ES2360954T3 - Procedimientos para detectar la evolución de la displasia de cuello uterino de bajo grado. - Google Patents
Procedimientos para detectar la evolución de la displasia de cuello uterino de bajo grado. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2360954T3 ES2360954T3 ES06748239T ES06748239T ES2360954T3 ES 2360954 T3 ES2360954 T3 ES 2360954T3 ES 06748239 T ES06748239 T ES 06748239T ES 06748239 T ES06748239 T ES 06748239T ES 2360954 T3 ES2360954 T3 ES 2360954T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- pap
- chromosome
- probe
- cervical
- patient
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/5755—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the uterine cervix, uterine corpus or endometrium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Paper (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
Abstract
Un procedimiento para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo, comprendiendo el procedimiento: detectar cualquier amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra obtenida a partir de una paciente que tiene i) displasia de cuello uterino de bajo grado; o ii) que no tiene displasia identificando así a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo si una amplificación genómica de cromosoma 3q se detecta.
Description
Este trabajo se respaldó por el Instituto Nacional de Salud.
La visualización de la aneuploidía cromosómica y los cambios en la cantidad de copias de genes asociados al cáncer específicos se ha convertido en un complemento importante en la evaluación morfológica de rutina de muestras citológicas.1 Este enfoque es biológicamente válido y exitoso ya que la aneuploidía cromosómica y los desequilibrios genómicos resultantes son específicos para células cancerosas, distintos para diferentes carcinomas, y se producen temprano durante la evolución de la enfermedad. 2,3 Algunos desequilibrios genómicos se correlacionan con un mal pronóstico y un fallo en el tratamiento,4-6 y otros, tales como la amplificación del oncogén Her2/neu en el cáncer de mama, pueden guiar las decisiones terapéuticas.7
Como la mayoría de los otros carcinomas humanos, los cánceres de cuello uterino se definen por una distribución conservada de desequilibrios genómicos. Además de la infección con el virus del papiloma humano de alto riesgo,9,10 la transformación secuencial del epitelio escamoso del cuello uterino requiere la adquisición de copias adicionales del brazo del cromosoma 3q,11 entre otras anormalidades citogenéticas.12 Los análisis de CGH de carcinomas de cuello uterino han mostrado que más del 85% de los carcinomas de cuello uterino invasivos portan desequilibrios genómicos específicos que dan como resultado un incremento de la cantidad de copias del brazo del cromosoma 3q.5,11,20-26 La región de solapamiento mínimo apunta a la banda de cromosoma 3q26, que contiene el gen para el componente de ARN de telomerasa humana (TERC).27
La implementación de programas de detección de cáncer de cuello uterino ha reducido enormemente la incidencia y la mortalidad de la enfermedad en países industrializados.16,17 Sin embargo, una única evaluación citológica permanece relativamente insensible, de ahí la necesidad de frecuentes investigaciones de seguimiento. Esto es atribuible a errores de muestreo o de interpretación, y al hecho de que puede que algunas lesiones tempranas no hayan adquirido alteraciones fenotípicas reconocibles.17 Los carcinomas de cuello uterino invasivos se desarrollan a través de estadios crecientes de displasia de cuello uterino y avanzan hasta CIN3, que se considera una lesión precancerosa auténtica que requiere intervención quirúrgica. Sin embargo, sólo aproximadamente el 10-15% de todas las lesiones displásicas de bajo grado siguen este trayecto de progresión lineal. La identificación de marcadores de la evolución de la enfermedad, sería por lo tanto de gran interés clínico.
Un estudio previo demostró que la visualización de copias adicionales de TERC puede servir como una prueba específica y sensible para la amplificación de 3q26 en muestras citológicas recogidas de manera rutinaria, incluyendo muestras de displasia de cuello uterino de bajo grado.8 Este hallazgo fue consistente con, pero no concluyente de, la hipótesis de que la ventaja en el crecimiento impuesto de 3q refleja un punto de no retorno durante la transformación maligna secuencial de las células epiteliales de cuello uterino. Por ejemplo, la solicitud de los EE.UU. con número de serie 10/857859, presentada el 4 de junio de 2004 y publicada como la publicación de la solicitud de los EE.UU. N.º 20050026190, indica que la amplificación de 3q26 se pueden usar para detectar selectivamente neoplasias intraepiteliales de cuello uterino de alto grado (CIN II y CIN III) y carcinomas malignos en una biopsia de cuello uterino y especímenes del frotis de Papanicolaou sin detectar neoplasia intraepitelial de cuello uterino de bajo grado. Así, se piensa que la amplificación de 3q26 es un factor de distinción entre adenocarcinomas y displasias de cuello uterino de bajo grado y de alto grado.
Se ha demostrado ahora que la identificación de una amplificación de 3q en la displasia de cuello uterino de bajo grado puede proporcionar información relacionada con el potencial evolutivo de lesiones individuales para el cáncer y la displasia de cuello uterino de alto grado.
La presente invención proporciona un procedimiento para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo, comprendiendo el procedimiento: detectar cualquier amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra obtenida de una paciente i) que tiene displasia de bajo grado, o ii) que no tiene displasia identificando así a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo si se detecta una amplificación genómica del cromosoma 3q.
Se da a conocer un procedimiento para evaluar un cambio en una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado a una afección de cáncer o displasia de cuello uterino de alto grado, que comprende: detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente displasia de cuello uterino de bajo grado para evaluar de este modo el cambio en la afección de una paciente a un cáncer o displasia de cuello uterino de alto grado. La detección de la amplificación genómica del cromosoma 3q indica la evolución de la afección de una paciente a displasia de cuello uterino de alto grado.
Se da a conocer adicionalmente un procedimiento para monitorizar un cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado en una paciente que comprende: someter a ensayo para determinar una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente displasia de cuello uterino de bajo grado para monitorizar de este modo un cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado. El procedimiento puede comprender adicionalmente determinar que la amplificación genómica del cromosoma 3q está presente en la muestra o que la amplificación genómica del cromosoma 3q no está presente en la muestra.
Las displasias de cuello uterino de bajo grado de la invención pueden ser, pero no se limitan a, neoplasias intraepiteliales de cuello uterino de grado 1. Las displasias de cuello uterino de alto grado de la invención incluyen, pero no se limitan a, neoplasias intraepiteliales de cuello uterino de grado 2, neoplasias intraepiteliales de cuello uterino de grado 3 y carcinomas in situ.
En una realización, la muestra obtenida de la paciente es una preparación a partir del cuello uterino, incluyendo, pero sin limitarse a, un frotis de Papanicolaou o una suspensión de células de capa fina (por ejemplo, mono-capa).
De acuerdo con realizaciones específicas de la invención, la amplificación genómica puede estar dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q. Este locus incluye las secuencias de codificación del gen de la telomerasa (TERC). Así, en una realización, la amplificación genómica se detecta hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26. Los procedimientos de la invención pueden implicar adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa, o una parte del mismo.
En otras realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del cromosoma 3q, o una parte del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, EVI1 (sitio de integración vírico ectópico 1, 3q24-3q28), MDS1 (síndrome de mielodisplasia 1, 3q26), MYNN (mioneurina, 3q26.2), GPR160 (receptor acoplado a proteína G 160, 3q26.2-3q27), PRKCI (proteína cinasa C, 3q26.3), SKIL (similar a SKI 3q26), CLDN11 (claudina 11, 3q26.2-3q26.3), EIF5A2 (factor de iniciación de traducción eucariota 5A2, 3q26.2), y TNIK (cinasa de interacción con TRAF2 y NCK, 3q26.2), PLD1 (fosfolipasa D1, 3q26), GHSR (receptor de secretagogos de hormona de crecimiento, 3q26.31), TNSF10 (factor de necrosis tumoral 10, 3q26), ECT2 (oncogén de secuencia de transformación de célula epitelial 2, 3q26.1-3q26.2), WIG1 (proteína con dedos de zinc diana p53, 3q26.3-3q27), PIK3A (fosfoinosítido-3-cinasa, 3q26.3), MFN1 (mitofusina 1, 3q26.32) y USP13 (proteasa específica de ubiquitina 13, 3q26.2-3q26.3).
En otra realización, el marcador detectable de la sonda emite una señal fluorescente. En otra realización más, el marcador detectable de la sonda es cromogénico.
En otra realización más, la amplificación genómica se detecta por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En otra realización más, la amplificación genómica se detecta midiendo la cantidad de polipéptido transcrito a partir de un gen que tiene un locus dentro de la amplificación genómica.
En una realización específica, la amplificación genómica se detecta midiendo la cantidad del polipéptido de telomerasa.
En una realización específica, se puede obtener un frotis de Papanicolaou citológicamente normal de una paciente que no tiene displasia pero que tiene una amplificación genómica del cromosoma 3q.
Se da a conocer un procedimiento para evaluar el mantenimiento o la regresión de una afección de una paciente displasia de cuello uterino de bajo grado que comprende: a) someter a ensayo para determinar una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente displasia de cuello uterino de bajo grado y b) determinar que la amplificación genómica de la etapa a) no está presente, en el que la ausencia de la amplificación genómica de la etapa a) indica el mantenimiento o la regresión de una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado.
En una realización, la regresión se detecta obteniendo un frotis de Papanicolaou citológicamente normal de la paciente.
Se dan a conocer kits proporcionados para llevar a cabo procedimientos de la invención.
Se da a conocer un kit para evaluar un cambio en una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para evaluar el cambio en una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado.
Se da a conocer adicionalmente un kit para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo de acuerdo con procedimientos de la invención.
Se da a conocer un kit para monitorizar un cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado en una paciente que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para monitorizar el cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado.
Se da a conocer un kit para evaluar el mantenimiento o la regresión de una afección de una paciente afección de displasia de cuello uterino de bajo grado que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para evaluar el mantenimiento o la regresión de una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado.
En un aspecto, se proporcionan procedimientos para evaluar un cambio en una afección de una paciente de normal a una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado, displasia de cuello uterino de alto grado o cáncer y comprenden detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente un diagnóstico normal para evaluar de este modo el cambio en la afección de una paciente a una displasia de cuello uterino de bajo grado, displasia de cuello uterino de alto grado o cáncer.
En una realización, la detección de la amplificación genómica del cromosoma 3q indica la evolución de la afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo o alto grado.
En otra realización, la amplificación genómica está dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q.
En un aspecto, se proporcionan procedimientos de diagnóstico de adenocarcinoma en un sujeto y comprenden detectar la amplificación genómica de un gen de la telomerasa o una parte del mismo en un sujeto.
En una realización, se detecta la amplificación genómica hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26.
En otra realización, la sonda comprende un cóntigo de cuatro clones BAC solapantes. En realizaciones relacionadas, la sonda comprende cinco o seis clones BAC solapantes.
En otra realización más, la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa,
o una parte del mismo.
En ciertas realizaciones, la muestra es una preparación a partir del cuello uterino.
En una realización, los procedimientos pueden comprender adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3.
En una realización, los procedimientos pueden comprender adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 7.
En una realización, los procedimientos pueden comprender adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero de los cromosomas 3 y 7.
En un aspecto, se proporcionan kits para monitorizar un adenocarcinoma en una paciente y comprenden una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para monitorizar el adenocarcinoma de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.
Otros aspectos de la invención se describen en o son evidentes a partir de la siguiente divulgación, y están dentro del ámbito de la invención.
La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse junto con los dibujos adjuntos, incorporados en el presente documento por referencia. Se describirán ahora diversas características y realizaciones preferidas de la presente invención a modo de ejemplo no limitante y con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 representa esquemáticamente el conjunto de sondas FISH de triple color (Heselmeyer-Haddad et al., 2003).
La figura 2A muestra los resultados de la hibridación del gen de la TERC (rojo) a los frotis de Papanicolaou previamente teñidos de la paciente 9 (grupo 2, regresoras, tabla 3). Se visualizan dos áreas distintas de los portaobjetos. Para simplicidad, sólo se muestran las señales para la sonda de TERC. Todos los núcleos presentan dos señales de TERC que indican un estado diploide normal para estas células.
La figura 2B muestra los resultados de la hibridación del gen de la TERC (rojo) a los frotis de Papanicolaou previamente teñidos de la paciente 2 (grupo 1, progresoras, tabla 2). Los múltiples núcleos que aparecieron aberrantes durante la detección citológica por todo el portaobjetos revelan copias extra de TERC (mostrado como señales rojas). Nótese que tanto los núcleos más grandes como las células con pequeños núcleos revelan un incremento de la cantidad de copias para este gen (área inferior derecha).
La figura 2C muestra los resultados de la hibridación del gen de la TERC (rojo) a los frotis de Papanicolaou previamente teñidos de la paciente 7 (grupo 1, tabla 2). Nótese múltiples células positivas de 3q en el frotis de Papanicolaou (patrón principal 2-3-3).
La figura 2D muestra los resultados de la hibridación del gen de la TERC (rojo) a los frotis de Papanicolaou previamente teñidos de la paciente 9 (grupo 3, tabla 4). Este caso reveló cuatro, ocasionalmente cinco copias de 3q en una base de diploide (es decir, dos señales para CEP7). De forma interesante, la lesión CIN3 posterior mostró el mismo patrón principal (2-3-4), apoyando la hipótesis de la expansión clonal.
La figura 3A muestra la curva ROC de sensibilidad frente a 1 - especificidad a umbrales que varían entre el 0 y el 100% de células anormales para la ganancia de 3q, y la figura 3b muestra la curva de DFI frente al umbral para la ganancia de 3q. La triángulos blancos tanto en 3A como en 3B denotan los resultados cuando se consideran células con >2 señales de TERC/célula, excluyendo tetraploidía como positiva. Los cuadrados azules reflejan los resultados cuando sólo se consideraron células tetraploides, es decir, patrones de hibridación de cuatro señales para cada sonda (4-4-4). Los círculos rojos muestran los resultados cuando se consideran células con cualquier ganancia de 3q (>2 señales de TERC/célula incluyendo células con un patrón de hibridación tetraploide).
La figura 4 representa un análisis FISH de interfase de la muestra de ganancia de TERC en 3q26 en adenocarcinomas de cuello uterino negativos para VPH e infectados con VPH. (A) Localización cromosómica del conjunto de sondas de triple color: CEP 7 (marcados con Spectrum Aqua, que se pseudo-colorea en azul claro en paneles B, C, E y G), CEP 3 (Spectrum Green, pseudo-coloreado en verde en paneles B, C, E y G), y TERC (Spectrum Orange, pseudo-coloreado en rojo). (B) Núcleos normales con el patrón esperado de dos señales por sonda por núcleo (2-2-2). (C y D) caso negativo para VPH número 4. (E y F) caso infectado con VPH número 6, y (G y H) caso positivo para VPH número 10. Todos Los casos presentan extensiones variantes de ganancia de TERC. Las agrupaciones de células en C, E y G y en D, F y H muestran células con cantidades de señales aberrantes idénticas con el conjunto de sondas de triple color mostrado o bien sólo con la sonda de TERC, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
"Adenocarcinoma" se refiere al menos a un carcinoma de cuello uterino como se conoce por alguien experto en la técnica. El adenocarcinoma de cuello uterino se desarrolla al menos en parte a partir de las células glandulares productoras de moco del cuello intrauterino.
"Displasia de cuello uterino de bajo grado" se refiere a lesiones de cuello uterino displásicas menores incluyendo neoplasias intraepiteliales de cuello uterino de grado 1.
"Displasia de cuello uterino de alto grado" se refiere a carcinoma in situ o lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado incluyendo neoplasias de cuello uterino intraepiteliales de grado 2 ó 3.
"Neoplasias intraepiteliales de cuello uterino" o "CIN" se categorizan como grado 1, 2 ó 3 dependiendo de la extensión de la aberración en la estratificación celular. CIN 1 se caracteriza por la presencia de células de tipo basal inmaduras en el tercio inferior del epitelio. CIN 2 se caracteriza por la presencia de células de tipo basal inmaduras en los dos tercios inferiores del epitelio. En CIN 3, el grosor total del epitelio contiene células no diferenciadas y no estratificadas.
"Evolución" de una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado se refiere a una conversión maligna de lesiones displásicas de cuello uterino menores tales como neoplasias intraepiteliales de cuello uterino de grado 1 o de grado 2 a displasias de cuello uterino de alto grado.
"Mantenimiento" de una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado se refiere a la presencia continua de lesiones de cuello uterino displásicas menores a lo largo del tiempo.
"Regresión" de una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado se refiere a una reducción
o erradicación de lesiones displásicas menores a lo largo del tiempo. La erradicación se puede detectar mediante un frotis de Papanicolaou citológicamente normal en una paciente diagnosticado previamente con displasia de cuello uterino de bajo grado.
"Amplificación genómica" se refiere a un incremento en la cantidad de copias en una secuencia genómica, tal como una secuencia que codifica uno o más genes.
Un "locus" se refiere a una región cromosómica definida de acuerdo con los mapas genéticos de un organismo. Normalmente, los mapas genéticos designan la posición específica (es decir, el "locus") ocupada por un gen dado en un cromosoma y en un locus particular, puede estar presente uno cualquiera de los genes variantes.
Una "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a un polímero de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos en forma monocatenaria o bien bicatenaria y, a menos que se indique lo contrario, debería abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar en una manera similar a los nucleótidos de origen natural.
"Secuencias de ácidos nucleicos complementarios" se refiere a secuencias de ADN o ARN contiguas que tienen nucleótidos compatibles (por ejemplo, A/T, G/C) en posiciones correspondientes, de tal forma que se produce el emparejamiento de bases entre las secuencias. Por ejemplo, las cadenas sentido y antisentido de una hélice de ADN monocatenario se conocen en la técnica por ser complementarias.
Una "sonda" o una "sonda de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se define para ser una colección de uno o más fragmentos de ácidos nucleicos cuya hibridación a una secuencia de ácidos nucleicos cromosómica se puede detectar.
"Hibridar" se refiere a la unión de dos ácidos nucleicos monocatenarios por medio de emparejamiento de bases complementarias así como a dos o más ácidos nucleicos.
Una "sonda centromérica de enumeración" es una sonda que se hibrida a una región cromosómica próxima al centrómero, normalmente una región de secuencia de repetición, y puede indicar la presencia o ausencia de un cromosoma entero.
Una "paciente" es un sujeto hembra, preferentemente humano, que tiene o que tiene previamente cáncer o displasia de cuello uterino, por ejemplo, displasia de cuello uterino de bajo grado, o un frotis de Papanicolaou citológicamente normal. Otras definiciones aparecen en el contexto a lo largo de la divulgación.
II. Procedimientos de la invención
Las muestras biológicas obtenidas a partir de pacientes normalmente son preparaciones de cuello uterino, incluyendo un frotis de Papanicolaou o una suspensión de capa fina de células. Una muestra biológica es una muestra que contiene células o material celular, por ejemplo, células o material derivado del cuello uterino del útero. Ejemplos de especímenes de cuello uterino incluyen biopsias, frotis, raspados de cuello uterino y similares. Normalmente, las células se cosechan a partir de una muestra biológica y se preparan usando técnicas bien conocidas en la técnica. Las muestras pueden comprender cualquier cantidad de células que sea suficiente para un diagnóstico clínico, y contienen normalmente al menos aproximadamente 100 células. En un ensayo típico, el patrón de hibridación se evalúa en aproximadamente 25-5.000 células. Están disponibles numerosos procedimientos para recolectar células de cuello uterino para su evaluación. Por ejemplo, las células de las zonas de transformación extra e intrauterinas se recogen usando dispositivos bien conocidos tales como cepillos cervicales (o "escobas") o espátulas de plástico y de madera. Los frotis convencionales se preparan extendiendo las células bien y de manera uniforme sobre un portaobjetos de vidrio. Después, el portaobjetos se fija rápidamente por inmersión en etanol al 95% o pulverizando con un fijador comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para el procedimiento de recogida ThinPrep™ (Cytyc Corp., Boxborough, Mass.), las células se transfieren del cuello uterino al fijador PreservCyt™. Esto permite a las células preservarse hasta que estén listas para un procesamiento adicional. Después, las células se dispersan suavemente, se aleatorizan y se recogen sobre un filtro de membrana TransCyt™ dibujando la muestra a través del filtro con un vacío hasta que una cantidad óptima de células se deposita en el filtro. Las células se pueden procesar adicionalmente como se desee. En otro procedimiento, las células recogidas en preservCyt™ u otra solución fijadora se pueden lavar adicionalmente mediante centrifugación, retirando el sobrenadante y resuspendiéndolas en solución Carnoys (3:1 de metanol:ácido acético), repitiendo (por ejemplo, tres veces) como se desee. Después, las células se transfieren a un portaobjetos de vidrio goteando una pequeña alícuota de suspensión celular directamente sobre el portaobjeto. Los portaobjetos se secan normalmente durante toda una noche.
Cuando se deseen procedimientos de hibridación, tales muestras biológicas comprenden ADN en una forma adecuada para la hibridación con una de las sondas de la invención. El ácido nucleico puede ser ADN genómico total, ARNm total, ADN genómico o ARNm de cromosomas particulares o secuencias seleccionadas (por ejemplo, secuencias 3q).
La muestra biológica se puede preparar opcionalmente de modo que los núcleos en la muestra biológica permanecen sustancialmente intactos y comprenden núcleos de interfase preparados de acuerdo con técnicas estándar. La muestra biológica también puede comprender cromosoma condensado sustancialmente intacto (por ejemplo, un cromosoma de la metafase). Tales cromosomas condensados o núcleos de interfase son adecuados para su uso como dianas de hibridación en técnicas de hibridación in situ (por ejemplo FISH).
Una sobreabundancia de ARNm y proteína puede resultar de la transcripción de genes duplicados dentro de la región amplificada del cromosoma 3q. Por consiguiente, los procedimientos para detectar la amplificación genómica pueden incluir procedimientos conocidos en la técnica para medir niveles de ARNm (por ejemplo, RT-PCR) y niveles de proteína (por ejemplo, prueba de bandas de Western, ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima (ELISA), inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia). La expresión de proteínas se puede evaluar usando un inmunoensayo. El inmunoensayo es un ensayo que utiliza un anticuerpo para unirse específicamente al analito (por ejemplo, proteína telomerasa). El inmunoensayo se caracteriza por la detección de la unión específica de la proteína a un anticuerpo. El análisis de bandas de Western (inmunotransferencia) también se puede usar para cuantificar la presencia de las proteínas en la muestra. Esta técnica comprende generalmente separar proteínas de muestra por electroforesis en gel sobre la base de peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado, (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nailon o un filtro de nailon derivatizado), e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a la proteína deseada.
Las amplificaciones genómicas también se pueden identificar a través de procedimientos de hibridación en los que se une una sonda a una secuencia de nucleótidos dentro de una muestra u se obtiene a partir de una muestra. Esencialmente, la amplificación genómica se detecta hibridando una sonda que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del cromosoma 3q (por ejemplo, 3q26).
Los formatos de hibridación adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, variaciones de las bandas de Southern, bandas de Northern, CGH, procedimientos de hibridación in situ y amplificación cuantitativa tales como PCR cuantitativa (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Kallioniemi et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 89: 5321-5325 (1992), y PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990)). La muestra también puede comprender ácidos nucleicos aislados inmovilizados sobre una superficie sólida (por ejemplo, nitrocelulosa) para su uso en hibridaciones de Southern o de transferencia en mancha y similares. En diversos de formatos de bandas (por ejemplo, transferencia en mancha, bandas de Southern y bandas de Northern), los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN genómico, ADNc o ARN) se hibridan a una sonda específica para la región diana. La sonda o bien la diana se pueden inmovilizar sobre la superficie sólida. Los procedimientos para llevar a cabo hibridaciones de Southern son bien conocidos por los expertos en la técnica, véase, por ejemplo, Sambrook et al.
La ganancia o la pérdida de cromosomas o de regiones cromosómicas se puede evaluar mediante procedimientos de hibridación in situ en los que se examina el patrón de hibridación de la sonda cromosómica o del conjunto de sondas cromosómicas (por ejemplo, la cantidad de señales para cada sonda), y se registra la cantidad de señales. La hibridación in situ comprende las siguientes etapas principales: (1) fijación de tejido o estructura biológica a analizar; (2) tratamiento de prehibridación de la estructura biológica para incrementar la accesibilidad de ADN diana, y para reducir la unión no específica; (3) hibridación de la mezcla de ácidos nucleicos al ácido nucleico en la estructura biológica o en el tejido; (4) lavados de posthibridación para retirar fragmentos de ácidos nucleicos no unidos en la hibridación y (5) detección de los fragmentos de ácidos nucleicos hibridados. El reactivo usado en cada una de estas etapas y sus condiciones de uso varían dependiendo de la aplicación particular.
En algunas aplicaciones es necesario bloquear la capacidad de hibridación de secuencias repetitivas. En este caso, se usa ADN Cot1 o ADN genómico humano como agente para bloquear tal hibridación. El intervalo de tamaño preferido es de desde aproximadamente 200 pb hasta aproximadamente 1000 bases, más preferentemente de entre aproximadamente 400 hasta aproximadamente 800 pb para ácidos nucleicos traducidos de mella bicatenarios.
Los protocolos de hibridación para las aplicaciones particulares dadas a conocer en el presente documento se describen en Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9138-9142 (1988) y en la publicación EPO N.º 430.402. Los protocolos de hibridación adecuados también se pueden encontrar en Methods in Molecular Biology volumen 33: In situ Hybridization Protocols, K. H. A. Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., (1994) y en Kallioniemi et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 89: 5321-5325 (1992).
Normalmente, es deseable usar FISH de doble color, en el que se utilizan dos sondas, cada una marcada por un tinte fluorescente diferente. Una sonda de prueba que se hibrida a la región de interés se marca con un tinte, y una sonda de control que se hibrida a una región diferentes se marca con un segundo tinte (por ejemplo, una sonda centromérica de enumeración). Un ácido nucleico que se hibrida a una parte estable del cromosoma de interés, tal como la región centromérica, a menudo es más útil como sonda de control. De este modo, se pueden explicar las diferencias entre la eficacia de la hibridación de muestra a muestra.
Los procedimientos FISH para detectar anormalidades cromosómicas se puede llevar a cabo sobre células individuales a partir de la muestra. Se pueden usar secciones del tumor embebidas en parafina, como material recién preparado o congelado. Ya que la FISH se puede aplicar al material limitado, también se pueden usar improntas preparadas a partir de tumores primarios no cultivados (véase, por ejemplo, Kallioniemi, A. et al., Cytogenet. Cell Genet. 60: 190-193 (1992)). Por ejemplo, se pueden usar pequeñas muestras de tejido de biopsia para improntas (véase, por ejemplo, Kallioniemi, A. et al., Cytogenet. Cell Genet. 60: 190-193 (1992)). También se pueden analizar pequeñas cantidades de células obtenidas a partir de biopsia por aspiración o células en fluidos corporales (por ejemplo, sangre, orina, esputo y similares). La comparación de la intensidad de la señal de hibridación de la sonda para la región diana con la señal de una sonda dirigida a un control (no amplificado o retirado) tal como ADN centromérico, proporciona una estimación de la cantidad de copias relativo del ácido nucleico diana.
Usando los resultados proporcionados en el presente documento, un experto puede preparar sondas de ácidos nucleicos que sean complementarias a las secuencias de 3q conocidos por tener alteraciones genéticas. En particular, tales secuencias de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, TERC (telomerasa, 3q26), EVI1 (sitio de integración vírico ectópico 1, 3q24-3q28), MDS1 (síndrome de mielodisplasia 1, 3q26), MYNN (mioneurina, 3q26.2), GPR160 (receptor acoplado a proteína G 160, 3q26.2-3q27), PRKCI (proteína cinasa C, 3q26.3), SKIL (similar a SKI, 3q26), CLDN11 (claudina 11, 3q26.2-3q26.3), EIF5A2 (factor de iniciación de traducción eucariota 5A2, 3q26.2), y TNIK (cinasa de interacción con TRAF2 y NCK, 3q26.2), PLD1 (fosfolipasa D1, 3q26), GHSR (receptor de secretagogos de hormona de crecimiento, 3q26.31), TNSF10 (factor de necrosis tumoral 10, 3q26), ECT2 (oncogén de secuencia de transformación de célula epitelial 2, 3q26.1-3q26.2), WIG1 (proteína con dedos de zinc diana p53, 3q26.3-3q27), PIK3A (fosfoinosítido-3-cinasa, 3q26.3), MFN1 (mitofusina 1, 3q26.32) y USP13 (proteasa específica de ubiquitina 13, 3q26.2-3q26.3).
En una realización preferida, se aplica una sonda genómica para el gen de la telomerasa (TERC) en la banda de cromosoma 3q26 en combinación con dos sondas de control (CEP3 y CEP7).
La sonda a menudo se marca con un marcador detectable de modo que se pueda identificar su unión a la secuencia de ácidos nucleicos diana. En algunas realizaciones, las sondas se unen a una superficie sólida como una serie de moléculas de ácido nucleico. La sonda se produce a partir de una fuente de ácidos nucleicos de una o más partes particulares (preseleccionadas) del genoma, por ejemplo uno o más clones, un cromosoma completo aislado o un fragmento de cromosoma, o una colección de productos de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las sondas de la presente invención están producidas a partir de ácidos nucleicos encontrados en las regiones de alteración genética como se describe en el presente documento. La sonda se puede procesar de alguna manera, por ejemplo, bloqueando o retirando ácidos nucleicos repetitivos o por enriquecimiento con ácidos nucleicos únicos.
La muestra o las sondas usadas en la invención pueden ser ácidos nucleicos aislados inmovilizado sobre una superficie sólida (por ejemplo, nitrocelulosa) para su uso en hibridaciones de Southern o de transferencia en mancha y similares. En algunas realizaciones, la muestra o las sondas pueden comprender una serie de ácidos nucleicos como se describe por ejemplo en el documento WO 96/17958. Las técnicas que pueden producir series de alta densidad para diversas aplicaciones también se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Fodor et al. Science 767-773 (1991) y la patentes de los EE.UU. N.º 5.143.854). En algunos casos, los ácidos nucleicos se pueden amplificar usando técnicas estándar, tales como PCR, antes de la hibridación.
Se pueden usar una serie de procedimientos para identificar sondas que se hibriden específicamente a la región 3q26 distintas de las que se ejemplifican aquí. Por ejemplo, se pueden generar sondas mediante selección aleatoria de clones a partir de una biblioteca específica de cromosomas, y después mapear por microscopía de imagen digital. Este procedimiento se describe en la patente de los EE.UU. N.º 5.472.842. Brevemente, se digiere ADN específico de cromosoma o genómico con enzimas de restricción o se cizalla mecánicamente para dar secuencias de ADN de al menos aproximadamente 20 kb y más preferentemente aproximadamente de 40 kb a 300 kb. Las técnicas de digestión de secuencia parcial son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning 2ª Ed., Wiley N.Y. (1988). Las secuencias resultantes están ligadas con un vector y se introducen en el huésped apropiado. Los vectores ejemplares adecuados para este fin incluyen cosínidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC) y fagos deP1. También están disponibles comercialmente diversas bibliotecas que abarcan cromosomas enteros de, por ejemplo, Genoma Systems. Alternativamente, se pueden obtener bibliotecas del registro de clones BAC/PAC o de los clones de Caltech.
Una vez se construye una biblioteca de sondas, un subgrupo de las sondas se mapea físicamente en el cromosoma 3q. Se pueden usar FISH y análisis de imagen digital para localizar clones a lo largo del cromosoma deseado. Brevemente, los clones se mapean por FISH hasta la metafase se extiende a partir de células normales usando, por ejemplo, FITC como el fluoróforo. Los cromosomas se pueden contrateñir mediante una tinción que tiñe el ADN con independencia de la composición de bases (por ejemplo, yoduro de propidio), para definir la representación del cromosoma. Las metafases teñidas se diagnostican por imagen en un microscopio de fluorescencia con un divisor de haces policromáticos para evitar cambios de imagen dependientes del color. Las diferentes imágenes de color se adquieren con una cámara CCD y las imágenes digitalizadas se almacenan en un ordenador. Después, se usa un programa de ordenador para calcular el eje del cromosoma, proyectar las dos (para secuencias de copia individuales) señales de FITC perpendicularmente sobre este eje, y calcular la longitud fraccional promedio a partir de una posición definida, normalmente el p-telómero. Este enfoque se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. N.º 5.472.842.
Las sondas que se hibridan a locus cromosómicos específicos están disponibles comercialmente de Vysis, Inc. (Downers Grove, Ilinois.) y Cancer Genetics, Inc., River Vale, Nueva Jersey. Alternativamente, las sondas se pueden preparar de manera no comercial usando técnicas bien conocidas. Las fuentes de ADN para usar en la construcción de sondas de ADN incluyen ADN genómico, secuencias de ADN clonado tales como cromosomas artificiales de bacterias (BAC), híbridos de células somáticas que contienen uno o una parte de un cromosoma humano junto con el complemento de cromosoma normal del huésped, y cromosomas purificados mediante citometría de flujo o microdisección. La región de interés se puede aislar a través de clonación o mediante amplificación específica de sitio por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, Nath, at al., Biotechnic Histochem, 1998, 73 (1): 6-22; Wheeless, et al., Cytometry, 1994, 17:319-327; y la patente de los EE.UU. N.º
5.491.224. También se pueden usar sondas de APN o ADN oligoméricas sintetizadas.
La información de secuencia de los genes identificados en el presente documento permite el diseño de sondas de hibridación altamente específicas o de cebadores de amplificación adecuados para la detección de las secuencias diana a partir de estos genes. Como se destaca anteriormente, se conoce la secuencia completa de estos genes. Los medios para detectar las secuencias de ADN específicas dentro de los genes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar sondas de oligonucleótidos elegidas por ser complementarias de una subsecuencia seleccionada dentro del gen. Alternativamente, las secuencias o subsecuencias se pueden amplificar mediante una variedad de técnicas de amplificación de ADN (por ejemplo, por medio de la reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa, amplificación de la transcripción, etc.) antes de la detección usando una sonda. La amplificación de ADN incrementa la sensibilidad del ensayo proporcionando más copias subsecuencias diana posibles. Además, usando cebadores marcados en el procedimiento de amplificación, las secuencias de ADN se pueden marcar ya que están amplificadas.
El tamaño de la región cromosómica detectada mediante las sondas usadas en la invención puede variar, por ejemplo, desde una secuencia de sonda de varios cientos de pares de bases hasta un gran segmento de 150.000 bases. Para sondas específicas de locus, que están marcadas directamente, es preferente el uso de sondas de al menos 100.000 bases de complejidad, y el uso de ácido nucleico de bloqueo no marcado, como se da a conocer en la patente de los EE.UU. N.º 5.756.696, incorporada en el presente documento por referencia, para evitar la unión no específica de la sonda. También es posible el uso de ácido nucleico oligomérico sintético, no marcado o ácido nucleico de proteínas como el ácido nucleico de bloqueo. Para dirigir un locus de gen particular, es preferente que las sondas abarquen el locus de codificación genómico entero del gen.
La sonda de la invención se puede marcar con un marcador detectable. Los procedimientos de etiquetado de los ácidos nucleicos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las marcas preferidas son aquellas que son adecuadas para su uso en hibridación in situ. Las sondas de ácido nucleico se pueden marcar de manera detectable antes de la reacción de hibridación. Alternativamente, se puede usar una marca detectable que se une al producto de hibridación. Tales marcas detectables incluyen cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable y se han desarrollado bien en el campo de los inmunoensayos.
Las marcas se pueden acoplar a las sondas en una variedad de medios conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las sondas de ácido nucleico se marcan usando traducción de mella o extensión del cebador aleatoria (Rigby, et all. J. Mol. Biol., 113: 237 (1977) o Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)). Los procedimientos particularmente preferentes para el marcado de sondas se describen en la patente de los EE.UU. N.º 5.491.224. Estos procedimientos implican el marcado directo de las sondas mediante modificación química de residuos de citosina.
Como se usa en el presente documento, un marcador detectable es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, enzimáticos, inmunoquímicos o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen marcas radiactivas (por ejemplo, 32P, 125I, 14C, 3H y 35S), fluoróforos (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, Texas Red), reactivos densos a los electrones (por ejemplo, oro), enzimas (por ejemplo, enzimas que metabolizan sustratos para producir una señal cromogénica), marcas colorimétricas (por ejemplo, oro coloidal), marcas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads™) y similares. Ejemplos de marcas que no se detectan directamente pero que se detectan mediante el uso de una marca directamente detectable incluyen biotina y dioxigenina así como haptenos y proteínas para los que están disponibles antisueros marcados o anticuerpos monoclonales.
Las sondas cromosómicas pueden contener cualquier marcador detectable que facilite la detección de la sonda cuando se hibrida a un cromosoma. Los marcadores eficaces incluyen tanto marcas directas como indirectas como se describe a continuación.
Las sondas cromosómicas pueden estar marcadas directamente con un marcador detectable. Ejemplos de marcadores detectables incluyen fluoróforos, es decir, moléculas orgánicas que presentan fluorescencia después de absorber luz, e isótopos radiactivos, por ejemplo, (por ejemplo 32P, 125I, 14C, 3H y 35S). Los fluoróforos pueden estar marcados directamente después de la unión covalente a un nucleótido incorporando el nucleótido marcado en la sonda con técnicas estándar, tales como traducción de mella, cebado aleatorio y marcado por PCR. Alternativamente, los nucleótidos de deoxicitidina dentro de la sonda se pueden transaminar con un engarce. Después, el fluoróforo se puede unir covalentemente a los nucleótidos de deoxicitidina transaminados. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.º 5.491.224 de Bittner, et al., que se incorpora en el presente documento por referencia. Las técnicas de marcado de sonda útiles se describen en Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, Y.-S. Fan, Ed., Chap. 2, "Labeling Fluorescence In situ Hybridization Probes for Genomic Targets", L. Morrison et.al., p. 21-40, Humana Press, (2002), incorporado en el presente documento por referencia.
Ejemplos de fluoróforos que se pueden usar en los procedimientos descritos en el presente documento son: ácido 7amino-4-metilcumarin-3-acético (AMCA), Texas Red™ (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.); 5-(y-6)-carboxi-Xrodamina, lisamina rodamina B, 5-(y-6)-carboxifluoresceína; fluoresceína-5-isotiocianato (FITC); ácido 7dietilaminocumarin-3-carboxílico, tetrametil-rodamina-5-(y-6)-isotiocianato; 5-(y-6)-carboxitetrametilrodamina; ácido 7-hidroxi-cumarin-3-carboxílico; ácido 6-[fluoresceína 5-(y-6)-carboxamido]hexanoico; ácido N-(4,4-difluoro-5,7dimetil-4-bora-3a, 4a diaza-3-indacenepropionico; eosina-5-isotiocianato; eritrosina-5-isotiocianato; 5-(y-6)carboxirodamina 6G; acetil-azida azul de Cascade™ (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.), SpectrumOrange™, SpectrumAqua™, SpectrumGreen™, SpectrumGold™, y SpectrumRed™(Vysis, Inc., Downers Grove, III.).
Cuando se usan sondas múltiples, se pueden elegir fluoróforos de diferentes colores de modo que cada sonda cromosómica en el conjunto se puede visualizar claramente. Preferentemente, el panel de sonda de la invención comprenderá cuatro sondas separadas, cada una marcada con un fluoróforo separado. También está dentro del alcance de la invención el uso de múltiples paneles secuencialmente en la misma muestra: en esta realización, después de que se hibride el primer panel, los resultados se diagnostican por imagen digitalmente, la muestra se destiñe y después se hibrida con un segundo panel. Las sondas se pueden ver con un microscopio de fluorescencia y un filtro apropiado para cada fluoróforo, o usando conjuntos de filtros de paso de bandas dobles o triples para observar múltiples fluoróforos. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.º 5.776.688 de Bittner, et al., que se incorpora en el presente documento por referencia. Se puede usar cualquier procedimiento de diagnóstico por imagen microscópico adecuado para visualizar las ondas hibridadas, incluyendo sistemas de diagnóstico por imagen digital automatizados, tales como los disponibles de MetaSystems o Applied Imaging. Alternativamente, se pueden usar técnicas tales como citometría de flujo para examinar el patrón de hibridación de las sondas cromosómicas.
Las sondas también se pueden marcar indirectamente, por ejemplo, con biotina o digoxigenina por medios bien conocidos en la técnica. Sin embargo, después se requieren marcadores detectables secundarios o procesamiento adicional para visualizar las sondas marcadas. Por ejemplo, una sonda marcada con biotina se puede detectar por avidina conjugada con un marcador detectable, por ejemplo, un fluoróforo. Adicionalmente, la avidina se puede conjugar con un marcador enzimático tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano. Tales marcadores enzimáticos se pueden detectar en reacciones colorimétricas estándar usando un sustrato para la enzima. Los sustratos de la fosfatasa alcalina incluyen 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y nitro azul de tetrazolio. El diaminobenzoato se puede usar como sustrato para peroxidasa de rábano. Se puede lograr la detección de fluorescencia de una biotina hibridada u otra sonda marcada indirecta mediante el uso del sistema de amplificación con tiramida comercialmente disponible.
La presente invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes, ilustrativos que proporcionan una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas.
EJEMPLOS
5 Se recogieron 59 muestras de frotis de Papanicolaou diagnosticadas rutinariamente y teñidas previamente de 34 pacientes a partir del archivo del laboratorio de citopatología del Klinik Kloster Paradiese en Soest, Alemania, con el consentimiento informado, y se asignaron a tres grupos. Se evaluaron las frotis de Papanicolaou de acuerdo con procedimientos de diagnóstico de rutina establecidos, es decir, detección inicial por un auxiliar de laboratorio de citología y (cuando se encontraron células aberrantes) un diagnóstico por consenso de dos patólogos.
10 En resumen, se tiñeron todas las muestras de acuerdo con procedimientos estándar y se embebieron en un medio de montaje permanente bajo cubreobjetos. Se adquirieron imágenes citológicas de las muestras. A partir de lesiones citológicamente normales, se tomaron 15-30 imágenes de campo claro de áreas sobre los portaobjetos que contenían células epiteliales con densidad celular razonable. Si durante el procedimiento de detección de frotis de
15 Papanicolaou normales se encontraron células que parecían sospechosas, se tomaron imágenes de éstas, también. A partir de lesiones de CIN y de los carcinomas, se adquirieron entre 15 y 30 imágenes de áreas que contenían células fenotípicamente sospechosas usando un objetivo seco de contraste de Leica Phase de 20x (NA 0,5). Se registraron las coordenadas xy de estas áreas.
20 Se llevó a cabo la evaluación citológica de acuerdo con un sistema de clasificación personalizado en Alemania. La tabla 1 presenta la conversión del sistema de clasificación alemán (basado en la nomenclatura de Munich)13 a la nomenclatura de Bethesda14 y la nomenclatura usando neoplasias intraepiteliales de cuello uterino.
Tabla 1: Comparación de terminología: Sistemas de clasificación citológica
- Clasificación de Bethesda
- Neoplasia intraepitelial de cuello uterino (CIN) Pap I-V (usado en Alemania)
- Normal
- Normal
- Pap I, Pap II
- ASCUS
- ASCUS
- Pap IIw, Pap III
- LSIL (lesión intraepitelial escamosa de bajo grado)
- CIN 1 Pap IIID
- HSIL (lesión intraepitelial
- CIN 2
- escamosa de alto grado)
- CIN 3 Pap IVa, Pap IVb
- Carcinoma
- Carcinoma Pap V
25 Los grupos de pacientes fueron los siguientes: el primer grupo de pacientes (n=22 muestras) consistió en 12 casos para los que el diagnóstico inicial fue CIN1 y CIN2 (PapIIId). Los frotis de Papanicolaou combinados detectados de dos meses a dos años después del diagnóstico inicial revelaron una evolución a CIN3 (PapIV). Este grupo se seleccionó para evaluar si las lesiones de CIN1 y CIN2 que evolucionan a CIN3 llevan ya copias extra del brazo del
30 cromosoma 3q.
El segundo grupo (n=19 muestras) consistió en 10 casos en los que se evaluaron los frotis de Papanicolaou como CIN1 y CIN2, y cuyos frotis de Papanicolaou posteriores, de varios meses a dos años después, fueron citológicamente normales. Se planteó la hipótesis de que las lesiones de CIN1 y CIN2 en este grupo no habrían
35 adquirido ganancias de 3q.
El tercer grupo (n=23 muestras) consistió en 12 casos para los que los frotis de Papanicolaou se diagnosticaron inicialmente como normales. Sin embargo, en todos los casos, estas mujeres desarrollaron CIN3 (PapIVa/b) (n=11)
o carcinomas de cuello uterino (PapV) (n = 1) después de un periodo de seguimiento de sólo uno a tres años. En
40 este grupo, sería de interés saber si algunos de los frotis de Papanicolaou normales fueron al menos inicialmente positivos para la ganancia de 3q y evaluar por qué la detección citológica no ha identificado las células aberrantes.
Ejemplo 2: FISH y enumeración de señales
45 Antes de la hibridación in situ, se retiraron los cubreobjetos incubando los cubreobjetos en xileno durante 2-4 días. Después de retirar los cubreobjetos, se lavaron dos veces los portaobjetos en xileno, se rehidrataron, y se destiñeron en HCl al 0,5%/EtOH al 70% durante 1-2 horas. Se pretrataron los portaobjetos con pepsina al 0,05% durante 10-30 minutos y se fijaron en EtOH al 100%.
50 El panel de sondas fluorescentes de tres colores se ha descrito previamente en detalle.8 Consiste en un cóntigo de BAC que contiene el gen de la telomerasa humano (TERC, marcado con SpectrumOrange™), una sonda centromérica de enumeración para el cromosoma 3 (CEP3, se marcaron con SpectrumGreen™), y una sonda de control para el centrómero del cromosoma 7 (CEP7, marcado con SpectrumAqua™). El conjunto de sondas se representa esquemáticamente en la figura 1.
Los detalles de las condiciones de hibridación y de los lavados de posthibridación se describieron previamente.8 Las sondas se proporcionaron por Vysis, Inc./Abbott Laboratories (Downers Grove, IL). Se hibridaron aproximadamente un tercio de las muestras usando un cóctel de sondas proporcionado por Cancer Genetics, Inc. (Milford, MA). En este conjunto de sondas, se reemplazó la sonda de TERC marcada con Spectrum Orange con un cóntigo de BAC específico para TERC que se marcó directamente con rodamina usando el protocolo desarrollado por Kreatech (http://www.kreatech.com). En resumen, este protocolo depende del uso de una molécula que consiste en un complejo de platino, una molécula detectable y un grupo saliente, que es desplazado después de la reacción con la diana. La molécula forma un enlace coordinado, acoplándose firmemente a la diana. El comportamiento de los conjuntos de sonda fue comparable (datos no mostrados).
Después de la hibridación, se contratiñeron los núcleos celulares con DAPI y se embebieron en una solución antidesteñimiento. Los detalles del procedimiento FISH, que también se pueden recuperar en http://www.riedlab.nci.nih.gov, son los siguientes: se lavaron los portaobjetos hibridados en formamida al 50%/2X SSC (pH 7-7,5) durante 3x5 min a 45ºC, con agitación. Se lavaron los portaobjetos en 0,1x SSC a 45ºC durante 3x5 min, con agitación. Se sumergieron los portaobjetos en 4X SSC/Tween 20 al 0,1%. Se añadieron 120 µl de solución bloqueante (BSA al 3%/4X SSC/Tween 20 al 0,1%) a los cubreobjetos, que después se cubrieron con un cubreobjetos de 24 mm x 60 mm en una cámara de hibridación húmeda a 37ºC durante 30 min.
Se sumergieron los portaobjetos en 4X SSC/0/15 Tween 20 para retirar por lavado la solución de bloqueo. Se tiñeron los cubreobjetos durante 5 minutos en solución de tinción de DAPI en una cubeta coplin protegida de la luz. Se lavaron los portaobjetos durante 5 minutos en 2X SSC, con agitación. Después, se deshidrataron los cubreobjetos sumergiéndolos en una serie de etanol de: 70%, 90% y 100% y se secaron al aire. Finalmente, se aplicaron 35 µl de solución anti-desteñimiento (a base de 1,4-fenilen-diamina), se cubrieron los portaobjetos con cubreobjetos de 24 mm x 60 mm y se almacenaron en un recipiente protegido de la luz a 4ºC hasta el diagnóstico por imagen del portaobjetos.
Después del traslado, se adquirieron imágenes de FISH usando un objetivo de inmersión en aceite Leica de 40x (NA 1,25). Las imágenes representativas de los resultados tanto de citología como de FISH se muestran en la figura 2. Con el fin de adquirir imágenes para el área idéntica sobre los portaobjetos, se tomaron varias imágenes fluorescentes. Se evaluaron diferentes cantidades de células por caso: esta cantidad fue dependiente de la densidad celular y de la cantidad de células morfológicamente aberrantes (como se identifica por la tinción de Papanicolaou anterior). La enumeración de señales se centró principalmente en aquellas células que parecían sospechosas por la detección citológica de rutina (véanse los ejemplos en la figura 2). Por lo tanto, el procedimiento de enumeración de señales difirió del descrito previamente.8 Se consideraron positivos para el ensayo de 3q los casos en los que más del 20% de las células presentaron una cantidad de señales de TERC mayor de 2.
Fueron posibles análisis exitosos de muestras secuenciales en 12 de 22 casos en el grupo 1, en 10 de 19 casos en el grupo 2 y en 12 de 23 casos en el grupo 3. Las imágenes morfológicas que se adquirieron antes de FISH se revisaron y se evaluaron independientemente por dos patólogos para asegurar una correlación directa de la genética con el diagnóstico citológico. En los pocos casos de menor discordancia entre los dos patólogos, se logró un diagnóstico de consenso.
Los resultados se resumieron en las tablas 2-4.
Tabla 2: Grupo 1: Progresoras con PAPIIID positivo de 3q. Número de caso de paciente, fecha de nacimiento, fechas de frotis de Papanicolaou, patrones de hibridación, diagnóstico de evaluación y estado de 3q para la Pap III y el Pap IVa posterior en paciente.
- Estado de 3q
- Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia n.d. Ganancia Ganancia Ganancia Tetraploide Tetraploide
- Patrones de hibridación observados en Pap IVa y la cantidad de núcleos contados para cada patrón. Los patrones se describen en el ordensiguiente: CEP7-CEP3-3q
- 5x2-3-3,1x3-3-3,1x3-4-4,1x4-5-5 9x2-2-3,3x2-3-3,14x3-3-3 53x 2-2-3,4x 2-3-3,4x 2-3-4,1x 2-25, 5x 3-3-3 5x 7-7-6,4x ?- ?-5 ó 6 9x 2-2-2,1x 2-2-3, 3x 2-3-3, 2x 2-24, 5x 2-3-4 1x ?- ?-2,2x ?- ?-4, 2x 2-?-5,11x 3?-5,2x 7-7- 5,1x3-?-6 n.d. 1x 3-3-3,1x 3-4-4,7x 4-4-4.1x 4-45.4x 4-5-5, 2x5-5-5 2x 2-2-2,2x 3-4-4,15x 4-4-4.1x 4-45,2x 4-4- 4 ó 5, 2x 4-5-5,1x4-46,1x5-5-5 17x 4-4-4, 5x 4-5-5,1x 5-5-5 13x 2-2-2, 6x 4-4-4 4x 2-2-2,17x 4-4-4,1x 4-4-5?
- Diagnóstico deevaluación(diagnóstico deconsenso de dospatólogos queevalúan lasimágenes dePapanicolaouquecorresponden alas áreas quehibridaron con3q)
- Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa. CIN3 Pap IVa. CIN3 Pap IVa. CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa. CIN3 Pap IVa, CIN3
- Fecha de Pap IVa
- Dic. 00 Oct. 00 Sept. 01 Mar. 01 Jul. 01 Sept. 00 2003 Feb. 98 Ene. 99 Dic. 99 Jul. 97 Jul. 01
- Estado de 3q
- Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Tetraploide Tetraploide Tetraploide Tetraploide Tetraploide
- Patrones de hibridación observados en Pap IIID y la cantidad de núcleos contados para cada patrón. Los patrones se describen en el ordensiguiente: CEP7-CEP3-3q
- 1x 2-2-4,1x 2-2-3, 3x ?- ?-3,1x 3-33,1x 5-5-5, 1x?-?-5 14x 2-2-3,1x2-3-3,13x 3-3-3 3x 2-3-3, 2x 2-3-3or4,2x 2-3-4,3x 24-4.2x 3-3- 3 6x 2-2-5,10x 2-2-6.4x 2-?-4 ó 5 6x 7-2-2,18x 7-3-4, 5x 7-2-4, 6x ?- ?4 20x 2-2-2, 2x 2-2-3, 2x 2-3-4, 5x 3-44. 4x 3-4-5 10x2-2-2,12x2-3-3, 2x2-4-4 11x 2-2-2,1x 2-2-3,1x 2-4-4, 8x 4-44,1x 4-4-5 2x2-2-2,1x 2-2-4,4x 4-4-4 42x4-4.4.1x3-3-3? 5x 2-2-2. 5x 4-4*4 2x 2-2-2,29x 4-4-4,1x 4-4-4 ó 5
- Diagnóstico deevaluación(diagnóstico deconsenso de dospatólogosevaluando lasimágenes dePapanicolaouquecorresponden alas áreas quehibridaron con3q)
- Pap IVa, CIN3 Pap IIID, CIN 2 Pap IIID, CIN 2 Pap IIID, CIN 2 Pap IIID, CIN 2 Pap IIID. CIN 2 Pap IIID, CIN 2 Pap IIID. CIN 2 Pap llw. ASCUS Pap IIID. CIN 2 Pap IIID, CIN 2 Pap IIID. CIN 2
- Fecha de Pap III D
- Oct. 00 Ago. 00 Jun. 01 Ene. 01 Jun. 00 Jul. 00 Oct. 00 Dic. 97 1997 Oct. 98 Mar. 97 1999
- Fecha de nacimiento
- 30/01/1964 12/12/1947 27/03/1968 21/01/1962 21/09/1959 25/10/1954 05/07/1960 07/01/1961 74 11/06/1962 28/12/1957 24/09/1961
- N.º de caso
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Los "patrones principales" están marcados en negrita "n.d." no determinadoTabla 2. Se muestran los patrones de hibridación y la cantidad de células con un patrón de hibridación específico observado en frotis de Papanicolaou individuales. La columna "estado de 3q" refleja la interpretación de los patrones de hibridación ya que se refiere a cantidades de copias de 3q Tabla 3: Grupo 2: Regresoras. Número de caso de paciente, fecha de nacimiento, fechas de frotis de Papanicolaou, patrones de hibridación, diagnóstico de evaluación y estado de 3q para la Pap III y el frotis de Papanicolaou normal posterior de paciente.
- estado de 3q
- Diploide n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Diploide n.d. n.d. n.d.
- Patrones dehibridaciónobservados en Pap II y la cantidad denúcleos contadospara cada patrón. Los patrones sedescriben en elorden siguiente:CEP7-CEP3-3q
- 34x2-2-2 no evaluable n.d. no evaluable no evaluable n.d. 20x2-2-2 no evaluable n.d. no evaluable
- Diagnóstico deevaluación(diagnóstico deconsenso de dospatólogos queevalúan lasimágenes dePapanicolaou quecorresponden a las áreas quehibridaron con 3q)
- Pap I, normal n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. Pap II, normal n.d. n.d. n.d.
- Fecha de Pap II
- Ago. 00 2001 Dic. 00 2001 Dic. 99 2000 Jul. 01 Abr. 00 2001 2001
- estado de 3q
- Diploide Diploide Diploide Diploide Diploide Diploide Diploide Tetraploide Tetraploide Tetraploide
- Patrones de hibridación observados en Pap IIID y la cantidad de núcleos contados para cada patrón. Los patrones se describen en el ordensiguiente: CEP7-CEP3-3q
- 29x 2-2-2 25x 2-2-2,1x 2-3-37 40x 2-2-2 46x 2-2-2, 3x 4-4-4,1x 4-4-4? 49x 2-2-2,1x 2-2-37,1x 2-2-4, 2x 4-4-4 57x 2-2-2,1x 2-2-3?, 3x 2-2-4 19x 2-2-2, 2x 4-?-4,1x ?-?-4 ó 5 18x 2-2-2,1x2-2-4,4x 4-4-4,1x 4-?-4 50x 2-2-2, 1x 2-2-4?, 13x 4-4-4 10x 2-2-2, 7x 4-4-4,1x 4-?-4
- Diagnóstico deevaluación(diagnóstico deconsenso de dospatólogos queevalúan lasimágenes dePapanicolaou quecorresponden a las áreas quehibridaron con 3q)
- Pap IIID CIN 2 Pap IIID CIN 2 Pap IIID CIN1/2 Pap IIID CIN 2 Pap IIID CIN 2 Pap IIID CIN1/2 Pap IIID CIN 2 Pap IIID CIN 1/2 Pap IIID CIN 1 Pap IIID CIN 2
- Fecha de Pap IIID
- Oct.99 Ene.01 2000 2000 Jul. 99 Feb.99 Ago.99 1999 2000 Feb.01
- Fecha de nacimiento
- - 03/09/1959 28/03/1969 06/04/1969 05/06/1977 28/02/1970 15/04/1947 - 01/08/1954 14/09/1973
- N.º de caso
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Los "patrones principales" están marcados en negrita"n.d." no determinado
Tabla 3. Se muestran los patrones de hibridación y la cantidad de células con un patrón de hibridación específico observado en frotis de Papanicolaou individuales. La columna "estado de 3q" refleja la interpretación de los patrones de hibridación ya que se refiere a cantidades decopias de 3q
Nueve de las 12 lesiones de CIN3 en el grupo 1 (Tabla 2: progresoras) revelaron diversos grados de células con copias extra del brazo del cromosoma 3q y dos fueron tetraploides (patrón de hibridación de cuatro señales para todas las tres sondas, 4-4-4); un caso no se determinó. Siete de las lesiones de CIN1 y CIN2 combinados precedentes fueron positivas para ganancia de 3q, indicando así que aquellas lesiones CIN1/CIN2 con una alta probabilidad para la evolución llevan frecuentemente copias extra de este marcador genético. Las cinco lesiones restantes fueron tetraploides, incluyendo los precursores de las dos lesiones de CIN3 tetraploides.
En el grupo 2 (Tabla 3: regresoras), siete de las lesiones CIN1/CIN2 que no evolucionaron fueron diploides (patrón de hibridación de dos señales cada una para todas las sondas, 2-2-2); tres casos fueron tetraploides (4-4-4), y ninguno de los casos mostró una ganancia de 3q. Estos hallazgos demostraron que las lesiones CIN1/CIN2 que experimentaron espontáneamente una regresión no llevan una ganancia de TERC.
- estado de 3q
- Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia Tetraploide Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia
- Patrones de hibridación observados en Pap IVa/b y la cantidad de núcleoscontados para cada patrón. Los patrones se describen en el orden siguiente: CEP7CEP3-3q
- 4x 2-2-3, 2x 2-3-3,1x 3-3-3,1x 2-3-4, 1x 25-5. 3x 3 5-5,4x 4-5-5 5x 2-2-3, 5x 2-3-3, 3x 2-4-4, 3x 4-4-4,1x 54-4 1x 2-2-2, 6x 2-2-3, 3x 2-3-3,1x 2-2-4, 1x 23-4 4x 2-2-2, 2x 2-2-3, 6x 2-3-3,1x 2-3-4, 2x 33-3, 2x 3 3-4,1x 3-3-5,1x 4-4-4, 4x 3-3-? 18x 2-2-2, 6x 2-2-3, 4x 2-3-3,1x 3-3-3 1x 2-2-2, 2x 3-4-4,7x 4-4-4, 4x 4-5-5, 9x 55-5 9x 7-?-3, 4x7-3-3,2x2-3-3 61 x 4-4-4,1x 2-2-37,3x 4-4-57,1x 3-4-4? 2x 2-2-2,3x 2-3-3,98x 2-3-4,1x 2-3-5, 2x 24-5, 4x4-6-6 4x 2-2-2,1x 2-2-3,3x 2-3-3, 6x 2-2-4, 8x 22-5, 8x 2-2-6,1x2-2-7, 3x 2-2-8, 26x 2-44,1x 2-4-5,1x 2-4-6.1x 2-4-5,13x 2-5-5,1x2-4-6,1x 2-6-9,1x 3-3- 3,10x 3-4-4,1x 3-35,1x 3-3-6,1x 3-3-7,1x 3-4-5, 1x3-5-7.1x36-6.3x4-4-4 6x2-2-2, 5x2-4-4,128x2-5-5 6x 2-2-2, l0x 2-2-3,1x 3-2-3, 3x 2-3-5,1x 22-8,1x 2-3-8.1x 3-3-8, 87x 4-3-8,1x 4-45,1x 4-4-8,1x 5-4-8
- Diagnóstico deevaluación(diagnóstico deconsenso de dospatólogos queevalúan lasimágenes dePapanicolaou quecorresponden a las áreas quehibridaron con 3q)
- Pap IVb, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa. CIN3 Pap IVb, CIN3 Pap IVa, CIN3 Pap IVa, CIN 3 Pap IVa. CIN 3 Pap IVa. CIN 3 PapV, Carcinoma
- Fecha de Pap IV a/IVb
- Pap IVb: Feb.01 Pap IVa: May.00 Pap IVa:Ene.99 Pap IVa: Jun.98 Pap IVa: Feb.99 Pap IVa:Ago.01 Pap IVb: Abr.02 Pap IVa: Jun.00 Pap IVa: Mar.00 Pap V: Abr. 99 Pap IVa: Ago.99 Pap V. Feb. 99
- estado de 3q
- Diploide Diploide Diploide Diploide Diploide Diploide Diploide Diploide Ganancia Ganancia Ganancia Ganancia
- Patrones de hibridación observados en Pap II y la cantidad de núcleos contadospara cada patrón. Los patrones se describen en el ordensiguiente: CEP7-CEP3-3q
- 17x 2-2-2,1x 2-2-3?,1x 2-3-3? 14x 2-2-2,1x 2-2-3?,1x 2-3-3? 15x 2-2-2, 2x 2-2-3? 16x2-2-2,1x2-4-4?, 1x3-3-3? 34x2-2-2, 1x2-3-3? 22x2-2-2,1x5-5-5? 22x 2-2-2. 2x?-?-3? 18x2-2-2 20x 2-2-2, 1x 2-3-3?, 16x 2-3-4, 2x 2-3-5 3x 2-2-2, 4x 2-7-3,1x 2-2-3, 3x 2?-4,1x2- 2-4, 1x 2-7-S, 1x 2-25,2x 2-5-5, 1x2-2-6. 1x2-7-7,1x37-4,2x4-4-4 8x 2-2-2,46x 2-5-5 52x 2-7-2,15x 2-?-3, 3x 2-2-3, 2x4-?-4,1x 4-7-8
- Diagnóstico deevaluación(diagnóstico deconsenso de dospatólogos queevalúan lasimágenes dePapanicolaouquecorresponden alas áreas quehibridaron con3q)
- Pap l/ll. normal Pap II, normal Pap II, normal Pap II, normal Pap II, normal Pap IIID, CIN1 Pap 1, normal Pap II. normal Pap II, normal Pap IIID. CIN 2 Pap IVa, CIN 3 Pap II, normal
- Fecha de Pap l/lI
- Pap 1:1999 Pap II: 1999 Pap 1: Oct. 96 Pap 1: Sept. 97 Pap II: Feb. 98 Pap II: Mar. 00 Pap 1: Jul. 01 Pap II: 1998 Pap II: Jul. 97 Pap 1:1996 Pap II: 1997 Pap II: Ago. 98
- Fecha de nacimiento
- 22/09/1941 - 06/07/1958 16/04/1951 17/06/1973 - - 26/02/67 23/09/1961 13/07/1950 - 18/05/2015
- N.º de caso:
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Los "patrones principales" están marcados en negrita Tabla 4. Se muestran los patrones de hibridación y la cantidad de células con un patrón de hibridación específico observado en frotis de Papanicolaou individuales. La columna "estado de 3q" refleja la interpretación de los patrones de hibridación ya que se refiere a cantidades de copias de 3q
Once de las 12 lesiones de CIN3 y carcinomas en el grupo 3 (Tabla 4: frotis de Papanicolaou normal seguido de CIN3 o carcinoma) revelaron una ganancia de 3q. Una lesión (n.º 8, tabla 4) fue tetraploide. Cabe anotar que, cuatro de los 12 frotis de Papanicolaou citológicamente normales ya presentaron una ganancia de 3q. Esto indica que la visualización de copias del adicionales del gen de la TERC podría servir como un marcador específico y temprano en frotis de Papanicolaou citológicamente normales obtenidos de mujeres que son propensas a desarrollar lesiones de CIN3 o enfermedad invasiva.
Cabe anotar que, un determinado número de casos en los grupos de progresoras y regresoras mostraron patrones de señal que son compatibles con una tetraploidización del genoma (es decir, cuatro copias de CEP7, CEP3 y 3q, conocidas como 4-4-4 en las tablas 2-4). Los patrones de hibridación observados en las lesiones de CIN3 positivas para 3q y sus precursores de CIN1/2 combinados sugieren que se mantiene una cierta aneuploidía cromosómica, una vez establecida, durante la evolución del tumor, lo que de nuevo sugiere expansión clonal (tablas 2-4). Es sorprendente que ninguna de las lesiones positivas para 3q en las que la ganancia de TERC se produjo en una base de diploide (como se evaluó con las cantidades de copias para CEP3 y CEP7) mostró un patrón de hibridación tetraploide a lesiones de menor grado.
Todas las lesiones de CIN3 para las que las correspondientes lesiones premalignas fueron tetraploides, se mantuvieron tetraploideas o desarrollaron ganancia de 3q en una base de tetraploide. Esta observación indica que la ganancia de 3q se puede producir sobre la base de genoma diploide o bien tetraploide. Así, la medida del contenido de ADN cuantitativa sola puede no ser suficiente como procedimiento de diagnóstico en citología de cuelo de útero.30
Aunque ninguna de las muestras en el grupo 2 (regresoras) fue positiva para ganancia de 3q, tres lesiones fueron tetraploides. Esto implica que la tetraploidización per se no modifica el genoma de tal forma que la evolución es inevitable. Esto es consistente con observaciones previas que indican que se puede producir duplicación del genoma como respuesta fisiológica a ciertos retos medioambientales.30,31
En el diagnóstico de evaluación de las imágenes morfológicas de dos patólogos experimentados, una de las cuatro lesiones de 3q positivas se elevó de normal a CIN2 (Pap IIID), y otra se elevó a CIN3 (Pap IVa), mientras que el diagnóstico para dos de ellas permaneció como se determinó, es decir, normal.
La comparación del fenotipo citológico de las células con la composición genética indica que, en dos casos, las células displásicas estaban presentes en el portaobjetos, aún cuando no se tuvieron en cuenta (un problema conocido en citología de cuello uterino); sin embargo, en los otros dos casos, el fenotipo celular parecía normal en la evaluación a pesar de la presencia de aneuploidía cromosómica y ganancia de 3q. Esto demuestra que la adquisición de ganancias genómicas específicas puede preceder alteraciones fenotípicas apreciables mediante inspección morfológica. Ejemplos de imágenes de estos casos se presentan en las figuras 2.
La figura 2A corresponde a un frotis de Papanicolaou evaluado como Pap IIID (CIN1). Cabe anotar que, las células morfológicamente sospechosas no llevan copias extra de los genes de la TERC (dos copias por célula sólo). La figura 2B corresponde a un frotis de Papanicolaou evaluado como Pap IIID (CIN2). La figura 2C corresponde al frotis de Papanicolaou de una paciente diagnosticada inicialmente como Pap IIID (Octubre, 2000) y considerada una regresora debido a que los frotis de Papanicolaou posteriores fueron normales (2001), pero evaluada por medio de un frotis de Papanicolaou de 2002 como CIN2 y por medio de un frotis de Papanicolaou de 2003 como CIN3 (y, de acuerdo con ello, asignada al grupo 1). La figura 2D corresponde a un frotis de Papanicolaou valorado repetidamente como morfológicamente normal, aunque la paciente presentó una lesión de CIN3 después de 28 meses.
Cabe anotar que, en muchos casos, las células que fueron positivas para copias adicionales de 3q se localizaron próximas entre sí en los cubreobjetos diagnosticados. Esto indica un evento de evolución clonal, en el que las copias extra de 3q presentan una ventaja en el crecimiento de células epiteliales de cuello uterino, que eventualmente da como resultado una población celular en carcinomas de cuello uterino en los que la mayoría de las células son positivas para 3q. De acuerdo con ello, la visualización de copias adicionales del gen de la TERC en lesiones displásicas premalignas no es sólo informativa para el diagnóstico de displasia, sino que también puede proporcionar información relacionada con el potencial evolutivo de lesiones individuales.
El diagnóstico de evaluación de las imágenes morfológicas de las áreas evaluables con el marcador de 3q estuvo de acuerdo con el diagnóstico inicial para 53 de los 59 especímenes (90%). Seis especímenes se elevaron o redujeron del diagnóstico original, incluyendo los casos discutidos anteriormente (grupo 3, tabla 4, caso 10 de Pap I a Pap IIID, y caso 11 de Pap II a Pap IVa). El diagnóstico de Pap V original del caso 10 (tabla 4) se redujo a Pap IVa. En el grupo 3, tabla 4, el caso 6 se elevó de Pap II a Pap IIID, y en el grupo 1, tabla 2, el caso 1 se elevó de Pap IIID a Pap IVa, y el caso 9 se redujo de Pap IIID a Pap IIw, ASCUS.
Como se planteó como hipótesis, algunos de los frotis de Papanicolaou que se habían evaluado previamente como normales revelaron la presencia de 3q, cuya detección daría como resultado un diagnóstico más temprano. De hecho, se encontró que siete de las 12 lesiones de CIN1/CIN2 que evolucionaron a CIN3 eran positivas para 3q (todas las lesiones CIN3 combinadas llevaron TERC amplificada). En fuerte contraste, ninguna de las lesiones que experimentaron espontáneamente una regresión mostró una ganancia de 3q.
5
A. Prueba exacta de Fisher
La evaluación estadística se basó en la prueba exacta de Fisher y en la estimación de parámetros binomial exacta, que es adecuada para cantidades pequeñas de muestras. Se usó la prueba exacta de Fisher para el análisis de
10 tablas de contingencia de 2x2 de los datos categóricos. Las dos variables categóricas usadas son las evaluaciones patológicas (evolución y regresión) y la detección de aberraciones genómicas, que es positiva o bien negativa. Cada célula en la tabla 5 refleja los resultados observados a partir de las muestras de pacientes.
La hipótesis nula (H0) postula que la presencia de aberraciones genómicas (la ganancia de 3q o bien la tetraploidía)
15 y el estado de la evolución son independientes entre sí. La tasa de evolución se define como el número de casos que evolucionan sobre el número total de los casos sometidos a prueba. Los puntos finales superior e inferior de los intervalos de confianza exactos para la estimación de este parámetro binomial se designaron como PL(α) por Pα L(n, B) y ácido PU(α) por Pα u(n, B) y se determinaron con base a las ecuaciones a continuación.15
y
B se refiere al número de evoluciones (éxitos) en los ensayos de Bernoulli, y fγ,n1,n2 es el percentil γth superior para la 25 distribución F con n1 grados de libertad en el numerador y n2 grados de libertad en el denominador.
Los resultados se resumieron en la tabla 5.
Tabla 5: Evaluación estadística
- Perfil de aberración
- Evaluación patológica valor p de la prueba de Fisher Tasa de evolución Intervalo de confianza del 95% de la tasa de evolución
- Evolución
- Regresión inferior superior
- 4-4-4
- 5 3 0.625 0.2449 0.9148
- 2-2-2 y ganancia de 3q
- 7 7 0.6749 0.5000 0.2304 0.7696
- ganancia de 3q
- 7 0 0.0053 1.0000 0.5904 1.0000
- 2-2-2 y 4-4-4
-
5
10
imagen16 0.3333 0.1182 0.6162
- ganancia de 3q y 4-4-4 12
-
imagen16 3 0.0007 0.8000 0.5191 0.9567
- 2-2-2
-
0
7
imagen16 0.0000 0.0000 0.4096
30 Tabla 5. Análisis estadístico para las tablas de contingencia y los intervalos de confianza de la tasa de evolución. Desde la izquierda, el clasificador de las columnas para las tres tablas de contingencia de 2x2 es la evaluación patológica (evolución y regresión). Los clasificadores de las filas son la detección de tetraploidía (parte superior de la tabla de 2x2), ganancia del cromosoma de 3q (centro de la tabla de 2x2) y ganancia de 3q incluyendo tetraploidía (parte inferior de la tabla de 2x2), respectivamente. El valor p de dos colas para cada tabla se deriva de la prueba
35 exacta de Fisher. A la derecha, la tasa de evolución para los diferentes patrones de hibridación se calculó con base a los recuentos de células en las tablas de contingencia. Su intervalo de confianza del 95% exacto se obtuvo usando el procedimiento descrito en la sección de Materiales y procedimientos.
Para los pacientes en los que las frotis de Papanicolaou contenían células tetraploides, las probabilidades (de 5 a 3)
40 están en favor de la evolución, aunque el valor p es de 0,6749. Por lo tanto, H0 no se puede rechazar (es decir, no hay una evidencia estadística fuerte de que la tetraploidía está asociada con la evolución).
Para casos con una ganancia de 3q frente a casos diploides y tetraploides, el valor p es de 0,0053.
45 Así, hay una fuerte evidencia para rechazar H0, indicando que las copias adicionales de 3q y la evolución están asociadas. El intervalo de confianza del 95% varía desde 0,5904 hasta 1,0000. Así, con la confianza del 95%, se espera que la probabilidad de evolución sea del 59% al 100%.
Para pacientes que tienen una ganancia de 3q o bien tetraploidía, el valor p para la prueba es de 0,0007. Por lo tanto, H0 se puede rechazar con confianza. Existe una correlación significativa entre las copias adicionales de 3q y el desarrollo de carcinomas. Se espera una tasa de evolución del 52% al 96% en pacientes con muestras positivas para 3q o bien tetraploides.
Si los casos mencionados anteriormente en los grupos de progresoras y regresoras que mostraron patrones de señales que son compatibles con una tetraploidización del genoma (véase el ejemplo 2 anterior) se incluyen usando un umbral conservador del 20%, la prueba logra una sensibilidad del 100% (es decir, la asociación de la evolución con tetraploidía o bien ganancia de TERC) con una especificidad del 70%, que se define como la asociación de la regresión con la ausencia de patrones positivos de 3q, es decir una ganancia de 3q que incluye tetraploidía (siete de 10 casos, según la tabla 5).
B. Análisis ROC
Se usó el análisis de las características del operador receptor (ROC) para establecer adicionalmente umbrales óptimos e identificar parámetros FISH que predicen mejor la evolución. Se generaron curvas ROC representando la sensibilidad para predecir la evolución frente a 1 menos la especificidad para predecir la regresión, calculado a umbrales celulares en porcentaje que varían desde el 0% al 100% (incrementos del 1%). Se generaron curvas con base al porcentaje de células tetraploides (patrón de hibridación 4-4-4), el porcentaje de células con ganancia de 3q (> 2 señales de TERC por célula, excluyendo tetraploidía), y el porcentaje de células con tetraploidía o bien ganancia de 3q (es decir, > 2 señales de TERC por célula, incluyendo tetraploidía).
En la figura 3A, la comparación de las curvas ROC curvas muestra que la tetraploidía sola (cuadrados azules) no es un buen indicador de la evolución, mientras que la ganancia de 3q (definida para este propósito como >2 señales de TERC/célula, exclusivas de tetraploidía, triángulos blancos) es un indicador mejor, y la ganancia de 3q incluyendo tetraploidía (cualquier ganancia de 3q, círculos rojos) muestra características ROC muy buenas.
En la representación de ROC, las curvas que están más próximas a los valores ideales de una sensibilidad del 100% y de una especificidad del 100% (esquina superior izquierda de la gráfica ROC, véase la figura 3A) proporcionan la mejor combinación de sensibilidad y especificidad (asumiendo igual importancia para cada una) y los umbrales óptimos se seleccionan normalmente a partir de puntos próximos a las "roturas" en las curvas (región más cercana a la esquina superior izquierdo; pendiente de la curva próxima a 45º).
El punto en la última curva de ROC que se sitúa cerca de la esquina superior izquierda de la gráfica representa los valores de sensibilidad y especificidad del 91,7% (11/12) y del 100% (10/10), respectivamente, que se obtienen para umbrales de porcentaje celulares del 45 al 49%. Sin embargo, para identificar a las mujeres que probablemente evolucionen, se prefiere una sensibilidad más alta y una sensibilidad del 100% (12/12) con una especificidad del 90% (9/10) se logran con umbrales que varían entre el 25 y el 39%. Para asegurar además la identificación de progresoras probables, se usó un umbral más conservador del 20% en el presente estudio.
C. Análisis de DFI
Se puede obtener una mejor vista de la dependencia de la sensibilidad y la especificidad en el umbral representando la distancia desde el ideal (DFI) frente al umbral (figura 3B, que usa los mismos datos usados para construir la figura 3A). DFI se define como la distancia desde el punto ideal (0, 1) en la representación de ROC (sensibilidad del 100%, especificidad del 100%) y se calcula como [(1-sensibilidad)2 + (1-especificidad)2]1/2. La DFI es más pequeña para la mejor combinación de sensibilidad y especificidad (dando el mismo peso a ambas) y varía desde un valor de 0 para umbrales que proporciona una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100%, es decir, el punto ideal a un valor máximo de 21/2.
Las curvas identifican los intervalos umbral que proporcionan la menor combinación de sensibilidades y especificidades, y enfatizan en que la ganancia de 3q incluida la tetraploidía (círculos rojos) se ajusta mejor para predecir la evolución (mínimo menor y más ancho de las tres curvas) que la tetraploidía sola (cuadrados azules) o que ganancia de 3q sola (triángulos blancos). Los mínimos en una curva de DFI indican los mejores valores para los umbrales, y los mínimos anchos son indicadores de ensayos más fuertes, ya que la colocación de los umbrales es menos crítica.
Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para fines de claridad y comprensión, será patente para los expertos en la técnica que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no deben interpretarse como que limitan el alcance de la invención, que está definido por las reivindicaciones numeradas adjuntas.
Ejemplo 4: Ganancia frecuente de TERC en adenocarcinomas de cuello uterino
Material tumoral
El estudio incluye especímenes de tejido tumoral embebido en parafina fijado con formalina de 12 adenocarcinomas de cuello uterino primario diagnosticados y tratados quirúrgicamente en el Karolinska University Hospital-Huddinge
5 durante 1992-2000 (Tabla 6). Se identificaron todos los casos de tumores del Registro Central de Cáncer Sueco organizado por la Junta Nacional de Salud y Bienestar. Este registro incluye todos los casos de tumores malignos diagnosticados histopatológicamente después de 1959, de modo que cada tumor se identifica por un código topográfico e histopatológico. Se recogieron todas las muestras tumorales con el consentimiento informado y la aprobación del comité de ética local.
10
Tabla 6. Detalles clínicos y estado de VPH de los 12 adenocarcinomas en el estudio.
N.º de Id. de lab. Diagnóstico Año del último Edad en el Estadio Diferenciación Implicación de Estado de Seguimiento caso de cáncer frotis de Pap. diagnóstico del tumor del tumor ganglios infección de VPH /resultado linfáticos tiempo resultado
1 230-3 1992 1990/normal 30 años 1B Mala No VPH 16 13 años AwoD 2 T15-2 1992 1989/normal 46 años 1B Mala No VPH 18 13 años AwoD 3 186-5 1995 1992/normal 37 años 1B Buena No VPH 18 10 años AwoD 4 120-7 1997 1987/normal 39 años 1B Buena No VPH negativo 8 años AwoD 5 549-3 1992 1978/normal 50 años 2B Buena Si VPH negativo 13 años AwoD 6 149-4 1994 1992/normal 32 años 1B Mala No VPH 18 11 años AwoD 7 162-0 2000 1997/normal 62 años 1B Buena No VPH 45 4 años DoD 8 164-0 2000 1998/normal 64 años 1B Mala No VPH negativo 5 años AwoD 9 179-9 1999 1996 /normal 63 años 2B Moderada Si VPH negativo 6 años AwoD 10 235-9 2000 1999 53 años 1A Buena No VPH 16 5 años AwoD
/inflamación 11 062-7 1997 1996/normal 45 años 1B Buena No VPH 18 7 años DoD 12 132-3 1993 1992/normal 49 años 1A Buena No VPH 18 11 años AwoD
AwoD = Viva sin enfermedad; DoD = Muerta por enfermedad
La información clínica para cada caso se detalla en la tabla 6 y se ha publicado previamente (Andersson et al., 2003a). El diagnóstico histopatológico se basó en criterios WHO. Se clasificaron los 12 tumores como adenocarcinomas de cuello uterino y todos estaban sin ningún componente de células escamosas. Siete tumores se diferenciaron bien (58%), uno se diferenció moderadamente (8%) y cuatro tumores se diferenciaron mal (33%). El estadiaje clínico se hizo de acuerdo con la clasificación FIGO para cáncer de cuello uterino (Benedet et al., 2000). En el diagnóstico inicial, 10 tumores se clasificaron como estadio I (83%) y dos tumores como estadio II (17%). Dos pacientes presentaron inicialmente implicación de ganglios linfáticos (17%). Previamente se tomaron muestras de todos los pacientes para el análisis de frotis de Papanicolaou. Se evaluaron todos menos un frotis de Papanicolaou (que se evaluó que mostraba signos de inmunidad celular inflamación) como normales en el momento de la evaluación citológica más reciente (Tabla 6). Todos los pacientes se siguieron de manera retrospectiva desde el momento del diagnóstico hasta junio de 2005, y se registraron la recurrencia de enfermedad y los datos de supervivencia.
Estado VPH
Los resultados de los análisis de detección del VPH se han publicado previamente para todos los casos (Andersson et al., 2003a). En resumen, los análisis se realizaron en ADN extraído obtenido a partir de secciones de bloques de parafina de los que se ha usado la sección precedente para diagnóstico morfológico. Se amplificó un fragmento de 139-148 pb a partir de la región L1 con cebadores GP5 +/GP6+, tipificado para VPH mediante secuenciación de ADN directa y comparación con bases de datos de secuencia de VPH conocidas usando el algoritmo de BLAST (www.ncbi.nlm.nih.govBLAST). Así se encontró que ocho de los 12 tumores eran positivos para VPH; se infectaron cinco tumores con VPH 18, dos con VPH 16 y uno con VPH 45 (Tabla 6). Los cuatro especímenes tumorales restantes eran negativos para VPH. La edad promedio en el diagnóstico de cáncer era significativamente inferior para los casos positivos para VPH en comparación con las mujeres con negativo para VPH (44,2 años, DE = 10,4 frente a 54 años, DE = 11,8; p = 0,001).
Preparación de suspensiones de núcleos para el análisis FISH
Se prepararon preparaciones de núcleos de una única capa para las hibridaciones FISH de interfase usando el procedimiento Hedley con modificaciones (Castro et al., 1993). Se cortó una sección de 50 µm de cada una de las 12 muestras de tejido tumoral embebido en parafina fijado con formalina. Después de la desparafinación en xileno, se rehidrató la sección en una serie de etanol y en agua destilada, y se desintegró la sección en 500 µl de proteasa al 0,1%/PBS 1x (Proteasa: Tipo XXIV, Bacteriana, P 8038, Sigma San Luis, MO y PBS 1x de Dulbecco, Life Technologies, Rockville, MD) a 45ºC durante 45-60 minutos. La reacción se detuvo añadiendo 500 µl de PBS 1x a temperatura ambiente. Después se filtró la muestra a través de una membrana de nailon (CN 051, DAKO, Glostrup, Dinamarca), se centrifugó y se resuspendió en PBS 1x. Se prepararon cubreobjetos de Cytospin de Shandon Cytospin®, y se fijaron en una serie de etanol.
Hibridación in situ de fluorescencia (FISH)
Se realizó el análisis FISH de triple color en cada caso usando el siguiente conjunto de sondas: una sonda específica centromérica para cromosoma 7 (CEP®7); una sonda específica centromérica para cromosoma 3 (CEP3); y un cóntigo que consiste en cuatro clones BAC solapantes que contienen el gen de la TERC en la localización cromosómica 3q26. Se obtuvieron todas las sondas de Vysis/Abbott Molecula, Inc. (Des Plaines, IL). Los detalles para este conjunto de sondas, su sensibilidad y especificidad, así como las condiciones experimentales se publicaron previamente (Heselmeyer-Haddad et al., 2003). En resumen, se marcó CEP7 con Spectrum Aqua™ (SA), CEP3 con Spectrum Green™ (SG) y el cóntigo de TERC con Spectrum Orange™ (SO), usando marcadores químicos como se ha descrito (Bittner et al., 1996). Antes de la hibridación, se pretrataron los portaobjetos cytospin con una digestión de pepsina, y se fijaron en una serie de etanol. Se desnaturalizaron los cubreobjetos en formamida al 70%, SSC 2x durante 3,5 minutos a 80ºC. Las sondas se desnaturalizaron, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la hibridación durante toda una noche a 37ºC, los portaobjetos se lavaron en primer lugar cuatro veces en formamida al 50%/SSC 2x a 45ºC (una vez durante 3 minutos y tres veces durante 7 minutos), seguido de lavados en SSC 2x a 45ºC durante 5 minutos y en SSC 2x/NP40 al 0,1% a 45ºC durante 5 minutos. Se contratiñeron los cubreobjetos con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), y posteriormente se embebieron en una solución antidesteñimiento.
Valoración de los resultados de FISH
Se llevaron a cabo análisis FISH y de imagen usando un microscopio de fluorescencia Leica DM-RXA (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con filtros ópticos personalizados de DAPI, SA, SG y SO (Chroma Technologies, Brattleboro, VT) y un objetivo de 40 x Plan Apo (NA 1,25). Se tomaron imágenes en áreas de densidad celular óptima con agrupamientos celulares mínimos usando una cámara digital ORCA ER (IEEE1394 I/F) (Hamamatsu, Bridgewater, NJ). Se usó Leica Q-Fluoro para adquirir imágenes multifocales para cada uno de los filtros ópticos de DAPI, SA, SG y SO. Se adquirieron de diez a 16 imágenes y se realizó la enumeración de señales en estos imágenes digitales para 208-641 núcleos para cada caso. Se enumeraron las señales contadas y se evaluaron en software personalizado basado en Excel.
Los núcleos que no se pudieron evaluar (por ejemplo, debido a una hibridación insuficiente o a núcleos solapantes) se excluyeron del análisis adicional. Los resultados para todos los núcleos "contables" se registraron en gráficos de traslado en forma de patrones para el panel de sonda total. Por ejemplo, el patrón (2-3-3), se refiere a dos señales para CEP7, tres señales para CEP3 y tres señales para TERC en un núcleo dado. Se registraron los núcleos con cantidades de señal normales para las tres sondas (es decir, 2-2-2) como "diploides", y los núcleos con cuatro señales para cada sonda (patrón 4-4-4) se consideraron "tetraploides". El nivel de base para el panel de sonda de CEP7-CEP3-TERC se evaluó previamente sobre portaobjetos citológicos que contenían núcleos de células de cuello uterino normales (Heselmeyer-Haddad et al., 2003). Esto confirmó que la desviación con respecto al patrón esperado (2-2-2) se vio en menos del 2% de las células normales.
Se evaluaron doce adenocarcinomas de cuello uterino (tabla 6) para determinar el cambio en la cantidad de copias del locus de TERC en la banda cromosómica 3q26 usando interfase FISH. El panel de sondas de tres colores que consiste en CEP7-CEP3-TERC se hibridó simultáneamente a cubreobjetos cytospin con núcleos de interfase preparados a partir de secciones de tejido fijado con formalina. Todos los casos se hibridaron exitosamente y se analizaron, de modo que se valoraron de 208 a 641 núcleos por caso. La figura 1 muestra hibridaciones representativas. Se observaron tanto los patrones "diploides" normales (2-2-2) como los núcleos con patrones no diploides. Los resultados se resumieron en la tabla 7. En todos los 12 tumores se detectó una proporción significativa de núcleos "no diploides", y nueve de los tumores presentaron >50% de núcleos "no diploides". En los tumores individuales, se encontraron núcleos con >2 señales de TERC en frecuencias similares como células con patrones "no diploides", y casi todos los núcleos con patrones "no diploides" presentaron >2 señales de TERC. En los núcleos "no diploides" no se observó comúnmente un patrón "tetraploide" (4-4-4). En diez de los tumores, menos del 1% de los núcleos presentaron (4-4-4) y en dos casos se vio (4-4-4) en el 4% y el 12% respectivamente (tabla 7). Así, la ganancia de TERC estaba presente en todos los tumores estudiados y no fue un efecto del estado "tetraploide".
Tabla 7. Resultados del análisis de FISH de interfase de los 12 adenocarcinomas de cuello uterino.
"Diploide" "No "Tetraploide" Núcleos "No Señales por célula: promedio (intervalo) TERC relativo frente a Patrones
N.º de Recuento [2-2-2] diploide"* [4-4-4] con >2 diploide" CEP7 CEP3 TERC CEP7 CEP3 "no diploides" caso de núcleos
TERC con >2 más comunes TERC
1 376 33% 67% 1% 66% 99% 2,2(2-5) 2,2 (2-5) 3,0 (2-8) 1,4 1,4 [2-2-3] [2-2-4]
2 391 31% 69% 0% 64% 92% 2,1 (2-4) 2,1 (2-4) 3,2 (2-7) 1,5 1,6 [2-2-4] [2-2-3] [2-2-5] [4-4-4] [4-3-4] [4-3-]
3 215 27% 73% 12% 68% 94% 3,0 (2-6) 3,1 (2-8) 3,3 (2-9) 1,1 1,1 [3-3-3] [3-4-4] [2-4-6] [2-3-5] [2-4-5]
4 466 40% 60% 0% 59% 99% 2,0(1-4) 3,2(2-5) 4,4 (2-12) 2,1 1,4 [2-4-7]
5 336 68% 32% 1% 27% 86% 2,1 (2-4) 2,1 (2-4) 2,4 (2-6) 1,1 1,1 [2-2-3] [2-2-4] [2-3-2] [2-3-4] [2-3-5] [2-2-3]
6 641 69% 31% 1% 28% 92% 2,0 (0-4) 2,3 (2-8) 2,6 (2-8) 1,3 1,1 [2-3-3] [2-2-5] [2-2-4] [2-2-6]
7 412 28% 72% 0% 71% 99% 2,1 (2-4) 2,1 (2-8) 4,2 (2-15) 2,0 2,0 [2-2-3] [2-2-4] [2-2-3] [2-3-3]
8 626 46% 54% 1% 54% 98% 2,0 (2-4) 2,2 (2-5) 2,9 (2-12) 1,4 1,3 [2-2-5] [2-2-3] [2-3-3] [2-2-4]
9 253 29% 71% 0% 64% 91% 2,6 (2-5) 3,0 (2-7) 3,4 (2-11) 1,3 1,1 [3-2-2] [3-4-4] [2-2-4] [2-2-3] [2-2-5]
10 286 30% 70% 0% 66% 95% 2,7 (2-7) 2,9 (2-7) 5,2 (2-22) 2,0 1,8 [2-2-6]
11 393 79% 21% 4% 18% 83% 2,2(2-6) 2,2 (2-6) 2,3 (2-6) 1,04 1,04 [2-2-3] [4-4-4] [2-3-2]
12 208 20% 80% 0% 79% 99% 1,9 (0-4) 2,0 (0-5) 3,0 (2-7) 1,6 1,5 [2-2-3] [2-2-4]
* El nivel de base de la desviación de (2-2-2) los núcleos normales es inferior al 2% (Heselmayer-Hadad et al., 2003)
Heterogeneidad intra-tumoral para ganancia y amplificación del locus de TERC
Se observó esos diferentes patrones FISH en los casos individuales. Para varios de los tumores se observaron un o unos pocos patrones predominantes. Además, todos los casos presentaron proporciones que varían de patrones "no diploides" recurrentes pero diferentes. La comparación de las cantidades de señales registradas para TERC frente a CEP7 y CEP3 mostraron copias de TERC relativas incrementadas en los 12 casos estudiados (intervalo de 1,04-2,0; tabla 7). La cantidad promedio absoluta de señales TERC por núcleos varió entre 2,3 (caso 11) y 5,2 (caso 10), y se encontraron repetidamente en cinco de los núcleos de tumores con más de 10 señales (tabla 7). La fig. 4 ilustra los núcleos del caso 10 con amplificación de más de 20 señales TERC, junto con 6 señales para CEP3 y CEP7 (fig. 1G y H). En el nivel de núcleos individuales, la distribución de señales FISH para TERC fue de tipo similar, porque las señales se distribuyeron aleatoriamente en los núcleos sin agrupación obvia. Estos hallazgos demuestran que la ganancia de TERC no es solamente ni siempre un resultado del incremento en la cantidad de copias de cromosoma 3, sino una ganancia/amplificación subcromosómica del locus del gen TERC.
La ganancia de TERC es independiente de estado de la infección del VPH
La información clínica y de seguimiento así como el estado de VPH de los 12 adenocarcinomas de cuello uterino se proporcionan en la tabla 6. Ocho casos fueron positivos para VPH y cuatro fueron negativos para VPH. Se demostraron proporciones muy altas de núcleos "no diploides" con >2 señales de TERC en tumores positivos para VPH (83-99%) así como negativos para VPH (86-99%). Las cantidades absolutas de señales de TERC por núcleo se incrementaron de forma similar en tumores positivos para VPH (promedio 3,4; intervalo 2-22) y negativos para VPH (promedio 3,3; intervalo 2-12). No se anotaron asociaciones patentes entre las cantidades de copias de TERC y las características clínicas, tales como la edad en el diagnóstico, el estadio, la diferenciación, la implicación de ganglios linfáticos o el resultado en el seguimiento. Así, la ganancia de TERC es característica de adenocarcinomas de cuello uterino per se, e independiente del estado de la infección de VPH.
Se analizaron una serie de 12 adenocarcinomas de cuello uterino primarios para determinar la ganancia o la amplificación del gen de la telomerasa humano TERC, que se mapea en la banda del cromosoma 3q26. Ocho de los 12 carcinomas (67%) fueron positivos para VPH (cinco tumores fueron positivos para VPH 18, dos para VPH 16, y uno para VPH 45) (Andersson et al., 2003a; Skyldberg et al., 1999). Los cuatro especímenes tumorales restantes eran negativos para VPH. Después se usó FISH con un panel de sonda diseñado personalizado que incluye el gen de la telomerasa humano (TERC) para evaluar el potencial de este marcador genético para mejorar el diagnóstico morfológico de adenocarcinomas de cuello uterino.
La detección de una trisomia por CGH requiere que esté presente esta aberración numérica en al menos el 40% de las células. FISH, por supuesto, detecta cambios en un única base celular y, por tanto, no es sensibles a la dilución. Adicionalmente, los amplicones de las cantidades bajas de copias de regiones pequeñas podría eludir la detección por CGH.
El ADN de VPH no ha sido identificado en la misma proporción en adenocarcinomas que en carcinomas de cuello uterino escamosos (Andersson et al., 2003b; Skyldberg et al., 1999; Tenti et al., 1996). Es posible que los factores oncogénicos distintos de VPH jueguen probablemente un papel en la transformación maligna de adenocarcinomas de cuello uterino (Skyldberg et al., 1999; Pirog et al., 2000).
Estos datos muestran que 10 de las 12 mujeres tuvieron un frotis de Papanicolaou normal dentro de los 3 años antes del diagnóstico de enfermedad invasiva, y sin desear comprometerse con ninguna teoría científica, puede apoyar la hipótesis de un carcinoma de aparición rápida. Por otro lado, dado que la sensibilidad de un frotis de Papanicolaou para la detección de adenocarcinomas de cuello uterino es muy baja (Krane et al., 2001), la hipótesis de aparición rápida no se puede aplicar a estos casos.
Los carcinomas escamosos de cuello uterino se definen mediante una distribución no aleatoria y recurrente de desequilibrios genómicos. Además del VPH, la transformación secuencial del epitelio escamoso de cuello uterino requiere la adquisición de copias adicionales del brazo del cromosoma 3q. Usando una sonda genómica para el gen de la TERC en la banda del cromosoma 3q26 en combinación con dos sondas específicas centroméricas (CEP3 y CEP7), se mostró una alta cantidad de copias de este locus en adenocarcinomas de cuello uterino. Se halló ganancia o amplificación de 3q en todos los adenocarcinomas de cuello uterino investigados. La aplicación de este conjunto de sondas proporciona una prueba genética objetiva para el diagnóstico de adenocarcinomas de cuello uterino y podría ayudar en la interpretación de los frotis con un alto grado de células glandulares.
Se necesita en la técnica un marcador molecular objetivo en este grupo de pacientes debido a la identificación citomorfológicamente difícil de estas células y a las cantidades limitadas de células representativas debido a los problemas técnicos en el muestreo de estas lesiones. Como se muestra en el presente documento, muchas mujeres con adenocarcinoma de cuello uterino presentaron frotis de Papanicolaou morfológicamente normales, a menudo sólo 1-2 años antes del diagnóstico.
Las siguientes referencias específicas están indicadas anteriormente por números de referencia correspondientes.
REFERENCIAS
1. Ghadimi BM, Heselmeyer-Haddad K, Auer G, Ried T: Interphase cytogenetics: at the interface of genetics and morphology. Anal Cell Pathol 1999, 19:3-6 2. Heim S, Mitelman F: Cancer Cytogenetics. New York, Wiley-Liss, 1995
3. Ried T, Heselmeyer-Haddad K, Blegen H, Schrock E, Auer G: Genomic changes defining the genesis, progression, and malignancy potential in solid human tumors: a phenotype/genotype correlation. Genes Chromosomes Cancer 1999, 25:195-204 4. Visakorpi T, Hyytinen E, Koivisto P, Tanner M, Keinanen R, Palmberg C, Palotie A, Tammela T, Isola J, Kallioniemi OP: In vivo amplification of the androgen receptor gene and progression of human prostate cancer. Nat Genet 1995, 9:401-406 5. Dellas A, Torhorst J, Jiang F, Proffitt J, Schultheiss E, Holzgreve W, Sauter G, Mihatsch MJ, Moch H: Prognostic value of genomic alterations in invasive cervical squamous cell carcinoma of clinical stage IB detected by comparative genomic hybridization. Cancer Res 1999, 59:3475-3479
- 6.
- Ghadimi BM, Grade M, Liersch T, Langer C, Siemer A, Fuzesi L, Becker H: Gain of chromosome 8q23-24 is a predictive marker for lymph node positivity in colorectal cancer. Clin Cancer Res 2003, 9:1808-1814
- 7.
- Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T, Eiermann W, Wolter J, Pegram M, Baselga J, Norton L: Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001, 344:783-792
- 8.
- Heselmeyer-Haddad K, Janz V, Castle PE, Chaudhri N, White N, Wilber K, Morrison LE, Auer G, Burroughs FH, Sherman ME, Ried T: Detection of genomic amplification of the human telomerase gene (TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the diagnosis of cervical dysplasia. Am J Pathol 2003, 163:1405-1416
- 9.
- Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Munoz
N: Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999, 189:12-19
- 10.
- zur Hausen H: Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer 2002, 2:342-350
- 11.
- Heselmeyer K, Schrock E, du Manoir S, Blegen H, Shah K, Steinbeck R, Auer G, Ried T: Gain of chromosome 3q defines the transition from severe dysplasia to invasive carcinoma of the uterine cervix. Proc Natl Acad Sci U S A 1996, 93:479-484.
- 12.
- Atkin NB: Cytogenetics of carcinoma of the cervix uteri: a review. Cancer Genet Cytogenet 1997, 95:33-39
- 13.
- Freudenberg N, Kortsik C, Ross A: Grundlagen der Zytopathologie. Basel, Karger, 2002, pp 142
- 14.
- Solomon D, Davey D, Kurman R, Moriarty A, O'Connor D, Prey M, Raab S, Sherman M, Wilbur D, Wright T, Jr., Young N: The 2001 Bethesda System: terminology for reporting results of cervical cytology. JAMA 2002, 287:21142119
- 15.
- Hollander M, Wolfe D: Nonparametric Statistic Methods. New York, John Wiley & Sons Inc., 1999
- 16.
- Koss LG: The Papanicolaou test for cervical cancer detection. A triumphs and a tragedy. JAMA 1989,261:737743
- 17.
- Shingleton HM, Patrick RL, Johnston WW, Smith RA: The current status of the Papanicolaou smear. CA Cancer J Clin 1995, 45:305-320
- 18.
- Castle PE, Wacholder S, Sherman ME, Lorincz AT, Glass AG, Scott DR, Rush BB, Demuth F, Schiffman M: Absolute risk of a subsequent abnormal pap among oncogenic human papillomavirus DNA-positive, cytologically negative women. Cancer 2002, 95:2145-2151
- 19.
- Castle PE, Wacholder S, Lorincz AT, Scott DR, Sherman ME, Glass AG, Rush BB, Schussler JE, Schiffman M: A prospective study of high-grade cervical neoplasia risk among human papillomavirus-infected women. J Natl Cancer Inst 2002, 94:1406-1414
- 20.
- Heselmeyer K, Macville M, Schrock E, Blegen H, Hellstrom AC, Shah K, Auer G, Ried T: Advanced-stage cervical carcinomas are defined by a recurrent pattern of chromosomal aberrations revealing high genetic instability and a consistent gain of chromosome arm 3q. Genes Chromosomes Cancer 1997, 19:233-240 21. Kirchhoff M, Rose H, Petersen BL, Maahr J, Gerdes T, Lundsteen C, Bryndorf T, Kryger-Baggesen N, Christensen L, Engelholm SA, Philip
J: Comparative genomic hybridization reveals a recurrent pattern of chromosomal aberrations in severe dysplasia/carcinoma in situ of the cervix and in advanced-stage cervical carcinoma. Genes Chromosomes Cancer 1999, 24:144-150
22. Allen DG, White DJ, Hutchins AM, Scurry JP, Tabrizi SN, Garland SM, Armes JE: Progressive genetic aberrations detected by comparative genomic hybridization in squamous cell cervical cancer. Br J Cancer 2000, 83:1659-1663 23. Yang YC, Shyong WY, Chang MS, Chen YJ, Lin CH, Huang ZD, Wang, Hsu MT, Chen ML: Frequent gain of copy number on the long arm of chromosome 3 in human cervical adenocarcinoma. Cancer Genet Cytogenet 2001, 131:48-53 24. Umayahara K, Numa F, Suehiro Y, Sakata A, Nawata S, Ogata H, Suminami Y, Sakamoto M, Sasaki K, Kato H: Comparative genomic hybridization detects genetic alterations during early stages of cervical cancer progression. Genes Chromosomes Cancer 2002, 33:98-102
25. Hidalgo A, Schewe C, Petersen S, Salcedo M, Gariglio P, Schluns K, Dietel M, Petersen I: Human papilloma virus status and chromosomal imbalances in primary cervical carcinomas and tumour cell lines. Eur J Cancer 2000, 36:542-548 26. Matthews CP, Shera KA, McDougall JK: Genomic changes and HPV type in cervical carcinoma. Proc Soc Exp Biol Med 2000, 223:316-321
- 27.
- Hackett JA, Greider CW: Balancing instability: dual roles for telomerase and telomere dysfunction in tumorigenesis. Oncogene 2002, 21:619-626
- 28.
- Campion MJ, McCance DJ, Cuzick J, Singer A: Progressive potential of mild cervical atypia: prospective cytological, colposcopic, and virological study. Lancet 1986, 2:237-240 '
- 29.
- Koss LG, Stewart F, Foote FW, Jordan MJ, Bader GM, Day E: Some Histological Aspects of Behavior of
Epidermoid Carcinoma in situ and Related Lesions of the Uterine Cervix. A Long-Term Prospective Study. Cancer 1963, 16:1160-1211 30. Bocking A, Nguyen VQ: Diagnostic and prognostic use of DNA image cytometry in cervical squamous intraepithelial lesions and invasive carcinoma. Cancer 2004, 102:41-54
31. Matzke MA, Mette MF, Kanno T, Matzke AJ: Does the intrinsic instability of aneuploid genomes have a causal role in cancer? Trends Genet 2003, 19:253-256 32. Sudbo J, Kildal W, Risberg B, Koppang HS, Danielsen HE, Reith
A: DNA content as a prognostic marker in patients with oral leukoplakia. N Engl J Med 2001, 344:1270-1278 Andersson S, Larson B, Hjerpe A, Silfversward C, Sällström J, Wilander E, Rylander E (2003a) Adenocarcinoma of the uterine cervix: the presence of human papillomavirus and the method of detection. Acta Obstet Gynecol Scand
82: 960-965 Andersson S, Rylander E, Larson B, Sigurdardottir S, Backlund I, Sällström J, Wilander E (2003b) Types of human papillomavirus revealed in cervical adenocarcinomas after DNA sequencing. Oncol Rep 10: 175-179 Benedet JL, Bender H, Jones H, 3rd, Ngan HY, Pecorelli S (2000) FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers. FIGO Committee on Gynecologic Oncology. Int J Gynaecol Obstet 70: 209262 Bergström R, Sparen P, Adami HO (1999) Trends in cancer of the cervix uteri in Sweden following cytological screening. Br J Cancer 81: 159-156 Bittner ML, Morrison LE Legator MS (1996) Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture. United States Government Printing Office. Washington DC United States Patent 5, 491,224 Bosch FX, Manos MM, Munoz N, Sherman M, Jansen AM, Peto J, Schiffman MH, Moreno V, Kurman R, Shah KV (1995) Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) study group. J Natl Cancer Inst 87: 796-802 Bosch FX, Munoz N (2002) The viral etiology of cervical cancer. Virus Res 89: 183-189 Castro J, Heiden T, Wang N, Tribukait B (1993) Preparation of cell nuclei from fresh tissues for high-quality DNA flow cytometry. Cytometry 14: 793-804 Dahlgren L, Mellin H, Wangsa D, Heselmeyer-Haddad K, Bjomestal L, Lindholm J, Munck-Wikland E, Auer G, Ried T, Dalianis T (2003) Comparative genomic hybridization analysis of tonsillar cancer reveals a different pattern of genomic imbalances in human papillomavirus-positive and -negative tumors. Int J Cancer 107: 244-249 Heselmeyer K, Schrock E, du Manoir S, Blegen H, Shah K, Steinbeck R, Auer G, Ried T (1996) Gain of chromosome 3q defines the transition from severe dysplasia to invasive carcinoma of the uterine cervix. Proc Natl Acad Sci USA 93: 479-484 Heselmeyer K, Macville M, Schrock E, Blegen H, Hellstrom AC, Shah K, Auer G, Ried T (1997a) Advanced-stage cervical carcinomas are defined by a recurrent pattern of chromosomal aberrations revealing high genetic instability and a consistent gain of chromosome arm 3q. Genes Chromosomes Cancer 19: 233-240 Heselmeyer K, du Manoir S, Blegen H, Friberg B, Svensson C, Schrock E, Veldman T, Shah K, Auer G, Ried T (1997b) A recurrent pattern of chromosomal aberrations and immunophenotypic appearance defienes anal squamous cell carcinomas. Br J Cancer 76: 1271-1278 Heselmeyer-Haddad K, Janz V, Castle PE, Chaudhri N, White N, Wilber K, Morrison LE, Auer G, Burroughs FH, Sherman ME, Ried T (2003) Detection of genomic amplification of the human telomerase gene (TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the diagnosis of cervical dysplasia. Am J Pathol 163: 1405-1416 Heselmeyer-Haddad K, Sommerfeld K, White NM, Chaudhri N, Morrison LE, Palanisamy N, Wang ZY, Auer G, Steinberg W, Ried T (2005) Genomic amplification of the human telomerase gene (TERC) in pap smears predicts the development of cervical cancer. Am J Pathol 166: 1229-1238 Hildesheim A, Hadjimichael O, Schwartz PE, Wheeler CM, Barnes W, Lowell DM, Willett J, Schiffman M (1999) Risk factors for rapid-onset cervical cancer. Am J Obstet Gynecol 180: 571-577 Kinney WK, Manos MM, Hurley LB, Ransley JE (1998) Where's the high-grade cervical neoplasia? The importance of minimally abnormal Papanicolaou diagnoses. Obstet Gynecol 91: 973-976 Krane JF, Granter SR, Trask CE, Hogan CL, Lee KR (2001) Papanicolaou smear sensitivity for the detection of adenocarcinoma of the cervix: a study of 49 cases. Cancer 93: 8-15 Macgregor JE, Campbell MK, Mann EM, Swanson KY (1994) Screening for cervical intraepithelial neoplasia in north east Scotland shows fall in incidence and mortality from invasive cancer with concomitant rise in preinvasive disease. BMJ
308: 1407-1411 Mählck CG, Jonsson H, Lenner P (1994) Pap smear screening and changes in cervical cancer mortality in Sweden. Int J Gynecol Obstet 44: 267-272 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P (2001) Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer 94: 153-156 Pirog EC, Kleter B, Olgac S, Bobkiewicz P, Lindeman J, Quint WG, Richart RM, Isacson C (2000) Prevalence of human papillomavirus DNA in different histological subtypes of cervical adenocarcinoma. Am J Pathol 157: 1055-1062 Ponten J, Adami HO, Friberg LG, Gustafsson L, Miller AB, Parkin M, Sparen P, Trichopoulos D (1995) HPV and cervical cancer. Int J Cancer 63: 317 Sasieni P, Adams J (2001) Changing rates of adenocarcinoma and adenosquamous carcinoma of the cervix in England. Lancet,
357: 1490-1493 Sherman ME, Schiffman MH, Lorincz AT, Manos MM, Scott DR, Kuman RJ, Kiviat NB, Stoler M, Glass AG, Rush BB (1994) Toward objective quality assurance in cervical cytopathology:correlation of cytopathologic diagnosis with detection of high-risk human papillomavirus types. Am J Clin Pathol 102: 182-187 Skyldberg BM, Murray E, Lambkin H, Kelehan P, Auer GU (1999) Adenocarcinoma of the uterine cervix in Ireland and Sweden: human papillomavirus infection and biologic alterations. Mod Pathol 12: 675-682 Smith HO, Tiffany MF, Qualls CR, Key CR (2000) The rising incidence of adenocarcinoma relative to squamous cell carcinoma of the uterine cervix in the United States--a 24-year population-based study. Gynecol Oncol 78: 97-105 Stoltzfus P, Heselmeyer-Haddad K, Castro J, White N, Silfverswärd C, Sjövall K, Einhorn N, Tryggvason K, Auer G, Ried T, Nordström B (2005) Gain of chromosome 3q is an early and consistent genetic aberration in carcinomas of the vulva. Int J Gynecol Cancer 15: 120-126 Tenti P, Romagnoli S, Silini E, Zappatore R, Spinillo A, Giunta P, Cappellini A, Vesentini N, Zara C, Carnevali L (1996) Human papillomavirus types 16 and 18 infection in infiltrating adenocarcinoma of the cervix: PCR analysis of 138 cases and correlation with histologic type and grade. Am J Clin Pathol 106: 52-56 Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Munoz N (1999) Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 189: 12-19 Vizcaino AP, Moreno V, Bosch FX, Munoz N, Barros-Dios XM, Parkin DM (1998) International trends in the incidence of cervical cancer: I.
Adenocarcinoma and adenosquamous cell carcinomas. Int J Cancer 75: 536-545 Yang YC, Shyong WY, Chang MS, Chen YJ, Lin CH, Huang ZD, Wang, Hsu MT, Chen ML (2001) Frequent gain of copy number on the long arm of chromosome 3 in human cervical adenocarcinoma. Cancer Genet Cytogenet 131: 48-53
PUNTOS
En realizaciones preferentes específicas, la presente divulgación se refiere a los siguientes puntos:
- 1.
- Un procedimiento para evaluar un cambio en una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo
grado a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado o cáncer, que comprende: detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente displasia de cuello uterino de bajo grado para evaluar de este modo el cambio en la afección de una paciente a un cáncer o displasia de cuello uterino de alto grado.
- 2.
- El procedimiento del punto 1, en el que la amplificación genómica del cromosoma 3q indica la evolución de la afección de una paciente a displasia de cuello uterino de alto grado.
- 3.
- El procedimiento del punto 1, en el que la amplificación genómica está dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q.
- 4.
- El procedimiento del punto 1, en el que la displasia de cuello uterino de bajo grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 1.
- 5.
- El procedimiento del punto 1, en el que la displasia de cuello uterino de alto grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 2.
- 6.
- El procedimiento del punto 1, en el que la displasia de cuello uterino de alto grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 3.
- 7.
- El procedimiento del punto 1, en el que la displasia de cuello uterino de alto grado es un carcinoma in situ.
- 8.
- El procedimiento del punto 3, en el que la amplificación genómica se detecta hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26.
- 9.
- El procedimiento del punto 8, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa, o una parte del mismo.
- 10.
- El procedimiento del punto 8, en el que el marcador detectable emite una señal fluorescente.
- 11.
- El procedimiento del punto 8, en el que el marcador detectable es cromogénico.
- 12.
- El procedimiento del punto 8, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3 o del cromosoma 7.
- 13.
- El procedimiento del punto 3, en el que la amplificación genómica se detecta por la reacción en cadena de la polimerasa.
- 14.
- El procedimiento del punto 3, en el que la amplificación genómica se detecta midiendo la cantidad del polipéptido de telomerasa.
- 15.
- El procedimiento del punto 1, en el que la muestra es una preparación a partir del cuello uterino.
- 16.
- El procedimiento del punto 13, en el que la preparación es un frotis de Papanicolaou o una suspensión de capa fina de células.
- 17.
- Un kit para evaluar un cambio en una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para evaluar el cambio en una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado, de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de los puntos 1-16.
- 18.
- Un procedimiento para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo, que comprende: fabricar una primera identificación de una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra obtenida a partir de una paciente conocida por haber tenido una afección de
i) displasia de cuello uterino de bajo grado; o bien
ii) sin displasia
identificando así a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo.
- 19.
- El procedimiento del punto 18, en el que la amplificación genómica está dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q.
- 20.
- El procedimiento del punto 18, en el que la displasia de cuello uterino de bajo grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 1.
- 21.
- El procedimiento del punto 18, en el que se obtiene un frotis de Papanicolaou normal de una paciente que no tiene displasia.
- 22.
- El procedimiento del punto 19, en el que la amplificación genómica se detecta hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26.
- 23.
- El procedimiento del punto 22, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa, o una parte del mismo.
- 24.
- El procedimiento del punto 23, en el que el marcador detectable emite una señal fluorescente.
- 25.
- El procedimiento del punto 23, en el que el marcador detectable es cromogénico.
- 26.
- El procedimiento del punto 22, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria
de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3.
- 27.
- El procedimiento del punto 19, en el que la amplificación genómica se detecta por la reacción en cadena de la polimerasa.
- 28.
- El procedimiento del punto 19, en el que la amplificación genómica se detecta midiendo la cantidad del polipéptido de telomerasa.
- 29.
- El procedimiento del punto 18, en el que la muestra es una preparación a partir del cuello uterino.
- 30.
- El procedimiento del punto 29, en el que la preparación es un frotis de Papanicolaou o una suspensión de capa fina de células.
- 31.
- Un kit para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de los puntos 18-30.
- 32.
- Un procedimiento para monitorizar un cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir
de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado en una paciente que comprende: someter a ensayo para determinar una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente displasia de cuello uterino de bajo grado para monitorizar de este modo un cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado.
- 33.
- El procedimiento del punto 32, que comprende adicionalmente determinar que la amplificación genómica del cromosoma 3q está presente en la muestra.
- 34.
- El procedimiento del punto 32, que comprende adicionalmente determinar que la amplificación genómica del cromosoma 3q no está presente en la muestra.
- 35.
- El procedimiento del punto 32, en el que la amplificación genómica está dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q.
- 36.
- El procedimiento del punto 32, en el que la displasia de cuello uterino de bajo grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 1.
- 37.
- El procedimiento del punto 32, en el que la displasia de cuello uterino de alto grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 2.
- 38.
- El procedimiento del punto 32, en el que la displasia de cuello uterino de alto grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 3.
- 39.
- El procedimiento del punto 32, en el que la displasia de cuello uterino de alto grado es un carcinoma in situ.
- 40.
- El procedimiento del punto 35, en el que la amplificación genómica se detecta hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26.
- 41.
- El procedimiento del punto 40, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa, o una parte del mismo.
- 42.
- El procedimiento del punto 40, en el que el marcador detectable emite una señal fluorescente.
- 43.
- El procedimiento del punto 40, en el que el marcador detectable es cromogénico.
- 44.
- El procedimiento del punto 40, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3.
- 45.
- El procedimiento del punto 35, en el que la amplificación genómica se detecta por la reacción en cadena de la polimerasa.
- 46.
- El procedimiento del punto 35, en el que la amplificación genómica se detecta midiendo la cantidad del polipéptido de telomerasa.
- 47.
- El procedimiento del punto 32, en el que la muestra es una preparación a partir del cuello uterino.
- 48.
- El procedimiento del punto 47, en el que la preparación es un frotis de Papanicolaou o una suspensión de capa fina de células.
- 49.
- Un kit para monitorizar un cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado en una paciente que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para monitorizar el cambio a una afección de displasia de cuello uterino de alto grado a partir de una afección de displasia de cuello uterino de bajo grado, de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de los puntos 32-48.
- 50.
- Un procedimiento para evaluar el mantenimiento o la regresión de una afección de una paciente de displasia de
cuello uterino de bajo grado que comprende: a) someter a ensayo una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente displasia de cuello uterino de bajo grado; y b) determinar que la amplificación genómica de la etapa a) no está presente, en el que la ausencia de la amplificación genómica de la etapa a) indica mantenimiento o regresión de la afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado.
- 51.
- El procedimiento del punto 50, en el que la amplificación genómica está dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q.
- 52.
- El procedimiento del punto 50, en el que la displasia de cuello uterino de bajo grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 1.
- 53.
- El procedimiento del punto 50, en el que la regresión se detecta obteniendo un frotis de Papanicolaou citológicamente normal de la paciente.
- 54.
- El procedimiento del punto 51, en el que la amplificación genómica se detecta hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26.
- 55.
- El procedimiento del punto 50, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa, o una parte del mismo.
- 56.
- El procedimiento del punto 50, en el que el marcador detectable emite una señal fluorescente.
- 57.
- El procedimiento del punto 50, en el que el marcador detectable es cromogénico.
- 58.
- El procedimiento del punto 50, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3 o del cromosoma 7.
- 59.
- El procedimiento del punto 51, en el que la amplificación genómica se detecta por la reacción en cadena de la polimerasa.
- 60.
- El procedimiento del punto 51, en el que la amplificación genómica se detecta midiendo la cantidad del polipéptido de telomerasa.
- 61.
- El procedimiento del punto 50, en el que la muestra es una preparación a partir del cuello uterino.
- 62.
- El procedimiento del punto 61, en el que la preparación es un frotis de Papanicolaou o una suspensión de capa fina de células.
- 63.
- Un kit para evaluar el mantenimiento o la regresión de una afección de una paciente afección de displasia de cuello uterino de bajo grado que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q e instrucciones para usar la sonda para evaluar el mantenimiento o la regresión de una afección de una paciente de displasia de cuello uterino de bajo grado, de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de los puntos 50-62.
- 64.
- El procedimiento del punto 8, 22, 40 ó 50, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en sitio de integración vírica ectópica 1, síndrome de mielodisplasia 1, mioneurina, receptor acoplado a proteína G 160, poteincinasa C, similar a SKI, claudina 11, factor de iniciación de traducción eucariota 5A2, cinasa de interacción con TRAF2 y NCK, fosfolipasa D1, receptor de secretagogo de hormona de crecimiento, factor de necrosis tumoral 10, oncogén de secuencia de transformación de célula epitelial 2, proteína con dedos de zinc diana p53, fosfoinosítido-3-cinasa, mitofusina 1 y proteasa específica de ubiquitina 13.
- 65.
- Un procedimiento para evaluar un cambio en una afección de una paciente de normal a una afección de
displasia de cuello uterino de bajo grado, displasia de cuello uterino de alto grado o cáncer, que comprende: detectar una amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra de una paciente que tiene o que tiene previamente un diagnóstico normal para evaluar de este modo el cambio en la afección de una paciente a una displasia de cuello uterino de bajo grado, displasia de cuello uterino de alto grado o cáncer.
- 66.
- El procedimiento del punto 65, en el que la amplificación genómica del cromosoma 3q indica la evolución de la afección de una paciente a displasia de cuello uterino de bajo grado o de alto grado.
- 67.
- El procedimiento del punto 65, en el que la amplificación genómica está dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q.
- 68.
- Un procedimiento de diagnóstico de adenocarcinoma en un sujeto que comprende: detectar la amplificación genómica de un gen de la telomerasa o una parte del mismo en un sujeto.
- 69.
- El procedimiento del punto 68, en el que la amplificación genómica se detecta hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26.
- 70.
- El procedimiento del punto 69, en el que la sonda comprende un cóntigo de cinco clones BAC solapantes.
- 71.
- El procedimiento del punto 68, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa, o una parte del mismo.
- 72.
- El procedimiento del punto 68, en el que la muestra es una preparación a partir del cuello uterino.
- 73.
- El procedimiento del punto 68, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3.
- 74.
- El procedimiento del punto 68, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 7.
- 75.
- El procedimiento del punto 68, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero de los cromosomas 3 y 7.
- 76.
- Un kit para monitorizar un adenocarcinoma en una paciente que comprende una sonda para detectar una amplificación genómica de los cromosomas 3q e instrucciones para usar la sonda para monitorizar el adenocarcinoma de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de los puntos 68-74.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para identificar a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo,comprendiendo el procedimiento: detectar cualquier amplificación genómica del cromosoma 3q en una muestra obtenida a partir de una paciente que tienei) displasia de cuello uterino de bajo grado; o ii) que no tiene displasia identificando así a una paciente con riesgo de desarrollar carcinoma de cuello uterino invasivo si una amplificación genómica de cromosoma 3q se detecta.
-
- 2.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la amplificación genómica está dentro del locus 3q26 del cromosoma 3q.
-
- 3.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la displasia de cuello uterino de bajo grado es una neoplasia intraepitelial de cuello uterino de grado 1.
-
- 4.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se obtiene un frotis de Papanicolaou normal de una paciente que no tiene displasia.
-
- 5.
- El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la amplificación genómica se detecta hibridando la muestra a una sonda que comprende un marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos del locus 3q26.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la secuencia de ácidos nucleicos de la sonda es complementaria del gen de la telomerasa, o una parte del mismo.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el marcador detectable emite una señal fluorescente.
-
- 8.
- El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el marcador detectable es cromogénico.
-
- 9.
- El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente hibridar la muestra a una sonda centromérica de enumeración que comprendeun marcador detectable y una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia de ácidos nucleicos próxima al centrómero del cromosoma 3.
-
- 10.
- El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la amplificación genómica se detecta por la reacción en cadena de la polimerasa.
-
- 11.
- Los procedimientos de la reivindicación 2, en los que la amplificación genómica se detecta midiendo la cantidad del polipéptido de telomerasa.
-
- 12.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra es una preparación a partir del cuello uterino.
-
- 13.
- El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la preparación es un frotis de Papanicolaou o una suspensión de capa fina de células.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65417605P | 2005-02-18 | 2005-02-18 | |
| US654176P | 2005-02-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2360954T3 true ES2360954T3 (es) | 2011-06-10 |
Family
ID=36778261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06748239T Expired - Lifetime ES2360954T3 (es) | 2005-02-18 | 2006-02-21 | Procedimientos para detectar la evolución de la displasia de cuello uterino de bajo grado. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8409808B2 (es) |
| EP (2) | EP2333117B1 (es) |
| JP (1) | JP5053867B2 (es) |
| AT (1) | ATE498023T1 (es) |
| AU (1) | AU2006213996B2 (es) |
| CA (1) | CA2598179A1 (es) |
| DE (1) | DE602006020021D1 (es) |
| DK (1) | DK1853735T3 (es) |
| ES (1) | ES2360954T3 (es) |
| WO (1) | WO2006089287A2 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100211066A1 (en) * | 2006-06-06 | 2010-08-19 | University Of Massachusetts | Use of IMP3 as a Prognostic Marker for Cancer |
| US20090208965A1 (en) * | 2006-10-25 | 2009-08-20 | Ikonisys, Inc. | Automated method for detecting cancers and high grade hyperplasias |
| WO2008070333A2 (en) * | 2006-10-25 | 2008-06-12 | Ikonisys, Inc. | Automated detection of cancer and high grade hyperplasias |
| CA2731781A1 (en) | 2008-07-21 | 2010-01-28 | Neodiagnostix, Inc. | Methods for the cytological analysis of cervical cells |
| WO2011011527A2 (en) | 2009-07-21 | 2011-01-27 | Neodiagnostix, Inc. | Method and system for automated image analysis in cancer cells |
| US8865882B2 (en) | 2010-09-08 | 2014-10-21 | Cancer Genetics, Inc. | Methods for detecting human papilloma virus-associated cancers |
| JP6685229B2 (ja) | 2014-02-17 | 2020-04-22 | シエナ キャンサー ダイアグノスティクス リミテッドＳｉｅｎｎａ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ | 癌を検出する方法 |
| WO2017027928A1 (en) * | 2015-08-19 | 2017-02-23 | Sienna Cancer Diagnostics Ltd | Cancer detection method |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5756696A (en) | 1986-01-16 | 1998-05-26 | Regents Of The University Of California | Compositions for chromosome-specific staining |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| AU647741B2 (en) | 1989-12-01 | 1994-03-31 | Regents Of The University Of California, The | Methods and compositions for chromosome-specific staining |
| US5491224A (en) | 1990-09-20 | 1996-02-13 | Bittner; Michael L. | Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture |
| US5472842A (en) | 1993-10-06 | 1995-12-05 | The Regents Of The University Of California | Detection of amplified or deleted chromosomal regions |
| US5830645A (en) | 1994-12-09 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
| US5919624A (en) * | 1997-01-10 | 1999-07-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Methods for detecting cervical cancer |
| US20040248107A1 (en) * | 2003-06-09 | 2004-12-09 | Sokolova Irina A. | Detection of high grade dysplasia in cervical cells |
-
2006
- 2006-02-21 ES ES06748239T patent/ES2360954T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2006-02-21 AU AU2006213996A patent/AU2006213996B2/en not_active Ceased
- 2006-02-21 WO PCT/US2006/006116 patent/WO2006089287A2/en not_active Ceased
- 2006-02-21 US US11/884,608 patent/US8409808B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-21 EP EP10185965.0A patent/EP2333117B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2006-02-21 EP EP06748239A patent/EP1853735B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2006-02-21 DK DK06748239.8T patent/DK1853735T3/da active
- 2006-02-21 DE DE602006020021T patent/DE602006020021D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2006-02-21 AT AT06748239T patent/ATE498023T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-02-21 JP JP2007556404A patent/JP5053867B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-21 CA CA002598179A patent/CA2598179A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-04-01 US US13/854,764 patent/US20140005063A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1853735B1 (en) | 2011-02-09 |
| WO2006089287A3 (en) | 2006-12-14 |
| DK1853735T3 (da) | 2011-05-16 |
| US8409808B2 (en) | 2013-04-02 |
| WO2006089287A2 (en) | 2006-08-24 |
| JP2008530998A (ja) | 2008-08-14 |
| EP2333117A1 (en) | 2011-06-15 |
| EP2333117B1 (en) | 2013-10-16 |
| AU2006213996A1 (en) | 2006-08-24 |
| CA2598179A1 (en) | 2006-08-24 |
| DE602006020021D1 (de) | 2011-03-24 |
| AU2006213996B2 (en) | 2011-08-11 |
| HK1115166A1 (en) | 2008-11-21 |
| JP5053867B2 (ja) | 2012-10-24 |
| EP1853735A2 (en) | 2007-11-14 |
| US20140005063A1 (en) | 2014-01-02 |
| US20090035763A1 (en) | 2009-02-05 |
| ATE498023T1 (de) | 2011-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Andersson et al. | Frequent gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 in cervical adenocarcinomas | |
| US20140005063A1 (en) | Method for detecting risk of progression of low grade cervical dysplasia | |
| US8951725B2 (en) | Diagnostic methods for determining prognosis of non-small cell lung cancer | |
| Tsiambas et al. | HER2/neu expression and gene alterations in pancreatic ductal adenocarcinoma: a comparative immunohistochemistry and chromogenic in situ hybridization study based on tissue microarrays and computerized image analysis | |
| Dolan et al. | Comparison of immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization assessment of HER-2 status in routine practice | |
| Fishman et al. | The scientific basis of early detection of epithelial ovarian cancer: the National Ovarian Cancer Early Detection Program (NOCEDP) | |
| ES2384796T3 (es) | Detección de displasia de alto grado en células del cuello uterino | |
| US20070178503A1 (en) | In-situ genomic DNA chip for detection of cancer | |
| JP2004505247A (ja) | 子宮頚部悪性腫瘍につながる異常の検出 | |
| CA2651419A1 (en) | Diagnostic methods for determining treatment | |
| Berdugo et al. | RB1, p16, and human papillomavirus in oropharyngeal squamous cell carcinoma | |
| US20200199687A1 (en) | Materials and methods for assessing progression of prostate cancer | |
| JP2001522983A (ja) | 子宮頸異形成及び癌を検出するための生化学的方法 | |
| CA2778004A1 (en) | Diagnostic methods for determining prognosis of non-small-cell lung cancer | |
| JPWO2020054782A1 (ja) | 乳癌細胞存在率の推定方法 | |
| Chen et al. | High-risk HPV E6/E7 mRNA in situ hybridization in endocervical glandular neoplasia: performance compared with p16INK4a and Ki67 immunochemistry | |
| US8999647B2 (en) | Methods of subclassification of ductal carcinoma in situ of the breast | |
| Class et al. | Patent application title: METHOD FOR DETECTING RISK OF PROGRESSION OF LOW GRADE CERVICAL DYSPLASIA Inventors: The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Thomas Ried (Bethesda, MD, US) Kerstin Heselmeyer-Haddad (Edewecht, DE) Winfried Steinberg (Soest, DE) Gert Auer (Solna, SE) Sonia Andersson (Stockholm, SE) Catharina Larsson (Stockholm, SE) Assignees: The USA as represented by the secretary, Dept. of Health & Human Services | |
| CN111912985A (zh) | E3泛素化蛋白连接酶ubr5在制备肿瘤诊断或预后评估试剂盒中的应用 | |
| HK1115166B (en) | Methods for detecting progression of low grade cervical dysplasia | |
| EP2396424A1 (en) | Galectin-1 (gal1) as a biomarker for differential diagnosis of osteosarcoma and chondrosarcoma | |
| Borczuk | Molecular Diagnosis of Pleural Neoplasms | |
| Leemans et al. | Loss of heterozygosity at 9p and p53 immunopositivity in surgical margins predict local relapse in head and neck squamous cell carcinoma | |
| Wolff | Impact of HPV infection on oral squamous cell carcinoma | |
| Benevolo et al. | Comparative evaluation of nm23 and p16 expression as biomarkers of HR-HPV infection and CIN2+ lesions of the uterine cervix |