ES2361489T3

ES2361489T3 - Moléculas de adn que codifican canales de cloruro regulados por l-glutamato de rhipicephalus sanguineus.

Info

Publication number: ES2361489T3
Application number: ES01922781T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey W. Warmke; Youfeng Yang; Doris F. Cully; Michel J. Hamelin
Original assignee: Merial Ltd; Merial LLC
Current assignee: Merial Ltd; Merial LLC
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2011-06-17
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: US20030229215A1; WO2001074838A1; US20080045696A1; PT1272503E; DK1272503T3; US7915010B1; DE60144276D1; EP1272503B1; US7202054B2; EP1272503A4; JP2004500118A; EP1272503A1; US20080286770A1; CA2405268C; ATE502955T1; CA2405268A1; US7541432B2; US7674586B2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica una proteína de canal GluCl de R. sanguineus, en que dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8.

Description

Campo de la invención.

[0001] La presente invención se refiere en parte a moléculas de ácido nucleico (polinucleótidos) aisladas que codifican canales de cloruro regulados por glutamato de Rhipicephalus sanguineus (garrapata marrón del perro). La presente invención se refiere también a vectores recombinantes y hospedadores recombinantes que contienen un fragmento de ADN que codifica canales de cloruro regulados por glutamato de R. sanguineus, formas sustancialmente purificadas de canales de cloruro regulados por glutamato de R. sanguineus asociados y fracciones de membrana recombinantes que comprenden estas proteínas, proteínas mutantes asociadas y a procedimientos asociados con la identificación de compuestos que modulan canales de cloruro regulados por glutamato de R. sanguineus asociados, que serán útiles como insecticidas.

Antecedentes de la invención.

[0002] Los canales de cloruro regulados por glutamato o receptores H se han identificado en los nervios y músculos de artrópodos (Lingle y col., 1981, Brain Res. 212: 481-488; Horseman y col., 1988, Neurosci. Lett. 85: 6570; Wafford y Sattelle, 1989, J. Exp. Bio. 144: 449-462; Lea y Usherwood, 1973, Comp. Gen. Pharmacol. 4: 333-350; Cull-Candy, 1976, J. Physiol. 255: 449-464).

[0003] Los canales de cloruro regulados por glutamato de invertebrados son dianas importantes para los compuestos antihelmínticos e insecticidas de la clase de la avermectina, de amplio uso. Las avermectinas son una familia de lactonas macrocíclicas aisladas originalmente del actinomiceto Streptomyces avermitilis. El derivado semisintético de la avermectina, ivermectina (22,23-dihidroavermectina B1a) se usa en todo el mundo para el tratamiento de helmintos parásitos y plagas de insectos del hombre y los animales. Las avermectinas siguen siendo los endectocidas de amplio espectro más potentes con baja toxicidad para el huésped. Después de muchos años de uso en el campo, sigue habiendo poca resistencia a la avermectina en la población de insectos. La combinación de un buen índice terapéutico y la baja resistencia sugiere que los canales de cloruro regulados por glutamato (GluCl) siguen siendo buenas dianas para el desarrollo de insecticidas.

[0004] Se han clonado canales de cloruro regulados por glutamato a partir del nematodo del suelo Caenorhabditis elegans (Cully y col., 1994, Nature 371: 707-711; véase también la patente de los EE. UU. n°

5.527.703 y Arena y col., 1992, Molecular Brain Research 15: 339-348) y de Ctenocephalides felis (pulga; véase el documento WO 99/07828).

[0005] Además, anteriormente se identificó un gen codificante de un canal de cloruro regulado por glutamato en Drosophila melanogaster (Cully y col., 1996, J. Biol. Chem. 271: 20187-20191; véase también la patente de los EE. UU n° 5.693.492).

[0006] A pesar de la identificación de los clones de ADNc mencionados anteriormente que codifican canales GluCl, sería ventajoso identificar genes adicionales codificantes de canales GluCl en R. sanguineus con el fin de permitir una mejora del cribado para identificar nuevos moduladores de los canales GluCl que puedan tener actividad insecticida, acaricida y/o nematocida para la salud animal, especialmente en relación con el tratamiento de infestaciones de garrapatas y ácaros en perros, gatos, ganado, ovejas y otros animales importantes para la agricultura. La presente invención se enfrenta a estas necesidades y las satisface desvelando nuevos genes que expresan un canal GluCl1 de R. sanguineus y un canal GluCl2 de R. sanguineus, en que la expresión de estos ARN de GluCl de R. sanguineus en ovocitos de Xenopus o en otras células hospedadoras adecuadas resulta en un canal GluCl activo. La expresión heteróloga de un canal GluCl de la presente invención permitirá el análisis farmacológico de compuestos activos contra especies de invertebrados parásitos importantes para la salud animal o humana, especialmente en el tratamiento de infestaciones de garrapatas en perros y gatos. Las líneas celulares heterólogas que expresan un canal GluCl activo pueden usarse para establecer ensayos funcionales o de unión para identificar nuevos moduladores de los canales GluCl que pueden ser útiles en el control de los grupos de especies mencionados anteriormente.

Resumen de la invención.

[0007] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada o purificada que codifica una nueva proteína de canal GluCl1 del invertebrado Rhipicephalus sanguineus (garrapata marrón del perro). Las moléculas de ADN desveladas en este documento pueden transfectarse en una célula hospedadora elegida, en que la célula hospedadora recombinante proporciona una fuente de cantidades sustanciales de un canal iónico regulado por ligando (LGIC) expresado y funcional, simple, homomultimérico o heteromultimérico. Es posible que tales canales iónicos funcionales regulados por ligando respondan a otros ligandos conocidos, los cuales, a su vez, proporcionarán dianas de cribado adicionales para identificar moduladores de estos canales, moduladores que pueden actuar como tratamiento insecticida, miticida y/o nematocida eficaz para su uso en la salud animal y humana y/o en la protección de los cultivos.

[0008] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada y purificada que codifica una nueva proteína de canal GluCl2 del invertebrado Rhiphicephalus sanguineus.

[0009] La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl1 de Rhiphicephalus sanguineus, en que esta molécula de ADN comprende la secuencia nucleotídica desvelada en este documento como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5.

[0010] La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl2 de Rhiphicephalus sanguineus, en que esta molécula de ADN comprende la secuencia nucleotídica desvelada en este documento como SEQ ID NO:7.

[0011] En este documento se desvelan fragmentos o mutantes biológicamente activos de SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7 que codifican un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl1 o GluCl2 del invertebrado Rhiphicephalus sanguineus, respectivamente. Cualquiera de estos fragmentos y/o mutantes biológicamente activos codificará una proteína o un fragmento de proteína que mimetiza, al menos sustancialmente, las propiedades farmacológicas de una proteína de canal GluCl de R. sanguineus, incluyendo, pero sin limitarse a las proteínas de canal GluCl1 de R. sanguineus según se exponen en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, así como la respectiva proteína de canal GluCl2 según se expone en SEQ ID NO:8. Cualquiera de estos polinucleótidos incluye, pero no se limita necesariamente a sustituciones, deleciones y adiciones nucleotídicas, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales, de modo que estas mutaciones codifican un ARNm que expresa un canal GluCl de R. sanguineus funcional en una célula eucariota, como los ovocitos de Xenopus, de manera que son útiles para el cribado en busca de agonistas y/o antagonistas de la actividad de GluCl de R. sanguineus.

[0012] En este documento se desvelan las secuencias de la figura 1 (SEQ ID NO:1; designada T12), la figura 3 (SEQ ID NO:3; designada T82) y la figura 5 (SEQ ID NO:5; designada T32) que codifican nuevas proteínas GluCl1 de Rhiphicephalus sanguineus y de la figura 7 (SEQ ID NO:7, designada B1) que codifica una nueva proteína GluCl2 de Rhiphicephalus sanguineus.

[0013] Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), como ADN genómico o ADN complementario (ADNc), que puede ser de cadena sencilla (hebra codificante o no codificante) o doble, así como ADN sintético, tal como un polinucleótido sintetizado de cadena sencilla. La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención puede incluir también una molécula de ácido ribonucleico (ARN).

[0014] La presente invención se refiere también a vectores recombinantes y a células hospedadoras recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas desveladas en esta memoria descriptiva.

[0015] La presente invención se refiere también a una forma sustancialmente purificada de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que comprende la secuencia de aminoácidos desvelada en la figura 2 (SEQ ID NO:2), la figura 4 (SEQ ID NO:4) y la figura 6 (SEQ ID NO:6), así como a una nueva proteína GluCl2 de Rhiphicephalus sanguineus que comprende la secuencia de aminoácidos desvelada en la figura 8 (SEQ ID NO:8).

[0016] Un aspecto preferido de esta parte de la presente invención es una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de la secuencia de aminoácidos desvelada en la figura 2 (SEQ ID NO:2), la figura 4 (SEQ ID NO:4) y la figura 6 (SEQ ID NO:6).

[0017] Otro aspecto preferido de esta parte de la presente invención es una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus que consta de la secuencia de aminoácidos desvelada en la figura 8 (SEQ ID NO:8).

[0018] Otro aspecto preferido de la presente invención se refiere a una proteína de canal GluCl madura, totalmente procesada (incluyendo cualquier procesamiento proteolítico, glicosilación y/o fosforilación) y sustancialmente purificada, obtenida a partir de una célula hospedadora recombinante que contiene un vector de expresión de ADN que comprende una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:1, 3, 5 y/o 7 y expresa las proteínas precursoras respectivas RsGluCl1 o RsGluCl2. Se prefiere especialmente que la célula hospedadora recombinante sea una célula hospedadora eucariota, incluyendo, pero sin limitarse a una línea celular de mamífero, una línea celular de insecto, como la línea celular S2, u ovocitos de Xenopus.

[0019] En este documento se menciona una preparación de membrana sustancialmente purificada, una preparación de membrana parcialmente purificada o un lisado celular que se ha obtenido a partir de una célula hospedadora recombinante transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa de manera apropiada un marco de lectura abierta completo según se expone en SEQ ID NO:1, 3, 5 y/o 7, lo que resulta en una forma funcional del canal RsGluCl1 o RsGluCl2 respectivo. Las fracciones subcelulares de membrana y/o los lisados celulares que contienen membranas de las células hospedadoras recombinantes (tanto procariotas como eucariotas, así como células transformadas o transfectadas tanto de manera estable como transitoria) contienen las proteínas funcionales codificadas por los ácidos nucleicos de la presente invención. Esta preparación de membrana de base recombinante puede comprender un canal GluCl de R. sanguineus y esencialmente no contiene proteínas contaminantes, incluyendo, pero sin limitarse a otras proteínas procedentes de

R. sanguineus o proteínas del hospedador, de una célula recombinante que exprese la proteína de canal GluCl1 T12 (SEQ ID NO:2), T82 (SEQ ID NO:4), T32 (SEQ ID NO:6) y/o la proteína de canal GluCl2 B1 (SEQ ID NO:8). Por lo tanto, un aspecto preferido de la invención es una preparación de membrana que contiene un canal GluCl de R. sanguineus que comprende una proteína GluCl que comprende la forma funcional de las proteínas de canal GluCl1 de longitud completa según se desvela en la figura 2 (SEQ ID NO:2; T12), la figura 4 (SEQ ID NO:4; T82) y la figura 6 (SEQ ID NO:6; T32) y/o una forma funcional de la proteína de canal GluCl2 de longitud completa según se desvela en la figura 8 (SEQ ID NO:8; B1). Estas fracciones subcelulares de membrana comprenderán formas naturales o variaciones mutantes que son formas biológicamente funcionales de los canales GluCl de R. sanguineus, cualquier combinación homomultimerica o heteromultimérica de estos.

[0020] En este documento se describen fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que comprende la secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID No: 2, 4 y/o 6, así como fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus que comprende la secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID No: 8, incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a sustituciones, deleciones y adiciones de aminoácidos, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales, de modo que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteínas de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y serían útiles para el cribado en busca de moduladores selectivos, incluyendo, pero sin limitarse a agonistas y/o antagonistas para la farmacología de los canales GluCl de R. sanguineus.

[0021] Un aspecto preferido de la presente invención se desvela en la figura 2 (SEQ ID NO:2), la figura 4 (SEQ ID NO:4), la figura 6 (SEQ ID NO:6) y la figura 8 (SEQ ID NO:8) que son, respectivamente, las secuencias de aminoácidos que comprenden las proteínas GluCl1 y GluCl2 de R. sanguineus de la presente invención. La caracterización de una o más de estas proteínas de canal permite procedimientos de cribado para identificar nuevos moduladores de los canales GluCl que puedan tener actividad insecticida, miticida y/o nematocida para la salud animal o la protección de los cultivos. Como se ha señalado anteriormente, la expresión heteróloga de un canal GluCl de Rhiphicephalus sanguineus permitirá el análisis farmacológico de compuestos activos contra especies invertebradas parásitas importantes para la salud animal y humana, especialmente en perros y gatos, de los que es sabido que sufren infestaciones frecuentes de garrapatas. Las líneas celulares heterólogas que expresan un canal RsGluCl1 funcional (por ejemplo, formas funcionales de SEQ ID NO:2, 4 y/o 6) o RsGluCl2 (por ejemplo, una forma funcional de SEQ ID NO:8) pueden usarse para establecer ensayos funcionales o de unión para identificar nuevos moduladores de los canales GluCl que pueden ser útiles en el control de los grupos de especies mencionados anteriormente.

[0022] En este documento se mencionan anticuerpos policlonales y monoclonales producidos en respuesta a las formas desveladas de RsGluCl1 y/o RsGluCl2 o un fragmento biológicamente activo de estas.

[0023] También se mencionan en este documento construcciones de fusión de RsGluCl1 y/o RsGluCl2, incluyendo, pero sin limitarse a construcciones de fusión que expresan una parte de RsGluCl ligada a varios marcadores, incluyendo, pero sin limitarse de ningún modo a GFP (proteína verde fluorescente), el epítopo de MYC y GST. Cualquiera de estas construcciones de fusión puede expresarse en la línea celular de interés y usarse para un cribado en busca de moduladores de una o más de las proteínas RsGluCl desveladas en este documento.

[0024] La presente invención se refiere a procedimientos de expresión de las proteínas de canal GluCl1 de R. sanguineus y/o RsGluCl2 y de equivalentes biológicos desvelados en este documento, a ensayos que emplean estos productos génicos, a células hospedadoras recombinantes que comprenden construcciones de ADN que expresan estas proteínas y a compuestos identificados a través de estos ensayos que actúan como agonistas o antagonistas de la actividad del canal GluCl.

[0025] Un objetivo de la presente invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7) que codifique un nueva forma de GluCl de R. sanguineus o fragmentos, mutantes o derivados de RsGluCl1 o RsGluCl2, siendo estas proteínas según se exponen en SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, respectivamente. Cualquier polinucleótido de este tipo incluye, pero no se limita necesariamente a sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales, de modo que estas mutaciones codifican un ARNm que expresa una proteína o un fragmento de proteína de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y serían útiles para el cribado en busca de moduladores selectivos para la farmacología de GluCl de invertebrados.

[0026] Otro objetivo de la presente invención es proporcionar las proteínas o fragmentos de proteínas GluCl de R. sanguineus codificadas por las moléculas de ácido nucleico a las que se hace referencia en el párrafo precedente.

[0027] Otro objetivo de la presente invención es proporcionar vectores recombinantes y células hospedadoras recombinantes que comprendan una secuencia de ácido nucleico que codifique proteínas GluCl de R. sanguineus o un equivalente biológico de estas.

[0028] Un objetivo de la presente invención es proporcionar una forma sustancialmente purificada de las proteínas GluCl1 o GluCl2 de R. sanguineus según se exponen en SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, respectivamente.

[0029] Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una forma recombinante sustancialmente purificada de una proteína GluCl de R. sanguineus que se ha obtenido a partir de una célula hospedadora recombinante transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa apropiadamente un marco de lectura abierto completo según se expone en SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7, lo que resulta en una forma procesada y funcional del canal RsGluCl respectivo. Se prefiere especialmente que la célula hospedadora recombinante sea una célula hospedadora eucariota, como una línea celular de mamífero.

[0030] Se proporcionan fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de las proteínas GluCl1 o GluCl2 de

R. sanguineus, respectivamente, según se exponen en SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a sustituciones, deleciones y adiciones de aminoácidos, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales, de modo que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteínas de uso diagnóstico, terapéutico y/o profiláctico.

[0031] Además, se proporciona una preparación subcelular de membrana sustancialmente purificada, una preparación de membrana parcialmente purificada o un lisado crudo de células recombinantes que comprenden un canal simple, homomultimérico o heteromultimérico farmacológicamente activo que contiene GluCl1 o GluCl2 de R. sanguineus, respectivamente, especialmente fracciones subcelulares obtenidas de una célula hospedadora transfectada o transformada con un vector de ADN que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos según se expone en la figura 2 (SEQ ID NO:2), la figura 4 (SEQ ID NO:4), la figura 6 (SEQ ID NO:6) y la figura 8 (SEQ ID NO:8).

[0032] Además se proporciona una preparación de membrana sustancialmente purificada, una preparación de membrana parcialmente purificada o un lisado crudo obtenidos de una célula hospedadora recombinante transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa apropiadamente un marco de lectura abierto completo según se expone en SEQ ID NO:1, 3, 5 y/o 7, lo que resulta en una forma procesada y funcional del canal RsGluCl respectivo. Se prefiere especialmente que la célula hospedadora recombinante sea una célula hospedadora eucariota, incluyendo, pero sin limitarse a una línea celular de mamífero, una línea celular de insecto como la línea celular S2, u ovocitos de Xenopus.

[0033] También es un objetivo de la presente invención el uso de proteínas GluCl de R. sanguineus o preparaciones de membrana que contienen proteínas GluCl de R. sanguineus o un equivalente biológico para el cribado en busca de moduladores, preferentemente moduladores selectivos, de la actividad del canal GluCl de R. sanguineus. Cualquier compuesto de este tipo puede ser útil en el cribado y la selección de compuestos activos contra especies de invertebrados parásitos importantes para la salud animal y humana. Tales especies incluyen, pero no se limitan a gusanos, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos. Estas preparaciones de membrana pueden generarse a partir de líneas celulares heterólogas que expresen estas proteínas GluCl y pueden constar de la proteína de longitud completa, fragmentos biológicamente activos de la proteína de longitud completa o pueden depender de proteínas de fusión expresadas a partir de diversas construcciones de fusión que pueden construirse con los materiales disponibles en la técnica.

[0034] Según se usa en este documento, “sustancialmente sin otros ácidos nucleicos” significa sin otros ácidos nucleicos en al menos el 90%, preferentemente el 95%, con mayor preferencia el 99% e incluso con mayor preferencia el 99,9%. Según se usa de manera intercambiable con los términos “sustancialmente sin otros ácidos nucleicos” o “sustancialmente purificado” o “ácido nucleico aislado” o “ácido nucleico purificado” también se refiere a moléculas de ADN que comprenden una región codificante de una proteína GluCl de R. sanguineus que se ha purificado separándola de otros componentes celulares. Por lo tanto, una preparación de ADN de GluCl de R. sanguineus, sustancialmente sin otros ácidos nucleicos no contendrá, como porcentaje del ácido nucleico total, más del 10%, preferentemente no más del 5%, con mayor preferencia no más del 1% e incluso con mayor preferencia no más del 0,1% de ácidos nucleicos distintos de GluCl de R. sanguineus. Es posible determinar si una preparación dada de ADN de GluCl de R. sanguineus no contiene sustancialmente otros ácidos nucleicos por medio de las técnicas convencionales de evaluación de la pureza de los ácidos nucleicos como, por ejemplo, la electroforesis en gel combinada con los procedimientos de tinción adecuados, por ejemplo, la tinción con bromuro de etidio, o por secuenciación.

[0035] Según se usa en este documento, “sustancialmente sin otras proteínas” o “sustancialmente purificada” significa sin otras proteínas en al menos el 90%, preferentemente el 95%, con mayor preferencia el 99% e incluso con mayor preferencia el 99,9%. Por lo tanto, una preparación de proteína GluCl de R. sanguineus, sustancialmente sin otros ácidos nucleicos no contendrá, como porcentaje de la proteína total, más del 10%, preferentemente no más del 5%, con mayor preferencia no más del 1% e incluso con mayor preferencia no más del 0,1% de proteínas distintas de GluCl de R. sanguineus. Es posible determinar si una preparación dada de proteína GluCl de R. sanguineus no contiene sustancialmente otras proteínas por medio de las técnicas convencionales de evaluación de la pureza de las proteínas como, por ejemplo, la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) combinada con los procedimientos de detección apropiados, por ejemplo, tinción con plata o inmunotransferencia. Según se usa de manera intercambiable con los términos “sustancialmente sin otras proteínas”

o “sustancialmente purificada”, los términos “proteína GluCl de R. sanguineus aislada” o “proteína GluCl de R. sanguineus purificada” también se refieren a una proteína GluCl de R. sanguineus aislada de una fuente natural. El uso del término “aislada” o “purificada” indica que la proteína GluCl de R. sanguineus ha sido extraída de su entorno celular normal. Por lo tanto, una proteína GluCl de R. sanguineus aislada puede estar en una disolución que no contiene células o colocada en otro entorno celular diferente de aquel en el que se presenta de manera natural. El término aislada no implica que una proteína GluCl de R. sanguineus aislada sea la única proteína presente, sino que significa que una proteína GluCl de R. sanguineus aislada no contiene sustancialmente otras proteínas ni material no aminoacídico (por ejemplo, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos) asociado de manera natural con la proteína GluCl de R. sanguineus in vivo. Por lo tanto, una proteína GluCl de R. sanguineus que se expresa de manera recombinante en una célula procariota o eucariota y se purifica sustancialmente a partir de esta célula hospedadora que no expresa esta proteína GluCl de modo natural (es decir, sin intervención) es, por supuesto, una “proteína GluCl de R. sanguineus aislada” en cualquiera de las circunstancias a las que se hace referencia en este documento. Según se ha señalado anteriormente, una preparación de proteína GluCl de R. sanguineus que es una proteína GluCl de R. sanguineus aislada o purificada no contendrá sustancialmente otras proteínas y no contendrá, como porcentaje de la proteína total, más del 10%, preferentemente no más del 5%, con mayor preferencia no más del 1% e incluso con mayor preferencia no más del 0,1% de proteínas distintas de GluCl de R. sanguineus.

[0036] Según se usa de manera intercambiable en este documento, “equivalente funcional” o “equivalente biológicamente activo” significa una proteína que no tiene exactamente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína GluCl de R. sanguineus de origen natural, debido a un corte y unión alternativo o a deleciones, mutaciones, sustituciones o adiciones, pero que mantiene sustancialmente la misma actividad biológica que GluCl de R. sanguineus. La secuencia de aminoácidos de tales equivalentes funcionales será significativamente idéntica a la de GluCl R. sanguineus de origen natural y los genes y el ADNc que codifican tales equivalentes funcionales pueden detectarse mediante hibridación en condiciones poco restrictivas con una secuencia de ADN que codifique GluCl de

R. sanguineus de origen natural. Por ejemplo, una proteína GluCl1 de R. sanguineus de origen natural desvelada en este documento comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra como SEQ ID NO:2 y está codificada por SEQ ID NO:1. Un ácido nucleico que codifique un equivalente funcional tiene al menos una identidad del 50% en cuanto a nucleótidos con SEQ ID NO:1.

[0037] Según se usa en este documento, “una sustitución de aminoácido conservadora” se refiere a la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido químicamente similar. Algunos ejemplos de tales sustituciones conservadoras son: la sustitución de un resto hidrófobo (isoleucina, leucina, valina o metionina) por otro, la sustitución de un resto polar por otro resto polar de la misma carga (por ejemplo, arginina por lisina; ácido glutámico por ácido aspártico).

[0038]: Según se usa en este documento, “LGIC” se refiere a un canal iónico regulado por ligando.

[0039]: Según se usa en este documento, “GluCl” se refiere a un canal de cloruro regulado por L-glutamato.

[0040]: Según se usa en este documento, “RsGluCl” se refiere a un canal de cloruro regulado por L-glutamato

de Rhipicephalus sanguineus.

[0041] Además, según se usa en este documento, “RsGluCl” puede referirse a RsGluCl1 y/o RsGluCl2.

[0042] Según se usa en este documento, el término “mamífero” se referirá a cualquier mamífero, incluyendo el ser humano.

Breve descripción de los dibujos

[0043]

La figura 1 muestra la secuencia nucleotídica del clon de ADNc de GluCl1 de R. sanguineus T12, expuesta en SEQ ID NO:1. La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína GluCl1 de R. sanguineus T12, según se expone en SEQ ID NO:2. La figura 3 muestra la secuencia nucleotídica del clon de ADNc de GluCl1 de R. sanguineus T82, según se expone en SEQ ID NO:3. La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína GluCl1 de R. sanguineus T82, según se expone en SEQ ID NO:4. La figura 5 muestra la secuencia nucleotídica del clon de ADNc de GluCl1 de R. sanguineus T32, según se expone en SEQ ID NO:5. La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína GluCl1 de R. sanguineus T32, según se expone en SEQ ID NO:6. La figura 7 muestra la secuencia nucleotídica del clon de ADNc de GluCl2 de R. sanguineus B1, según se expone en SEQ ID NO:7. La figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína GluCl2 de R. sanguineus B1, según se expone en SEQ ID NO:8. La figura 9 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas RsGluCl1 [T12 (SEQ ID NO:2), T82 (SEQ ID NO:4), T32 (SEQ ID NO:6)] y RsGluCl2 (B1, SEQ ID NO:8). La figura 10 muestra la corriente activada por glutamato en ovocitos de Xenopus a los que se ha inyectado ARN de RsGluCl1 T12. La activación de la corriente fue máxima con glutamato 10 µM y no se observó ninguna corriente en ovocitos sin inyectar.

La figura 11 muestra la activación por ivermectina de RsGluCl2 expresada en ovocitos de Xenopus. La activación de la corriente fue máxima con ivermectina aproximadamente 1 µM.

Descripción detallada de la invención

[0044] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada que codifica una proteína de canal GluCl del invertebrado Rhipicephalus sanguineus. Las moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas de la presente invención no contienen sustancialmente otros ácidos nucleicos. En su mayoría, para fines de clonación, el ácido nucleico preferido es ADN. Según se ha señalado anteriormente, las moléculas de ADN desveladas en este documento pueden transfectarse en una célula hospedadora elegida, en que la célula hospedadora recombinante proporciona una fuente de cantidades sustanciales de un canal GluCl expresado y funcional, simple, homomultimérico o heteromultimérico. Es posible que tales canales iónicos funcionales regulados por ligando respondan a otros ligandos conocidos, los cuales, a su vez, proporcionarán dianas de cribado adicionales para identificar moduladores de estos canales, moduladores que pueden actuar como tratamiento insecticida, miticida y/o nematocida eficaz para su uso en la salud animal y humana y/o en la protección de los cultivos. En este documento se demuestra que RsGluCl1 presenta una corriente en respuesta a glutamato y que una proteína de canal RsGluCl2 expresada en ovocitos de Xenopus presenta una corriente en respuesta a la adición de fosfato de ivermectina. Sin embargo, ha de señalarse que una subunidad proteica de canal simple puede no formar un canal funcional, tal como se ha observado con la subunidad  de GABA-A, que no expresa un homomultímero funcional. Por lo tanto, las proteínas expresadas de la presente invención pueden funcionar in vivo como componentes de un canal iónico regulado por ligando natural que contiene una serie de proteínas accesorias y/o de canal, incluyendo las proteínas de canal desveladas en este documento. Sin embargo, las proteínas GluCl de la presente invención no necesitan mimetizar directamente el canal natural para ser útiles para el experto en la técnica. Por el contrario, la capacidad de formar un canal simple, asociado a la membrana dentro de una célula hospedadora recombinante hace que estas proteínas puedan usarse en la metodología de cribado conocida en la técnica y descrita en parte en esta memoria. Por consiguiente, según se ha señalado dentro de esta memoria, las proteínas de canal Rs desveladas de la presente invención son útiles como canales funcionales simples o como canal homomultimérico o como canal heteromultimérico con diversas proteínas desveladas en este documento con o sin subunidades proteicas de canal de Rs adicionales o proteínas accesorias que puedan contribuir al canal GluCl funcional completo. Según se ha señalado anteriormente, las moléculas de ADN desveladas en este documento pueden transfectarse en una célula hospedadora elegida, en que la célula hospedadora recombinante proporciona una fuente de cantidades sustanciales de un canal GluCl expresado y funcional, simple, homomultimérico o heteromultimérico. Es posible que tales canales iónicos funcionales regulados por ligando respondan a otros ligandos conocidos, los cuales, a su vez, proporcionarán dianas de cribado adicionales para identificar moduladores de estos canales, moduladores que pueden actuar como tratamiento insecticida, miticida y/o nematocida eficaz para su uso en la salud animal y humana y/o en la protección de los cultivos.

[0045] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico (polinucleótico) aislada que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl1 del invertebrado Rhiphicephalus sanguineus, en que esta molécula de ADN comprende la secuencia nucleotídica desvelada en este documento como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5.

[0046] La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) aislada que codifica un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl2 del invertebrado Rhiphicephalus sanguineus, en que esta molécula de ADN comprende la secuencia nucleotídica desvelada en este documento como SEQ ID NO:7.

[0047] El aislamiento y la caracterización de las moléculas de ácido nucleico RsGluCl de la presente invención se realizaron según se describe en detalle en la sección correspondiente al ejemplo 1. Según se discute en este documento, estas moléculas de ADNc son especialmente útiles para establecer nuevos cribados en busca de insecticidas, validar potenciales compuestos de partida con actividad insecticida, especialmente para uso en el tratamiento de infestaciones de garrapatas y ácaros en ganado, perros y gatos, o que puedan matar otros arácnidos, y el uso de estas nuevas secuencias de ADNc como sondas de hibridación para aislar genes relacionados de otros organismos con el fin de establecer cribados en busca de fármacos pesticidas adicionales. Los ADNc que codifican RsGluCl1 y RsGluCl2 de la presente invención se aislaron de la especie de garrapata marrón del perro Rhipicephalus sanguineus. La secuencia de ADN predice proteínas que tienen características comunes con la clase de canales de cloruro sensibles a glutamato e ivermectina. Al expresar los ADNc de RsGluCl1 y RsGluCl2 en ovocitos de Xenopus se observa un canal sensible a glutamato e ivermectina. Probablemente, la farmacología de los compuestos que actúan sobre estos canales será diferente entre estas especies. Al realizar el cribado con el canal de arácnido será más probable descubrir compuestos específicos para arácnidos. Por lo tanto, los ADNc de la presente invención pueden expresarse en líneas celulares u otros sistemas de expresión y usarse para experimentos de unión competitiva o para ensayos de canales de cloruro funcionales para el cribado en busca de compuestos que activen, bloqueen o modulen el canal.

[0048] Los canales de cloruro regulados por glutamato (GluCl) de invertebrados están relacionados con los canales de cloruro regulados por glicina y por GABA y son distintos de los receptores de glutamato como excitador (por ejemplo, los receptores NMDA o AMPA). Los primeros dos miembros de la familia GluCl se identificaron en C. elegans, después de un cribado funcional en busca del receptor del fármaco antihelmíntico ivermectina. En la actualidad se han clonado varios GluCl adicionales en otras especies de invertebrados. Sin embargo, todavía no existe evidencia de equivalentes de GluCl en vertebrados; por ello, los canales GluCl son excelentes dianas para antihelmínticos, insecticidas, acaricidas, etc. Algunos moduladores específicos de GluCl, como el ácido nodulispórico y sus derivados tienen un perfil de seguridad ideal, ya que carecen de toxicidad de origen mecanístico en vertebrados. La presente invención se refiere en parte a tres clones nuevos de GluCl1 de R. sanguineus, T12, T82 y T32 y a un clon de GluCl2 de R. sanguíneus, B1. Los ADNc de RsGluCl1 se aislaron por hibridación en condiciones poco restrictivas mediante una sonda de GluCl de Drosophila representativa de los putativos dominios transmembranales M1, M2 y M3. El ADNc de RsGluCl2 se aisló por PCR mediante cebadores degenerados representativos de las regiones conservadas en los dominios amino y M2 de las proteínas GluCl de Drosophila, pulga (C. felis) y C. elegans. Parece ser que en estos ADNc tiene lugar una edición de ARN (transiciones A-G), que ha resultado en algunos cambios de aminoácidos. RsGluCl1 T12 y T82 son similares, con la excepción de un aminoácido diferente, mientras que RsGluCl1 T32 contiene dos exones adicionales en la región codificante.

[0049] La presente invención se refiere a la molécula de ADN aislada o purificada descrita en la figura 1 (T12) y expuesta como SEQ ID NO:1 que codifica la proteína GluCl1 de R. sanguineus descrita en la figura 2 y expuesta como SEQ ID NO:2, en que la secuencia nucleotídica de T12 es la siguiente:

imagen1

[0050] La presente invención se refiere también a la molécula de ADN aislada o purificada descrita en la figura 5 3 (T82) y expuesta como SEQ ID NO:3 que codifica la proteína GluCl1 de R. sanguineus descrita en la figura 4 y expuesta como SEQ ID NO:4, en que la secuencia nucleotídica de T82 es la siguiente:

imagen1

[0051] La presente invención se refiere también a la molécula de ADN aislada o purificada descrita en la figura 5 (T32) y expuesta como SEQ ID NO:5 que codifica la proteína GluCl1 de R. sanguineus descrita en la figura 6 y expuesta como SEQ ID NO:6, en que la secuencia nucleotídica de T32 es la siguiente:

imagen1

[0052] La presente invención se refiere también a una molécula de ADN aislada o purificada que codifica una proteína GluCl2 de R. sanguineus. Un ácido nucleico tal se describe en la figura 7 (B1) y se expone como SEQ ID NO:7 y codifica la proteína GluCl2 de R. sanguineus descrita en la figura 8 y expuesta como SEQ ID NO:8, en que la

5 secuencia nucleotídica de B1 es la siguiente:

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[0053] Las moléculas de ADN aisladas ejemplificadas anteriormente y mostradas en las figuras 1, 3, 5 y 7, 5 respectivamente, comprenden las características siguientes: T12 (SEQ ID NO:1):

2.138 nucleótidos: Met inicial (nucleótidos 331-333) y “TGA” como codón de terminación (nucleótidos 1.681-1.683), en que el marco de lectura abierto resulta en una proteína expresada de 450 aminoácidos, según se expone en SEQ ID NO:2.

T82 (SEQ ID NO:3):

2.289 nucleótidos: Met inicial (nucleótidos 502-504) y “TGA” como codón de terminación (nucleótidos 1.852-1.854), en que el marco de lectura abierto resulta en una proteína expresada de 450 aminoácidos, según se expone en SEQ ID NO:4.

T32 (SEQ ID NO:5):

2.400 nucleótidos: Met inicial (nucleótidos 617-619) y “TGA” como codón de terminación (nucleótidos 2.168-2.170), en que el marco de lectura abierto resulta en una proteína expresada de 517 aminoácidos, según se expone en SEQ ID NO:6.

B1 (SEQ ID NO:7):

1.402 nucleótidos: Met inicial (nucleótidos 131-133) y “TAA” como codón de terminación (nucleótidos 1.385-1.387), en que el marco de lectura abierto resulta en una proteína expresada de 418 aminoácidos, según se expone en SEQ ID NO:8.

[0054] En este documento se describen fragmentos o mutantes biológicamente activos de SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7 que codifican un ARNm que expresa una nueva proteína de canal GluCl1 o GluCl2 del invertebrado Rhipicephalus sanguineus, respectivamente. Cualquiera de estos fragmentos y/o mutantes biológicamente activos codificará una proteína o un fragmento de proteína que mimetiza, al menos sustancialmente, las propiedades farmacológicas de una proteína de canal GluCl de R. sanguineus, incluyendo, pero sin limitarse a las proteínas de canal GluCl1 de R. sanguineus según se exponen en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6, así como la respectiva proteína de canal GluCl2 según se expone en SEQ ID NO:8. Cualquiera de tales polinucleótidos incluye, pero no se limita necesariamente a sustituciones, deleciones y adiciones nucleotídicas, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales, de modo que estas mutaciones codifican un ARNm que expresa un canal GluCl de R. sanguineus funcional en una célula eucariota, como los ovocitos de Xenopus, de manera que son útiles para el cribado en busca de agonistas y/o antagonistas de la actividad de GluCl de R. sanguineus.

[0055] En este documento se desvelan las secuencias de la figura 1 (SEQ ID NO:1; designada T12), la figura 3 (SEQ ID NO:3; designada T82) y la figura 5 (SEQ ID NO:5; designada T32) que codifican nuevas proteínas GluCl1 de Rhiphicephalus sanguineus y de la figura 7 (SEQ ID NO:7, designada B1) que codifica una nueva proteína GluCl2 de Rhiphicephalus sanguineus.

[0056] Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN), como ADN genómico y ADN complementario (ADNc), que puede ser de cadena sencilla (hebra codificante o no codificante) o doble, así como ADN sintético, tal como un polinucleótido sintetizado de cadena sencilla. La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención puede incluir también una molécula de ácido ribonucleico (ARN).

[0057] La degeneración del código genético es tal que todos los aminoácidos, excepto dos, están codificados por más de un único codón. Esto permite la construcción de un ADN sintético que codifica las proteínas RsGluCl1 o RsGluCl2, en que la secuencia nucleotídica del ADN sintético difiere de manera significativa de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7, pero todavía codifica las mismas proteínas RsGluCl que SEQ ID NO:1, 3, 5 y

7. Se pretende que tales ADN sintéticos estén dentro del alcance de la presente invención. Si se desea expresar tales ADN sintéticos en una célula u organismo hospedador en concreto, el uso de codones de tales ADN sintéticos puede ajustarse para reflejar el uso de codones de ese hospedador en concreto, lo que conduce a altos niveles de expresión de la proteína RsGluCl en el hospedador. En otras palabras, esta redundancia en los diversos codones que codifican aminoácidos específicos está dentro del alcance de la presente invención. Por lo tanto, esta invención también se dirige a aquellas secuencias de ADN que codifican un ARN que comprende codones alternativos que codifican la traducción eventual de un aminoácido idéntico, como se muestra a continuación:

A = Ala = alanina: codones GCA, GCC, GCG, GCU C = Cys = cisteína: codones UGC, UGU D = Asp = ácido aspártico: codones GAC, GAU E = Glu = ácido glutámico: codones GAA, GAG F = Phe = fenilalanina: codones UUC, UUU G = Gly = glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU H = His = histidina: codones CAC, CAU I = Ile = isoleucina: codones AUA, AUC, AUU K = Lys = lisina: codones AAA, AAG L = Leu = leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU M = Met = metionina: codón AUG N = Asp = asparragina: codones AAC, AAU P = Pro = prolina: codones CCA, CCC, CCG, CCU Q = Gln = glutamina: codones CAA, CAG

R = Arg = arginina: codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU S = Ser = serina: codones AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU T = Thr = treonina: codones ACA, ACC, ACG, ACU V = Val = valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU W = Trp = triptófano: codón UGG Y = Tyr = tirosina: codones UAC, UAU

Por lo tanto, la presente invención desvela la redundancia de codones que puede resultar en moléculas de ADN diferentes que expresan una proteína idéntica. Para los fines de esta memoria descriptiva, una secuencia que contiene uno o más codones sustituidos se definirá como una variación degenerada. Otra fuente de variación de la secuencia puede producirse a través de la edición del ARN, según se discute a continuación. Tal edición de ARN puede resultar en otra forma de redundancia de codones, en la que un cambio en el marco de lectura abierta no resulta en un resto de aminoácido alterado en la proteína expresada. También están incluidas en el alcance de esta invención mutaciones en la secuencia de ADN o en la proteína traducida que no alteran sustancialmente las propiedades físicas finales de la proteína expresada. Por ejemplo, puede que la sustitución de valina por leucina, arginina por lisina o asparragina por glutamina no cause ningún cambio en la funcionalidad del polipéptido.

[0058] Se sabe que las secuencias de ADN que codifican un péptido pueden alterarse de modo que codifiquen un péptido con propiedades diferentes de las del péptido de origen natural. Los procedimientos de alteración de las secuencias de ADN incluyen, pero no se limitan a la mutagénesis dirigida. Algunos ejemplos de propiedades alteradas incluyen, pero no se limitan a cambios en la afinidad de una enzima por un sustrato o de un receptor por un ligando.

[0059] En este documento se desvelan secuencias de ADN que hibridan con SEQ ID NO:1, 3, 5 y 7 en condiciones restrictivas. A modo de ejemplo y no como limitación, un procedimiento que usa condiciones muy restrictivas es como sigue: la prehibridación de los filtros que contienen el ADN se lleva a cabo durante un periodo desde 2 horas a toda la noche a 65°C en un tampón compuesto de SSC 6x, disolución de Denhardt 5x y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 12 a 48 horas a 65°C en la mezcla de prehibridación que contiene 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 106 cpm de la sonda marcada con 32P. El lavado de los filtros se realiza a 37°C durante 1 hora en una disolución que contiene SSC 2x, SDS al 0,1%. A esto sigue un lavado en SSC 0,1x, SDS al 0,1% a 50°C durante 45 minutos, antes de la autorradiografía. Otros procedimientos con condiciones muy restrictivas incluirían una etapa de hibridación llevada a cabo en SSC 5x, disolución de Denhardt 5x, formamida al 50% a 42°C durante 12 a 48 horas o una etapa de lavado llevada a cabo en SSPE 0,2x, SDS al 0,2% a 65°C durante 30 a 60 minutos. Los reactivos mencionados en los procedimientos anteriores para llevar a cabo la hibridación en condiciones muy restrictivas son bien conocidos en la técnica. Los detalles de la composición de estos reactivos pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Además de las anteriores, en la técnica son bien conocidas otras condiciones muy restrictivas que también pueden usarse.

[0060] La “identidad” es una medida de la identidad de las secuencias nucleotídicas o de las secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias se alinean de manera que se obtenga el máximo emparejamiento. La “identidad” de por sí tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse mediante técnicas publicadas. Véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatic and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Mientras que existe una serie de procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, el término “identidad” es bien conocido para los expertos en la técnica (Carillo y Lipton, 1988, SIAM J. Applied. Math. 48: 1073). Los procedimientos empleados normalmente para determinar la identidad o la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a aquellos desvelados en las publicaciones Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 y Carillo y Lipton, 1988, SIAM J. Applied. Math. 48: 1073. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas de ordenador. Los programas de ordenador preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a GCG Program Package (Devereux y co,, 1984, Nucleic Acids Research 12(1):387), BLASTN y FASTA (Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403).

[0061] Como ilustración, con un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica con una “identidad” de al menos, por ejemplo, el 95% con una secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO:1 se pretende indicar que la secuencia nucleotídica del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, con la excepción de que la secuencia del polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales o nucleótidos alternativos por cada 100 nucleótidos de la secuencia nucleotídica de referencia SEQ ID NO:1. En otras palabras, para obtener un polinucleótido con una secuencia nucleotídica idéntica en al menos el 95% con una secuencia nucleotídica de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden estar delecionados o sustituidos por otros nucleótidos o en la secuencia de referencia puede haberse insertado un número de nucleótidos de hasta el 5% del número total de nucleótidos de la secuencia de referencia. Estas mutaciones o sustituciones alternativas de nucleótidos de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones de los extremos 5’ o 3’ de la secuencia nucleotídica de referencia o en cualquier punto entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Una fuente de una “mutación” o cambio tal que resulta en una identidad inferior al 100% puede producirse a través de la edición del ARN. El proceso de edición del ARN resulta en la modificación de una molécula de ARNm de tal modo que el uso de este ARNm modificado como molde para generar un ADNc clonado puede resultar en uno o más cambios de nucleótidos, lo que puede resultar o no en un cambio de codón. Se sabe que esta edición del ARN está catalizada por una editasa de ARN. Una editasa de ARN tal es una adenosinadesaminasa de ARN, que transforma un resto de adenosina en un resto de inosina, el cual tiende a mimetizar un resto de citosina. Por consiguiente, la transformación de un resto de un ARNm de A a I resultará en transiciones A-G en las regiones codificante y no codificante de un ADNc clonado (por ejemplo, véase Hanrahan y col., 1999, Annals New York Acad. Sci. 868: 51-66; para una revisión véase Bass, 1997, TIBS 22: 157-162). De manera similar, con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos, por ejemplo, el 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO:2 se pretende indicar que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, con la excepción de que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO:2. En otras palabras, para obtener un polipéptido con una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 95% con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los restos de aminoácido de la secuencia de referencia pueden estar delecionados o sustituidos por otros aminoácidos o en la secuencia de referencia puede haberse insertado un número de aminoácidos de hasta el 5% del número total de restos de aminoácido de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxiterminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier punto entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los restos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De nuevo, como se ha señalado anteriormente, la edición del ARN puede resultar en un cambio de codones que puede dar lugar a una proteína expresada que difiera en “identidad” de otras proteínas expresadas a partir de transcritos de “ARN sin editar”, los cuales corresponden directamente al marco de lectura abierto de la secuencia genómica. Los marcos de lectura abiertos de los clones T12 y T82 son idénticos, con la excepción de un único cambio de nucleótido que resulta en un único cambio de aminoácido (T12 – “gag”/Glu frente a T82 – “aag”/Lys para el resto de aminoácido 447 de SEQ ID NO:2 y 4). El clon T12/T82 muestra aproximadamente el 57% de identidad con el clon B1 en cuanto a nucleótidos, mientras que el clon T32 muestra aproximadamente el 57% de identidad con el clon B1 en cuanto a nucleótidos.

[0062] La presente invención se refiere también a vectores recombinantes y hospedadores recombinantes, tanto procariotas como eucariotas que contienen las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas desveladas en esta memoria descriptiva. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican una proteína de canal RsGluCl, en su totalidad o en parte, pueden unirse a otras moléculas de ADN, es decir, a moléculas de ADN a las que la secuencia codificante de RsGluCl no está unida de manera natural, para formar “moléculas recombinantes de ADN” que codifican una proteína de canal RsGluCl respectiva. Las nuevas secuencias de ADN de la presente invención pueden insertarse en vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican RsGluCl o un equivalente funcional. Estos vectores pueden ser de ADN o ARN; en su mayoría, para fines de clonación se prefieren los vectores de ADN. Los vectores típicos incluyen plásmidos, virus modificados, bacteriófagos, cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras y otras formas de ADN episómico o integrado que puedan codificar una proteína de canal RsGluCl. La determinación de un vector apropiado para una transferencia génica en concreto o para otro uso se encuentra dentro del ámbito del experto en la técnica.

[0063] La presente invención también se refiere a una forma sustancialmente purificada de una proteína de canal RsGluCl respectiva, que comprende la secuencia de aminoácidos desvelada en la figura 2, la figura 4, la figura 6 y la figura 8 y según se expone en SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, respectivamente. Las proteínas RsGluCl desveladas contienen un marco de lectura abierto de 450 aminoácidos (T12 y T82, SEQ ID NO:2 y 4, respectivamente), 517 aminoácidos (T32, SEQ ID NO:6) y 418 aminoácidos (SEQ ID NO:8) de longitud, según se muestra en las figuras 2, 4, 6 y 8 y a continuación:

T12:

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T82:

imagen2

T32:

imagen1

B1:

imagen1

[0064] Los marcos de lectura abiertos de los clones T12 y T82 son idénticos, con la excepción de un único cambio de nucleótido que resulta en un único cambio de aminoácido en el resto 447 de SEQ ID NO:2 y 4. El marco de lectura abierto de T32 contiene dos exones adicionales en comparación con el marco de lectura T12/T82, que resultan en una inserción de 35 aminoácidos en la región aminoterminal de la proteína T32 (restos de aminoácidos 30-64 de SEQ ID NO:6) y otra inserción de 32 aminoácidos dentro de la región COOH-terminal (restos de aminoácidos 410-441). Los clones T12/T82 muestran aproximadamente el 57% de identidad con el clon B1 en cuanto a nucleótidos, mientras que el clon T32 muestra aproximadamente el 57% de identidad con el clon B1 en cuanto a nucleótidos.

[0065] En este documento se mencionan fragmentos y/o mutantes biológicamente activos de las proteínas RsGluCl1 y RsGluCl2 que comprenden la secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, incluyendo, pero sin limitarse necesariamente a sustituciones, deleciones y adiciones de aminoácidos, truncamientos aminoterminales y truncamientos carboxiterminales, de modo que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteínas de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y serían útiles para el cribado en busca de agonistas y/o antagonistas de la función de RsGluCl.

[0066] Con este fin, un aspecto preferido de la presente invención es un receptor de canal RsGluCl funcional, compuesto de una proteína de canal simple o un canal que comprende subunidades múltiples, al que se hace referencia en este documento como un canal homomultimérico o un canal heteromultimérico. Por lo tanto, un canal simple puede estar compuesto de una proteína según se desvela en SEQ ID NO:2, 4, 6 o 8 o de un equivalente biológicamente activo de esta (es decir, una proteína de canal alterada que todavía funciona de manera similar a la de un receptor de canal sin manipular). Un complejo receptor de canal homomultimérico comprenderá más de un polipéptido seleccionado del grupo desvelado de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, así como equivalentes biológicamente activos. Un complejo receptor de canal heteromultimérico comprenderá subunidades múltiples, en que al menos dos

o tres proteínas desveladas en este documento contribuyen a la formación del canal o en que al menos una de las proteínas se asocia con proteínas o componentes del canal adicionales para proporcionar un complejo receptor de canal activo. Por lo tanto, en este documento se describen canales sustancialmente purificados, así como preparaciones de membrana sustancialmente purificadas, preparaciones de membrana parcialmente purificadas o lisados celulares que contienen los canales funcionales simples, homomultiméricos o heteromultiméricos descritos en este documento. Estas proteínas de canal GluCl totalmente procesadas y sustancialmente purificadas pueden obtenerse a partir de una célula hospedadora recombinante que contiene un vector de expresión de ADN que comprende una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:1, 3, 5 y/o 7 y expresa la proteína precursora RsGluCl1 respectiva. Se prefiere especialmente que la célula hospedadora recombinante sea una célula hospedadora eucariota, incluyendo, pero sin limitarse a una línea celular de mamífero, una línea celular de insecto como la línea celular S2, u ovocitos de Xenopus, como se ha señalado anteriormente.

[0067] Al igual que con muchas proteínas, es posible modificar muchos de los aminoácidos de la proteína de canal RsGluCl mientras se conserva sustancialmente la misma actividad biológica de la proteína sin manipular. Por lo tanto, se desvelan polipéptidos RsGluCl1 modificados que tienen deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos, pero que siguen conservando la misma actividad biológica de la RsGluCl correspondiente respectiva. Por lo general se acepta que las sustituciones de un solo aminoácido normalmente no alteran la actividad biológica de una proteína (véase, por ejemplo, Molecular Biology of the Gene, Watson y col., 1987, cuarta edición, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., página 226; Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Por consiguiente, se desvelan polipéptidos en los que se ha llevado a cabo la sustitución de un aminoácido en SEQ ID NO:2, 4, 6 y/o 8, en que los polipéptidos todavía conservan sustancialmente la misma actividad biológica que la proteína RsGluCl1 correspondiente. También se desvelan polipéptidos en los que se han llevado a cabo dos o más sustituciones de aminoácidos en SEQ ID NO:2, 4, 6 y/o 8, en que los polipéptidos todavía conservan sustancialmente la misma actividad biológica que la proteína RsGluCl1 correspondiente. En particular, se mencionan realizaciones en las que las sustituciones descritas anteriormente son sustituciones conservadoras.

[0068] Un experto en la técnica reconocerá además que también sería posible producir polipéptidos que son equivalentes funcionales de RsGluCl y presentan cambios respecto a la secuencia de aminoácidos de RsGluC consistentes en pequeñas deleciones o inserciones de aminoácidos siguiendo las mismas pautas (es decir, minimizando las diferencias de la secuencia de aminoácidos entre RsGluCl y las proteínas relacionadas). En general, las pequeñas deleciones o inserciones son de aproximadamente uno a cinco aminoácidos. El efecto de estas pequeñas deleciones o inserciones sobre la actividad biológica del polipéptido RsGluCl modificado puede analizarse fácilmente produciendo el polipéptido sintéticamente o realizando los cambios requeridos en el ADN que codifica RsGluCl y expresando después el ADN de manera recombinante y analizando la proteína producida por tal expresión recombinante.

[0069] Por lo tanto, se desvelan también formas truncadas de RsGluCl que contienen la región que comprende el sitio activo de la enzima. Tales proteínas truncadas son útiles en diversos ensayos descritos en este documento, para estudios de cristalización y para estudios de las relaciones entre estructura y actividad.

[0070] En este documento se mencionan lisados crudos que contienen membranas o fracciones subcelulares de membranas sustancialmente purificadas de las células hospedadoras recombinantes (tanto células procariotas como eucariotas, así como células transformadas o transfectadas tanto de manera estable como transitoria) que contienen las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Estas células hospedadoras recombinantes expresan RsGluCl o un equivalente funcional que se asocia postraslacionalmente con la membrana celular en una forma biológicamente activa. Estas fracciones subcelulares de membrana comprenderán formas naturales o mutantes de RsGluCl en concentraciones sustancialmente superiores a las concentraciones endógenas y, por lo tanto, serán útiles en ensayos para seleccionar moduladores de las proteínas o canales RsGluCl. En otras palabras, un uso específico de tales membranas subcelulares implica la expresión de RsGluCl dentro de la célula recombinante, seguida del aislamiento y purificación sustancial de las membranas, separándolas de los otros componentes celulares y su uso posterior en ensayos para seleccionar moduladores como agonistas o antagonistas de la proteína o del canal biológicamente activo que comprende una o más de las proteínas desveladas en este documento. Alternativamente, las células lisadas que contienen las membranas pueden usarse directamente en ensayos para seleccionar moduladores de la(s) proteína(s) expresada(s) de manera recombinante desveladas en este documento. Por lo tanto, en este documento se desvela una preparación de membrana sustancialmente purificada o componentes de una célula recombinante lisada que incluyen membranas, que se han obtenido a partir de una célula hospedadora recombinante transformada o transfectada con un vector de expresión de ADN que comprende y expresa apropiadamente un marco de lectura abierto completo según se expone en SEQ ID NO:1, 3, 5 y/o 7, lo que resulta en una forma funcional del canal RsGluCl respectivo. Se prefiere especialmente que la célula hospedadora recombinante sea una célula hospedadora eucariota, incluyendo, pero sin limitarse a una línea celular de mamífero, una línea celular de insecto, como la línea celular S2,

[0071] En este documento se desvelan moléculas de ácido nucleico aisladas que son construcciones de fusión que expresan proteínas de fusión útiles en ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad de la RsGluCl natural, así como para generar anticuerpos contra RsGluCl. Las construcciones de fusión glutatión-Stransferasa (GST)-RsGluCl son un ejemplo de este tipo. Las proteínas recombinantes de fusión GST-RsGluCl pueden expresarse en diversos sistemas de expresión, incluyendo células del insecto Spodoptera frugiperda (Sf21) (Invitrogen) mediante un vector de expresión de baculovirus (pAcG2T, Pharmingen). Otro aspecto implica construcciones de fusión de RsGluCl unidas a diversos marcadores, incluyendo, pero sin limitarse a GFP (proteína verde fluorescente), el epítopo MYC y GST. De nuevo, cualquiera de tales construcciones de fusión puede expresarse en la línea celular de interés y usarse para el cribado en busca de moduladores de una o más de las proteínas RsGluCl desveladas en este documento.

[0072] Un aspecto preferido para el cribado en busca de moduladores de la actividad del canal RsGluCl es un sistema de expresión para ensayos basados en electrofisiología para medir la actividad del canal de cloruro regulado por glutamato que comprende la inyección de las moléculas de ADN de la presente invención en ovocitos de Xenopus laevis. El uso general de los ovocitos de Xenopus en el estudio de la actividad de los canales iónicos es conocido en la técnica (Dascal, 1987, Crit. Rev. Biochem. 22: 317-317; Lester, 1988, Science 241: 1057-1063; véase también Methods of Enzymology, vol. 207, 1992, capítulos 14-25, Rudy e Iverson, ed., Academic Press, Inc., Nueva York). Existe un procedimiento mejorado para medir la actividad de los canales y la modulación por agonistas y/o antagonistas que presenta una sensibilidad varias veces superior a las técnicas previas. Los ovocitos de Xenopus se someten a la inyección de material de ácido nucleico, que incluye pero no se limita a ADN, ARNm, ARNc y codifica un canal regulado, en que la actividad del canal puede medirse, así como la respuesta del canal a diversos moduladores. La actividad del canal iónico se mide por medio de un potencial de fijación más positivo que el potencial inverso para cloruro (es decir, mayor que -30 mV), preferentemente de aproximadamente 0 mV. Esta alteración de las condiciones de medida del ensayo resulta en un aumento de 10 veces de la sensibilidad del ensayo a la modulación por fosfato de ivermectina. Por lo tanto, este ensayo mejorado permite el cribado y la selección de compuestos que modulan la actividad de GluCl a niveles que hasta ahora se consideraban indetectables.

[0073] Para la clonación de RsGluCl puede usarse uno cualquiera de una diversidad de procedimientos. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a (1) una técnica de clonación RACE PCR (Frohman y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002). La técnica RACE 5’ y/o 3’ puede emplearse para generar una secuencia de ADNc de longitud completa. Esta estrategia implica el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos del gen para la ampliación por PCR del ADNc de RsGluCl. Estos cebadores específicos del gen se diseñan a través de la identificación de una secuencia nucleotídica que es una etiqueta de secuencia expresada (EST), identificada por la búsqueda en cualquier serie de bancos de datos de ácidos nucleicos y proteínas a disposición pública. (2) La expresión funcional directa del ADNc de RsGluCl después de la construcción de una biblioteca de ADNc que contiene RsGluCl en un sistema vector de expresión apropiado. (3) El cribado de una biblioteca de ADNc que contiene RsGluCl construida en un vector lanzadera, plásmido o bacteriófago, con un oligonucleótido degenerado marcado como sonda, diseñado a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína RsGluCl. (4) El cribado de una biblioteca de ADNc que contiene RsGluCl construida en un vector lanzadera, plásmido o bacteriófago, con un ADNc parcial que codifica la proteína RsGluCl. Este ADNc parcial se obtiene por la ampliación específica por PCR de fragmentos de ADN de RsGluCl a través del diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos conocida de otros canales GluCl relacionados con la proteína RsGluCl. (5) El cribado de una biblioteca de ADNc que contiene RsGluCl construida en un vector lanzadera, plásmido o bacteriófago, con un ADNc parcial o un oligonucloeótido con homología con una proteína RsGluCl. Esta estrategia puede implicar asimismo el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos del gen para la ampliación por PCR del ADNc de RsGluCl identificado como una EST, según se describe anteriormente. (6) El diseño de oligonucleótidos específicos de los extremos 5’ y 3’ del gen mediante el uso de SEQ ID NO:1, 3 y 5 como molde, de modo que o bien puede generarse un ADNc de longitud completa por las técnicas RACE conocidas o bien puede generarse una parte de la región codificante por estas mismas técnicas RACE conocidas para generar y aislar una parte de la región codificante para usarla como sonda para el cribado de una o varios tipos de bibliotecas de ADNc y/o genómicas con el fin de aislar una versión de longitud completa de la secuencia nucleotídica que codifica RsGluCl. Alternativamente, los ADNc de RsGluCl1 y RsGluCl2 de la presente invención pueden clonarse como se describe en la sección del ejemplo 1. Para los clones de ADNc de RsGluCl1, se aisló ARN poliA+ de adultos de la garrapata marrón del perro mediante el kit de aislamiento de ARNm Poly(A) PureTM (Ambion). El ADNc de la garrapata se sintetizó con cebadores oligo-dT y el kit de síntesis de ADNc ZAP cDNA® (Stratagene) y el ADNc > 1kb se seleccionó mediante columnas de fraccionamiento por tamaño para ADNc (BRL). Se construyó una biblioteca de ADNc de garrapata en el vector λ ZAP® II con el kit de clonación GIGAPACK® III Gold (Stratagtene). Un fragmento de ADNc de GluCl de Drosophila que abarcaba la región M1 a M3 se usó para un cribado en condiciones poco restrictivas de la biblioteca de ADNc de garrapata. Los filtros se expusieron durante once días y se aislaron seis clones positivos para el análisis de secuencia. Tres de los clones (T12, T82 y T32) codifican proteínas relacionadas con GluCl y se secuenciaron por los dos extremos. Para el aislamiento de los ADNc de RsGluCl2, de nuevo, la mayoría de los procedimientos moleculares se realizaron siguiendo los procedimientos estándar disponibles en referencias como Ausubel y col. (1992, Short protocols in molecular biology. F. M. Ausubel y col., 2.a edición (John Wiley & Sons)) y Sambrook y col. (1989, Molecular cloning. A laboratory manual. J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 2.a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press)). A partir de cabezas de garrapata se aisló ARN Poly (A)+. La primera hebra de ADNc se sintetizó a partir de 50 ng de ARN mediante un sistema de preamplificación SUPERSCRIPT (Life Technologies). Para la reacción de PCR se usó una décima parte de la reacción de la primera hebra. Los oligonucleótidos degenerados usados se diseñaron basados en secuencias obtenidas de GluCl de C. elegans, Drosophila y pulga (C. felis): se realizaron dos tandas de PCR con las combinaciones “27F2 + 3AF1 y después 27F2 + 3BF2”. Una décima parte de los productos de la reacción de PCR se analizó por transferencia de Southern para identificar secuencias contaminantes y evitar su clonación por PCR. Los productos nuevos obtenidos por PCR del tamaño adecuado se clonaron en el vector plasmídico pCR2.1 mediante el kit de clonación “TA” (Invitrogen, Inc.). Después de analizar las secuencias (ABI Prism, PE Applied Biosystems), los insertos de los clones de PCR seleccionados se marcaron radioactivamente y se usaron como sondas para el cribado de una biblioteca de ADNc generada en el vector Uni-ZAP® (Stratagene Inc.) a partir de la preparación de ARN mencionada anteriormente. Las secuencias de clones de ADNc de longitud completa se analizaron mediante el programa de GCG Inc. La subclonación de RsGluCl2 en un vector de expresión en mamíferos se realizó por escisión de un fragmento de 1,85 kb (digestión XhoI-EcoRI) con la región codificante del inserto original del clon RsGluCl2 B1 a partir del plásmido UniZap® pBS y su ligación posterior en el vector TetSplice® (Life Technologies Inc.).

[0074] Los expertos en la técnica advertirán inmediatamente que otros tipos de bibliotecas, así como bibliotecas construidas a partir de otros tipos celulares o tipos de especies pueden ser útiles para el aislamiento de un ADN codificante de RsGluCl o un homólogo de RsGluCl. Otros tipos de bibliotecas incluyen, pero no se limitan a bibliotecas de ADNc derivadas de otros tipos celulares de la garrapata marrón del perro.

[0075] Los expertos en la técnica advertirán inmediatamente que es posible preparar bibliotecas adecuadas de ADNc a partir de células o de líneas celulares con actividad de RsGluCl. La selección de las células o líneas celulares para su uso en la preparación de una biblioteca de ADNc para aislar un ADNc que codifique RsGluCl puede realizarse midiendo primeramente la actividad de RsGluCl asociada a las células por medio de cualquier ensayo conocido disponible para tal fin.

[0076] La preparación de bibliotecas de ADNc puede realizarse por técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, algunas técnicas bien conocidas de construcción de bibliotecas de ADNc pueden encontrarse en Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. También es posible obtener bibliotecas de ADN complementario de numerosas fuentes comerciales, incluyendo, pero sin limitarse a Clontech Laboratories, Inc. y Stratagene.

[0077] Los expertos en la técnica también advertirán inmediatamente que el ADN que codifica RsGluCl puede aislarse también a partir de una biblioteca de ADN genómico adecuada. La construcción de bibliotecas de ADN genómico puede realizarse por técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Algunas técnicas bien conocidas de construcción de bibliotecas de ADN genómico pueden encontrarse en Sambrook y col., cita anterior. Es posible preparar bibliotecas genómicas, especialmente en los vectores cromosómicos artificiales P1, de las que pueden aislarse clones genómicos que contienen RsGluCl mediante sondas basadas en las secuencias nucleotídicas de RsGluCl desveladas en este documento. Los procedimientos de preparación de tales bibliotecas son conocidos en la técnica (Ioannou y col., 1994, Nature Genet. 6: 84-89).

[0078] Para clonar un gen de RsGluCl por uno de los procedimientos preferidos, puede ser necesaria la secuencia de aminoácidos o la secuencia nucleotídica de un RsGluCl o de una proteína homóloga. Con este fin, puede purificarse una proteína de canal RsGluCl respectiva y determinar su secuencia de aminoácidos parcial mediante un secuenciador automático. No es necesario determinar la secuencia de aminoácidos completa, pero puede determinarse la secuencia lineal de dos regiones de seis a ocho aminoácidos para la amplificación por PCR de un fragmento parcial de RsGluCl. Una vez que se han identificado las secuencias de aminoácidos adecuadas se sintetizan las secuencias de ADN capaces de codificarlas. Dado que el código genético es degenerado, puede usarse más de un codón para codificar un aminoácido concreto y, por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser codificada por cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN similares. Solamente un miembro del conjunto será idéntico a la secuencia de RsGluCl, pero otros miembros del conjunto serán capaces de hibridar con el ADN de RsGluCl, incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con errores de emparejamiento. Los oligonucleótidos de ADN con errores de emparejamiento pueden hibridar aún suficientemente con el ADN de RsGluCl como para permitir la identificación y el aislamiento del ADN codificante de RsGluCl. Alternativamente, la secuencia nucleotídica de una región de una secuencia expresada puede identificarse mediante la búsqueda en uno

o más bancos de datos genómicos disponibles. Es posible usar cebadores específicos del gen para realizar la amplificación por PCR de un ADNc de interés a partir de una biblioteca de ADNc o de una población de moléculas de ADNc. Según se ha señalado anteriormente, la secuencia nucleotídica apropiada para usar en un procedimiento a base de PCR puede obtenerse de SEQ ID NO:1, 3, 5 ó 7, bien con el fin de aislar productos solapantes de RACE 5’ y 3’ para la generación de una secuencia de longitud completa que codifique RsGluCl o con el fin de aislar una parte de la secuencia nucleotídica codificante de RsGluCl para usar como sonda para el cribado de una o más bibliotecas a base de ADNc o genómico para aislar una secuencia de longitud completa que codifique RsGluCl o proteínas similares a RsGluCl.

[0079] Esta invención incluye también vectores que contienen un gen de RsGluCl, células hospedadoras que contienen los vectores y procedimientos para preparar la proteína RsGluCl sustancialmente pura que comprenden las etapas de introducción del gen de RsGluCl en una célula hospedadora y cultivo de la célula hospedadora en las condiciones apropiadas para producir RsGluCl. La proteína RsGluCl así producida puede recolectarse de las células hospedadoras de la manera convencional. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a procedimientos de expresión de la proteína RsGluCl y los equivalentes biológicos desvelados en este documento, a ensayos que emplean estos productos génicos, a células hospedadoras recombinantes que comprenden construcciones de ADN que expresan estas proteínas y a compuestos identificados a través de estos ensayos que actúan como agonistas o antagonistas de la actividad de RsGluCl.

[0080] El ADNc de RsGluCl clonado obtenido por los procedimientos descritos anteriormente puede expresarse de manera recombinante por clonación molecular en un vector de expresión (como pcDNA3.neo, pcDNA3.1, per2.1, pBlueBacHis2 o pLITMUS28, así como otros ejemplos listados a continuación) que contenga un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción adecuados y su transferencia a células hospedadoras procariotas o eucariotas para producir RsGluCl recombinante. En este documento, los vectores de expresión se definen como secuencias de ADN requeridas para la transcripción del ADN clonado y la traducción de su ARNm en un hospedador apropiado. Tales vectores pueden usarse para expresar ADN eucariota en una diversidad de hospedadores como bacterias, algas verdeazuladas, células vegetales, células de insectos y células animales. Los vectores diseñados específicamente permiten la transferencia de ADN entre hospedadores como bacterias y levaduras o bacterias y células animales. Un vector de expresión construido apropiadamente debería contener: un origen de replicación para su replicación autónoma en las células hospedadoras, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios de corte para enzimas de restricción de utilidad, potencial para un alto número de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige la ARN polimerasa para unirse al ADN e iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es un promotor que hace que se inicie la síntesis de ARNm con mucha frecuencia. Para determinar la(s) secuencia(s) de ADNc de RsGluCl que produce(n) cantidades óptimas de RsGluCl, pueden construirse moléculas de ADNc que incluyen, pero no se limitan a las siguientes: un fragmento de ADNc que contiene el marco de lectura abierto de longitud completa de RsGluCl, así como diversas construcciones que contienen partes del ADNc que codifican solamente dominios específicos de la proteína o dominios reorganizados de la proteína. Todas las construcciones pueden diseñarse para contener nada, todo o partes de la región no traducida de los extremos 5’ y/o 3’ de un ADNc de RsGluCl. Los niveles de expresión y actividad de RsGluCl pueden determinarse después de la introducción de estas construcciones, individualmente y en combinación, en las células hospedadoras apropiadas. Después de determinar la casete de ADNc de RsGluCl que produce la expresión óptima en ensayos transitorios, esta construcción de ADNc de RsGluCl se transfiere a diversos vectores de expresión (incluyendo virus recombinantes), incluyendo, pero sin limitarse a aquellos para células de mamíferos, células vegetales, células de insectos, ovocitos, bacterias y células de levaduras. Las técnicas para estas manipulaciones pueden encontrarse descritas en Sambrook y col., cita anterior, y son bien conocidas y disponibles para el experto en la técnica. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención incluye células hospedadoras que se han manipulado para contener y/o expresar secuencias de ADN que codifican RsGluCl. Un vector de expresión que contiene un ADN que codifica una proteína similar a RsGluCl puede usarse para la expresión de RsGluCl en una célula hospedadora recombinante. Tales células hospedadoras recombinantes pueden cultivarse en las condiciones adecuadas para producir RsGluCl o una forma biológicamente equivalente. Los vectores de expresión pueden incluir, pero no se limitan a vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos diseñados específicamente o virus. Los vectores de expresión de mamíferos disponibles en el comercio que pueden ser adecuados para la expresión de RsGluCl recombinante incluyen, pero no se limitan a pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLITMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 3714b), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35 (ATCC 37565). También pueden usarse diversos vectores de expresión bacterianos para la expresión de RsGluCl recombinante en células bacterianas. Los vectores de expresión bacterianos disponibles en el comercio que pueden ser adecuados para la expresión de RsGluCl recombinante incluyen, pero no se limitan a pCR2.1 (Invitrogen), pET11a (Novagen), λ gt11 (Invitrogen) y pKK223-3 (Pharmacia). Además, pueden usarse diversos vectores de expresión de células fúngicas para la expresión de RsGluCl recombinante en células fúngicas. Los vectores de expresión de células fúngicas disponibles en el comercio que pueden ser adecuados para la expresión de RsGluCl recombinante incluyen, pero no se limitan a pYES2 (Invitrogen) y el vector de expresión de Pichia (Invitrogen). Además, pueden usarse diversos vectores de expresión de células de insectos para expresar la proteína recombinante en células de insectos. Los vectores de expresión de células de insectos disponibles en el comercio que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de RsGluCl incluyen, pero no se limitan a pBlueBacIII y pBlueBacHis2 (Invitrogen) y pAcG2T (Pharmingen).

[0081] Las células hospedadoras recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo, pero sin limitarse a bacterias como E. coli, células fúngicas como levaduras, células de mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a líneas celulares de origen bovino, porcino, de mono y de roedor y células de insectos, incluyendo, pero sin limitarse a líneas celulares derivadas de R. sanguineus y del gusano de seda. Por ejemplo, un sistema de expresión de insectos utiliza las células del insecto Spodoptera frugiperda (Sf21) (Invitrogen) en combinación con un vector de expresión de baculovirus (pAcG2T, Pharmingen). También, las líneas celulares de mamíferos que pueden ser adecuadas y que están disponibles en el comercio incluyen, pero no se limitan a células L L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L L-M (ATCC CCL 1.2), Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171) y CPAE (ATCC CCL 209).

[0082] La especificidad de unión de los compuestos que muestran afinidad por RsGluCl se muestra midiendo la afinidad de los compuestos por células recombinantes que expresan el receptor clonado o por membranas de estas células que forman un canal de membrana funcional simple, homomultimérico o heteromultimérico. La expresión del receptor clonado y el cribado en busca de compuestos que se unan a RsGluCl o que inhiban la unión de un ligando conocido de RsGluCl marcado radioactivamente a estas células o a membranas preparadas a partir de estas células proporcionan un procedimiento efectivo para la rápida selección de compuestos con alta afinidad por RsGluCl. Tales ligandos no tienen por qué estar marcados radioactivamente, sino que pueden ser también compuestos no isotópicos que pueden usarse para desplazar compuestos marcados radioactivamente unidos o que pueden usarse como activadores en ensayos funcionales. Los compuestos identificados por el procedimiento anterior son probablemente agonistas o antagonistas de RsGluCl y pueden ser péptidos, proteínas o moléculas no proteicas orgánicas o inorgánicas.

[0083] Un aspecto preferido para el cribado en busca de moduladores de la actividad del canal RsGluCl es un sistema de expresión para ensayos basados en electrofisiología para medir la actividad de canales regulados por ligando (como la actividad del canal GluCl) que comprende la inyección de las moléculas de ADN o ARN de la presente invención en ovocitos de Xenopus laevis. El uso general de los ovocitos de Xenopus en el estudio de la actividad de los canales iónicos es conocido en la técnica (Dascal, 1987, Crit. Rev. Biochem. 22: 317-317; Lester, 1988, Science 241: 1057-1063; véase también Methods of Enzymology, vol. 207, 1992, capítulos 14-25, Rudy e Iverson, ed., Academic Press, Inc., Nueva York). Los ovocitos de Xenopus se someten a la inyección de material de ácido nucleico, que incluye pero no se limita a ADN, ARNm o ARNc y codifica un canal regulado por ligando, después de lo cual es posible medir la actividad del canal, así como la respuesta del canal a diversos moduladores.

[0084] Por consiguiente, se desvelan procedimientos para el cribado en busca de compuestos que modulen la expresión del ADN o ARN que codifica una proteína RsGluCl, así como de compuestos que afecten a la función de la proteína RsGluCl. Los procedimientos para identificar agonistas y antagonistas de otros receptores son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse para la identificación de agonistas y antagonistas de un canal RsGluCl. Por ejemplo, Cascieri y col. (1992, Molec. Pharmacol. 41: 1096-1099) describen un procedimiento para identificar sustancias que inhiben la unión de agonistas a los receptores de neurocinina de rata y, por lo tanto, son agonistas o antagonistas potenciales de los receptores de neurocinina. El procedimiento implica la transfección de células COS con vectores de expresión que contienen receptores de neurocinina de rata, el crecimiento de las células transfectadas durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de los receptores de neurocinina, la recolección de las células transfectadas y su resuspensión en un tampón de ensayo que contiene un agonista conocido de los receptores de neurocinina marcado radioactivamente en presencia o en ausencia de la sustancia y, después, la medida de la unión del agonista conocido del receptor de neurocinina marcado radioactivamente al receptor de neurocinina. Si la cantidad de unión del agonista conocido es menor en presencia de la sustancia que en ausencia de la sustancia, la sustancia es un ligando potencial del receptor de neurocinina. En caso de que se mida la unión de la sustancia como un agonista o antagonista a RsGluCl, esta unión puede medirse mediante el empleo de un ligando marcado. El ligando puede marcarse de cualquier manera conveniente conocida en la técnica, por ejemplo, radioactiva, fluorescente o enzimáticamente.

[0085] Por lo tanto, en este documento se mencionan procedimientos para el cribado en busca de compuestos que modulen la expresión del ADN o ARN que codifica una proteína RsGluCl. Los compuestos que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas o moléculas no proteicas orgánicas o inorgánicas. Los compuestos pueden modular por aumento o atenuación de la expresión del ADN o ARN que codifica RsGluCl o de la función de los canales a base de RsGluCl. Los compuestos que modulan la expresión del ADN o ARN que codifica la proteína RsGluCl o la función biológica de esta pueden detectarse por medio de diversos ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo “afirmativo/negativo” para determinar si hay un cambio de expresión

o de función. El ensayo puede hacerse cuantitativo por comparación de la expresión o la función de una muestra de prueba con los niveles de expresión o de función de una muestra estándar. Para estos usos pueden prepararse kits con RsGluCl, anticuerpos contra RsGluCl o RsGluCl modificada, por procedimientos conocidos.

[0086] Con este fin se proporcionan procedimientos para la identificación de una sustancia que module la actividad del receptor RsGluCl que implican:

(a): la adición de una sustancia de prueba en presencia y ausencia de una proteína receptora RsGluCl, en que dicha proteína receptora RsGluCl comprende la secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2, 6 y/o 8; y

(b): la medida y comparación del efecto de la sustancia de prueba en presencia o ausencia de la proteína receptora RsGluCl o un canal funcional respectivo.

[0087] Además, en este documento se desvelan varias realizaciones específicas para mostrar los diversos tipos de ensayos de cribado o selección que el experto en la técnica puede usar en combinación con un vector de expresión que dirija la expresión de la proteína receptora RsGluCl. Los procedimientos para la identificación de ligandos u otros receptores son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse a los ligandos de RsGluCl. Por lo tanto, estas realizaciones se presentan como ejemplos y no como limitaciones. Con este fin, la presente invención incluye ensayos mediante los cuales pueden identificarse moduladores de RsGluCl (como agonistas o antagonistas). Por consiguiente, en este documento se describe un procedimiento para determinar si una sustancia es un agonista

o antagonista potencial de RsGluCl, que comprende:

(a): la transfección o transformación de células con un vector de expresión que dirige la expresión de RsGluCl en las células, lo que resulta en las células de prueba;

(b): el crecimiento de las células de prueba durante un tiempo suficiente para permitir la expresión de RsGluCl y la generación de un canal funcional;

(c): la exposición de las células a un ligando de RsGluCl marcado en presencia y en ausencia de la sustancia;

(d): la medida de la unión del ligando marcado al canal RsGluCl; en que si la cantidad de unión del ligando marcado es menor en presencia de la sustancia que en ausencia de la sustancia, entonces la sustancia es un ligando potencial de RsGluCl.

[0088] Las condiciones en las que se lleva a cabo la etapa (c) del procedimiento son condiciones que se usan típicamente en la técnica para el estudio de las interacciones proteína-ligando: por ejemplo, pH fisiológico; condiciones salinas como las representadas por tampones de uso corriente como PBS o en medios de cultivo de tejidos; una temperatura desde aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 55°C. Las células de prueba pueden recolectarse y resuspenderse en presencia de la sustancia y del ligando marcado. En una modificación del procedimiento descrito anteriormente, la etapa (c) se modifica de modo que las células no se recolectan y se resuspenden, sino que el agonista conocido marcado radioactivamente y la sustancia se ponen en contacto con las células mientras las células están unidas a un sustrato, por ejemplo, placas de cultivo de tejidos.

[0089] También se desvela un procedimiento para determinar si una sustancia es capaz de unirse a RsGluCl, es decir, si la sustancia es un modulador potencial de la activación del canal RsGluCl, en que el procedimiento comprende:

(a): la transfección o transformación de células con un vector de expresión que dirige la expresión de RsGluCl en las células, lo que resulta en células de prueba;

(b): la exposición de las células a la sustancia;

(c): la medida de la cantidad de unión de la sustancia a RsGluCl;

(d): la comparación de la cantidad de unión de la sustancia a RsGluCl en las células de prueba con la cantidad de unión de la sustancia a células control que no han sido transfectadas con RsGluCl;

en que si la cantidad de unión de la sustancia es mayor en las células de prueba que en las células control, la sustancia es capaz de unirse a RsGluCl. La determinación de si la sustancia es un agonista o un antagonista puede llevarse a cabo por medio de ensayos funcionales, como el ensayo electrofisiológico descrito en este documento.

[0090] Las condiciones en la que se lleva a cabo la etapa (b) del procedimiento son condiciones que se usan típicamente en la técnica para el estudio de las interacciones proteína-ligando: por ejemplo, pH fisiológico; condiciones salinas como las representadas por tampones de uso corriente como PBS o en medios de cultivo de tejidos; una temperatura desde aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 55°C. Las células de prueba se recolectan y resuspenden en presencia de la sustancia.

[0091] Los ensayos descritos anteriormente pueden ser ensayos funcionales, en que pueden llevarse a cabo ensayos electrofisiológicos (por ejemplo, véase el ejemplo 2) en líneas celulares de mamífero transfectadas, en una línea celular de insecto o en ovocitos de Xenopus, para medir los diversos efectos que puedan tener los compuestos de prueba en la capacidad de un ligando conocido (como glutamato) para activar el canal o para que un compuesto de prueba module la actividad por sí mismo (similar al efecto de ivermectina en canales GluCl conocidos). Por lo tanto, el experto en la técnica podrá adaptar cómodamente los clones de ADNc de la presente invención a la metodología conocida para cribados tanto iniciales como secundarios para seleccionar compuestos que se unan a los canales funcionales RsGluCl de la presente invención y/o los activen.

[0092] Un procedimiento preferido para identificar un modulador de una proteína de canal RsGluCl comprende, en primer lugar, la puesta en contacto del compuesto de prueba con una proteína de canal RsGluCl de

R. sanguineus, seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8; y en segundo lugar, la medida del efecto del compuesto de prueba en la proteína de canal RsGluCl. Un aspecto preferido implica el uso de una proteína RsGluCl de R. sanguineus que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.

[0093] Otro procedimiento preferido para la identificación de un compuesto que module la actividad de la proteína de canal regulada por glutamato RsGluCl comprende, en primer lugar, la inyección en una célula hospedadora de una población de moléculas de ácido nucleico, de las que al menos una parte codifica una proteína de canal GluCl de R. sanguineus seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8, de modo que la expresión de dicha parte de moléculas de ácido nucleico resulta en un canal regulado por ligando activo y, en segundo lugar, la medida de la corriente de membrana de la célula hospedadora en presencia y en ausencia de un compuesto de prueba. Pueden usarse numerosos moldes, incluyendo, pero sin limitarse a ADN complementario, ARN mensajero poli A+ y ARN complementario.

[0094] Las moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteínas recombinantes y anticuerpos de la presente invención pueden usarse para el cribado y medida de las cantidades de RsGluCl. Las proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de ARN y anticuerpos se prestan en sí mismas a la formulación de kits adecuados para la detección y tipificación de RsGluCl. Un kit tal comprendería un soporte compartimentalizado adecuado para mantener estrechamente confinado al menos un contenedor. Además, el soporte comprendería reactivos como RsGluCl recombinante o anticuerpos dirigidos contra RsGluCl adecuados para la detección de RsGluCl. El soporte puede contener también un medio para la detección de un antígeno marcado tal o sustratos enzimáticos o similares.

[0095] Los ensayos descritos en este documento pueden llevarse a cabo con células que han sido transfectadas con RsGluCl de manera transitoria o estable. El vector de expresión puede introducirse en las células hospedadoras mediante una serie de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a transformación, transfección, fusión de protoplastos y electroporación. La transfección pretende incluir cualquier procedimiento conocido en la técnica para la introducción de RsGluCl en las células de prueba. Por ejemplo, la transfección incluye la transfección mediada por fosfato de calcio o cloruro de calcio, la lipofección, la infección con una construcción retrovírica que contiene RsGluCl y la electroporación. Las células que contienen el vector de expresión se analizan individualmente para determinar si producen la proteína RsGluCl. La identificación de células que expresan RsGluCl puede hacerse por varios procedimientos, incluyendo, pero sin limitarse a la reactividad inmunológica con anticuerpos dirigidos contra RsGluCl, la unión de un ligando marcado o la presencia de actividad de RsGluCl funcional no endógena.

[0096] La especificidad de la unión de los compuestos que muestran afinidad por RsGluCl se demuestra midiendo la afinidad de los compuestos por células recombinantes que expresan el receptor clonado o por membranas de estas células. La expresión del receptor clonado y el cribado en busca de compuestos que se unan a RsGluCl o que inhiban la unión de un ligando conocido de RsGluCl a estas células o a membranas preparadas a partir de estas células proporcionan un procedimiento efectivo para la rápida selección de compuestos con alta afinidad por RsGluCl. Estos ligandos no tienen por qué estar marcados radioactivamente, sino que pueden ser también compuestos no isotópicos que pueden usarse para desplazar compuestos marcados radioactiva, fluorescente o enzimáticamente o que pueden usarse como activadores en ensayos funcionales. Los compuestos identificados por el procedimiento anterior son probablemente agonistas o antagonistas de RsGluCl.

[0097] Por lo tanto, la especificidad de la unión de los compuestos con afinidad por RsGluCl se demuestra midiendo la afinidad de los compuestos por células recombinantes que expresan el receptor clonado o por membranas de estas células. La expresión del receptor clonado y el cribado en busca de compuestos que se unan a RsGluCl o que inhiban la unión de un ligando conocido de RsGluCl (como glutamato, ivermectina o ácido nodulispórico) marcado radioactivamente a estas células o a membranas preparadas a partir de estas células proporcionan un procedimiento efectivo para la rápida selección de compuestos con alta afinidad por RsGluCl. Estos ligandos no tienen por qué estar marcados radioactivamente, sino que pueden ser también compuestos no isotópicos que pueden usarse para desplazar compuestos marcados radioactiva, fluorescente o enzimáticamente o que pueden usarse como activadores en ensayos funcionales. Los compuestos identificados por el procedimiento anterior son probablemente agonistas o antagonistas de RsGluCl. Según se ha señalado anteriormente en esta memoria descriptiva, los compuestos pueden modular por aumento o atenuación de la expresión del ADN o ARN que codifica RsGluCl o actuando como agonistas o antagonistas de la proteína receptora RsGluCl. De nuevo, estos compuestos que modulan la expresión del ADN o ARN que codifica la proteína RsGluCl o la función biológica de esta pueden detectarse por medio de diversos ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo “afirmativo/negativo” para determinar si hay un cambio de expresión o de función. El ensayo puede hacerse cuantitativo por comparación de la expresión o la función de una muestra de prueba con los niveles de expresión o de función de una muestra estándar.

[0098] Los ensayos funcionales del canal de cloruro regulado RsGluCl 1 y/o 2 miden una o más actividades de canal de cloruro regulado por ligando, en que el canal está compuesto totalmente o en parte por el canal RsGluCl. La actividad del canal RsGluCl puede medirse mediante el canal descrito en este documento por sí mismo;

o como una subunidad en combinación con una o más subunidades adicionales del canal de cloruro regulado por ligando (preferentemente uno o más RsGluCl), en que las subunidades se combinan entre sí para proporcionar una actividad de canal funcional. Los ensayos para medir la actividad del canal de cloruro regulado RsGluCl incluyen un cribado funcional por medio de 36Cl, un cribado funcional por medio de electrofisiología de pinzamiento zonal de membrana y un cribado funcional por medio de colorantes fluorescentes. En general, las técnicas para llevar a cabo tales análisis son bien conocidas en la técnica. (Véase, por ejemplo, Smith y col., 1998, European Journal of Pharmacology 159: 261-269; González y Tsien, 1997, Chemistry & Biology 4: 269-277; Millar y col., 1994, Proc. R. Soc., Lond. B. 258: 307-314; Rauh y col., 1990, TiPS 11: 325-329 y Tsien y col., patente de los EE. UU. n° 5.661.035). Los ensayos funcionales pueden realizarse con compuestos individuales o preparaciones que contienen compuestos diferentes. Una preparación que contiene compuestos diferentes en que uno o más compuestos afectan a la actividad del canal RsGluCl puede dividirse en grupos más pequeños para identificar el(los) compuesto(s) que afectan a la actividad del canal RsGluCl. En una realización de la presente invención se usa una preparación de prueba que contiene al menos 10 compuestos en un ensayo funcional. En un ensayo funcional pueden usarse canales RsGluCl producidos de manera recombinante presentes en entornos diferentes. Los entornos adecuados incluyen células vivas y extractos celulares purificados que contienen el canal RsGluCl y una membrana apropiada para la actividad; y el uso de un canal RsGluCl purificado producido de manera recombinante significa que se ha introducido en un entorno diferente, adecuado para la medida de la actividad del canal RsGluCl. Algunos derivados de RsGluCl pueden usarse para ensayos en busca de compuestos activos en el canal y para obtener información relativa a diferentes regiones del canal. Por ejemplo, pueden producirse derivados del canal RsGluCl en los que se alteran regiones de aminoácidos del canal nativo y el efecto de la alteración en la actividad del canal puede medirse para obtener información sobre diferentes regiones del canal.

[0099] La expresión del ADN de RsGluCl puede realizarse también con ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético puede traducirse eficientemente en varios sistemas sin células, incluyendo, pero sin limitarse a extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como traducirse eficientemente en sistemas a base de células, incluyendo, pero sin limitarse a microinyección en ovocitos de rana, en lo que se prefiere la microinyección en ovocitos de rana.

[0100] Después de la expresión de RsGluCl en una célula hospedadora, la proteína RsGluCl puede recuperarse para proporcionar la proteína RsGluCl en forma activa. Hay varios procedimientos de purificación de la proteína RsGluCl disponibles y adecuados para su uso. La proteína RsGluCl recombinante puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares por diversas combinaciones o por la aplicación individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción en hidroxiapatito y cromatografía de interacción hidrófoba. Además, la proteína RsGluCl recombinante puede separarse de otras proteínas celulares por medio de una columna de inmunoafinidad preparada con anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para la proteína RsGluCl de longitud completa o fragmentos polipeptídicos de la proteína RsGluCl.

[0101] La expresión del ADN de RsGluCl puede realizarse también con ARNm sintético producido in vitro. El ARNm sintético puede traducirse eficientemente en varios sistemas sin células, incluyendo, pero sin limitarse a extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como traducirse eficientemente en sistemas a base de células, incluyendo, pero sin limitarse a microinyección en ovocitos de rana, en lo que se prefiere la microinyección en ovocitos de rana.

[0102] Después de la expresión de RsGluCl en una célula hospedadora, la proteína RsGluCl puede recuperarse para proporcionar la proteína RsGluCl en forma activa. Hay varios procedimientos de purificación de la proteína RsGluCl disponibles y adecuados para su uso. La proteína RsGluCl recombinante puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares por diversas combinaciones o la aplicación individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción en hidroxiapatito y cromatografía de interacción hidrófoba. Además, la proteína RsGluCl recombinante puede separarse de otras proteínas celulares por medio de una columna de inmunoafinidad preparada con anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para la proteína RsGluCl de longitud completa o fragmentos polipeptídicos de la proteína RsGluCl.

[0103] Pueden producirse anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra RsGluCl1 o RsGluCl2 o un péptido sintético (normalmente de aproximadamente 9 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud) de una parte de RsGluCl1 o RsGluCl2, según se desvela en SEQ ID NO:2, 4, 6 y/8. Los anticuerpos monoespecíficos contra RsGluCl se purifican de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos reactivos contra RsGluCl o se preparan como anticuerpos monoclonales reactivos contra RsGluCl por medio de la técnica de Kohler y Milstein (1975, Nature

256: 495-497). Un anticuerpo monoespecífico según se usa en este documento se define como una especie de anticuerpo simple o una especie de anticuerpo múltiple con características de unión homogéneas para RsGluCl. Una unión homogénea según se usa en este documento se refiere a la capacidad que presenta la especie de anticuerpo de unirse a un antígeno o epítopo específico, como aquellos asociados con RsGluCl, según se describe anteriormente. Los anticuerpos específicos de RsGluCl humanos se producen por inmunización de animales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares con una concentración apropiada de la proteína RsGluCl o de un péptido sintético generado de una parte de RsGluCl, con o sin inmunoadyuvantes.

[0104] Antes de la primera inmunización se recoge el suero de preinmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1.000 mg de la proteína RsGluCl asociada con un inmunoadyuvante aceptable. Tales inmunoadyuvantes aceptables incluyen, pero no se limitan al adyuvante de Freund completo e incompleto, precipitado de alumbre, agua en emulsión de aceite con Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial consta de la proteína RsGluCl o un fragmento peptídico de esta, preferentemente en el adyuvante completo de Freund, administrada en varios puntos por vía subcutánea (SC) o intraperitoneal (IP) o ambas. A intervalos regulares, preferentemente semanales, se extrae sangre de cada uno de los animales para determinar el título de anticuerpos. Los animales pueden recibir o no inyecciones de refuerzo después de la inmunización inicial. Aquellos animales que reciben inyecciones de refuerzo, reciben generalmente una cantidad igual de RsGluCl en el adyuvante incompleto de Freund por la misma vía. Las inyecciones de refuerzo se administran a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta obtener títulos máximos. Aproximadamente siete días después de cada inmunización de refuerzo o con frecuencia aproximadamente semanal después de una inmunización única se extrae sangre de los animales, se recoge el suero y se almacenan alícuotas a aproximadamente -20°C.

[0105] Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos contra RsGluCl se preparan mediante la inmunización de ratones consanguíneos, preferentemente Balb/c, con la proteína RsGluCl. Los ratones se inmunizan por vía IP o SC con aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg, preferentemente aproximadamente 10 mg, de la proteína RsGluCl en aproximadamente 0,5 ml de tampón o solución salina, incorporados en un volumen igual de un adyuvante aceptable, según se discute anteriormente. Se prefiere el adyuvante competo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial en el día 0 y se dejan descansar durante aproximadamente tres a aproximadamente treinta semanas. Los ratones inmunizados reciben una o más inmunizaciones de refuerzo de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de RsGluCl en una disolución tampón como tampón fosfato salino por vía intravenosa (IV). A partir de los ratones positivos para los anticuerpos se obtienen linfocitos, preferentemente linfocitos esplénicos, extrayendo el bazo de los ratones inmunizados por los procedimientos estándar conocidos en la técnica. Se producen células de hibridoma mediante la mezcla de los linfocitos esplénicos con un acompañante de fusión apropiado, preferentemente células de mieloma, en condiciones que permitan la formación de hibridomas estables. Los acompañantes de fusión pueden incluir, pero no se limitan a: mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, en que se prefiere Sp 2/0. Las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se fusionan en polietilenglicol, de peso molecular aproximadamente 1.000, a concentraciones desde aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%. Las células de hibridoma fusionadas se seleccionan por crecimiento en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con hipoxantina, timidina y aminopterina por procedimientos conocidos en la técnica. Se recoge el líquido del sobrenadante de los pocillos con crecimiento positivo en aproximadamente los días 14, 18 y 21 y se analiza la producción de anticuerpos mediante un inmunoensayo como el inmunorradioensayo en fase sólida (SPIRA), con RsGluCl como antígeno. El líquido de los cultivos se analiza también mediante el ensayo de precipitación de Ouchterlony para determinar el isótopo del mAb. Las células de hibridoma de los pocillos positivos para el anticuerpo se clonan por una técnica como la técnica del agar blando de MacPherson, 1973, Soft Agar Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, eds., Academic Press.

[0106] Los anticuerpos monoclonales se producen in vivo por inyección de ratones Balb/c sensibilizados con pristano, con aproximadamente 0,5 ml por ratón y aproximadamente 2 x 106 a aproximadamente 6 x 106 células de hibridoma, aproximadamente 4 días después de la sensibilización. Aproximadamente 8-12 días después de la transferencia de células se recoge el líquido ascítico y los anticuerpos monoclonales se purifican por los procedimientos conocidos en la técnica.

[0107] La producción in vitro de mAb dirigidos contra RsGluCl se lleva a cabo por crecimiento del hibridoma en el medio DMEM con suero bovino fetal a aproximadamente el 2% para obtener cantidades suficientes de los mAb específicos. Los mAb se purifican por procedimientos conocidos en la técnica.

[0108] Los títulos de anticuerpo del líquido ascítico o del cultivo del hibridoma se determinan mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos que incluyen, pero no se limitan a precipitación, aglutinación pasiva, la técnica de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) y técnicas de radioinmunoensayo (RIA). Otros ensayos similares se usan para detectar la presencia de RsGluCl en los fluidos corporales o en extractos tisulares y celulares.

[0109] Los expertos en la técnica advertirán inmediatamente que los procedimientos descritos anteriormente para la producción de anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos para fragmentos peptídicos de RsGluCl o para una RsGluCl de longitud completa respectiva.

[0110] Las columnas de afinidad con anticuerpos para RsGluCl se preparan, por ejemplo, por la adición de anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que se preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida, de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan entonces al gel por medio de enlaces amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados restantes se inactivan con etanolamina HCl 1M (pH 8). La columna se lava después con agua, seguida de glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteínas extrañas. La columna se equilibra entonces en tampón fosfato salino (pH 7,3) y los sobrenadantes del cultivo celular o los extractos celulares que contienen RsGluCl de longitud completa o fragmentos de la proteína RsGluCl se hacen pasar lentamente a través de la columna. Después, la columna se lava con tampón fosfato salino hasta que la densidad óptica (A280) se reduce hasta el valor de fondo y entonces la proteína se eluye con glicina HCl 0,23 M (pH 2,6). A continuación, la proteína RsGluCl purificada se dializa frente a tampón fosfato salino.

[0111] En este documento se menciona un animal transgénico no humano que es útil para estudiar la capacidad de diversos compuestos de actuar como moduladores de RsGluCl o de cualquier canal RsGluCl funcional alternativo in vivo, al proporcionar células para su cultivo in vitro. En referencia a los animales transgénicos descritos en este documento, se hace referencia a transgenes y a genes. Según se usa en este documento, un transgén es una construcción genética que incluye un gen. El transgén se integra en uno o más cromosomas en las células de un animal por los procedimientos conocidos en la técnica. Una vez integrado, el transgén se porta en al menos un sitio en los cromosomas de un animal transgénico. Por supuesto, un gen es una secuencia nucleotídica que codifica una proteína, como uno o una combinación de los clones de ADNc descritos en este documento. El gen y/o el transgén pueden incluir también elementos de regulación genética y/o elementos estructurales conocidos en la técnica. Un tipo de células diana para la introducción de transgenes son las células madre embrionarias (ES). Las células ES pueden obtenerse de preembriones cultivados in vitro y fusionados con embriones (Evans y col., 1981, Nature 292: 154-156; Bradley y col., 1984, Nature 309: 255-258; Gossler y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069; Robertson y col., 1986, Nature 322: 445-448). Los transgenes pueden introducirse eficientemente en las células ES por diversas técnicas estándar como transfección de ADN, microinyección o por transducción mediada por retrovirus. A continuación, las células ES transformadas resultantes pueden combinarse con blastocistos de un animal no humano. Después, las células ES introducidas colonizan el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante (Jaenisch, 1988, Science 240: 1468-1474). Por lo tanto, también estará dentro del ámbito del experto en la técnica la producción de animales invertebrados transgénicos o con genes inactivados (por ejemplo, C. elegans) que expresen el transgén RsGluCl en un entorno con GluCl de C. elegans sin manipular así como en mutantes de C. elegans con una o las dos subunidades GluCl de C. elegans inactivadas.

[0112] Pueden formularse composiciones de utilidad farmacéutica que comprendan moduladores de RsGluCl según procedimientos conocidos como la mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de estos vehículos y procedimientos de formulación pueden encontrarse en la obra Pharmaceutical Sciences de Remington. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración efectiva, tales composiciones contendrán una cantidad efectiva de la proteína, ADN, ARN, RsGluCl modificada o agonistas o antagonistas de RsGluCl, incluyendo activadores o inhibidores de tirosina-cinasa.

[0113] Las composiciones terapéuticas o de diagnóstico desveladas en este documento se administran a un individuo en cantidades suficientes para el tratamiento o el diagnóstico de trastornos. La cantidad efectiva puede variar en función de diversos factores como el estado, peso, sexo y edad del individuo. Otros factores incluyen el modo de administración.

[0114] Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse al individuo por diversas vías como la vía subcutánea, tópica, oral e intramuscular.

[0115] El término “derivado químico” describe una molécula que contiene fracciones químicas adicionales que normalmente no forman parte de la molécula básica. Tales fracciones pueden mejorar la solubilidad, la semivida, la absorción, etc. de la molécula básica. Alternativamente, las fracciones pueden atenuar efectos secundarios no deseables de la molécula básica o reducir su toxicidad. Algunos ejemplos de tales fracciones se describen en diversos textos como Pharmaceutical Sciences, de Remington.

[0116] Los compuestos identificados según los métodos desvelados en este documento pueden usarse en solitario en las dosis apropiadas. Alternativamente, puede ser deseable la coadministración o la administración secuencial de otros agentes.

[0117] Por lo tanto, también se proporcionan formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas para su uso en los nuevos procedimientos de tratamiento descritos en este documento. Las composiciones que contienen los compuestos identificados según esta invención como principio activo pueden administrarse en formas de dosificación terapéutica muy diversas en vehículos de administración convencionales. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse en formas de dosificación oral como comprimidos, cápsulas (incluyendo en cada caso formulaciones de liberación retardada y sostenida), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, disoluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o por inyección. Igualmente, también pueden administrarse por vía intravenosa (tanto en bolos como infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión o intramuscular, todas ellas formas de uso bien conocidas por el experto en la técnica farmacéutica.

[0118] Ventajosamente, los compuestos mencionados en este documento pueden administrarse en una dosis única diaria o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas, dos, tres o cuatro veces al día. Además, los compuestos pueden administrarse por vía intranasal mediante el uso tópico de vehículos intranasales adecuados, o por vía transdérmica, mediante el uso de los parches transdérmicos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por supuesto, para la administración en forma de un sistema de administración por vía transdérmica, la administración de la dosis será continua en lugar de intermitente durante todo el régimen de dosificación.

5

[0119] Para un tratamiento combinado con más de un agente activo, en que los agentes activos están en formulaciones de dosificación individuales, los agentes activos pueden administrarse de manera simultánea o cada uno puede administrarse en momentos escalonados individualmente.

10 [0120] El régimen de dosificación que utiliza los compuestos mencionados en este documento se selecciona en función de diversos factores que incluyen el tipo, especie, edad, peso, sexo y estado médico del paciente; la gravedad de la enfermedad por tratar; la vía de administración, la función renal, hepática y cardiovascular del paciente; y el compuesto empleado en concreto. Un médico o un veterinario experto pueden fácilmente determinar y prescribir la cantidad efectiva del fármaco requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la

15 enfermedad. La precisión óptima a la hora de conseguir concentraciones del fármaco en un intervalo que produzca eficacia sin toxicidad requiere un régimen basado en la cinética de la disponibilidad del fármaco en los puntos de acción. Esto implica una consideración de la distribución, el equilibrio y la eliminación del fármaco.

[0121] Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la presente invención, sin que por ello esta se 20 limite.

Ejemplo 1

Aislamiento y caracterización de moléculas de ADN que codifican RsGluCl y RsGluCl2

25 [0122] La mayoría de los procedimientos moleculares se realizaron según los procedimientos estándar disponibles en referencias como Ausubel y col. (1992, Short protocols in molecular biology. F. M. Ausubel y col., 2.a edición (John Wiley & Sons)) y Sambrook y col. (1989, Molecular cloning. A laboratory manual. J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 2.a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press)).

30 [0123] RsGluCl1 – Se aisló ARN poliA+ de adultos de la garrapata marrón del perro mediante el kit de aislamiento de ARNm Poly(A)PureTM (Ambion). El ADNc de la garrapata se sintetizó con cebadores oligo-dT y el kit de síntesis ZAP cDNA® (Stratagene) y el ADNc > 1kb se seleccionó mediante columnas de fraccionamiento por tamaño para ADNc (BRL). Se construyó una biblioteca de ADNc de garrapata en el vector λ ZAP® II con el kit de

35 clonación GIGAPACK® III Gold (Stratagtene). Un fragmento de ADNc de GluCl de Drosophila que abarcaba la región M1 a M3 se usó para un cribado en condiciones poco restrictivas [formamida al 25% v/v / SSCP 5x (SSCP 1x = NaCl 120 mM / citrato de sodio 15 mM / fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8) / SDS al 0,1% / disolución de Denhardt 10x / ADN de esperma de salmón (250 µg/ml) a 42°C; lavado con SSC 0,2x / SDS al 0,1% a 42°C] de la biblioteca de ADNc de garrapata. La secuencia nucleotídica de la sonda es la siguiente:

[0124] Los filtros se expusieron durante once días y se aislaron seis clones positivos para el análisis de secuencia. Tres de los clones (T12, T82 y T32) codifican proteínas relacionadas con GluCl y se secuenciaron por los dos extremos.

45 [0125] RsGluCl2 - A partir de cabezas de la garrapata marrón del perro se aisló ARN Poly (A)+. La primera hebra de ADNc se sintetizó a partir de 50 ng de ARN mediante un sistema de preamplificación SUPERSCRIPT (Life Technologies). Para la reacción de PCR se usó una décima parte de la reacción de la primera hebra. Los oligonucleótidos degenerados usados se diseñaron basados en secuencias obtenidas de GluCl de C. elegans,

50 Drosophila y pulga (C. felis): Cebador directo (27F2): GGAT(G/T)CCNGA(C/T)N(C/T)NTT(C/T)TTNN(A/C)NA(A/C)(C/T)G (SEQ ID NO:9); Cebador inverso 1 (3AF1): CNA(A/G)(A/C)A(A/G)NGCNC(A/C)GAANA(C/T)(A/G)AA(C/T)G (SEQ ID NO:10);

55 Cebador inverso 2 (3AF2):

imagen3

CAN(A/G)CNCCN(A/G)(G/T)CCANAC(A/G)TCNA(C/T)N(A/G)C (SEQ ID NO:11).

Se realizaron dos tandas de PCR con las combinaciones “27F2 + 3AF1 y después 27F2 +3BF2”. Los ciclos fueron los siguientes: 1 x (95°C durante 120 s), después 30 x (95°C durante 45 s; 50°C durante 90 s; 72°C durnate 120 s). Se usaron reactivos de Life Technology Inc. La concentración de nucleótidos fue de 5 µM. Una décima parte de los productos de la reacción de PCR se analizó por transferencia de Southern, para identificar secuencias contaminantes y evitar su clonación por PCR. Los productos nuevos obtenidos por PCR del tamaño adecuado se clonaron en el vector plasmídico pCR2.1 mediante el kit de clonación “TA” (Invitrogen, Inc.). Después de analizar las secuencias (ABI Prism, PE Applied Biosystems), los insertos de los clones de PCR seleccionados se marcaron radioactivamente y se usaron como sondas para el cribado de una biblioteca de ADNc generada en el vector Uni-ZAP® (Stratagene, Inc.) a partir de la preparación de ARN mencionada anteriormente. Las secuencias de clones de ADNc de longitud completa se analizaron mediante el programa de GCG Inc. La subclonación de RsGluCl2 en un vector de expresión en mamíferos se realizó por escisión de un fragmento de 1,85 kb (digestión XhoI-EcoRI) con la región codificante del inserto original del clon RsGluCl2 B1 a partir del plásmido UniZap® pBS y su ligación posterior en el vector TetSplice® (Life Technologies Inc.). Los clones de ADNc T12 y T82 son idénticos en la región codificante, con la excepción de un único nucleótido diferente que resulta en la sustitución de un único aminoácido, lo que probablemente es un polimorfismo de origen natural. El clon T32 tiene dos exones adicionales que no están presentes en los ADNc de T12 y T82, uno está próximo al extremo 5’ de la región codificante (exón de 135 pb) y el otro está en el asa intracelular M3-M4 (exón de 96 pb). Adicionalmente, estos exones opcionales no están incluidos en la ORF de DrosGluCl-1. Por lo tanto, estos clones de ADNc se designan también como RsGluCl1L (T32 - 2,48 kb) y RsGluCl-1S (T12 y T82 - 2,126 kb). La proteína predicha RsGluCl-1S es idéntica en aproximadamente el 71% a la proteína DrosGluCl-1.

Ejemplo 2

Expresión funcional de los clones de RsGluCl1 y RsGluCl2 en ovocitos de Xenopus

[0126] Los ovocitos de Xenopus laevis se prepararon e inyectaron mediante procedimientos estándar descritos previamente (Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S. y Cully, D. F. Mol. Pharmacol. 40, 368-374 (1991); Arena, J. P., Liu, K. K., Paress, P. S., Schaeffer, J. M. y Cully, D. F., Mol. Brain Res. 15, 339-348 (1992)). Se anestesiaron hembras adultas de Xenopus laevis con metanosulfonato de tricaína al 0,17% y los ovarios se extrajeron quirúrgicamente y se colocaron en una disolución compuesta de: NaCl 82,5 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, piruvato de Na 2,5 mM, penicilina G 100.000 unidades/l, sulfato de estreptomicina 1.000 mg/l, pH 7,5 (Mod. OR-2). Los lóbulos de los ovarios se abrieron, se lavaron varias veces en Mod. OR-2 y se incubaron en colagenasa al 0,2% (Sigma, tipo 1) en Mod. OR-2 a temperatura ambiente con agitación suave. Después de una hora se renovó la disolución de colagenasa y los ovocitos se incubaron durante 30-90 min más hasta que el 50% de los ovocitos se hubo liberado de los ovarios. Se seleccionaron ovocitos de los estadios V y VI y se colocaron en un medio con: NaCl 96 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1,8, HEPES 5 mM, piruvato de Na 2,5 mM, teofilina 0,5 mM, gentamicina 50 mg/ml, pH 7,5 (ND-96) durante 16-24 horas antes de la inyección. Se inyectaron en los ovocitos 50 nl de ARN de Dv8, Dv9, RsGluCl1 o RsGluCl2 a una concentración de 0,2 mg/mol. Los ovocitos se incubaron a 18°C durante 1-6 días en ND-96 antes de proceder al registro.

[0127] Los registros se realizaron a temperatura ambiente en ND-96 modificado, compuesto de: NaCl 96 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 0,1, BaCl2 3,5 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5. Los ovocitos se sometieron a pinzamiento de voltaje mediante un amplificador Dagan CA1 con dos microelectrodos (Dagan Corporation, Minneapolis, MN) interconectado a un ordenador Macintosh 7100/80. El electrodo de paso de corriente se rellenó con KCl 0,7 M, citrato de K 1,7 M y el electrodo de registro de voltaje se rellenó con KCl 1M. Durante todo el experimento, los ovocitos se superfundieron con ND-96 modificado (disolución de control) o con ND-96 con activadores y bloqueadores potenciales del canal a una velocidad de aproximadamente 3 ml/min. Los datos se obtuvieron a 100 Hz y se filtraron a 33,3 Hz con el software Pulse de HEKA Elektronik (Lambrecht, Alemania). Todos los registros se realizaron desde un potencial de fijación de 0 o de -30 mV.

[0128] A partir del clon RsGluCl-1S T12 se sintetizó ARNc y se expresó en ovocitos de Xenopus. El canal codificado por RsGluCl-1 es un canal de cloruro regulado por glutamato y activado por IVM-PO4.

[0129] La figura 10 muestra la corriente activada por glutamato en ovocitos a los que se había inyectado ARN de RsGluCl1 T12. La activación de la corriente fue máxima con glutamato 10 µM y en los ovocitos no inyectados no se observó ninguna corriente. La aplicación de ivermectina 100 nM produce una corriente similar, pero no inactivadora.

[0130] La figura 11 muestra la activación por ivermectina de RsGluCl2 expresado en ovocitos de Xenopus. La activación de la corriente fue máxima con ivermectina aproximadamente 1 µM y ninguna corriente se activó por glutamato cuando el canal se expresó como un canal funcional simple.

Ejemplo 3

Expresión funcional de clones de RsGluCl en células de mamíferos

[0131] Un gen de RsGluCl puede clonarse en un vector de expresión en mamíferos y usarse para transfectar la línea celular de mamífero elegida. Los clones celulares estables se seleccionan por crecimiento en presencia de G418. Se aíslan clones individuales resistentes a G418 y se analizan para confirmar la presencia de un gen RsGluCl intacto. Después, los clones que contienen RsGluCl se analizan en cuanto a la expresión mediante técnicas inmunológicas, como inmunoprecipitación, inmunotransferencia e inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para las proteínas RsGluCl. Los anticuerpos se obtienen de conejos inoculados con péptidos sintetizados a partir de la secuencia de aminoácidos predicha a partir de las secuencias RsGluCl. La expresión se analiza también mediante técnicas electrofisiológicas de pinzamiento zonal de membrana y un ensayo de flujo de aniones.

[0132] Se usan células que expresan RsGluCl de manera estable o transitoria para analizar la expresión de proteínas de canal activas. Estas células se usan para identificar y examinar otros compuestos en cuanto a su capacidad para modular, inhibir o activar el canal respectivo.

[0133] Se ligan casetes que contienen el ADNc de RsGluCl en la orientación positiva con respecto al promotor en los sitios de restricción apropiados del lado 3’ del promotor y se identifican por mapeo de sitios de restricción y/o secuenciación. Estos vectores de expresión de ADNc pueden introducirse en células hospedadoras fibroblásticas, por ejemplo COS-7 (ATCC CRL1651) y CV-1 tat (Sackevitz y col., 1987, Science 238: 1575), 293, L (ATCC CRL6362) por procedimientos estándar, incluyendo, pero sin limitarse a electroporación o procedimientos químicos (liposomas catiónicos, DEAE dextrano, fosfato de calcio). Las células transfectadas y los sobrenadantes de los cultivos celulares pueden recolectarse y analizarse en cuanto a la expresión de RsGluCl según se describe en este documento.

[0134] Todos los vectores usados para expresión transitoria en mamíferos pueden usarse para establecer líneas celulares estables que expresan RsGluCl. Es de esperar que las construcciones de ADNc de RsGluCl inalterado clonadas en vectores de expresión programen las células hospedadoras para producir la proteína RsGluCl. Además, RsGluCl se expresa extracelularmente como una proteína segregada mediante la ligación de construcciones de ADNc de RsGluCl con ADN que codifica la secuencia señal de una proteína segregada. Las células hospedadoras para transfección incluyen, pero no se limitan a CV-1-P (Sackevitz y col., 1987, Science 238: 1575), tk-L (Wigler y col., 1977, Cell 11: 223), NS/0 y dHFr-CHO (Kaufman y Sharp, 1982, J. Mol. Biol. 159: 601).

[0135] La cotransfección de cualquier vector que contenga un ADNc de RsGluCl con un plásmido de selección por un fármaco, incluyendo, pero sin limitarse a G418, aminoglicosido-fosfotransferasa, higromicina, higromicina-Bfosfotransferasa, APRT, xantinaguanina-fosforibosiltransferasa, permitirán la selección de clones transfectados de manera estable. Las cantidades de RsGluCl se cuantifican mediante los ensayos descritos en este documento. Las construcciones de ADNc de RsGluCl pueden ligarse también en vectores que contienen marcadores de resistencia a fármacos amplificables para la producción de clones celulares de mamíferos que sinteticen las mayores cantidades posibles de RsGluCl. Después de introducir estas construcciones en las células, los clones que contienen el plásmido se seleccionan con el agente apropiado y el aislamiento de un clon con exceso de expresión con un alto número de copias del plásmido se lleva a cabo por selección con dosis crecientes del agente. La expresión de RsGluCl recombinante se consigue por transfección de un ADNc de longitud completa de RsGluCl en una célula hospedadora de mamífero.

Ejemplo 4

Clonación de ADNc de RsGluCl en un vector de expresión de baculovirus para expresión en células de insectos

[0136] Los vectores de baculovirus que derivan del genoma del virus AcNPV se han diseñado para proporcionar un alto nivel de expresión de ADNc en la línea Sf9 de células de insecto (ATCC CRL 1711). Un baculovirus recombinante que expresa ADNc de RsGluCl se produce por los procedimientos estándar siguientes (Invitrogen Maxbac Manual): las construcciones de ADNc de RsGluCl se ligan en el gen de polihedrina en diversos vectores de transferencia de baculovirus, incluyendo los vectores pAC360 y BlueBac (Invitrogen). Se generan baculovirus recombinantes por recombinación homóloga tras la cotransfección del vector de transferencia de baculovirus y ADN genómico lineal de AcNPV (Kitts, 1990, Nucl. Acids Res. 18: 5667) en células Sf9. Los virus pAC360 recombinantes se identifican por la ausencia de cuerpos de inclusión en las células infectadas y los virus pBlueBac recombinantes se identifican en función de la expresión de -galactosidasa (Summers, M. D. y Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin n° 1555). La expresión de RsGluCl se mide tras la purificación de las placas mediante los ensayos descritos en este documento.

[0137] El ADNc que codifica el marco de lectura abierto de RsGluCl GluCl completo se inserta en el sitio BamHI de pBlueBacII. Las construcciones en la orientación positiva se identifican por análisis de secuencia y se usan para transfectar células Sf9 en presencia de ADN lineal de AcNPV sin manipular.

Ejemplo 5

Clonación de ADNc de RsGluCl en un vector de expresión en levaduras

[0138] Se produce RsGluCl recombinante en la levadura S. cerevisiae tras la inserción del cistrón óptimo de ADNc de RsGluCl en vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o extracelular de proteínas heterólogas. Para el caso de la expresión intracelular, los vectores como EmBLyex4 o similares se ligan al cistrón de RsGluCl (Rinas y col., 1990, Biotechnlology 8: 543-545; Horowitz B. y col., 1989, J. Biol. Chem. 265: 41894192). Para la expresión extracelular, el cistrón de RsGluCl GluCl se liga en vectores de expresión en levaduras que fusionan una señal de secreción (un péptido de levaduras o mamíferos) al extremo NH2 de la proteína RsGluCl (Jacobson, 1989, Gene 85: 511-516; Riett y Bellow, 1989, Biochem. 28: 2941-2949).

[0139] Estos vectores incluyen, pero no se limitan a pAVE1-6, que fusiona la señal de la seroalbúmina humana al ADNc expresado (Steep, 1990, Biotechnology 8: 42-46) y el vector pL8PL que fusiona la señal de la lisozima humana al ADNc expresado (Yamamoto, Biochem. 28: 2728-2732). Además, RsGluCl se expresa en levaduras como una proteína de fusión conjugada con ubicuitina mediante el vector pVEP (Ecker, 1989, J. Biol. Chem. 264: 7715-7719, Sabin, 1989, Biotechnology 7: 705-709, MacDonnell, 1989, Mol. Cel Biol. 9: 5517-5523). Los niveles de RsGluCl expresada se determinan por los ensayos descritos en este documento.

Ejemplo 6

Purificación de RsGluCl recombinante

[0140] La proteína RsGluCl producida de manera recombinante puede purificarse por cromatografía de afinidad con anticuerpos. Se preparan columnas de afinidad con anticuerpos contra RsGluCl GluCl mediante la adición de los anticuerpos dirigidos contra RsGluCl GluCl a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que se preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida, de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan entonces al gel por medio de enlaces amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados restantes se inactivan con etanolamina HCl 1M (pH 8). La columna se lava después con agua, seguida de glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteínas extrañas. La columna se equilibra entonces en tampón fosfato salino (pH 7,3) junto con los agentes solubilizadores de membrana adecuados como detergentes y los sobrenadantes del cultivo celular o los extractos celulares que la RsGluCl solubilizada se hacen pasar lentamente a través de la columna. Después, la columna se lava con tampón fosfato salino junto con detergentes hasta que la densidad óptica (A280) se reduce hasta el valor de fondo y entonces la proteína se eluye con glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) junto con detergentes. A continuación, la proteína RsGluCl purificada se dializa frente a tampón fosfato salino.

Listado de secuencias [0141]

<110> Merck & Co., Inc.

<120> MOLECULAS DE ADN QUE CODIFICAN CANALES DE CLORURO REGULADOS POR GLUTAMATO DE RIPHICEPHALUS SANGUINEUS

<130> 20438 PCT <150>60/193,934

<151> 31-03-2000

<160> 12

<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0

<210> 1

<211> 2.138

<212> ADN

<213> Rhipicephalus sanguineus

<220>

<221> Secuencia codificante

<222> (331)…(1.683)

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 450

<212> Proteína

<213> Rhipicephalus sanguineus

<400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 2.289 5 <212> ADN

<213> Rhipicephalus sanguineus

<220>

<221> Secuencia codificante

<222>: (502)…(1.854)10 <400> 3

<210> 4

<211> 450

<212> Proteína

<213> Rhipicephalus sanguineus

<400> 4

<210> 5

<211> 2.400

<212> ADN

<213> Rhipicephalus sanguineus

<220>

<221> Secuencia codificante

<222> (617)…(2.170)

<400> 5

<210> 6

<211> 517

<212> Proteína

<213> Rhipicephalus sanguineus

<400> 6

<210> 7

<211> 1.402 5 <212> ADN

<213> Rhipicephalus sanguineus

<220>

<221> Secuencia codificante

<222>: (131)…(1.385)10 <400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 418

<212> Proteína

<213> Rhipicephalus sanguineus

<400> 8

imagen1

5

10

15

<210> 9

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<221> elemento mixto

<222> (1)…(27)

<223> n = A, T, C o G

<400> 9 ggatkccnga ynynttyttn nmnamyg 27

<210> 10

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<221> elemento mixto

<222> (1)…(24)

<223> n = A, T, C o G

<400> 10

cnarmarngc ncmgaanayr aayg: 24

<210> 11

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<221> elemento mixto

<222> (1)…(26)

<223> n = A, T, C o G

<400> 11

canrcnccnr kccanacrtc naynrc: 26

<210> 12

<211> 248

<212> ADN

<213> Drosophila melanogaster

<400> 12

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica una proteína de canal GluCl de R. sanguineus, en que dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, 4, 6 y 8.
2.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2.
3.

Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación
2.
4.

Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 3.
5.

Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante que comprende:

(a) la transfección del vector de expresión de la reivindicación 3 en una célula hospedadora adecuada;

(b) el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.
6.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:1.
7.

La molécula de ADN de la reivindicación 6 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 331 al nucleótido 1.683 de SEQ ID NO:1.
8.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:4.
9.

Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación
8.
10.

Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 9.
11.

Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante que comprende:

(a)

la transfección del vector de expresión de la reivindicación 10 en una célula hospedadora adecuada;

(b)

el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.
12.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:3.
13.

La molécula de ADN de la reivindicación 12 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 502 al nucleótido 1.854 de SEQ ID NO:3.
14.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:6.
15.

Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación
14.
16.

Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 15.
17.

Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus en una célula

hospedadora recombinante que comprende:

(a)

la transfección del vector de expresión de la reivindicación 16 en una célula hospedadora adecuada;

(b)

el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.
18.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:5.
19.

La molécula de ADN de la reivindicación 18 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 617 al nucleótido 2.170 de SEQ ID NO:5.
20.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus, en que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:8.
21.

Un vector de expresión para expresar una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante, en que dicho vector de expresión comprende una molécula de ADN de la reivindicación
20.
22.

Una célula hospedadora que expresa una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus recombinante, en que dicha célula hospedadora contiene el vector de expresión de la reivindicación 21.
23.

Un procedimiento para la expresión de una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus en una célula hospedadora recombinante que comprende:

(a)

la transfección del vector de expresión de la reivindicación 21 en una célula hospedadora adecuada;

(b)

el cultivo de las células hospedadoras de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus a partir de dicho vector de expresión.
24.

Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus que consta de una secuencia nucleotídica según se expone en SEQ ID NO:7.
25.

La molécula de ADN de la reivindicación 24 que consta de la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 131 al nucleótido 1.387 de SEQ ID NO:7.
26.

Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2.
27.

Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus de la reivindicación 26 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.
28.

Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl1 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 27.
29.

Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:4.
30.

Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus de la reivindicación 29 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.
31.

Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl1 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 30.
32.

Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:6.
33.

Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus de la reivindicación 32 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.
34.

Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl1 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 33.
35.

Una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus sustancialmente sin otras proteínas que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:8.
36.

Una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus de la reivindicación 35 que es un producto de un vector de expresión de ADN contenido dentro de una célula hospedadora recombinante.
37.

Una preparación de membrana sustancialmente pura que comprende la proteína de canal GluCl2 de

R. sanguineus purificada a partir de la célula hospedadora recombinante según se define en la reivindicación 36.
38.

Una proteína de canal GluCl1 de R. sanguineus que consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de las secuencias de aminoácidos según se exponen en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:6.
39.

Una proteína de canal GluCl2 de R. sanguineus que consta de una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:8.
40.

Un procedimiento para identificar un modulador de una proteína de canal GluCl que comprende:

(a) la puesta en contacto de un compuesto de prueba con una proteína de canal GluCl de R. sanguineus seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 y SEQ ID N:8

(b) la medida del efecto del compuesto de prueba sobre la actividad de la proteína de canal GluCl.
41.

El procedimiento de la reivindicación 40, en que la proteína GluCl de R. sanguineus de la etapa (a) es un producto de un vector de expresión de ADN contenido en una célula hospedadora recombinante.
42.

Un procedimiento para identificar un compuesto que module la actividad de las proteínas de canal reguladas por glutamato que comprende:

(a)

la inyección en una disolución de células hospedadoras de una población de moléculas de ácido nucleico, de las cuales, al menos una parte codifica una proteína de canal GluCl de R. sanguineus seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:8, de modo que la expresión de dicha parte de moléculas de ácido nucleico resulta en un canal regulado por glutamato activo;

(b) la adición de un compuesto de prueba a dicha disolución;

(c)

la medida de la corriente de membrana de la célula hospedadora a un potencial de fijación más positivo que el potencial inverso para cloruro.
43. El procedimiento de la reivindicación 42, en que dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consta de ADN complementario, ARN mensajero poli A+ y ARN complementario.