ES2361608T3 - Complejos de metal de transición marcados. - Google Patents

Abstract

Complejo de metal de transición marcado, que comprende un átomo de metal de transición, un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo de metal de transición, un resto tridentado inerte como puente estabilizador, y un marcador, en el que el átomo de metal de transición está unido al resto tridentado por medio de tres átomos donadores, seleccionándose cada uno independientemente entre el grupo de átomos de nitrógeno y azufre, átomos donadores que están presentes en el resto tridentado y en el que los átomos donadores en el resto tridentado están separados entre sí por 3-5 átomos de carbono.

Description

La presente invención se refiere a complejos de metal de transición marcados, entidades químicas o biológicas marcadas, que comprenden dichos complejos, métodos para preparar dichas entidades químicas o biológicas marcadas, así como a utilizaciones específicas de dichos complejos de metal de transición.

El marcado de moléculas bio-orgánicas, tales como moléculas de ADN, es deseable para aplicaciones en campos tales como tecnología de ADN recombinante. En muchos casos, sin embargo, no se desea marcar la macromolécula de ácido nucleico, sino marcar cierto nucleótido. El objetivo principal del marcado de nucleótidos es que estos nucleótidos marcados puedan incorporarse en moléculas de ácido nucleico. De esta manera, puede influirse sobre la ubicación del marcador en el ácido polinucleico resultante, lo que no es posible cuando se une un marcador a la macromolécula.

Se sabe que los nucleótidos pueden unirse de manera suficiente a un marcador por medio de un complejo de cis-platino. Sin embargo, dichos nucleótidos marcados no son incorporados de forma satisfactoria para formar moléculas de ADN por la ADN polimerasa, o no lo son en absoluto.

Los métodos alternativos disponibles para marcar un nucleótido, que puede incorporarse en un ácido polinucleico son los métodos más convencionales de marcado. Sin embargo, estos métodos también tienen una gran desventaja, ya que no son adecuados para marcar cualquier nucleótido. En algunos casos, por ejemplo, cuando solamente unos pocos residuos de cierto nucleótido están presentes en cierto ácido polinucleico, o cuando se va a marcar el residuo nucleotídico terminal de un ácido polinucleico, se desea ser capaz de marcar cualquier nucleótido. Un ejemplo de dicho método convencional ha sido descrito por Dale y otros, Biochemistry, 14, (1975), 2447-2457, método que implica mercuriación covalente directa como técnica de marcado. Dale y otros, describen que la citosina y el uracilo pueden mercuriarse en su posición C5 en condiciones suaves. Sin embargo, también describen que, para las bases adenina, timina y guanina, se obtuvieron resultados negativos.

Por lo tanto, existe una necesidad de un sistema de marcado universal, que sea excelente para unir marcadores y moléculas bio-orgánicas, incluyendo todos los nucleótidos diferentes, y que también haga posible incorporar enzimáticamente cualquier nucleótido marcado a través de dicho sistema de marcado en un ácido polinucleico de manera eficaz.

Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han desarrollado una nueva categoría de complejos de metal de transición que pueden marcar a una entidad química o biológica de forma, como mínimo, tan eficaz como los métodos conocidos. Además, se concibe que los nucleótidos unidos al sistema de marcado de la presente invención puedan incorporarse en polinucleótidos muy eficazmente.

Estos complejos de metal de transición marcados comprenden un resto tridentado inerte como puente estabilizador, un marcador, y un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo del metal de transición.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un complejo de metal de transición marcado que comprende un átomo de metal de transición, un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo de metal de transición, un resto tridentado inerte como puente estabilizador, y un marcador, según la reivindicación 1.

Estos complejos de metal de transición pueden prepararse con mayores rendimientos que los que se basan en restos bidentados, mientras que muestran además estabilidades y purezas mejoradas. Además, los presentes complejos metálicos son más reactivos y provocan un marcado más eficaz en comparación con complejos de metal de transición que se basan en restos bidentados. Además, la preparación de un complejo de metal de transición según la presente invención puede realizarse en un procedimiento de una etapa, lo que es altamente ventajoso.

Entre las ventajas de la utilización de ligandos tridentados están el efecto de quelado y el efecto trans. El efecto de quelado se refiere a la coordinación más rápida y más eficaz de un átomo de metal de transición con el ligando, debido a que el metal se une a tres sitios de una y la misma molécula. Como resultado, la pureza a la que se obtiene el complejo es mayor. El efecto trans se refiere a las mayores reactividad y eficacia de marcado de un complejo de metal de transición según la presente invención, debido a que los grupos salientes están situados en la posición trans de un sitio de unión del resto tridentado, otorgando un carácter polar a la configuración. Este sitio de unión es, preferentemente, una amina secundaria o terciaria, contribuyendo de este modo a dicho carácter polar.

Casi cualquier entidad química o biológica que contiene un átomo de S (azufre) o átomo de N (nitrógeno) accesible puede marcarse con los complejos de metal de transición marcados según la presente invención. Las entidades adecuadas para ser marcadas con los complejos de metal de transición marcados son moléculas bio-orgánicas tales como ácido nucleico (nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ADN, ARN, homodúplex, heterodúplex o múltiplex).

Los complejos de metal de transición se unen muy fácilmente (de forma no covalente) a la posición N-7 de residuos de guanina. De esta manera, moléculas de ADN o ARN, ya sean monocatenarias o no, pueden identificarse fácilmente (por ejemplo, detectarse, separarse, purificarse, aislarse), pero esto también permite la producción de sondas para técnicas de hibridación en las que moléculas de ADN/ARN no marcadas hibridan con la sonda marcada. Los complejos de metal de transición marcados apenas interfieren en la hibridación, si es que interfieren. Además, esta técnica evita la utilización de nucleótidos modificados en la preparación de sondas. Sin embargo, proteínas, péptidos y otras moléculas bio-orgánicas también pueden identificarse con las sustancias de marcado según la presente invención.

Los complejos de metal de transición marcados según la presente invención también son muy adecuados para unir moléculas bio-orgánicas a superficies sólidas tales como nitrocelulosa, filtros de nylon, placas de microvaloración, perlas, vidrio, fibras y similares.

Nucleótidos modificados utilizando un complejo de metal de transición según la presente invención y oligonucleótidos y polinucleótidos en los que los nucleótidos se han incorporado, y oligonucleótidos y polinucleótidos que se han modificado directamente utilizando estos nuevos compuestos de platino pueden utilizarse como sondas en investigación biomédica, diagnóstico clínico y tecnología de ADN recombinante.

La amplia diversidad de utilidades de los complejos según la presente invención se basa en la capacidad de los complejos de metal de transición para formar complejos estables con moléculas bio-orgánicas, por ejemplo ácidos (poli)nucleicos o (poli)péptidos y derivados de los mismos que, a su vez, podrían detectarse por medio de restos detectables que están unidos a moléculas bio-orgánicas o interactúan con las mismas. Algunas utilizaciones incluyen detectar e identificar agentes etiológicos que contienen ácido nucleico, por ejemplo bacterias y virus; cribar bacterias en busca de resistencia a antibióticos; cribar animales en busca de trastornos genéticos relacionados con efectos farmacéuticos; diagnosticar trastornos genéticos, por ejemplo trisomía del par 21, anemia de células falciformes: cariotipado cromosómico; e identificar células tumorales. Además, los complejos de marcado son muy útiles en farmacología, especialmente para el cribado de fármacos, identificación de dianas de fármacos, monitorización de fármacos y administración de fármacos.

La presente invención también da a conocer un kit de diagnóstico para identificar, determinar y/o localizar sustancias biológicas de interés, que comprende el complejo de metal de transición de la presente invención, opcionalmente junto con otros medios adecuados para la detección. Por supuesto, la presente invención también da a conocer un kit, en el que los respectivos componentes del complejo de metal de transición marcado están presentes por separado, es decir, en forma no unida.

Los ejemplos de complejos de metal de transición adecuados según la presente invención son complejos en los que el metal de transición se selecciona entre el grupo que comprende vanadio, cromo, hierro, níquel, cobre, rutenio, paladio, platino, molibdeno, tungsteno, cobalto, manganeso, osmio, rodio, iridio, zinc y cadmio. Preferentemente, según la presente invención, el metal de transición se selecciona entre el grupo que comprende hierro, níquel, rutenio, paladio, platino, molibdeno, tungsteno y cobalto. Más preferentemente, el metal de transición es platino, cobalto o rutenio.

El resto reactivo del complejo de metal de transición es de forma adecuada un buen ligando saliente. Preferentemente, el resto reactivo se selecciona entre el grupo de Cl -, NO3-, HCO3-, CO32-, SO32-, ZSO3-, I -, Br -, F -, acetato, carboxilato, fosfato, nitrato de etilo, oxalato, citrato, un fosfonato, ZO -, y agua. Z se define en el presente documento como un resto hidrógeno o un grupo alquilo o arilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. De estos ligandos, Cl -y NO3-son los más preferentes.

Los complejos de metal de transición marcados según la presente invención comprenden un tridentado inerte como puente estabilizador. Inerte, tal como se utiliza en el presente documento, indica que el resto permanece unido al complejo de transición durante el proceso de marcado y en lo sucesivo, sin reaccionar químicamente con una entidad.

El metal de transición se une al resto tridentado por medio de átomos de nitrógeno o azufre que están presentes en el resto tridentado, o cualquier combinación de estos átomos. Por ejemplo, el metal de transición puede unirse al resto tridentado por medio de dos átomos de nitrógeno y un átomo de azufre. Preferentemente, sin embargo, el metal de transición se une al resto tridentado por medio de tres átomos de nitrógeno.

En el contexto de la presente invención, la dureza de un elemento químico se define como la proporción del estado de oxidación y el radio del átomo. En base a esta definición, la dureza aumenta de izquierda a derecha en una fila de la Tabla Periódica, y disminuye de arriba hacia abajo en una columna de la Tabla Periódica. El metal de transición se combina con un resto tridentado que se une al metal de transición a través de un átomo (nitrógeno o azufre) de dureza similar a la del metal de transición, dado que esto tiene un efecto beneficioso sobre la estabilidad del complejo resultante. En base a esta estrategia, el platino se combina preferentemente con un resto tridentado que se une a éste a través de nitrógeno o azufre.

Es preferente, adicionalmente, que el estado de oxidación del metal de transición se seleccione de modo que se consiga una combinación estable con un resto tridentado particular. Por ejemplo, los restos tridentados que se unen al metal de transición a través de oxígeno se combinan preferentemente con Pt(IV), Pd(IV), Mo(VI), W(VI), Ru(III), Co(III), Fe(II) y Fe(III), en lugar de con Pt(II) o Pd(II). Se considera que los restos tridentados que se unen al metal de transición a través de nitrógeno no tienen ninguna preferencia particular por un estado de oxidación particular del metal de transición, aunque Cu(I) es menos preferente. Los restos tridentados que se unen al metal de transición a través de fósforo o azufre se combinan preferentemente con Pt(II), Pd(II), Fe(II), Co(II), en lugar de con Pt(IV), Fe(III)

o Ru(III).

En general, los restos tridentados adecuados que pueden utilizarse según la presente invención incluyen aquellos que tienen, como mínimo, tres átomos donadores seleccionados independientemente entre N y S y separados por de 3 a 5, átomos de carbono.

Los sitios reactivos preferentes incluyen sitios reactivos que comprenden una amina, una fosfamina, un tiol, un tioéter, un sulfuro, una tioamida, un tiol, una amida, una fosfamida, una tiofosfamida, una imida, una imina, una fosfoimina, un aldehído, una cetona, un éster, un anhídrido, un tianhídrido, un alcohol, un éter, una urea, una tiourea, una fosfourea, una acilurea, una acilfosfourea, una oxourea, un tioaldehído, una tiocetona, un tioéster, un tiofosfato, un tioanhídrido, un ácido carboxílico o ácido tiocarboxílico y sales de los mismos, o una piridina, un imidazol, un pirazol, una fosfopiridina, un fosfoimidazol, un fosfopirazol, un furano o un tiofeno. Los ejemplos de entidades que pueden marcarse son entidades seleccionadas entre el grupo de aminoácidos (preferentemente metionina, cisteína, e histidina), péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, inmunoglobulinas, enzimas, sinzimas, fosfo-aminoácidos, fosfolípidos, lípidos (por ejemplo, fosfatidilcolina, esfingolípidos), glucoproteínas, ácidos nucleicos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos péptidonucleicos, oligómeros de ácidos péptidonucleicos, polímeros de ácidos péptidonucleicos, aminas, aminoglucósidos, nucleopéptidos y glucopéptidos. Preferentemente, según la presente invención, la entidad se selecciona entre el grupo de ácidos nucleicos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, aminoácidos, péptidos, oligopéptidos y polipéptidos.

Según la presente invención, el marcador está contenido adecuadamente en el resto tridentado inerte o unido al resto tridentado, opcionalmente por medio de un espaciador. En caso de que el estado de oxidación del metal de transición sea mayor que (II), el marcador también puede estar unido al metal de transición.

Puede utilizarse cualquier tipo de marcador, siempre que pueda estar contenido en el resto inerte o unido al espaciador que, a su vez, está unido al resto tridentado. Dicho marcador puede ser una marca radiactiva; una enzima; un componente de un par de unión específico tal como avidina, estreptavidina o biotina, biocitina, iminobiotina; una sustancia colorante coloidal; una marca fosforescente (por ejemplo un quelado de europio, una porfirina de platino); una marca quimioluminiscente (por ejemplo, luminol); un fluorócromo, incluyendo una cianina, un colorante Alexa (Molecular Probes), colorante Bodipy (Molecular Probes), una rodamina, carboxi-rodamina; dinitrofenol (DNP); tert-butoxicarbonilo; un lantánido, por ejemplo Europio o Terbio ya esté o no en una configuración de quelado; una sustancia reductora (eosina, eritrosina, etc.); un sol (suspensión coloidal) de látex (coloreado); digoxigenina; un metal (por ejemplo, rutenio, por ejemplo en caso de complejos binucleares o polinucleares); un sol de metal u otro sol particulado (selenio, carbono y similares); dansil-lisina; un colorante UV; un colorante VIS; colorante InfraRojo; coumarina (por ejemplo, aminometil coumarina); un soporte sólido; un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido o polinucleótido, un anticuerpo, un aminoácido, una proteína o (poli)péptido que tiene un efecto fisiológico sobre una célula o en la misma (por ejemplo, proteína A, proteína G, molécula de transporte a través de la membrana), etc. Una clase especial de marcador es el propio metal de transición. Dicho marcador de metal de transición puede estar presente sin ningún otro marcador de metal de transición (mononuclear) o combinado con otros marcadores de metal de transición (binuclear o polinuclear) tanto en configuración homo como hetero, o ya esté o no combinado con otros tipos de marcadores, tal como se han descrito anteriormente. Esos complejos de marcado son especialmente útiles en medios de detección electroquímica, por ejemplo biosensores.

Son particularmente preferentes DNP, fluoresceína, colorantes de cianina y tetrametilrrodamina, entre otras, dado que pueden formar complejos estables con platino unido a una entidad. Otros marcadores preferentes incluyen biotina, avidina, estreptavidina y digoxigenina.

En una realización de la presente invención, el marcador está conectado al resto tridentado inerte por medio de un espaciador. Preferentemente dicho espaciador comprende una cadena que tiene, como mínimo, cuatro átomos, y preferentemente no más de 20 átomos, cadena que comprende un resto donador de electrones en un extremo y un resto para reaccionar con el marcador, en la que la cadena está unida al resto tridentado a través del resto donador de electrones. Es posible unir en primer lugar el espaciador al marcador antes de que el espaciador reaccione con el resto tridentado. El resto donador de electrones del espaciador puede ser, por ejemplo, un grupo amina o un anión tiolato. Preferentemente, la cadena comprende además, como mínimo, un heteroátomo. Los espaciadores altamente preferentes son polietilenglicol, 1,6-diaminohexano y 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano. En una realización preferente de la presente invención, se utiliza 1,6-diaminohexano tert-butoxicarbonilo, como complejo de metal de transiciónespaciador intermedio, antes de unirlo al marcador. En realizaciones preferentes, los espaciadores difieren en masa molecular sustituyendo átomos, por ejemplo, por isótopos alternativos.

Los complejos particularmente preferentes de la presente invención son los complejos de metal de transición que comprenden el resto tridentado, tal como se describen en los ejemplos adjuntos. Se hace referencia específica a realizaciones preferentes denominadas en ellos como un complejo N3 trans-C3 tridentado, tal como se muestra por ejemplo, en la figura 6, compuesto no. 5 y figura 9, compuesto 4; un complejo N3 cis-C2 tridentado tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 8, compuesto no. 10 y figura 13, compuesto no. 5; un complejo N3 trans-C2 tridentado tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 16, compuesto no. 4; un complejo NS2 trans-C2 tridentado tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 17, compuesto no. 3; un complejo tridentado trans con un puente (piridina)3 tal como se muestra, por ejemplo, en la figura 15 compuesto 7. El término “cis” se refiere en el presente documento a la posición del grupo saliente y el marcador (opcionalmente unido mediante un brazo espaciador) en el metal de transición que es adyacente, mientras que el término “trans” se refiere en el presente documento a la posición del grupo saliente y el marcador (opcionalmente unido mediante un brazo espaciador) en el metal de transición que es opuesta. La indicación C2 o C3 indica el tamaño en número de átomos de carbono que forman un puente entre dientes individuales, mientras que N3 indica que los dientes del tridentado son todos átomos de nitrógeno. NS2 indica que dos de los dientes del tridentado son átomos de azufre, siendo el tercero un átomo de nitrógeno. La expresión “dientes del tridentado” refiriéndose en el presente documento a la parte del resto tridentado que participa realmente en la formación del enlace de coordinación al metal de transición.

La ventaja particular del complejo de la presente invención es que permite la posibilidad de la formación de un enlace coordinado entre el complejo del metal de transición y la entidad química o biológica, mejorando de este modo enormemente su idoneidad para su utilización como compuesto de marcado. Este compuesto de marcado preferentemente comprende como resto marcador una marca fluorescente, tal como fluoresceína; amino-metil coumarina (AMCA); tetrametil-rodamina (TAMRA); dietil aminometil coumarina (DEAC); carboxi-fluoresceína (FAM); carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA); carboxi-X-rodamina (ROX); Azul Cascade (CB); isotiocinato de fluoresceína (FITC); Verde Oregon (OG); Alexa 488 (A488); verde Rodamina (RGr); carboxi-rodamina 6G (R6G); Rojo Texas (TxR); Cy3; Cy3.5; Cy5, Cy5.5; Cy7, carboxinaftofluoresceína (CNF) y colorantes Bodipy®, o una marca de hapteno tal como biotina (BIO); digoxigenina (DIG); y 2,4-dinitrofenilo (DNP). El complejo de metal de transición de la presente invención puede denominarse adecuadamente, por lo tanto, como un compuesto de marcado en su totalidad. El compuesto de marcado puede ser utilizado de forma muy adecuada para marcar ácidos nucleicos. Se apreciará que otras entidades químicas o biológicas, tales como moléculas proteináceas también pueden marcarse de forma muy adecuada mediante el complejo tridentado de la presente invención.

La presente invención se refiere adicionalmente a una entidad química o biológica marcada con el complejo de metal de transición marcado que comprende, como mínimo, un isótopo estable diferente. Preferentemente, dicha entidad es un aminoácido, péptido o proteína.

Un aspecto particular de la presente descripción se refiere a la utilización de los complejos de metal de transición marcados según la presente invención en la identificación de proteínas y el mapeo de sus interacciones celulares, que son herramientas importantes para entender el funcionamiento de sistemas biológicos, y para evaluar el efecto de estados de enfermedad o de la administración de fármacos. De esa manera, puede determinarse la composición del proteoma así como los cambios cualitativos y cuantitativos en su interior. El proteoma humano comprende más de 100.000 proteínas con características ampliamente diversas, de origen natural a niveles de concentración que abarcan hasta nueve órdenes de magnitud. Estas cifras ilustran algunos de los desafíos a los que se enfrentan los investigadores del proteoma. El análisis a gran escala (finalmente global) de proteínas expresado en una célula o tejido se ha denominado como análisis del proteoma (Pennington y otros, 1997, Trends Cell Bio 7: 168-173) o proteómica. En comparación con el análisis del genoma, el análisis del proteoma se enfrenta a desafíos específicos.

Una amplia gama de tecnologías está disponible para identificar proteínas y mapear sus interacciones celulares. Para desentrañar la naturaleza de una proteína desconocida y para evaluar su función, generalmente están implicadas una serie de etapas posteriores (Patterson y Aebersold, 2003, Nat. Genet. 33 Suppl: 311-23).

Una primera etapa está formada por tecnologías de visualización y mapeo del proteoma. El procedimiento utilizado más ampliamente para obtener mapas de proteínas o huellas moleculares es electroforesis en gel bidimensional (2DE) (Rabilloud, 2000, Anal Chem. 72(1): 48A-55A). En 2DE, las proteínas se separan mediante su punto isoeléctrico (pI) en una dimensión, seguida de separación por peso molecular (PM) en la segunda dimensión. Las proteínas separadas pueden visualizarse utilizando tintes generales tales como azul de Coomassie, tintes de plata, colorantes fluorescentes, o radiomarcado (Patton, 2002, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 771(1-2): 3-31). Los complejos patrones de manchas generados requieren un análisis de imágenes avanzado para un procesamiento adicional. Habitualmente se comparan dos o múltiples perfiles de proteínas, que representan, por ejemplo, diferentes fases celulares. Manchas de proteínas de interés expresadas de forma diferencial se escinden del gel para un análisis posterior a la separación. De esta manera, los cambios en el proteoma debidos a una alteración del estado de la célula pueden visualizarse y los cambios característicos en la expresión de la proteína pueden localizarse con exactitud.

Una segunda etapa posterior está representada por tecnologías de identificación de proteínas, de forma predominante Espectrometría de Masas (MS). Un espectrómetro de masas es, esencialmente, una combinación de un módulo de ionización, un analizador de masas y un detector, y mide la proporción de masa con respecto a carga (m/z) de analitos ionizados (por ejemplo péptidos o proteínas). Los analitos pueden cargarse mediante bombardeo atómico rápido (FAB), ionización por pulverización de electrones (ESI), ionización-desorción por láser asistida por matriz (MALDI) o ionización química a presión atmosférica (APcI). El analizador de masas es la parte más flexible del espectrómetro de masas. Dado que un campo eléctrico desviará a las partículas cargadas, y el potencial de energía puede convertirse en movimiento inercial en base a la masa y al potencial, el analizador de masas dirige algunas masas al detector en base a sus proporciones de masa con respecto a carga (m/z) modificando los potenciales del campo eléctrico. El analizador puede utilizarse para estabilizar un estrecho intervalo de m/z o para realizar un barrido a través de un intervalo de m/z para catalogar los iones presentes. Existen varios tipos, incluyendo analizadores de masas de tiempo de vuelo, trampa de iones, y cuadrupolar. El detector registra simplemente la carga inducida cuando un ión pasa por o golpea una superficie.

Dado que un espectrómetro de masas es un detector no específico, a menudo se utilizan interfaces específicas para unir un espectrómetro de masas a un cromatógrafo de gases (GC) o de líquidos (LC) para introducir analitos separados en el MS. Un espectrómetro de masas en tándem (MS-MS o MSn) es uno que es capaz de realizar múltiples rondas de espectrometría de masas. Por ejemplo, un analizador de masas puede aislar un péptido entre los muchos que entran en un espectrómetro de masas. Un segundo analizador de masas estabiliza a continuación los iones peptídicos mientras el gas colisiona con ellos, haciendo que se fragmenten. Un tercer analizador de masas cataloga a continuación los fragmentos producidos a partir de los péptidos. Este proceso, llamado disociación inducida por colisión, es la base de muchos experimentos en proteómica. Hasta la fecha, están disponibles diversos espectrómetros de masas, cada uno presentando sus ventajas específicas para algunas aplicaciones (Gygi y Aebersold, 2000, Curr Opin Chem Biol. 4(5): 489-94; Mann y otros, 2001, Ann. Rev. Biochem. 70: 437-473).

Una etapa final en la evaluación del análisis funcional de una proteína implica tecnologías tales como resonancia del plasmón superficial (SPR), que pueden proporcionar información detallada sobre interacciones biomoleculares, por ejemplo de proteínas conocidas y sus dianas. El fenómeno de SPR se produce en una fina película metálica en una interfaz óptica en condiciones de reflexión total de luz polarizada en un ángulo específico. El procedimiento mide cambios sutiles de resonancia óptica, y es sensible al índice de refracción del medio en el lado opuesto de esta película. Los cambios en el índice de refracción se producen cuando las moléculas se unen a, o se disocian de una biomolécula que ha estado unida a la superficie metálica. De esta manera, se generan perfiles de actividad de unión en tiempo real con características de asociación o disociación de la interacción (Green y otros, 2000, Biomaterials 21(18): 1823-35; Rich y Myszka, 2000, Curr Opin Biotechnol. 11(1): 54-61; McDonnell, 2001, Curr Opin Chem Biol. 5(5): 572-7).

Los avances tecnológicos han tenido como objetivo generalmente mejorar la sensibilidad y la cuantificación de detección de las diversas proteínas. Además, han tenido como objetivo dar a conocer métodos que puedan dejar a la 2DE obsoleta, es decir, volverse independientes del gel. La complejidad de los patrones de 2DE y los sesgos inherentes contra proteínas poco abundantes, pequeñas (menos de 10 kDa) o poco solubles (por ejemplo unidas a la membrana) han desencadenando el desarrollo de técnicas que permitan mediciones (semi)cuantitativas de proteínas en un proteoma directamente (Regnier y otros, 2002, J Mass Spectrom. 37(2): 133-45; Bauer y Kuster, 2003, Eur J Biochem. 270(4): 570-8).

Una estrategia muy adecuada que sortea la utilización de 2DE es el procedimiento ICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopo) desarrollado por Gygi y otros en 1999 (Nat. Biotechnol. 17(10): 994-9). Este procedimiento es capaz de comparar rápidamente dos perfiles de expresión de proteínas globales diferentes mediante MS en base a marcado diferencial con isótopos estables. El reactivo de ICAT de primera generación estaba constituido por i) un grupo reactivo de proteína específico de tiol (yodoacetamida) capaz de marcar residuos de cisteína (Cys) de proteínas, ii) dos diferentes restos enlazadores que contienen ocho átomos de hidrógeno (1H) (d0, isótopo ligero) u ocho átomos de deuterio (2H) (d8, isótopo pesado) para el marcado diferencial de dos poblaciones de proteínas, y iii) una etiqueta de afinidad, en su mayoría biotina, que permite el aislamiento selectivo de péptidos marcados.

El propio procedimiento ICAT implica la reducción y alquilación de las cadenas laterales de cisteína en una mezcla compleja de proteínas, con lo que las proteínas de un estado celular están marcadas con la etiqueta marcada en d0 y las proteínas de un segundo estado celular (por ejemplo un estado de enfermedad) están marcadas con la forma d8 de la etiqueta. Las dos mezclas se combinan a continuación y se someten a digestión proteolítica, para proporcionar fragmentos que puedan someterse al análisis por MS. La mezcla compleja resultante de péptidos proteolíticos se purifica mediante cromatografía en columna por afinidad para extraer los sub-conjuntos marcados de péptidos. La muestra se analiza a continuación mediante una combinación de LC-MS, para proporcionar la información cuantitativa o la abundancia de proteínas en base a la abundancia relativa de los isótopos d0 y d8, y LC-MS-MS, para proporcionar la información cualitativa en base a la masa molecular del péptido y la información sobre la secuencia de aminoácidos.

La inapropiada co-elución de péptidos marcados con el reactivo de ICAT pesado frente a péptidos marcados con el ICAT ligero, y la mala recuperación de péptidos marcados capturados con etiqueta de afinidad condujo al desarrollo del reactivo de ICAT de segunda generación. Estos reactivos de ICAT están compuestos por i) un grupo reactivo con proteínas específico de tiol (yodoacetamida) capaz de marcar residuos de cisteína (Cys) de proteínas, ii) un resto enlazador que contiene un número definido de átomos de carbono (ligero) o isótopos de carbono (pesado) para un marcado diferencial de dos poblaciones de proteínas, iii) una etiqueta de afinidad, en su mayoría biotina, que permite el aislamiento selectivo de péptidos marcados, y iv) un sitio escindible mediante ácido que permite la eliminación de la parte de biotina de la etiqueta del reactivo de ICAT antes del análisis por MS y MS-MS. El grupo reactivo con proteínas une covalentemente la etiqueta de afinidad codificada por isótopo a la proteína mediante la alquilación de cisteínas libres. Dado que la técnica de ICAT se basa en el marcado del residuo o los residuos de cisteína de una proteína, las proteínas que no contienen una cisteína no serán detectadas con ICAT. Además, el residuo de cisteína debe estar ubicado en un péptido manejable; es decir, un péptido que es el resultado de la digestión proteolítica con un peso molecular (PM) de aproximadamente entre 600 y 3500 Da. Los péptidos fuera de este intervalo de PM no contendrán un número suficiente de aminoácidos para proporcionar la información cualitativa necesaria para la identificación de proteínas, o serán tan grandes que no podrán ser sometidos a fragmentación MS-MS mediante disociación activada mediante colisiones. Además, las etiquetas de ICAT a base de cisteína no proporcionarán información sobre los cambios en el proteoma en base a modificación post-traduccional, tal como fosforilación, a no ser que la modificación se produjera de forma fortuita en el péptido que contiene Cys.

Se han desarrollado diversos métodos alternativos para marcar de forma diferencial proteínas mediante procedimientos de marcado tanto químicos como metabólicos (Goshe y Smith, 2003, Curr Opin Biotechnol. 14(1): 101-9). Los métodos químicos se basan en modificaciones proteicas clásicas de péptidos individuales o digestos tripsínicos de proteínas. Por ejemplo, residuos de lisina (Lys) pueden marcarse en el extremo C terminal utilizando un derivado pesado de 2-metiloxi-1H-imidazol que contiene cuatro átomos de 2H (d4) (Peters y otros, 2001, Rapid Commun Mass Spectrom. 15(24): 2387-92). Los residuos de Lys también pueden marcarse mediante guanidinación diferencial utilizando O-metil-isourea en un procedimiento denominado marcado de abundancia codificado por masa (MCAT; Cagney y Emili. 2002. Nat Biotechnol. 20(2): 163-70). Los residuos de metionina (Met) pueden marcarse, por ejemplo, utilizando ésteres activados de (d0/d4)-ácido nicotínico (Shen y otros, 2003. Molec Cell Proteomics 2: 315-324). Los residuos de Cys pueden marcarse mediante alquilación diferencial utilizando N-(d0/d5)-etilyodoacetamida. Las aminas primarias de péptidos pueden marcarse de forma diferencial utilizando derivados de Nacetoxi-(d0/d3)-succinimida (Chakraborty y Regnier, 2002).

En general, sin embargo, los anteriores métodos de marcado requieren separación por 2DE o, en el caso de ICAT, purificación por cromatografía de afinidad, para reducir la complejidad de las mezclas antes del análisis por MS. iTRAQ e iPROT son tecnologías de marcado isobárico que no utilizan isótopos para cribado diferencial, sino isómeros diferentes de un reactivo de marcado.

Además, la química de marcado implicada carece de robustez, parcialmente debido a la inestabilidad del reactivo químico y sus propiedades de reactividad cruzada no deseadas, lo que conduce a heterogeneidad en los pares de señales obtenidos. Además, la cobertura promedio del proteoma humano es relativamente baja, por ejemplo solamente ≈85% para ICAT. Estos factores dificultan la utilización de métodos de marcado diferencial en investigación del proteoma, especialmente en el caso de aplicaciones de alto rendimiento (automatizadas).

Actualmente, existe una necesidad de procedimientos robustos para el marcado diferencial de péptidos que pueda soportar tanto análisis a gran escala en investigación del proteoma, como ensayos rutinarios (de diagnóstico). Es deseable, por lo tanto, que dichos procedimientos de marcado ofrezcan un marcado altamente específico de residuos de aminoácidos diana, alta cobertura del proteoma, y condiciones de marcado robustas. Además, el marcado no debe conducir a complejos espectros de masas, es decir, no deben marcarse demasiados residuos de aminoácidos. El marcado de los aminoácidos seleccionados puede realizarse preferentemente de forma saturada, la molécula marcada con un isótopo pesado debe tener, preferentemente, características cromatográficas idénticas a la molécula marcada con el ligero, por ejemplo el mismo tiempo de retención, la molécula marcada con el isótopo pesado debe tener, preferentemente, características de ionización idénticas a la molécula marcada con el ligero, y el marcado no debe interferir, idealmente, en la digestión enzimática de las proteínas.

Es deseable además que, después del marcado diferencial, los productos puedan separarse mediante medios alternativos a la cromatografía de afinidad antes de someterlos a espectrometría de masas. Una mejora deseada adicional respecto a la tecnología actual es la omisión de la etapa de purificación antes de la MS. En su lugar, sería ventajoso si la diferenciación entre moléculas marcadas y no marcadas pudiera realizarse durante la MS-MS.

Sorprendentemente, se ha descubierto que un método de marcado en el que se utiliza un complejo de metal de transición marcado según la presente invención cubre una o más de estas necesidades. Dicho método da como resultado, ventajosamente, un enlace entre la entidad y la marca que sobrevive al proceso de ionización de la espectrometría de masas.

Por consiguiente, la nueva categoría de complejos de metal de transición marcados según la presente invención puede utilizarse ventajosamente como etiquetas en métodos para el marcado diferencial de moléculas bio-orgánicas. Éstas constituyen mejoras respecto a los reactivos existentes para marcado por expresión diferencial y sortean los diversos problemas de los reactivos de la técnica anterior.

La presente invención también se refiere a un método para hacer a una entidad química o biológica distinguible mediante espectrometría de masas, comprendiendo dicho método la etapa de marcar de forma diferencial a dicha entidad, como mínimo, con un complejo de metal de transición marcado según la presente invención.

La presente invención se refiere además a la utilización de un complejo de metal de transición marcado, según la presente invención, para crear un cambio definido en el peso molecular de la entidad química o biológica, para facilitar el análisis por espectrometría de masas de dicha entidad o una muestra que comprende dicha entidad.

La creación de un cambio definido en la masa molecular de una entidad química o biológica después de la unión de un complejo de metal de transición marcado resultará finalmente de la unión del complejo de metal de transición marcado a ésta. Por lo tanto, dicho cambio coincidirá esencialmente con una carga en la masa de la entidad que es proporcional a la masa del complejo de metal de transición marcado menos la masa de la parte saliente de un grupo saliente. Dicho cambio de masa puede determinarse mediante análisis por espectrometría de masas.

La presente invención también se refiere a un método para hacer a entidades químicas o biológicas distinguibles mediante espectrometría de masas según la presente invención, comprende el marcado diferencial de dichas entidades, como mínimo, con un complejo de metal de transición marcado, en el que complejos de metal de transición marcados adecuados son aquellos tal como se han descrito anteriormente en el presente documento. La utilización en el presente documento de dos complejos de metal de transición marcados diferentes, teniendo cada uno su propia especificidad de marcado, permite la posibilidad de marcar de forma diferencial diferentes entidades dentro de una muestra.

Otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el análisis por espectrometría de masas de una entidad química o biológica, comprendiendo dicho método las etapas de marcar de forma diferencial a dicha entidad, como mínimo, con un complejo de metal de transición marcado según la presente invención y analizar dicha entidad mediante espectrometría de masas.

En realizaciones preferentes de métodos de la presente invención, dichas entidades químicas o biológicas proceden de diferentes muestras.

Aún en otras realizaciones preferentes de métodos de la presente invención, dicha etapa de marcar de forma diferencial dichas entidades se realiza, como mínimo, con dos complejos de metal de transición marcados según la presente invención, en la que dichos complejos de metal de transición marcados son de diferente masa molecular, siendo dicha diferencia de masa molecular ≥ 1 Da.

En realizaciones preferentes de métodos de la presente invención, dichos complejos de metal de transición marcados muestran las mismas características de marcado, las mismas propiedades en cromatografía de líquidos (LC), por ejemplo la misma hidrofobicidad o hidrofilia, y el mismo estado de oxidación del metal.

Aún en otras realizaciones preferentes de métodos de la presente invención, complejos de metal de transición marcados que contienen un espaciador son adecuados en barrido del ión padre o barrido de pérdidas neutras en espectrometría de masas.

Aún en otras realizaciones preferentes de métodos de la presente invención, la huella molecular del isótopo del metal de transición puede utilizarse como herramienta de identificación de entidades marcadas.

La diferencia de masa molecular entre dichos complejos de metal de transición marcados puede deberse a la presencia o ausencia de isótopos, átomos, grupos de átomos, moléculas, o grupos de moléculas específicos en cualquier parte de los complejos de metal de transición, o ligandos, espaciadores, restos reactivos y/o marcadores unidos a ellos.

En realizaciones preferentes de la presente invención, dicha diferencia de masa molecular entre dichos complejos de metal de transición marcados se debe a la presencia de diferentes isótopos estables en dichos complejos, por ejemplo en los que un primer complejo de metal de transición marcado comprende un isótopo ligero y, como mínimo, un segundo complejo de metal de transición marcado comprende un isótopo pesado.

Los isótopos estables que causan la diferencia de masa molecular pueden estar comprendidos en cualquier parte de los complejos de metal de transición marcados. Están contenidos de forma adecuada en el resto tridentado inerte o unidos al resto tridentado por medio de un espaciador.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un conjunto de dichos, como mínimo, dos complejos de metal de transición marcados de diferente masa molecular.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un kit de partes que comprende un conjunto de, como mínimo, dos complejos de metal de transición marcados de diferente masa molecular. Preferentemente, la diferencia en masa molecular resulta de la presencia de, como mínimo, un isótopo estable diferente entre dichos complejos de metal de transición.

Una “entidad química o biológica” tal como se utiliza en el presente documento debe interpretarse como algo que comprende uno o más sitios reactivos que contienen azufre, oxígeno, fósforo y/o nitrógeno, incluyendo entidades que han sido modificadas para contener dichos sitios reactivos (por ejemplo mediante incorporación de residuos de serina, treonina o tirosina).

“Entidad” se refiere además a un microorganismo, un virus o un prión, o a un material que comprende uno o más de dichos tipos reactivos con azufre, reactivos con fósforo, reactivos con oxígeno o reactivos con nitrógeno de sitios reactivos, o un producto hecho del mismo, tal como una micromatriz, una placa de microvaloración, una tira de ensayo o un tubo de ensayo. En particular, una entidad se refiere a un compuesto inorgánico u orgánico, incluyendo un compuesto bio-orgánico.

Una “molécula bio-orgánica” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una molécula biológica que contiene carbono. Además, una molécula bio-orgánica se refiere a un compuesto capaz de inducir o afectar a una acción en un sistema biológico, por ejemplo induciendo o afectando a un efecto terapéutico o profiláctico, una respuesta inmune, un proceso metabólico, etc.

El término “marcado” se utiliza en el presente documento para referirse al proceso de acoplar/unir el complejo de metal de transición marcado a una entidad.

La expresión “marcado diferencial” se utiliza en el presente documento para referirse a la reacción de marcado que da como resultado una distribución desigual del marcador entre sitios reactivos, entre entidades o entre muestras. El marcado diferencial puede dar como resultado una entidad que tiene diferentes marcadores en sitios reactivos distintos, por ejemplo una entidad que tiene sus sitios reactivos de P, O, S y N marcados de forma diferencial. El marcado diferencial también puede dar como resultado entidades idénticas de una muestra que tienen diferentes marcadores o que tienen diferentes densidades de marcadores, por ejemplo una muestra puede tener proteínas idénticas que están marcadas de forma diferencial. Además, el marcado diferencial puede dar como resultado entidades idénticas de dos muestras que tienen diferentes marcadores o que tienen diferentes densidades de marcador. Dicho tipo de marcado diferencial es muy adecuado para el análisis comparativo de proteomas, genomas,

o metabolitos entre células.

Un “marcador”, “etiqueta” o “marca”, tal como se utilizan de forma sinónima en el presente documento, puede ser cualquier resto que puede unirse a la entidad mediante el complejo de metal de transición, y que puede utilizarse para detectar, monitorizar o visualizar la entidad.

Un “residuo” de un compuesto tal como se utiliza en el presente documento debe interpretarse como el propio compuesto o como parte de una entidad mayor, por ejemplo un residuo de aminoácido en una proteína.

Un “isótopo estable diferente” se define en el presente documento como un isótopo alternativo de un átomo que es estable y no es el isótopo de dicho átomo que es el más abundante en la naturaleza. En el caso de C (carbono) 13C (1,07%) sería un isótopo estable diferente, en oposición al que se encuentra normalmente 12C (98,93%). En el caso en que el metal de transición es, por ejemplo, Pt (platino), 192Pt (0,79%), 194Pt (32,9%), 196Pt (25,3%) y 198Pt (7,2%) son isótopos estables diferentes en oposición al que se encuentra normalmente y 195Pt (33,8%).

Una entidad unida al complejo de metal de transición marcado puede denominarse como un aducto de Me-S (cuando se une a un sitio activo que contiene azufre), a un aducto Me-N (cuando se una a un sitio activo que contiene nitrógeno), o en general a un aducto de Me.

Un sitio reactivo que contiene azufre puede denominarse en lo sucesivo en el presente documento como un sitio reactivo de S, y un sitio reactivo que contiene nitrógeno puede denominarse en lo sucesivo en el presente documento como sitio reactivo de N. Del mismo modo, un sitio reactivo que contiene oxígeno puede denominarse como un sitio reactivo de O, y un sitio reactivo que contiene fósforo puede denominarse como sitio reactivo de P.

Se conoce bien en la técnica que una entidad química o biológica puede marcarse con un marcador detectable para identificar, detectar, visualizar, separar, purificar, aislar, cuantificar o monitorizar la entidad, por ejemplo en investigación o diagnóstico químico, biológico o médico. En la técnica se conocen una gran diversidad de métodos de marcado (para una revisión, véase Hermanson, 1996, Bioconjugate techniques, Academic Press, ISBN 0-12-342335-X). Muchos factores pueden desempeñar un papel en la elección de un marcador detectable particular y un método particular de marcado. Dichos factores incluyen la naturaleza de la entidad, las condiciones de la reacción de marcado, la sensibilidad durante la reacción de marcado, la especificidad hacia la entidad y los límites de detección de la entidad marcada.

La reactividad de los complejos de metal de transición marcados hacia diversos sitios reactivos es beneficiosa en muchas aplicaciones, dado que puede permitir reacciones de marcado rápidas y una excelente sensibilidad hacia una amplia diversidad de entidades.

Los inventores de la presente invención han descubierto que una ventaja particular de la utilización de complejos de metal de transición marcados, como enlazadores en reacciones de marcado respecto a enlazadores tales como Nhidroxisuccinimida (NHS) y maleimida es que los complejos de metal de transición marcados según la presente invención son aplicables de forma rutinaria en aplicaciones de espectrometría de masas. Además, la composición y proporción específicas entre el átomo del metal de transición más abundante y sus diferentes isótopos estables puede proporcionar una herramienta definida en la identificación de entidades marcadas en espectrometría de masas. Una ventaja adicional de la utilización de los presentes complejos de metal de transición marcados en reacciones de marcado es que, dependiendo de los restos reactivos utilizados, dichos complejos pueden soportar el marcado de una amplia diversidad de entidades químicas.

Otra ventaja es que las proteínas pueden marcarse mediante un complejo de metal de transición marcado adecuado en residuos histidina (His), metionina (Met) y/o cisteína (Cys). Esto proporciona la posibilidad de marcar más grupos laterales en una cadena peptídica y, de este modo, conseguir mayores densidades de marcado. Esto también puede permitir el marcado de residuos de aminoácidos adicionales en una cadena peptídica.

No todas las proteínas y/o péptidos biológicos comprenden cisteína, y el marcado de cisteína permitirá la detección de solamente el 85% de las proteínas en el proteoma. La posibilidad de marcar residuos de metionina permitirá la detección del 97% de las proteínas en el proteoma. En combinación, la utilización de los complejos de marcado de la presente invención proporciona ahora una cobertura del proteoma del 98,35%. Por lo tanto, la posibilidad de seleccionar nuevos aminoácidos diana representa un importante avance en la investigación del proteoma.

Además, la especificidad de la reacción de marcado con los complejos de metal de transición marcados según la presente invención puede controlarse, tal como para discriminar entre marcado de sitios reactivos que contienen azufre y sitios reactivos que contienen nitrógeno en una entidad química o biológica. Por lo tanto, al utilizar los complejos de metal de transición marcados según la presente invención, puede dirigirse el marcado de una entidad hacia un sitio reactivo especificado dentro de una entidad o grupo de entidades que comprenden juntas diversos sitios reactivos.

En una realización de una utilización de un complejo de metal de transición marcado según la presente invención, las entidades químicas o biológicas en una muestra pueden marcarse de forma diferencial según un método descrito en la solicitud de patente europea 1 262 778.

En una realización preferente, la utilización de un complejo de metal de transición marcado según la presente invención comprende el marcado diferencial de entidades químicas o biológicas presentes en dos muestras diferentes cuya composición se va a comparar. Una utilización preferente incluye la medición del perfil de expresión de proteínas, o proteoma en una muestra de ensayo, para comparar los resultados de la misma con resultados correspondientes de una muestra de referencia.

Otra ventaja más de la utilización de complejos de metal de transición marcados en procedimientos de marcado diferencial de proteínas, es que no existe interferencia con la posterior digestión con tripsina. Esto es especialmente ventajoso en procedimientos de marcado de proteomas celulares que están sometidos a digestión con tripsina para proporcionar péptidos de longitud adecuada para análisis por MS.

Aparte de la posibilidad de marcar entidades procedentes de una muestra, es decir, dichas entidades que se producen como una mezcla, las entidades químicas o biológicas también pueden proceder de diferentes muestras. El marcado diferencial puede comprender, por ejemplo, el marcado de entidades en una muestra de ensayo, sin marcar las entidades en la muestra de referencia o viceversa. Entidades idénticas presentes en ambas muestras se vuelven entonces distinguibles mediante espectrometría de masas como resultado del cambio definido en la masa molecular de las entidades en la muestra de ensayo. Como alternativa, el marcado diferencial también puede comprender el marcado de entidades en ambas muestras. En dichos casos, hacer a dichas entidades distinguibles mediante espectrometría de masas implicará el marcado de forma diferencial de dichas entidades, como mínimo, con dos complejos de metal de transición marcados de diferente masa molecular.

Un método para el marcado diferencial puede realizarse en una amplia diversidad de solución tamponada y en un amplio intervalo de pH. Las soluciones tamponadas adecuadas incluyen todos los tampones utilizados habitualmente tales como TRIS/Glicina y tampones de fosfato. Detergentes tales como Tween-20, Triton X-100 o SDS pueden estar presentes en la mezcla de marcado. La presencia de sales, tales como sales de sodio, potasio o amonio de cloruro, nitrato, sulfato o fosfato, a concentraciones a las cuales se utilizan habitualmente, apenas afecta a la reacción de marcado. Los tampones preferentes para el marcado en MS son aquellos que no dejan trazas residuales después de la evaporación, por ejemplo tampones que contienen acetato de amonio y similares.

Los parámetros de reacción para la reacción de marcado diferencial también pueden seleccionarse de modo que una entidad se marque de forma diferencial e incluyen la elección de un valor de pH específico. El pH, tal como se utiliza en el presente documento, debe interpretarse como el valor de pH de una solución en agua a 20ºC. En general, la formación de aductos de Me-S es independiente del pH, mientras que la formación de aductos de Me-N es dependiente del pH. En una realización preferente, uno o más sitios reactivos de S se marcan de forma selectiva respecto a uno o más sitios que contienen nitrógeno utilizando el pH.

Como directriz, puede seleccionarse el pH de la reacción de marcado a un pH por debajo del pKa más bajo de cualquiera de los sitios reactivos de N de la entidad que no deben marcarse, permitiendo el marcado diferencial de uno o más sitios reactivos de S. Cómo entenderá el experto en la materia, otros factores, además del pKa, pueden desempeñar un papel, incluyendo la influencia del micro-entorno en las proximidades de una entidad que se va a marcar. En general, los sitios reactivos de S se marcan de forma diferencial respecto a sitios reactivos de N a pH ácido.

En teoría, la formación de un aducto de Me-S es un proceso de una etapa. Un grupo reactivo sale del complejo de platino después de que S done un par de electrones al platino. Se cree que este proceso, la conversión directa de Me-X en Me-S, es independiente del pH. Por otro lado, los donadores de N requieren la sustitución de un grupo reactivo del complejo de platino por oxígeno antes de la sustitución de N. En primer lugar, Me-X se convierte en Me-O y Me-N eventual. Éste es un esquema de dos etapas, en el que la primera etapa puede controlarse cambiando el pH. Los factores que influyen en el pH de una solución pueden interferir, por lo tanto, en la formación de un aducto de Me-N.

La presencia de iones también puede utilizarse para controlar la selectividad del complejo de metal de transición por sitios reactivos de N. En una realización, uno o más ligandos salientes, preferentemente restos aniónicos, se utilizan en la inhibición del marcado de un complejo de metal de transición marcado en un sitio reactivo de N, para aumentar el marcado diferenciado de un sitio reactivo de S. Los ejemplos preferentes de dichos ligandos salientes incluyen Cl -, NO3-, HCO3-, CO32-, SO32-, ZSO3-, I -, Br -, F -, acetato, carboxilato, fosfato, nitrato de etilo, oxalato, citrato, un fosfonato, ZO -, y agua. Z se define en el presente documento como un resto de hidrógeno o un grupo alquilo o arilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Se han conseguido resultados particularmente buenos utilizando sales que comprenden un resto aniónico, de las cuales el cloruro es particularmente preferente. Los contraiones son preferentemente cationes alcalinos, cationes alcalinotérreos o cationes utilizados también para dirigir el marcado. En una realización preferente, la fuerza iónica total de dichos restos aniónicos utilizados en la inhibición del marcado a un sitio reactivo de N es, como mínimo, de 0,1 mol/l. Más preferentemente, la fuera iónica total está en el intervalo de 0,1 a 0,5 mol/l.

La presencia de iones de metales de transición, también puede utilizarse para la selección del sitio reactivo a marcar. En particular, se ha descubierto que dichos iones son adecuados para impedir o ralentizar el marcado de un sitio reactivo de S o para hacer lábil a un aducto de Me-S marcado, de modo que uno o más sitios reactivos de N se marquen eficazmente de forma diferencial respecto a dicho sitio reactivo de S. Esta forma de marcado diferencial de entidades o muestras puede tener ventajas específicas cuando solamente se va a analizar un subconjunto de entidades.

Además de los parámetros tal como se han mencionado anteriormente, un método según la presente invención puede ajustarse finamente adicionalmente mediante parámetros tales como temperatura, que varía preferentemente en el intervalo entre 0ºC y 120ºC, más preferentemente en el intervalo entre 20ºC y 70ºC; tiempo de reacción, habitualmente en el intervalo entre 1 minuto y 48 horas, preferentemente en el intervalo entre 10 minutos y 24 horas, más preferentemente en el intervalo entre 25 minutos y 15 horas; concentración de los reactivos, proporción molar de los reactivos, carga neta global del complejo de metal de transición marcado, y similares. Estos parámetros pueden ajustarse dependiendo de la aplicación particular de cualquier manera conocida en la técnica. La carga neta global del complejo de metal de transición marcado, por ejemplo, afecta a la especificidad de formación de aducto de Me-N en histidina a pH neutro. Los complejos de Me neutros, tales como complejos de metal de transición de fluoresceína y cianina, forman aductos de Me-N mientras que complejos marcados de metal de transición cargados positivamente, por ejemplo complejos de rodamina y dinitrofenol con Me, no son o son menos eficaces. Los complejos de metal de transición marcados cargados positivamente muestran marcado diferencial hacia aductos de N por encima del punto isoeléctrico del péptido, proteína, y similares. Aparte de permitir el marcado selectivo de sitios reactivos de N respecto a sitios reactivos de S o viceversa, un método según la presente invención también hace posible diferenciar entre distintos sitios reactivos de N o distintos sitios reactivos de S, seleccionando las condiciones correctas, tal como se describe en la solicitud de patente europea 1 262 778.

Las instrucciones anteriores para el marcado diferencial de una única entidad también pueden emplearse para obtener el marcado requerido u óptimo para el marcado diferencial de diferentes compuestos, y de compuestos de diferente origen.

Un método para el análisis por espectrometría de masas de las entidades químicas o biológicas según la presente invención debe hacer, en primer lugar, a dichas entidades distinguibles mediante MS y, por lo tanto, implica una primera etapa de marcado de forma diferencial de las entidades, como mínimo, con un complejo de metal de transición marcado tal como se ha descrito anteriormente. Además, dicho método implica la etapa de analizar la masa molecular de dichas entidades mediante espectrometría de masas. El experto en la materia está al corriente de las diversas posibilidades de la detección por MS.

Antes de la detección por MS, entidades de diferentes muestras pueden mezclarse opcionalmente y la mezcla someterse a análisis por MS. La ventaja de mezclar entidades o muestras marcadas de forma diferencial antes del análisis por MS es que las condiciones de MS son iguales para todas las entidades ensayadas y el cambio de la masa molecular puede discernirse fácilmente.

Además, antes de la detección por MS, las entidades marcadas pueden purificarse a partir de entidades no marcadas mediante, por ejemplo, aislamiento por afinidad de los materiales marcados por afinidad, o particularmente en métodos de la presente invención mediante cromatografía de intercambio iónico, o utilizando marcadores fluorescentes en combinación con clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Además, los complejos de metal de transición marcados de la presente invención ofrecen la oportunidad de separar entidades marcadas (de forma diferencial) durante MS-MS sin purificación anterior.

En los métodos que implican la comparación de muestras, es preferente, por lo tanto, que ambas muestras se marquen con complejos de metal de transición marcados de diferente masa molecular para permitir que se realice una etapa de purificación en ambas de dichas muestras. De esta manera, el sesgo de purificación es igual para ambas muestras. Como marca de afinidad, puede utilizarse cualquier marca capaz de unirse a un reactivo de captura. En realizaciones preferentes de la presente invención, la marca de afinidad es una biotina, o dinitrofenol (DNP), fluoresceína o colorante Dyomics 647 y el reactivo de captura preferente es una estreptavidina o avidina, anti-DNP, anti-fluoresceína, y anti-Dyomics 647, respectivamente. Después del aislamiento por afinidad de materiales marcados por afinidad, algunos de los cuales pueden estar marcados isotópicamente, la interacción entre la marca de afinidad y el reactivo de captura se altera o se rompe para permitir el análisis por MS de los materiales aislados. La marca de afinidad puede desplazarse desde el reactivo de captura mediante adición de ligando de desplazamiento, que puede ser una marca de afinidad libre o un derivado de dicha marca de afinidad, o cambiando el disolvente (por ejemplo, tipo de disolvente o pH del mismo) o las condiciones de temperatura, el complejo de enlazado puede escindirse química, enzimática, térmica o fotoquímicamente para liberar los materiales aislados para análisis por MS.

Antes de la detección por MS, las entidades marcadas se separan para permitir la detección de especies preseleccionadas de moléculas. La separación por anticipado, por ejemplo mediante cromatografía de líquidos (LC)

o cromatografía de gases (GC), permitirá el análisis por MS de una mezcla compleja de proteínas. El experto en la materia será capaz de determinar procedimientos de separación requeridos u óptimos para la aplicación específica.

Un método para el análisis por espectrometría de masas de las entidades químicas o biológicas puede comprender el análisis comparativo de una muestra de ensayo y una muestra de referencia. Cuando, después del marcado diferencial, las dos muestras se mezclan y la mezcla se somete a separación cromatográfica seguida de análisis por espectrometría de masas, las entidades marcadas con el complejo de metal de transición marcado mostrarán un cambio de masa molecular predecible en comparación con las entidades no marcadas. Como tal, dicho método de la presente invención permite el análisis comparativo por espectrometría de masas de las entidades químicas o biológicas entre muestras.

Para distinguir entidades de una muestra de ensayo de entidades de una muestra de referencia en base a su masa molecular, dicho método también puede comprender la provisión, como mínimo, de dos complejos de metal de transición marcados de diferente masa molecular y el marcado diferencial de dichas entidades entre dichas muestras. En otras palabras, las entidades de la muestra de ensayo se marcan con un complejo de metal de transición marcado de una primera masa molecular, y las entidades de la muestra de referencia se marcan con un complejo de metal de transición marcado de un segundo peso molecular. Dependiendo de la resolución requerida, una diferencia de masa molecular entre los complejos de metal de transición marcados de 1 Da puede ser suficiente. Ventajosamente, la diferencia de peso molecular entre los complejos de metal de transición marcados en dicho conjunto es mayor de 2, más ventajosamente mayor de 4, preferentemente mayor de 6, más preferentemente mayor de 8, y aún más preferente mayor de 10 Da.

El objetivo de los dos complejos de metal de transición marcados con diferente masa molecular es generar pares o conjuntos de reactivos que son de forma sustancial químicamente idénticos, pero que son distinguibles por masa.

La diferencia de masa molecular puede provocarse sustituyendo átomos o ligandos de los complejos de metal de transición por átomos o ligandos de mayor o menor masa molecular. Los ligandos que alteran la masa adecuados incluyen grupos alifáticos, carbohidratos, funciones alcohol, y halógenos tales como, por ejemplo, F, Cl y Br.

La diferencia de masa molecular también puede provocarse sustituyendo átomos de los complejos de metal de transición por isótopos estables alternativos. Para ello, los complejos de metal de transición pueden marcarse isotópicamente de forma diferencial, por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más átomos en los complejos por un isótopo estable de los mismos. Por ejemplo, pueden sustituirse hidrógenos por deuterios, 12C por 13C, 14N por 15N, 195Pt por 192Pt, 194Pt, 196Pt o 198Pt, 16O por 18O, etc. Además los átomos de P o S presentes en el complejo pueden sustituirse. En realizaciones preferentes, se utiliza 1H y 2H, o 12C y 13C, o 14N y 15N, u 16O y 18O, o combinaciones de los mismos. Además, la utilización de la mezcla de isótopos de metales de transición, por ejemplo isótopos de Pt, proporcionará un patrón único de distribución de masas, haciendo más fácil la distinción de entidades marcadas.

En otra realización alternativa más, el marcador unido al complejo de metal de transición puede proporcionar ese

5

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50

complejo con una diferencia de masa molecular mediante maneras descritas anteriormente. Como tal, la diferencia de masa molecular puede atribuirse a (la presencia de) el marcador. En una realización preferente, la complejidad se reduce utilizando platino monoisotópico y ligando o ligandos marcados con 15N, 13C y/o D.

La presente invención se refiere a un conjunto de, como mínimo, dos complejos de metal de transición de diferente masa molecular tal como se ha descrito anteriormente. Dicho conjunto puede utilizarse para análisis cualitativos y particularmente cuantitativos de perfiles de expresión de proteínas globales en células y tejidos.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un complejo de metal de transición que comprende, como mínimo, un isótopo estable diferente tal como se ha descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere a una entidad química o biológica marcada con el complejo de metal de transición marcado que comprende, como mínimo, un isótopo estable diferente. Preferentemente, dicha entidad es un aminoácido, péptido o proteína.

Los complejos de transición según la presente invención son muy adecuados para cuantificación (absoluta). Éste es un método para determinar las cantidades absolutas de entidades en una única muestra utilizando patrones de entidad internos. El enfoque de dichos métodos está sobre una entidad específica de interés, o su estado de modificación. El método no requiere que la entidad esté marcada, sin embargo requiere que se preparen patrones internos específicos antes del análisis por espectrometría de masas. Los patrones internos adecuados son entidades con características similares, si no idénticas, a la entidad que se está investigando.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un kit de partes que comprende un conjunto de dichos, como mínimo, dos complejos de metal de transición de diferente masa molecular. Preferentemente, la diferencia de masa molecular resulta de la presencia de diferentes isótopos estables en dichos complejos de metal de transición. El kit de partes puede comprender además instrucciones de reacción, una o más muestras de ensayo, uno o más reactivos diferentes, uno o más tubos o tiras de ensayo y similares, y una o más preparaciones seleccionadas entre el grupo formado por tampones, preparaciones de marcador y preparaciones para ajustar la fuerza iónica. Dicho kit es muy adecuado para emplear un método según la presente invención.

La presente invención da a conocer reactivos analíticos y métodos basados en espectrometría de masas que utilizan estos reactivos para el análisis rápido y cuantitativo de proteínas o la función de proteínas en mezclas de proteínas. El método analítico puede utilizarse para análisis cualitativo y particularmente cuantitativo de perfiles de expresión de proteínas globales en células y tejidos, es decir, el análisis cuantitativo de proteomas. El método también puede emplearse para cribar e identificar proteínas cuyo nivel de expresión en células, tejido o fluidos biológicos está afectado por un estímulo (por ejemplo, administración de un fármaco o contacto con un material potencialmente tóxico), mediante un cambio en el entorno (por ejemplo, nivel de nutrientes, temperatura, paso del tiempo) o mediante un cambio de la afección o estado celular (por ejemplo, estado de enfermedad, tumor, mutación dirigida, inactivaciones de genes) de la célula, tejido u organismo a partir del cual se originó la muestra. Las proteínas identificadas en dicho cribado pueden funcionar como marcadores para el estado cargado. Por ejemplo, las comparaciones de perfiles de expresión de proteínas de células normales y tumorales pueden dar como resultado la identificación de proteínas cuya presencia o ausencia es característica y diagnóstica del tumor.

La presente invención se ilustrará a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

I. Preparación de ligandos tridentados y complejación del metal de transición

Se describen ligandos del siguiente tipo, su complejación con K2PtCl4, y la posterior desprotección de BOC del complejo resultante para reacción con ésteres de NHS y la incorporación de un marcador.

imagen1

donde 1 imagen2 6, m= 2ó 3, yn = 3 ó 2si m imagen3 2

13

Síntesis de 2 (figura 5: esquema 1) (los números en negrita indican los compuestos tal como se muestran en las figuras y esquemas a los que se refieren, por ejemplo en el presente ejemplo a los de la figura 5: esquema 1)

Se disolvió 1, N-Boc-hexano-1,6-diamina, (140,5 mg, 649,5 µmoles) en una mezcla de H2O/EtOH 1/1 (20 ml). Se añadió acrilonitrilo (425,5 µl, 6,495 mmoles) a la solución resultante. La mezcla se llevó a reflujo durante una noche a 60ºC y se llevó a sequedad para dar un material marrón pálido puro y oleoso. Los residuos se disolvieron en CH2Cl2 y se secaron sobre MgSO4. Se obtuvo 2 después de la filtración y la eliminación de los disolventes a presión reducida. (Rendimiento: 166,8 mg, 95%). 1H RMN (CDCl3): δ 1,35 (4H, m, NH(CH2)2(CH2)2); 1,43 (13H, m, NH(CH2)(CH2)CH2)2(CH2) + tBu); 2,60 (6H, m, NH(CH2)(CH2)5 + (CH2)(CH2)CN); 2,94 (4H, m, CH2CN); 3,1 (2H, m, (CH2)NHBoc); 4,55 (1H, pico ancho, NHBoc).

Síntesis de 3 (figura 5: esquema 1)

Se disolvió 2 (153,0 mg, 474,5 µmoles) en CH2Cl2 (20 ml). Después de agitar la solución a 0ºC durante 30 minutos, se añadió una solución de LiAlH4 en Et2O (1 M, 2,9 ml, 2900 µmoles) gota a gota. La mezcla se agitó a 0ºC durante 90 minutos y se dejó que alcanzara temperatura ambiente. El exceso de LiAlH4 se destruyó cuidadosamente mediante la adición de 4 ml de agua gota a gota. Las sales de Li se eliminaron por filtración, y se lavaron con agua (10 ml) y CH2Cl2 (10 ml). La capa acuosa se separó y se extrajo con CH2Cl2 (3 x 10 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre MgSO4 y se llevaron a sequedad a presión reducida para dar 3 como un aceite

1H

incoloro (rendimiento: 99,3 mg, 63%). RMN (CDCl3): δ 1,23 (4H, m, NH(CH2)2(CH2)2); 1,38 (13H, m, NH(CH2)(CH2)CH2)2(CH2) + tBu); 1,52 (4H, m, (CH2)(CH2)NH2); 2,32 (2H, m, N(CH2)(CH2)5); 2,44 (4H, m, N(CH2)(CH2)2NH2); 2,74 (4H, m, CH2NH2); 3,02 (2H, m, (CH2)NHBoc); 3,30 (4H, pico ancho, NH2); 4,72 (1H, pico ancho, NHBoc).

Síntesis de 6 (figura 7: esquema 3)

Una solución de 165 µl (233,97 mg, 2,072 mmoles) de cloruro de cloroacetilo en 70 ml de CH2Cl2 se añadió a una velocidad de 5 gotas por segundo y a temperatura ambiente a una mezcla de 198,50 µl (211,60 mg, 2,071 mmoles) de N-acetiletilendiamina, 140 ml de CH2Cl2 y 2071,6 µl (80,77 mg, 2,072 mmoles) de una solución 1 M de NaOH en agua. Después de que se completara la adición, la mezcla resultante se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Los disolventes se eliminaron a presión reducida. Los sólidos se lavaron con MeOH y las sales de NaCl se separaron mediante centrifugado. Los extractos de MeOH transparentes se llevaron a continuación a sequedad a presión reducida y las etapas de lavado con MeOH y centrifugado se repitieron hasta que no podía separarse NaCl. Los extractos de MeOH se llevaron a sequedad a presión reducida, lo que produjo 6.

Síntesis de 7 (figura 7: esquema 3)

Una solución de 6 (1 mmol por 17 ml) en MeCN se añadió a una velocidad de 5 gotas por segundo y a 75ºC (condensador de reflujo introducido en la parte superior del matraz en el que se añade la solución de 6) a una mezcla que contenía 3 (con respecto al número de moles de 6) equivalentes de K2CO3, 1 equivalente molar (con respecto al número de moles de 6) de KI y 1 equivalente molar (con respecto al número de moles de 6) de 1, N-Bochexano-1,6-diamina en MeCN (1 mmol de 1 por 34 ml). Después de que la adición se completó, se dejó la mezcla a reflujo durante una noche. Los disolventes se eliminaron a continuación a presión reducida. Los sólidos se lavaron con CH2Cl2 y las sales de K+ se filtraron. Los extractos de CH2Cl2 se llevaron a sequedad a presión reducida, lo que produjo 7.

Síntesis de 8 (figura 7: esquema 3)

El procedimiento descrito para la preparación de 3 se repitió utilizando 7 en lugar de 3, lo que produjo 7.

Protocolo general para la complejación de ligandos tridentados de Boc (3 en el esquema 2 (figura 6) y 8 en el esquema 4 (figura 8)) con K2PtCl4

Se añadieron K2PtCl4 y 1 equivalente molar de L, donde L es el ligando tridentado utilizado, a DMF (4,69 x 10-6 moles de K2PtCl4 por ml). La mezcla se calentó a continuación a 40ºC durante una noche, durante la cual las sales de K2PtCl4 rojas se disolvieron. La solución se llevó a sequedad y las sales de K+ se lavaron con agua. Los sólidos insolubles se filtraron y se lavaron con Et2O antes de secarlos a presión reducida.

4: 195Pt RMN (MeOD): δPt -2520 ppm. MS (EI+): m/z 561 [M-Cl]+

Protocolo general para la desprotección de Boc y la posterior incorporación de un marcador en complejos de Pt

Se disolvieron 126 µmoles de [Pt(L)Cl]Cl en HCl 200 mM (3 ml). La solución resultante se agitó a continuación a 50ºC durante una noche. El pH se llevó a 8 mediante la adición de NaOH 1 M. A continuación se añadió tampón de acoplamiento a succinimida 5x (2 ml) a la solución. El éster succinimídico de NHS (63 µmoles) en DMF (5 ml) se añadió posteriormente gota a gota. La solución resultante se agita durante una noche a temperatura ambiente protegida de la luz. La especie disuelta a una concentración de 1 mg/ml se purifica a continuación a través de una columna Sephadex (G15) y se obtiene al eliminar los disolventes a presión reducida.

5 4 después de la desprotección de Boc: 195Pt RMN (MeOD): δPt -2512 ppm. MS (EI+): m/z 461 [M-Cl]+

II. Complejación de K2PtCl4 con dietilentriamina

La dietilentriamina está disponible en el mercado (Aldrich, nº de cat. D9.385-6). Se disolvió K2PtCl4 (1 g) en milli-Q

10 (25 ml). Los pequeños cristales amarillos y el material gris que no se había disuelto se filtraron. Se añadió dietilentriamina (0,5 ml) a la solución roja transparente resultante. El pH se ajustó a 3 utilizando una solución de HCl en agua (6 M). La solución se llevó a reflujo durante 6,5 horas. Después de 2 horas de reacción, el pH se ajustó a 4 utilizando soluciones de NaOH en agua (1 y 5 M). Se dejó enfriar a la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante una noche. El pH se acidificó a continuación a 1 utilizando una solución de HCl en agua (6 M). La mezcla de

15 reacción se introdujo a continuación en el congelador (-20ºC) durante 72 horas. Se formaron cristales blancos que se filtraron. El pH del filtrado se llevó a 6, parte del disolvente se evaporó y la solución resultante se enfrió en un baño de hielo. Esto produjo un segundo conjunto de cristales que se filtraron. 195Pt RMN (D2O): δPt -2722 ppm.

III. Preparación de complejos de APET (no forma parte de la presente invención)

20 -Preparación del éter 4'-aminopentílico-2,2':6',2" terpiridina (2)

imagen1

A una suspensión agitada de 986 mg (17,6 mmoles, 4,7 eq) de KOH en polvo en DMSO seco (20 ml) a 80ºC, se le añadieron 385,8 mg de 5-amino pentanol (3,74 mmoles, 1 eq). Después de la adición del alcohol, la solución viró de

25 naranja a marrón. Después de 30 minutos, se añadió 1 g de 4'-cloro-2,2':6',2" terpiridina (3,74 mmoles, 1 eq). Después de 4 horas para 2 y 18 horas 30 minutos para 3 de agitación a 80ºC, la solución se vertió en 200 ml de Milli Q fría. La capa acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3 x 20 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron mediante un evaporador rotatorio. El rendimiento del producto era de 908,4 mg de partículas amarillas (73%).

30 1H RMN (CDCl3)

δ 1,3 [pico ancho, 2H, CH2], 1,9 [pico ancho, 2H, CH2], 2,2 [pico ancho, 2H, CH2], 2,5 [pico ancho, 2H, CH2], 2,6 [pico ancho, 2H, NH2], 3,6 [t, 2H, CH2], 6,8 [dd, 2H, H4,4"], 7,3 [t, 2H, H5,5"], 7,42 [s, 2H, H3',5'], 7,9 [dd, 2H, H3,3"], 8,1 [d, 2H,

35 H6,6"].

13C RMN (CDCl3)

δ 23,5 [CH2], 29,09 [CH2], 33,4 [CH2], 42 [CH2-NH2], 68,4 [CH2-O], 107,5 [CH, C3',5'], 121,5 [CH, C5,5"], 124,3 [CH, 40 C3,3"], 137,2 [CH, C4,4"], 149,3 [CH, C6,6"], 156,03 [C, C2,2"], 157,1 [C, C2',6'], 167,3 [C, C4'].

Absorción de luz UV/Visible (CHCl3)

-1)

λmax 245 nm (ε 16500 M-1 .cm

-1)

45 279nm(ε 16500 M-1 .cm

-Preparación del éter de 4'-polietilenglicol-2,2':6',2" terpiridina (3)

imagen1

A una suspensión agitada se añadieron 98,6 mg de KOH en polvo (1,76 mmoles, 4,7 eq) en DMSO seco (20 ml) a 80ºC, 112,2 mg de PEG 300 (0,374 mmoles, 1 eq). Después de 30 minutos, se añadieron 100 mg de 4'-cloro

5 2,2':6',2" terpiridina (0,374 mmoles, 1 eq). Después de 20 h de agitación a 80ºC, la solución se vertió en 200 ml de Milli Q fría. La capa acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3 x 20 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se evaporaron mediante evaporador rotatorio. El aceite amarillo se obtuvo con un rendimiento del 35% (68,3 mg).

10 1H RMN (CDCl3)

δ 3 [pico ancho, 1H, OH], 3,67 [2H, CH2], 3,60 [m, 6H, CH2], 3,86 [t, 2H, CH2], 4,33 [t, 2H, CH2], 7,24 [t, 2H, H5,5"], 7,74 [dd, 2H, H4,4"], 7,95 [s, 2H, H3',5'], 8,5 [dd, 2H, H3,3"], 8,6 [d, 2H, H6,6"].

15 13C RMN (CDCl3)

δ 62,2 [CH2-O], 68,5 [CH2-O], 71,3 [CH2-O], 71,6 [CH2-O], 73,5 [CH2-O], 108,2 [CH, C3',5'], 122,06 [CH, C5,5"], 124,60 [CH, C3,3"], 137,54 [CH, C4,4"], 149,73 [CH, C6,6"], 156,7 [C, C2,2"], 157,7 [C, C2',6'], 167,7 [C, C4'].

20 -Acoplamiento entre el fluorócromo (o hapteno) con APET (6a-d)

imagen1

En un microrreactor equipado con un dispositivo de agitación magnético se disolvió APET en 300 µl de DMF. Se añadieron 1 eq del colorante y 3 eq de TEA y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 20 h en la oscuridad. El disolvente se eliminó. La pureza de los productos se comprobó mediante RP HPLC y los productos se

25 purificaron mediante RP HPLC preparativa con el tampón de acetonitrilo/TEAA en Luna 10 C18 (2).

Rendimiento:

Tabla 1: Rendimiento obtenido para el ligando 6a-d

Fluorócromo (o Hapteno) m (mg) Rendimiento

6a DEAC 7,2 97%

6b 6TAMRA 3,1 55%

6c LC Biotina 5,8 78%

6d DNP 3,5 51%

30 1H RMN (CDCl3)

• DEAC (6a):

35 δ 1,24 [t, 6H, CH3], 1,66 [Quintuplete, 2H, CH2], 1,73 [Quintuplete, 2H, CH2], 1,87 [Quintuplete, 2H, CH2], 3,47 [m, 6H, CH2], 4,27 [t, 2H, CH2-O], 6,48 [d, 1H, J = 6,48Hz, CH], 6,63 [dd, 1H, Jp = 2,41 y Jo = 8,95Hz, CH], 7,33 [m, 2H, H5,5"], 7,43 [d, 1H, Jo = 8,95Hz, CH], 7,84 [td, 2H, J = 1,77 y J = 7,71Hz, H4,4"], 7,97 [s, 2H, H3',5'], 8,58 [dd, 2H, H3,3"], 8,69 [dd, 2H, H6,6"], 8,71 [s, 1H, CH], 8,86 [t, 1H, Amida].

• 6 TAMRA (6b):

5 δ 1,29 [s, 6H, CH3], 1,32 [s, 6H, CH3], 1,57 [Quintuplete, 2H, CH2], 1,66 [Quintuplete, 2H, CH2], 1,87 [Quintuplete, 2H, CH2], 4,22 [t, 2H, CH2-O], 3,42 [m, 2H, CH2-NH], 6,38 [m, 1H, CH], 6,40 [m, 1H, CH], 6,47 [s, 1H, CH], 6,48 [s, 1H, CH], 6,58 [m, 1H, CH], 6,61 [m, 1H, CH], 7,31 [t, 2H, J = 6,78Hz, H5,5"], 7,49 [s, 1H, CH], 7,85 [t, 2H, J = 7,71Hz, H4,4"], 7,99 [s, 2H, H3',5’], 8,04 [d, 1H, CH], 8,07 [d, 1H, CH], 8,61 {d, 2H, J = 7,95Hz, H3,3"], 8,67 [d, 2H, J = 4,50Hz,

10 H6,6"].

• LC Biotina (6c):

δ 1,54 [m, 4H, CH2], 1,62 [m, 12H, CH2], 1,92 [Quintuplete, 2H, CH2], 2,20 [t, 4H, CH2], 3,18 [t, 4H, CH2-NH], 3,34 [m, 15 3H, CH-NH y CH2-NH], 3,38 [m, 2H, CH2-S], 4,32 [m, 4H, NH], 4,53 [m, 2H, CH-S], 7,55 [t, 2H, J = 1,55 y 5,08, H5,5"], 7,75 [s, 2H, H3',5'], 8,05 [td, 2H, J = 1,60 y 7,78Hz, H4,4"], 8,57 [d, 2H, J = 7,96Hz, H3,3"], 8,69 [d, 2H, J = 4,26Hz, H6,6"].

• DNP (6d):

20 δ 1,20 [m, 4H, CH2], 1,50 [m, 2H, CH2], 1,60 [m, 2H, CH2], 1,76 [m, 2H, CH2], 1,89 [m, 2H, CH2], 2,22 [m, 4H, CH2], 3,33 [m, 2H, CH2-O], 3,37 [m, 2H, CH2-NH], 4,27 [pico ancho, 1H, NH], 5,57 [m, 1H, NH], 7,37 [t, 2H, J = 4,68Hz, H5,5"], 7,88 [t, 2H, J = 7,02Hz, H4,4"], 7,98 [s, 2H, H3',5'], 8,18 [dd, 1H, Jm = 2,61 y Jo = 9,48 Hz, CH], 8,47 [m, 1H, CH], 8,60 [d, 2H, J = 7,83Hz, H3,3"], 8,67 [d, 2H, H6,6"], 9,06 [d, 1H, Jm = 2,64Hz, CH].

25 13C RMN (CDCl3)

• DEAC (6a):

δ 13,20 [CH3, CH3-CH2], 24,29 [CH2, CH2-CH2-CH2], 26,16 [CH2, CH2-CH2-CH2], 29,54 [CH2, CH2-CH2-CH2], 30,11

30 [CH2, CH2-NH], 40,33 [CH2, CH2-CH3], 45,83 [CH2, CH2-CH3], 68,84 [CH2, O-CH2], 108,33 [CH, C3',5'], 110,68 [CH], 122,20 [CH, C5,5"], 124,52 [CH, C3,3"], 131,91 [CH], 137,50 [CH, C4,4"], 148,88 [CH], 149,76 [CH, C6,6"], 157,00 [C, C2,2"], 157,76 [C, C2',6'], 168,00 [C, C4'], 173,00 [C, C=O amida].

Absorción de luz UV/Visible (CHCl3) 35

-1)

Compuesto imagen4 max (nm) ε (M-1 ·cm

245 16500

2 APET

279 16500

250 1920

6a DEAC APET

420 2480

255 45700 6b 6 TAMRA APET 276 37800 545 660

245 17200

6c LC Biotina APET

279 16900

244 25100 6d DNP APET 255 20100 349 13300

Espectro de emisión

Compuesto Concentración (mol/l) Excitación Máximo de emisión 6a DEAC APET 3,6 x 10-6 390 nm 447,7 nm 6b 6 TAMRA APET 3,3 x 10-6 510 nm 556,7 nm

40 -Complejación de K2PtCl4 con 6c, LC Biotina APET

Se disolvió K2PtCl4 (6,0 mg) en N,N'-dimetilformamida (1 ml). La solución resultante se añadió lentamente a una solución de DNP APET (8,3 mg) en N,N'-dimetilformamida (2 ml). La solución resultante se calentó durante una noche a 40ºC protegida de la luz. La mezcla se llevó a continuación a sequedad a presión reducida.

45 195Pt RMN (D2O): δPt -2701, y -2951 ppm.

-Complejación de K2PtCl4 con 6d, DNPAPET

Se disolvió K2PtCl4 (6,0 mg) en N,N'-dimetilformamida (1 ml). La solución resultante se añadió lentamente a una solución de DNP APET (9,3 mg) en propanol (1 ml) y N,N'-dimetilformamida (2 ml). La solución resultante se calentó durante una noche a 40ºC protegida de la luz. La mezcla se llevó a continuación a sequedad a presión reducida.

195Pt RMN (D2O): δPt -2686, -2954 y -3442 ppm.

Información adicional sobre la preparación de complejos de APET

La 4'-cloro 2,2':6',2" Terpiridina y el 5-amino pentanol se adquirieron de Aldrich. El K2PtCl4 se adquirió de Sigma. La EZ Link NHS LC Biotina se adquirió de Pierce. 6 TAMRA-SE, DNP-SE, DEAC se obtuvieron de Molecular Probes. La cromatografía en columna se realizó en gel de sílice 60 de Fluka para el ligando. Los complejos se purificaron en alúmina N de ICN Biomedical GmbH. Todos los disolventes se obtuvieron de Merck y se utilizaron sin purificación adicional. El agua utilizada era agua Milli Q que está desmineralizada (R = 18,2 MΩ/cm). El eluyente utilizado para todos los ciclos analíticos mediante RP HPLC fue:

•

A: 10% de CH3CN/90% de TEAA 0,1 M pH 5

•

B: 70% de CH3CN/30% de TEAA 0,1 M pH 5.

Tampón TEAA 1 M pH 5,0: En un cilindro graduado de 500 ml, se agitaron 200 ml de agua Milli Q, 30 ml de ácido acético y 70 ml de TEA. A continuación, se añadió agua Milli Q hasta 400 ml. La solución se enfrió a temperatura ambiente y el pH se ajustó a 5 con ácido acético. El volumen se ajustó con Milli Q a 500 ml. La solución se almacenó a entre 2 y 6ºC.

Tampón Acetonitrilo al 10%/Acetato de trietilamonio 0,1 M pH 5,0 al 90%: En un cilindro graduado de 1000 ml, se agitaron 100 ml de acetonitrilo, 90 ml de TEAA 1 M pH 5,0 y 810 ml de Milli Q a temperatura ambiente. La solución se filtró en un filtro de membrana de 1,0 µm. La solución se desgasificó a continuación en una bomba de vacío entre 10 y 20 minutos. El tampón se almacenó a entre 2 y 6ºC.

Tampón Acetonitrilo al 70%/ Acetato de trietilamonio 0,1 M pH 5,0 al 30%: En un cilindro graduado de 1000 ml, se agitaron 700 ml de acetonitrilo, 30 ml de TEAA 1 M pH 5,0 y 270 ml de agua Milli Q a temperatura ambiente. La solución se filtró en un filtro de membrana de 1,0 µm. La solución se desgasificó a continuación en una bomba de vacío entre 10 y 20 minutos. El tampón se almacenó a entre 2 y 6ºC.

Columna: el análisis de RP HPLC se realizó utilizando el explorador Amersham Pharmacia Biotech Akta equipado con una columna Luna 5a C18(2) de Phenomex. Las características de la columna y del análisis son las siguientes: Altura 25 cm, Diámetro 0,46 cm, Volumen de la columna 4,155 ml, Presión 14 MPa, Caudal 1 ml/minuto.

Longitud de onda: El análisis se realizó generalmente con tres longitudes de onda (254, 280 y 215 nm) pero las longitudes de onda se adaptaron para el fluorócromo para detectar más fácilmente el fluorócromo (o hapteno) libre.

RMN: los compuestos preparados se caracterizaron mediante espectroscopía de 1H RMN y 13C RMN. El 1H RMN se registró a 300 MHz y 13C RMN a 75 MHz, ambos en un espectrómetro Bruker DPX 300. Los espectros de 1H RMN se referenciaron con tetrametilsilano interno (TMS). Los espectros de 13C RMN se referenciaron respecto a resonancia del disolvente. Todas las muestras se midieron a temperatura ambiente.

Luz UV/Visible: Los espectros de UV se registraron en un espectrómetro Ultrospec 4000 de Amersham Pharmacia Biotech. Los espectros se midieron en una cubeta de cuarzo a entre 200 y 700 nm para el ligando y el complejo.

Espectro de emisión: los espectros de emisión se registraron en un Espectrómetro de Luminiscencia LS 45 de Perkin Elmer. Las longitudes de onda de excitación se seleccionaron con un monocromador. Cada longitud de onda de excitación se había seleccionado en la máxima absorción del colorante. Los espectros se habían registrado a temperatura ambiente.

IV. Utilización de reactivos APET-Pt/Pd/Ru/Co en el marcado de ácidos nucleicos y proteínas. (no según la presente invención)

Una serie de metales incluyendo platino (Pt), paladio (Pd), rutenio (Ru) y cobalto (Co) se introdujeron en el espaciador APET. En primer lugar, el fluorócromo o hapteno se unió a APET y a continuación una serie de metales se introdujeron en la molécula de APET marcada. El análisis químico se realizó mediante H-RMN. La pureza de los reactivos purificados mediante RP-HPLC variaba entre el 80 -99%.

Complejos de Biotina-APET:

Los espaciadores de Biotina-APET se complejaron con Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, Mn2+, Ni2+, Pd2+, Pt2+, Ru2+ y Zn2+ .

Todos los complejos eran solubles en agua excepto Pt, Pd y Ru, estos eran solubles en DMF o DMSO. La pureza de estos reactivos era del 82-99% con >80% de rendimiento. El complejo Bio-APET-Pd era menos estable (posible explicación: formación de cadenas a través de la unión de Pd con tioéter de biotina u otra molécula de Bio-APET-Pd, como podía observarse en cromatogramas de HPLC). Los complejos de marcado se incubaron con proteínas y ADN a diferentes proporciones, temperaturas, tiempo de incubación y pH. Se descubrió que los complejos de Bio-APET-que contenían Pt, Pd y Ru marcaban tanto proteínas como ADN, Bio-APET-Co marcaba proteínas (a pH ≥ 8,0) pero no ADN y los otros metales eran menos reactivos o no formaban enlaces estables.

La figura 1 muestra que Bio-APET-Ru es más reactivo con ADN que el complejo de marcado con platino bidentado estándar (Bio-BOC-Pt). El ADN se marcaba más rápido y a temperatura significativamente más baja. Además, cuando Bio-APET-Ru se mezcla a 1:1 con Flu-BOC-Pt estándar, la mayoría de la señal se encuentra con detección con biotina. Si Flu-BOC-Pt se mezclaba con Bio-BOC-Pt, la mayoría de la señal se encuentra con la detección con fluoresceína. Bio-APET-Pt reaccionaba de forma similar a Bio-BOC-Pt (no se muestran los datos). De forma interesante, podrían marcarse perlas de metionina con complejos de APET que contenían Pd y Pt, mientras que el complejo Bio-APET-Ru mostraba mucha menos, si es que mostraba alguna, reactividad hacia las perlas de metionina. Bio-APET-Ru se utilizó con éxito en un experimento de micromatriz que incluía el marcado del ARN total. En general, Bio-APET-Ru es más estable y supera al Biotina-BOC-Pt estándar. Bio-APET-Ru es más reactivo tanto con proteínas como con ADN (por ejemplo, marcado suficiente a temperaturas más bajas). Tomando en consideración el hecho de que se cree que Ru reacciona solamente con nitrógeno y no con azufre, Biotina-APET-Ru podría ser un reactivo más estable que el complejo de Biotina-BOC-Pt estándar (por ejemplo, un marcado no suficiente a temperaturas más bajas).

Complejos de DNP-APET:

Complejos de DNP-APET que contenían Pt, Pd y Ru son reactivos hacia ADN y proteínas (véase la tabla 1). Como se muestra en la figura 2, la reactividad por ADN a temperatura >40ºC es igual a la del DNP-BOC-Pt bidentado estándar. El DNP-APET-Pd no se unía de forma muy estable a ADN, ya que se observaba muy poco marcado a temperatura >60ºC.

El marcado diana de suero completo humano se realizó utilizando complejos DNP-BOC-Pt estándar y DNP-APET-Ru,Pt,Pd. Se desarrolló un análisis de ELISA de captura de IgA, IgG e IgM. A las proporciones de marcado utilizadas con DNP-APET-Pt y -Pd, la mayor parte de las proteínas precipitaban rápidamente. Los datos muestran que el complejo de Pt precipitaba proteínas más rápido, sin embargo marcaba mucho peor que el complejo de Pd. No se encontraron resultados positivos reales con DNP-APET-Pt. Para la detección de IgG BOC-Pt = APET-Pd > APET-Ru y para la detección de IgA BOC-Pt = APET-Pd = APET-Ru. El DNP-APET-Pd puede optimizarse rebajando la proporción dado que a la proporción más baja utilizada, solamente el 20% de IgG y el 50% de IgA estaban en solución (marcado 1 h a 37ºC), mientras que los mejores resultados obtenidos con complejos de marcado bidentados de control y DNP-APET-Ru eran de fracciones que contenían >85% de IgG y >75% de IgA (marcado 20 h a 37ºC).

Complejos de Cy3/5-APET:

El marcado de ADN se conseguía con Cy3-APET-Pt, Cy5-APET-Pd y Cy5-APET-Ru. El marcado diana de suero completo humano se realizó utilizando Cy5-BOC-Pt, Cy5-APET-Ru y Cy5-APET-Pd estándar. Se desarrolló un ensayo ELISA de captura de IgA. Cy5 servía como hapteno (detectado mediante MoAb anti-Cy5 conjugado a HRP). La figura 3 muestra que, en todos los casos, se detecta IgA marcada con Cy5. Los mejores resultados se obtuvieron con el complejo Cy5-BOC-Pt de control.

V. Síntesis de un complejo de péptido marcador-tridentado-Pt

El péptido era de 16 aminoácidos y sirve como molécula transbordadora que transporta una bio-molécula a través de la membrana plasmática de una célula. El péptido tiene un grupo NH2 terminal en un extremo y en el otro extremo un soporte sólido. Dicha amina se disolvió en una mezcla 50:50 de MilliQ y etanol para obtener una concentración de 0,02 mg de la amina por ml de solución. Se añadió una dilución 1000 veces de equivalentes molares de acrilonitrilo a la solución. Se dejó la solución a reflujo (calentamiento a 65ºC) durante una noche (condensador de reflujo instalado en la parte superior del matraz de fondo redondo conectado a una máquina de refrigeración de agua). La mezcla se secó en evaporación rotatoria y el sedimento se lavó con etanol seco (3 -5 ml) y se evaporó de nuevo a sequedad. El compuesto de nitrilo se mezcló con cloruro de níquel (II) en una proporción molar de 1:1 en etanol seco (20 ml para 20 mmoles del nitrilo). Una solución recién preparada de borohidrudo sódico (1 mmol por 1 mmol de nitrilo) se añadió (2 mmoles) muy cuidadosamente (en pequeñas porciones) La solución se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, la solución se filtró con MilliQ y el níquel metálico se eliminó utilizando un imán. El filtrado se disolvió en 2 ml de DMF. Se añadieron cinco equivalentes (100 µmoles) de tetracloroplatinato de potasio (II) (en polvo) y la mezcla se mantuvo a 40ºC durante una noche. A continuación, la mezcla se filtró y se lavó con DMF (dimetilformamida), MilliQ, y DCM (diclorometano). La solución se llevó a sequedad en evaporación rotatoria. El soporte sólido puede eliminarse mediante química estándar dependiendo del tipo de química utilizada para acoplar el péptido al soporte sólido. En este caso particular se utilizó la química de TFA. Finalmente, se sintetizó un complejo de Pt mono-funcional que comprendía un metal de transición -tridentado -marcador (péptido).

VI. Marcado de masas

El complejo de dietilentriamina Pt, complejo {Pt[dienCl-] Cl-; solución 5 µM utilizada} reveló que este compuesto era estable en MS y tenía un patrón isotópico característico de las distribuciones isotópicas simuladas de Pt y N. El ión molecular más abundante obtenido para el compuesto de marcado ligero (figura 4) tenía un ión molecular [M1+] a m/z = 334. No se observaron picos contaminantes a partir de la síntesis de este compuesto. El único otro pico visible era la pérdida del Cl -que fue sustituido por un grupo OH -a m/z = 315 observado durante le reacción de marcado.

El marcado del péptido YGGFMK con un exceso 3 M de Pt[dienCl] Cl se realizó a 45 y 85ºC. Después de 1 hora de incubación en acetato de amonio 5 mM pH 6-7, con exceso 3 M de compuesto de marcado: péptido, el péptido que contiene metionina estaba completamente marcado a ambas temperaturas. El marcado a 85ºC no dio como resultado más productos de reacciones secundarias que el marcado a 45ºC sin embargo la intensidad de los productos secundarios era mayor a 85 que a 45ºC, pero esto puede atribuirse a la posición del capilar de nanopulverización. Este compuesto de marcado tridentado mono-funcional dio como resultado el marcado del péptido.

Las mediciones de MS se realizaron en un instrumento con triple cuadrupolo (Micromass, Manchester, Reino Unido) operando en modo de ión positivo, equipado con una fuente de nanoelectropulverización Z-spray. Las agujas de nanoelectropulverización estaban hechas de capilares de borosilicato de vidrio (Kwik-Fil, World Precision Instruments, Sarasota, FL) en un estirador de micropipetas P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Las agujas estaban recubiertas con una fina capa de oro (aproximadamente 500 Å) utilizando un aparato Edwards Scancoat (Edwards Laboratories, Milpitas, CA) seis Pirani 501 (a 40 mV, 1 kV, durante 200 segundos). El potencial entre la aguja de nanopulverización y el orificio del espectrómetro de masas se ajustaba habitualmente a 1.200 V; el voltaje del cono era de 30 V. La aguja de nanopulverización se mantuvo de forma constante a aproximadamente 30ºC. Para las mediciones de MS/MS, la energía de colisión se ajustó a un voltaje apropiado requerido para obtener suficiente información sobre la secuencia (<20 V). Se utilizó argón como gas de colisión. Los parámetros de resolución de masas del cuadrupolo se ajustaron a una ventana de masas relativamente grande para seleccionar toda la envuelta del isótopo de los iones precursores.

VII. Síntesis de N3 trans-C3 tridentado (esquema 5)

Preparación de 1-adición de Michael de acrilonitrilo:

Se disolvió N-Boc-hexano-1,6-diamina, (140,5 mg, 649,5 µmoles) en una mezcla de H2O/EtOH 1/1 (20 ml). Se añadió acrilonitrilo (425,5 µl, 6,495 mmoles) a la solución resultante. La mezcla se llevó a reflujo durante una noche a 60ºC y se llevó a sequedad para dar un material marrón pálido oleoso puro. Los residuos se disolvieron en CH2Cl2 y se secaron sobre MgSO4. Se obtuvo 1 después de la filtración y eliminación de los disolventes a presión reducida. (Rendimiento: 166,8 mg, 95%).

1H RMN (CDCl3): δ 1,35 (4H, m, NH(CH2)2(CH2)2); 1,43 (13H, m, NH(CH2)(CH2)CH2)2(CH2) + tBu); 2,60 (6H, m, NH(CH2)(CH2)5 + (CH2)(CH2)CN); 2,94 (4H, m, CH2CN); 3,1 (2H, m, (CH2)NHBoc); 4,55 (1H, pico ancho, NHBoc).

Preparación de 2-reducción con hidruro de litio aluminio:

Se disolvió 1 (151,0 mg, 5,129 x 10−4 moles) en diclorometano (20 ml). La solución resultante se agitó en un baño de hielo (0ºC.) durante 20 minutos. A continuación se añadió hidruro de litio aluminio (5 ml de una solución 1 M en éter dietílico, 5 mmoles). Inmediatamente se observó la precipitación de sólidos blancos. La mezcla resultante se agitó a 0ºC (baño de hielo) durante 30 minutos, durante los cuales se dejó que la temperatura se equilibrara con la temperatura ambiente. A continuación se añadieron cuidadosamente 7,5 ml de MilliQ para neutralizar el exceso de hidruro de litio aluminio. La adición de MilliQ causó la precipitación de una cantidad más importante de sólidos blancos. A continuación, se filtró la mezcla. Los extractos orgánicos se separaron de los extractos acuosos y se secaron a presión reducida produciendo un aceite incoloro. (Rendimiento: 23,5 mg, 15,1%).

1H RMN de 1 (CDCl3): δH 1,22 (m, 4H, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 1,41 (m, 13H, protones de tBut y CH2 restantes del espaciador de hexanodiamina), 1,82 (singlete ancho, 4H, NH2), 2,29 (m, 8H, (CH2)2NH2), 2,68 (m, 2H, NCH2(CH2)5 NHBoc), 3,06 (m, 2H, CH2NHBoc), 4,61 (m, 2H, NHBoc) ppm. MS (ESI+) m/z: 303 [M+H]+.

Preparación de 3-complejación con tetracloroplatinato de potasio:

Se disolvió 2 (829,2 mg, 2,509 mmoles) en N,N′-dimetilformamida (535,4 ml). A continuación se añadió tetracloroplatinato de potasio (1041,4 mg, 2,509 mmoles) en estado sólido. La mezcla resultante se calentó a 40ºC durante una noche. Se observó que, al calentar, las sales de platino rojas se disolvían. A continuación, se filtró la mezcla para permitir la separación de los sólidos blancos de cloruro de potasio. El filtrado se llevó a sequedad calentando a presión reducida. A continuación se añadió MilliQ (aproximadamente 30 ml) para eliminar las sales de cloruro de potasio restantes. Los extractos acuosos se filtraron. Los sólidos marrones se lavaron con éter dietílico (10 ml) y se secaron a presión reducida. (Rendimiento: 853,00 mg, 57,0%)

Preparación de 4a y preparación in situ de de 5-Eliminación del grupo protector de Boc y reacción con el éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina:

Se mezcló 3 (7,3 mg, 1,2 x 10−5 moles) con ácido clorhídrico 200 mM (4 ml). La mezcla resultante se calentó durante una noche a 50ºC. Durante el calentamiento, se observó que los sólidos marrones precipitaban. El pH se ajustó a aproximadamente 8,0 utilizando soluciones de hidróxido sódico (1 M) y ácido clorhídrico (200 mM) en MilliQ.

Cualquier material marrón insoluble puede disolverse mediante la adición de la cantidad mínima de N,N′dimetilformamida, mediante adición gota a gota utilizando una pipeta Pasteur. Como alternativa, la adición del éster succinimidílico en N,N′-dimetilformamida puede permitir la solubilización de los residuos marrones. A continuación se añadieron MilliQ (476 µl), hidróxido sódico en MilliQ (solución 1 M, 25 µl).

El éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina (4,76 mg, 1,0 x 10−5 moles) en N,N′-dimetilformamida (95,2 µl) se añadió gota a gota. Se añadieron MilliQ (381 µl), trietilamina (3 µl), MilliQ (162 µl), N,N′-dimetilformamida (4 gotas mediante adición con pipeta Pasteur), metanol (5 gotas mediante adición con pipeta Pasteur) y diclorometano (4 gotas). Se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0. Puede añadirse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente protegida de la luz durante 5 minutos, después de los cuales se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0.

De nuevo, puede emplearse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla se agitó a continuación durante una noche a temperatura ambiente protegida de la luz. A continuación se filtraron los materiales insolubles. El filtrado se llevó a sequedad.

La desalación puede conseguirse mediante la eliminación de los disolventes después de la reacción con el éster succinimidílico. Los residuos se disuelven a continuación en la cantidad mínima de MilliQ y la solución resultante se trata a través de una columna Sephadex G15.

195Pt RMN (DMF-d7): δPt -3129 y -2519 ppm. MS (ESI+) m/z: 800 [M]+.

Utilización de N3 trans-Bio ULS (4a) en el marcado de proteínas

Un lisado de células HELA que contenía 50 µg de proteínas se marcó con el compuesto 4a en 50 µl de tampón de marcado durante 3 horas a 37ºC. La cantidad de 4a era de 0,5, 1, 2, 4 ó 16 µg, respectivamente. La reacción de marcado se interrumpió mediante la adición de tampón de muestra reductor. Se utilizó BIO-AP como anticuerpo de detección (1:1000). El resultado de la transferencia de Western se muestra en la figura 10.

Preparación de 4b y preparación in situ de 5-Eliminación del grupo protector de Boc y reacción con el éster succinimidílico de 6-FAM fluoresceína:

Se mezcló 3 (2,15 mg, 3,6 x 10−5 moles) con ácido clorhídrico 200 mM (366,46 µl). A continuación se añadió metanol (3 gotas mediante adición desde una pipeta Pasteur) y N,N′-dimetilformamida dando como resultado un volumen total de aproximadamente 1 ml.

La mezcla resultante se calentó durante una noche a 50ºC. Durante el calentamiento, se observó que los sólidos marrones precipitaban. El pH de la mitad de la solución se ajustó a continuación a aproximadamente 8,0 utilizando soluciones de hidróxido sódico (1 M) y ácido clorhídrico (200 mM) en MilliQ. A continuación se añadió el tampón de acoplamiento a succinimida (5x, 65,70 µl). Cualquier material marrón insoluble puede disolverse mediante la adición de la cantidad mínima de N,N′-dimetilformamida, mediante adición gota a gota utilizando una pipeta Pasteur. Como alternativa, la adición del éster succinimidílico en N,N′-dimetilformamida puede permitir la solubilización de los residuos marrones.

El éster succinimidílico de fluoresceína (0,82 mg, 2,1 x 10−6 moles) en N,N′-dimetilformamida (164,235 µl) se añadió gota a gota. La mezcla se agitó a continuación durante una noche a temperatura ambiente protegida de la luz. La desalación puede conseguirse mediante la eliminación de los disolventes después de la reacción con el éster succinimidílico. Los residuos se disuelven a continuación en la cantidad mínima de MilliQ y la solución resultante se trata a través de una columna Sephadex G15.

Utilización de N3 trans-Flu ULS (4b) en el marcado de proteínas

Se utilizaron 1, 2, 4, 6, 7,5, 10, 12,5, y 25 µg de 4b para marcar 50 µg de una mezcla de seis proteínas con diferentes pesos moleculares (lactoalbúmina, inhibidor de tripsina, anhidrasa carbónica, ovoalbúmina, BSA, fosforilasa B). Este marcado (una hora a 50ºC) se comparó con cantidades de marcado estándar de FLU-ULS a 12,5 µg de una transferencia detectada con anti-FLU-AP (figura 11).

Marcado de ácidos nucleicos con N3 trans-Flu ULS (4b)

Se marcó ADN [un plásmido pUC19 con un inserto de 1,77 kb que porta la secuencia de ADN satélite humana III situada en posición peri centromérica en el cromosoma 1 (1q12)] con 4b añadiendo 10 µg de 4b a 3 µg de ADN en un volumen de 100 µl. La mezcla se incubó a 85ºC durante 1 hora y el 4b no unido se eliminó mediante precipitación en etanol estándar. El sedimento de ADN mostraba fluorescencia verde cuando se iluminaba con luz UV. Se utilizó ADN marcado con 4b purificado como sonda en un ensayo de hibridación in situ. La sonda se disolvió en un tampón de hibridación que contenía formamida al 60%, SSC 1× y sulfato de dextrano al 10% a una concentración final de 4 ng/µl. Se aplicaron diez µl a una preparación de metafase humana pretratada estándar y se incubaron durante 5 minutos a 80ºC para permitir que tanto la diana como la sonda se desnaturalizaran. A continuación, se incubaron portaobjetos durante una noche a 37ºC y la sonda no unida o mal unida se eliminó mediante un lavado en SSC/SDS 1× al 0,1% a 65ºC. Después de la rehidratación, la preparación se incluyó en un reactivo protector de la fluorescencia que contenía DAPI. Las imágenes de fluorescencia se registraron utilizando un microscopio de fluorescencia Leica equipado con una cámara digital.

La figura 1 muestra que la sonda marcada con 4b puede utilizarse para visualizar la región 1q12 del cromosoma humano 12 mediante hibridación fluorescente in situ. La eficacia de marcado de ADN de la sonda de 4b permite la visualización directa por fluorescencia, incluso en condiciones estrictas.

Preparación de 4c y preparación in situ de 5-Eliminación del grupo protector de Boc y reacción con el éster succinimidílico de DNP

Se mezcló 3 (2,15 mg, 3,6 x 10−5 moles) con ácido clorhídrico 200 mM (163,62 µl). A continuación se añadió metanol (3 gotas mediante adición desde una pipeta Pasteur) y N,N′-dimetilformamida, dando como resultado un volumen total de aproximadamente 1 ml.

La mezcla resultante se calentó durante una noche a 50ºC. Durante el calentamiento, se observó que los sólidos marrones precipitaban. El pH de la mitad de la solución se ajustó a continuación a aproximadamente 8,0 utilizando soluciones de hidróxido sódico (1 M) y ácido clorhídrico (200 mM) en MilliQ. A continuación se añadió el tampón de acoplamiento a succinimida (5x, 245,43 µl).

Cualquier material marrón insoluble puede disolverse mediante la adición de la cantidad mínima de N,N′dimetilformamida, mediante adición gota a gota utilizando una pipeta Pasteur. Como alternativa, la adición del éster succinimidílico en N,N′-dimetilformamida puede permitir la solubilización de los residuos marrones. El éster succinimidílico de DNP (1,6 mg, 3,34 x 10−6 moles) en N,N′-dimetilformamida (245,43 µl) se añadió gota a gota. La mezcla se agitó a continuación durante una noche a temperatura ambiente protegida de la luz.

La desalación puede conseguirse mediante la eliminación de los disolventes después de la reacción con el éster succinimidílico. Los residuos se disuelven a continuación en la cantidad mínima de MilliQ y la solución resultante se trata a través de una columna Sephadex G15.

VIII. Síntesis de N3 cis-C2 tridentado (esquema 6) (no según la presente invención)

Preparación de 1-reacción con cloruro de cloroacetilo:

Se disolvió N-Boc-1,6-diaminohexano (175,6 mg, 8,12 x 10−4 moles) en diclorometano (15,4 ml). MilliQ (3883 µl) y una solución 1 M de hidróxido sódico (811,5 µl, 8,12 x 10−4 moles) en agua. La mezcla resultante se agitó a 0ºC (baño de hielo) durante 20 minutos.

Se añadió cloruro de cloroacetilo (64,5 µl, 8,10 x 10−4 moles) en diclorometano (2940,40 µl). La mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 30 minutos.

La capa orgánica se separó a continuación, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se secó a presión reducida. Se obtuvieron sólidos blancos. (Rendimiento: 161,4 mg, 67,9%).

1H RMN de 1 (CDCl3): δH 1,35 (m, 4H, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 1,44 (s, 9H, protones de tBu), 1,53 (m, 4H, CH2 restantes del espaciador de hexanodiamina), 3,10 (m, 2H, CH2NHBoc), 3,26 (m, 2H, CH2C(O)NHCH2), 4,04 (s, 2H, CH2C(O)), 4,52 (s ancho, 1H, NHBoc), 6,61 (s ancho, 2H, ClCH2NHC(O)) ppm.

Preparación de 2-reacción con etilendiamina:

Se recogió etilendiamina (147,4 mg, 2,452 mmoles) en acetonitrilo (25 ml). Se disolvió 1 (161,4 mg, 5,51 x 10−4 moles) en acetonitrilo (25 ml). La solución resultante se añadió a una velocidad de aproximadamente 1 gota cada 5 segundos a la solución de etilendiamina, a 75ºC. Después de que se completara la adición, la mezcla resultante se calentó a 75ºC durante una noche.

A continuación se filtraron los sólidos. El filtrado se llevó a sequedad. Los materiales insolubles se extrajeron en diclorometano (3 x 3 ml). Los extractos orgánicos se separaron de cualquier residuo acuoso y se secaron a presión reducida, produciendo un aceite incoloro. (Rendimiento: 41,3 mg, 23,7%).

1H RMN de 2 (CDCl3): δH 1,09 (m, 4H, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 1,35 (s, 9H, protones de tBu), 1,39 (m, 4H, CH2 restantes del espaciador de hexanodiamina), 2,62 (t, 2H, J = 7,14 Hz, NH2CH2), 2,91 (t, 2H, J = 5,41 Hz, C(O)NHCH2), 3,01 (m, 2H, CH2NHBoc), 3,14 (s ancho; 1H, NH, NHCH2C(O)), 3,26 (t, J = 5,36 Hz, 2H, NH2CH2CH2), 3,40 (m, 2H, CH2C(O)), 4,79 (s ancho, 1H, NHBoc), 7,14 (s ancho, 1H, CH2C(O)NH) ppm.

Preparación de 3-reducción con hidruro de litio aluminio:

Se disolvió 2 (41,3 mg, 1,61 x 10−4 moles) en diclorometano (5 ml). La solución resultante se agitó en un baño de hielo (0ºC) durante 20 minutos. A continuación se añadió hidruro de litio aluminio (1 ml de una solución 1 M en éter dietílico, 1 mmol). Inmediatamente se observó que precipitaban sólidos blancos. La mezcla resultante se agitó a 0ºC (baño de hielo) durante 30 minutos, durante los cuales se dejó que la temperatura se equilibrara con la temperatura ambiente. A continuación se añadieron cuidadosamente 1,5 ml de MilliQ para neutralizar el exceso de hidruro de litio aluminio. La adición de MilliQ causó la precipitación de una cantidad más importante de sólidos blancos. A continuación, se filtró la mezcla. Los extractos orgánicos se separaron de los extractos acuosos y se secaron a presión reducida produciendo un aceite incoloro. (Rendimiento: 33,8 mg, 69,4%).

1H RMN de 3 (CDCl3): δH 1,29 (m, 8H, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 1,41 (m, 9H, protones de tBu), 1,80 (s ancho, 4H, amina NH), 2,62 (m, 4H, NH2CH2 y NHCH2(CH2)5), 3,05 (m, 6H, NH2CH2CH2NH(CH2)2NH), 3,21 (m, 2H, NHBoc) ppm.

Preparación de 4-complejación con tetracloroplatinato de potasio:

Se disolvió 3 (33,8 mg, 1,12 x 10−4 moles) en N,N′-dimetilformamida (17,1 ml). Se añadió tetracloroplatinato de potasio sólido (46,1 mg, 1,11 x 10−4 moles). La mezcla resultante se calentó a 40ºC durante el fin de semana. Se observó que los sólidos rojos de tetracloroplatinato de potasio se disolvían durante el calentamiento y se observó que la solución de N,N′-dimetilformamida viraba a marrón pálido. A continuación se eliminaron los disolventes a presión produciendo sólidos marrones. Los sólidos se lavaron con MilliQ (20 ml). Los sólidos marrones se disolvieron de nuevo en N,N′-dimetilformamida (17,1 ml) y la solución resultante se calentó a 40ºC durante una noche. Los disolventes se eliminaron a continuación a presión reducida. Finalmente, los sólidos marrones se disolvieron en 47,2 ml de metanol y la solución resultante se calentó a 60ºC durante el fin de semana. (Rendimiento: 34,3 mg, 59,8%).

195Pt RMN (CD3OD): δPt -2523 ppm.

Preparación de 5 y preparación in situ de 6-Eliminación del grupo protector de Boc y reacción con el éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina:

Se mezcló 4 (34,3 mg, 6,69 x 10−5 moles) con ácido clorhídrico 200 mM (980,88 µl). La mezcla resultante se calentó durante una noche a 50ºC. Durante el calentamiento, se observó que los sólidos marrones precipitaban. El pH se ajustó a aproximadamente 8,0 utilizando soluciones de hidróxido sódico (1 M) y ácido clorhídrico (200 mM) en MilliQ. La mezcla resultante se dejó permanecer a temperatura ambiente durante una hora. Cualquier material marrón insoluble puede disolverse mediante la adición de la cantidad mínima de N,N′-dimetilformamida, mediante adición gota a gota utilizando una pipeta Pasteur.

El éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina (21,1 mg, mol) en N,N’-dimetilformamida (422 µl) se añadió gota a gota. Se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0. Puede añadirse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente protegida de la luz durante 5 minutos, después de los cuales se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0. De nuevo, puede emplearse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla se agitó a continuación durante una noche a temperatura ambiente protegida de la luz. (Rendimiento: 15 mg, 27,8%)

La desalación puede conseguirse mediante la eliminación de los disolventes después de la reacción con el éster succinimidílico. Los residuos se disuelven a continuación en la cantidad mínima de MilliQ y la solución resultante se trata a través de una columna Sephadex G15.

196Pt RMN (CD3OD): δPt -2630 ppm.

Utilización de N3 cis-Bio ULS (5) como compuesto de marcado

Se marcaron 25 µg de una mezcla de seis proteínas (véase anteriormente) en 50 µl de tampón de marcado a 37ºC durante 16 horas. La cantidad de 5 era de 5, 10, 12,5, 15 ó 20 µg, respectivamente. La reacción de marcado se interrumpió mediante la adición de un tampón de muestra reductor. Anticuerpo de detección: BIO-AP 1:1000.

Los resultados del marcado se muestran en la figura 14.

Síntesis de 7-complejación con tetracloroplatinato de potasio:

Se disolvió 6c (5,8 mg, 8,6 x 10−6 moles) en N,N′-dimetilformamida (11,2 ml). Se añadió tetracloroplatinato de potasio sólido (3,6 mg, 8,8 x 10−6 moles). La mezcla resultante se calentó a 40ºC durante una noche. Se observó que los sólidos rojos de tetracloroplatinato de potasio se disolvían durante el calentamiento y se observó que la solución de N,N′-dimetilformamida viraba a naranja. A continuación se eliminaron los disolventes a presión produciendo sólidos marrones. (Rendimiento: 12,4 mg, 37,4%).

1H RMN de 1 (DMF-d7): δH 1,27 (m, 4H, CH2 alifáticos), 1,57 (m, 8H, CH2 alifáticos), 1,88 (m, 4H, CH2 alifáticos), 2,11 (m, 4H, C(O)CH2), 3,11 (m, 4H, CH2NHC(O)), 4,29 (m, 2H, CH2NHC(O)NH), 4,61 (m, 2H, OCH2), 7,50 (m, 2H, H aromáticos), 7,80 (m, 2H, H aromáticos), 8,69 (m, 4H, H aromáticos) ppm. 195Pt RMN (DMF-d7): δPt -2707 ppm. MS (ESI+) m/z: 867 [M]+.

La figura 15 muestra el esquema de síntesis de 7 -complejación con tetracloroplatinato de potasio.

IX. Síntesis de N3 trans-C2 tridentado (esquema 7) [no según la presente invención]

Preparación de 1-adición de cloroacetonitrilo:

Se recogió N-Boc-1,6-diaminohexano (67,98 mg, 3,142 x 10−4 moles) en la cantidad mínima de diclorometano (1 ml). A continuación se añadió acetonitrilo (25 ml). También se añadieron carbonato potásico (224,1 mg, 1,621 mmoles) y yoduro potásico (122,3 mg, 7,367 x 10−4 moles), en estado sólido. A continuación se añadió cloroacetonitrilo (1,0 ml, 16 mmoles). La mezcla resultante se calentó a 75ºC durante una noche. Se observó que la solución viraba a negro durante el calentamiento. A continuación se filtraron los sólidos. El filtrado se llevó a sequedad. Los materiales insolubles se extrajeron en diclorometano (3 x 3 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se filtraron y se secaron a presión reducida. Se aislaron sólidos de color naranja.

1H RMN de 1 (MeOD): δH 1,22 (m, 41-1, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 1,36 (m, 13H, protones de tBu y CH2 restantes del espaciador de hexanodiamina), 2,63 (m, 21-1, NCH2(CH2)5 NHBoc), 2,99 (m, 2H, CH2NHBoc), 3,76 (m, 2H, CH2CN), 6,49 (s ancho, 1H, NHBoc) ppm.

Preparación de 2-reducción con hidruro de litio aluminio:

Se disolvió 1 (151,0 mg, 5,129 x 10−4 moles) en diclorometano (20 ml). La solución resultante se agitó en un baño de hielo (0ºC) durante 20 minutos. A continuación se añadió hidruro de litio aluminio (5 ml de una solución 1 M en éter dietílico, 6 mmoles). Inmediatamente se observó que precipitaban sólidos blancos. La mezcla resultante se agitó a 0ºC (baño de hielo) durante 30 minutos, durante los cuales se dejó que la temperatura se equilibrara con la temperatura ambiente. A continuación se añadieron cuidadosamente 7,5 ml de MilliQ para neutralizar el exceso de hidruro de litio aluminio. La adición de MilliQ causó la precipitación de una cantidad más importante de sólidos blancos. A continuación, se filtró la mezcla. Los extractos orgánicos se separaron de los extractos acuosos y se secaron a presión reducida produciendo un aceite incoloro. (Rendimiento: 23,5 mg, 15,1%).

1H RMN de 1 (CDCl3): δH 1,22 (m, 4H, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 1,41 (m, 13H, protones de tBu y CH2 restantes del espaciador de hexanodiamina), 1,82 (singlete ancho, 4H, NH2), 2,29 (m, 8H, (CH2)2NH2), 2,68 (m, 2H, NCH2(CH2)5NHBoc), 3,06 (m, 2H, CH2NHBoc), 4,61 (m, 2H, NHBoc) ppm. MS (ESI+) m/z: 303 [M+H]+.

Preparación de 3-complejación con tetracloroplatinato de potasio:

Se disolvió 2 (23,5 mg, 7,77 x 10−5 moles) en N,N′-dimetilformamida (12,5 ml). Se añadió tetracloroplatinato de potasio sólido (32,4 mg, 7,80 x 10−5 moles). La mezcla resultante se calentó a 40ºC durante una noche. Se observó que los sólidos rojos de tetracloroplatinato de potasio se disolvían durante el calentamiento y se observó que la solución de N,N′-dimetilformamida viraba a marrón pálido. A continuación se eliminaron los disolventes a presión produciendo sólidos marrones. 195Pt RMN (DMF-d7): δPt -2586 ppm. (Rendimiento: 27 mg, 61,1%)

Preparación de 4 y preparación in situ de 5-Eliminación del grupo protector de Boc y reacción con el éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina:

Se mezcló 3 (13,5 mg, 4,13 x 10−5 moles) con ácido clorhídrico 200 mM (670,03 µl). La mezcla resultante se calentó durante una noche a 50ºC. Durante el calentamiento, se observó que los sólidos marrones precipitaban. El pH se ajustó a aproximadamente 8,0 utilizando soluciones de hidróxido sódico (1 M) y ácido clorhídrico (200 mM) en MilliQ. Cualquier material marrón insoluble puede disolverse mediante la adición de la cantidad mínima de N,N′dimetilformamida, mediante adición gota a gota utilizando una pipeta Pasteur. Como alternativa, la adición del éster succinimidílico en N,N′-dimetilformamida puede permitir la solubilización de los residuos marrones. El éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina (18,76 mg, 4,13 x 10−5 moles) en N,N′-dimetilformamida (ml) se añadió gota a gota. Se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0. Puede añadirse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente protegida de la luz durante 5 minutos, después de los cuales se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0. De nuevo, puede emplearse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla se agitó a continuación durante una noche a temperatura ambiente protegida de la luz. A continuación se filtraron los materiales insolubles.

La desalación puede conseguirse mediante la eliminación de los disolventes después de la reacción con el éster succinimidílico. Los residuos se disuelven a continuación en la cantidad mínima de MilliQ y la solución resultante se trata a través de una columna Sephadex G15.

195Pt RMN (DMF-d7): δPt -2707 ppm. MS (ESI+) m/z: 772 [M]+.

X. Síntesis de NS2 trans-C2 tridentado (esquema 8) [no según la presente invención]

Preparación de 1-adición de éter 2-cloroetilmetílico:

Se recogió N-Boc-1,6-diaminohexano (101,3 mg, 4,688 x 10−4 moles) en la cantidad mínima de diclorometano (1 ml). A continuación se añadió acetonitrilo (30 ml). También se añadieron carbonato potásico (327,1 mg, 2,367 mmoles) y yoduro potásico (157,1 mg, 9,463 x 10−4 moles), en estado sólido. A continuación se añadió éter 2-cloroetilmetílico (93,3 µl, 9,35 x 10−4 moles). La mezcla resultante se calentó a 75ºC durante una noche. A continuación se filtraron los sólidos. El filtrado se llevó a sequedad. Los residuos se extrajeron con diclorometano (3 x 3 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, se filtraron y se secaron a presión reducida, produciendo sólidos blancos. (Rendimiento: 19,2 mg, 11,2%). 1 H RMN de 1 (CDCl3): δH 1,27 (m, 4H, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 1,40 (m, 9H, protones de tBu), 1,44 (m, 4H, CH2 restantes del espaciador de hexanodiamina), 2,10 (s, 6H, CH3 ), 2,54 (m, 6H, NCH2(CH2)5NHBoc y NCH2CH2S), 2,76 (m, 2H, CH2NHBoc), 3,21 (m, 2H, NHBoc), 4,54 (s ancho, 1H, NHBoc) ppm. MS (ESI+) m/z: 365 [M+H]+.

Preparación de 2-complejación con tetracloroplatinato de potasio:

Se disolvió 1 (19,2 mg, 5,26 x 10−5 moles) en N,N′-dimetilformamida (11,2 ml). Se añadió tetracloroplatinato de potasio sólido (21,7 mg, 5,23 x 10−5 moles). La mezcla resultante se calentó a 40ºC durante una noche. Se observó que los sólidos rojos de tetracloroplatinato de potasio se disolvían durante el calentamiento y se observó que la solución de N,N′-dimetilformamida viraba a naranja. A continuación se eliminaron los disolventes a presión produciendo sólidos marrones. (Rendimiento: 12,4 mg, 37,4%).

195Pt RMN (DMF-d7): δPt -3543 ppm.

Preparación de 3 y preparación in situ de 4-Eliminación del grupo protector de Boc y reacción con el éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina:

Se mezcló 2 (12,4 mg, 1,97 x 10−5 moles) con ácido clorhídrico 200 mM (1336,39 µl). La mezcla resultante se calentó durante una noche a 50ºC. Durante el calentamiento, se observó que los sólidos marrones precipitaban. El pH se ajustó a aproximadamente 8,0 utilizando soluciones de hidróxido sódico (1 M; 240 µl) y ácido clorhídrico (200 mM; 10 µl) en MilliQ. Cualquier material marrón insoluble puede disolverse mediante la adición de la cantidad mínima de N,N′-dimetilformamida, mediante adición gota a gota utilizando una pipeta Pasteur. Como alternativa, la adición del éster succinimidílico en N,N′-dimetilformamida puede permitir la solubilización de los residuos marrones.

El éster succinimidílico de EZ-link-LC-Biotina (7,993 mg, 1,76 x 10−5 moles) en N,N′-dimetilformamida (159,86 µl) se añadió gota a gota. Se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0. Puede añadirse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente protegida de la luz durante 5 minutos, después de los cuales se comprobó que el pH era de aproximadamente 8,0. De nuevo, puede emplearse trietilamina para este ajuste del pH. La mezcla se agitó a continuación durante una noche a temperatura ambiente protegida de la luz. A continuación se filtraron los materiales insolubles. La purificación se realizó utilizando HPLC. Se descubrió que la especie diana se eluía en la fracción 10 (de 57,94 a 62,94 ml).

La desalación puede conseguirse mediante la eliminación de los disolventes después de la reacción con el éster succinimidílico. Los residuos se disuelven a continuación en la cantidad mínima de MilliQ y la solución resultante se trata a través de una columna Sephadex G15.

5 1H RMN de 1 (D2O): δH 1,62 (m, 12H, del espaciador de LC-Biotina), 1,77 (m, 8H, CH2 del espaciador de hexanodiamina), 2,94 (m, 4H, C(O)CH2), 3,05 (s, 6H, CH3), 3,30 (m, 6H, NCH2(CH2)5NH y NCH2CH2S), 3,54 (m, 4H, NCH2 CH2S), 3,86 (m, 2H, CH2C(O)NH), 4,0 (m, 2H, CH2NHC(O)NH) ppm.

MS (ESI+) m/z: 782 [M+-Cl -+OH−]+. 10

Detalles sobre el método de análisis por HPLC preparativa:

El análisis de HPLC analítica se realizó en una columna Luna3 C18 de fase inversa de un volumen de 88,247 ml (250 x 21,2 µl), con tampones de NaCl (100 mM; 90% en tampón A y 70% en tampón B)/2-propanol (el 10% en 15 tampón A y el 90% en tampón B). 803,0 ml (aproximadamente) en total se eluyeron a través de la columna a una velocidad de 5,0 ml/minutos. El método incorporaba un gradiente lineal entre 94,25 y 182,49 ml (1,0 volumen de columna) para alcanzar una concentración del 30,0% de B, entre 182,49 y 403,21 ml (2,5 volúmenes de columna) para alcanzar una concentración del 80% de B, entre 403,21 y 447,33 ml (0,5 volúmenes de columna) para alcanzar una concentración del 100% de B y entre 579,91 ml y 624,03 ml (0,5 volúmenes de columna) para eluir A puro de

20 nuevo. Entre 447,33 y 579,81, se eluyó B puro.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Complejo de metal de transición marcado, que comprende un átomo de metal de transición, un resto reactivo para permitir que una entidad química o biológica quede unida al átomo de metal de transición, un resto tridentado inerte como puente estabilizador, y un marcador,

   en el que el átomo de metal de transición está unido al resto tridentado por medio de tres átomos donadores, seleccionándose cada uno independientemente entre el grupo de átomos de nitrógeno y azufre, átomos donadores que están presentes en el resto tridentado y en el que los átomos donadores en el resto tridentado están separados entre sí por 3-5 átomos de carbono.

2. 2.

   Complejo, según la reivindicación 1, en el que el metal de transición se selecciona entre el grupo que comprende vanadio, cromo, hierro, níquel, cobre, rutenio, paladio, platino, molibdeno, tungsteno, cobalto, manganeso, osmio, rodio, iridio, zinc y cadmio.

3. 3.

   Complejo, según la reivindicación 2, en el que el metal de transición se selecciona entre el grupo que comprende hierro, níquel, rutenio, paladio, platino, molibdeno, tungsteno y cobalto.

4. 4.

   Complejo, según la reivindicación 3, en el que el metal de transición es platino, cobalto o rutenio.

5. 5.

   Complejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el marcador está contenido en el resto tridentado o unido al resto tridentado, opcionalmente por medio de un espaciador.

6. 6.

   Complejo, según la reivindicación 5, en el que el átomo del metal de transición está unido al resto tridentado por medio de tres átomos de nitrógeno.

7. 7.

   Complejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el marcador es una marca fluorescente.

8. 8.

   Complejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el resto reactivo se selecciona entre el grupo que comprende Cl -, NO3-, HCO3-, CO32-, SO32-, ZSO3-, I -, Br -, F -, acetato, carboxilato, fosfato, nitrato de etilo, oxalato, citrato, un fosfonato, ZO, y agua, en el que Z se define como un resto de hidrógeno o un grupo alquilo o arilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.

9. 9.

   Entidad química o biológica marcada que comprende una entidad química o biológica que está unida a un complejo de metal de transición según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la entidad química o biológica ha sustituido al resto reactivo.

10. 10.

    Entidad química o biológica marcada, según la reivindicación 9, en la que la entidad se selecciona entre el grupo que comprende aminoácidos, péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, inmunoglobulinas, enzimas, sinzimas, fosfolípidos, glucoproteínas, ácidos nucleicos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, ácidos péptidonucleicos, oligómeros de ácidos péptidonucleicos, polímeros de ácidos péptidonucleicos, aminas y aminoglucósidos.

11. 11.

    Método para preparar una entidad química o biológica marcada, según la reivindicación 9 ó 10, en el que una entidad química o biológica se pone en contacto con un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en condiciones tales que el resto reactivo es sustituido por la entidad química o biológica.

12. 12.

    Utilización de un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para crear un cambio definido del peso molecular de la entidad química o biológica para facilitar el análisis por espectrometría de masas de dicha entidad o una muestra que comprende dicha entidad.

13. 13.

    Método para hacer a una entidad química o biológica distinguible mediante espectrometría de masas, comprendiendo dicho método la etapa de marcar de forma diferencial a dicha entidad, como mínimo, con un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

14. 14.

    Método para análisis por espectrometría de masas de una entidad química o biológica, comprendiendo dicho método las etapas de marcar de forma diferencial a dicha entidad, como mínimo, con un complejo de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y analizar dicha entidad mediante espectrometría de masas.

15. 15.

    Método, según la reivindicación 13 ó 14, en el que se marcan, como mínimo, dos entidades y en el que dichas entidades proceden de diferentes muestras.

16. 16.

    Método, según la reivindicación 15, en el que dicha etapa de marcar de forma diferencial a dicha entidad se realiza, como mínimo, con dos complejos de metal de transición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dichos complejos de metal de transición son de diferente peso molecular, siendo dicha diferencia de peso molecular ≥ 1 Da.

17. 17.

    Conjunto de, como mínimo, dos complejos de metal de transición de diferente peso molecular, en el que cada uno de dichos complejos de metal de transición es según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

    5 18. Kit de partes que comprende el conjunto de, como mínimo, dos complejos de metal de transición de diferente peso molecular, según la reivindicación 17.
18. 19. Kit de partes, según la reivindicación 18, que comprende además, como mínimo, un artículo seleccionado entre

    el grupo que comprende instrucciones de reacción, muestras de ensayo, tubos o tiras de ensayo, tampones, 10 preparaciones de marcador y preparaciones para ajustar la fuerza iónica.