ES2360331A1 - Saponinas triterpénicas procedentes del cormo de crocus sativus como adyuvante en formulaciones de vacunas proteicas. - Google Patents
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Abstract
Saponinas triterpénicas procedentes del cormo de Crocus Sativus como adyuvante en formulaciones de vacunas proteicas.La presente invención se refiere a unas nuevas saponinas triterpénicas procedentes del cormo del azafrán (Crocus sativus L.), a una composición que las comprende, a su uso como sustancias adyuvantes en vacunas proteicas así como en la elaboración de medicamentos, preferiblemente para el tratamiento del cáncer y más preferiblemente para el tratamiento del carcinoma cervical, y a un método de obtención de las mismas. El empleo de estas saponinas triterpénicas como adyuvantes en vacunas deriva en una respuesta inmune incrementada, funcional y duradera frente al antígeno, superior a la de otras sustancias con capacidad inmunopotenciadora tales como las sales de aluminio, IFA (adyuvante incompleto de Freund), CpG (secuencias cortas de DNA bacteriano de citosina, fosfato y guanina) e incluso otras saponinas como QuilA, sin presentar los efectos adversos que habitualmente se observan bajo la administración de estos otros adyuvantes.
Description
Saponinas triterpénicas procedentes del cormo de
Crocus sativus como adyuvante en formulaciones de vacunas
proteicas.
La presente invención se encuadra en el campo de
la inmunología y de la farmacia, y específicamente se refiere a
unas nuevas saponinas triterpénicas procedentes del cormo del
azafrán (Crocus sativus L.), a una composición que las
comprende, a su uso como sustancias adyuvantes en vacunas proteicas
y a un método de obtención de las mismas. El empleo de estas
saponinas triterpénicas como adyuvantes en vacunas deriva en una
respuesta inmune incrementada, funcional y duradera frente al
antígeno.
Crocus sativus o azafrán es una planta
conocida por sus estigmas desecados ya que éstos constituyen una de
las especias más caras del mundo (también conocida como azafrán). A
pesar de los muchos estudios científicos que se han realizado con
los estigmas, debido a su alto valor agronómico, pocos estudios se
han llevado a cabo en otras partes de la planta. Dentro de estos
pocos, en el cormo de azafrán (el órgano reproductivo de esta
planta) se ha descrito la presencia de una fracción cromatográfica
en fase reversa (C4), que además de presentar actividad antitumoral
contra varias líneas celulares provoca, como se ha determinado en
otros estudios, la activación de macrófagos mediante liberación de
óxido nítrico (NO) bajo dosis no tóxicas. En un primer momento, la
bioactividad se atribuyó a la presencia de un proteoglicano en esta
fracción (Escribano, et al., Planta Médica, 2000,
66(2):157-62). Posteriormente, se demostró
que esta fracción estaba compuesta por un 5% de proteínas y un 95%
de saponinas triterpénicas.
Actualmente, existe en el campo de la
inmunología un interés creciente en la búsqueda de nuevas sustancias
con actividad adyuvante/inmunopotenciadora. Los adyuvantes son
sustancias que, usadas en combinación con el antígeno vacunal,
logran superar los niveles de inmunidad alcanzados con el empleo del
antígeno solo. Los adyuvantes, por tanto, son sustancias o
preparados químicos que, incorporados al antígeno o inyectados
simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Por
lo que gracias a su empleo se logra una economía de antígeno y de
tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos.
Los avances experimentados en la última década
en la síntesis de péptidos, la secuenciación de nucleótidos y la
ingeniería genética han posibilitado el desarrollo de las
denominadas "vacunas de nueva generación"; sin embargo, la
aplicación exitosa de estas nuevas vacunas requiere de un esfuerzo
de investigación sostenido encaminado a descubrir sustancias con
actividad inmunopotenciadora (adyuvantes), eficaces en la
estimulación de la respuesta inmune y desprovistas de propiedades
biológicas adversas (Grupta, et al., 1993, Vaccine,
11:293-306), ya que en la mayoría de los casos su
inclusión en la vacuna es indispensable para lograr niveles
significativos de respuestas inmunes específicas de antígeno.
Desde el punto de vista de su origen, naturaleza
química y actividad biológica específica, los adyuvantes
constituyen una familia muy heterogénea de compuestos, a los que se
les atribuyen funciones fundamentales:
- 1.
- La estimulación de la resistencia no específica del huésped contra las enfermedades infecciosas y el cáncer; y,
- 2.
- La potenciación de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de laboratorio durante la inmunización experimental con vistas a la producción de antisueros.
Respecto al mecanismo de acción de estas
sustancias, es muy variado, siendo uno de los más importantes el
llamado "efecto depot", por el que los adyuvantes de aluminio,
las emulsiones oleosas y los liposomas o microesferas mantienen el
antígeno atrapado en el sitio de la administración, impidiendo su
liberación masiva y permitiendo un estímulo inmune prolongado.
Las investigaciones realizadas han demostrado
que virtualmente todos los adyuvantes activan los macrófagos
(Guerrero & Gattas, 1982, Revista de Microbiología,
13(2):110-115); que al ser activados
estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de
antígeno expresado en la membrana celular y de la eficiencia de su
presentación a los linfocitos. El macrófago también libera factores
solubles estimulantes, que amplifican la proliferación de los
linfocitos. Por otro lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de
actuar específicamente sobre los linfocitos; pero, en general,
éstos funcionan mejor si facilitan la liberación simultánea del
antígeno y de sustancias inmunomoduladoras al tejido linfoide.
El número de productos naturales y derivados de
la síntesis química con propiedades
adyuvantes/inmunopotencia-
doras es cada vez mayor. Sin embargo, sigue siendo necesario encontrar una sustancia con una adecuada relación eficiencia/seguridad. Así, aunque se conoce que los adyuvantes completo e incompleto de Freund (FCA y FIA) presentan una marcada toxicidad, han sido utilizados durante más de 50 años y aún son empleados con frecuencia en el campo de la investigación cuando se dispone de cantidades limitadas de antígenos o cuando éstos presentan una reducida inmunogenicidad (US 2003124709 A1). Para las vacunas veterinarias, los adyuvantes más ampliamente utilizados son las emulsiones de aceite mineral (del tipo aceite en agua o agua en aceite) (US 5109026 A), que si bien inducen una fuerte respuesta inmune presentan efectos no deseados, y las sales de aluminio (hidróxido y fosfato de aluminio) (US 2009/0202590 A1). También se emplean liposomas, la toxina colérica, la vitamina E, los complejos inmunoestimulantes (ISCOM_{s}), el monofosforil-lípido A derivado de bacterias o las saponinas, como QuilA o QS21, o incluso una combinación de estos dos últimos (US 7147862 B1), así como diferentes emulsiones de aceites de origen vegetal o animal.
doras es cada vez mayor. Sin embargo, sigue siendo necesario encontrar una sustancia con una adecuada relación eficiencia/seguridad. Así, aunque se conoce que los adyuvantes completo e incompleto de Freund (FCA y FIA) presentan una marcada toxicidad, han sido utilizados durante más de 50 años y aún son empleados con frecuencia en el campo de la investigación cuando se dispone de cantidades limitadas de antígenos o cuando éstos presentan una reducida inmunogenicidad (US 2003124709 A1). Para las vacunas veterinarias, los adyuvantes más ampliamente utilizados son las emulsiones de aceite mineral (del tipo aceite en agua o agua en aceite) (US 5109026 A), que si bien inducen una fuerte respuesta inmune presentan efectos no deseados, y las sales de aluminio (hidróxido y fosfato de aluminio) (US 2009/0202590 A1). También se emplean liposomas, la toxina colérica, la vitamina E, los complejos inmunoestimulantes (ISCOM_{s}), el monofosforil-lípido A derivado de bacterias o las saponinas, como QuilA o QS21, o incluso una combinación de estos dos últimos (US 7147862 B1), así como diferentes emulsiones de aceites de origen vegetal o animal.
Respecto a la selección de adyuvantes para
vacunas de uso humano, el criterio más importante es la bioseguridad
y, en la práctica, los compuestos de aluminio son los más
empleados. Otros compuestos empleados son los polisacáridos
naturales y algunos derivados obtenidos por hidrólisis o
modificación química, como los glucanos aislados de la pared
celular de levaduras, el J-carragenano y el sulfato
de dextrano.
Los adyuvantes se pueden clasificar como
inmunoestimuladores, los cuales presentan un efecto estimulador
directo sobre las células del sistema inmune, o como
"vehículos", si funcionan como portadores que facilitan el
transporte y presentación del antígeno al sistema inmune.
Adicionalmente, algunos adyuvantes pueden funcionar por una
combinación de estos mecanismos. Los adyuvantes específicos se
pueden utilizar para conducir una respuesta inmune hacia una
característica particular deseada. Teóricamente, se han establecido
dos tipos principales de mecanismos inmunes efectores. Uno es una
respuesta predominantemente humoral, caracterizada por la generación
de citoquinas y anticuerpos de tipo Th2; y el otro es una respuesta
inmune predominantemente mediada por células, caracterizada por la
generación de citoquinas de tipo Th1 y de células T citotóxicas. Sin
embargo, en la práctica lo que se observa generalmente es un
equilibro entre los dos tipos de respuesta, describiéndose cualquier
respuesta dada como predominantemente humoral (tipo Th2) o como
predominantemente mediada por células (tipo Th1). Así, para
cualquier patógeno particular, si se desea que una vacuna induzca
una respuesta inmune de tipo Th1 predominantemente, entonces la
vacuna debería formularse con un adyuvante conocido que induzca
respuestas tipo Th1. Uno de los adyuvantes que se conoce por
inducir un equilibrio entre las respuestas inmunes humoral y
mediada por células, que puede incluir una potente respuesta mediada
por células y también una potente respuesta humoral, son las
saponinas procedentes de Quijalla saponaria. La fracción
QS21, derivada de la mezcla de saponinas QuilA, es la fracción de
saponinas de Q. saponaria más conocida y ampliamente
utilizada como adyuvante en la preparación de vacunas (US 5057540
A).
Se ha demostrado que QS21 induce citoquinas Th1
y anticuerpos de isotipo IgG2a en ratones, lo cual es consistente
con una respuesta de tipo Th1. Las saponinas se integran en las
membranas celulares a través de su interacción con el colesterol,
resultando en la formación de poros por donde el antígeno puede
entrar. Posteriormente, los péptidos de esos antígenos pueden ser
procesados y presentados vía complejo mayor de histocompatibilidad
clase I (MHC-I), estimulando de esta manera una
respuesta de linfocitos T CD8+ citotóxicos. QuilA y sus derivativos
QS21 han sido ampliamente usados en vacunas veterinarias y evaluados
en ensayos clínicos. De esta manera, QS21 ha sido incluido como
adyuvante en formulaciones contra el HIV en cobayas y humanos,
cáncer en humanos, malaria en micos Aotus y ratones, virus
respiratorio sincitial (respiratory syncytial virus),
citomegalovirus, Toxoplasma gondii y leishmaniasis visceral
en perros y ratones. Ensayos clínicos en HIV-1,
influenza, herpes y hepatitis B también se han llevado a cabo
utilizando QS21. Finalmente, las saponinas de Q. saponaria
también han sido usadas en formulaciones adyuvantes tales como los
complejos inmunoestimulatorios o ISCOMs.
Sin embargo, a pesar de su efectiva capacidad
adyuvante, el uso de QS21 tiene serias limitaciones debido a sus
efectos adversos: dolor severo en el lugar de la inyección,
formación de granulomas y toxicidad reflejada en altos niveles de
hemólisis de eritrocitos (RBC), principales desventajas que hacen
que QS21 aún no pueda ser usado ampliamente y con confianza en el
desarrollo de vacunas humanas profilácticas o terapéuticas. Por
esta razón es de gran importancia la búsqueda de nuevas saponinas
con efectos adyuvantes tan o mayores que los de las saponinas de
Q. saponaria, pero con reducidos o ningún efecto adverso
serio.
La presente invención proporciona una nueva
mezcla de saponinas triterpénicas procedentes del cormo del azafrán
(Crocus sativus L.), que pueden ser usadas como sustancias
adyuvantes en vacunas proteicas, así como un método de obtención de
las mismas. El empleo de estas saponinas triterpénicas como
adyuvantes en vacunas deriva en una respuesta inmune incrementada,
funcional y duradera frente al antígeno.
Se ha detectado en la zona externa o epidermis
del cormo del azafrán la presencia de una mezcla de diferentes
saponinas triterpénicas, denominada CS5. Los inventores han
optimizado el proceso de extracción de CS5, de manera que este
producto se ha obtenido puro y libre de proteínas. CS5 posee
actividad citotóxica frente a células tumorales, presentando una
IC_{50} de 24 \mug/mL, al igual que su fracción cromatográfica
mayoritaria, CS5-1, cuya IC_{50} es de 9
\mug/mL. Esta fracción CS5-1 representa
aproximadamente el 70% (m/m) del total de las saponinas de la
mezcla CS5 y comprende Azafrina 1 y Azafrina 2.
Por otro lado, cuando CS5 es administrado al
organismo junto con un antígeno, se puede observar que esta mezcla
de saponinas presenta una actividad adyuvante superior a la de otras
sustancias con capacidad inmunopotenciadora tales como las sales de
aluminio, IFA (adyuvante incompleto de Freund), CpG (secuencias
cortas de DNA bacteriano de citosina, fosfato y guanina) e incluso
otras saponinas como QuilA, que se manifiesta a través de un
incremento significativo de los niveles de anticuerpos y de
linfocitos específicos de antígeno y de la inducción no sólo de la
respuesta inmune de tipo Th1, sino también de la de tipo Th2.
Además, la administración del adyuvante CS5 no provoca los efectos
adversos derivados del empleo de otras saponinas como QuilA, lo que
supone que CS5 es inmunoestimulante a dosis que se encuentran
dentro del rango de dosis no tóxicas, permitiendo así su uso como
adyuvante sin ningún riesgo de producir la hemólisis que acompaña al
empleo de otras saponinas. Este efecto adyuvante de CS5 no se
limita exclusivamente a incrementar la respuesta inmune en un corto
período de tiempo después de aplicar la vacuna, sino que también
posee la capacidad de generar respuestas inmunológicas duraderas
que pueden ser re-potenciadas con una futura
exposición al antígeno.
Otra de las ventajas asociadas a CS5, es que su
localización tisular posibilita la utilización de cormos en
dormancia con pesos menores a 5 gramos, ya que su menor tamaño
implica una mayor superficie y por lo tanto un mayor rendimiento
para la extracción de las saponinas, los cuales son inviables en
campo ya que no generan flores y, por lo tanto, no son
seleccionados durante el tamizado de los mismos para su venta.
Además, la utilización de tierras de secano para la obtención de
cormos de pequeño tamaño para la extracción de CS5 podría suponer
un empuje en el sector agrícola, ya que debido a las restricciones
en el uso del agua se está produciendo un abandono forzado de estas
tierras.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se
refiere a un compuesto, de ahora en adelante "compuesto de la
invención", de fórmula general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
donde R_{1} se selecciona de
entre los siguientes
grupos:
y R_{2} representa el siguiente
grupo:
o cualquiera de sus isómeros o sus
sales.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, el isómero es el ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido,
que
corresponde al compuesto de fórmula general (I) cuando la sustitución en R_{1} es el primero de los dos grupos que es posible seleccionar para esa posición R_{1}. En otra realización preferida, el isómero es el ácido 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido, que
corresponde al compuesto de fórmula general (I) cuando la sustitución R_{1} es el segundo de los dos grupos que es posible seleccionar para esa posición R_{1}.
corresponde al compuesto de fórmula general (I) cuando la sustitución en R_{1} es el primero de los dos grupos que es posible seleccionar para esa posición R_{1}. En otra realización preferida, el isómero es el ácido 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido, que
corresponde al compuesto de fórmula general (I) cuando la sustitución R_{1} es el segundo de los dos grupos que es posible seleccionar para esa posición R_{1}.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición, de ahora en adelante "composición de la
invención", que comprende un compuesto de fórmula general (I) o
cualquiera de sus isómeros o sus sales. En una realización
preferida, el isómero es el ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
En otra realización preferida, el isómero es el ácido
3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
En una realización más preferida, la composición de la invención
comprende los isómeros ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-
(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido y ácido 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-
hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido y ácido 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-
hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
Preferiblemente, la composición de la invención
comprende la fracción CS5-1, y más preferiblemente
la composición de la invención comprende la fracción CS5. La
fracción CS5 comprende, a su vez, derivados de los dos isómeros del
compuesto de la invención y la fracción CS5-1, y
esta última comprende ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido
y ácido
3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-
D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadeca-
noil]-\beta-D-fucopiranósido. La fracción CS5 puede obtenerse por el primer método de la invención que se explicará más adelante en la presente descripción.
D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadeca-
noil]-\beta-D-fucopiranósido. La fracción CS5 puede obtenerse por el primer método de la invención que se explicará más adelante en la presente descripción.
En la presente descripción se hará referencia al
isómero de fórmula química: ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido
como "Azafrina 1" y al isómero de fórmula química: ácido
3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galacto-
piranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-
ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido como "Azafrina 2". Estas dos saponinas bidesmosídicas son isómeros derivados del ácido equinocístico, cuya única diferencia es la presencia del ácido glucurónico o galacturónico en posición C3 del aglicón.
piranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-
ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido como "Azafrina 2". Estas dos saponinas bidesmosídicas son isómeros derivados del ácido equinocístico, cuya única diferencia es la presencia del ácido glucurónico o galacturónico en posición C3 del aglicón.
La caracterización de estos dos isómeros se
puede llevar a cabo por la separación de ambos a partir de la
composición de la invención, preferiblemente CS5-1
purificada a partir de CS5, mediante, por ejemplo, pero sin
limitarnos, cromatografía en capa fina o TLC y posterior análisis
estructural mediante, por ejemplo, pero sin limitarnos, la
combinación de espectrometría de masas
(GC-EI-MS, MALDI-TOF
y ESI-MS) y espectroscopía de resonancia molecular
(RMN incluyendo, pero sin limitarnos,
^{1}H-^{1}H TOCSY, ROESY,
^{1}H-^{13}C HSQC, gHSQCTOCSY, DEPT y HMBC).
Los datos espectrales de RMN de ambas saponinas, Azafrina 1 y
Azafrina 2, son los que se recogen en las tablas 1, 2 y 3 de los
ejemplos de la presente invención.
La Azafrina 1 es un sólido amorfo de color
blanco, cuyo punto de ablandamiento es 70-75ºC;
[\alpha]_{D}^{20} -62.5 (c 0.016, piridina);
TLC R_{f} = 0.80; MALDI-TOF-MS
m/z 1965.5 [M+Na]^{+} (MW 1942 Da); Modo
positivo ESI-MS m/z 1966.7
[C_{92}H_{198}O_{40}+Na]^{+}; ^{1}H y ^{13}C NMR
(piridina-d_{5}, 500 MHz/125 MHz) (Tablas 1 a 3 de los
ejemplos).
La Azafrina 2 es un sólido amorfo de color
blanco, cuyo punto de ablandamiento es 130-145ºC;
[\alpha]_{D}^{20} -12.9 (c 0.031, piridina);
TLC R_{f} = 0.71; MALDI-TOF-MS
m/z 1965.5 [M+Na]^{+} (MW 1942 Da); Modo
positivo ESI-MS (m/z): 1966.7
[C_{92}H_{198}O_{40}+Na]^{+}. ^{1}H y ^{13}C NMR
(piridina-d_{5}, 500 MHz/125 MHz) (Tablas 1 a 3 de los
ejemplos).
Así, la composición de la invención es,
preferiblemente, una mezcla de diferentes saponinas triterpénicas
derivadas principalmente del ácido equinocístico y minoritariamente
del ácido oleanólico. Preferiblemente, la composición de la
invención comprende CS5-1 y más preferiblemente
comprende CS5. El análisis estructural de CS5 se podría llevar a
cabo, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante
HPLC-ESI-MS, análisis de azúcares
por metanólisis y butanólisis por GC-MS y mediante
hidrólisis ácida de las saponinas y purificación de los aglicones
que a su vez pueden ser analizados, por ejemplo, pero sin
limitarnos, por RMN (Resonancia Magnética Nuclear) mediante
diferentes técnicas espectrales: 1D ^{1}H, TOCSY, ROESY, DEPC,
HSQC o HMBC. La fracción mayoritaria de CS5 es la denominada
CS5-1, de la que se pueden extraer la Azafrina 1 y
la Azafrina 2 una vez que ésta es purificada a partir de CS5
mediante, por ejemplo, pero sin limitarnos, un gradiente isocrático
con acetonitrilo, preferiblemente, al 40% de acetonitrilo y más
preferiblemente, al 40% de acetonitrilo con un 0,05% de ácido
trifluoroacé-
tico.
tico.
El compuesto y la composición de la invención
son útiles en la estimulación de la respuesta inmune del organismo
frente a un antígeno cuando son administradas junto con el mismo,
por lo que pueden ser aplicables en tratamientos de inmunización
frente a patógenos. El compuesto y la composición de la invención
presentan también actividad citotóxica frente a células tumorales,
incluyendo, aunque sin limitarnos, células HeLa, línea celular
procedente de un carcinoma cervical frecuentemente empleada en el
ámbito biomédico para ensayos de citotoxicidad en cáncer. Ya que el
compuesto y la composición de la invención presentan un efecto
inhibidor de la proliferación en células tumorales HeLa, éstos
pueden presentar asimismo efectos citotóxicos similares en la
proliferación de células derivadas de otros tipos de cáncer.
Por ello, otro aspecto de la invención se
refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de
un medicamento o, alternativamente, al compuesto de la invención
para su uso como medicamento. Otro aspecto de la invención se
refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de
un medicamento para el tratamiento del cáncer o, alternativamente,
al compuesto de la invención para su uso en el tratamiento del
cáncer. En una realización preferida, el cáncer es carcinoma
cervical. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del
compuesto de la invención como adyuvante para una vacuna.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de la composición de la invención para la elaboración de un
medicamento o, alternativamente, a la composición de la invención
para su uso como medicamento. Otro aspecto de la invención se
refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración
de un medicamento para el tratamiento del cáncer o,
alternativamente, a la composición de la invención para su uso en el
tratamiento del cáncer. En una realización preferida de este
aspecto de la invención, el cáncer es carcinoma cervical. Otro
aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la
invención como adyuvante para una vacuna.
Tal y como se emplea en la presente descripción,
el término "adyuvante" se refiere a cualquier sustancia con
actividad inmunopotenciadora cuya finalidad es la de incrementar la
efectividad de la respuesta inmune. Un adyuvante inmunológico es
cualquier sustancia o preparado químico que, incorporado al antígeno
o inyectado simultáneamente con él, hace más efectiva la respuesta
inmune.
Se define "medicamento" como cualquier
sustancia usada para la prevención, el diagnóstico, el alivio, el
tratamiento o la curación de enfermedades en el hombre y los
animales. En el contexto de la presente invención se refiere a una
preparación que comprenda, al menos, el compuesto de la invención o
la composición de la invención, que preferiblemente comprende
Azafrina 1 o Azafrina 2 y más preferiblemente Azafrina 1 y Azafrina
2. Preferiblemente, la composición de la invención comprende
CS5-1 y más preferiblemente CS5.
El medicamento comprende, al menos, el compuesto
de la invención o la composición de la invención. El compuesto o la
composición de la presente invención se formulan en una composición
farmacéutica apropiada, en la cantidad terapéuticamente efectiva,
preferiblemente junto con uno o más vehículos, adyuvantes o
excipientes farmacéuticamente aceptables. El medicamento es útil
para el tratamiento del cáncer, preferiblemente, carcinoma cervical
y/o para la prevención de enfermedades infecciosas.
El término "tratamiento", tal como se
entiende en la presente invención, supone combatir los efectos
causados como consecuencia del cáncer, preferiblemente, del
carcinoma cervical, para estabilizar el estado de los individuos o
prevenir daños posteriores. El término "prevención", tal como
se entiende en la presente invención, consiste en evitar la
aparición de daños cuya causa sea la exposición a cualquier antígeno
capaz de desencadenar una respuesta inmunológica en el cuerpo
humano o animal, o bien cualquier tipo de cáncer, preferiblemente
carcinoma cervical.
Se entiende por "cáncer" el conjunto de
enfermedades en las cuales el organismo produce un exceso de células
malignas (células cancerígenas o cancerosas), con crecimiento
descontrolado y división más allá de los límites normales, que en
estadíos avanzados conduce a la invasión del tejido circundante y,
finalmente, a metástasis. Comprende cualquier enfermedad de un
órgano o tejido en un mamífero, preferiblemente el hombre,
caracterizada por una multiplicación pobremente controlada, o
descontrolada, de células normales o anormales en dicho tejido, y
su efecto en la totalidad del cuerpo. El término cáncer, dentro de
esta definición, incluye las neoplasias benignas, malignas,
displasias, hiperplasias, así como neoplasias que muestran
metástasis, o cualquier otra transformación como por ejemplo,
leucoplasias que a menudo preceden al brote del cáncer. Las células
y los tejidos son cancerosos cuando crecen y se replican más
rápidamente de lo normal, desplazándose o dispersándose en el
tejido sano circundante o en cualquier otro tejido del cuerpo, lo
que se conoce como metástasis, asume formas y tamaños anormales,
muestra cambios en su ratio nucleocitoplasmático, policromasia
nuclear, y finalmente cesa. Células y tejidos cancerosos pueden
afectar al cuerpo como un todo causando síndromes paraneoplásicos,
o puede ocurrir en un órgano o tejido vital, siendo interrumpida o
dañada su función normal, con posibles resultados fatales. El
resultado final de la evolución de un cáncer que involucra a un
órgano vital, ya sea primario o metastático, es la muerte del
mamífero afectado. Generalmente se dice que el cáncer se encuentra
en uno de tres estados de crecimiento: temprano o localizado, cuando
el tumor aún se encuentra confinado en el tejido de origen, o en su
localización primaria; extensión directa, cuando las células
cancerígenas del tumor han invadido el tejido adyacente o se ha
extendido únicamente a los nódulos linfáticos regionales; o
metástasis, cuando las células cancerosas han migrado a partes
distantes del cuerpo desde la localización primaria, por medio del
sistema circulatorio o linfático, y se ha establecido en
localizaciones secundarias.
Se dice que un cáncer es maligno por su
tendencia a causar la muerte si no es tratado. Los tumores benignos
usualmente no causan la muerte, aunque pueden hacerlo si interfieren
con la función normal del cuerpo por sus características o
localización, tamaño o efectos paraneoplásicos. En general, las
células cancerosas se dividen a una tasa mayor que las células
normales, pero la distinción entre el crecimiento de los tejidos
cancerosos y normales no es tanto que la división celular sea mucho
más rápida, como la pérdida parcial o completa de la capacidad de
detención de su crecimiento y diferenciación en un tejido útil y
limitado, del tipo que caracteriza el equilibrio funcional de
crecimiento del tejido normal.
El término "cáncer" en esta descripción, no
se limita simplemente a neoplasias benignas, sino que comprende
también otras neoplasias benignas o malignas como: 1) carcinoma, 2)
sarcoma, 3) carcinosarcoma, 4) cánceres de los tejidos formadores
de sangre, 5) tumores de tejidos nerviosos, incluyendo el cerebro,
6) cáncer de células de la piel. Algunos tipos de cáncer son, por
ejemplo pero sin limitarnos, cáncer de mama, de próstata, de colon
y recto, de pulmón, linfoma no Hodgkin, melanoma, de riñón (células
renales), de estómago, de hígado, de páncreas, óseo, de timo, de
endometrio o uterino o de cuello del útero. El "carcinoma
cervical" o "cáncer de cuello de útero" o "cáncer de
cérvix" es un tipo de cáncer que se forma en los tejidos del
cérvix o cuello del útero. Por lo general, es un cáncer que crece
lentamente, que puede no presentar síntomas, pero que puede
detectarse por medio de pruebas de citología regulares (mediante el
raspado de células del cérvix y posterior examen al
microscopio).
El compuesto y la composición de la invención
son útiles como adyuvantes en vacunas, debido a que tras ser
administrados junto con el antígeno contra el que se pretende
inmunizar al organismo, son capaces de provocar una respuesta
inmune superior a la conseguida tras la administración del antígeno
solo o junto con los otros adyuvantes conocidos en el estado de la
técnica ensayados en la invención.
Tal y como aparece en la presente descripción,
el término "vacuna" se refiere a un preparado que comprende
una cantidad inmunogénicamente efectiva de uno o más antígenos que,
una vez dentro del organismo, provoca una respuesta inmune. Esta
respuesta inmune genera una memoria inmunológica. Se incluyen dentro
de esta definición tanto las vacunas preparadas con toxoides, como
las preparadas con antígenos vivos atenuados o con antígenos
muertos o inactivos. Preferiblemente, las formulaciones de la vacuna
contienen un antígeno o composición antigénica capaz de generar una
respuesta inmune frente a un patógeno humano. Tales antígenos o
composiciones antigénicas derivan preferiblemente de:
VIH-1 (tal como tat, nef, pg120 o gp160), del virus
del herpes humano, tal como gD o derivados del mismo o de la
proteína Inmediata Temprana tal como ICP27 de VSH1 o VSH2, del
citomegaloviurs (tales como gB o derivados del mismo), del
Rotavirus (que incluyen virus vivos atenuados), del virus de Epstein
Barr (tal como gp350 o derivados del mismo), del Virus de Varicella
Zoster (tal como gpI, II y IE63), del virus de la hepatitis tal
como virus de la hepatitis B (por ejemplo, antígeno de Superficie de
la Hepatitis B o un derivado del mismo), virus de la hepatitis A,
virus de la hepatitis C y virus de la hepatitis E, o de otros
patógenos virales, tales como paramixovirus: virus Respiratorio
Sincitial (tal como las proteínas F y G o derivados de las mismas),
virus de la parainfluenza, virus del sarampión, virus de paperas,
virus del papiloma humano (por ejemplo HPV6, 11, 16, 18,..),
flavivirus (por ejemplo, Virus de la Fiebre Amarilla, Virus del
Dengue, virus de la encefalitis Tick-borne, Virus de
la Encefalitis Japonesa) o virus de la gripe, o derivados de
patógenos bacterianos tales como Neisseria spp., que incluye
N. gonorrhea y N. meningitidis (por ejemplo,
polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, proteínas de
unión a transferrina, proteínas de unión a lactoferrina, PilC,
adhesinas); Streptococcus spp., que incluye S.
pneumoniae (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados
de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a
colina), S. pyogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos
de las mismas), S. agalactiae, S. mutans;
Haemophilus spp., que incluye H. influenzae type B
(por ejemplo PRP y conjugados del mismo), H. influenza no
clasificable (por ejemplo, OMP26, adhesinas de alto peso molecular,
P5, P6, lipoproteína D), H. ducreyi; Moraxella spp.,
que incluye M. catarrhalis, también conocida como
Branhamella catarrhalis (por ejemplo, adhesinas e invasinas
de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp., que incluye
B. pertussis (por ejemplo, pertactina, tóxina pertussis o
derivados de la misma, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa,
fimbriae), B. parapertussis y B. bronchiseptica;
Mycobacterium spp., que incluye M. tuberculosis (por
ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B o -C), M. bovis, M.
leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M.
smegmatis; Legionella spp., que incluye L.
pneumophila; Escherichia spp., que incluye E.
coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, tóxina
lábil al calor o derivados de la misma, tóxina estable al calor o
derivados de la misma), E. coli enterohemorrágica, E.
coli enteropatogénica (por ejemplo toxina similar a la toxina
shiga o derivados de la misma); Vibrio spp., que incluye
V. cholera (por ejemplo toxina colérica o derivados de la
misma); Shigella spp., que incluye S. sonnei, S.
dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., que
incluye Y. enterocolítica (por ejemplo una proteína Yop), Y.
pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp.,
que incluye C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e
invasinas), y C. coli; Salmonella spp, que incluye
S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S.
enteritidis; Listeria spp., que incluye L.
monocytogenes; Helicobacter spp, que incluye H.
pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, tóxina de vacuolación);
Pseudomonas spp que incluye P. aeruginosa;
Staphylococcus spp, que incluye S. aureus, S.
epidermidis; Enterococcus spp., que incluye E.
faecalis, E. faecium; Clostridium spp., que
incluye C. tetani (por ejemplo toxina tetánica y derivados
de la misma), C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y
derivados de la misma), C. difficile (por ejemplo toxinas de
clostridium A y B y derivados de la misma); Bacillus spp.,
que incluye B. anthracis (por ejemplo toxina botulínica y
derivados de la misma); Corynebacterium spp., que incluye
C. diphtheriae (por ejemplo tóxina diftérica y derivados de
la misma); Borrelia spp., que incluye B. burgdorferi
(por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo
OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC,
DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA,
DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., que incluye E.
equi y el agente de la Ehrlichiosis Granulocítica Humana;
Rickettsia spp., que incluye R. rickettsii;
Chamydia spp., que incluye C. trachomatis (por
ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pheumoniae
(por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C.
psittaci; Leptospira spp., que incluye L.
interrogans; Treponema spp., que incluye T.
pallidum (por ejemplo, proteínas raras de la membrana externa),
T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivados de
parásitos tales como Plasmodium spp., que incluye P.
falciparum; Toxoplasma spp., que incluye T.
gondii (por ejemplo, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp.,
que incluye E. histolytica; Babesia spp., que incluye
B. microti; Trypanosoma spp., que incluye T.
cruzi; Giardia spp., que incluye G. lamblia;
Leshmania spp., que incluye L. major;
Pneumocystis spp., que incluye P. carinni;
Trichomonas spp., que incluye T. vaginalis;
Schisostoma spp., que incluye S. mansoni, o derivados
de levaduras tales como Candida spp., que incluye C.
albicans; o Cryptococcus spp., que incluye C.
neoformans.
Los derivados del antígeno de superficie del
virus de la Hepatitis B se conocen bien en la técnica e incluyen
entre otros, los antígenos establecidos PreS1 o PreS2.
La vacuna puede comprender, además, antígenos
derivados de parásitos que causan la malaria. Por ejemplo, los
antígenos de Plasmodium falciparum incluyen RTS, S y TRAP.
Otros antígenos de plasmodia que son candidatos para ser
componentes de una vacuna en múltiples etapas contra la malaria son
los antígenos de P. falciparum: MSP1, AMA1, MSP3, EBA,
GLURP, RAP1, RAP2, Secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP,
SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, PFs230 o
sus análogos en Plasmodium spp.
Las formulaciones de la vacuna pueden contener,
también, un antígeno antitumoral y ser útiles para el tratamiento
inmunoterapéutico de cánceres. Ejemplos de estos antígenos incluyen
MAGE1 y MAGE3 u otros antígenos MAGE para el tratamiento del
melanoma, PRAME, BAGE o GAGE. Otros antígenos específicos de tumor
que son adecuados para su utilización junto con el adyuvante de la
presente invención incluyen, pero no se restringen a: antígeno
específico del cáncer de próstata (PSA) o Her2/neu, KSA (GA377),
MUC-1 o antígeno carcinoembrionario (CEA).
La vacuna se puede utilizar también para la
profilaxis o terapia de alergia. Tales vacunas podrían comprender
antígenos específicos del alergeno (por ejemplo Der p1) y antígenos
no específicos de un alergeno (por ejemplo el decapéptido de
Stanworth).
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que es inmunogénicamente efectiva
sin los efectos colaterales adversos significativos en vacunaciones
típicas. Tal cantidad variará dependiendo del antígeno o inmunógeno
específico que se utilice y de cómo se presente. La cantidad óptima
de una vacuna particular se determinará mediante estudios estándar
que implican la observación de las apropiadas respuestas inmunes en
individuos. Después de la vacunación inicial, los individuos pueden
recibir una o varias inmunizaciones de recuerdo espaciadas
adecuadamente.
Las formulaciones de la vacuna se pueden
utilizar tanto para propósitos profilácticos como terapéuticos.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica, de ahora en adelante "composición
farmacéutica de la invención", que comprende al menos el
compuesto de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido
y ácido
3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
En
una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización más preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. En una realización aún más preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de un antígeno.
una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización más preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. En una realización aún más preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de un antígeno.
Como se emplea aquí, el término "principio
activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente
activa", "ingrediente activo" o "ingrediente
farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que
potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro
efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento,
o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o
función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye
aquellos componentes que promueven un cambio químico en la
elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma
modificada prevista que proporciona la actividad específica o el
efecto.
Los "vehículos farmacéuticamente
aceptables" se refieren a aquellas sustancias, o combinación de
sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la
elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluyen,
pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser
utilizados en la presente invención son los vehículos conocidos en
el estado de la técnica.
Las composiciones farmacéuticas y medicamentos
de la presente invención pueden utilizarse en un método de
tratamiento o de prevención de forma aislada o conjuntamente con
otros compuestos farmacéuticos destinados al tratamiento o
prevención de enfermedades infecciosas o de cáncer, preferiblemente,
carcinoma cervical.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden formularse para su administración en una variedad
de formas conocidas en el estado de la técnica.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden
administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al
hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a,
parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural,
intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial,
intratecal, intralesional, intraarterial, intracardíaca,
intramuscular, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular
o intratumoral.
La dosificación para obtener una cantidad
terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como
por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del mamífero. En el
sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del compuesto
o de la composición de la invención que produzca el efecto deseado
y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las
características propias de dicho compuesto o composición y el efecto
terapéutico a conseguir. Se contempla que las composiciones de la
presente invención puedan ser composiciones farmacéuticas, que
comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del
antígeno,
junto con una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención o de la composición de la invención.
junto con una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención o de la composición de la invención.
En la presente descripción se entiende por
"cantidad inmunogénicamente efectiva" aquella cantidad de
antígeno o de composición antigénica o de adyuvante (compuesto o
composición de la invención) que produzca una respuesta inmune
capaz de proteger al organismo frente a la enfermedad provocada por
el patógeno que contiene dicho antígeno. La respuesta inmune de un
organismo a un antígeno o a una composición antigénica puede ser
evaluada mediante la cuantificación del nivel de anticuerpos
específicos de antígeno presentes en el organismo tras la
administración del adyuvante junto con el antígeno o la composición
antigénica, lo cual se podría realizar, por ejemplo, pero sin
limitarnos, mediante inmunoensayos tipo ELISA; y/o mediante la
medida del nivel de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitarnos,
los linfocitos T cooperadores o "helper" o CD4+, citotóxicos o
CD8+, de memoria, reguladores o "natural killer", lo cual
podría llevarse a cabo mediante, por ejemplo, pero sin limitarnos,
técnicas de inmunofluorescencia, y la posterior comparación de los
niveles obtenidos con unos valores "control" correspondientes
a un organismo en el que no se ha llevado a cabo dicha inmunización
mediante la inoculación del antígeno.
La composición de la invención, que
preferiblemente comprende Azafrina 1 o Azafrina 2 y más
preferiblemente Azafrina 1 y Azafrina 2, se encuentra en una
concentración de entre 0,5 y 21 \mug, más preferiblemente de
entre 0,5 y 6 \mug y aún más preferiblemente de entre 4 y 6
\mug, cantidades inmunogénicamente efectivas a las que se ha
demostrado una inducción significativa de la respuesta inmune en
respuesta al antígeno.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de obtención de una composición que comprende Azafrina 1 y
Azafrina 2, de ahora en adelante "primer método de la
invención", que comprende:
- a.
- separar la epidermis del cormo de Crocus Sativus,
- b.
- liofilizar la epidermis obtenida en el paso (a),
- c.
- extraer las saponinas de la epidermis del paso (b) mediante isopropanol:agua 1:1,
- d.
- concentrar el producto obtenido en el paso (c) mediante vacío, hasta obtener un producto oleoso y resuspenderlo en metanol hasta obtener una proporción producto oleoso:metanol 7:3,
- e.
- precipitar la suspensión obtenida en el paso (d) con acetona,
- f.
- repetir los pasos (d) y (e) tres veces más, y
- g.
- fraccionar el precipitado obtenido en el paso (f) mediante cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, la cromatografía del paso (g) se realiza mediante una
primera elución isocrática seguida de un gradiente de acetonitrilo.
En una realización más preferida, la cromatografía del paso (g) se
realiza mediante una primera elución isocrática seguida de un
gradiente de acetonitrilo y una segunda elución en gradiente. En
una realización aún más preferida, la cromatografía del paso (g)
consiste en una cromatografía semipreparativa en fase reversa HPLC
en columna C18.
Se entiende por "cormo" el órgano
reproductivo del azafrán o Crocus Sativus cuya
"epidermis" está localizada en la zona externa del mismo, la
cual se puede separar de la zona interna o parénquima mediante
disección. "Crocus Sativus" o "azafrán" es una
planta perteneciente al género Crocus dentro la familia
Iridaceae que se caracteriza por tener una flor color lila donde
destacan el color rojo de los estigmas y el amarillo de los
estambres. Como se muestra en los ejemplos de la presente invención,
la composición de la invención se ha detectado únicamente en la
zona externa (epidermis) del cormo de azafrán, determinándose que
podría estar presente en un 0,5% (m/m).
Una vez separada la epidermis del cormo se
procede a su liofilización en el paso (b) del primer método de la
invención. Se entiende por "liofilizar " separar el agua de una
sustancia, o de una disolución, mediante congelación y posterior
sublimación a presión reducida del hielo formado, para dar lugar a
un material esponjoso que se disuelve posteriormente con facilidad.
Se utiliza en la deshidratación de los alimentos, materiales
biológicos y otros productos sensibles al calor.
El término "saponinas" hace referencia a
los glucósidos de esteroides o de triterpenoides, llamadas así por
sus propiedades similares a las del jabón: cada molécula está
constituida por un elemento soluble en lípidos (el esteroide o el
triterpenoide) y un elemento soluble en agua (el azúcar), y forman
una espuma cuando son agitadas en agua. Los inventores de la
presente invención han descubierto que las saponinas de azafrán son
poco solubles en los solventes característicos de la mayoría de los
procesos de purificación de las saponinas (H_{2}O, MeOH y
n-butanol), y extremadamente solubles en
isopropanol:agua 1:1 (isopropanol 50%). Por ello, la extracción de
las saponinas del paso (c) del primer método de la invención, aunque
podría realizarse mediante, por ejemplo, pero sin limitarnos,
acetonitrilo:agua (1:1), se realiza, preferiblemente, tres veces
durante 2 horas con 2-propanol al 50%. El producto
obtenido se concentra en el primer método de la invención mediante
un protocolo de precipitaciones y lavados que comprende los pasos
(d) a (f) y que, preferiblemente, sigue los siguientes pasos: en el
paso (d) se concentra el extracto obtenido en el paso (c) mediante
vacío, lo cual puede realizarse preferiblemente, aunque sin
limitarnos, mediante un rotavapor, más preferiblemente a 45ºC, hasta
obtener un residuo oleoso que se resuspende en metanol (MeOH) hasta
obtener una disolución final del 30% (v/v), a continuación, en el
paso (e) se precipita con acetona 1:1 dicha suspensión mediante
centrifugación a, preferiblemente, 8.000 rpm durante 20 minutos.
Posteriormente, este proceso de resuspensión y precipitado con MeOH
y acetona se repite tres veces más en el paso (f) del primer método
de la invención. Así se obtiene un producto amarillento que se
disuelve en acetonitrilo al 50%
(v/v).
(v/v).
El producto obtenido en el paso (f) del primer
método de la invención se fracciona mediante cromatografía en el
paso (g). La "cromatografía" consiste en un método de
separación para la caracterización de mezclas complejas. Es un
conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva,
cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos
componentes. Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en
todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas,
líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de
una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado
en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta
forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes
atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van
separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase
estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una
señal que puede depender de la concentración y del tipo de
compuesto. Ejemplos de cromatografía son, sin limitarnos,
cromatografía en papel, de gases, en capa fina, líquida en fase
reversa, líquida en fase normal, líquida de intercambio iónico,
líquida de exclusión, líquida de adsorción o de fluidos
supercríticos.
La "cromatografía en fase reversa" o de
"interacción hidrofóbica (HIC)" es una técnica que permite
separar moléculas en base a su polaridad. En este tipo de
cromatografía la fase estacionaria es de partículas de sílica
químicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o
aromáticos de diferentes tipos, lo que convierte a la fase
estacionaria en una matriz apolar. Por lo tanto, para este tipo de
cromatografías se emplean mezclas de solventes polares, tales como
agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes
alifáticos. En general, esta técnica se ha empleado para
substituyentes y matrices compatibles con fluidos biológicos. Por
tanto, el termino HIC es común cuando se habla de purificación de
proteínas y carbohidratos. La cromatografía en fase reversa se
puede llevar a cabo por técnicas conocidas mediante el empleo de
columnas de afinidad. Un ejemplo de cromatografía en fase reversa
es, pero sin limitarnos, el sistema de alto desempeño (HPLC o
"High Performance Liquid Chromatography"), un tipo de
cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y
química analítica, también denominada "Cromatografía líquida de
alta presión" o High pressure liquid chromatography
(HPLC). El HPLC es una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de
interacciones químicas entre las substancias analizadas y la columna
cromatográfica. Esta técnica utiliza una alta presión para mejorar
la resolución y reducir los tiempos de separación. El cromatograma
obtenido proporciona un perfil de picos correspondientes a las
diferentes moléculas, relacionados según su tiempo de retención con
los estándares, lo que permite identificar las moléculas presentes
en la mezcla.
En la presente invención, la cromatografía del
paso (g) consiste, preferiblemente, en una cromatografía en fase
reversa HPLC, más preferiblemente, la cromatografía del paso (g) se
realiza mediante HPLC en una columna C18 (9,5 x 250 mm) llevando a
cabo un primer paso de elución isocrática (utilización de una fase
móvil de composición constante), preferiblemente seguida de un
gradiente de acetonitrilo como solvente y un segundo paso de
elución en gradiente, utilizando, preferiblemente, aunque sin
limitarnos, el método de análisis especificado en la tabla 4 de los
ejemplos de la presente invención, usando como patrón
preferiblemente la fracción CF. Se entiende por "C18", la
resina (en columna) más comúnmente empleada para saponinas que posee
una cadena lineal de 18
carbonos.
carbonos.
Como fase móvil en la cromatografía se puede
utilizar un solo disolvente, "elución isocrática", que en caso
de la invención es acetonitrilo preferiblemente al 10%, o dos o más
disolventes de diferente polaridad cuya relación cambia a lo largo
de la elución cromatográfica, "elución en gradiente", que
mejoran la eficacia. En este último caso, la mezcla de disolventes
puede ser muy variada. Los equipos adecuados para llevar a cabo
estas técnicas constan de dispositivos que introducen los
disolventes de dos o más recipientes en una cámara de mezcla a
distintas velocidades, con ello se alcanza la relación más idónea de
los mismos.
El procedimiento a seguir en la cromatografía
para purificar la composición de la invención, es preferiblemente
el que se recoge en la tabla 5 de los ejemplos de la presente
invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de obtención del compuesto de la invención, de ahora en
adelante "segundo método de la invención", que comprende todos
los pasos del primer método de la invención y además:
- h.
- separar el producto obtenido en el paso (g) mediante cromatografía en capa fina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se entiende por "cromatografía en capa
fina" o "TLC" (Thin-Layer
Chromatography), la técnica cromatográfica utilizada, entre
otros posibles usos, para separar los componentes puros que forman
parte de una mezcla. Es una técnica basada en la preparación de una
capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de
vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un
adsorbente, placas de vidrio u otro tipo de soporte, un dispositivo
que mantenga las placas durante la extensión, otro para aplicar la
capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las
placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad
las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es
líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase
estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo
general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los
componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos
polares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del
capilar (micropipeta, jeringuilla, etc.) sobre la placa preparada.
La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se
va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo.
Ejemplos de eluyentes válidos para su uso en esta técnica son,
aunque sin limitarnos, éter de petróleo, éter dietílico,
ciclohexano, acetato de etilo, tetracloruro de carbono, piridina,
benceno, etanol, cloroformo, metanol, diclorometano, agua o
ácido
acético.
acético.
Las concentraciones de cualquiera de los
compuestos empleados en cualquiera de los pasos de los dos métodos
de la invención deben aproximarse a las especificadas en la presente
descripción, no obstante, los errores de medida en la práctica
justificarían que un experto en la materia las modificase para
llevar a cabo dichos métodos, siempre que el producto obtenido, es
decir, la composición y el compuesto de la invención, presentasen
las mismas propiedades estructurales y funcionales (adyuvantes y
citotóxicos) que en la presente invención.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Muestra la localización de CS5 en la
zona externa (epidermis) del cormo del azafrán, extracción
mediante cromatografía en fase reversa C18 y análisis por HPLC.
Fig. 2. Representa el esquema del proceso de
purificación de CS5, donde sólo aparece un paso
cromatográfico.
Fig. 3. Muestra el efecto de CS5 sobre la
respuesta específica de anticuerpos
anti-OVA.
Fig. 4. Muestra el efecto de CS5 sobre la
respuesta inmune específica primaria de: A) linfocitos T CD4+
OVA-específicos y B) linfocitos T CD8+
OVA-específicos. C) Efecto de CS5 sobre la respuesta
inmune específica secundaria de linfocitos T CD4+
péptido-específicos.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto la efectividad de la nueva mezcla de saponinas
triterpénicas, CS5, como adyuvante útil en formulaciones de
vacunas. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para
ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen
solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser
interpretados como limitaciones a la invención que aquí se
reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran
la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Los cormos de C. sativus fueron
recolectados en agosto y guardados a -80ºC hasta su uso.
Aplicando un proceso cromatográfico en una C18
(característico para saponinas) se separó la parte proteica de los
glicoconjugados. Una vez purificadas las saponinas de azafrán se
realizó un ensayo de solubilidades, detectándose que las saponinas
de azafrán, eran poco solubles en H_{2}O, MeOH y
n-butanol, solventes característicos en la mayoría
de los procesos de purificación de las saponinas, y extremadamente
solubles en isopropanol:agua 1:1 (isopropanol
50%).
50%).
Con el objetivo de optimizar el proceso de
extracción se realizó una disección separando la zona externa o
epidermis y la zona interna o parénquima del cormo para llevar a
cabo el proceso de extracción y análisis por HPLC (Figura 1). La
presencia de CS5 solo se detectó en la epidermis.
En este momento, CS5 se purificó mediante el
proceso de extracción (esquematizado en la Figura 2) descrito en
detalle a continuación y que consta de los siguientes pasos:
i. Disección de la zona externa del cormo y
liofilización,
ii. Extracción de las saponinas mediante
isopropanol:agua 1:1 (isopropanol 50%),
iii. Precipitaciones y lavados con MeOH:Acetona
1:1, y
iv. Fraccionamiento por cromatografía
semipreparativa en fase reversa mediante HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Tanto la zona externa (epidermis) como interna
(parénquima) del cormo se liofilizaron por separado. En paralelo se
extrajeron las saponinas 3 veces durante 2 horas a temperatura
ambiente con 2-propanol al 50%. El extracto se
concentró mediante vacío con un rotavapor a 45ºC para eliminar el
disolvente, hasta obtener un residuo oleoso que se resuspendió en
MeOH hasta obtener una disolución final del 30% (V/V). Dicha
suspensión se precipitó con acetona (1:1) mediante centrifugación a
8.000 rpm durante 20 minutos. El precipitado (CS15) se resuspendió
en MeOH para precipitarlo de nuevo con acetona (1:1) por
centrifugación y obtener un residuo amarillento (Csap) que se
disolvió en acetonitrilo al 50% (v/v). Csap, se analizó mediante
cromatografía en fase reversa en HPLC (Figura 1) en una Zorbax C18
(9,5 x 250 mm, Hewlett Packard, Palo Alto, CA) utilizando un método
de análisis (Tabla 4) que se puso a punto utilizando como patrón la
fracción CF (Escribano et al., 1999).
Se determinó que CS5 de cormo de azafrán podría
estar presente en un 0,5% (m/m). Este nuevo producto libre de
proteínas, es citotóxico contra células tumorales HeLa con una
IC_{50} de 24 \mug/mL.
\newpage
CS5 se purificó con un método semipreparativo
(Tabla 5) mejorando el método previamente descrito al incluir una
etapa de 5 minutos de lavado al 10% de acetonitrilo o ACN (con un
0,05% ácido trifluoroacético) justo después de cargar la muestra.
La fracción mayoritaria presente en CS5, CS5-1, se
purificó utilizando un gradiente isocrático al 40% de ACN (con un
0,05% ácido trifluoroacético). Tanto CS5 como CS5-1
se liofilizaron y guardaron a 4ºC hasta el momento de su uso.
El poder rotatorio se determinó a 20ºC en un
polarímetro (Perkin-Elmer 241 MC polarimeter).
MALDI-TOF-MS
(Matrix-assisted laser desorption ionization
time-of-flight mass
spectrometry) se llevó a cabo en un instrumento
Voyager-DE (PerSeptive Biosystems, Manchester, UK)
utilizando ácido sinapínico como matriz. Los espectros en modo
positivo se registraron en un LCQ DecaXP equipado con una fuente de
ionización de electrospray (Thermo Finningan, San Jose, CA). Las
muestras se disolvieron en 50% de 2-propanol/agua
(v/v) en una concentración aproximada de 10-30
\mug/\muL e introducida con un flujo de 5 \muL/min. La
temperatura del capilar fue de 225ºC. Los espectros se adquirieron
tanto en modo positivo como negativo en un rango de
50-2000 (m/z) con un voltaje de spray
de 4,8 kV y variando el voltaje del capilar de 31,5 a 46,0 V (Guo
et al., 2009). Los espectros de NMR (Nuclear Magnetic
Resonance) se registraron en un espectrómetro
DRX-500 (Bruker) y en un espectrómetro SYSTEM 500
(Varian) equipado con sonda fría (500 MHz para ^{1}H, 125 Mz para
^{13}C). Las muestras se disolvieron en 600 \muL de
piridina-d_{5} y se analizaron a 300K. Los experimentos que
se llevaron a cabo fueron: TOCSY (20-200 ms),
^{1}H-^{13}C HSQC, gHSQCTOCSY, HMBC, DEPT y
ROESY (300 ms). El desplazamiento químico (\delta) se expresó en
ppm utilizando como referencia la piridina-d_{5} (^{1}H,
7.19 ppm; ^{13}C, 123.15 ppm). Los análisis de metilación
(Ciucanu y Kerek, 1984), el análisis cuantitativo/cualitativo
(Kamerling y Vliegenthart, 1989) y la determinación de la
configuración absoluta (Gerwig et al., 1979) de los
monosacáridos se llevaron a cabo en un GC-MS
(Gas-liquid Chromatography-Mass
Spectrometry) utilizando un sistema Fisons Instruments GC
8060/MD 800 (Interscience) con una columna capilar
AT-1 (30 m x 0.25 mm, Alltech, Flemington, NJ). El
asilamiento y purificación se llevó a cabo en un sistema 1100 HPLC
(Hewlett Packard, Palo Alto, CA) conectado en línea con un detector
de fotodiodos (190-800 nm).
Las Azafrinas 1 y 2 se obtuvieron a partir de
CS5-1 mediante cromatografía en capa fina en láminas
de sílica gel 60 F254 (Merck) utilizando
CHCl_{3}-MeOH-H_{2}O (56:37:7)
como fase móvil. Las bandas se visualizaron mediante tinción con
0,2% de orcinol en 20% H_{2}SO_{4} y revelado mediante calor a
150ºC durante 5 min. La bandas se recortaron y extrajeron con
CHCl_{3}-MeOH-H_{2}O (14:6:1).
La fase orgánica se eliminó bajo flujo de N_{2} y la fracciones
extraídas se purificaron de nuevo mediante HPLC con el gradiente
isocrático descrito anteriormente para obtener Azafrina 1 y
Azafrina 2, ambos compuestos con el mismo tiempo de retención (10,9
min).
La hidrólisis ácida de CS5 y posterior
purificación de las sapogeninas (ácido equinocístico y oleanólico)
se llevó a cabo de acuerdo con la bibliografía (Melek et al.,
2002).
Los datos químicos obtenidos para las dos
Azafrinas de CS5 son:
Sólido amorfo de color blanco, punto de
ablandamiento 70-75ºC;
[\alpha]D20-62.5 (c 0.016, piridina); TLC
Rf = 0.80; MALDI-TOF-MS m/z 1965.5
[M+Na]+ (MW 1942 Da); Modo positivo ESI-MS m/z
1966.7 [C92H198O40+Na]+; 1H y 13C NMR (piridina-d5,
500 MHz/125 MHz): ver Tablas 1-3.
Sólido amorfo de color blanco, punto de
ablandamiento 130-145ºC; [\alpha]
D20-12.9 (c 0.031, piridina); TLC Rf = 0.71;
MALDI-TOF-MS m/z 1965.5 [M+Na]+ (MW
1942 Da); Modo positivo ESI-MS (m/z): 1966.7
[C92H198O40+
Na]+. 1H y 13C NMR (piridina-d5, 500 MHz/125 MHz): ver Tablas 1-3.
Na]+. 1H y 13C NMR (piridina-d5, 500 MHz/125 MHz): ver Tablas 1-3.
CS5 es una mezcla de diferentes saponinas
triterpénicas derivadas principalmente del ácido equinocístico y
minoritariamente del ácido oleanólico. El análisis estructural se
llevó a cabo mediante HPLC-ESI-MS,
análisis de azúcares por metanólisis y butanólisis por
GC-MS y mediante hidrólisis ácida de las saponinas y
purificación de los aglicones que a su vez fueron analizados por
NMR mediante diferentes técnicas espectrales (1D ^{1}H, TOCSY,
ROESY, DEPC, HSQC, HMBC).
La fracción cromatográfica mayoritaria de CS5,
CS5-1, representa aproximadamente un 70% (m/m) del
total de las saponinas y al igual que CS5 de la cual procede, es
citotóxica contra las células tumorales HeLa con una IC_{50} de 9
\mug/mL. CS5-1, está constituida por Azafrina 1
(1) y Azafrina 2 (2) caracterizadas como (1) ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-
\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido y (2) 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-
D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadeca-
noil]-\beta-D-fucopiranósido. Estas dos saponinas bidesmosídicas, son isómeros derivados del ácido equinocístico, cuya única diferencia es la presencia del ácido glucurónico o galacturónico en posición C3 del aglicón.
\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido y (2) 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-
D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadeca-
noil]-\beta-D-fucopiranósido. Estas dos saponinas bidesmosídicas, son isómeros derivados del ácido equinocístico, cuya única diferencia es la presencia del ácido glucurónico o galacturónico en posición C3 del aglicón.
\newpage
La separación de estos dos isómeros se obtuvo
mediante cromatografía en capa fina (según lo explicado en el
apartado anterior) y su análisis estructural (Tablas
1-3) se realizó mediante la combinación de
espectrometría de masas (GC-EI-MS,
MALDI-TOF y ESI-MS) y espectroscopia
de resonancia molecular (NMR incluyendo
^{1}H-^{1}H TOCSY, ROESY, ^{1}H -^{13}C
HSQC, gHSQCTOCSY, DEPT y HMBC).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las células tumorales (línea HeLa) se obtuvieron
de la colección americana de cultivos tipo (Rockville, MD). El
ensayo antitumoral se llevó a cabo a partir de la bibliografía
descrita (Escribano et al., 1996), viéndose que CS5 es
citotóxico contra células tumorales HeLa con una IC_{50} de 24
\mug/mL. Su fracción mayoritaria, CS5-1, es
también citotóxica contra estas células con una IC_{50} de 9
\mug/mL.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones C57BL/6 y C57BLCD45.1 fueron
obtenidos originalmente de los laboratorios Harlan (Holanda, B.V) y
Charles River (L'arbresle cedex, Francia), respectivamente. Los
ratones transgénicos P14, que expresan un TCR (receptor de
linfocitos T) específico para el péptido 33-41
(gp33) de la glicoproteína del virus de la coriomeningitis
linfocítica (LCMV, por sus siglas en inglés) fueron obtenidos en el
propio instituto de los inventores. La tipificación de las crías y
parentales fue llevada a cabo mediante la tinción de linfocitos de
sangre periférica (PBL's) con el tetrámero gp33 conjugado con el
fluorocromo PE (PE-gp33) durante 30 minutos a
temperatura ambiente, lisando los eritrocitos con solución para
lisis de células rojas (BD biosciences, San José, CA) y consecuente
análisis por citometría de flujo. Los ratones transgénicos
OT-I y OT-II transgenic mice, que
expresan un TCR específico para los péptidos restringidos a
H-2^{b}, SIINFEKL y ISQ respectivamente, fueron
también obtenidos en el propio instituto de los inventores y
tipificados mediante la tinción de sus linfocitos T CD8+ y T CD4+
con las proteínas conjugadas APC-V\alpha2 y
PE-V\beta5. Para todos los experimentos se
utilizaron ratones macho de entre 6 y 12 semanas. Todas las cepas de
ratones se mantuvieron en el animalario del Ludwig Institute for
Cancer Research, bajo condiciones estériles y a una temperatura de
25\pm2ºC. Todos los procedimientos aplicados a los ratones están
aprobados por el respectivo comité de ética en animales.
Los péptidos Gp33-41
(KAVYNFATC), ISQ y SIINFEKL fueron sintetizados en el Ludwig
Institute for Cancer Research, diluidos en agua ultrapura
(Gp33-41) ó PBS-DMSO (ISQ y
SIINFEKL) y almacenados a -80ºC a una concentración de 1 mg/mL. La
Ovalbúmina libre de endotoxinas (EndoGrade Ovalbumin, conc. de
endotoxinas. < 1 EU/mg, >98% de pureza) fue comprada a Hyglos
AG (Regensburg, Alemania). El aluminio (Alum) usado en los
experimentos consiste en una mezcla de hidróxido de aluminio e
hidróxido de magnesio y la solución stock se preparó en solución
salina a una concentración de 15,73 \mug/\mul. Las secuencias
CpG-ODN-1826 (<0,2 ng/mL de
endotoxinas de acuerdo al test limulus) fueron gentilmente
proveídas por A. Krieg, Coley Pharmaceutical Group (Wellesley, MA).
QuilA es una mezcla de saponinas extraídas de la corteza del árbol
suraméricano Quillaja saponaria, y fueron gentilmente
donadas por la compañía Brenntag Nordic A/S, Dinamarca. El adyuvante
Incompleto de Freund (IFA) fue comprado a la compañía
Sigma-Aldrich, Inc.
Se prepararon suspensiones de células en PBS a
partir del bazo y nódulos linfáticos de ratones transgénicos P14
CD45.1^{+/+}, OT-I CD45.1^{+/+} ó
OT-II CD45.1^{+/+}. Posteriormente, las
células fueron marcadas o no, según fuera el caso, con CFSE y
finalmente, transferidas adoptivamente intravenosamente (en la vena
de la cola) a ratones vírgenes C57BL/6 CD45.1-/-.
Para las inmunizaciones con el péptido
gp33-41, 24 horas antes de la inmunización se
transfirieron adoptivamente en los ratones vírgenes 20 x 10^{6}
células marcadas con CFSE, provenientes de ratones transgénicos.
Para la evaluación de la expansión de células T de memoria
específicas, se transfirieron adoptivamente 1,4 x 10^{6}
linfocitos T CD4+ purificados. Para los ensayos in vivo de
proliferación, las células se marcaron con CFSE y se transfirieron
adoptivamente en ratones vírgenes C57BL/6. Según los requerimientos
del experimento, se transfirieron 5 x 10^{6} OT-I
células/ratón ó 5 x 10^{6} OT-I más 5 x 10^{6}
OT-II células/ratón. Todas las inyecciones se
realizaron en un volumen de 200 \muL.
Para rastrear la proliferación de células T
in vivo, las células se marcaron con CFSE antes de ser
transferidas adoptivamente en los ratones recipientes. Las
suspensiones de células se lavaron dos veces con PBS 0,1% BSA, se
resuspendieron a 10 x 10^{6} células/mL y luego se incubaron con
CFSE 5 \muM (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) en
PBS-BSA durante 8 minutos a 37ºC. Posteriormente,
las células se lavaron dos veces con PBS-BSA 0,1% y
una vez con PBS solo. Finalmente, las células se resuspendieron en
PBS a la concentración apropiada para ser transferidas en los
ratones vírgenes.
La purificación de células T CD4+ se llevó a
cabo mediante aislamiento de las mismas por depleción de células T
CD4- (selección negativa), las cuales fueron marcadas indirectamente
con un cóctel de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina
como reactivo de marcaje primario, y con anticuerpos monoclonales
anti-biotina conjugados con perlas magnéticas
(Microbeads) como reactivo de marcaje secundario. Las células T CD4-
marcadas magnéticamente fueron excluidas de la solución de células
al ser retenidas en una columna MACS® cuando pasaron por el campo
magnético de un separador MACS® (Miltenyi, Biotec), mientras que las
células T CD4+ pasaron a través de la columna y se recogieron en un
tubo.
Después de la transferencia adoptiva, los
ratones se dejaron en reposo durante 24 h y se dividieron en grupos
consistentes en 3 ó 4 ratones cada uno. Posteriormente, todos los
ratones fueron inyectados subcutáneamente en la base de la cola,
con solución salina como control negativo (placebo) o bien fueron
vacunados de acuerdo con los protocolos que se describirán más
adelante. El volumen de todas las inyecciones fue de 100
\muL/ratón. Para el uso de CS5 en las inmunizaciones, primero se
evaporó la solución de Isopropanol 50% en el cual el stock se
encontraba resuspendido, y finalmente CS5 se resuspendió en solución
salina a la concentración apropiada de acuerdo con el protocolo de
vacunación.
Después de transferir adoptivamente células
provenientes de ratones transgénicos P14 en ratones vírgenes
C57BL/6, los ratones recipientes fueron inmunizados una vez con 50
\mug de gp33-41 diluido en 100 \mul de solución
salina (PBS) solamente o con gp33-41 diluido en
solución salina con CpG (50 \mug), QuilA (20 ug) o CS5 (10, 25,
50 ó 100 \mug). 5 días después de la inmunización, los ratones
fueron sacrificados para evaluar la proliferación de células T CD8+
específicas y no específicas en nódulos linfáticos de drenaje. La
evaluación se realizó mediante citometría de flujo.
Ratones C57BL/6, en los cuales se transfirieron
previamente células marcadas con CFSE provenientes de ratones
transgénicos OT-I, fueron inmunizados una vez con el
péptido SIINKFEL (50 \mug) diluido en solución salina solamente o
con SIINKFEL diluido en solución salina conteniendo CpG (50 \mug),
QuilA (20 \mug) o CS5 (1, 5 ó 10 \mug). 4 días después de la
inmunización, se evaluó la proliferación y activación de linfocitos
T CD8+ específicos en nódulos linfáticos de drenaje mediante
citometría de flujo.
Para los ensayos de proliferación in
vivo, ratones transferidos adoptivamente con células
OT-I y OT-II marcadas con CFSE
fueron inmunizados una vez con la proteína OVA (1 \mug) disuelta
en solución salina (PBS) solamente o con OVA disuelta en PBS
conteniendo Aluminio (200 \mug), CpG (50 \mug), QuilA (20
\mug) o CS5 (1, 5, 10 ó 20 \mug). 4 días después se evaluó la
proliferación y activación de células T CD4+ y CD8+ específicas en
nódulos linfáticos de drenaje mediante FACS (Fluorescence
Activated Cell Sorting).
Para la evaluación de la respuesta de
anticuerpos específica anti-OVA, ratones
transferidos con células OT-II fueron inmunizados
con OVA (100 \mug) diluida en solución salina (PBS) solamente o
con OVA diluida en PBS conteniendo Aluminio (200 \mug), QuilA (20
\mug) o CS5 (1, 5, 10 ó 20 \mug) un día después de la
transferencia adoptiva. Al día 14, se les dio a los ratones una
inyección de refuerzo basada en el mismo protocolo de la primera
inmunización. Finalmente, se colectaron muestras de suero
independientes para cada uno de los ratones, a los días 14 (antes
de la inyección de refuerzo), 21 y 28.
Para la evaluación de la expansión de células T
CD4+ específicas de memoria, los ratones fueron inmunizados como se
ha descrito arriba y al día 28 se reestimularon con una emulsión de
PBS/IFA (1:1) conteniendo péptido ISQ. 4 días después del
reestímulo, los ratones fueron sacrificados y la expansión de
células péptido-específicas fue evaluada en nódulos
linfáticos de drenaje, mediante la detección de células T CD4+
CD45.1+/+ por FACS.
La expresión de marcadores de activación y
fenotípicos en la superficie de las células fue evaluada mediante
inmunofluorescencia. En resumen, las células fueron incubadas
durante 5 minutos con el anticuerpo 24G2 para bloquear la unión
inespecífica al receptor FcR. Posteriormente, fueron incubadas con
los respectivos anticuerpos fluorocromados diluidos en PBS 2% FCS
0,01% Azida y EDTA 2 mM. Las células del donante (exógenas) fueron
discriminadas de las del recipiente (endógenas) mediante tinción de
las mismas con anticuerpos monoclonales anti-CD45.1
o anti-CD45.2 (CD45.1 para células exógenas; CD45.2
para células endógenas). Las células exógenas OT-I y
OT-II fueron detectadas mediante tinción con las
combinaciones de anticuerpos monoclonales
anti-V\alpha2, anti-V\beta5 y
anti-CD8\alpha; o anti-V\alpha2,
anti-V\beta5 y anti-CD4
respectivamente. La activación de células T fue evaluada mediante
tinción de la superficie celular con anti-CD44,
anti-CD62L y anti-CD69.
Las células T CD8+ específicas para
Gp33-41 fueron detectadas mediante tinción con el
tetrámero H_{2}-Db LCMV gp33-41
conjugado con PE, en combinación con tinción con anticuerpo
anti-CD8\alpha. La tinción fue llevada a cabo a
temperatura ambiente durante 40 min, antes de proceder a la tinción
con anticuerpos a 4ºC.
La fluorescencia de anticuerpos, tetrámeros y
CFSE fue evaluada con un FACScalibur (Becton Dickinson) y cuando la
tinción era de más de cuatro colores, se utilizó un FACScanto
(Becton Dickinson). Los datos fueron analizados utilizando el
programa FlowJo (Tree Star, Inc).
Los niveles de IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b
específicos contra OVA fueron detectados mediante inmunoensayo
ELISA. En resumen, placas multipocillo (Nunc Immuno) sensibilizaron
con OVA mediante incubación de las mismas con 50 \mul de OVA
resuspendida en PBS a 5 \mug/mL y posterior incubación a 4ºC
durante toda la noche. A continuación, las placas se lavaron con
PBS 0,05% (v/v) Tween 20 (PBS/Tween) y luego se bloquearon con leche
al 5% en PBS/Tween durante 1 hora a temperatura ambiente. Después
de realizar cuatro lavados, diluciones seriadas en
PBS-T 2,5% leche de las muestras de suero se
añadieron a los pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente las placas se lavaron con
PBS/Tween y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en
presencia del anticuerpo secundario respectivo:
anti-Inmunoglobulina G (anti-IgG,
1:6000) de ratón (producida en cabra y conjugado con HRP),
anti-IgG1 1:4000, anti-IgG2a 1:5000
o anti-IgG2b 1:2000 (Southern Biotechnology
Associates). Después de cuatro lavados adicionales, las placas
fueron incubadas con el substrato para HRP, SIGMAFAST^{TM}
OPD (o-Phenylenediamine dihydrochloride) (Sigma Aldrich,
Buchs, Suiza) durante 40 minutos a temperatura ambiente. Finalmente
se midió la absorbancia a 450 nm o a 492 nm (en el caso de que la
reacción se bloqueara previamente con HCl 3M) en un lector de
microplacas.
Los datos se expresaron como la media \pm
error estándar de la media (SEM) y la significancia estadística de
las diferencias entre grupos de datos fue calculada usando un
t-test estándar, con un intervalo de confianza del 95%. Los
valores P<0,05 fueron considerados como estadísticamente
significantes.
La actividad adyuvante de las saponinas puede
determinarse por varios métodos. El incremento en el título de
anticuerpos contra un antígeno específico bajo la administración
conjunta de este con un adyuvante es un criterio para evaluar la
actividad adyuvante de un compuesto (Dalsgaard, K., 1978, Acta
Veterinia Scandinavica 69, 1-40; Scott, M. T.,
Gross-Samson, M., and Bomford, R., 1985, Int. Archs.
Allergy Appl. Immun. 77, 409-412). Para evaluar el
efecto adyuvante de CS5, ratones C57BL/6 fueron inmunizados
subcutáneamente con el antígeno OVA (Ovalbúmina, una proteína del
huevo) mezclado con diferentes dosis del potencial adyuvante. Dos
semanas después, el suero de los ratones fue colectado y la
presencia de anticuerpos específicos anti-OVA fue
evaluada mediante inmunoensayo ELISA. La inmunización con el
antígeno solamente no causó ningún incremento en el nivel de
anticuerpos anti-OVA en comparación con el nivel
observado en ratones no inmunizados. En contraste, la
administración de CS5 claramente condujo a un incremento
significativo de los niveles de anticuerpos (Figura 3. Respuesta de
anticuerpos). La actividad adyuvante de CS5 y otros adyuvantes como
el extracto de saponinas "QuilA" y sales de aluminio
(Aluminio) fue comparada, encontrando que CS5, Quil A y Aluminio
inducen niveles similares de IgG1 (respuesta tipo Th2) pero
solamente CS5 y QuilA incrementaron significativamente los niveles
de IgG2a e IgG2b (respuesta tipo Th1). Colectivamente, estos
resultados demuestran la actividad adyuvante de CS5 y su
superioridad en comparación con el aluminio, ya que tiene capacidad
para inducir no solamente una respuesta inmune de tipo Th1, sino
también de tipo Th2.
Con el objetivo de determinar el efecto
adyuvante de CS5 en la respuesta de linfocitos T, se evaluó la
activación primaria de los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos
para el antígeno OVA. Ratones C57Bl/6 fueron inmunizados
subcutáneamente con OVA solamente o mezclado con diferentes dosis de
CS5 como potencial adyuvante, o con QuilA, CpG y Aluminio como
controles. Cuatro días después se evaluó el nivel de expansión y
proliferación de linfocitos específicos para OVA. CS5, a dosis de 1
y 5 \mug, incrementó la proliferación y expansión de la población
de células T CD4+ específicas para OVA, siendo 5 \mug la dosis a
la cual se observó el mayor efecto (Figura 4A, proliferación
CD4).
La activación primaria de los linfocitos T CD8+
también se vio aumentada por el uso de CS5 como adyuvante. La
inmunización con OVA y CS5 indujo proliferación de la población de
linfocitos T CD8+, la cual se vio reflejada en una expansión de
ésta hasta 8-10 veces más en comparación con el
control (OVA solamente). QuilA tuvo un efecto similar al de CS5.
Por el contrario los adyuvantes CpG, IFA/CpG y Aluminio, a pesar de
incrementar la proliferación de la población de linfocitos T CD8+
específicos para OVA, no tuvieron ningún efecto en la expansión de
la misma, lo cual sugiere que las células proliferan pero no logran
mantenerse viables. Este resultado sugiere que CS5 tiene una
capacidad adyuvante superior a la de otros adyuvantes como Aluminio,
IFA ó CpG para inducir una respuesta inmune mediada por linfocitos
T citotóxicos (Figura 4B, proliferación CD8).
Una de las principales características de un
buen adyuvante, es su capacidad no solo de incrementar la respuesta
inmune frente a un antígeno, sino también de que esta respuesta
inducida sea funcional y duradera. Una manera de evaluar si un
potencial adyuvante presenta esta capacidad, sería evaluar la
respuesta inmune secundaria generada después de un reestímulo, en
un organismo que ha sido inmunizado en el pasado con el mismo
antígeno. Para este fin, se evaluó la respuesta secundaria de
linfocitos T CD4+ en ratones C57Bl/6. En resumen, linfocitos T CD4+
específicos para un péptido de OVA fueron transferidos adoptivamente
a ratones C57Bl/6, los cuales fueron posteriormente inmunizados dos
veces (día 1 y 14) con OVA solamente o en presencia de CS5 u otros
adyuvantes. Quince días después de la segunda inmunización, todos
los ratones fueron reestimulados con el péptido de OVA y la
expansión de la población de linfocitos T CD4+
péptido-específicos fue evaluada al cuarto día
después del reestímulo. Los ratones inmunizados con QuilA y CS5
mostraron grandes poblaciones de linfocitos T CD4+
péptido-específicos en nódulos linfáticos de drenaje
(cercanos al sitio de la inyección), mientras que en aquellos
inmunizados con OVA solamente o en presencia de aluminio no fue
posible detectar ninguna respuesta después del reestímulo, a pesar
de haber observado una respuesta primaria después de la primera
inmunización. Lo anterior muestra que el efecto adyuvante de CS5
no se limita exclusivamente a incrementar la respuesta inmune en un
corto lapso de tiempo después de aplicar la vacuna, sino que también
tiene la capacidad de generar respuestas duraderas que pueden ser
re-potenciadas con una futura exposición al
antígeno. (Figura 4C, expansión CD4 de "memoria").
La hemólisis de eritrocitos (RBC) causada por
toxicidad en la mayoría de los animales incluyendo los humanos es
una desventaja relevante para el desarrollo clínico de las saponinas
como adyuvantes. Con el objetivo de determinar si las dosis de CS5
evaluadas para la formulación de vacunas tenían un efecto tóxico en
los eritrocitos, se realizó un test hemolítico in vivo usado
ratones como modelo, y no se detectó hemoglobina libre en el suero
sanguíneo de ratones inmunizados a ninguna de las dosis de CS5
evaluadas. CS5 mostró ser inmunoestimulante a dosis que se
encuentran dentro del rango de dosis no tóxicas, lo cual permite su
uso como adyuvante sin ningún riesgo de hemólisis.
Una consecuencia directa de la localización
tisular de CS5 desde el punto de vista agronómico es la posibilidad
de poder utilizar cormos en dormancia con pesos menores a 5 gramos,
ya que su menor tamaño implica una mayor superficie y por lo tanto
un mayor rendimiento para la extracción de saponinas. Estos cormos
son inviables en campo ya que no generan flores y, por lo tanto, no
son seleccionados durante el tamizado de los mismos para su venta.
Además, la utilización de tierras de secano para la obtención de
cormos de pequeño tamaño para la extracción de CS5 podría suponer
un empuje para muchos agricultores que debido a las restricciones en
el uso del agua se están viendo forzados al abandono de estas
tierras.
Claims (25)
1. Compuesto de fórmula general (I):
donde R_{1} se selecciona de
entre los siguientes
grupos:
\newpage
y R_{2} representa el siguiente
grupo:
o cualquiera de sus isómeros o sus
sales.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1 donde el
isómero es el ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
3. Compuesto según la reivindicación 1 donde el
isómero es el ácido
3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
4. Composición que comprende un compuesto de
fórmula general (I) o cualquiera de sus isómeros o sus sales.
5. Composición según la reivindicación 4 donde
el isómero es el ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
6. Composición según la reivindicación 4 donde
el isómero es el ácido
3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
7. Composición según la reivindicación 4 que
comprende los isómeros ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopira-
nosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido y ácido 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopira-
nosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
nosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido y ácido 3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopira-
nosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
8. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de un medicamento.
9. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para la elaboración de un medicamento para
el tratamiento del cáncer.
10. Uso del compuesto según la reivindicación 9
donde el cáncer es carcinoma cervical.
11. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 como adyuvante para una vacuna.
12. Uso de la composición según cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 7 para la elaboración de un
medicamento.
13. Uso de la composición según cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 7 para la elaboración de un medicamento
para el tratamiento del cáncer.
14. Uso de la composición según la
reivindicación 13 donde el cáncer es carcinoma cervical.
15. Uso de la composición según cualquiera de
las reivindicaciones 4 a 7 como adyuvante para una vacuna.
16. Composición farmacéutica que comprende al
menos el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3.
17. Composición farmacéutica que comprende al
menos ácido
3-O-\beta-D-glucuronopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido
y ácido
3-O-\beta-D-galacturonopiranosil-equinocístico-28-O-[\beta-D-galactopiranosil-(1\rightarrow2)-\alpha-L-arabinopiranosil-(1\rightarrow2)-[\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)]-\alpha-
L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
L-ramnopiranosil-(1\rightarrow2)-[4-O-di-\alpha-L-ramnopiranosil-3,16-dihidroxi-10-oxo-hexadecanoil]-\beta-D-fucopiranósido.
18. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 16 ó 17 que además comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
19. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 18 que además comprende otro principio
activo.
20. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 16 a 19 que además comprende una cantidad
inmunogénicamente efectiva de un antígeno.
21. Método de obtención de una composición según
la reivindicación 7 que comprende:
- a.
- separar la epidermis del cormo de Crocus Sativus,
- b.
- liofilizar la epidermis obtenida en el paso (a),
- c.
- extraer las saponinas de la epidermis del paso (b) mediante isopropanol:agua 1:1,
- d.
- concentrar el producto obtenido en el paso (c) mediante vacío, hasta obtener un producto oleoso y resuspenderlo en metanol hasta obtener una proporción producto oleoso:metanol 7:3,
- e.
- precipitar la suspensión obtenida en el paso (d) con acetona,
- d.
- repetir los pasos (d) y (e) tres vesces más, y
- g.
- fraccionar el precipitado obtenido en el paso (f) mediante cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Método según la reivindicación 21 donde la
cromatografía del paso (g) se realiza mediante una primera elución
isocrática seguida de un gradiente de acetonitrilo.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21 ó 22 donde la cromatografía del paso (g) se
realiza mediante una primera elución isocrática seguida de un
gradiente de acetonitrilo y una segunda elución en gradiente.
24. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 23 donde la cromatografía del paso (g)
consiste en una cromatografía semipreparativa en fase reversa HPLC
en columna C18.
25. Método de obtención del compuesto según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende todos los
pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 y
además:
- h.
- separar el producto obtenido en el paso (g) mediante cromatografía en capa fina.
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|---|---|---|---|
| ES200930901A ES2360331B8 (es) | 2009-10-26 | 2009-10-26 | Saponinas triterpénicas procedentes del cormo de crocus sativus como adyuvante en formulaciones de vacunas proteicas. |
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| WO2000009075A2 (en) * | 1998-08-14 | 2000-02-24 | Galenica Pharmaceuticals, Inc. | Chemically modified saponins and the use thereof as adjuvants |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011051520A1 (es) | 2011-05-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2360331 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20120704 |