% ± 0,1% e incubando a 37ºC ± 3ºC durante 4 horas. Se interrumpió la reacción añadiendo L-aspartato 0,21 ± 0,02 M. La mezcla se mantuvo a continuación a temperatura ambiente durante 1 ± 0,1 horas y a continuación entre 2ºC y 8ºC durante 1 a 7 días.

La mezcla resultante se filtró por diálisis frente a tampón de fosfato potásico 10 mM/NaCl 0,15 M/glicerol al 5% en un filtro de membrana NMWL de 30 kDa y a continuación se esterilizó por paso a través de un filtro de membrana ≤ 0,22 μm. La masa estéril se almacenó entre 2ºC y 8ºC y se realizó la adsorción en tres meses.

La fracción de HAF, preparada en forma pura como se describe en el Ejemplo 2 se convirtió en vacuna ajustando la concentración de de L-lisina y formaldehído a 47 ± 5 mM y 0,24 ± 0,5% respectivamente e incubando de 35ºC a 38ºC durante 6 semanas. La mezcla se filtró atd membrana frente a fosfato potásico 10 mM/NaCl 0,5 M utilizando un filtro de membrana NMWL de 30 kDa y se esterilizó por paso a través de un filtro de membrana. La masa estéril se almacenó entre 2ºC y 8ºC y se realizó la adsorción en tres meses.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe la adsorción de los antígenos purificados de Bordetella pertussis.

Para la adsorción individual de PT, HAF, Agg y 69 kDa en fosfato de aluminio (alumbre) se preparó una solución madre de fosfato de aluminio a una concentración de 18,75 ± 1 mg/ml. Se preparó un recipiente adecuado y alguno de los antígenos distribuidos asépticamente en el recipiente. Se añadió asépticamente 2-fenoxietanol hasta proporcionar una concentración final de 0,6% ± 0,1% v/v y se agitó hasta ser homogénea. El volumen apropiado de fosfato de aluminio se añadió asépticamente al recipiente. Se añadió un volumen apropiado de agua destilada esterilizada para llevar la concentración final hasta 3 mg de fosfato de aluminio/ml. Se sellaron los recipientes y se marcaron y se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 4 días. El recipiente se almacenó a continuación esperando la formulación final.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe la formulación de un componente de la vacuna contra la tos ferina combinado con los toxoides diftéricos y tetánicos.

Los antígenos de B. pertussis preparados como se describe en los ejemplos anteriores se formularon con toxoides diftéricos y tetánicos para proporcionar varios vacunas contra la tos ferina del componente (CP).

Se produjeron componentes de la tos ferina a partir del cultivo de Bordetella pertussis en un cultivo sumergido tal como se describe con detalle en los Ejemplos 1 a 4 anteriores. Una vez terminado el cultivo, el caldo de cultivo y las células bacterianas se separaron por centrifugación. Cada antígeno se separó individualmente. La toxina de la tos ferina (PT) y hemoaglutinina filamentosa (HAF) se purificaron en el caldo de cultivo por cromatografía secuencial sobre perlita e hidroxiapatita. Se desintoxicó PT con glutaraldehído y algún PT residual (aproximadamente 1%) presente en la fracción HAF se desintoxicó con formaldehído. Se prepararon aglutinógenos fimbriales (2 + 3) (AGG) a partir de las células bacterianas. Se destruyeron las células con urea y se calentaron, y los aglutinógenos fimbriales se purificaron por precipitación con polietilenglicol y cromatografía sobre polietilenimina sílice. El componente de la proteína de 69 kDa (pertactina) se aisló en el ensayo procedente de la etapa de cromatografía sobre perlita (Ejemplo 2) por precipitación con sulfato de amonio y se purificó por cromatografía secuencial sobre hidroxiapatita y Q-sepharose. Todos los componentes se esterilizaron por filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 μm.

Se preparó toxoide diftérico procedente del cultivo de Corynebacterium diphtheriae en cultivo sumergido por los procedimientos habituales. La producción del toxoide diftérico se divide en cinco etapas, a saber mantenimiento de la semilla de trabajo, cultivo de Corynebacterium diphtheriae, recolección de la toxina de la difteria, desintoxicación de la toxina de la difteria y concentración del toxoide de la difteria.

Preparación del toxoide diftérico

(I) Semilla de trabajo

La cepa de Corynebacterium diphtheriae se mantuvo como un lote de semillas liofilizadas. La semilla reconstituida se cultivó en tubos en pendiente con medio de Loeffler durante 18 a 24 horas a 35ºC ± 2ºC y a continuación se transfirió a matraces de medio de difteria. En el cultivo se analizó a continuación la pureza y el contenido en Lf. La semilla restante se utilizó para inocular un fermentador.

(II) Cultivo de Corynebacterium diphtheriae

El cultivo se incubó a 35ºC ± 2ºC y se agitó en el fermentador. Se añadieron al cultivo cantidades predeterminadas de soluciones de sulfato ferroso, cloruro cálcico y fosfato. Las cantidades existentes de cada solución (fosfato, sulfato ferroso, cloruro cálcico) se determinaron experimentalmente para cada lote del medio. Las concentraciones seleccionadas son aquellas que proporcionan el contenido más alto de Lf. Al final del ciclo de cultivo (30 a 50 horas) se tomaron muestras de los cultivos para pureza y contenido de Lf.

Se ajustó el pH con bicarbonato sódico, y se inactivó el cultivo con tolueno al 0,4% durante 1 hora a una temperatura mantenida de 35ºC ± 2ºC. A continuación se realizó on ensayo de esterilidad para confirmar la ausencia de C. diphtheriae viva.

(III) Recolección de toxina de la difteria

Los cultivos tratados con tolueno de uno o varios fermentadores se mezclaron en un depósito grande. Se añadieron aproximadamente 0,12% de bicarbonato sódico, 0,25% de carbón activo y 23% de sulfato amónico y se midió el pH.

Se agitó la mezcla durante aproximadamente 30 minutos. Se añadió tierra de diatomeas y se bombeó la mezcla a un filtro de profundidad. Se recirculó el filtrado hasta quedar transparente, se recogió a continuación y se tomaron muestras para ensayo de contenido de Lf. Se añadió sulfato amónico adicional al filtrado para dar una concentración del 40%. Se añadió también tierra de diatomeas. La mezcla se mantuvo durante 3 a 4 días entre 2ºC y 8ºC para dejar sedimentar el precipitado. Se recolectó la toxina precipitada y se disolvió en solución salina al 0,9%. Se eliminó la tierra de diatomeas por filtración y la toxina se dializó frente a solución salina al 0,9%, para eliminar el sulfato amónico. Se mezcló la toxina dializada y se tomaron muestras para el ensayo de contenido en Lf y pureza.

(IV) Desintoxicación de la toxina de la difteria

La desintoxicación tuvo lugar inmediatamente después de la diálisis. Para la desintoxicación, se diluyó la toxina de modo que la solución final contenía:

(a): Toxina de la difteria a 1.000 ± 10% Lf/ml.

(b): Bicarbonato sódico al 0,5%

(c): Formalina al 0,5%

(d): Monohidrocloruro de L-lisina al 0,9% p/v

Se llevó la solución a volumen con solución salina y se ajustó el pH a 7,6 ± 0,1.

Se filtró el toxoide a través de un filtro de tierra de diatomeas con celulosa y/o un prefiltro de membrana y un filtro de membrana de 0,2 μm en el recipiente de recogida y se incubó durante 5 a 7 semanas a 34ºC. Se retiró una muestra para ensayo de toxicidad.

(V) Concentración del toxoide purificado

Se mezclaron los toxoides, a continuación se concentraron por ultrafiltración y se recogieron en un recipiente adecuado. Se tomaron muestras para ensayo de contenido en Lf y pureza. Se añadió el conservante (2fenoxietanol) para dar una concentración final de 0,375% y se ajustó el pH entre 6,6 y 7,6.

Se esterilizó el toxoide por filtración a través de un prefiltro y un filtro de membrana de 0,2 μm (o equivalente) y se recolectó. Se tomaron muestras a continuación del toxoide estéril para la irreversibilidad del contenido en Lf del toxoide, el contenido de conservante, pureza (contenido en nitrógeno), ensayos de esterilidad y toxicidad. El toxoide concentrado estéril se almacenó entre 2ºC y 8ºC hasta la formulación final.

Preparación del toxoide tetánico

Se preparó el toxoide tetánico (T) a partir del cultivo de Clostridium tetani en cultivo sumergido.

La producción del toxoide tetánico puede dividirse en cinco etapas a saber, mantenimiento de la semilla de trabajo, cultivo de Clostridium tetani, recogida de toxina del tétanos, desintoxicación de la toxina del tétanos y purificación del toxoide tetánico.

(I) Semilla de trabajo

La cepa de Clostridium tetani utilizada en la producción de la toxina del tétanos para la conversión al toxoide tetánico

se mantuvo en forma liofilizada en un lote de semillas. La semilla se inoculó en medio con tioglicolato y se dejó desarrollar durante aproximadamente 24 horas a 35ºC ± 2ºC. Se tomó una muestra para el ensayo de pureza del cultivo.

(II) Cultivo de Clostridium tetani

El medio de tétanos se distribuyó en un fermentador, se calentó y se enfrió. El fermentador se sembró a continuación y se dejó desarrollar el cultivo durante 4 a 9 días a 34ºC ± 2ºC. Se tomó una muestra para la pureza del cultivo y ensayo del contenido en Lf.

(III) Recolección de toxina del tétanos

La toxina se separó por filtración a través de almohadillas de tierra de diatomeas con celulosa y la toxina clarificada a continuación se esterilizó en filtro utilizando filtros de membrana. Se tomaron muestras para el contenido en Lf y esterilidad. La toxina se concentró por ultrafiltración, utilizando un tamaño de poro de 30.000 daltons.

(IV): Desintoxicación de la toxina del tétanos

Se tomaron muestras de la toxina para el ensayo de contenido en Lf para desintoxicación. Se desintoxicó la toxina concentrada (475 a 525 Lf/ml) mediante la adición de bicarbonato sódico al 0,5% p/v, formalina al 0,3% v/v y monohidrocloruro de L-lisina al 0,9% p/v y se llevó a volumen son solución salina. El pH se ajustó a 7,5 ± 0,1 y la mezcla se incubó a 37ºC durante 20 a 30 días. Se tomaron muestras para ensayo de esterilidad y toxicidad.

(V): Purificación del toxoide

El toxoide concentrado se esterilizó a través de prefiltros, seguido de filtro de membrana de 0,2 μm. Se tomaron muestras para ensayos de esterilidad y contenido en Lf.

La concentración óptima de sulfato amónico se basó en un fraccionamiento. Se determinó la curva “S” de las muestras del toxoide. La primera concentración se añadió al toxoide (diluida entre 1.900 y 2.100 Lf/ml). La mezcla se mantuvo durante por lo menos 1 hora entre 20ºC y 25ºC y se recogió el sobrenadante y se descartó el precipitado que contenía la fracción de alto peso molecular.

Se añadió una segunda concentración de sulfato amónico al sobrenadante para el segundo fraccionamiento para eliminar las impurezas de bajo peso molecular. La mezcla se mantuvo durante al menos 2 horas entre 20ºC y 25ºC y a continuación pudo mantenerse entre 2ºC y 8ºC durante un máximo de tres días. El precipitado que representa el toxoide purificado, se recolectó por centrifugación y filtración.

Se eliminó el sulfato amónico de la vacuna purificada por filtración por diálisis, utilizando membranas de ultrafiltración Amicon (o equivalentes) con PBS hasta que no pudo detectarse más sulfato amónico en la solución de la vacuna. Se ajustó el pH entre 6,6 y 7,6, y se añadió 2-fenoxietanol hasta dar una concentración final de 0,375%. Se esterilizó la vacuna por filtración en membrana, y se tomaron muestras para ensayo (irreversibilidad de la vacuna, contenido en Lf, pH, contenido en conservante, pureza, esterilidad y toxicidad).

Una formulación de una vacuna contra la tos ferina de componente combinada con toxoides diftérico y tetánico se denominó CP10/5/5/3DT. Cada dosis humana de 0,5 ml de CP10/5/5/3DT se formuló para contener:

Otra formulación de la vacuna contra la tos ferina de componente combinada con toxoides diftérico y tetánico se denominó CP10/5/5DT. Cada 0,5 ml de dosis humana de CP10/5/5DT se formuló para que contenga:

10 μg Toxoide de la tos ferina (PT) 5 μg Hemoaglutinina filamentosa (HAF) 5 μg Aglutinógenos 2 y 3 fimbriales (FIMB) 15 Lf Toxoide diftérico 5 Lf Toxoide tetánico 1,5 mg Fosfato de aluminio 0,6% 2-fenoxietanol, como conservante Otra formulación de la vacuna contra la tos ferina de componente combinada con toxoides diftéricos y tetánicos se denominó CP20/20/5/3DT. Cada 0,5 ml de dosis humana de CP20/20/5/3DT se formuló para que contenga:

20 μg Toxoide de la tos ferina (PT) 20 μg Hemoaglutinina filamentosa (HAF) 5 μg Aglutinógenos fimbriales 2 y 3 (FIMB) 3 μg Proteína de la membrana externa de 69 kDa 15 Lf Toxoide diftérico 5 Lf Toxoide tetánico 1,5 mg Fosfato de aluminio 0,6% 2-fenoxietanol, como conservante

Otra formulación de la vacuna contra la tos ferina de componente combinada con toxoides diftéricos y tetánicos se denominó CP20/10/10/6DT. Cada 0,5 ml de dosis humana de CP20/10/10/6DT se formuló para que contenga:

20 μg Toxoide de la tos ferina (PT) 10 μg Hemoaglutinina filamentosa (HAF) 10 μg Aglutinógenos 2 y 3 fimbriales (FIMB) 6 μg Proteína de la membrana externa de 69 kDa 15 Lf Toxoide diftérico 5 Lf Toxoide tetánico 1,5 mg Fosfato de aluminio 0,6% 2-fenoxietanol, como conservante

Ejemplo 6

Este ejemplo describe la evaluación clínica de vacunas contra la tos ferina de componente acelular, producidas según la invención.

(a) Estudios en adultos

Los estudios en adultos y niños de 16 a 20 meses de edad indicaban que las vacunas multicomponentes que contenían aglutinógenos fimbriales son seguras e inmunógenas (Tabla 2).

Se realizó un estudio clínico en Fase I en niños de 17 y 18 meses de edad en Calgary, Alberta con la vacuna contra la tos ferina de cinco componentes (CP10/5/5/3DT) y la reacción adversa indicada. Treinta y tres niños recibieron la vacuna y además 35 recibieron la misma vacuna sin el componente de la proteína de 69 kDa.

Las reacciones locales son raras. Las reacciones generalizadas desfavorables, que consisten principalmente en irritabilidad estaban presentes en aproximadamente la mitad de los participantes en el estudio, independientemente de la vacuna que se administró. Se midieron aumentos de anticuerpos significativos para aglutinógenos anti-PT, anti-FHA y antifimbriales y anticuerpos de IgG anti-69 kDa por inmunoanálisis enzimático y anticuerpos anti-PT en el ensayo de neutralización de células CHO. No se detectaron diferencias en la respuesta al anticuerpo de los niños que recibieron los cuatro componentes (CP10/5/5DT) o cinco componentes (CP10/5/5/3DT) excepto en el anticuerpo anti69 kDa. Los niños que recibieron la vacuna de cinco componentes que contenía la proteína de 69 kDa presentaban un nivel de anticuerpos anti-69 kDa después de la inmunización significativamente mayor.

Se realizó un estudio de respuesta a la dosis con la vacuna de 4 componentes en Winnipeg, Manitoba, Canadá. Se utilizaron formulaciones de vacuna de dos componentes: CP10/5/5/3DT y CP20/10/10/6DT. Se incluyó también como referencia una vacuna de DPT de células completas.

Este estudio fue un estudio doble a ciegas en 91 lactantes de 17 a 18 meses de edad al tiempo de dosis de refuerzo contra la tos ferina. Tanto CP10/5/5/3DT como CP20/10/10/6DT fueron bien tolerados por estos niños. No se demostraron diferencias en el número de niños que presentaba reacción local, o reacciones generalizadas después de ambas vacunas del componente. En comparación, significativamente más niños que recibieron la vacuna de células completas presentaban reacciones locales y generalizadas que aquellos que recibieron las vacunas del componente CP20/10/10/6DT.

Estudios en niños

Fase II

Se realizó un estudio utilizando la vacuna de CP10/5/5/3DT en Calgary, Alberta y British Columbia, Canada. En este estudio, 432 lactantes recibieron la vacuna contra la tos ferina del componente o la vacuna DPT de referencia de células completas a los 2, 4 y 6 meses de edad. La vacuna de CP10/5/5/3DT fue bien tolerada por estos lactantes. Las reacciones locales fueron menos frecuentes con la vacuna del componente que con la vacuna de células completas después de cada dosis.

Una respuesta al anticuerpo significativa para todos los antígenos se demostró después de la vacunación con la vacuna contra la tos ferina del componente. Los receptores de la vacuna de células completa tuvieron una respuesta vigorosa al anticuerpo contra los aglutinógenos fimbriales, D y T. A los siete meses, del 82% al 89% de los receptores de la vacuna del componente y el 92% de los receptores de la vacuna de las células completas presentaba un incremento de cuatro veces o aumento mayor en el valor de anticuerpo para los aglutinógenos fimbriales. En comparación, la respuesta del anticuerpo contra FHA fue del 75% al 78% en las vacunas del componente en comparación con el 31% de los receptores de células completas. Se observó un aumento de cuatro veces en el anticuerpo anti-69 kDa en el 90% al 93% de los receptores de la vacuna del componente y el 75% de los de las células totales. Un aumento de cuatro veces en el anticuerpo contra PT por inmunoanálisis enzimático se observó en el 40% al 49% de las vacunas del componente y el 32% de las vacunas de células completas; un aumento de cuatro veces en el anticuerpo PT por neutralización de CHO se observó en el 55% al 69% de las vacunas del componente y el 6% de las vacunas de células completas (Tabla 2).

Fase II B

Se evaluaron las vacunas de CP20/20/5/3DT y de CP10/10/5/3DT en un estudio a ciegas al azar frente a una referencia de D15PT con un contenido en difteria de 15 Lf menor en comparación con una formulación de 25 Lf de 100 lactantes a los 2, 4 y 6 meses de edad. No se detectaron diferencias en las cantidades de reacciones adversas entre las formulaciones de dos componentes; ambas eran significativamente menos reactógenas que la referencia de células completas. Los valores de anticuerpo mayores frente a PT por inmunoanálisis enzimática y neutralización de CHO y FHA se consiguieron en los receptores de la vacuna con CP20/20/5/3DT con un contenido aumentado en antígenos. A los 7 meses, el valor de la media geométrica de anti-FHA fue de 95,0 en los receptores de CP20/20/5/3DT, 45,2 en los receptores de CP10/15/5/3DT y fueron solamente de 8,9 en los receptores de D15PT. Los valores anti-PT fueron de 133,3, 58,4 y 10,4 por inmunoanálisis y de 82,4, 32,7 y 4,0 por neutralización de CHO respectivamente (Tabla 2).

El estudio demostró que la vacuna contra la tos ferina del componente combinada con los toxoides diftérico y tetánico adsorbidos, con un contenido aumentado del antígeno, era segura e inmunógena en lactantes y que el contenido en antígeno aumentado, aumentó la respuesta unitaria a los antígenos (PT y FHA) preparados sin aumento en reactogenicidad.

Ensayo comparativo en Fase II, NIAID, USA.

Se realizó un estudio en fase II en USA bajo los auspicios del National Institute of Allergy and InfectiOus Diseases (NIAID) como preludio a una prueba de eficacia a gran escala de las vacunas contra la tos ferina acelulares. Una vacuna contra la tos ferina de un componente de la invención en combinación con los toxoides diftérico y tetánico adsorbió (CP10/15/5/3DT) y se incluyó en esta prueba junto con otras 12 vacunas acelulares y 2 vacunas de células completas. Los resultados de seguridad se publicaron sobre 137 niños inmunizados a los 2, 4 y 6 meses de edad con la vacuna del componente CP10/15/5/3DT.

Como se aprecia en los estudios anteriores, la vacuna del componente se observó que era segura, de baja reactogenicidad y que era bien tolerada por las vacunas.

A los 7 meses, el anticuerpo anti-PT, el anticuerpo anti-FHA y el anticuerpo anti-69 kDa y el anticuerpo con aglutinógenos antifimbriales eran todos mayores o equivalentes a las concentraciones conseguidas después de las vacunas con células completas (ref. 71 y Tabla 2). Se realizó un estudio doble a ciegas en el que los niños fueron situados al azar para recibir bien la formulación de vacuna CP20/20/5/3DT o la CP10/15/5/3DT. Se inscribieron un total de

2.050 lactantes en USA y Canadá; 1961 lactantes completaron el estudio. Ambas formulaciones de la vacuna eran seguras, de baja reactogenicidad e inmunógenas en estos lactantes. Se evaluó la inmunogenicidad en un subgrupo de 292. Se produjo un aumento de anticuerpo en todos los antígenos contenidos en la vacuna por ambas formulaciones de la vacuna. La formulación de CP20/20/5/3DT produjo valores mayores de anticuerpo contra FHA pero no contra PT. La formulación CP10/15/5/3DT produjo valores mayores contra el aglutinógeno de las fimbrias y los valores de aglutinógeno mayores.

Una seguridad adicional y un estudio de inmunogenicidad se realizaron en Francia. El diseño del estudio fue similar al estudio de Norteamérica, descrito anteriormente, excepto que se administraron vacunas a los 2, 3 y 4 meses de edad. Las reacciones locales y generalizadas fueron generalmente menores. En general la vacuna fue mejor aceptada por los participantes en el estudio francés utilizando este régimen de administración.

Prueba de eficacia controlada con placebo de dos vacunas antitosferínicas acelulares y de una vacuna de células completas en 10.000 lactantes

Siguiendo los resultados de la prueba comparativa de USA en fase II NIAID, se seleccionaron vacunas acelulares de dos componentes y de cinco componentes para una prueba de eficacia multicentro, controlada por placebo doble al azar. La prueba clínica se realizó en Suecia, donde existe una alta incidencia de tos ferina. La vacuna de dos componentes contenía gliceraldehído y PT inactivada por fomalina (25 μg), FHA tratado con formalina (25 μg) y 17 Lf del toxoide diftérico y 10 Lf del toxoide tetánico. La vacuna contra la tos ferina de cinco componentes fue CP10/5/5/3DT. Para la prueba, diez mil lactantes, que representan, aproximadamente la mitad de los lactantes de este grupo de edad en Suecia, se inscribieron en 14 lugares del estudio definidos geográficamente mediante la utilización de la partida de nacimiento.

Los niños nacidos en enero y febrero de 1992 se seleccionaron al azar en una prueba de 3 ramas. Después del consentimiento paterno, dos tercios de los lactantes recibieron una de cada dos preparaciones antitosferínicas acelulares contra la difteria y el tétanos a los dos, cuatro y seis meses de edad. El grupo de referencia recibió solamente DT. En mayo de 1992, se introdujo una vacuna DTP de células completas comercializada autorizada en USA y los niños nacidos en marzo hasta diciembre de 1992 se sometieron al azar en una prueba de 4 ramas. Después del consentimiento paterno, las tres cuartas partes de los lactantes recibieron una de cada tres preparaciones de DPT a los dos, cuatro y seis meses de edad. El grupo de referencia recibió solamente DT.

Cada vacuna se administró a aproximadamente 2.500 niños. Las vacunas se administraron en tres dosis. La primera dosis se administró a los 2 meses de edad y no después de los 3 meses de edad. Se administraron dosis posteriores con intervalo de 8 semanas. Las vacunas se administraron por inyección intramuscular.

Se realizó un seguimiento durante 30 meses a los niños y a sus grupos familiares. Si había indicios de tos ferina, se recogían los datos clínicos y la verificación en el laboratorio se investigaba mediante aspiraciones nasales para cultivo bacteriológico y diagnóstico por reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Se recogieron las muestras de sangre de enfermos en fases aguda y convaleciente para el diagnóstico serológico.

Antes de este estudio, se desconocía el alcance de la protección proporcionada por vacunas contra la tos ferina de un componente de la presente invención en una población humana en situación de riesgo (particularmente recién nacidos). En particular, la contribución de varios componentes de Bordetella y su presencia en las vacunas contra la tos ferina en cantidades relativas seleccionadas para la eficacia de las vacunas resultaba desconocida.

El principal objetivo de la prueba consistió en estimar la capacidad de las vacunas contra la tos ferina acelulares y de la vacuna de células completas para proteger contra la tos ferina típica en comparación con el placebo.

Un punto final secundario consistió en explorar la eficacia de la vacuna contra la infección de la tos ferina confirmada de gravedad variable.

La eficacia de la vacuna se define como el tanto por ciento de reducción en la probabilidad de contraer tos ferina entre receptores de la vacuna en relación con los niños sin vacunar.

El riesgo relativo de tos ferina en dos grupos de vacuna se expresa como la relación de la probabilidad de la enfermedad en los dos grupos.

La probabilidad de contraer tos ferina, denominada también la frecuencia del ataque, puede estimarse de diferentes maneras. En los cálculos del tamaño de la muestra, la probabilidad de contraer tos ferina en un grupo de estudio dado se estima por el cociente entre el número de niños con tos ferina y los niños que permanecen en el grupo de estudio a la terminación del seguimiento del estudio.

La eficacia del componente CP10/5/5/3DT de la vacuna en esta prueba para prevenir la tos ferina típica se representa en la Tabla 4 y fue de aproximadamente 85%. En la misma prueba una vacuna acelular de tos ferina de dos componentes que contenía solamente TP y FAH fue aproximadamente 58% eficaz y una vacuna de células completas fue solamente 48% eficaz. La CP10/5/5/3DT fue también eficaz para prevenir la tos ferina leve en una eficacia estimada de aproximadamente el 77%.

Las preparaciones de vacunas son seguras, no reactógenas, inmunógenas y protectoras en los seres humanos.

Tabla 1. Vacunas contra la tos ferina acelulares 20

Vacuna: PT Agente toxoideo HAF P.69 AGG2 AGG3 Referencia

AMVC: + H2O2 a - - - - 62

Masa PHLd: + TMNc - - - - 63

Instituto Merieux: + Gld + - - - 64

Smith-Kline: + + Fle/Gl Fl/Gl + + -+ -- -- 32 32

CAMRf: + Fl + - + + 65

Lederle/Fakeda: + Fl + + + - 66

Connaught: + Gl + - + + 32

+: Gl + + + + 67

a Peróxido de hidrógeno inactivado. b Massachusetts Public Health Laboratories. c TNM, tetranitrometano inactivado. d GI, glutaraldehído inactivado. e FI, formalina inactivada. f Centro de Microbiología Aplicada e Investigación.

Tabla 2

Respuestas del anticuerpo de IgG al antígeno de la tos ferina y a los toxoides diftérico y tetánico en adultos y niños después de (inmunización con placebo o toxoides de la tos ferina acelular (AP), difteria-tétanos-tos ferina (DTP) o multicomponente acelular DTP (ADTP)

Adultos

Niños Antes de la inmunización

Después de la inmunización día 28 Antes de la inmunización Después de la inmunizaciónPlacebo Placebo DTP ADTP DTP

ADTP CP10/10/5/3 DT

AP CP10/5/5/3

CP10/10/5/3 DT

Toxoide de la tos 16,4522,7816,56

415,87

43,7115,45221,32306,55ferina (9,46-28,62) (12,11·42,86) (9,0-30,22)

(243,91-709,09)

(14,29·133,88) (8,30-28,10) (99,0,490:67)

(155,84,-603,03) Hemoaglutinina

15,2423,5913,36

317,37

2,933,8630,0629,86filamentosa (10,28-22,60) (13,39·33,69) (7,71-23,16)

(243,03·141,41)

(1,81-4,73) (3,03-4,93) (11,82-76,46)

(16,31-53,99)Aglutinógeno

21,2628,6427,0

2048,00

26,7229,24315,21243,3(12,10,37,23) (12,20-67,21) (15,37-47,78)

(1025,62-4089,55 )

(16,94-42,15) (13,63-62,75) (127,4-779,9)

(594,8,2603,3)Pertactina

7,8911,477,46

855,13

6,549,4560,1 3116,16(4,00-13,56) (6,41-20,55) (3,51-15,87)

(396,41-1844,67)

(2,79-15,33) (5,50-16,23) (24,59-147,04)

(57,97-233,19)Ensayo de

12,3021,1110,78

604,67

27,479,71270,60342,51neutralización de (6,97,21,68) (10,33-43,06) (5,54-20,97)

(403,82-405,41),

(7,36-102,62) (4,71,20,03) (24,6-1100,8) (146,6-800,2) células de CHO Toxoide diftérico <0,1 <0,1 <0,1

<0,1

<0,1 <0,1 8,759,65(6,52-23,92)

(5,62-16,57)Toxoide tetánico

<0,1 <0,1 <0,1

<0,1

<0,1 <0,1 4,116,32 (3,20-5,28)

(5,31-7,53)nº estudiado

16 15 16

15

10 23 12 25

Los datos se expresan como media geométrica en intervalos de confianza del 95%. Para el toxoide de la tos ferina, la hemoaglutinina filamentosa, los aglutinógenos, laperctactina y los toxoides diftérico y tetánico, los títulos de anticuerpos se expresan en unidades de ELISA/nl. Para el ensayo de neutralización de células CHO, los valoresreflejan la dilución mayor que demuestra el 80% de neutralización.

Tabla 3. Resultados serológicos de vacunas contra la tos ferina acelulares en lactantes (2, 4 y 6 meses de edad)

Prueba clínica: Valores geométricos medios “

Producto: Estudio nº departicipantes PT FHA 69kDa Aglutinógenos fimbriales Neutralización de lascélulasde CHO Aglutinación Tét Dif

1: CP10/5/5DTCP10/5/5/3DTCélula completa(Mass.)Célula completa(Lederle) Estudio comparativo multicentro del US NIAID (Ciclo 1) 10811395312 38362067 3736513 311310164 22924170193 16015080270 85734284 7,85,0-- 0,80,4--

2: CP10/5/5/3DTCélula completa (CLL) Fase II Canada 315101 87,120 50,24,7 29,96,4 239,8603,2 29,62,6 -- 1,51,2 0,30,4

3: CP10/5/5/3DTCP10/10/5/3DTCélula completa (CLL) Fase HB Canada 323330 58,4133,310,4 45,295,08,9 40,637,16,8 111,4203,8393,9 32,782,44,0 - 1,01,11,8 0,140,210,31

4: CP10/5/5/3DTCP20/20/5/3DT Fase IIC Canada 42250 105,1101,6 82,5163,9 71,187,6 358,6220,6 66,968,7 307,0219,2 2,01,8 0,330,38

5: CP20/20/5/3DTCélula completa (CLL) Estudio de viabilidad de Montreal 5858 212,7101,4 83,411,7 106,316,8 601,9906,9 109,66,0 1,91,1 0,530.27

6: CP10/5/3DT . CP20/20/5/3DTCélula completa (CLI) Célula completa(Lederle) Estudio comparativo del US NIAID (Ciclo II) 80808080 4239218 348732 5043916 310843329 19625454137 18513716786 - -

CI.I - Connaught Laboratories Incorporated, Swiftwater, Pennsylvania. CI.L. Connaught Laboratories Limited, Willowdale, Ontario. Mass - Massachusetts Public Laboratories.Lederle - Lederle Laboratories Inc.

2 Tabla 4 - Eficacia de vacunas contra la tos ferina acelulares

Vacuna Eficacia %

A B CP10/5/5/3DT 84,7 (80,3 → 88,5)1 77 PT25 - FHA25DT 58 (49,8 → 64,8)1 DPT2 47,9 (37,1 → 56,9)1

A: definición del caso: Tos espasmódica de 21 días y cultivo positivo

B: definición del caso: Tos de tos ferina leve de por lo menos un día Nota 1: Límites de confianza Nota 2: Vacuna contra la tos ferina de células completas

Referencias

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25

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Utilización de la forma purificada de toxoide de la tos ferina, hemoaglutinina filamentosa, pertactina y aglutinógenos fimbriales de B. pertussis en la elaboración de una preparación de vacuna de combinación contra la enfermedad causada por B. pertussis, para la administración a una población humana en situación de riesgo de enfermedad causada por B. pertussis para proporcionar protección contra la enfermedad causada por B. pertussis en la que cada dosis humana única de la preparación de vacuna contiene los antígenos de tos ferina siguientes, a saber de 5 a 30 μg de nitrógeno de dicho toxoide de la tos ferina, 5 a 30 μg de nitrógeno de dicha hemoaglutinina filamentosa, 3 a 15 μg de nitrógeno de pertactina, y 1 a 10 μg de nitrógeno de aglutinógenos fimbriales 2 (Agg2) y 3 (Agg3) y en la que la relación en peso de Agg2 a Agg3 es de 1,5:1 a 2:1 y en la que dicha preparación de vacuna proporciona dicha protección contra la enfermedad causada por B. pertussis en por lo menos el 70% de los miembros de una población en situación de riesgo que se puede determinar por un ensayo de eficacia clínica y en la que dicha vacuna está sustancialmente exenta de aglutinógeno 1 fimbrial.
2.

Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha preparación de vacuna contiene por lo menos un inmunógeno distinto de Bordetella.
3.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha preparación de vacuna contiene:

(a)

10 μg de nitrógeno de toxoide de la tos ferina, 5 μg de nitrógeno de hemoaglutinina filamentosa, 3 μg de nitrógeno de aglutinógenos y 5 μg de nitrógeno de pertactina en una dosis humana única; o

(b)

20 μg de nitrógeno de toxoide de la tos ferina, 20 μg de nitrógeno de hemoaglutinina filamentosa, 3 μg de nitrógeno de aglutinógenos y 5 μg de nitrógeno de pertactina en una dosis humana única.
4.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la extensión de la protección es de por lo menos 80% para un caso de tos ferina que presenta una tos espasmódica de una duración de por lo menos 21 días y una infección bacteriana confirmada.
5.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la extensión de la protección es de por lo menos 70% para un caso de tos ferina leve que presenta una tos de por lo menos un día de duración.
6.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha preparación de vacuna incluye un adyuvante.

26 27