ES2361696T3 - Utilización de un anticuerpo anti-cd151 para el tratamiento del cáncer. - Google Patents

Abstract

Uso de al menos un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a la proteína CD151 y de inhibir así el crecimiento tumoral para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los tumores primarios.

Description

La presente solicitud se refiere a una nueva utilización de anticuerpos anti-CD151 capaces de inhibir el crecimiento tumoral, siendo dichos anticuerpos principalmente monoclonales de origen murino, quimérico y humanizado. Según un aspecto particular, la solicitud tiene por objeto la utilización de estos anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, como medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cánceres. La solicitud comprende finalmente los productos y/o las composiciones que comprenden dichos anticuerpos en asociación, por ejemplo, con anticuerpos y/o agentes anticancerosos o conjugados con toxinas y su utilización para la prevención y/o el tratamiento de determinados cánceres.

CD151, también denominada PETA-3 o SFA-1, es una proteína de membrana que pertenece a la familia de las tetraspaninas (Boucheix y Rubinstein, 2001, Cell Mol. Life Sci. 58, 1189-1205 ; Hemler, 2001, J. Cell Biol. 155, 1103-1107). En el ser humano, CD151 posee 253 aminoácidos y contiene 4 fragmentos de membrana y 2 dominios extracelulares EC1 (18 aminoácidos, secuencia [40-57]) y EC2 (109 aminoácidos, secuencia [113-221]), también denominados bucles extracelulares. Sin embargo, debe indicarse que a nivel de la secuencia nucleotídica, se han identificado hasta la fecha dos variantes para CD151, a saber una que comprende los nucleótidos A y C respectivamente en las posiciones 395 y 409 (SEQ ID No. 1) [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355] y la otra que comprende para las mismas posiciones los nucleótidos G y T en lugar y en el sitio de los nucleótidos A y C [Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]. Debido a esto, puede observarse una mutación a nivel de la secuencia peptídica, a saber una mutación de los restos K (Lys) y P (Pro) respectivamente en las posiciones 132 y 137 en los restos R (Arg) y S (Ser) [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355 / Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263].

CD151 está sobreexpresada en numerosos cánceres, como por ejemplo los cánceres de pulmón [Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114], de colon [Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167], de próstata [Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721] o de páncreas [Gesierich et al., 2005, Clin. Cancer Res. 11, 2840-2852].

La utilización de ratones knock-out que no expresan CD151, y de anticuerpos anti-CD151 y de ARNsi para bloquear in vitro la funcionalidad y la expresión de CD151 en diferentes tipos celulares ha permitido mostrar que CD151 está implicada en varios fenómenos asociados con el cáncer, como la adhesión celular (Nishiuchi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944 ; Winterwood et al., 2006, Mol. Biol. Cell 17, 2707-2721), la motilidad celular (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343), la migración celular (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765 ; Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820 ; Penas et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126-1135 ; Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416), la invasión celular (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343 ; Shiomi et al., 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506 ; Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292) y la angiogénesis (Yanez-Mo et al., 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804 ; Sincock et al., 1999, J. Cell Sci. 112, 833-844 ; Takeda et al., 2006, Blood).

Una de las propiedades notables de las tetraspaninas es su capacidad para asociarse entre ellas, así como a un número importante de otras moléculas de superficie para formar complejos macromoleculares estructurados. En estos complejos, cada tetraspanina está asociada específicamente a una o varias moléculas de superficie formando así complejos primarios, constituidos por una tetraspanina y una molécula asociada. Las tetraspaninas pueden organizar microdominios particulares de la membrana plásmica en los cuales reclutarán a sus moléculas asociadas que podrían estar acopladas funcionalmente. El conjunto de las interacciones que implican a las tetraspaninas se ha denominado « red de tetraspaninas » o « Tetraspanin Web ».

CD151 interacciona en la superficie de las células con diferentes proteínas de membrana. Se han puesto de manifiesto complejos muy estables, resistentes a la acción de determinados detergentes, principalmente con las integrinas receptoras de las lamininas, y más particularmente con las integrinas α3β1o α6β4 cuyo ligando preferente es la laminina 5 (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765 ; Lammerding et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621). Esta asociación implica los dominios extracelulares de CD151 y de las integrinas. La secuencia QRD [194-196] de CD151, localizada en el bucle EC2, es muy importante en esta asociación ya que la mutación de este sitio provoca la pérdida de la interacción con determinadas integrinas (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Por otra parte, los complejos ternarios funcionales CD151/integrina α6β4/c-Met (receptor de HGF) se han puesto de manifiesto en células tumorales (Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416). La inhibición de la expresión de CD151 por tratamiento de las células con un ARN de interferencia provoca una inhibición del crecimiento y de la migración celular inducida por HGF.

Las interacciones en una misma célula de CD151 con otras tetraspaninas, necesarias para la formación de la red de tetraspaninas, dependerá de las regiones de membrana y citoplásmicas de CD151 ya que se ha mostrado que la deleción del bucle EC2 no rompe la asociación de CD151 con otras tetraspaninas (Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151).

CD151 es capaz de regular los fenómenos de adhesión, de migración y de invasión celular por la modulación de diferentes vías de señalización, como por ejemplo la vía de los fosfoinosítidos a través de una asociación con la PI4-quinasa (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765), la vía de señalización de c-Jun a través de la fosforilación de FAK, Src, p38-MAPK y JNK (Hong et al., 2006), la fosforilación de las integrinas por la PKC (Zhang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 25005-25013), la activación de GTPasas de la familia Rho (Shigeta et al., 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176).

Las interacciones de tipo homofílico entre células son también responsables de un aumento de la motilidad celular y de la expresión de la metaloproteinasa MMP-9 (Hong et al., 2006). Estas interacciones intercelulares CD151-CD151 provocan la activación de c-Jun a través de la fosforilación de FAK, Src, p38-MAPK y JNK

Hasta la fecha, a pesar del interés de la proteína CD151, sólo se ha generado un anticuerpo con fines terapéuticos, a saber el anticuerpo monoclonal 50-6.

El anticuerpo monoclonal 50-6 (isotipo IgG1) dirigido contra CD151 se ha generado en el ratón por inmunizaciones sustractivas con células humanas de carcinoma epidermoide HEp-3 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820).

El anticuerpo 50-6 es capaz de inhibir in vitro la migración de las células humanas de carcinoma cervical HeLa transfectadas con el fin de sobreexpresar CD151 y de las células HEp-3, y la angiogénesis en un modelo de neovascularización de membrana corioalantoica inducida por bFGF (basic fibroblast growth factor). Inhibe in vivo las metástasis inducidas por la inoculación de células HEp-3 en 2 modelos de embrión de pollo (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). En estos modelos, la actividad inhibidora del anticuerpo 50-6 se determina por la medida de la actividad de la proteína huPA (human urokinase-type plasminogen activator) en extractos de pulmones. Según los autores, esta dosificación constituye el reflejo de la presencia de células humanas en los pulmones. Después de la dosificación, se estima la reducción de las metástasis (diseminación de las células HEp-3 en los pulmones de los embriones de pollo) inducida por el anticuerpo 50-6, por comparación con un anticuerpo control, en 74% en un modelo denominado de « metástasis espontánea » en el que la inoculación de las células está seguida de una inyección del anticuerpo y en 57% en un modelo denominado de « metástasis experimental» en el que las células y el anticuerpo se inoculan conjuntamente. Según los autores, las propiedades anti-tumorales del anticuerpo 50-6 observadas in vivo no parecen estar asociadas a un efecto citostático o citotóxico ya que no se ha mostrado ningún efecto sobre la proliferación in vitro de las células HEp-3.

El hibridoma que produce el anticuerpo 50-6 está disponible en la ATCC con la referencia CRL-2696 (hibridoma depositado inicialmente con la referencia 50-6 [PTA-227]).

Según un aspecto general, la presente invención pretende la utilización de al menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a la proteína CD151 e inhibir así el crecimiento tumoral para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores primarios.

Varios estudios experimentales han mostrado el papel importante de las tetraspaninas en la formación de metástasis, actuando bien como supresores o bien como promotores de las metástasis. Así, la transfección de tetraspaninas como CD9, CD63 o CD82 reduce el potencial metastásico de líneas cancerosas. En cambio, la expresión de las tetraspaninas CD151 y Co-029 parece producir el efecto inverso. Estas 2 tetraspaninas serían por lo tanto promotores de la metástasis. Estos resultados son coherentes con diferentes estudios clínicos que han demostrado que, en varios cánceres (mama, pulmón, esófago, estómago, hígado, páncreas, colon, próstata, melanoma…), CD9 y CD82 se expresan menos en los tumores primitivos cuando hay metástasis y que su bajada de expresión predice una tasa de supervivencia inferior. En el cáncer de pulmón, la disminución combinada de la expresión de CD9 y de CD82 se ha correlacionado con un potencial metastásico más importante que cuando se reduce la expresión de uno solo de estos dos antígenos.

Varios estudios retrospectivos han mostrado que la sobreexpresión de CD151 estaba asociada a la agresividad de determinados cánceres, como los cánceres de pulmón, de colon y de próstata, y podía considerarse como un factor de mal pronóstico (Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114 ; Hashida et al., 2003, Br.

J. Cancer 89, 158-167 ; Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721). En estos casos, la media de supervivencia está en efecto disminuida en los pacientes cuyo tumor expresa CD151, comparativamente con aquellos cuyo tumor no expresa CD151.

La sobreexpresión de CD151 en diferentes líneas tumorales humanas (HeLa, RPMI14788, A172, HT1080), inducida por transfección del gen correspondiente, provoca un aumento de la motilidad, de la migración y de la invasión de las células transfectadas (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820 ; Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343). Estos fenómenos se inhiben en presencia de anticuerpos anti-CD151.

Según otro aspecto, los fragmentos funcionales de anticuerpo según la invención consisten, por ejemplo, en fragmentos Fv, scFv (sc para cadena sencilla), Fab, F(ab’)2, Fab', scFv-Fc o fragmentos divalentes, o cualquier fragmento cuya duración de vida media estaría aumentada por modificación química, como la adición de poli(alquilen)glicol tal como poli(etilen)glicol ("PEGilación") (fragmentos PEGilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab’)2-PEG o Fab’-PEG) (« PEG » según la nomenclatura inglesa Poly(Ethylene) Glycol), o por incorporación en un liposoma, microesferas o PLGA, siendo capaces dichos fragmentos de ejercer de manera general una actividad incluso parcial del anticuerpo del que proceden.

Preferentemente, dichos fragmentos funcionales estarán constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del que se derivan, siendo suficiente dicha secuencia parcial para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del que procede y una afinidad suficiente, preferentemente al menos igual a 1/100, de manera más preferida al menos 1/10 de la del anticuerpo del que procede.

Dicho fragmento funcional contendrá como mínimo 5 aminoácidos, preferentemente 10, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del que procede.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales serán fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab’)2, F(ab'), scFv-Fc o fragmentos divalentes, que poseen generalmente la misma especificidad de fijación que el anticuerpo del que proceden. Según la presente invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención pueden obtenerse a partir de anticuerpos tales como los descritos anteriormente por métodos tales como digestión con enzimas, como la pepsina o la papaína y/o por escisión de los puentes disulfuro por reducción química. De otra manera, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente invención pueden obtenerse por técnicas de recombinaciones genéticas muy conocidas igualmente por el experto en la técnica o por síntesis peptídica mediante

por ejemplo sintetizadores automáticos de péptidos tales como los suministrados por la empresa Applied.

Según un aspecto de la invención, el anticuerpo utilizado consiste en un anticuerpo monoclonal murino.

Están comprendidos igualmente por anticuerpos según la presente invención, los anticuerpos quiméricos o humanizados.

Por anticuerpo quimérico, se entiende designar un anticuerpo que contiene una región variable (cadena ligera y cadena pesada) natural derivada de un anticuerpo de una especie dada en asociación con las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a dicha especie dada.

Los anticuerpos o sus fragmentos de tipo quimérico utilizados según la invención pueden prepararse utilizando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico podrá realizarse clonando un ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, principalmente murino, según la invención y una secuencia que codifica la región constante de anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de la invención codificado por dicho gen recombinante será por ejemplo una quimera ratón-ser humano, estando determinada la especificidad de este anticuerpo por la región variable derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos, se podrá hacer referencia por ejemplo al documento Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).

Por anticuerpos humanizados, se entiende designar un anticuerpo que contiene las regiones CDRs derivadas de un anticuerpo de origen no humano, derivándose las demás partes de la molécula de anticuerpo de uno (o varios) anticuerpos humanos. Además, algunos de los restos de los segmentos del esqueleto (denominados FR) pueden modificarse para conservar la afinidad de unión (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986 ; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988 ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

Los anticuerpos humanizados o sus fragmentos funcionales pueden prepararse por técnicas conocidas por el experto en la técnica (como por ejemplo las descritas en los documentos Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992 ; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992 ; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169175, 1992). Dichos anticuerpos humanizados se prefieren para su utilización en los métodos de tratamiento profiláctico y/o terapéutico in vivo. Otras técnicas de humanización son igualmente conocidas por el experto en la técnica como por ejemplo la técnica de « CDR Grafting » descrita por PDL que es el objeto de las patentes EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 o EEUU 5.530.101, EEUU 6.180.370, EEUU 5.585.089 y EEUU 5.693.761. Se pueden citar igualmente las patentes EEUU 5.639.641 ó 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

De manera sorprendente, y contra toda previsión por parte del experto en la técnica, la presente invención describe por primera vez la utilización de un anticuerpo anti-CD151 tal como se ha descrito más arriba, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir la proliferación de las células tumorales y el desarrollo del tumor primario, independientemente de su capacidad de inhibir la angiogénesis y/o la formación de metástasis.

Los anticuerpos descritos en la solicitud presentan, por lo tanto, la capacidad de inhibir primeramente el desarrollo de los tumores.

Esta actividad anti-tumoral de los anticuerpos objeto de la presente invención constituye una propiedad nueva e inesperada para un anticuerpo dirigido contra CD151, ya que ningún anticuerpo anti-CD151 descrito hasta la fecha posee este tipo de actividad. Los anticuerpos objeto de la presente invención presentan, por lo tanto, una propiedad diferente, y suplementaria, respecto a los anticuerpos descritos anteriormente, y principalmente respecto al anticuerpo 50-6 ya que las propiedades anti-tumorales de este anticuerpo no están ligadas a un efecto sobre la proliferación de las células tumorales.

Este resultado también constituye la primera manifestación de un vínculo entre CD151 y el desarrollo del tumor primario, incluso de la proliferación de las células tumorales in vivo. En efecto, hasta la fecha sólo se habían descrito las actividades pro-metastásicas y pro-angiogénicas de CD151.

La proliferación desordenada de las células de un órgano o de un tejido constituye una de las primeras etapas del cáncer. Las células tumorales son células que ya no tienen la capacidad de someterse a los controles normales del crecimiento celular en el órgano o tejido referido. El crecimiento tumoral es exponencial, y las células tumorales se multiplican de forma excesiva bajo el efecto de factores de crecimiento y angiogénicos.

Según un aspecto principal, la invención se refiere a la utilización de al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir el desarrollo del tumor primario y la proliferación de las células tumorales.

Más particularmente, la presente invención se refiere a la utilización de al menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a la proteína CD151, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los tumores primarios.

Además, la solicitante avanza, sin querer estar asociada a ninguna teoría, que la utilización de anticuerpos anti-CD151 en el marco del tratamiento del cáncer presentará un interés, no únicamente debido a una inhibición de la angiogénesis, sino igualmente debido a la inhibición de la actividad promotora de metástasis de CD151.

La presente invención describe, por lo tanto, la utilización de un anticuerpo tal como se ha descrito más arriba, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir la actividad promotora de metástasis de dicha proteína CD151 en las células tumorales.

Más particularmente, la solicitante piensa que esta inhibición se traduce en una inhibición de las diferentes etapas del proceso metastásico, y principalmente de la adhesión celular, de la migración celular y/o de la invasión celular.

Las etapas clásicas de dicha actividad promotora, y más particularmente de la diseminación tumoral y del proceso metastásico, son las siguientes :

1/ invasión del tejido de sostén por las células del tumor primario que necesita una degradación por enzimas proteolíticas (tales como las metaloproteinasas) de la membrana basal y de la matriz extracelular constituidas por proteínas estructurales como la laminina, el colágeno o la fibronectina,

2/ migración de las células tumorales a través de los tejidos y en la circulación sanguínea,

3/ adhesión a la pared vascular y parada en un órgano,

4/ salida del vaso (nueva etapa de invasión) y adaptación al nuevo entorno (proliferación y angiogénesis).

La migración celular es esencial durante el desarrollo embrionario. Aunque la migración de las células sea menos importante en el adulto, determinados tipos celulares, tales como los linfocitos, los macrófagos y los fibroblastos, continuarán desplazándose durante la respuesta inmunitaria, la inflamación y la curación de heridas en el adulto para mantener la hemostasis. Sin embargo, a nivel patológico, la migración de las células tumorales, contribuye de forma importante a la progresión de los tumores al estadio metastásico. Un determinado número de factores quimiotácticos son responsables de esta migración, factores derivados bien de las células tumorales o del anfitrión. Entre estos factores, se citan los factores de crecimiento (principalmente los que estimulan la angiogénesis), los péptidos de degradación del colágeno, las proteínas de adhesión como la laminina y la fibronectina.

Según un aspecto particular, la solicitud se refiere a la utilización de al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir la migración celular de las células tumorales.

La invasión es el signo principal de la malignidad de un tumor : éste sobrepasa su centro de origen para extenderse a los tejidos cercanos y a distancia. El carácter invasivo traduce la pérdida de las propiedades habituales de una célula : normalmente las células de la mayoría de los tejidos se adhieren las unas a las otras mediante estructuras denominadas desmosomas, por moléculas adhesivas; en un epitelio, también se adhieren a la membrana basal que lo limita en profundidad. Las células tumorales pierden estas propiedades normales para adquirir las nuevas. Los vínculos entre ellas se relajan y las células se liberan las unas de las otras. Adquieren una movilidad que les permite liberarse del foco primitivo, introducirse en (invadir) los tejidos vecinos, implicando a veces a las fibras del tejido conjuntivo. Para los epitelios flanqueados principalmente por una membrana basal y para los carcinomas que se derivan, esta membrana es el primer obstáculo a franquear. Ésta resulta alterada y disuelta por las enzimas (proteasas, catepsina) secretadas por las células tumorales. Esta destrucción de la membrana basal se ve a veces acentuada por las enzimas normalmente secretadas por los glóbulos blancos y desprovistas de sus actividades habituales. Todas estas modificaciones biológicas y moleculares del comportamiento celular son la condición de la invasión.

Según otro aspecto, la solicitud se refiere a la utilización de al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir la invasión celular de las células tumorales.

Las células del organismo se adhieren las unas a las otras así como a la matriz extracelular que las rodea. La adhesión celular es un mecanismo ubicuo implicado en la mayoría de los fenómenos celulares fisiológicos, tales como la supervivencia, la proliferación o la diferenciación de las células, pero también en las diferentes situaciones patológicas como por ejemplo el cáncer y el fenómeno de metástasis. Diferentes proteínas de la superficie celular están implicadas en la adhesión celular, tales como las cadherinas o las integrinas.

De manera preferida, la utilización según la invención se basa principalmente en la inhibición de la adhesión celular.

Según otro aspecto más, la invención se refiere a la utilización de al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir la adhesión celular de las células tumorales.

Como se ha dicho más arriba, la proteína CD151 forma parte de la familia de las tetraspaninas y, como tal, comprende 2 dominios extracelulares EC1 (18 aminoácidos, secuencia [40-57]) y EC2 (109 aminoácidos, secuencia [113-221]), denominados también bucles extracelulares.

Según la presente invención, los anticuerpos utilizados son capaces de unirse al menos a un epítopo situado en el dominio extracelular. De manera preferida, dicho anticuerpo se fijará a nivel de los bucles EC1 y/o EC2.

Más particularmente, según una forma de ejecución preferida de la invención, se describe la utilización de al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a un epítopo comprendido en el bucle extracelular 1 (EC1) y/o 2 (EC2), preferentemente EC2, correspondiente respectivamente a los aminoácidos 40-57 (SEQ ID No. 6) y 113-221 (SEQ ID No. 4) de la proteína CD151.

El bucle EC1 [40-57] comprende 18 aminoácidos y presenta una masa teórica de 2.002,2 Da.

El bucle EC2 [113-221] posee un sitio de N-glicosilación (resto Asn159) y 6 restos Cisteína que forman 3 puentes disulfuro. Se ha propuesto un modelo estructural del bucle EC2 de las tetraspaninas, y principalmente de CD151, a partir de la estructura tridimensional del bucle EC2 de la tetraspanina CD81 (Seigneuret et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064). Según este modelo, las tetraspaninas poseen un armazón común, relativamente conservado y constituido por 3 hélices α, y un dominio específico variable. Para CD151, este armazón estará constituido por las regiones [113-157] y [209-221], y el dominio variable por la región [158-208].

El dominio variable del bucle EC2 estará más particularmente implicado en las interacciones específicas de CD151 con las proteínas de la familia de las integrinas. Los experimentos de mutación dirigida han mostrado principalmente la importancia de la región [193-208], y más precisamente del tripéptido QRD [194-196] y del resto Cisteína en posición 192, en la asociación de CD151 con determinadas integrinas receptores de la laminina, tales como las integrinas α3β1o α6β4 (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309).

De manera aún más preferida, la presente invención pretende la utilización de al menos un anticuerpo antiCD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a un epítopo de la región EC2 que comprende al menos los aminoácidos Glutamina, Arginina y Aspartato respectivamente en las posiciones 194, 195 y 196 (QRD194196) de la proteína CD151.

5 Según otro aspecto, debe comprenderse que la invención consiste principalmente en la utilización de al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, que consiste en un anticuerpo monoclonal.

Debe entenderse por « anticuerpo monoclonal » un anticuerpo procedente de una población de anticuerpos sensiblemente homogéneos. Más particularmente, los anticuerpos individuales de una población son idénticos con la excepción de algunas mutaciones opcionales que pueden producirse naturalmente que pueden

10 encontrarse en proporciones mínimas. En otros términos, un anticuerpo monoclonal consiste en un anticuerpo homogéneo resultante de la proliferación de un solo clon celular (por ejemplo un hibridoma, una célula anfitriona eucariota transfectada con una molécula de ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, una célula anfitriona procariota transfectada con una molécula de ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, etc.) y que se caracteriza generalmente por cadenas pesadas de una sola y misma clase y sub-clase, y cadenas ligeras de un solo tipo. Los

15 anticuerpos monoclonales son muy específicos y están dirigidos contra un solo antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que comprenden clásicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes, o epítopos, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo epítopo del antígeno.

Según un modo de realización particular de la invención, el anticuerpo monoclonal utilizado se elige entre los anticuerpos TS151 y TS151r. En lo que sigue de la descripción, las expresiones TS151r y TS151R son 20 intercambiables. La presente invención describe, por lo tanto, la utilización de al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de

sus fragmentos funcionales, consistiendo dicho anticuerpo en el anticuerpo TS151 y/o el anticuerpo TS151r. Más particularmente, el anticuerpo TS151 se define porque comprende al menos : las 3 CDRs de la cadena pesada CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 respectivamente de secuencia

25 SEQIDNo.7,8y9;y las 3 CDRs de la cadena ligera CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 respectivamente de secuencia SEQ ID No. 11, 12 y13. Según otra forma de realización, el anticuerpo TS151 se caracteriza porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 10 y una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID 30 No. 14. La tabla 1 siguiente recoge estos elementos.

Anticuerpo

Cadena ligera Cadena pesada SEQ ID N°

CDR-H1

7

CDR-H2

8

CDR-H3

9

TS151

CDR-L1 11

CDR-L2

12

CDR-L3

13

Completa (dominio variable)

10

Completa (dominio variable)

14

Tabla 1

35 En lo que se refiere al anticuerpo TS151r, este último se define porque comprende al menos : las 3 CDRs de la cadena pesada CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 respectivamente de secuencia

SEQ ID No. 15, 16 y 17 ; y las 3 CDRs de la cadena ligera CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 respectivamente de secuencia SEQ 40 IDNo.19,20y21.

Según otra forma de realización, el anticuerpo TS151r se caracteriza porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 18 y una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID No. 22.

La tabla 2 siguiente resume estos elementos. 45

Anticuerpo

Cadena ligera Cadena pesada SEQ ID N°

CDR-H1

15

CDR-H2

16

CDR-H3

17

TS151r

CDR-L1 19

CDR-L2

20

CDR-L3

21

Completa (dominio variable)

18

Completa (dominio variable)

22

Tabla 2

5 Según otra forma de realización, la tabla 3 siguiente reagrupa las secuencias nucleotídicas de los anticuerpos TS151 y TS151r.

Anticuerpo

Cadena ligera Cadena pesada SEQ ID N°

CDR-H1

23

CDR-H2

24

CDR-H3

25

TS151

CDR-L1 27

CDR-L2

28

CDR-L3

29

Completa (dominio variable)

26

Completa (dominio variable)

30

CDR-H1

31

CDR-H2

32

CDR-H3

33

TS151r

CDR-L1 35

CDR-L2

36

CDR-L3

37

Completa (dominio variable)

34

Completa (dominio variable)

38

Tabla 3

10 La generación de dichos anticuerpos se detalla a nivel del ejemplo 1. Estos 2 anticuerpos están dirigidos contra epítopos diferentes ya que TS151 reconoce CD151 tanto cuando está asociada a las integrinas como libre en la superficie de la célula (Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-995), mientras que TS151r no reconoce los complejos CD151-integrinas (Serru et al., 1999, Biochem. J. 340, 103-111 ; Geary et al., 2001, Tissue Antigens 58, 141-153 ; Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309 ; Sterk et al., 2002, J. Cell Sci. 115, 1161

15 1173). El epítopo reconocido por TS151r está localizado en el bucle EC2 y contiene los restos Q194, R195 y D196 (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Este anticuerpo está dirigido, por lo tanto al menos en parte, contra el sitio de CD151 implicado en las interacciones contra las integrinas. El resto C192 también estará implicado en el reconocimiento de CD151 por TS151r (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). El epítopo del anticuerpo TS151, aunque sea diferente del de TS151r, no se ha determinado con precisión.

20 El tratamiento de queratinocitos humanos (línea epitelial HaCaT) con el anticuerpo TS151r provoca una pérdida del contacto célula-célula, una redisposición del citoesqueleto, una redistribución intracelular de la integrina α6β4 y un aumento de la migración de las células sobre la laminina 1 (Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-995).

Más particularmente, el anticuerpo utilizado preferido consiste en el anticuerpo TS151. 25 De manera preferida, la utilización de los anticuerpos anti-CD151 en el marco del tratamiento del cáncer se justifica muy particularmente en los cánceres que sobreexpresan este mismo receptor CD151.

Dichos cánceres consisten en cáncer de colon [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003) :158-167], cáncer

de pulmón, preferiblemente de pulmón de células no pequeñas [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) :4109

4114], cáncer de próstata [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004) :17] y cáncer de páncreas [Gesierich

30 et al., Clin. Cancer Res. 11 [2005) :2840-2852].

La presente solicitud reivindica, por lo tanto, la utilización de un anticuerpo tal como se ha descrito más arriba para el tratamiento del cáncer, consistiendo dicho cáncer preferiblemente en los cánceres de colon, de pulmón, de próstata o de páncreas.

La invención se refiere igualmente a una composición farmacéutica que comprende como principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo, o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, al que se añade preferiblemente un excipiente y/o un vehículo aceptable farmacéuticamente.

Más particularmente, la invención pretende la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de una composición farmacéutica que comprende, además, al menos un vehículo aceptable farmacéuticamente

En la presente descripción, se entiende designar por vehículo aceptable farmacéuticamente, un compuesto

o una combinación de compuestos que forma parte de una composición farmacéutica que no provocan reacciones secundarias y que permite por ejemplo la facilitación de la administración de o de los compuestos activos, el aumento de la duración de su vida y/o de su eficacia en el organismo, el aumento de su solubilidad en disolución o la mejora de su conservación. Estos vehículos aceptables farmacéuticamente son muy conocidos y serán adaptados por el experto en la técnica en función de la naturaleza y del modo de administración de o de los compuestos activos elegidos.

Preferentemente, estos compuestos se administrarán por vía sistémica, en particular por vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por vía oral. De manera más preferida, la composición que comprende los anticuerpos según la invención, se administrará en varias tomas, de manera escalonada en el tiempo.

Sus modos de administración, posologías y formas galénicas óptimas pueden determinarse según los criterios que se tienen generalmente en cuenta en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente como por ejemplo la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios constatados.

Según la solicitud, se describe una composición para el tratamiento del cáncer, caracterizada porque comprende como principio activo al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a la proteína CD151.

Según la solicitud, se describe una composición para el tratamiento del cáncer, caracterizada porque comprende como principio activo al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a la proteína CD151 y/o de inhibir su actividad promotora de metástasis.

Según la solicitud, se describe igualmente una composición para el tratamiento del cáncer, caracterizada porque comprende como principio activo al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de inhibir el desarrollo de tumores primarios.

Según otro aspecto de la invención, se describe una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho al menos un anticuerpo un anticuerpo monoclonal seleccionado entre los anticuerpos TS151 o TS151r.

Según un aspecto más de la invención, se reivindica una composición que comprende una combinación de los anticuerpos TS151 y TS151r, o de sus fragmentos funcionales.

Se deduce de la bibliografía que la proteína CD151 está sobreexpresada en los cánceres y, muy particularmente, en los carcinomas de colon [Hashida et al., Br. J. Cancer 89 (2003): 158-167], los cánceres de pulmón de células no pequeñas [Tokuhara et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001): 4109-4114], los cánceres de próstata [Ang et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers 13 (2004): 1717-1721] y los cánceres de páncreas [Gesierich et al., Clin. Cancer Res. 11 (2005): 2840-2852].

Evidentemente, la lista anterior se proporciona sólo a título ilustrativo y debe comprenderse que cualquier cáncer sobreexpresa la proteína CD151 y, por lo tanto, es susceptible de tratarse según la presente invención.

Otra forma de ejecución complementaria de la invención consiste en una composición tal como se ha descrito más arriba que comprende, además, como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o escalonada en el tiempo, un agente citotóxico/citostático y/o un anticuerpo monoclonal.

La presente invención se refiere, por lo tanto, igualmente a una composición tal como se ha descrito más arriba, caracterizada porque comprende, además, como producto de combinación para una utilización simultánea, separada o escalonada en el tiempo, al menos un agente citotóxico/citostático y/o una toxina celular y/o un radioelemento y/o un anticuerpo monoclonal.

Se entiende por "utilización simultánea", la administración de los dos compuestos de la composición según la invención comprendidos en una sola y misma forma farmacéutica.

Se entiende por "utilización separada", la administración, al mismo tiempo, de los dos compuestos de la composición según la invención, comprendidos en formas farmacéuticas distintas.

Se entiende por "utilización escalonada en el tiempo", la administración sucesiva de los dos compuestos de la composición según la invención, comprendido cada uno en una forma farmacéutica distinta.

De una forma general, la composición según la invención aumenta considerablemente la eficacia del tratamiento del cáncer. En otros términos, el efecto terapéutico del anticuerpo según la invención se potencia de manera inesperada por la administración de un agente citotóxico. Otra ventaja subsecuente principal producida por una composición según la invención, se refiere a la posibilidad de utilizar dosis eficaces del principio activo más bajas, lo que permite evitar o reducir los riesgos de aparición de efectos secundarios, en particular el efecto del agente citotóxico. Además, esta composición según la invención permitirá alcanzar el efecto terapéutico que se espera más rápidamente.

Por « agentes terapéuticos anti-cáncer » o « agentes citotóxicos », se entiende una sustancia que, cuando se administra a un paciente, trata o previene el desarrollo del cáncer en el paciente. A título de ejemplo no limitativo para dichos agentes, pueden mencionarse los agentes « alquilantes », los antimetabolitos, los antibióticos anti-tumorales, los inhibidores mitóticos, los inhibidores de la función cromatina, los agentes anti-angiogénesis, los anti-estrógenos, los anti-andrógenos o los inmunomoduladores.

Dichos agentes se citan, por ejemplo, en el VIDAL, en la página dedicada a los compuestos unidos a la cancerología y la hematología columna « Citotóxicos », estos compuestos citotóxicos citados por referencia a este documento se citan aquí como agentes citotóxicos preferidos.

Los « agentes alquilantes » hacen referencia a cualquier sustancia que puede acoplarse de manera covalente o alquilar cualquier molécula, preferentemente un ácido nucleico (ej. : ADN), en una célula. Como ejemplos de dichos agentes alquilantes, se pueden citar las mostazas de nitrógeno como mecloretamina, clorambucilo, melfalan, hidrocloruro, pipobroman, prednimustina, fosfato disódico o estramustina ; oxazafosforinas como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida o ifosfamida ; aziridinas o etilen-iminas como tiotepa, trietilenamina o altetramina ; nitrosoureas como carmustina, estreptozocina, fotemustina o lomustina ; sulfonatos de alquilo como busulfan, treosulfan o improsulfan ; triacenos como dacarbazina ; o los complejos de platino como cisplatino, oxaliplatino o carboplatino.

Los « antimetabolitos » hacen referencia a sustancias que bloquean el crecimiento y/o el metabolismo celular interfiriendo con determinadas actividades, generalmente la síntesis de ADN. A título de ejemplo de antimetabolito, se puede mencionar metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, citosina arabinósido, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, deoxicoformicina y pentostatina.

Los « antibióticos anti-tumorales » hacen referencia a los compuestos que pueden prevenir o inhibir la síntesis de ADN, de ARN y/o de proteínas. Los ejemplos de dichos antibióticos anti-tumorales comprenden doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina valrrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina y procarbazina.

Los « inhibidores mitóticos » previenen la progresión normal del ciclo celular y de la mitosis. En general, los inhibidores de los microtúbulos o « taxoides » como paclitaxel y docetaxel son capaces de inhibir la mitosis. Los alcaloides de vinca, como vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina son igualmente capaces de inhibir la mitosis.

Los « inhibidores de función cromatina » o « inhibidores de topo-isomerasas » hacen referencia a sustancias que inhiben la función normal de las proteínas que modelan la cromatina como las topo-isomerasas I y

II. Los ejemplos de dichos inhibidores comprenden, para la topo-isomerasa I, camptotecina así como sus derivados como irinotecan o topotecan y, para la topo-isomerasa II, etopósido, fosfato de etipósido y tenipósido.

Los « agentes anti-angiogénesis » hacen referencia a cualquier fármaco, compuesto, sustancia o agente que inhibe el crecimiento de los vasos sanguíneos. Los ejemplos de agentes anti-angiogénesis comprenden, sin ninguna limitación, razoxin, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS27023A, halofuginona, COL-3, neovastat, BMS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferón-alfa, EMD121974, interleuquina-12, IM862, angiostatina y vitaxina.

Los « anti-estrógenos » o « agentes anti-estrogénicos » hacen referencia a cualquier sustancia que disminuye, antagoniza o inhibe la acción de los estrógenos. Los ejemplos de dichos agentes son tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, yodoxifeno, anastrozol, letrozol y exemestano.

Los « anti-andrógenos » o « agentes anti-andrógeno » hacen referencia a cualquier sustancia que reduce, antagoniza o inhibe la acción de un andrógeno. Los ejemplos de anti-andrógenos son flutamida, nilutamida, bicalutamida, esprironolactona, acetato de ciproterona, finasteride y cimitidina.

Los inmunomoduladores son sustancias que estimulan el sistema inmunitario. Los ejemplos de dichos inmunomoduladores comprenden interferones, interleuquinas como aldesleuquina, OCT-43, denileuquin diflitox o interleuquina-2, factores de necrosis tumoral como tasonermina u otros tipos de inmunomoduladores como lentinan, esizofiran, roquinimex, pidotimod, pegademasa, timopentina, poli I :C, o levamisol en combinación con 5fluorouracilo.

Para más detalles, el experto en la técnica podrá remitirse al manual editado por la Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique titulado « traité de chimie thérapeutique, Vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edición TEC & DOC, 2003 ».

Los anticuerpos monoclonales preferidos se eligen entre los anticuerpos capaces de inhibir específicamente la actividad tirosina quinasa de los receptores IGF-IR, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR, VEGF, etc., (o cualquier otro anticuerpo anti-tumoral conocido por el experto en la técnica), aislados, o sus fragmentos funcionales y compuestos derivados, capaces de inhibir la actividad proliferativa y/o anti-apoptótica y/o angiogénica y/o inductora de diseminación metastásica promovidas por dichos receptores.

En un modo de realización particularmente preferido, dicha composición como producto de combinación según la invención se caracteriza porque dicho agente citotóxico está acoplado químicamente a dicho anticuerpo para una utilización simultánea.

En un modo de realización particularmente preferido, dicha composición según la invención se caracteriza porque dicho agente citotóxico/citostático se elige entre los agentes inhibidores o estabilizadores del huso, preferentemente vinoerelbina y/o vinflunina y/o vincristina.

Con el fin de facilitar el acoplamiento entre dicho agente citotóxico y dicho anticuerpo según la invención, se podrán introducir principalmente moléculas espaciadoras entre los dos compuestos a acoplar, tales como poli(alquilenos)glicoles como polietilenglicol o aminoácidos o, en otro modo de realización, utilizar derivados activos de dichos agentes citotóxicos en los que se introducirán funciones capaces de reaccionar con dicho anticuerpo según la invención. Estas técnicas de acoplamiento son muy conocidas por el experto en la técnica y no se desarrollarán en la presente descripción.

La invención se refiere, bajo otro aspecto, a una composición caracterizada porque uno, al menos, de dichos anticuerpos, o uno de sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, está conjugado con una toxina celular y/o un radioelemento

Preferentemente, dicha toxina o dicho radioelemento es capaz de impedir el crecimiento o la proliferación de la célula tumoral, principalmente de inactivar totalmente dicha célula tumoral.

Preferentemente, dicha toxina es una toxina de enterobacterias, principalmente la exotoxina A de Pseudomonas.

Los radioelementos (o radio-isótopos) conjugados preferentemente con el anticuerpo empleados en terapia son radio-isótopos que emiten rayos gamma y preferentemente yodo131 , itrio90 , oro 199 , paladio100 , cobre67 , bismuto217 y antimonio211. Los radio-isótopos que emiten rayos beta y alfa pueden utilizarse igualmente en terapia.

Por toxina o radioelemento conjugado al menos a un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención, se entiende designar cualquier medio que permita unir dicha toxina o dicho radioelemento a dicho al menos un anticuerpo, principalmente por acoplamiento covalente entre los dos compuestos, con o sin la introducción de molécula de unión.

Entre los agentes que permiten una unión química (covalente), electrostática o no covalente de todo o parte de los elementos del conjugado, puede mencionarse muy particularmente benzoquinona, carbodiimida y más particularmente EDC (hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, ácido ditiobisnitrobenzoico (DTNB), tio-acetato de N-succinimidil S-acetilo (SATA), los agentes denominados de « bridging » que presentan uno o varios grupos, que tienen uno o varios grupos fenilasido, que reaccionan con los ultravioletas (U.V.) y muy preferentemente N-[-4-(azidosalicilamino)butil]-3’-(2’-piridilditio)propionamida (APDP), 3-(2piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) y 6-hidrazino-nicotinamida (HYNIC).

Otra forma de acoplamiento, muy especialmente para los radioelementos, puede consistir en la utilización de un quelante de iones bifuncional.

Entre estos quelantes, es posible mencionar los quelatos derivados de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o de DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) que han sido desarrollados para unir metales, particularmente metales radiactivos e inmunoglobulinas. Así, el DTPA y sus derivados pueden sustituirse con diferentes grupos en la cadena de carbonos con el fin de aumentar la estabilidad y la rigidez del complejo ligando-metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); patente EEUU 4 831 175).

Por ejemplo, el DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético) y sus derivados, que se han utilizado muy ampliamente en medicina y en biología durante mucho tiempo bien en su forma libre o bien en la forma de un complejo con un ión metálico, presenta la característica notable de formar quelatos estables con iones metálicos y acoplarse a proteínas de interés terapéutico o diagnóstico como anticuerpos para el desarrollo de radioinmunoconjugados en la terapia del cáncer (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).

La presente invención comprende además la utilización de la composición según la invención para la preparación de un medicamento.

La presente solicitud pretende, por lo tanto, más particularmente la utilización de una composición tal como se ha descrito más arriba para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. Entre los cánceres que pueden prevenirse y/o tratarse, se prefiere el cáncer de colon, de pulmón, de próstata o de páncreas.

Además, según un aspecto particularmente innovador y ventajoso, la presente invención pretende la utilización de una composición tal como se ha descrito más arriba para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los tumores primarios.

La invención tiene igualmente por objeto la utilización de un anticuerpo según la invención, para la preparación de un medicamento destinado a la selección específica como diana de un compuesto activo biológicamente frente a las células que expresan o sobreexpresan el receptor CD151.

Se entiende designar aquí por compuesto activo biológicamente cualquier compuesto capaz de modular, principalmente inhibir, la actividad celular, en particular su crecimiento, su proliferación, la transcripción o la traducción de genes.

Otras características y ventajas de la invención aparecerán en lo que sigue de la descripción con los ejemplos y las figuras cuyas leyendas se representan a continuación.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra las secuencias nucleotídicas y proteicas de la proteína CD151, secuencias sobre las cuales se resaltan los bucles EC1 y EC2.

La figura 2 es un esquema que ilustra la estructura de las tetraspaninas de las que forma parte la proteína CD151, y muy particularmente los dos bucles extracelulares EC1 y EC2.

La figura 3 representa la comparación PBS / anticuerpo control en el modelo ortotópico A549.

La figura 4 representa la evaluación de la actividad antitumoral del anticuerpo TS151 in vivo en el modelo ortotópico. Se injertan ratones inmunodeprimidos (n=10) por vía intrapleural con 1.106 células A549. Siete días después del injerto, los ratones se tratan por vía intraperitoneal con una dosis de inducción de 500 µg de anticuerpo TS151 seguido de un tratamiento, dos veces a la semana, durante 5 semanas, con una dosis de 250 µg de anticuerpo por ratón. Se inyecta al lote testigo PBS según el mismo esquema de administración.

La figura 5 ilustra la expresión de la molécula CD151 en pacientes que padecen cáncer de próstata. Cada letra corresponde al estudio de un paciente y para cada paciente el panel superior corresponde al tejido normal adyacente al tumor y el panel inferior corresponde al tejido tumoral.

La figura 6 ilustra la expresión de la molécula CD151 en pacientes que padecen cáncer de pulmón. Cada letra corresponde al estudio de un paciente y para cada paciente el panel superior corresponde al tejido normal adyacente al tumor y el panel inferior corresponde al tejido tumoral.

La figura 7 ilustra la actividad in vivo de los anticuerpos TS151 y TS151R en el modelo de xenoinjerto PC3. Se injertaron ratones Swiss Nude (n=6) por vía subcutánea con células PC3. Cinco días después del injerto de las células, los ratones reciben, por vía i.p., una dosis de inducción de 2 mg/ratón de los anticuerpos a ensayar seguido de dos administraciones a la semana de una dosis de 1 mg/ratón de estos anticuerpos. El volumen tumoral se evalúa por la fórmula π/6 x Longitud x ancho x espesor y se efectúa un ensayo de Mann y Whitney para la evaluación estadística de los resultados.

La figura 8 ilustra la evaluación de la especificidad de los anticuerpos TS151 y TS151r para la forma humana de CD151 por transferencia western.

La figura 9 ilustra la inhibición de la adhesión de las células A549 sobre la laminina 5. A/ Inhibición de la adhesión celular por diferentes anticuerpos anti-integrinas. B/ Inhibición de la adhesión celular por una combinación TS151/anticuerpo anti-integrina α3.

Ejemplo 1 : Generación de los anticuerpos TS151r y TS151

Generación del anticuerpo TS151r

Para generar el anticuerpo TS151r, se inmunizaron ratones BALB/c por vía intraperitoneal por medio de 107 células HeLa. Después de 3 inmunizaciones y una inyección de refuerzo final, las células del bazo de un ratón se fusionaron con células de mieloma P3X63AG8 por las técnicas clásicamente descritas por Kohler y Milstein

(5.107 células de bazo / 3.107 células de mieloma). Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes de la fusión se cribaron para evaluar su capacidad de reconocimiento de las células HeLa por citometría de flujo, y su capacidad de inmunoprecipitar CD151 a partir de un lisado de células HeLa preparado en presencia del detergente Brij 97 y que conlleva la co-inmunoprecipitación de CD9. Se comprueba que el anticuerpo TS151r posee estas diferentes propiedades.

Generación del anticuerpo TS151

Para generar el anticuerpo TS151, se inmunizaron ratones BALB/c por vía intraperitoneal por medio de 107 células Jurkat y 107 HEL (2 inmunizaciones). Después de una inyección de refuerzo final por medio de complejos proteicos que contienen la proteína ADAM10 obtenidos a partir de lisados de células Jurkat y HEL, las células del bazo se fusionaron con células de mieloma P3X63AG8 por las técnicas clásicamente descritas por Kohler y Milstein

(5.107 células de bazo / 3.107 células de mieloma). Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes de la fusión se criban en primer lugar para evaluar su capacidad de reconocimiento de las células Jurkat y HEL por citometría de flujo. El anticuerpo TS151 se seleccionó tomando como base su capacidad de inmunoprecipitar CD151 a partir de un lisado celular preparado en presencia del detergente Brij 97 y que conlleva la co-inmunoprecipitación de otras tetraspaninas.

Ejemplo 2 : Evaluación in vivo de la actividad anti-tumoral de los anticuerpos TS151 y TS151r en un modelo ortotópico A549

Material y Método

Después de verificar la expresión de la proteína CD151 (datos no mostrados), las células A549 originarias de la ATCC se cultivan rutinariamente en medio F12K, 10 mM de glutamina, 10% de SVF. Estas células se dividen 2 días antes del injerto con el fin de que estén en la fase exponencial de crecimiento. Para el injerto, se anestesian ratones inmunodeprimidos de 7 semanas antes de recibir 1.106 células A549 por vía intrapleural. El tumor primario se desarrolla rápidamente e invade en 4 días las estructuras adyacentes al sitio de inyección incluyendo el mediastino, los pulmones y el diafragma. Para mimetizar mejor la enfermedad, el inicio del tratamiento no comienza hasta 7 días después del implante de las células, por vía intraperitoneal. Después de inyectar una dosis de inducción de 500 µg/ratón, se administra el anticuerpo TS151 purificado 2 veces a la semana, durante 5 semanas, a la dosis de 250 µg/ratón. Un grupo de ratones que recibe PBS se introduce como control habida cuenta de que los experimentos efectuados anteriormente han mostrado que la administración de un isotipo control IgG1 no tenía ningún impacto sobre la supervivencia de los animales.

La figura 3, obtenida a partir de datos preliminares, demuestra la especificidad de la actividad observada con el anticuerpo anti-CD151. En efecto, el tratamiento de los animales con una IgG1 murina (mIgG1) utilizada como isotipo control muestra que esta última no tiene ningún impacto sobre la supervivencia de los animales inyectados con el PBS utilizado como vehículo de estos anticuerpos.

El parámetro de evaluación de este modelo es la supervivencia de los animales y la actividad anti-tumoral se expresa por el cálculo de T/C%= mediana de supervivencia de los animales tratados/mediana de supervivencia de los animales del grupo control X 100. Se estableció que un T/C% superior o igual a 125 % significa una actividad del producto.

Resultados La Figura 4 muestra una actividad antitumoral del anticuerpo TS151 con un T/C% calculado de 140%

Ejemplo 3 : Comparación de la actividad anti-tumoral in vivo de los anticuerpos TS151 y 50-6 en un modelo ortotópico A549

Material y Método El protocolo aplicado es idéntico al del ejemplo 2 anterior.

Resultados

Los datos obtenidos ponen claramente de manifiesto que el anticuerpo TS151 presenta una actividad anti

tumoral claramente superior a la mostrada por el anticuerpo 50-6 que no presenta, en cuanto a él, más que un

T/C% de 118, es decir, inferior al valor umbral de 125% (datos no mostrados).

Los resultados obtenidos, a saber el T/C% calculado como se ha definido más arriba, se representan en la tabla 4 siguiente.

Anticuerpo TS151

Anticuerpo 50-6

T/C%

140 118

10 Tabla 4

Ejemplo 4 : Estudio de la expresión de la molécula CD151

La expresión de la proteína CD151 se investigó por inmunohistoquímica en muestras de tejidos humanos procedentes de pacientes que padecen cánceres de próstata o cáncer de pulmón. En estos pacientes estaban 15 disponibles láminas de tejidos normales adyacentes al tumor y por lo tanto se incluyeron para calibrar el nivel de

expresión en los tejidos tumorales frente a los normales.

Para estos experimentos, se utilizan láminas de tipo « Tissue array » comerciales. Después de la

desparafinización, se efectuó un desenmascaramiento antigénico a 30°C por medio de una disolución enzimática

que contiene pepsina (Labvision ref. AP-9007-005). Esta etapa fue seguida por una etapa de eliminación de las

20 peroxidasas endógenas por incubación de los cortes en una disolución de peróxido de hidrógeno (Sigma) al 0,3% en agua. Se efectuó una saturación de los sitios no específicos con una disolución de Ultra-V-Block (Labvision, ref. TA-125-UB) y el marcaje se efectuó mediante un anticuerpo murino anti-CD151 comercial (Serotech, Ref. MCA 1856) utilizado a una concentración final de 5 µg/ml. Un anticuerpo isotipo control IgG1 murino (DakoCytomation, Ref. X0931) se utiliza como control negativo del experimento. El revelado del marcaje se hace con el sistema de

25 revelado Envision Dual Link (DakoCytomation, Ref. K4061) y la referencia de DAB, sustrato de las peroxidasas es S3309 de DakoCytomation. Los resultados presentados en la figura 5 muestran que varios pacientes que desarrollan tumores de próstata presentan una sobreexpresión de la molécula CD151. Esta sobreexpresión puede ser muy significativa para el 20% de los pacientes estudiados (pacientes A y C) o moderada (pacientes A y D). Debe indicarse que,

30 excepto a nivel de las células endoteliales, los tejidos normales prostáticos correspondientes no expresan o expresan poco CD151 y que, en caso de expresión, ésta parece estar limitada a las estructuras de tipo glandular. El paciente E presenta un ejemplo de tumor que no expresa CD151.

En el caso del cáncer de pulmón (Figura 6), se observa una expresión moderada (paciente A) a fuerte (paciente B) a nivel de determinadas células del tejido pulmonar normal. Sin embargo, el tejido tumoral presenta 35 una densidad muy grande de células fuertemente marcadas (pacientes A y B). El paciente C presenta un ejemplo

de tumor que no expresa CD151.

Ejemplo 5 : Efecto de los anticuerpos TS151 y TS151R sobre el crecimiento in vivo del tumor PC3 implantado por vía subcutánea en el ratón Nude.

40 Dados los resultados obtenidos en inmunohistoquímica sobre los « tissue array » de próstata, se consideró una evaluación de los anticuerpos anti-CD151 sobre un xenoinjerto de tumor PC3. La línea PC3 es una línea prostática independiente de andrógenos originaria de la ATCC y cultivada en medio F12K+10% SVF+L-Glutamina. Para la evaluación, se implantan 5.106 células PC3 en el flanco derecho de ratones Swiss Nude. Cinco días después del implante, los animales se aleatorizan sobre la base del volumen tumoral y se reparten en 3 grupos

45 comparables. El volumen tumoral del lote de animales injertados seleccionado está comprendido entre 41 y 47 mm3 (volumen calculado con la fórmula π/6 x Longitud x ancho x espesor) en el día 0 del tratamiento. Los animales reciben los anticuerpos purificados a ensayar o PBS. Las dosis de anticuerpo y la frecuencia de las inyecciones son las siguientes : dosis de inducción 2 mg/dosis de anticuerpo ; dosis de mantenimiento 1 mg/dosis 2 veces a la semana.

50 Los resultados presentados en la figura 7 muestran que los dos anticuerpos ensayados (TS151 y TS151R) se comportan de forma comparable e inhiben muy significativamente el crecimiento del tumor PC3 implantado en posición subcutánea en el ratón Swiss Nude. La tabla 5 siguiente resume los análisis estadísticos de estos resultados.

55

J0

J3 J7 J10 J14 J17 J20 J24 J28 J31 J35

Control/TS151

Mann-Whitney (Wilcoxon) p=0,132 p=0,937 p=0,065 p=0,589 p=0,002 p=0,002 p=0,002 p=0,002 p=0,002 p=0,002 p=0,002

Control/TS151R

Mann-Whitney (Wilcoxon) p=0,485 p=0,180 p=0,180 p=0,589 p=0,240 p=0,026 p=0,004 p=0,002 p=0,002 p=0,002 p=0,002

Tabla 5 Los estudios realizados en paralelo y presentados en la figura 8 muestran que los anticuerpos TS151 y TS151R reconocen específicamente la molécula CD151 humana sin ninguna reacción cruzada con el receptor 12

murino. Esta observación sugiere, por lo tanto, que la actividad observada en el modelo de xenoinjerto en el ratón nude no puede atribuirse más que a un efecto directo sobre el tejido humano injertado y excluye, consecuentemente, cualquier interferencia de los anticuerpos TS151 y TS151R con las células del estroma del tumor o las células endoteliales murinas. Por otra parte, TS151 y TS151R son dos IgG1 murinas y debido a ello y como conoce el experto en la técnica, es poco probable que la actividad observada esté ligada a las funciones efectoras de tipo ADCC y CDC que están mediadas muy particularmente por los anticuerpos de tipo IgG2a murino en el ratón.

El conjunto de estos resultados está de acuerdo, por lo tanto, con un mecanismo de acción directamente ligado a la inhibición de la proliferación celular tumoral in vivo por los anticuerpos TS151 y TS151R.

Ejemplo 6 : Especificidad de los anticuerpos TS151 y TS151r

La especificidad de los anticuerpos TS151 y TS151r se evaluó por transferencia western. Se depositaron lisados de tejidos humanos y murinos de pulmón, páncreas y colon (Biochain, 10 µg de proteínas totales), así como cantidades crecientes de lisado celular de HT-29 (10, 20 y 50 µg de proteínas totales) en un gel de acrilamida 4-12 % (BioRad). Después de la electroforesis (condiciones no reductoras), las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se transferencia se incubaron con los anticuerpos TS151 y TS151r purificados y después con un anticuerpo policlonal de conejo anti-Ig de ratón acoplado a la peroxidasa (GE Healthcare) antes de revelado de tipo ECL.

Los anticuerpos TS151 y TS151r presentan una especificidad para la forma humana de CD151 como demuestra el reconocimiento por transferencia western de CD151 en los lisados de células HT-29 y de diferentes tejidos de origen humano (figura 8). La ausencia de reactividad con la CD151 murina en los lisados de diferentes tejidos extraídos del ratón confirma la especificidad de los anticuerpos TS151 y TS151r para la forma humana de CD151.

Ejemplo 7 : Inhibición de la adhesión celular

Los experimentos de adhesión de células tumorales sobre la laminina 5, ligando de las integrinas α3β1y α6β4 con las que puede asociarse CD151, se realizan en placas de 96 pocillos. Después de inmovilización de la laminina 5 (Chemicon, 200 µl a 1 µg/ml) durante 1 hora a 37°C, los pocillos se saturan con BSA a 2 mg/ml (200 µl, 1 h a 37°C). Las células A549 en suspensión se marcan con diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA, Invitrogen) y se añaden a razón de 100.000 células (100 µl) por pocillo en presencia o ausencia de anticuerpo (100 µl). Después de incubar a 37°C durante 15, 30 ó 60 minutos, las células que no se hayan adherido se eliminan. Después de leer la quimioluminiscencia con un luminómetro (Mithras, Berthold), se determina el porcentaje de células que se han adherido mediante una gama de células marcadas con CMFDA. El anticuerpo anti-CD151 TS151 y los anticuerpos anti-integrina α3 P1B5, anti-α6 NKI-Go3 y anti-β4 ASC-3 (Chemicon) se evalúan a la concentración final de 20 µg/ml. El anticuerpo 9G4, dirigido contra una proteína de la membrana de Escherichia coli, se utiliza como control isotípico.

El anticuerpo anti-integrina α3 P1B5 inhibe la adhesión de las células A549 sobre la laminina 5 (Figura 9A), mientras que los anticuerpos anti-integrina α6 NKI-Go3 y anti-integrina β4 ASC-3 no inhiben la adhesión de las células A549 sobre este mismo ligando. Se constata, sin embargo, una pérdida de inhibición en función del tiempo. La inhibición inducida por P1B5 es en efecto superior a 90% a 15 min, pero cae a aproximadamente 20% después de 1 h. La asociación del anticuerpo P1B5 con el anticuerpo anti-integrina α6 NKI-Go3 o el anticuerpo anti-integrina β4 ASC-3 permite mantener una fuerte inhibición de adhesión después de 1 h : ésta es superior a 90% para la asociación con el anticuerpo anti-a6, y de aproximadamente 70% para la combinación con el anticuerpo anti-β4. Estos resultados demuestran que las células A549 se adhieren sobre la laminina 5 en primer lugar por medio de la integrina α3β1 y en segundo lugar por medio de la integrina α6β4.

El anticuerpo anti-CD151 TS151 no inhibe la adhesión de las células A549 sobre la laminina 5 cuando se utiliza solo (Figura 9B). El efecto de una combinación de TS151 con P1B5 sobre la adhesión de las células A549 se evaluó y comparó con las combinaciones mencionadas anteriormente. Esta combinación TS151/P1B5 proporciona un resultado comparable a la asociación del anticuerpo anti-α6/anti-α3 y anti-β4/anti-α3. Se observa en efecto un mantenimiento de la inhibición de adhesión, del orden de 80% después de 1 h. El anticuerpo TS151 será, por lo tanto, capaz de inhibir la adhesión de las células A549 por medio de un efecto antagonista sobre la integrina α6β4.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Pierre Fabre Médicament

<120> Utilización de un anticuerpo anti-CD151 para el tratamiento del

cáncer

<130> cas 640

<150> FR 06/09135

<151> 2006-10-18

<160> 38

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 759

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1 atgggtgagt tcaacgagaa gaagacaaca tgtggcaccg tttgcctcaa gtacctgctg 60 tttacctaca attgctgctt ctggctggct ggcctggctg tcatggcagt gggcatctgg 120 acgctggccc tcaagagtga ctacatcagc ctgctggcct caggcaccta cctggccaca 180 gcctacatcc tggtggtggc gggcactgtc gtcatggtga ctggggtctt gggctgctgc 240 gccaccttca aggagcgtcg gaacctgctg cgcctgtact tcatcctgct cctcatcatc 300 tttctgctgg agatcatcgc tggtatcctc gcctacgcct actaccagca gctgaacacg 360 gagctcaagg agaacctgaa ggacaccatg accaagcgct accaccagcc gggccatgag 420 gctgtgacca gcgctgtgga ccagctgcag caggagttcc actgctgtgg cagcaacaac 480 tcacaggact ggcgagacag tgagtggatc cgctcacagg aggccggtgg ccgtgtggtc 540 ccagacagct gctgcaagac ggtggtggct ctttgtgggc agcgagacca tgcctccaac 600 atctacaagg tggagggcgg ctgcatcacc aagttggaga ccttcatcca ggagcacctg 660 agggtcattg gggctgtggg gatcggcatt gcctgtgtgc aggtctttgg catgatcttc 720 acgtgctgcc tgtacaggag tctcaagctg gagcactac 759

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 2

Met Gly Glu Phe Asn Glu Lys Lys Thr Thr Cys Gly Thr Val Cys Leu 15 10 15 Lys Tyr Leu Leu Phe Thr Tyr Asn Cys Cys Phe Trp Leu Ala Gly Leu 20 25 30 Ala Val Met Ala Val Gly Ile Trp Thr Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr 35 40 45 Ile Ser Leu Leu Ala Ser Gly Thr Tyr Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Leu 50 55 60 Val Val Ala Gly Thr Val Val Met Val Thr Gly Val Leu Gly Cys Cys 65 70 75 80 Ala Thr Phe Lys Glu Arg Arg Asn Leu Leu Arg Leu Tyr Phe Ile Leu 85 90 95 Leu Leu Ile Ile Phe Leu Leu Glu Ile Ile Ala Gly Ile Leu Ala Tyr 100 105 110 Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asn Leu Lys Asp 115 120 125 Thr Met Thr Lys Arg Tyr His Gln Pro Gly His Glu Ala Val Thr Ser 130 135 140 Ala Val Asp Gln Leu Gln Gln Glu Phe His Cys Cys Gly Ser Asn Asn

145 150 155 160 Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg Ser Gln Glu Ala Gly 165 170 175 Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Cys Cys Lys Thr Val Val Ala Leu Cys 180 185 190 Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn Ile Tyr Lys Val Glu Gly Gly Cys 195 200 205 Ile Thr Lys Leu Glu Thr Phe Ile Gln Glu His Leu Arg Val Ile Gly 210 215 220 Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Cys Val Gln Val Phe Gly Met Ile Phe 225 230 235 240 Thr Cys Cys Leu Tyr Arg Ser Leu Lys Leu Glu His Tyr 245 250

<210> 3

<211> 327

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 3 gcctactacc agcagctgaa cacggagctc aaggagaacc tgaaggacac catgaccaag 60 cgctaccacc agccgggcca tgaggctgtg accagcgctg tggaccagct gcagcaggag 120 ttccactgct gtggcagcaa caactcacag gactggcgag acagtgagtg gatccgctca 180 caggaggccg gtggccgtgt ggtcccagac agctgctgca agacggtggt ggctctttgt 240 gggcagcgag accatgcctc caacatctac aaggtggagg gcggctgcat caccaagttg 300 gagaccttca tccaggagca cctgagg 327

<210> 4

<211> 109

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 4

Ala Tyr Tyr Gln Gln Leu Asn Thr Glu Leu Lys Glu Asn Leu Lys Asp 15 10 15 Thr Met Thr Lys Arg Tyr His Gln Pro Gly His Glu Ala Val Thr Ser 20 25 30 Ala Val Asp Gln Leu Gln Gln Glu Phe His Cys Cys Gly Ser Asn Asn 35 40 45 Ser Gln Asp Trp Arg Asp Ser Glu Trp Ile Arg Ser Gln Glu Ala Gly 50 55 60 Gly Arg Val Val Pro Asp Ser Cys Cys Lys Thr Val Val Ala Leu Cys 65 70 75 80 Gly Gln Arg Asp His Ala Ser Asn Ile Tyr Lys Val Glu Gly Gly Cys 85 90 95 Ile Thr Lys Leu Glu Thr Phe Ile Gln Glu His Leu Arg 100 105

<210> 5

<211> 54

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 5 tggacgctgg ccctcaagag tgactacatc agcctgctgg cctcaggcac ctac 54

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 6

Trp Thr Leu Ala Leu Lys Ser Asp Tyr Ile Ser Leu Leu Ala Ser Gly 15 10 15 Thr Tyr

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser 15

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 8

Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro 15

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 9

Ala Arg Arg Glu Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Glu Tyr 15 10

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 10

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe

50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Arg Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95 Ala Arg Arg Glu Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 11

Gln Ser Val Ser Thr Ser Thr Phe Ser Tyr 15 10

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 12

Ser Ala Ser 1

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 13

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Leu Thr 15

<210> 14

<211> 111

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30 Thr Phe Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Ser Trp

85 90 95 Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp 15

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 16

Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr 15

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 17

Ala Arg Gly Asp Asp Ala Tyr Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10 15

<210> 18

<211> 123

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Val Val Arg Pro Gly Ala 15 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30 Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60 Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Arg Gly Asp Asp Ala Tyr Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 19

Gln Ser Val Ser Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr 15 10

<210> <211> <212> <213>

20 3 PRT mus musculus

<400>

20

Tyr Ala Ser 1

<210> <211> <212> <213>

21 9 PRT mus musculus

<400>

21

Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr 1 5

<210> <211> <212> <213>

22 111 PRT mus musculus

<400>

22

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Arg Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Ile Gln Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> <211> <212> <213>

23 24 ADN mus musculus

<400> 23 ggttatacct tcacagacta ttca

24

<210> <211> <212> <213>

24 24 ADN mus musculus

<400> 24 ataaacactg agactggtga gcca

24

<210> 25

<211> 39

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 25 gctagaaggg agtatggtaa ctactatggt atggagtac 39

<210> 26

<211> 360

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 26 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 acagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccaa cactgcctat 240 ttgcggatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc tagaagggag 300 tatggtaact actatggtat ggagtactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcgtca 360

<210> 27

<211> 30

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 27 caaagtgtca gtacatctac ctttagttat 30

<210> 28

<211> 9

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 28 tctgcatcc 9

<210> 29

<211> 27

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 29 cagcacagtt gggagattcc gctcacg 27

<210> 30

<211> 333

<212> ADN

<213> mus musculus

<400> 30 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctacct ttagttatat acactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt ctgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat ttctgtcagc acagttggga gattccgctc 300 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaa 333

<210> <211> <212> <213>

31 24 ADN mus musculus

<400> 31 ggctacacct tcaccagctc ctgg

24

<210> <211> <212> <213>

32 24 ADN mus musculus

<400> 32 attcatccta atagtggtaa tact

24

<210> <211> <212> <213>

33 48 ADN mus musculus

<400> 33 gcaagagggg atgatgctta ctacagcggg ctctatgcta tggactac

48

<210> <211> <212> <213>

34 369 ADN mus musculus

<400> 34 caggtccaac tgcagcagcc tgggtctgtg gtggtgaggc ctggagcttc agtgaaactg tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctcctgga tgcactgggc gaagcagagg cctggacaag gccttgagtg gattggacag attcatccta atagtggtaa tactaattac aatgagaagt tcaaggtcaa ggccacactg actatagaca catcctccag cacagcctac gtggatctca acagcctgac atctggggac tctgcggtct attactgtgc aagaggggat gatgcttact acagcgggct ctatgctatg gactactggg gtcagggaac ctcagtcacc gtctcctca

60 120 180 240 300 360 369

<210> <211> <212> <213>

35 30 ADN mus musculus

<400> 35 caaagtgtca gtacatctag gtatagttat

30

<210> <211> <212> <213>

36 9 ADN mus musculus

<400> 36 tatgcatcc

9

<210> <211> <212> <213>

37 27 ADN mus musculus

<400> 37 caacacagtt gggagattcc gtacacg 27

5

<210> 38

<211> 333

<212> ADN

<213> mus musculus

10

<400> 38 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctaggt atagttatat gcactggtac 120 caacagatac aaggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 15 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat cactgtcaac acagttggga gattccgtac 300 acgttcggag gggggaccac gctggaaata aaa 333

20

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de al menos un anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a la proteína CD151 y de inhibir así el crecimiento tumoral para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de los tumores primarios.

2. 2.

   Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, es capaz de inhibir la proliferación de las células tumorales.

3. 3.

   Uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicho al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, es capaz de inhibir la actividad promotora de metástasis de dicha proteína CD151 en las células tumorales.

4. 4.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho al menos un anticuerpo antiCD151, o uno de sus fragmentos funcionales, es capaz de inhibir la migración celular de las células tumorales.

5. 5.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, es capaz de inhibir la adhesión celular de las células tumorales.

6. 6.

   Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, consiste en un anticuerpo monoclonal.

7. 7.

   Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende:

   -las 3 CDRs de la cadena pesada CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 respectivamente de secuencias SEQ ID No.7, 8 y 9; y

   -las 3 CDRs de la cadena ligera CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 respectivamente de secuencias SEQ ID No. 11, 12 y 13.

8. 8.

   Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 10 y una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID No. 14.

9. 9.

   Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende:

   -las 3 CDRs de la cadena pesada CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 respectivamente de secuencias SEQ ID No. 15, 16 y 17; y

   -las 3 CDRs de la cadena ligera CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 respectivamente de secuencias SEQ ID No.19, 20 y 21.

10. 10.

    Uso según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID No. 18 y una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID No.22.

11. 11.

    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichos cánceres consisten en los cánceres de colon, de pulmón, de próstata o de páncreas.

12. 12.

    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la preparación de una composición farmacéutica que comprende, además, al menos un vehículo aceptable farmacéuticamente.

13. 13.

    Composición caracterizada porque comprende como principio activo al menos un anticuerpo anti-CD151, o uno de sus fragmentos funcionales, capaz de unirse a la proteína CD151 e inhibir el desarrollo de tumores primarios.

14. 14.

    Composición según la reivindicación 13 para su utilización en el tratamiento de tumores primarios, caracterizada porque dichos anticuerpos anti-CD151 o uno de sus fragmentos funcionales, es un anticuerpo monoclonal seleccionado entre los anticuerpos:

    -TS151 que comprende las 3 CDRs de la cadena pesada CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 respectivamente de secuencias SEQ ID No. SEQ ID No. 7, 8 y 9; y las 3 CDRs de la cadena ligera CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 respectivamente de secuencias SEQ ID No. 11, 12 y 13; o

    -TS151r que comprende las 3 CDRs de la cadena pesada CDR-H1, CDR-H2 y CDRH3 respectivamente de secuencias SEQ ID No. 15, 16 y 17; y las 3 CDRs de la cadena ligera CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 respectivamente de secuencias SEQ ID No. 19, 20 y 21.
15. 15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 para su utilización en el tratamiento de tumores primarios, caracterizada porque comprende, además, como producto de combinación para una uso simultáneo, separada o escalonada en el tiempo, al menos un agente citotóxico/citostático y/o una toxina celular y/o

    un radioelemento y/o un anticuerpo monoclonal.