ES2362100T3 - Método para producir endonucleasas altamente sensibles, nuevas preparaciones de endonucleasas y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una endonucleasa recombinante especifica de emparejamientos erróneos en el que dicho método comprende: - expresar dicha endonucleasa recombinante en células de una planta hospedadora completa o de un órgano separado de esta, transformada transitoriamente por agroinfiltración con una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica dicha endonucleasa; - aislar dicha endonucleasa recombinante de dichas células de la planta hospedadora.

Description

La invención se refiere a la identificación y preparación de endonucleasas específicas de emparejamiento erróneo que tienen una actividad y sensibilidad elevada y una amplia especificidad de sustrato.

A comienzos del último siglo, el descubrimiento de la posibilidad de inducir mutaciones en el ADN por radiaciones o productos químicos ha aportado una considerable expectativa para comprender la función de genes in vivo. Desde entonces, la mutagénesis y la variación de secuencias naturales se han usado ampliamente para identificar nuevas funciones, genes correspondientes a una función específica así como sitios activos dentro de una proteína específica.

Un aspecto critico para la implementación de esta estrategia, en particular en el caso de mutaciones puntuales, es la elección de métodos de detección de mutaciones que se diseñan para seleccionar grandes tramos de ADN sin reducir la sensibilidad o especificidad del diagnóstico, proporcionando al mismo tiempo información sobre la localización de la mutación. Entre las herramientas y métodos más usados están los basados en el ADN defectuosamente emparejado que podría crearse in vitro por desnaturalización y renaturalización de dos moléculas de ADN. Los emparejamientos erróneos se detectan en estas moléculas heteroduplex usando productos químicos como aglutinantes o moléculas de surcos que pueden escindir específicamente el ADN monocatenario en el sitio de emparejamiento erróneo. Como alternativa, se han usado endonucleasas específicas monocatenarias para escindir en ADN en el sitio de emparejamiento erróneo. La mayoría de las endonucleasas descritas en este documento pertenecen ahora a la clase de nucleasas S1/P1.

Se sabe que nucleasas tales como S1, P1 y la nucleasa de frijol chino, pertenecientes a la misma familia denominada: “familia de nucleasas S1/P1” o “familia de nucleasas S1” escinden el ADN en regiones de una sola cadena. Sin embargo, estas nucleasas tienen un pH óptimo ácido en el intervalo de 4,0-5,0.

Esto es desventajoso para detectar emparejamientos erróneos, ya que valores bajos de pH favorecen la despurinización del ADN y desestabilizan los duplex de ADN, lo que conduce a una degradación no específica de ADN y reduce la sensibilidad y especificidad en la detección.

Hace algunos años, en extractos de diversas plantas, OLEYKOWSKI et al. (Nucleic Acids Res, 26, 4597-4602, 1998) detectaron una actividad endonucleasa de emparejamiento erróneo que tenia un pH óptimo neutro (aproximadamente pH 8) y que realizaba una escisión en una sola cadena en el lado 3’ de un sitio de emparejamiento erróneo. Estos autores describieron que esta actividad endonucleasa de emparejamiento erróneo se asociaba con manoxil glucoproteínas en extractos de brotes de alfalfa, espárragos, apio y tomate. La enzima procedente del apio, denominada CEL I, se purificó de los tallos del apio por etapas sucesivas de precipitación en sulfato de amonio, unión a una columna de agarosa-concavalina A y elución mediante �alfa�-d+-manosa, unión a una columna de fosfocelulosa y elución mediante un gradiente lineal de KCI, y fraccionamiento por cromatografía de exclusión de tamaño. La preparación de CEL I obtenida de esta manera contenía diversas bandas de proteínas de 34-39 kDa.

En YANG et al., (Biochemistry, 39, 3533-3541, 2000) y en la solicitud PCT documento WO 01/62974 se describe una purificación de CEL I mejorada mediante el uso de alfametil-manosido en los tampones de purificación para superar la agregación de CEL I con lecitinas endógenas. Estos documentos también describen la clonación del ADNc de CEL I. Basándose en datos de secuencias, CEL I se asignó a una subfamilia de la familia de nucleasas S1/P1 y se identificaron diversos posibles homólogos codificados por los genes BFN 1 de Arabidopsis (nucleótido de GenBank AY040016), ZEN 1 de Zinnia (nucleótido de GenBank AB003131), y DSA6 de lirio (nucleótido GenBank AF 082031).

Se ha demostrado que la actividad endonucleasa de CEL I es altamente especifica para emparejamientos erróneos por sustitución de bases y para emparejamientos erróneos resultantes de sucesos de inserción/deleción y que es independiente del contexto de la secuencia flanqueante. Por tanto esta es útil como un reactivo de detección de mutaciones en diversos métodos que implican selección mutacional. El sistema de detección de emparejamiento erróneo de CEL I es un ensayo sencillo que requiere amplificación de la secuencia diana por PCR, desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heteroduplex entre el alelo de tipo silvestre y el alelo mutante, escisión enzimática del emparejamiento erróneo y análisis del producto por electroforesis en gel. Esto es ventajoso sobre otros sistemas de detección de emparejamiento erróneo conocidos, como HPLC desnaturalizante, debido a su especificidad y sensibilidad para la detección de emparejamientos erróneos en grandes tramos de ADN.

A modo de ejemplo, OLEYKOWSKI et al y YANG et al (en publicaciones citadas anteriormente) indican su uso para detectar modificaciones de secuencias en el gen BRCA 1 humano y SOKUENKO et al (Nucl. Acids Res., 29 e111, 2001) describen su uso para detectar mutaciones y polimorfismos en grandes regiones de ADN genómico. CEL I también se usa para selección de alto rendimiento en TILLNG (Selección de lesiones inducidas localmente en genomas), en la que después de la mutagénesis química se realiza la selección para mutaciones puntuales, o para la detección de polimorfismos en poblaciones naturales, denominado también “Ecotilling” (COMAI et al, Plant Journal, 37, 778-786, 2004). Esto se ha usado en plantas (COLBERT et al., Plant Physiology 126, 480-484, 2001; TILL et al., Genome Research 13, 524-530, 2003; PERRY et al., Plant Phsysiology 131, 866-871, 2003) así como en animales tales como el pez cebra (WIENHOLDS et al., Genome res., 13, 2700-2707, 2003). Las solicitud PCT WO 03/066809 propone el uso de CEL I en un método para reclasificar variaciones de secuencia entre polinucleótidos relacionados denominado “Reclasificación Genética por Resolución de Emparejamiento erróneo” (GRAMMR).

Sin embargo CEL I tiene la desventaja de tener una eficacia de escisión que varia de un emparejamiento erróneo a otro: en el caso de un bucle de ADN con una sola inserción de nucleótidos, OLEYKOWSKI et al. (Nucleic Acids Res. 1998 Oct 15; 26 (20): 4567-602) indican que la preferencia de substrato de CEL I es G>A>C>T; en el caso de emparejamientos erróneos por sustituciones de bases la preferencia de substrato de CEL I es C/C ≥ C/A ~C/T ≥G/G >A/C ~A/A ~T/C > T/G ~G/T ~G/A ~A/G > T/T. Esta eficacia es significativa en los emparejamientos erróneos C/A, C/C, C/T, G/G. Se observa una disminución de la actividad para los otros y es casi ineficaz en el emparejamiento erróneo T/T. Esta variación en la eficacia de escisión puede dar como resultado una menor precisión en la detección de algunas mutaciones cuando se necesita la detección de un alelo en un grupo de ADN.

Otro inconveniente limitante del uso de CEL I es el bajo rendimiento de los métodos de purificación disponibles. OLEYKOWSKI et al., comenzando con 7 Kg. de tallo de apio que contenía aproximadamente 350 g de proteína obtuvieron 3 ml de CEL I a 0,1 µg/µl; el procedimiento de purificación descrito por YANG et al. y en el documento PCT WO 01/62974 se obtuvieron 5µg de CEL I purificada con una actividad específica de 3,1 x 107 de proteína CEL I unidades/mg comenzando a partir de 105 Kg. de tallo de apio.

Para obtener grandes cantidades de CEL I, se ha propuesto producirla por tecnología de ADN recombinante. La solicitud PCT WO 03/066809 propone una amplia lista de vectores y células hospedadoras posiblemente adecuados que incluyen casi cualquiera de los sistemas de expresión procariotas o eucariotas conocidos; sin embargo, el único sistema de expresión realmente descrito en este documento es un vector basado en tobamovirus. La construcción resultante de la clonación en dicho vector del ADNc de CEL I fusionado a una secuencia que codifica una etiqueta de 6-Histidinas se ha usado para infectar plantas de tabaco. CEL I recombinante se recuperó del líquido intracelular de las plantas infectadas y se purificó por cromatografía de afinidad de metales sobre resina de NTA-níquel. El documento PCT WO 03/066809 no dice nada acerca del rendimiento de la enzima purificada. Esto indica que su actividad en una reacción GRAMMR es similar a la de la enzima natural purificada a partir del apio. Uno de los inconvenientes de este sistema es que los virus tienden a recombinar, perdiendo parcial o completamente el gen expresado. Esto conduce a la producción de formas truncadas en la adición de CEL I de longitud completa, disminuyendo la actividad específica de la enzima.

La solicitud PCT WO2004/035771 se refiere a un método para la producción de CEL I en levaduras. Para este efecto, se construyó un gen sintético que codifica CEL I modificando la secuencia de ADN natural de CEL I de acuerdo con el uso de codón en levadura. Este documento indica que la CEL I recombinante producida por este gen sintético puede reconocer todas las combinaciones de emparejamiento erróneo posibles y explica con ejemplos el reconocimiento y la escisión del emparejamiento erróneo A/A. Por otro lado no dice nada acerca de la preferencia de emparejamiento erróneo de dicha CEL I recombinante.

De lo anterior parece que los métodos actualmente disponibles para la producción de CEL I recombinante no proporcionan ninguna mejora significativa sobre la producción de CEL I natural procedente del apio. Además no tratan el problema de la preferencia de substrato del CEL I natural.

Además, sería deseable tener otras endonucleasas que pudieran, como CEL I, escindir emparejamientos erróneos de pares de bases únicos en moldes de ADN heteroduplex a pH neutro, pero que tuvieran una preferencia de emparejamiento erróneo diferente o preferiblemente que escindieran igual de bien todos los emparejamientos erróneos. Sin embargo, hasta ahora dichas endonucleasas no se han identificado.

La existencia de actividades endonucleasas de tipo CEL I se ha descrito en muchas plantas (consúltese, por ejemplo OLEYKOWSKI et al., 1998 indicado anteriormente). Sin embargo, las enzimas responsables de estas actividades no se han caracterizado, sus propiedades químicas, tales como preferencia de sustrato, no se han estudiado y sus secuencias no se han identificado. Por otro lado, se han identificado por ordenador homólogos estructurales de CEL I (YANG et al. citado anteriormente; TILL et al. Nucleic Acids Res., 32, 2632-41, 2004). Se han descrito tres de estos (BFN1 de Arabidopsis, ZEN1 de Zinnia y DSA6 de lirio) como implicados en la senectud de las plantas (PEREZAMADOR et al., Plant Physiol. 122, 169-180 2000). Sin embargo, no se han purificado y permanecen sin caracterizarse bioquímicamente: en particular, no se ha ensayado su eficacia para reconocer emparejamientos erróneos en ADN heteroduplex in vitro. Procedente de la espinaca, se ha purificado una endonucleasa denominada SP que, basándose en su actividad, se ha asignado a la familia S1/P1 y que tiene un pH óptimo neutro. Al igual que CEL I, esta enzima escinde emparejamientos erróneos por inserciones/deleciones y por sustituciones de bases; sin embargo no reconoce a aquellos que contienen un resto de guanina (OLEYKOWSKI et al. Biochemistry, 38, 2200-5, 1999).

Buscando métodos alternativos para obtener CEL I recombinante, los autores de la invención han tratado de expresarla en plantas mediante expresión transitoria mediada por Agrobacterium.

Estos han expresado la CEL I recombinante en hojas de tabaco agroinfiltradas y la han purificado de los extractos de hojas por precipitación con sulfato de amonio. Sorprendentemente, han descubierto que, obtuvieron un rendimiento muy alto de CEL I recombinante con una alta especificidad y además, que dicha preparación de CEL I recombinante reconoce los emparejamientos erróneos con una especificidad más amplia y una mayor sensibilidad que en las preparaciones de CEL I conocidas en la técnica anterior, permitiendo una clara detección incluso de emparejamientos erróneos, tales como T/T, que se consideran mal reconocidos por CEL I.

A la vista de estos resultados, los autores de la invención han tenido la idea de usar este método para explorar endonucleasas, identificadas por ordenador como pertenecientes a la familia S1/P1, ensayando su actividad in vitro.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un método sencillo y rápido para obtener grandes cantidades de endonucleasas, en particular nucleasas S1/P1, a partir de una pequeña cantidad de material de partida.

En este documento, una endonucleasa específica de emparejamiento erróneo, se define como una endonucleasa que es capaz de escindir específicamente todos los emparejamiento erróneos por sustitución de bases (es decir A/A, G/G, C/C, T/T, A/G, A/C, G/T, C/T, G/A, C/A, T/C, T/G), así como por inserciones/deleciones de uno o más nucleótidos.

Un objeto de la presente invención es por tanto un método para producir una endonucleasa recombinante específica de emparejamiento erróneo, en las que dicho método comprende:

-

expresar dicha endonucleasa recombinante en células de una planta hospedadora completa o de un organismo separado de la misma transformado transitoriamente por agroinfiltración con una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica dicha endonucleasa;

-

aislar dicha endonucleasa recombinante de dichas células de la planta hospedadora.

Dichas células de plantas pueden formar parte de una suspensión de células o de un cultivo tisular u orgánico. En este caso, la enzima puede recogerse del sobrenadante y/o de las células o tejidos u órganos cultivados. Preferiblemente, formarán parte de una planta completa o de un órgano separado de la misma; en este caso, la transformación transitoria con la cepa Agrobacterium se realizará por agroinfiltración.

La agroinfiltración es un método de expresión transitoria basado en el suministro de Agrobacteria, que contiene un gen de interés, dentro del tejido de la planta intacta.

Una construcción de ADN que comprende un gen de interés se clona en un vector binario y se transfiere a una cepa de Agrobacterium seleccionada y la Agrobacteria transformada se cultiva hasta una fase logarítmica o hasta saturación y se recoge de la misma manera que para una transformación mediada por Agrobacterium convencional. Clásicamente, la agroinfiltración se realiza aplicando una suspensión de las células de Agrobacterium transformadas por inyección en un órgano (generalmente las hojas) de la planta seleccionada usando una jeringa sin aguja o por infiltración al vacío durante escasos minutos. Después de la liberación del vacío, el órgano o toda la planta se coloca en una cámara de cultivo. La proteína de interés expresada se extrae del órgano infiltrado, normalmente de uno a cuatro días después de la infiltración. Los protocolos de agroinfiltración se describen en diversas publicaciones, por ejemplo KAPILA et al., (Plant Sci. 122, 101-108, 1997; BENDAHMANE et al., (Plant Cell, 11, 781-792, 1999); SCOFIELD et al., (Science., 274, 2063-5, 1996); TANG et al., (Science., 274, 2060-3, 1996); MARILLONET et al., (Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 9852-7, 2004); WROBLEWSKI et al., (Plant Biotech. J., 3, pp. 259-273, 2005).

Los protocolos clásicos usados para la expresión transitoria mediada por Agrobacterium, y en particular para la agroinfiltración, pueden usarse en la realización práctica de la presente invención. Se dispone de una gran selección de cepas de Agrobacterium, de vectores binarios y de elementos reguladores que controlan la expresión del gen de interés y un experto en la materia puede seleccionar entre estas la más apropiada, por ejemplo de acuerdo con la planta hospedadora que se pretende usar.

En los experimentos descritos en los siguientes Ejemplos, los autores de la invención han usado un vector binario derivado de pBIN19, pBIN61, y una cepa de Agrobacterium C58C1 que aloja el plásmido pCH32 hipervirulento y el ADNc de las secuencias codificantes genómicas se ha expresado bajo el promotor del VMCa 35S. Sin embargo, pueden usarse otros vectores binarios, otras cepas de Agrobacterium y otros promotores constitutivos o inducibles con el mismo resultado.

Ventajosamente, la agroinfiltración se realizará en las hojas, que opcionalmente pueden separarse de dicha planta inmediatamente antes o inmediatamente después de la infiltración.

Las plantas hospedadoras que pueden usarse en el método de la invención incluyen cualquier planta que sea compatible con la transformación de Agrobacterium. Las plantas preferidas incluyen en particular las del género Nicotiana, en particular Nicotiana benthamiana y Nicotiana tabacum.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, dicha endonucleasa se aísla de un órgano de planta agroinfiltrada, en particular una hoja agroinfiltrada mediante un proceso que comprende las siguientes etapas:

-

extraer el contenido celular del órgano agroinfiltrado que expresa dicha endonucleasa;

-

añadir a dicho extracto sulfato de amonio a una concentración final del 30% o más y separar el precipitado de proteína del sobrenadante;

-

añadir a dicho sobrenadante sulfato de amonio a una concentración final del 80% o más y recuperar el precipitado de proteína que contiene la endonucleasa.

Dicho precipitado de proteína se resuspende en un tampón apropiado, por ejemplo, un tampón que comprende Tris HCl (pH 8), PMSF y glicerol al 10%. Este puede usarse directamente o conservarse a -80ºC hasta su uso.

Como alternativa, el extracto total obtenido después de la primera etapa indicada anteriormente puede usarse como tal, sin realizar etapas de precipitación con sulfato de amonio.

Opcionalmente, las endonucleasas producidas por el método de la invención pueden purificarse adicionalmente mediante cualquier método apropiado conocido en mismo, tal como purificación por afinidad en columna en la que CEL I se etiqueta con una etiqueta que tiene una afinidad hacia un componente específico en la columna. De acuerdo con una realización preferida, CEL I de la invención se proporciona con una etiqueta de 6-Histidina y se purifica por cromatografía de afinidad de metales sobre níquel-NTA.

Un método para ensayar si una endonucleasa candidata es una endonucleasa específica de emparejamiento

erróneo comprende:

a) producir dicha endonucleasa candidata en forma recombinante por el método de la invención, como se

ha definido anteriormente;

b) ensayar dicha endonucleasa recombinante para determinar su capacidad de degradar ADN

monocatenario;

c) ensayar dicha endonucleasa recombinante para determinar su capacidad de escindir un fragmento de

ADN heteroduplex del ensayo en un sitio de emparejamiento erróneo previamente definido;

d) ensayar dicha endonucleasa recombinante para determinar su capacidad de escindir fragmentos de ADN

heteroduplex portadores de todos los tipos de emparejamientos erróneos (es decir, emparejamientos

erróneos por sustitución de bases (A/A, G/G, C/C, T/T, A/G, A/C, G/T, C/T, G/A, C/A, T/C, T/G, así como

emparejamientos erróneos por inserción o deleción).

Si una endonucleasa supera los ensayos de las etapas b), c) y d) (es decir, si puede degradar ADN monocatenario, para escindir un fragmento de ADN heteroduplex del ensayo en un sitio de emparejamiento erróneo previamente definido y de escindir fragmentos de ADN heteroduplex portadores de todos los tipos de emparejamientos erróneos) se considera como una endonucleasa específica de emparejamientos erróneos.

Un procedimiento para seleccionar endonucleasas específicas de emparejamientos erróneos comprende:

a) producir endonucleasas candidatas en forma recombinante mediante el método de la invención, como se

ha definido anteriormente;

b) ensayar dichas endonucleasas recombinantes para determinar su capacidad de degradar ADN

monocatenario;

c) ensayar las endonucleasas recombinantes capaces de degradar ADN monocatenario y ensayarlas para

determinar su capacidad de escindir un fragmento de ADN heteroduplex del ensayo en un sitio de

emparejamiento erróneo conocido y bien caracterizado;

d) seleccionar las endonucleasas recombinantes capaces de escindir un fragmento de ADN heteroduplex

del ensayo en un sitio de emparejamiento erróneo conocido y bien caracterizado, y ensayarlas para

determinar su capacidad de escindir fragmentos de ADN heteroduplex portadores de todos los tipos de

emparejamiento erróneo.

e) seleccionar las endonucleasas recombinantes que superan los ensayos de las etapas b), c) y d).

Los métodos definidos anteriormente pueden comprender adicionalmente una etapa que consiste en ensayar dicha endonucleasa (o endonucleasas) para determinar su sensibilidad ensayando su capacidad para detectar un alelo mutante en un grupo de ADN, en presencia del alelo de tipo silvestre en exceso, y seleccionar las endonucleasas que son capaces de detectar dicho alelo mutante en presencia de del alelo de tipo silvestre en exceso al menos 9 veces (es decir, un alelo mutante en un grupo de 10), preferiblemente en presencia del alelo de tipo silvestre en exceso al menos 14 veces, aun más preferiblemente en presencia de al menos un exceso de 19 veces y para aumentar la preferencia, un exceso de 29 veces, 39 veces, 49 veces, 59 veces .

Preferiblemente, los ensayos definidos anteriormente se realizan en una mezcla de reacción que tiene un pH de 7 a 8, ventajosamente de 7,4 a 7,8 y que contiene de 5 a 20 mM, ventajosamente MgCl2 10 mM. Ventajosamente, dicha mezcla de reacción también comprende de 0,5 mM a 2 mM y preferiblemente 1 mM de DTT. Los autores de la invención también han observado que la adición de PEG-8000 del 2% al 10% (p/v) y en particular al 5% de la mezcla 5 de reacción final, aumenta la actividad global de las endonucleasas.

Las endonucleasas candidatas que pueden ensayarse mediante los procedimientos definidos anteriormente pueden encontrarse entre las de la familia S1/P1. En la base de datos PFAM (BATEMAN et al., Nucleic Acids Res. 32, D13841, 2004) esta familia se denomina PFAM 02265. Se puede, por ejemplo, usar el perfil HMM (Modelo oculto de 10 Márkov) construido a partir de PFAM 02265 como una sonda para explorar los bancos de datos de secuencias de ADN disponibles, usando el programa informático HMMER a identificar endonucleasas candidatas en diferentes plantas.

Como alternativa, el código InterPro IPR003154 (correspondiente a las endonucleasas S1/P1) puede usarse para la 15 exploración del contenido de bases de datos, por ejemplo usando la siguiente dirección:

http://www.ebi.ac.uk/interpro/ISpy?ipr=IPR003154

La exploración de las bases de datos TrembI/Swissprot con este código identifica 43 proteínas (Tabla 1).

20 Tabla 1: resultado de la exploración de la base de datos TrembI/Swissprot con el código IPR003154.

Número de acceso TrembI o Swissprot

Descripción Longitud de secuencia Bit (Blastp)

P24504

Nucleasa PA3 (EC 3.1.3.6) 270 127

P24289

Nucleasa P1(EC 3.1.30.1) 270 127

P24021

Nucleasa S1 (EC 3.1.30.1) 267 107

Q00235

Precursor de nucleasa S1. 287 109

Q9P356

Nucleasa Le1. 310 111

Q7S8Q5

Proteína hipotética. 306 114

Q87OT1

Nucleasa probable S1. 324 119

Q8NIH8

Nucleasa Le3. 298 129

Q25267

3’-nucleotidasa/nucleasa. 477

Q9GNZ4

Precursor de 3’nucleotidasa/nucleasa. 378

Q9NJ13

3’-nucleotidasa/nucleasa. 377

Q9NJY3

Nucleasa específica monocatenaria. 315

Q86GJ3

Nucleasa P4. 316

Q8T4M4

Nucleasa de clase I. 3i6

065424

Supuesta nucleasa bifuncional 362 217

065425

Supuesta nucleasa bifuncional 454 164

080326

Precursor de endonucleasa. 303 480

081656

Proteína 6 asociada a senectud. 298 461

081958

Endonucleasa. 288 289

Q93WW9

Endonucleasa de tipo Si (Fragmento). 1361 239

Q9ARD4

Supuesta nucleasa. 289

Q9C9G4

Supuesta nucleasa bifuncional 290 300

Q9FTRO

Supuesta nucleasa bifuncional. 310

Q9FTR1

Supuesta nucleasa bifuncional. 311 180

Q9LGA5

EST D48949(5i554i). 3081 293

Q9LL59

Endonucleasa de emparejamiento erróneo CEL I. 296 627

Q9SXG1

Nucleasa I. 290 291

Q9ZR87

Nucleasa bifuncional. 328 308

Q9ZR88

Nucleasa bifuncional (Fragmento). 280 305

Q9ZR89

Nucleasa bifuncional bfnl. 305 445

Q7XND5

Proteína 0SJNBbOO34l13.4. 252 277

Q7XPN4

Proteína OSJNBaOO6ODO6.10. 290 275

Q8LA68

Endonucleasa, supuesta. 296 281

Q8LCL6

Supuesta nucleasa bifuncional 290 299

Q8LDW6

Supuesta nucleasa bifuncional 294 274

068530

Homol. de S1 de endonucleasa. 309

Q8XRE8

Supuesta proteína peptídica de señal. 337

Q989R8

Endonucleasa. 278

Q7P202

Probable endonucleasa. 274

Q8F378

Nucleasa Si (EC 3.1.30.1). 306

Q8P5Y5

Endonucleasa. 270

Q8PHA3

Endonucleasa. 271

Q9SXA6

Nucleasa bifuncional bfnl. 305 448

Este análisis se completa preferiblemente realizando un Blast en las bases de datos (blastp o tblastn), usando una secuencia de proteínas de referencia (por ejemplo la secuencia de CEL I) y seleccionando los mejores aciertos.

5 Los siguientes ejemplos describirán con más detalle los ensayos de cinco endonucleasas candidatas de Arabidopsis thaliana.

Los autores de la presente invención descubrieron que una de estas endonucleasas, representada en la lista de

10 secuencias adjunta bajo la SEQ ID Nº 2 (la secuencia de ADN correspondiente se representa bajo la SEQ ID Nº 1) y que corresponde a BFN1 de Arabidopsis thaliana, tiene una especificidad diferente y una sensibilidad mucho mayor que CEL I.

Este descubrimiento de las propiedades de BFN1 como una endonucleasa específica de emparejamiento erróneo,

15 que hasta ahora se desconocía, permite proponer su uso como un reactivo de detección de mutaciones, para detectar emparejamientos erróneos resultantes de sustituciones de bases, así como de inserciones/deleciones de uno más nucleótidos.

La BFN1, así como cualquiera de las endonucleasas específicas de emparejamiento erróneo que pueden

20 identificarse de acuerdo con el método de la invención puede obtenerse en grandes cantidades por el método de producción de endonucleasas.

La presente invención también incluye preparaciones de endonucleasas recombinantes que pueden obtenerse mediante el método de producción de acuerdo con la invención. Estas son en particular preparaciones de CEL I

25 recombinante y preparaciones de BFN 1 recombinante.

Las preparaciones de CEL I recombinante de la invención tienen una especificidad de emparejamiento erróneo diferente y una mayor sensibilidad que las preparaciones de CEL I de la técnica anterior. Las preparaciones de CEL I recombinante de la invención, tienen la siguiente preferencia de emparejamiento erróneo: T/G  A/G  G/G  G/T  30 T/T  G/A ≥A/A  C/C ≥T/C  C/T > A/C  C/A, mientras que la preferencia de emparejamiento erróneo de las separaciones de CEL I de la técnica anterior es C/C ≥ C/A  C/T ≥ G/G > A/C  A/A  T/C > T/G  G/T  G/A  A/G > T/T. Las preparaciones de CEL I recombinante de la invención pueden reconocer un alelo mutante en presencia de

23 veces más del alelo de tipo silvestre mientras que las preparaciones de CEL I de la técnica anterior no reconocen eficazmente ningún alelo mutante cuando se diluye 8 veces en una dilución.

Las preparaciones de BFN 1 recombinante de la invención también tienen una especificidad de emparejamiento

5 erróneo diferente a la de las preparaciones de CEL I de la técnica anterior y las preparaciones de CEL I recombinante de la invención. Las preparaciones de BFN 1 recombinante de la invención tienen las siguientes preferencias de emparejamiento erróneo: G/G  G/A  A/G  G/T  T/G > T/T  A/A  C/C  T/C > C/T  A/C  C/A. En la siguiente tabla 2, se resumen las preferencias de emparejamiento erróneo para cada una de estas enzimas.

10 Tabla 2: Comparación de preferencias de reconocimiento de emparejamiento erróneo.

Proteína

Reconocido más eficazmente Bien reconocido Reconocido con menor eficacia Muy débilmente reconocido

CEL I de apio (técnica anterior)

C/C C/A C/T G/G A/C A/A T/C G/A T/G G/T A/G T/T

CEL I recombinante de acuerdo con la invención *

T/G G/G A/G G/T T/T C/C G/A A/A C/T C/A A/C T/C

BFN 1 (ENDO 1)

G/G A/G T/G G/A G/T A/A C/C T/T T/C C/T A/C C/A*

*= BFN1 (ENDO 1) reconoce estos emparejamientos erróneos de modo más eficaz que CEL I recombinante. ** N.I.: el cálculo de la eficacia de escisión solo es semicuantitativo; por lo tanto, pueden producirse ligeras variaciones en la clasificación de los emparejamientos erróneos, basándose en su reconocimiento por las endonucleasas, dependiendo del investigador y/o del experimento.

Adicionalmente, las preparaciones de BFN 1 recombinante de la invención tienen una mayor sensibilidad tanto en las preparaciones de CEL I de la técnica anterior como en las preparaciones de CEL I recombinante de la 15 invención. Las preparaciones de BFN 1 recombinante de la invención pueden reconocer un alelo mutante en presencia de 59 veces más el alelo de tipo silvestre.

Las preparaciones de endonucleasas BFN 1 o CEL I recombinantes de la invención pueden usarse, como un reactivo para la detección de mutación, en cualquier método que implique la exploración de emparejamientos

20 erróneos como se ha mencionado anteriormente. Son particularmente ventajosas en genotipificación, en TILLING, TILLING de alto rendimiento, Ecotilling, GRAMMR, etc. Los métodos para usar las preparaciones de endonucleasas de la invención implican básicamente las mismas etapas a las de la técnica anterior, es decir, amplificación por PCR de la secuencia diana, desnaturalización del producto de amplificación e hibridación para permitir la formación de heteroduplex entre el alelo de tipo silvestre y el

25 mutante, escisión de los heteroduplex por la endonucleasa y análisis de los productos de escisión. Ventajosamente, cuando se realizan estos métodos, puede usarse una mezcla de endonucleasas diferentes para la escisión de los heteroduplex. Debido a su elevada sensibilidad, las preparaciones de endonucleasas de la invención también permiten realizar métodos de alto rendimiento para identificar mutaciones en una muestra. Por ejemplo, las preparaciones de

30 endonucleasas de acuerdo con la invención pueden usarse para realizar métodos tales como que se describen en el documento WO 01/75167, con un numero de muestras mucho mayor dado que es posible agrupar muchas muestras juntas para el análisis. De acuerdo con la invención, las preparaciones de endonucleasas descritas anteriormente pueden usarse para explorar una o más mutaciones en un gen diana, en una gran cantidad de muestras a partir de un organismo o una

35 línea celular derivada del mismo, realizando las siguientes etapas: a) amplificar dicho gen diana o una parte del mismo de cada individuo de dicha población, b) clasificar dichos productos de amplificación en una matriz bi- o tri- dimensional, que comprende líneas, filas (matriz 2-D (bidimensional)) y columnas (matriz 3-d (tridimensional)), c) agrupar dichos productos de amplificación de manera que se obtengan diferentes grupos, presentado

40 cada grupo una fila, una línea o una columna de dicha matriz, d) añadir a cada grupo un producto de amplificación de referencia obtenido a partir de un gen no mutado e incubar dichos grupos en condiciones que permitan la formación de heteroduplex, e) incubar cada grupo con una preparación de endonucleasa de acuerdo con la invención, y f) detectar la presencia de heteroduplex en dichos grupos incubados.

45 Como alternativa, en el método anterior puede realizarse clasificando primero las muestras en la matriz, después agrupándolas (con la adición de la referencia) y realizando la amplificación, incubación y etapas de detección.

Dependiendo del número de muestras a explorar, la matriz puede ser bi- o tri-dimensional. Por ejemplo, si se van a explorar 576 muestras, puede usarse una matriz 24 x 24. Si se van a explorar 13.824 muestras, debe emplearse más apropiadamente una matriz tridimensional (24x24x24). Solamente serían necesarias 72 reacciones para explorar esta población y los genes mutados se individualizarían por los grupos en la columna, fila y línea a los que pertenece.

El producto de amplificación de referencia corresponde a un producto de amplificación obtenido a partir de un gen de referencia (en comparación con las mutaciones que se exploran), amplificado con los mismos cebadores que los del gen diana en la población. Es importante añadir un producto de amplificación de referencia. De hecho, aunque es bastante improbable que todas las muestras contengan la misma mutación exacta en comparación con el gen de referencia, esto asegurará que los heteroduplex puedan formarse si el grupo contiene un gen diana que contiene una mutación.

Además, la siguiente descripción adicional ilustrará la presente invención, que se refiere a ejemplos que ilustran la preparación y propiedades de la endonucleasa CEL-I recombinante, el ensayo de cinco endonucleasas candidatas de Arabidopsis thaliana, y la identificación de BFN 1, (en lo sucesivo en este documento denominada también ENDO 1) como una endonucleasa especifica de emparejamiento erróneo. Debe entenderse sin embargo que estos ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención y no constituyen de ninguna manera ninguna limitación de la misma.

Leyendas de las figuras Figura 1: detección de mutación puntual en gel de agarosa. Se habían incubado heteroduplex (de ADN mutante y de tipo silvestre) con diferentes diluciones de CEL I recombinante (D104 a D1000), o sin proteína (-). Figura 2: detección de mutación puntual en gel de acrilamida. WT+Mut: antes de la PCR se habían mezclado el ADN de tipo silvestre y el mutante, generando por lo tanto heteroduplex. WT: para la PCR solo se ha usado ADN de tipo silvestre, generando por lo tanto solamente homodúplex. Mut: para la PCR solo se ha usado ADN mutante, generando por lo tanto solamente homoduplex. D100, D500 y D1000: diluciones de la proteína CEL I recombinante. En la parte superior del gel se indica el tamaño de los homoduplex (661 pb). La fila de 405 pb muestra el fragmento marcado con el fluorocromo FAM. La fila de 256 pb muestra el fragmento marcado con el fluorocromo ROX. Figura 3: detección de mutación puntual en ADN genómico en gel de agarosa. Los productos de la PCR se obtuvieron como se describe más adelante en el ejemplo 4, con los cebadores 4-960 y 4-721 (SEC ID Nos: 3 y 4). Después se digirieron con diferentes diluciones de preparación de CEL I recombinante obtenida por precipitación con sulfato de amonio (como se describe en el ejemplo 2) y se analizó en gel de agarosa. El tamaño de los productos de la PCR para los alelos de tipo silvestre y mutante de 1-13 de rms, es de aproximadamente 500 pb (exactamente 481 pb). Como resultado de la detección de la mutación en el ADN heteroduplex, se obtuvieron dos bandas de aproximadamente 200 y 300 pb. Las dos bandas pueden observarse en un gel de agarosa incluso a una dilución de 1/1000 de la proteína producida en tabaco.

1: D100; 2: D500; 3: D1000; 4: sin enzima.

A: Terese; B: rms 1,13; C: T+rms 1,13 Figura 4: análisis de actividad de Cel I recombinante en todos los tipos de emparejamientos erróneos. Se creó, mediante PCR, una serie de mutantes en base al gen Rx y se obtuvieron heteroduplex mezclando los productos de amplificación correspondientes con estos mutantes diferentes. Para la PCR, se usaron oligonucleótidos marcados con fluoroforo IRD700 e IRD800 (MWS®) y se realizó la detección de emparejamiento erróneo en LICOR4300 (LICOR®). La figura muestra los canales (A) con IRD colorante 700 y (B) con IRD colorante 800 de un proceso. El canal A muestra el fragmento de 204 pb con el fragmento del extremo 5' marcado con colorante IRD-700 y el canal B muestra el fragmento de 438 pb con el fragmento del extremo 3’ con el colorante IRD-800. Figura 5: sensibilidad de la proteína Cel I recombinante producida en tabaco. 1: Guisante Wt (de tipo silvestre); 2: Le1; Wt+ Le1; 4 Wt+ Le1+2ADN; 5 Wt+ Le1+4ADN; 6WT+ Le1+6ADN; 7 Wt+ Le1+8ADN; 8 Wt+ Le1+10ADN. Figura 6: escisión de heteroduplex de ADN en el sitio de emparejamiento erróneo C-A/T-G por cinco endonucleasas candidatas. (Ho)= homoduplex de ADN; (Ht)= heteroduplex de ADN. Figura 7: análisis detallado del reconocimiento especifico de todos los tipos de emparejamiento erróneo con ENDO1 y ENDO5. Se usó el mismo protocolo que el de la figura 4. Figura 8: ensayo para medir la sensibilidad de detección de ENDO1. Como molde se usó una mezcla de ADN mutante (Le1) y de tipo silvestre (Torstag) para determinar la actividad de ENDO1, en las siguientes proporciones: 1 mutante por 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 60 de tipo silvestre (de izquierda a derecha). Las dos últimas líneas de cada panel son homoduplex (solamente mutante y solamente de tipo silvestre). Panel izquierdo: canal IRD700, tamaño del fragmento detectado=338 pb. Panel derecho: canal IRD800, tamaño del fragmento detectado=300 pb. Figura 9: comparación de detección de emparejamiento erróneo por CelI y ENDO1. Las líneas 1, 5, 8 y 10 corresponden a homoduplex. Los fragmentos resultantes de la escisión por la endonucleasa son de 405 pb (marcados en azul) y de 256 pb (marcados en rojo, menos visible en blanco y negro). ENDO1 reconoce emparejamientos erróneos más eficazmente que CelI. Además, el fondo (actividad no específica) es mucho menor con ENDO1. Figura 10: detección de una mutación puntual conocida en gel de acrilamida con ENDO1 en dos diluciones diferentes (D1000 y D5000). M5 y M12 son dos plásmidos que contienen el gen Rx; uno contiene la forma Wt (de tipo silvestre) y el otro la forma mutada. Cebadores: Rx21 rox y Rx22 fam (en esta figura, la banda de escisión más pequeña, marcada en rojo, apareció claramente sobre el gel pero es menos visible en blanco y negro.

EJEMPLO 1: CLONACION, PURIFICACION Y PRODUCCION DE LA ENDONUCLEASA CEL I 5 Clonación de ADNc de CEL I

Extracción de ARN de apio

Usando una maja y un mortero, se machacaron tejidos foliares jóvenes (1 g) en nitrógeno líquido. El polvo se suspendió en 10 ml de tampón de extracción Trizol (Gibco). La suspensión se mezcló con 2 ml de cloroformo y se centrífugo a 12000 rpm a 4 ºC durante 15 minutos. El sobrenadante se mezcló con un volumen igual de isopropanol y el ARN total se precipitó por centrifugación a 12000 rpm durante 10 minutos a 4 ºC. El sedimento se lavó con etanol al 80%, se secó al aire y se resuspendió en 200µl de agua con DEPC (dietilpirocarbonato).

15 Tratamiento con DNasa

El tratamiento con DNasa se realizó para hidrolizar el ADN que contamina la preparación de ARN. Siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega), se incubaron 10µg de ARN total con 10 unidades de DNasa. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos después se detuvo por adición de EDTA a una concentración final de 25mM y por termo inactivación de la DNasa a 65 ºC durante 10 minutos.

Síntesis de ADNc de CEL I

Para la síntesis de la primera cadena de ADNc se usaron diez microlitros de ARN tratado con DNasa. La

25 síntesis de la primera cadena de ADNc se cebó con 2 picomoles de cebador oligo dT de 20 unidades. La mezcla de reacción de 50 µl (10 µl de tampón Superscript [GIBCO-BRL] 5x, 5 µl de DTT 100 mm, 5 µl de dNTP 5mM) se calentó a 70 ºC durante 10 minutos y después se enfrió en hielo. Se añadió 1 µl de transcriptasa inversa Superscript (200 unidadesµl; GIBCO-BRL) e inhibidor de RNasa 1µl (37 unidadesµl; Pharmacia) y la reacción se incubo a 42 ºC durante 1 hora. Se usó amplificación por PCR para convertir la primera cadena de ADNc en doble cadena de ADNc por amplificación por PCR usando dos cebadores específicos en la UTR 5’ y 3’ de CEL I (véase más adelante la Tabla 3).

Clonación de CEL I y expresión en hojas de tabaco

35 La fase de lectura abierta de CEL I de longitud completa se amplificó por PCR y se insertó entre el promotor 35S y el terminador transcripcional del VMCa en el vector binario pBin 19 para crear pBIN35S-CELI. También se construyó otra construcción pBIN35S-CELI8His. La construcción pBIN35S-CELI8His es idéntica a pBIN35S-CELI excepto que se insertó una etiqueta de Histidina de 8 aminoácidos en el C terminal de la proteína CEL I. En la siguiente tabla 3, se indican los oligonucleótidos usados para crear pBIN35S-CELI y pBIN35S-CELI8His. TABLA 3

Nombre del cebador

N terminal de CEL

5’ TATCGTTCTAGAGGGAATGACGCGATTATATTCTGTGTTC 3’ SEC ID N° 5

C terminal de CEL

5’ TATCTGAATTCATGCCAAAGAATGATC 3’ SEC ID N°6

C terminal His 8 de CEL

5’AATTCAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGTGCCAAAGAATGATCTGCGG 3’ SEC ID N° 7

Estas construcciones se transformaron en la cepa C58C1 de Agrobacterium portadora del el plásmido auxiliar de virulencia pCH32 (Hamilton et al PNAS, 93 (18): 9975-9979, 1996). El plásmido pCH32 expresa VirG y VirE y se usó para potenciar la transferencia de ADN-T. Las células de Agrobacterium se inocularon en 5ml de medio con caldo L

45 (Sambrook et al. 1989) complementado con 50µg/ml de kanamicina y 50µg/ml de tetraciclina y se cultivaron a 28 º C durante una noche. Después, el medio con caldo L (50ml) complementado con 50 µg/ml de kanamicina y 5µg/ml de tetraciclina se inoculó con los cultivos de 5ml durante una noche y se cultivaron a 29 º C durante dos días. Las células se precipitaron y se resuspendieron hasta una concentraron final de DO600 de 0,5 en una solución que contenía MgCl2 10 mM, MES 10 mM, pH 5,6 y acetosiringona 150 µM. Los cultivos se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas antes de la agroinfiltración en hojas de Nicotiana bentamiana.

La suspensión de Agrobacterium se inyectó en las hojas usando una jeringa sin aguja.

Las plantas de Nicotiana bentamiana agroinfiltradas se incubaron durante al menos 48 horas a 24 ºC, 16 horas de

55 luz, 60 % de humedad. Para ensayar la eficacia de la agroinfiltración, las plantas también se agroinfiltraron con una construcción que expresaba la proteína fluorescente verde (GFP). Antes de recoger las hojas, se controló la intensidad de la expresión de la GFP para cada hoja usando una lámpara UV. Las hojas de la planta se recogieron solamente si se expresaba la GFP.

Preparación de la proteína de hojas de tabaco por precipitación con sulfato de amonio Se recogieron hojas de tabaco agroinfiltradas y se pesaron. Se homogeneizaron dos gramos de hojas agroinfiltradas en 7 ml de tampón que contenía Tris-HCl 0,1M, pH 8, PMSF 200µM, ßmercaptoetanol 0,125nM y 10% de glicerol y después se centrifugó a 3000 g durante 25 minutos para sedimentar los residuos celulares. Al sobrenadante se le añadió sulfato de amonio al 100% hasta la concentración final del 30% y después las muestras se incubaron en hielo durante 1 hora y se centrifugaron a 3000g durante 30 minutos a 4º C para sedimentar las proteínas que precipitan al 30% de sulfato de amonio. Al sobrenadante se le añadió sulfato de amonio al 100% para obtener una concentración final del 80% y las muestras se incubaron d nuevo en hielo durante 1 hora y se centrifugaron como se ha indicado anteriormente para sedimentar las proteínas que precipitan al 80% con sulfato de amonio. El sobrenadante que contiene las proteínas precipitadas al 80% de sulfato de amonio se resuspendió en 600µl de tampón de homogeneización. La concentración de proteínas se determinó por medio del kit de ensayo Reactivo Coomassie Plus (Pierce). El sedimento homogeneizado contenía 14µg de proteína µl. Por tanto, se recogieron 8400µg de proteínas a partir de 2 gramos de hojas de tabaco agroinfiltradas. El sedimento homogeneizado se diluyó a 1µg/µl en un tampón que contenía Tris HCl 50mM pH 8, glicerol al 10% y PMSF 100µM, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80º C.

Purificación de la proteína marcada con His-6 por cromatografía de afinidad con Ni-NTA:

Se recogieron 5 gramos de hojas de tabaco agroinfiltradas y se homogeneizaron en 15ml de tampón helado que contenía Na-fosfato (100mM), Tris HCI pH 8 (10mM), NaCl (200mM), metabisulfito de sodio (0,2%), PMSF (1mM), βMercaptoetanol (10Mm). Después de la homogeneización, la muestra se centrifugó a 6000 g (rotor Beckman, JA 20) durante 10 minutos a 4º C. Se añadió imidazol (10mM) al sobrenadante y con NaOH se ajustó el pH a 9. La solución se centrifugó a 42.000 g (rotor Beckman, JA 20) durante 60 minutos a 4º C. El sobrenadante se mezcló con 1 ml de agarosa en Ni-NTA (Quiagen) se pre-equilibró con tampón de homogeneización + imidazol 10mM pH9 (tampón B). La mezcla se homogeneizó durante 2 horas a 4º C para permitir que la proteína se uniese a perlas de agarosa en Ni-NTA. Las perlas se compactaron en una columna de polipropileno de 1ml (Quiagen) y la resina se lavó con 20 ml del tampón B. La proteína se eluyó con 5 ml (5x1 ml) de tampón B + imidazol 250 mM, pH 9. Las alícuotas de las fracciones se guardaron para permitir la actividad de la enzima durante la purificación. Para impedir cualquier inhibición de la actividad enzimática por la elevada concentración de imidazol, las fracciones eluídas se dializaron frente a 4 litros de tampón que contenía Tris-HCl pH 8, 0,1M, PMSF 100µM y ZnCl2 2M durante una noche a 4 ºC. Por lo tanto, se recuperaron 1000 g de proteínas. El sedimento homogeneizado se diluyó a 3gl/l en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8, glicerol al 10% y PMSF 100M, se dividió en alícuotas y se conservó a -80º C. (dilución D 10.000).

EJEMPLO 2: DEGRADACIÓN DE ADN ESPECÍFICO MONOCATENARIO

La actividad de la CEL I recombinante sobre la degradación de ADN monocatenario se realizó como se ha descrito anteriormente (SUNG SC, LAKKOWSKI M Sr.(1962) J Biol Chem. Febrero 1962; 237: 506-11). Se incubaron 30 microgramos de Dnasa, Rnasa y proteasa sin ADN genómico de guisante con 2g de extracto de proteína en un tampón que contenía Tris-HCl 50mM (pH 7,6), MgCl2 10mM, DTT 1mM y PEG-8000 al 5%. Para detener la reacción se añadió un volumen igual de LaCl 3 20 mM en HCl 0,2N. Las muestras se centrifugaron a 21.000 g durante 40 minutos y se midió la absorbancia a 260 nm del sobrenadante usando un espectrofotómetro para determinar la cantidad de ADN que se había vuelto soluble en ácido.

EJEMPLO 3: ESCISIÓN DE ADN HETERODUPLEX Y DETECCIÓN DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL CONOCIDA EN UN GEN DE ENSAYO EN AGAROSA Y GELES DE ACRILAMIDA POR LA ENDONUCLEASA PRODUCIDA EN TABACO

Para ensayar si la endonucleasa CEL I producida en tabaco puede reconocer mutaciones puntuales sencillas, se ensayó la actividad de la preparación de CEL I recombinante obtenida por precipitación con sulfato de amonio en ADN heteroduplex a partir de dos clones que difieren en una mutación puntual sencilla: cambio de C-G a A-T (Bendhamane et al., Plant Cell, 11, 781-792, 1999). La PCR se realizó en los dos clones, usando dos oligonucleótidos R21 y R22 (R21 5’ GAC ATA TGG ACT ACA GAA GCT TGG G 3’ SEC ID N° 8; R22 5’ GTT CAC GGG TCA CAT CAT GCA TTC C 3’ SEC ID N° 9). La amplificación por PCR y la reconstitución de ADN heteroduplex se realizó usando el siguiente programa: desnaturalización durante 2 min. a 95 ºC seguido de 7 ciclos con 20 s a 94C, Tf (55ºC) +3 ºC a Tf -4ºC durante 5 s, -1 ºC por ciclo, gradiente a 72 °C a 0.5 °C/s y una extensión a 72 °C durante 1 min, después 44 ciclos con 20 s a 94 °C, Tf -5 °C a 30 ºC, gradiente a 72 °C a 0.5 °C/s, y una extensión a 72 °C durante 1 min, una extensión final a 72°C durante 5 min y una etapa de desnaturalización a 94 °C durante 10 min seguido de un aumento de 40°C durante 20 s y -0.3 °C por ciclo.

Los productos de la PCR (una mezcla de ADN de tipo silvestre y mutante o solo ADN de tipo silvestre o mutante) se incubaron con la preparación de CEL I (solución madre a 1g/l diluido a 1/100, 1/500 ó 1/1000) de la siguiente manera: por ejemplo, se incubaron 10 l de producto PCR (500 ng) con 2,5 l del tampón de reacción (Hepes 10mm, MgSO4 10mM, Triton X100 al 0,002%, KCl 10mm) y 2,5l de la preparación de CEL I diluida en un volumen total de 25l, durante 30 minutos a 37 ºC. La reacción se detuvo por 5l de EDTA 500mM y los productos de digestión se analizaron en un gel de agarosa al 3%.

5 Como se muestra en la Figura 1, la detección de la mutación puntual en el gen de ensayo, Rx, en ADN heteroduplex se reveló por la aparición de dos bandas de aproximadamente 200 pb y 400 pb a diluciones 1/100, 1/500 y 1/1000. Cuando no se añade enzima, estas bandas no aparecen.

Los productos de la PCR se obtuvieron usando cebadores marcados con fluorescencia y se digirieron del mismo 10 modo que antes cuando se analizaron en gel de acrilamida sobre un secuenciador ABI377 (Figura 2).

Como se muestra en la Figura 2, las dos bandas de 256 y 405 pb aparecen solo cuando se han mezclado los ADN de tipo silvestre Wt y mutante Mut entre sí debido a la formación de heteroduplex entre los dos ADN. Esto aparece incluso más claro cuando se usan diferentes longitudes de onda para la visualización del gel. En particular, la banda

15 de 256 pb, marcada con el fluorocromo ROX (rojo) y no muy claramente individualizada sobre el negro y blanco en la figura 2, está claramente presente cuando se usa la mezcla Wt + Mut como un molde para la PCR y ausente en los otros casos.

Estos resultados demuestran que la proteína CEL I producida en plantas puede reconocer emparejamientos 20 erróneos en ADN.

EJEMPLO 4: DETECCIÓN DE MUTACIONES PUNTUALES EN ADN GENÓMICO DE GUISANTE POR LA CEL I RECOMBINANTE

25 Para ensayar si CEL I recombinante purificada de tabaco podría usarse para detectar mutaciones puntuales sencillas en guisante, se usaron diferentes mutantes rms y le de guisante, caracterizados previamente por Catherine Rameau (MORUS et al Plant Physiol 2001, 126 :1205-1213. ; RAMEAU et al, Plant Physiol 2002, 115 :458-467) como un ensayo se usaron; rms1,11 que contiene G---->A en diferentes posiciones en la secuencia del gen; rms 112 que contiene G---->A; rms 1-13 que contiene G---> A. Todas se mutaron a G---->A en el mismo gen rms1 pero en

30 diferentes posiciones.

Para amplificar los alelos de tipo silvestre y mutante de los locus de rms (rms1-13, rms1-10, rms1-12) y del locus le, se usaron cincuenta nanogramos de ADN genómico de guisante como molde. Los cebadores usados en esta amplificación por PCR se resumen en la Tabla 4.

35

TABLA 4:

Nombre del mutante del guisante

Nombre del cebador Secuencia 5’-> 3’

rms 1-10

4m118 5’TTGGTTGGACTTCACTTTGAGC 3’ SEC ID N°10

4m984

5’ CACAACAATCAGCAATGACAGC 3’ SEC ID N°11

rms 1-12

4-347 5’ GTGATTGCTCCACCTCCGCCACC 3’ SEC ID N°12

4-134

5’TACAGCGATTGATATAATATAAAATTATCC3’SEC ID N°13

rms 1-13

4-960 5’ GTGTTTGTCCAGTAATAGTGTCAGCATA 3’ SEC ID N°3

4-721

5’ AGGAACCTGAGAAAAGACTCGCCAGC 3’ SEC ID N°4

Ie 1

Ie 2462 5’ TGATATTGTCGTGCAATATGATGAAAC 3’ SEC ID N°14

Ie 3082

5’ATACCTATTTAGCCCACTTGGACAC 3’ SEC ID N°15

El programa de la amplificación de la PCR fue de 94 ºC, 1 min, (94 °C 15s, 55 °C 15s, 74 °C 1min, X35) 74 ºC 7min,

40 8 ºC. Los productos de la PCR se analizaron en gel de agarosa y se digirieron, como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior, con diferentes diluciones de preparación de CEL I recombinante obtenida por precipitación con sulfato de amonio. Como se muestra en la Figura 3, el tamaño del producto de la PCR en el mutante rms 1-13 y el mutante de tipo silvestre, es de aproximadamente 500 pb (exactamente 481 pb). Como resultado de la detección de la mutación en ADN heteroduplex, se obtuvieron dos bandas de aproximadamente 200 y 300 pb. Las dos bandas pueden

45 observarse en un gel de agarosa incluso a una dilución de 1/1000 de la proteína producida en tabaco. Este resultado demuestra que la proteína producida en plantas puede en primer lugar, reconocer una mutación puntual presente en ADN genómico y en segundo lugar, es muy activa ya que los productos de digestión pueden observarse incluso si la proteína se diluye a 1/1000.

50 EJEMPLO 5: EFICACIA DE ESCISIÓN DE EMPAREJAMIENTO ERÓNEO EN DIFERENTES EMPAREJAMIENTOS ERRÓNEOS POR LA CEL I RECOMBINANTE

Para ensayar si la CEL I recombinante preparada de acuerdo con la invención escinde preferencialmente un tipo emparejamiento erróneo, como la CEL I purificada de apio, se creó una serie de mutantes basados en el gen Rx. 55 Para este fin, se diseñaron diferentes cebadores (denominados Rx-A, T, G o C) conteniendo cada uno una mutación

puntual diferente. Cada uno de estos cebadores permite introducir, a una posición determinada del gen Rx, una de las 4 bases (A, T, G o C). Se crearon heteroduplex mezclando los productos de amplificación obtenidos con los diferentes cebadores.

La mezcla de la PCR (en volumen total de 50l) contenía el molde de ADN (50 ng), dNTP (0,2 mM), 5l de tampón PCR Pfu (10X, Stratagene), cebador Rx 21 (0.4M), cebador Rx-A o Rx-T o Rx-G o Rx-C (0.4M), Pfu (5U, Stratagene, 2.5 Unidades/l). El programa usado para la amplificación PCR fue 94 °C 1min, (94 °C 15s, 55 °C 15s, 74 °C 2min, X35) 74 °C 7 min, 8 °C durante una noche. Para la PCR se usaron oligonucleótidos marcados con fluoroforo IRD700 e IRD800 (MWS®) para permitir la detección de emparejamientos erróneos en LICOR4300 (LICOR ®).

Los productos de la PCR se analizaron en gel de agarosa y se clonaron en pGEM 3Zf. Todos los clones se habían secuenciado para garantizar que se había insertado la mutación correcta. Para reconstituir todos los tipos de emparejamiento erróneo, se usaron las combinaciones de estas construcciones como molde en la amplificación por PCR.

El producto PCR de emparejamiento erróneo incubó como se describe en el Ejemplo 2 anterior, con una preparación de CEL I recombinante obtenida de hojas de tabaco por precipitación con sulfato de amonio como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior.

Los productos de las digestiones se analizaron en gel de acrilamida. Se usó un gel de acrilamida desnaturalizante al 6,5% y las condiciones de electroforesis fueron: 1500V, 40W, 40mA, 45 °C con una velocidad de barrido de 1.

Los resultados se muestran en la Figura 4 (Gel de Licor).

Estos resultados demuestran que las preparaciones de CEL I de la invención reconocen todos los tipos de emparejamiento erróneo y particularmente emparejamientos erróneos indicados en la técnica anterior que se reconocían débilmente por CEL I purificada directamente del apio. Además, como se muestra en la Tabla 2 anterior, la preparación de CEL I de la invención reconoce emparejamientos erróneos, débilmente reconocidos por la preparación de CEL I de la técnica anterior, como T/T, G/A, A/G, G/T, T/G con especificidad muy elevada, siendo la preferencia de emparejamientos erróneos de esta enzima la siguiente: T/G  A/G  G/G  G/T > T/T  G/A  A/A  C/C >T/C  C/T  A/C  C/A.

Esta actividad especifica también se potenció cuando el tampón de reacción de CEL I se complementó con PEG al 5% (datos no mostrados).

EJEMPLO 6: SENSIBILIDAD DE LA CEL I RECOMBINANTE

Para verificar que la CEL I recombinante de la invención puede usarse para genotipado de alto rendimiento, se ensayó para ver si podía reconocer mutaciones en un grupo de individuos.

Se usó ADN genómico con un SNP (polimorfismo de un único nucleótido) (C--> T), correspondiente al mutante del guisante enano Le1, y al ADN genómico de la variedad de cultivo Torstag del guisante de tipo silvestre para amplificar el locus Le1. Este ADN genómico se había usado como control para la formación de homoduplex y heteroduplex.

Para crear ADN heteroduplex, ADN genómico derivado de la planta del guisante homocigoto para el locus le1 se diluyó con ADN genómico derivado de planta del guisante homocigoto para el locus le1 en diferentes proporciones y se usaron 30 ng para la amplificación por PCR usando los cebadores Le2462 marcados con el fluorocromo TET (5’TGATATTGTCGTGCAATATGATGAAAC3’ SEC ID N° 14) y Le3082 marcado con el fluorocromo ROX (MWG®) (5’ATACCTATTTAGCCCACTTGGACAC-3’ SEC ID N° 15). Las reacciones de la PCR se realizaron de la siguiente manera: 94 ºC 1min, (94 °C 15s, 55 °C 15s, 74 °C 1 min ) X35, 74 °C 7 min. En el ensayo de detección de emparejamientos erróneos, se usaron, como molde, los heteroduplex de ADN reconstituidos a partir de los productos de la PCR, como se ha escrito anteriormente.

En la Figura 5 se presentan los resultados de este experimento en grupo usando la proteína producida en tabaco. Como se esperaba, la proteína recombinante de la invención puede reconocer en cualquier momento el PSN de Le1 de un heteroduplex que se ha formado entre una cadena de tipo silvestre y una cadena de ADN mutante. Como resultado de la digestión, se obtuvieron dos bandas de tamaño esperado (300 pb y 338 pb) y también una tercera banda correspondiente al homoduplex no digerido (638pb). La banda de 338pb, que está marcada en rojo, aparece claramente sobre el gel (pero es menos visible en blanco y negro). De manera más interesante, la proteína puede detectar la mutación incluso cuando se usó un grupo de 25 ADN genómicos diferentes (adición de Le1 y de tipo silvestre con 23 ADN genómicos desconocidos).

Para terminar, la proteína producida en la planta tiene una sensibilidad elevada, lo que permite la identificación de un PSN conocido con secuencias de ADN amplificadas procedentes de ADN genómico de al menos 24 individuos.

EJEMPLO 7: INVESTIGACIÓN BIOINFORMÁTICA PARA DIFERENTES ENDONUCLEASAS EN ARABIDOPSIS.

5 Se realizó un análisis de una familia de genes de Arabidopsis que codifican endonucleasas, usando el perfil de proteína PF02265 de la base de datos PFAM. Este perfil HMM se usó como una sonda para dirigir todas las 27117 proteínas predichas en el genoma de Arabidopsis y la totalidad del genoma se tradujo en las 6 desfases del marco de lectura diferentes para evitar el efecto de la anotación automáticamente estructural. En este análisis se

10 identificaron 5 genes candidatos At1g11190, At1g68290, At4g21590, At4g21585 y At4g21600.

EJEMPLO 8: CLONACION Y EXPRESION DE GENES CANDIDATOS DE ARABIDOPSIS EN HOJAS DE TABACO

15 El ADNc de cada gen candidato se amplificó por PCR y se insertó entre el promotor 35S y el terminador transcripcional del VMCa en el vector binario pBin61 para crear pBIN35S-ENDO1, -ENDO2, -ENDO3, -ENDO4 y ENDO5 que corresponden a At1g11190, At1g68290, At4g21585, At4g21590 y At4g21600, respectivamente (Tabla 5). Estas construcciones se transformaron en la cepa C58C1 de Agrobacterium portadora del plásmido auxiliar de virulencia pCH32 (HAMILTON CM, et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A., 93(18):9975-9). El plásmido pCH32

20 expresa VirG y VirE y se usó para potenciar la transferencia de ADN-T. Las células de Agrobacterium se inocularon en 2 ml de medio con caldo L (SAMBROOK et al. 1989) complementado con 50g/ml de kanamicina y 5g/ml de tetraclicina y se cultivaron a 28ºC durante una noche. Las células se precipitaron y se resuspendieron hasta una concentración final de DO600 de 0,5 en una solución que contenía MgCl2 10mm, MES 10mM, pH 5,6 y 150m de acetosiringona. Los cultivos se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. antes de la agroinfiltración en hojas

25 de Nicotiana benthamiana. Las plantas de Nicotiana benthamiana agroinfiltradas se incubaron durante al menos 24 horas a 24ºC, 16 horas de luz, 60% de humedad. Para ensayar la eficacia de la agroinfiltración, las plantas también se agroinfiltraron con una construcción que expresaba la proteína fluorescente verde (GFP). Antes de recoger las hojas, se midió la intensidad de la expresión de la GFP para cada hoja usando una lámpara UV. Solo se recogían las hojas de la planta que expresaban la GFP. Las proteínas candidatas se extrajeron por precipitación con sulfato

30 de amonio como se describe en el Ejemplo 1.

Tabla 5: Secuencias de los cebadores usados para la clonación de la endonucleasa candidata con o sin etiqueta Histidina

Proteínas candidatas

Genes AGI Cebadores

ENDO5

At4g21600 Directo: AAGGATCCGAAAGCTCTGTGTTTCAGA SEC ID N0 :16 Inverso: GGAGTTGTTACGTGGGTTCTCAAGGATC SEC ID Nº :17

ENDO4

At4g21585 Directo:CTGGATCCCTGTTTTTAACTTTGGAAAG SEC ID Nº :18 Inverso: GGATGTTCAAGTGATTCTCCTGGATC SEC ID Nº :19

ENDO3

At4g21590 Directo:AAGGATCCATTCGACAAACTTTGTAAC SEC ID N0 :20 Inverso: AGAGTGGTCTTGGGAATATTTATCTCAG SEC ID Nº :21

ENDO2

At1g68290 Directo:ACGGATCCCATTTCAAAGAACTCTGA SEC ID Nº :22 Inverso: GACCAATCATTATGCTGTAACTTCAG SEC ID Nº :23

ENDO1 SEC ID Nº :2

At1g11190 Directo: CAGGATCCAAGTTTCAAACTTGAAG SEC ID Nº :24 Inverso: CGGTATGTCGGGTTTGGTTCAAGTGG SEC ID Nº :25

35 EJEMPLO 9: CARACTERIZACION BIOQUÍMICA DE LAS PROTEINAS CANDIDATAS

Como un ensayo simple para observar si la proteína candidata es activa, se incubo algún plásmido superenrollado con diferentes diluciones de extracto de proteína (precipitado de sulfato de amonio aL 80%). Como resultado de la presencia de una endonucleasa en el extracto de proteína, la estructura súper enrollada debe relajarse y aparecerán 40 algunas nuevas bandas de ADN cuando se procesa el medio de incubación sobre un gel de agarosa. Usando las diferentes soluciones pueden compararse las diferentes endonucleasas y observar cual es la más activa. El control

fue siempre endonucleasa CEL I recombinante preparada por precipitación con sulfato de amonio como se describe en el Ejemplo 1 anterior.

Para explorar las proteínas candidatas que pueden escindir el ADN heteroduplex en el sitio de emparejamiento erróneo, también se usó un sistema de caracterización rápido basado en tres etapas consecutivas.

En la primera etapa las proteínas candidatas se ensayaron para determinar su capacidad de degradar el ADN monocatenario. Esta condición se ensayó porque el ADN en el sitio de emparejamiento erróneo en el ADN heteroduplex es monocatenario. Por tanto, una endonucleasa que no puede digerir el ADN monocatenario se supone que no puede escindir el ADN en el sitio de emparejamiento erróneo. En segundo lugar, la proteína candidata debe escindir un ADN heteroduplex de ensayo en un sitio de emparejamiento erróneo conocido y bien caracterizado. En tercer lugar, las proteínas que pasan el ensayo 1 y 2 se evaluaron para determinar su eficacia para escindir los fragmentos de ADN heteroduplex que llevan todos los tipos de emparejamientos erróneos. Esto se realizó usando herramientas de ADN que comprenden un grupo de construcciones de plásmidos bien caracterizadas que contienen en posición específica del inserto, cada uno de los cuatro posibles nucleótidos.

Capacidad de degradar un ADN monocatenario

La actividad de las proteínas candidatas sobre la degradación de un ADN monocatenario se realizó como se describe en el Ejemplo 2. En este análisis las cinco proteínas candidatas al completo mostraron actividad nucleasa y se clasificaron desde la más activa a la menos activa de la siguiente manera: ENDO1, ENDO5, ENDO2, ENDO3 y ENDO4.

Escisión de ADN heteroduplex en sitios de emparejamiento erróneo C-A/T-G

Para ensayar si las proteínas candidatas producidas en tabaco podían reconocer mutaciones puntuales sencillas, se ensayó en la actividad de los extractos de proteínas en el ADN heteroduplex creado como se ha descrito en el Ejemplo 3. Los productos de la PCR que contenían cada uno o ambos de los alelos se incubaron con una dilución 1/1000 de los extractos de proteína derivados de hojas agroinfiltradas bien con el gen de endonucleasa candidato o con la GFP como control, de la siguiente manera: se incubaron 500 ng de productos de la PCR con extracto de proteína de tabaco en un volumen final de 25l que contenía Tris-HCl 50mM (pH 7,6), MgCl2 10mM, DTT 1mM y 5% de PEG-8000 durante 30 minutos a 37º C. Las reacciones se detuvieron con EDTA a la concentración final de 80mM y se analizaron en un gel de agarosa al 3%.

Si los dos oligonucleótidos estaban marcados con fluorescencia, los productos de digestión se analizaban en gel de acrilamida, en un secuenciador de ADN 377Abi. En este experimento, se predijo que si el extracto de proteína contenía una endonucleasa especifica de emparejamiento erróneo, el ADN heteroduplex podría escindir el sitio de emparejamiento erróneo, liberando por lo tanto dos bandas de 256 pb y 405 pb.

Los resultados se muestran en la figura 6 (obsérvese que la banda de 256 pb, marcada en rojo, es claramente visible cuando la enzima está en presencia de heteroduplex y ausente de otra manera; esta banda se diferencia menos en blanco y negro).

A partir de este análisis bioquímico, se llega a la conclusión de que las cinco endonucleasas muestran actividades de escisión específica de emparejamiento erróneo. Además, las tres enzimas, ENDO 1, ENDO 5, ENDO 2, que tienen mayor actividad específica nucleasa para el ADN monocatenario, escinden también con mayor eficacia el ADN heteroduplex en el sitio de emparejamiento erróneo C-A/T-G. Además, entre estas tres endonucleasas, ENDO 1 y ENDO 5 eran las más activas. Por tanto, estas dos nucleasas se seleccionaron para una caracterización más precisa.

Eficacia de escisión de emparejamiento erróneo por la endonucleasa candidata en diferentes emparejamientos erróneos

El principal objetivo de este trabajo es identificar una endonucleasa que escinda emparejamientos erróneos que CEL-I no reconozca eficazmente. Esto se realizó usando herramientas de ADN que comprenden un grupo de construcciones de plásmidos bien caracterizadas que contienen en posición especifica del inserto cada uno de los cuatro posibles nucleótidos. Para reconstruir todos los tipos de emparejamiento erróneo, como molde se usó la combinación de estas construcciones en la amplificación por PCR.

El producto de la PCR de emparejamiento erróneo se incubó como se ha indicado anteriormente (véase el ejemplo 5) con la endonucleasa candidata y se analizó sobre la secuenciadora LICOR.

Los resultados se muestran en la Figura 7.

En este análisis, CEL l al igual que ENDO 5 reconoce débilmente el tipo de emparejamiento erróneo T/T. Por otro lado, ENDO 1 reconoce casi todos los tipos de emparejamiento erróneo con elevada eficacia. A partir de este análisis, se puede llegar a la conclusión de que ENDO 1 puede reconocer emparejamientos erróneos no detectados por CEL- 1.

EJEMPLO 10: SENSIBILIDAD DE LA ENDO 1 PARA DETECTAR UN ALELO MUTANTE EN UN GRUPO DE ADN.

La sensibilidad de ENDO 1 se evaluó como se describe en el Ejemplo 3, con diluciones de 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o 60 veces con ADN portador del alelo de tipo silvestre.

En la Figura 8, se presentan los resultados de este experimento colectivo, que muestra la detección de un alelo a partir de un mutante homocigoto entre 60 alelos a partir de un tipo silvestre homocigoto. Se realizó la PCR de los dos organismos y los amplicones se cuantificaron en gel de agarosa y mezclaron juntos siguiendo una proporción decreciente de 1:1 a 1:60 de los amplicones de la PCR. Después, se ensayó la actividad de ENDO 1 en estas diferentes proporciones de mutantes: tipo silvestre.

En experimentos idénticos, CEL I purificada de apio puede detectar un alelo en un máximo de 16, con baja sensibilidad y solo se obtiene una sensibilidad correcta cuando la dilución es 8 veces inferior o igual.

En resumen, las endonucleasas de acuerdo con la invención y particularmente ENDO 1 tienen una interferencia de referencia mucho menor que CEL I, pueden usarse a diluciones muy altas en comparación con CEl I y tienen mejor especificidad y actividad que la endonucleasa CEL I.

Detección de mutación puntual en gel de acrilamida.

Se creó una serie de mutantes basados en el gen Rx. Se diseñaron diferentes plásmidos conteniendo cada uno un tipo de emparejamiento erróneo para demostrar la especificad de ENDO l. La mezcla de PCR contenía oligonucleótidos específicos para los plásmidos. Para la PCR se usaron oligonucleótidos marcados con los fluroforos ROX y FAM (MWG) para permitir la detección de emparejamientos erróneos en ABI377 MVG.

Como se muestra en la figura 9, ENDO l no escinde cuando solo hay homoduplex, por ejemplo línea 1 o línea 5 y las únicas bandas que pueden observarse en el gel son homoduplex en la parte superior del gel (aproximadamente 600 pb).

En cualquier momento se obtiene un emparejamiento erróneo en las muestras de este documento (resultante de la formación de heteroduplex entre dos cadenas de ADN procedentes de 2 plásmidos diferentes, como por ejemplo en las líneas 2, 3, 4 ó 6, 7 y 9) la ENDO l reconoce y escinde en el sitio de emparejamiento erróneo, dando como resultado la aparición de dos bandas correspondientes a los dos productos, cada uno marcado con un fluoroforo. Para la digestión con ENDO l, puede observarse una disminución en la referencia y solo pueden detectarse algunos emparejamientos erróneos con ENDO l (línea 9 por ejemplo).

Detección de una mutación puntual conocida en gel de acrilamida de ENDO 1 en dos diluciones diferentes D 1000 y D 5000.

Se usaron dos plásmidos que contenían una forma silvestre y una forma mutada del gen Rx. Estos difieren solamente en una mutación puntual conocida. La mezcla de la PCR contiene oligonucleótidos específicos para los plásmidos. Se usaron oligonucleótidos marcados con los fluoróforos ROX y FAM (MWG) en la PCR para permitir la detección de emparejamiento erróneo en ABI377 MWG.

Como se muestra en la Figura 10, en cualquier momento existe un heteroduplex en las muestras de este documento (M5+M12), ENDO 1 puede reconocer y escindir en el sitio de emparejamiento erróneo, dando como resultado la aparición de dos bandas marcadas con un fluoróforo. Cuando solamente están presentes los homoduplex M5 o M12, ENDO 1 no escinde y las únicas bandas que pueden observarse en el gel son homoduplex en la parte superior del gel (aproximadamente 600 pb). Cuando se usa la D 5000 para la ENDO 1, puede observarse una mejora de la referencia. Por lo tanto, ENDO 1 puede usar una dilución muy alta en comparación con cualquiera de las nucleasas conocidas en la técnica.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> GENOPLANTE-VALOR INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACION AGRONÓMICA BENDAHMANE, Abdelhafid STURBOIS, Bénédicte TRIQUES, Karine CABOCHE, Michel

<120> MÉTODO PARA PRODUCIR ENDONUCLEASAS ALTAMENTE SENSIBLES, NUEVAS PREPARACIONES DE ENDONUCLEASAS Y USOS DE LAS MISMAS.

<130> MJP/bv1516-19

5

<150> PCT/EP2004/009159 <151> 30-07-2004 <150> PCT/EP2004/009166 <151> 30-07-2004

10

<160> 25 <170> PatentIn versión 3.3

15

<210> 1 <211> 2640 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana

20

<220> <221> misc_feature <223> Gen At1g11190 de ENDO 1

<400> 1

imagen1

imagen1

<210> 2

<211> 305 5 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> misc_feature 10 <223> At1g11190 de la proteína ENDO 1

<400> 2

imagen1

imagen1

<210> 3

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4-960

imagen2

<210> 4

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4-721

imagen3

<210> 5

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> N-terminal de CEL

imagen4

<210> 6

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> C-terminal de CEL

imagen5

<210> 7

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> C-terminal con His de 8 aminoácidos de CEL <400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador (R21)

imagen6

<210> 9

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador (R22)

imagen7

<210> 10

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4m118

imagen8

<210> 11

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4m984

imagen9

<210> 12

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4-347

imagen10

<210> 13

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 4-134

imagen11

<210> 14

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador Ie 2462

imagen12

<210> 15

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador Ie 3082

imagen13

<210> 16

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para ENDO5

imagen14

<210> 17

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso para ENDO5

imagen15

<210> 18

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para ENDO4

<400> 18 <210> 19

imagen1

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso para ENDO4

imagen16

<210> 20

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para ENDO3

imagen17

<210> 21

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso para ENDO3

imagen18

<210> 22

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para ENDO2

imagen19

<210> 23

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso para ENDO2

imagen20

<210> 24

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo para ENDO1

imagen21

5

<210> 25

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10

<220>

<223> Cebador inverso para ENDO1

imagen22

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para producir una endonucleasa recombinante especifica de emparejamientos erróneos en el que dicho método comprende:

   - expresar dicha endonucleasa recombinante en células de una planta hospedadora completa o de un órgano separado de esta, transformada transitoriamente por agroinfiltración con una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica dicha endonucleasa;

   - aislar dicha endonucleasa recombinante de dichas células de la planta hospedadora.

2. 2.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha agroinfiltración se realiza en una hoja de dicha planta hospedadora.

3. 3.

   Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha planta hospedadora pertenece al género Nicotiana.

4. 4.

   Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha endonucleasa se aísla del órgano de la planta agroinfiltrada por un proceso que comprende las siguientes etapas:

   -extraer el contenido de las células procedentes del órgano agroinfiltrado que expresa dicha endonucleasa; -añadir a dicho extracto sulfato de amonio a una concentración final de al menos 30% y separar el precipitado proteico del sobrenadante;

   - añadir a dicho sobrenadante sulfato de amonio a una concentración final de al menos 80% y recuperar el precipitado proteico que contiene la endonucleasa.

5. 5.

   El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sulfato de amonio se añade a una concentración final de 30% en la primera etapa de precipitación y a una concentración final de 80% en la segunda etapa de precipitación.

6. 6.

   Una preparación de endonucleasa recombinante especifica de emparejamientos erróneos que puede obtenerse por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha endonucleasa se selecciona entre CEL I de Apium gravoeolens y BFN1 de Arabidopsis thaliana de SEC ID Nº: 2.

7. 7.

   Una preparación de endonucleasa CEL I recombinante de la reivindicación 6, en la que dicha endonucleasa CEL I recombinante tiene la siguiente preferencia de emparejamientos erróneos: T/T ∼ T/G ∼ A/G ∼ G/G ∼ G/A ∼ G/T ≥ A/A ∼ C/C ≥T/C ∼ C/T > A/C ∼ C/A y puede reconocer un alelo mutante en presencia de 23 veces más el alelo de tipo silvestre.

8. 8.

   Una preparación de endonucleasa BFN 1 recombinante de la reivindicación 6, que la que dicha endonucleasa BFN 1 recombinante tiene la siguiente preferencia de emparejamientos erróneos: G/G ∼ G/A ∼ A/G ∼ G/T ∼ T/G > T/T ∼ A/A ∼ C/C ∼ T/C > C/T ∼ A/C ∼ C/A, y puede reconocer un alelo mutante en presencia de 59 veces más el alelo de tipo silvestre.

9. 9.

   El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para detectar en un dúplex de ADN, un emparejamiento erróneo resultante de una sustitución de bases o de inserción o deleción de uno o más nucleótidos en una cadena de dicho duplex.

10. 10.

    El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en un protocolo de escisión de emparejamiento erróneo por detección de lesiones inducidas localmente en los genomas (TILLING).

11. 11.

    El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para la identificación de polimorfismos de ADN en poblaciones naturales, por Ecotilling.

12. 12.

    El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, como un reactivo de detección de emparejamientos erróneos.

13. 13.

    El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en un método de selección de emparejamientos erróneos.

14. 14.

    El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para seleccionar de manera simultánea una o más mutaciones en un gen diana en una población de cualquier organismo o de una línea celular derivada del mismo realizando las etapas de:

    a) amplificar dicho gen diana o parte del mismo para cada individuo de dicha población, b) clasificar dichos productos de amplificación en una matriz bi o tridimensional, que comprende líneas, filas (matriz bidimensional) y columnas (matriz tridimensional), c) reagrupar dichos productos de amplificación, para obtener diferentes grupos, representando cada grupo una fila, una línea o una columna de dicha matriz, d) añadir a cada grupo un producto de amplificación de referencia obtenido de un gen no mutado e incubar dichos grupos en condiciones que permitan la formación de heteroduplex, e e) incubar cada grupo con dicha preparación de endonucleasa, y f) detectar la presencia de heteroduplex en dichos grupos incubados.

15. 15.

    El uso de una preparación de endonucleasa recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para seleccionar de manera simultánea una o más mutaciones en un gen diana en una población de cualquier organismo o de línea celular derivada del mismo, realizando las etapas de:

    a) clasificar cada individuo de dicha población en una matriz bi- o tri- dimensional que comprende líneas, filas (matriz bidimensional) y columnas (matriz tridimensional), b) agrupar cada fila, línea y columna para obtener diferentes grupos, representando por lo tanto cada grupo una fila, línea o una columna de dicha matriz, c) añadir a cada grupo un producto génico de referencia obtenido de un gen no mutado, d) amplificar dicho gen diana o parte del mismo en cada grupo para conseguir grupos de productos amplificados, e) incubar dichos grupos de productos amplificados en condiciones que permitan la formación de heteroduplex, f) incubar dichos grupos de productos amplificados con dicha preparación de endonucleasa, y g) detectar la presencia de heteroduplex en dichos grupos incubados.