ES2362795T5 - Anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo de cadena única frente a antígeno prostático específico de membrana de superficie celular - Google Patents

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo de cadena única frente a antígeno prostático específico de membrana de superficie celular

El cáncer de la próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda causa de muerte

5 más común en la civilización occidental. No existe actualmente un tratamiento curativo para este tumor después de la progresión más allá de los límites resecables. Debido a la mortalidad y morbilidad significativa asociada con la progresión de la enfermedad, existe una necesidad urgente de tratamientos dirigidos nuevos. A diferencia del cáncer en otros sistemas orgánicos, el cáncer de próstata representa una diana excelente para terapia de anticuerpo por muchas razones, que incluyen i) la próstata expresa antígenos específicos de tejido, ii) la próstata es un órgano no

10 esencial y su destrucción no dañará al huésped, iii) los sitios de metástasis son ganglios linfáticos y hueso que reciben niveles elevados de anticuerpos circulantes, iv) los niveles en suero de PSA proporcionan un medio para controlar la respuesta terapéutica.

Entre varios marcadores candidatos que se han identificado para el cáncer de próstata, el antígeno prostático específico de membrana (PSMA) parece ser el más importante. Esta glicoproteína de transmembrana de tipo 2 de 15 aproximadamente 100 KD consiste en un segmento intracelular corto (aminoácidos 1-18), un dominio transmembrana (aminoácidos 19-43) y un dominio extracelular extenso (aminoácidos 44-750). PSMA puede servir como una diana útil para inmunoterapia debido a que cumple con los siguientes criterios: i) la expresión está limitada principalmente a la próstata, ii) PSMA se expresa de forma abundante como proteína en todas las fases de la enfermedad, iii) se presenta en la superficie celular pero no se vierte a la circulación, iv) la expresión está asociada

20 con la actividad enzimática o de señalización. PSMA también se expresa en la neovasculatura de la mayoría de otros tumores sólidos y, por lo tanto, puede ser una diana para administración de fármaco anti-angiogenético específico.

Debido a sus especificidades orientadas a diana, se ha puesto un gran énfasis en el desarrollo de anticuerpos monoclonales (mAb) para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas en la medicina del cáncer. Sin embargo, el uso 25 in vivo de mAb está asociado con problemas graves, debido a su tamaño e inmunogenicidad. Por lo tanto, la investigación se ha enfocado en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos más pequeños con menos efectos secundarios, mejor accesibilidad al tumor y velocidades de eliminación más rápidas. La ingeniería genética ha hecho posible construir fragmentos de anticuerpo de cadena única (scFv) que son potencialmente herramientas potentes para la terapia del cáncer. Estos anticuerpos pequeños están compuestos de los dominios variables de la cadena

30 ligera (VL) y la cadena pesada (VH) conectados por un péptido de engarce. Los mismos muestran inmunogenicidad pequeña, casi ningún efecto tóxico, una velocidad de eliminación aumentada, una captación mejorada por el tumor y una mejor penetración en las células del tumor. Los scFv murinos recombinantes se pueden establecer de acuerdo con procedimientos convencionales usando bibliotecas de expresión a partir de hibridomas o células del bazo de ratones inmunizados específicamente [Chowdhury y col., Mol. Immunol. 4 (1997), págs. 9-20].

35 El primer mAb publicado (7E11-C5) frente a PSMA se dirige al dominio intracelular de la proteína y demostró ser altamente específico de la próstata [Horoszewicz y col., Anticancer Res. 7 (1987), págs. 927-935]. También, los anticuerpos monoclonales frente al dominio extracelular de PSMA se han generado después de la inmunización con el antígeno. Sin embargo, aún existe una discrepancia entre la unión del antígeno en células fijas y cortes histológicos por una parte y la unión a células tumorales viables por la otra parte.

40 El antígeno prostático específico de membrana (PSMA) es un marcador prostático que se expresa altamente en la próstata normal así como en el cáncer prostático. Su expresión está aumentada en el cáncer prostático y se encuentra principalmente y en la próstata.

El antígeno prostático específico de membrana (PSMA) es una proteína celular unida a membrana única que está sobre expresada de forma múltiple en cáncer prostático así como la neovasculatura de muchos tumores sólidos

45 diferentes, pero no en la vasculatura de tejidos normales. Esta expresión única de PSMA lo hace un marcador importante así como una diana extracelular grande de agentes de formación de imágenes. PSMA puede servir como una diana para la administración de agentes terapéuticos tales como citotoxinas o radionúclidos. PSMA tiene dos funciones enzimáticas únicas, folato hidrolasa y NAALADasa y se ha observado que se recicla al igual que otros receptores unidos a membrana a través de depresiones revestidas por clatrina.

50 Una forma radio-inmuno-conjugada del anticuerpo monoclonal anti-PSMA (mAb) 7E11, está disponible en el mercado como “ProstaScint®” que se usa actualmente para diagnosticar la metástasis de cáncer prostático y la reaparición. El epítopo de PSMA reconocido por el anticuerpo monoclonal 7E11-C5.3 se localiza en el dominio citoplasmático del antígeno prostático específico de membrana.

Sin embargo, también hay informes que describen la expresión de PSMA en tejidos no prostáticos incluyendo riñón, 55 hígado y cerebro. Por lo tanto una explicación posible la proporcionan O’Keefe y col. (Prostate, 2004, February 1; 58

(2) 200-10), concretamente que existe un gen similar a PSMA que posee un identidad del 98% al gen de PSMA en el nivel nucleotídico, que se expresa en riñón e hígado bajo el control de un promotor diferente al gen de PSMA.

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El documento WO 01/009192 describe el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos para antígeno prostático específico de membrana. Los anticuerpos monoclonales anti-PSMA humanos se generaron inmunizando ratones con PSMA purificado o preparaciones enriquecidas de antígeno de PSMA. Tal antígeno purificado es un PSMA desnaturalizado ya que el mismo se ha purificado mediante inmunoadsorción después de la lisis celular con

5 detergentes iónicos.

El documento WO 97/35616 describe anticuerpos monoclonales específicos para el dominio extracelular de antígeno prostático específico de membrana. Las inmunizaciones se realizaron con un péptido C-terminal o una preparación de membrana de tumor que expresa PSMA. Los mAb no se unen específicamente a células que expresan PSMA y por lo tanto no se pueden usar con fines de diagnóstico o terapéuticos.

10 Bander y col., Seminars in Oncology, 2003, págs. 667-677 y el documento US 2004/0213791 describen respectivamente anticuerpos monoclonales dirigidos frente a antígeno prostático específico de membrana. Debido a que la inmunización se realizó con antígeno purificado, los anticuerpos monoclonales no tienen una unión celular elevada y no se pudo obtener scFv de ninguno de estos mAb.

El documento WO 98/03873 describe los mismos anticuerpos que el documento US 2004/0213791 o partes de unión

15 de los mismos que reconocen un dominio extracelular de antígeno prostático específico de membrana. No se pudo demostrar que las partes de unión de los anticuerpos, de hecho, se unen al antígeno. Fracasso y col., The Prostate, 2002, págs. 9-23 describen anticuerpos monoclonales anti-PSMA que están acoplados químicamente a la cadena A de ricina. Las construcciones descritas en este artículo no se unen de forma suficientemente específica a la diana y tienen las desventajas descritas en general de generación de inmunotoxinas.

20 Es un objeto de la presente invención proporcionar medios y construcciones superiores que ayuden a diferenciar con una mayor fiabilidad entre células tumorales y células sanas que expresan PSMA o una proteína similar y células negativas a PSMA. Tales construcciones se pueden usar para dirigirse más específicamente a cáncer de próstata.

Es otro objeto proporcionar construcciones que destruyan las células de cáncer prostático específicas que expresan PSMA.

25 El antígeno prostático específico de membrana (PSMA) es una diana atractiva para inmunoterapia de cáncer de próstata. Sin embargo, en células prostáticas el PSMA se expresa con una estructura terciaria y cuaternaria específica y los anticuerpos generados con PSMA desnaturalizado aislado no reconocen eficazmente células tumorales que expresan PSMA. La unión de anticuerpos y scFv a PSMA desnaturalizado se puede obtener después de la inmunización con el antígeno purificado aislado. Sin embargo, la presente invención permite la generación de

30 anticuerpos y scFv de afinidad elevada frente a PSMA celular nativo mediante un procedimiento de inmunización diferente que proporciona únicamente una poca producción de clones positivos. Únicamente los últimos anticuerpos generados con PSMA nativo pueden reaccionar con PSMA de superficie celular y se pueden usar como herramientas de diagnóstico y terapéuticas.

Los anticuerpos monoclonales (mAb), fragmentos de anticuerpo de cadena única (scFv) y diacuerpos de la presente

35 invención se prepararon de acuerdo con procedimientos convencionales a partir de células de bazo de ratones. Sin embargo, los ratones se habían inmunizado con células LNCaP y lisado de células LNCaP que contenía PSMA nativo de longitud completa. En una realización preferida de la presente invención el antígeno, concretamente el PSMA nativo de longitud completa se ha obtenido después del tratamiento de las células, preferentemente células LNCaP con un tampón de lisis especial denominado M-PER, reactivo de extracción de proteína de mamífero que

40 está disponible en el mercado en Pierce, Roquefort, Illinois. El tampón M-PER usa un detergente de propiedad en tampón de glicina 25 mM (pH 7,6). Se exploraron y seleccionaron hibridomas y scFv mediante citometría de flujo en células LNCaP positivas a PSMA después de la absorción con células prostáticas DU 145 negativas a PSMA. Adicionalmente, las mismas se ensayaron para determinar reactividad con PSMA purificado. Los anticuerpos y scFv monoclonales resultantes se caracterizaron mediante citometría de flujo en LNCaP y DU 145 transfectadas con

45 PSMA y mediante transferencia de Western con PSMA glicosilado y desglicosilado purificado. Adicionalmente, se preparó inmunocitología con células LNCaP e inmunohistoquímica en cortes de parafina de muestras de cáncer de próstata.

En el transcurso de la presente invención se pudieron obtener tres mAb (3/F11, 3/A12 y 3/E7), que fueron reactivos con células LNCaP viables y células DU 145 transfectadas con PSMA pero no como otras líneas celulares que no

50 expresan PSMA. La unión a células LNCaP fue muy marcada. A concentraciones de saturación (100 nM) la intensidad de fluorescencia de PE media (IFM) estuvo entre 1.000 y 1.600. La reactividad con PSMA purificado fue más marcada con la forma nativa (ELISA) que con la proteína desnaturalizada y desglicosilada (transferencia de Western). La inmunohistoquímica en cortes de parafina fue específicamente positiva para células epiteliales con mAb E7.

55 A partir del mAb 3/A12 se obtuvieron dos scFv, denominados E8 y A5, mediante selección de fagos recombinantes en células LNCaP y PSMA purificado. La secuencia de scFv E8 fue idéntica a scFv A4, que se obtuvo a partir de la biblioteca de células B del mismo ratón. ScFv E8 fue reactivo de forma marcada con células LNCaP que muestran una IFM de aproximadamente 100 a concentraciones de saturación, mientras que la IFM de scFv A5 fue únicamente aproximadamente 40 en las mismas condiciones. No se observó unión o se observó unión mínima con otras líneas celulares que carecen de expresión de PSMA. La unión de ambos scFv a PSMA glicosilado y desglicosilado desnaturalizado purificado fue débil. Adicionalmente, se obtuvo el scFv denominado D7 a partir de mAb 3/F11 y el scFv denominado H12 a partir de mAb 3/E7. ScFv E8 es una realización no cubierta por las reivindicaciones.

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5 En la presente solicitud se describen tres mAb, que son diferentes de los publicados por otros autores con respecto a la afinidad de unión elevada y tinción elevada de células de cáncer de próstata que expresan PSMA. Los anticuerpos 3/F11, 3/A12 y 3/E7 no sólo muestran una actividad de unión marcada sino también internalización en células LNCaP como se demuestra mediante citología de inmunofluorescencia y detección con microscopía láser confocal de barrido. Estos mAb se obtuvieron después de la inmunización con PSMA nativo de longitud completa, lo

10 cual difiere de procedimientos diferentes de inmunización publicados.

Después de la inmunización con PSMA desnaturalizado purificado se obtuvieron mAb que eran altamente específicos para el antígeno, pero únicamente tenían una unión limitada a células LNCaP que expresan PSMA y además no se internalizaron en las células. Estos datos de control no se muestran en la presente solicitud. Existen unos pocos mAb anti-PSMA descritos en la bibliografía. Sin embargo, los valores de intensidad de fluorescencia

15 medios fueron mucho más bajos que con los anticuerpos de la presente invención.

De forma similar a los mAb, se generaron scFv anti-PSMA después de la inmunización con PSMA desnaturalizado y nativo. Con el PSMA desnaturalizado se obtuvieron scFv altamente específicos al antígeno, pero que no se unían a células LNCaP (datos no mostrados en la presente solicitud). Por el contrario, con PSMA nativos se obtuvieron scFv con una actividad de unión celular elevada, pero una unión pobre al antígeno desnaturalizado aislado.

20 Sin embargo, los problemas identificados en estos y otros ensayos con inmunotoxinas enlazadas químicamente son el desarrollo de anticuerpos frente a las inmunotoxinas, toxicidad hepática y síndrome de extravasación vascular y también dificultades para producir cantidades grandes de material definido. Estos problemas, al menos en parte, se superan usando tecnología de ADN recombinante que hace posible la construcción de inmunotoxinas menos inmunogénicas y más pequeñas y permite más fácilmente la producción de inmunotoxinas en grandes cantidades.

25 También se cree que la penetración en tumores sería mejor para proteínas pequeñas que para conjugados grandes. Por lo tanto, se modificaron por ingeniería genética inmunotoxinas recombinantes fusionando la secuencia codificante de los scFv E8, H12, D7 y A5 y la toxina PE40. El hallazgo central fue que todas las inmunotoxinas recombinantes eliminaban eficazmente las células de cáncer prostático cultivadas de una manera dependiente de la dosis. Se observó eliminación marcada con la proteína de fusión A5 de unión más baja con CI50 de

30 aproximadamente 0,09 nM. La eliminación de células de cáncer de próstata que no expresan PSMA fue más de

2.000 veces menor. Esto puede remontarse a proteínas bacterianas residuales u otros agentes tóxicos en las preparaciones de inmunotoxina, debido a que se pudo observar el mismo fondo en concentraciones igualmente elevadas con el scFv en solitario. El término CI50 se define como la concentración en nM de la toxina que reduce la proliferación celular hasta el 50% de la proliferación celular sin añadir una toxina.

35 Los anticuerpos y scFv descritos en la presente solicitud se unen específicamente a PSMA de superficie celular nativo y por lo tanto tendrán un valor en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas que se enfocan en PSMA como un antígeno diana para el cáncer de próstata.

Debido a que PSMA se expresa en células de cáncer de próstata con una estructura terciaria y cuaternaria específica, únicamente los anticuerpos frente a esta conformación celular pueden reconocer y unirse de forma

40 marcada a células de cáncer de próstata viables y tejido que expresa PSMA. Por lo tanto, el objeto del presente estudio era generar tales mAb y scFv que se puedan usar para la dirección terapéutica y de diagnóstico de cáncer de próstata.

La presente invención proporciona, por lo tanto, un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que se une a antígeno prostático específico de membrana en su forma nativa que está presente en la

45 superficie de células tumorales que está enlazado a un marcador o un agente citotóxico.

La expresión “anticuerpo monoclonal asilado” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante puentes de disulfuro. Cada cadena pesada consiste en una región variable de cadena pesada (abreviado VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consiste en tres dominios, concretamente CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera 50 contiene una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, que también se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR) intercaladas con regiones que están más conservadas. Esas regiones también se denominan regiones flanqueantes (FR). Cada región VH y VL consiste en tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,

55 CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno.

En las Figuras 14, 20 y 21 las CDR están marcadas por cuadros grises. Esas áreas son importantes para la unión del anticuerpo monoclonal o la parte de unión a antígeno del mismo. Las otras áreas de las regiones flanqueantes que se pueden reemplazar por otras secuencias, proporcionaron la estructura tridimensional que es necesaria para que la unión no se altere. En el caso de que la estructura de la construcción se cambie, no habrá suficiente unión al antígeno. Los anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de ratón pueden provocar efectos secundarios inmunológicos indeseados debido al hecho de que los mismos contienen una proteína de otra especie que puede

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5 provocar anticuerpos. Para superar este problema los anticuerpos monoclonales o las partes de unión a antígeno de los mismos se pueden humanizar. El procedimiento de humanización de anticuerpos monoclonales se conoce por los expertos en la materia. Las regiones flanqueantes de un mAb de ratón se reemplazan por las correspondientes regiones flanqueantes humanas. Con el fin de mantener las propiedades de unión preferidas las secuencias de las CDR se deberían mantener en la medida de lo posible. Sin embargo, puede ser necesario realizar algunos cambios de aminoácidos con el fin de optimizar las propiedades de unión. Esto se puede realizar por un experto en la materia mediante procedimientos convencionales. Adicionalmente mediante la introducción de una región flanqueante humana puede ser necesario realizar cambios y/o supresiones de aminoácidos con el fin de mejorar las propiedades de la construcción.

La expresión “parte de unión a antígeno” del anticuerpo monoclonal se refiere a uno o más fragmentos de un

15 anticuerpo tal que conservaron la capacidad de unirse específicamente al antígeno prostático específico de membrana en su forma nativa. Los ejemplos de partes de unión a antígeno del anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados mediante un puente de disulfuro en la región de bisagra, un fragmento Fd que consiste en el dominio VH y CH1, un fragmento FV que consiste en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, un fragmento dAb que consiste en un dominio VH y una región determinante de complementariedad aislada (CDR).

El anticuerpo monoclonal aislado o parte de un antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención se puede internalizar por una célula tumoral si el mismo se usa con fines terapéuticos. Con fines de diagnóstico puede no ser necesaria una internalización.

25 El anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención se une de forma marcada a células LNCAP pero no a células que carecen de la expresión de antígeno prostático específico de membrana.

La unión del anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo se mide mediante la intensidad de fluorescencia de PE (IFM) que es preferentemente igual o mayor que 40 para un scFv y preferentemente mayor que 1.000 para un mAb a concentraciones de saturación.

Las propiedades de unión de los anticuerpos monoclonales aislados o parte de unión a antígeno de los mismos al PSMA nativo se compararon tratando células LNCAP con concentraciones crecientes del Ab anti-PSMA de primera etapa seguido por incubación con el anticuerpo marcado con PE de segunda etapa. A partir de las curvas de saturación resultantes se puede leer la concentración de anticuerpo que alcanza el 50% de saturación de sitios de

35 PSMA. Los tres mAb 3/F11, 3/A12 y 3/E7 mostraron una actividad de unión elevada alcanzando una saturación del 50% de sitios PSMA a aproximadamente 16 nM (3/F11), 2 nM (3/A12) y 30 nM (3/E7). Se observó una saturación del 50% de sitios de PSMA a 60 nM (A5) con el scFv.

Con el fin de determinar la fuerza de unión se midió la intensidad de fluorescencia (IFM) de PE (ficoeritrina). Los valores de IFM se representaron frente a la concentración de anticuerpo (o fragmentos de unión de los mismos) por lo que el valor meseta de IFM corresponde al 100% de saturación con antígeno. Después de haber determinado el valor superior (correspondiendo la meseta al 100% de saturación de antígeno) se puede determinar fácilmente el valor correspondiente al 50% de saturación. Mediante el uso del gráfico se puede observar la concentración correspondiente de los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos en nM.

El anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo comprende un marcador que puede ser

45 una partícula que emite radiación radioactiva. Esta partícula puede ser un elemento en una forma que se puede enlazar a la construcción, preferiblemente en forma de un complejo. Por ejemplo se puede usar un mAb marcado con 111Indio como un agente de radioinmunoescintigrafía en la detección de tumores metastásicos distantes en pacientes con cáncer de próstata. Por su puesto, se pueden usar otros elementos radioactivos adecuados como 35S

131I.

o

Como alternativa el anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo puede comprender una agente citotóxico que es una sustancia tóxica a células seleccionada entre el grupo que consiste en toxinas, por ejemplo taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y/o

55 puromicina.

El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo se define por las reivindicaciones. Un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de este tipo comprende una secuencia de aminoácidos parcial de al menos 10 aminoácidos consecutivos de SEC ID Nº: 10 (scFv A5), SEC ID Nº: 20 (scFv H12) y/o SEC ID Nº: 22 (scFv D7). El anticuerpo monoclonal o parte de unión a antígeno del mismo comprende al menos 25 o, más preferido, al menos 35 y más preferido al menos 50 aminoácidos consecutivos de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 20 y/o SEC ID Nº: 22, respectivamente. ScFv E8 es una realización que no está cubierta por las reivindicaciones.

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5 El anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo comprende las CDR que tienen SEC ID Nº: 11 a 16. De una manera similar las CDR se pueden deducir a partir de la Figura 20 y 21 en las que se designan las secuencias de CDR.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de secuencias de ADN para la preparación de anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de los mismos. SEC ID Nº: 17 y 18 se refieren scFv A5. SEC ID Nº: 19 y 23 se

10 refieren a scFv H12 y SEC ID Nº: 21 y 24 se refieren a scFv D7. Las secuencias registran la cadena codificante y la cadena complementaria a la misma. La SEC ID Nº: 18 se muestra en la orientación 5’3’. Los polinucleótidos de la presente invención comprenden una secuencia contigua de al menos 20, preferentemente 50 y más preferentemente 75 y lo más preferido es que sean al menos 100 nucleótidos del grupo que consiste en SEC ID Nº: 17, 18, 19, 21, 23 y 24. La secuencia que codifica la CDR se prefiere particularmente.

15 Es un aspecto de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente solicitud. La composición farmacéutica de la presente invención comprende el anticuerpo monoclonal o una parte de unión a antígeno del mismo junto con aditivos farmacéuticamente aceptables. Preferentemente una composición de este tipo se prepara para inyección intramuscular o intravenosa. Como alternativa el anticuerpo se puede proporcionar en una

20 formulación de liberación prolongada que permite la liberación sostenida del agente biológicamente activo a lo largo de un periodo determinado de tiempo que puede variar preferentemente de uno a seis meses. Una formulación de liberación sostenida de este tipo puede comprender un polímero biodegradable como un poliláctido o copolímero poliláctido/poliglicólido que se degrada a lo largo de un periodo de tiempo prolongado en el cuerpo humano por lo cual el anticuerpo o la parte de unión a antígeno del mismo que preferentemente tiene una toxina se libera de una

25 manera controlada a lo largo de un periodo de tiempo determinado.

El anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo se puede usar para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en particular cáncer de próstata.

Como alternativa la invención proporciona un kit de diagnóstico para la detección de células tumorales que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo. En tales realizaciones el

30 marcador permite la detección de la construcción con dispositivos de detección adecuados.

La invención también proporciona un procedimiento para la identificación in vitro de células tumorales mediante el cual las células tumorales que se tienen que identificar se ponen en contacto con un anticuerpo monoclonal aislado

o una parte de unión a antígeno del mismo que porta un marcador que se puede detectar mediante dispositivos

analíticos adecuados. El marcador permite la identificación de diagnóstico de células tumorales, por ejemplo en 35 cortes de tejidos humanos obtenidos después de cirugía o biopsia.

Breve Descripción de las Figuras

ScFv E8 es una realización que no está cubierta por las reivindicaciones.

Figura 1: Análisis de FACS de la unión de mAb 3/F11, 3/A12 y 3/E7 a la superficie de células LNCaP que expresan PSMA a concentraciones de saturación.

40 Figura 1 a-c: Curvas de saturación de antígeno de mAb 3/F11 (a), 3/A12 (b) y 3/E7 (c).

Figura 2: Citología de inmunofluorescencia: Unión de a) mAb 3/F11 b) mAb 3/A12 c) 3/E7 a células LNCaP. Las fotografías de la izquierda muestran una tinción de control con 4’,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Figura 3: Citología de inmunofluorescencia: Internalización de a) mAb 3/F11 b) mAb 3/A12 c) 3/E7 en 45 células LNCaP. Las fotografías de la izquierda muestran una tinción de control con 4’,6-Diamidino2-fenilindol (DAPI).

Figura 4: Transferencia de Western con PSMA purificado y los mAb 3/E7, 3/A12 y 3/F11.

Figura 5: Transferencia de Western con PSMA glicosilado y desglicosilado y mAb 3/A12.

Figura 6: Inmunohistoquímica de mAb 3/E7 en corte de parafina de cáncer de próstata.

50 Figura 7a/b: Análisis de FACS de los scFv E8 (a) y A5 (b) en células LNCaP que expresan PSMA a concentraciones de saturación.

Figura 7c/d: Curvas de saturación de antígeno de scFv E8 (c) y A5 (d).

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Figura 8: Transferencia de Western con PSMA purificado y los scFv A5 y E8.

Figura 9: inmunocitología de scFv E8 en células LCNaP.

Figura 10: construcción de la inmunotoxina E8-P40.

Figura 11: Efecto citotóxico de inmunotoxina recombinante E8-P40 en células LNCaP.

5 Figura 12: Efecto citotóxico de proteína de fusión recombinante A5-P40 en células LNCaP.

Figura 13: Secuencia de scFv E8. La secuencia de ADN se proporciona también como secuencia de aminoácidos por lo que la región de las CDW se identifica mediante un área marcada.

Figura 14: Secuencia de scFv A5. La secuencia de ADN se proporciona también como secuencia de aminoácidos por lo que la región de la CDW se identifica mediante un área marcada.

10 Figura 15: Esta Figura muestra la unión del scFv A5, H12 y D7 a células DU 145 negativas a PSMA (a) y células LNCaP positivas a PSMA (A5 = B, H12 = C, D7 = D). Las células se tiñeron con los mAb y un mAb anti-IgG de ratón conjugado con PE. Los histogramas representan logaritmos de fluorescencia de PE en citómetro de flujo. El control negativo se realizó únicamente con anticuerpo secundario.

15 Figura 16: La unión de los scFv A5, H12 y D7 a células BOSC negativas a PSMA (a) y células BOSC transfectadas con PSMA (A5 = B, H12 = C, D7 = D). Las células se tiñeron con el mAb anti-c-myc de scFv y anti-Ig de ratón conjugado con PE. Los histogramas representan logaritmos de fluorescencia de PE en citómetro de flujo. El control negativo se realizó únicamente con anticuerpo secundario.

20 Figura 17: demuestra el efecto citotóxico de inmunotoxina recombinante HE12-PE40 sobre células LNCaP (negro) y DU (blanco).

Figura 18: muestra esquemáticamente el esquema de construcción del diacuerpo A5-CD3.

Figura 19: muestra el efecto citotóxico de un diacuerpo construido a partir de scFv A5 (A5-CD3) a concentraciones diferentes y linfocitos de sangre periférica (proporción de efecto o diana 10:1) 25 sobre células LNCaP después de incubación de 48 h.

Figura 20: muestra la secuencia de scFv H12. La secuencia de aminoácidos se proporciona en el código de una letra en la primera línea (correspondiente a SEC ID Nº: 20). La cadena codificante se muestra en la segunda línea (SEC ID Nº: 19) y la cadena complementaria se muestra en la tercera línea. Esta secuencia corresponde a SEC ID Nº: 23. Las CDR se designan específicamente como CDR

30 H1, H2, H3, L1, L2 y L3. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones de CDR se muestran en un fondo gris.

Figura 21: muestra la secuencia de scFv D7. La secuencia de aminoácidos se muestra en la primera línea en el código de una letra. Esta secuencia corresponde a SEC ID Nº: 22. La cadena de ácido nucleico codificante se muestra en la primera línea. Esta secuencia corresponde a SEC ID Nº: 21 y la

35 cadena complementaria se muestra en la tercera línea. Esta secuencia corresponde a SEC ID Nº:

24. Las regiones de CDR H1, H2, H3, L1 y L2 se muestran en la secuencia. Las secuencias de ácido nucleico que codifican esas regiones se muestran en un fondo gris.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. ScFv E8 es una realización que no está cubierta por las reivindicaciones.

40 Ejemplo 1

a) Preparación de PSMA

Las líneas de células de carcinoma de próstata humano LNCaP, DU 145, PC-3 y HeLa así como el hibridoma 7E11C5.3 (IgG1-k, PSMA) se adquirieron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD, EE.UU. LNCaP, DU 145 y HeLa se cultivaron en medio RPMI 1640, PC-3 en medio F12 Nutrimix, ambos complementados

45 con penicilina (100.000 U/I), estreptomicina (100 mg/I) y FCS al 10 % a 37°C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %. Para la generación de células LNCaP que expresan PSMA no glicosilado en su superficie se añadieron 2 g/ml de tunicamicina (ICN Biomedicals) al medio durante 48 h.

Células LNCaP fijas se obtuvieron mediante tratamiento con paraformaldehído al 4% durante 10 min a TA y después se lavaron vigorosamente con PBS.

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Para preparar PSMA purificado, 108 células LNCaP se lavaron con PBS y después se lisaron en PBS que contenía IGEPAL al 1% durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación a 10.000 g el sobrenadante se proporcionó sobre una columna de cromatografía de afinidad 7E11-C5 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) y el PSMA se eluyó con tampón de glicina 100 mM pH 2,5 que contenía Tritón X-100 al 1%. Después de la neutralización la proteína se dializó exhaustivamente con PBS.

Para la preparación de PSMA desglicosilado, se añadió 1/10 vol. de tampón desnaturalizante de glicoproteína (BioLabs) a la solución con PSMA purificado y se calentó durante 10 min a 100ºC. Después se añadieron 1/10 vol. de NP-40 al 10% (10%) y 50 U de PNGasapor por g de PSMA y se incubó a 37ºC durante 1 h.

Para la preparación de un lisado de células de LNCaP que contenga PSMA nativo de longitud completa, las células se lisaron con reactivo M-PER (Pierce) durante 10 min y después se centrifugaron a 15.000 rpm durante 30 min a 4ºC. El sobrenadante que contenía el PSMA de longitud completa nativo se recogió (lisado de M-PER). La fracción molecular elevada (100 a 600 KD) de este lisado se separó mediante HPLC en una columna de exclusión por tamaño Biosil 250.

b) Transfección de PSMA de longitud completa en células DU 145 y PC3

PSMA de longitud completo se clonó en dos fragmentos (fragmento 1 desde pb 262 hasta el sitio de restricción EcoRI único en pb 1573 y el fragmento 2 desde la posición 1574 hasta 2512) en el vector pCR3.1 (Invitrogen). La transfección transitoria se obtuvo añadiendo una mezcla de 4 g de ADN y 10 l de Lipofectamina (Invitrogen) en 500 l de medio RPMI a 106 células de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de incubación de 48 h las células transfectadas de forma transitoria se usaron para ensayo.

Ejemplo 2

Inmunización de ratones

Ratones Balb/c hembra de cuatro meses de edad se inmunizaron por vía intraperitoneal con 300 g de lisado M-PER a partir de células LNCaP o con la fracción de HPLC molecular elevada del lisado o con 106 células LNCaP, fijadas con paraformaldehído al 2%. Estas preparaciones se mezclaron 1:1 con adyuvante de Freund completo. Cada ratón recibió 4 o 5 inmunizaciones con intervalos de 2 semanas. Cuatro días después de la última inmunización se recogieron células del bazo y se usaron para la preparación de hibridomas o una biblioteca de células B.

Ejemplo 3

Preparación de una biblioteca de células B

El bazo de ratón se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se cortó en trozos pequeños, se lavó nuevamente en PBS y después se homogeneizó con cuidado en un homogeneizador de mano “ajustable”. La suspensión de células única resultante se revistió en Ficoll (Pharmacia, Freiburg, Alemania) y se centrifugó a 400 g durante 20 min a temperatura ambiente. Las células B de interfase se aislaron con microperlas CD 19 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania). 106 células B se lisaron en 350 l de una solución que consiste en tiocianato de guanidina 4 M, citrato de sodio 25 mM, N-laurosilsarcosinato de sodio al 0,5% y 2-mercaptoetanol 100 mM.

Ejemplo 4

a) Preparación de Hibridomas

El bazo se retiró de forma aséptica y se preparó una suspensión de células única en medio RPMI-1640 sin suero. Los esplenocitos se añadieron a células de mieloma SP2/0 en una proporción de 10:1 y la fusión y selección se realizó para establecer los procedimientos [Galfre y col., Nature (1979), págs. 131-133].

Los sobrenadantes de hibridomas se ensayaron mediante FACS en células LNCaP y DU 145 y mediante un ELISA con PSMA purificado como fase sólida. Los anticuerpos monoclonales se purificaron usando una columna de proteína G (Pharmacia).

b) Determinación de isotipo de los mAb

Los isotipos de Ig de los mAb anti-PSMA se determinaron mediante ELISA usando anticuerpos específicos antiisotipo no marcados (fase sólida) o marcados con peroxidasa (indicador) (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL).

c) Aislamiento y caracterización de anticuerpos monoclonales conformacionales anti-PSMA

A partir de ratones Balb/c que se inmunizaron 5 veces con el lisado M-PER de células LNCaP, células de bazo se fusionaron con células SP2/0 de acuerdo con procedimientos establecidos. Los hibridomas positivos se seleccionaron mediante citometría de flujo con células LNCaP y ELISA en PSMA purificado. De esta manera se obtuvieron tres clones positivos. Los mAb correspondientes con sus isotipos fueron 3/F11 (IgG2a), 3/A12 (IgG1) y 3/E7 (IgG2b).

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d) Caracterización de mAb

5 Mediante citometría de flujo se pudo observar que los tres mAb y células LNCaP teñidas se unen muy bien con un porcentaje de células positivas que varía del 95% al 98%. La forma de las curvas de fluorescencia frente al número de acontecimientos sugirió que PSMA se distribuye de forma homogénea dentro de la población de células LNCaP (Figura 1). Para evaluar la especificidad de unión de los mAb anti-PSMA, células DU 145, PC3 negativas a PSMA, células HeLa y Jurkat también se tiñeron y se analizaron mediante citometría de flujo. Los tres mAb no tiñeron las

10 células negativas a PSMA (porcentaje de células positivas que varía del 0,04% al 2%).

Las propiedades de unión de los tres anticuerpos se compararon tratando células LNCaP con concentraciones crecientes del mAb anti-PSMA de primera etapa seguido por incubación con una cantidad de saturación de un anticuerpo de cabra marcado con PE (ficoeritrina) de segunda etapa seguido por análisis de citofluorometría. A concentraciones de saturación de antígeno [100 nM] la intensidad de fluorescencia media de PE (ficoeritrina)

15 corregida fue aproximadamente 1.000 para mAb 3A12 y aproximadamente 1.400 para mAb 3F11 y aproximadamente 1.600 para mAb 3E7. Como se muestra para mAb 3A12 la IFM fue cinco veces más baja en células LNCaP que expresan PSMA no glicosilado (cultivadas con tunicamicina).

Mediante citología de inmunofluorescencia y detección con un microscopio láser confocal de barrido se pudo demostrar una unión marcada de los tres mAb a células LNCaP (Figura 2) y también una internalización en estas

20 células (Figura 3). Todos los mAb fueron positivos en un ELISA con PSMA purificado como fase sólida. Con PSMA desnaturalizado los mAb mostraron una señal a aproximadamente 100 KD en transferencia de Western (Figura 4) mientras que la transferencia con PSMA desglicosilado fue débil dando una señal a aproximadamente 84 KD, que corresponde a los datos de la bibliografía (Figura 5).

La inmunohistoquímica en cortes de parafina de cáncer de próstata fue positiva con mAb 3/E7 pero no con mAb 25 3/F11 y 3/A12 (Figura 6). Los datos se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Caracterización de 3 anticuerpos monoclonales frente a PSMA de superficie celular

Hibridoma

Isotipo FACS de LNCaP [IFM]* FACS de DU* transf. con PSMA [IFM] ELISA de PSMA Transferenci a de PSMA Transferencia de PSMA desglicosilado Inmunohistoquí mica

3/F11

IgG2a 1400 105 pos pos (pos) neg

3/A12

IgG1 1000 110 pos pos (pos) neg

3/E7

IgG2b 1600 90 pos pos (pos) pos

IFM = intensidad de fluorescencia media a concentración de scFv que alcanza saturación de antígeno (se resta la tinción de fondo con anticuerpo secundario en solitario) (pos) = ligeramente positivo

A partir de estos datos se concluye que los 3 mAb muestran una unión muy marcada y altamente específica a PSMA nativo y desnaturalizado. Aunque la unión a PSMA desglicosilado es más débil, se puede excluir una especificidad

30 de azúcar a partir del hecho de que no se observa unión a células que no expresan PSMA.

Ejemplo 5

Preparación de una biblioteca de expresión de scFv en el fagémido pSEX

A partir de la biblioteca de células B o a partir de células de hibridoma se aisló ARN total y ARNm con membranas basadas en gel de sílice (Rneasy, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La síntesis 35 de ADNc se realizó a 42ºC durante 60 min en un volumen final de 50 l que contenía 25 l de ARN desnaturalizado, 10 l de tampón 5x (Promega, Heidelberg, Alemania), 5 l de dNTP 10 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Promega), 1,5 l de RNAsin (40 U/l, Promega), 2,5 l de cebadores de hexámero aleatorios 150 pM y 2,5 l de transcriptasa inversa AMV (10 U/l, Promega). Después las regiones codificantes de las cadenas pesadas y las cadenas gamma y kappa se amplificaron mediante PCR como se ha descrito previamente por Orum y col. [Nucleic Acids Res. (1993),

40 4491-4498]. Para cada cadena se realizaron 25 reacciones separadas combinando 25 cebadores directos de región constante diferentes con un cebador inverso correspondiente. Los productos amplificados para las cadenas ligeras y las cadenas pesadas se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

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Los productos de PCR para las cadenas ligeras se digirieron con Mlul y Notl, y se ligaron en el fagémido pSEX81 [Dübel y col., Gene (1993), 97-101] usando una proporción molar de 1:3 (2 g del vector, 400 ng de inserto). Los productos de un ligamiento se usaron para la electroporación de 50 l de células XL1-Blue de E. coli electrocompetentes (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Las bacterias se sembraron en nueve placas de agarosa de 80 mm de diámetro que contenían 100 g/ml de ampicilina y glucosa (SOB-AG) 0,1 M y se incubaron durante una noche a 30 ºC. Las bacterias se aislaron añadiendo 3 ml de medio 2xYT en cada placa, raspándolas con un distribuidor de vidrio estéril y sedimentándolas a 3.000 g durante 15 min. A partir de estas bacterias se aisló ADN de plásmido que reveló la sub-biblioteca VI. Después los productos de PCR para la cadena pesada y la sub-biblioteca VI se digirieron con Ncol y Hindlll. El ligamiento se preparó a una proporción de 3:1 (2 g de sub-biblioteca y 400 ng de inserto). La transformación mediante electroporación, el sembrado y la recolección de bacterias transformadas se realizó como se ha descrito para la sub-biblioteca VI. A partir de nueve placas de SOB-AG de 80 mm de diámetro se obtuvieron un total de 18 ml de biblioteca VHVL.

Ejemplo 6

Producción y selección de fago que presenta anticuerpo

a) Producción

En la biblioteca de VHVL en el fagémido pSEX los genes de anticuerpo se fusionan en fase con el gen III, que codifica la proteína de superficie menor gIIIp del fago filamentoso. Por lo tanto, la producción de partículas de fagémido recombinante que presentan al anticuerpo en la superficie requiere infección de la célula bacteriana que porta el fagémido con el fago sin capacidad de replicación M13KO7 [14]. M13KO se añadió a un cultivo de biblioteca de 10 ml a una multiplicidad de 10. Después de la incubación a 37 ºC durante 90 min las células se sedimentaron y resuspendieron en 15 ml de medio 2xYT que contenía 100 g/ml de ampicilina, 10 g/ml de tetraciclina y 50 g/ml de kanamicina. El cultivo se incubó durante una noche a 37 ºC a 250 rpm, después se enfrió en hielo y se centrifugó para retirar las células. El sobrenadante que contenía los fagos se mezcló con 1/5 volumen de una solución acuosa que contenía PEG 8.000 al 20% y NaCl al 14% y se incubó 1 h a 4 ºC. Después se añadió una etapa de centrifugación de 30 min a 4 ºC a 6.200 g. El sedimento que contiene los fagos se resuspendió en 2 ml de Tris/HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 2 mM, pH 7,5 y se usó para selección.

b) Selección para seleccionar clones de unión a antígeno y a células.

La selección en PSMA purificado se realizó en placas de microtitulación de 96 pocillos Maxi-Sorb (Nunc) que se revistieron con una solución de PSMA purificado (100 l/pocillo, 12 g/ml de PSMA en PBS) y se bloquearon con leche desnatada/PBS al 4%. Un ml de fagos recombinantes purificados (circa 1011) se incubaron en 1 ml de leche desnatada/PBS al 4% complementado con 15 l de Tritón X100 al 10% durante 15 min y después se permitió que se unieran a 8 pocillos revestidos con PSMA durante 2 h a 37 ºC. Después de 20 ciclos de lavado con PBS/Tween (0,1%) los fagos unidos se eluyeron con tampón de Glicina 0,1 M pH 2,2. Para selección en células LNCaP viables los fagos se absorbieron previamente en células DU 145. Para este procedimiento 1 ml de fagos recombinantes (circa 1011) se incubaron en leche desnatada/PBS al 2% durante 15 min y después con 107 células DU 145 durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador. Después las células se centrifugaron y el sobrenadante con fagos no absorbidos se incubó con 106 células LNCaP durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador. Después de 10 ciclos de lavado con leche desnatada/PBS al 2% y 5 ciclos con PBS los fagos unidos se eluyeron con HCl 50 mM con neutralización posterior con Tris-HCl 1 M (pH 7,5).

Células TG1 de E. coli se infectaron con los fagos eluidos, se sembraron en placas de SOB-AG y se incubaron durante una noche a 30 ºC. Una alícuota del eluido se usó para titulación. El procedimiento de selección se repitió tres a seis veces.

c) Recuperación de fago a pequeña escala.

A partir de la placa de titulación se aislaron 96 colonias individuales y cada una se transfirió a un pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos profundos llenos con 500 l de medio 2xYT que contenía 100 g/ml de ampicilina y glucosa 0,1 M (YT-AG) y se incubaron durante una noche a 37 ºC (placa maestra). Después 40 l de cultivo saturado a partir de cada pocillo de la placa maestra se transfirieron al pocillo correspondiente de una placa nueva que contenía 400 l de medio 2x YT-AG.

A cada pocillo se añadieron aproximadamente 1 x 1010 fagos auxiliares M13KO7 y se incubaron en un agitador durante 2 horas a 37 ºC. Después la placa se centrifugó y el sedimento se suspendió en medio 2xYT complementado con 100 g/ml de ampicilina, 10 g/ml de tetraciclina y 50 g/ml de kanamicina y se incubó a 29 ºC y 240 rpm durante una noche. Después de la centrifugación el sobrenadante que contenía los fagémidos recuperados se retiró y se usó para ELISA de fago y citometría de flujo.

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d) ELISA de fago

Placas de microtitulación se revistieron con PSMA purificado (1,5 g de PSMA/ml de PBS) durante una noche y después se bloquearon con leche desnatada/PBS al 2%. A cada pocillo se añadieron 200 l de fagémidos recuperados, se preincubaron 1:1 con leche desnatada/PBS al 2% y se incubaron durante 2 h a temperatura

5 ambiente. Después de cinco etapas de lavado con PBS-Tween, los fagos unidos se detectaron con 200 l/pocillo de anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (Pharmacia) durante 2 h a temperatura ambiente. El desarrollo se realizó con 3,3’,5’,5’-tetrametilbencidina como sustrato.

e) Aislamiento y caracterización de scFv conformacional anti-PSMA

Para la generación de scFv conformacional anti-PSMA se construyó una biblioteca VHVL en el fagémido pSEX a

10 partir de la biblioteca de células B de un ratón inmunizado con lisado M-PER de células LNGaP. Esta biblioteca tenía una complejidad de 107. De una manera similar se preparó una biblioteca VHVL a partir del anticuerpo monoclonal 3/A12, que se obtuvo a partir del mismo ratón inmunizado con lisado de LNCaP. Esta biblioteca VHVL tenía una complejidad de 105. Para aislar los fagos que presentan scFv de unión a PSMA celular en su superficie, se realizaron seis ciclos de selección alternativamente en células LNCaP después de la absorción con células DU-145

15 en tubos de poliestireno y en placas de microtitulación revestidas con 20 g/ml de PSMA purificado. Después de tres, cuatro y seis ciclos de selección las colonias de fagémido aisladas se cultivaron y las partículas de fago se recuperaron mediante infección con M13KO7. El análisis de 800 clones de fago a partir de la biblioteca de células B mediante citometría de flujo con células LNCaP y ELISA en PSMA purificado mostró un clon positivo denominado E8. A partir de la biblioteca VHVL de mAb 3/A12 se obtuvieron dos clones positivos después del cuarto ciclo de

20 selección denominados A4 y A5. Mediante la secuenciación de los mismos se observó que A4 era idéntico a E8.

La región codificante de los scFv E8 y A5 se transfirió desde el fagémido pSEX al vector de expresión pHOG, que contiene etiquetas c-myc y His C terminales. Las secuencias con las CDR correspondientes se proporcionan en la Figura 13 y Figura 14. Las regiones codificantes de las CDR de las partes de unión a antígeno están marcadas en las Figuras 13 y 14. Esas secuencias no se deben cambiar mientras que las otras partes de la secuencia que no

25 están marcadas se pueden cambiar. Sin embargo, la estructura tridimensional apropiada tiene que mantenerse.

El scFv E8 reaccionó de forma marcada con células LNCaP viables según se midió mediante citometría de flujo con valores de IFM de aproximadamente 100 a concentraciones de saturación, mientras que la unión de A5 fue mucho más débil con valores de IFM de aproximadamente 40 a concentraciones de saturación (Figura 7). Por el contrario, la unión a PSMA purificado como fase sólida en un ELISA fue débil para E8 y algo más fuerte para A5. Se observó

30 un patrón similar en transferencias de western con PSMA glicosilado y desglicosilado desnaturalizado (Figura 8). Mediante citología de inmunofluorescencia con células LNCaP y detección mediante microscopía láser confocal se pudo demostrar una muy buena unión del scFv E8 e internalización (Figura 9). Los datos del scFv se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Caracterización de 2 scFv frente a PSMA de superficie celular

ScFv

Origen FACS de LNCaP [IFM] FACS de DU transf. con PSMA [IFM] ELISA de PSMA Transferenci a de PSMA Transferencia de PSMA desgl.

E8 = A4

Biblioteca de células B y mAb A12 100 70 pos (pos) (pos)

A5

MAb A12 40 pos pos (pos)

IFM = intensidad de fluorescencia media a concentración de scFv que alcanza la saturación de antígeno (se resta la tinción de fondo con anticuerpo secundario en solitario) (pos) = ligeramente positivo

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Ejemplo 7

Expresión y purificación de scFv

Fragmentos de ScFv se expresaron en E. coli XL1-Blue (Stratagene) usando el vector de secreción pHOG 21 que contiene las secuencias de la etiqueta His-6 y c-myc en una posición C terminal del scFv [Kipriganov y col., J. 40 Immunol. Methods (1997), págs. 69-77]. Bacterias E. coli transformadas con plásmidos pHOG se cultivaron durante una noche en medio 2 x YT-AG, después se diluyeron 1:20 y se cultivaron como cultivos de 600 ml a 37 ºC. Cuando los cultivos alcanzaron DO 0,8, las bacterias se sedimentaron mediante centrifugación a 1.500 g durante 10 min y se resuspendieron en el mismo volumen de medio YT nuevo que contenía 50 g/ml de ampicilina, sacarosa 0,4 M e IPTG 1 mM. Después el cultivo se continuó a temperatura ambiente durante 18 a 20 h. Las células se recogieron 45 mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 min y 4 ºC. Para aislar las proteínas periplasmáticas solubles, las

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bacterias sedimentadas se resuspendieron en el 5% del volumen inicial de Tris-HCl 50 mM enfriado con hielo, sacarosa al 20%, EDTA 1 mM pH 8,0. Después de una incubación de 1 h en hielo, los esferoblastos se centrifugaron a 20.000 g a 4 ºC durante 30 min produciendo extracto periplasmático soluble en el sobrenadante. El extracto periplasmático se concentró usando membranas YM10 Amicon con un punto de corte de 10 kDa (Amicon, Witten, Alemania) seguido por diálisis vigorosa frente a Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,0.

La purificación se consiguió mediante cromatografía de afinidad por metal inmovilizado. Esto se realizó usando una columna de 1 ml de Sefarosa quelante (Pharmacia) cargada con Cu2+ y equilibrada con un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM y NaCl 1 M, pH 7,0. El extracto periplasmático se cargó, se lavó con veinte volúmenes de columna de tampón de equilibrio que contenía imidazol 30 mM y después se eluyó con el mismo tampón que contenía imidazol 250 mM. El material eluido se dializó frente a PBS.

La determinación del contenido de proteína se realizó con el Kit Micro BCA Protein Reagent (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La inducción de proteína se obtuvo con IPTG y la producción de scFv a partir de 600 ml de un cultivo de E. coli XL1 fue aproximadamente 20 g.

Ejemplo 8

Citometría de flujo

Células LNCaP, DU 145 y PC3 se recogieron de forma reciente a partir de matraces de cultivo de tejido y se preparó una suspensión de células únicas en PBS con FCS al 3% y NaN3 al 0,1%. Se incubaron aproximadamente 105 células con 50 l de fagémidos recuperados, se preincubaron 1:1 con leche desnatada/PBS al 2%, 1 h en hielo. Después de 3 ciclos de lavado con PBS, 25 l/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-c-myc 9E10 (10 g/ml; Becton Dickinson) o cuando los fagos se ensayaron, 25 l/pocillo de anticuerpo anti-M14 (10 g/ml; Pharmacia) se añadieron e incubaron 40 min en hielo. Después de lavar 3 veces con PBS las células se incubaron con 100 l de anti-IgG de ratón de cabra marcado con PE (Becton Dickinson) durante 40 min en hielo. Después las células se lavaron nuevamente y se resuspendieron en 100 l de una solución que contenía 1 g/ml de yoduro de propidio (Sigma, Deisenhofen) en PBS con FCS al 3% y NaN3 al 0,1% para excluir las células muertas. La fluorescencia relativa de células teñidas se midió usando un citómetro de flujo FACScan y el software CellQuest (Becton Dickinson Mountain View, CA).

Ejemplo 9

Citología de inmunofluorescencia

Células LNCaP se cultivaron en cubreobjetos de vidrio durante 24 horas. Para la fijación, las células se trataron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 min a TA, lo cual no permeabiliza la membrana celular, se lavaron con BSA-PBS al 1%, se inactivaron durante 10 min en NH4Cl 50 mM en PBS y se enjuagaron con BSA-PBS al 1%. Se añadió anticuerpo monoclonal primario a 4 g/ml en BSA-PBS al 1% y se incubó durante 60 min a 4 ºC. Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC (2 g/ml; Southern Biotechnology Associates Inc. Birmingham, EE.UU.) se incubó durante 30 min y se lavó exhaustivamente con BSA-PBS al 1%. Los portaobjetos se montaron en Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA).

Para experimentos de internalización el anticuerpo primario se incubó durante 30 min a 37 ºC antes de la fijación de las células con paraformaldehído al 2% y permeabilización con Tritón X100 al 0,5% en PBS.

Ejemplo 10

a) Inmunohistoquímica

Cortes de tejido con parafina se desparafinaron en primer lugar y después se trataron con Tritón X100 al 0,3% en PBS para recuperación de antígeno. Los cortes de Kryostat se fijaron en acetona fría. Después los cortes se trataron 30 min con H2O2 al 3% y metanol al 10% para inactivación de peroxidasa endógena. Después de bloqueo con BSA-PBS al 1% el anticuerpo primario se añadió a una concentración de 2 g/ml y se incubó durante 1 h a TA. Para el scFv se añadió un anticuerpo anti-c-myc de ratón secundario durante 1 h a TA. Después se incubó un anticuerpo anti-ratón de cabra biotinilado durante 30 min a TA y finalmente se desarrolló con reactivo ABC (Vectastain).

b) Análisis de transferencia de western

El análisis de transferencia de western se realizó a continuación de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodiopoliacrilamida (SDS) de PSMA purificado y el lisado de células a partir de células LNCaP y se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las transferencias se bloquearon durante una noche en PBS que contenía leche desnatada al 5% y se incubaron con los mAb purificados o scFv a concentraciones de 10 g/ml durante 1 h. Después las transferencias se lavaron 5 veces con PBS-Tween (0,5%) y se incubaron con anti-IgG de ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a TA. Después de 5 lavados con PBSTween (0,5%) las transferencias se desarrollaron usando 3,3’,5’,5’-tetrametilbencidina como sustrato.

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Ejemplo 11

Construcción, expresión y purificación de proteínas de scFv-PE40

La toxina usada en el presente enfoque fue la versión truncada de la exotoxina de Pseudomonas (PE40), que carece

5 de dominio la y que contiene únicamente los dominios Ib, II y III [Pastan y col., J. Biol. Chem. (1989), págs. 1515715160]. El ADN con la región codificante en el vector pSW200 se obtuvo del Prof. W. Wels, Frankfurt [Wels y col., Biotechnology (1992), págs. 1128-1132]. El fragmento de ADN desde la posición de pb 253 hasta 613 que codifica PE40 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pSW200. El ADN amplificado después se ligó en el vector pOG-His-scFv en una posición C terminal al scFv usando el sitio de restricción Xbal. Todas las etapas de clonación

10 se realizaron de acuerdo con los procedimientos convencionales en E. coli XL1 blue y los productos se confirmaron mediante secuenciación.

La inducción de proteína de la inmunotoxina y la purificación mediante IMAC fue la misma que el scFv. Los productos se ensayaron y caracterizaron mediante SDS-page, transferencia de western y citometría de flujo.

Ejemplo 12

15 Citotoxicidad de Inmunotoxinas de scFv-PE40

El metabolismo de la sal de tetrazolio WST roja a un colorante de formazán soluble en agua se determinó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer). Las células diana (LNCaP y DU 145 como control) se sembraron a 2,5 x 104/pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas hasta que se formó una capa de células confluyente. Se añadieron diversas diluciones de las inmuntoxinas recombinantes en alícuotas de

20 50 l/pocillo y las placas se incubaron durante 48 horas a 37 ºC, CO2 al 5%. Después de este tiempo los cultivos se pulsaron con 15 l/pocillo de reactivo WST y se incubaron durante 90 min a 37 ºC, CO2 al 5%. Después las absorbancias espectrofotométricas de las muestras se midieron a 450 nm (referencia 690 nm). Se calculó la concentración de inmunotoxina necesaria para conseguir una reducción del 50% en una viabilidad celular con relación a la de los cultivos de control no tratados (concentración inhibidora del 50% = CI50).

25 Los ensayos de citotoxicidad (WST) con las inmunotoxinas E8-P40 y A5-P40 se prepararon con células LNCaP que expresan PSMA y células de control DU 145. Como se muestra en la Figura 11 se pudo demostrar un efecto citotóxico elevado con la inmunotoxina E8-PE40 sobre células LNCaP con un valor de CI50 de 0,05 nM. En la Figura 12 el efecto citotóxico de la inmunotoxina A5-PE40 se muestra con una CI50 de aproximadamente 0,09 nM. El fondo citotóxico sobre células DU 145 que no expresan PSMA fue el 5% para la construcción E8 y únicamente el 0,01%

30 para la construcción A5 evidenciando una ventana terapéutica muy buena.

Ejemplo 13

Generación de los scFv H12 y D7 partir de mAb 3/F11 y 3/E7

A partir de cada mAb se generó una biblioteca de expresión de scFv en el fagémido pSEX como se ha descrito en el Ejemplo 5.

35 La producción y selección de fago que presenta anticuerpo se realizó de acuerdo con el Ejemplo 6.

Después de seis ciclos de selección alternativamente en PSMA y células LNCaP se obtuvo un clon positivo específico, a partir de mAB 3/E7, que se denominó H12 y se obtuvo un clon positivo a partir de mAB 3/F11, que se denominó D7. La región codificante de cada scFv se transfirió al vector de expresión pHOG-21.

La expresión y purificación de scFv se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 7.

40 Ejemplo 14

Caracterización de los scFv H12 y D7

a) Citometría de flujo en líneas celulares positivas y negativas para PSMA.

Los scFv H12 y D7 reaccionaron con células LNCaP viables según se midió mediante citometría de flujo.

A partir de las curvas de saturación la concentración de anticuerpo que alcanza el 50% de la saturación de los sitios

45 de PSMA se determinó que era aproximadamente 120 nM (H12) y 20 nM (D7), respectivamente. En las concentraciones de saturación se alcanzaron los valores de IFM de 70 (H12) y 40 (D7) (Figura 15).

Para evaluar la especificidad de unión a PSMA de los scFv H12 y D7, células de cáncer de próstata negativas a PSMA DU145 y PC3 y otras líneas celulares negativas a PSMA (HeLa, MCF7, HCT15 y Jurkat) se tiñeron adicionalmente y se analizaron mediante citometría de flujo. Los tres scFv no tiñeron las células negativas para

5

10

15

20

25

30

35

E06707388

19-10-2015

PSMA.

b) Citometría de flujo en transfectantes de PSMA

Para verificar una unión específica a PSMA, los scFv H12 y D7 también se ensayaron en células BOSC-23 transfectadas con PSMA. Ambos scFv mostraron una unión dependiente de concentración a células BOSC transfectadas con PSMA de longitud completa pero no a células no transfectadas (Figura 16). Las condiciones de saturación se alcanzaron a 100 nM (D7) y 200 nM (H12). Similar a los mAb, los valores de IFM de los transfectantes fueron menores que en las células LNCaP y mostraron una distribución amplia, lo cual puede corresponder a moléculas de PSMA variables en la superficie celular de las primeras.

c) Citología de inmunofluorescencia

Se preparó citología de inmunofluorescencia como se ha descrito en el Ejemplo 4. Después de la detección con un microscopio láser confocal de barrido se observó una unión marcada de los scFv a células LNCaP y también una internalización en estas células.

d) ELISA y transferencia de Western

La unión de los scFv H12 y D7 a PSMA purificado en un ELISA de fase sólida y mediante transferencia de Western fue débil.

Las secuencias (de aminoácidos y ácido nucleico) de H12 y D7 se proporcionan en la Figura 20 y la Figura 21.

Tabla 3: Características de los scFv H12 y D7 anti-PSMA

scFv

mAb original FACS en LNCaP IFM* FACS en BOSC transfectadas con PSMA (IFM*) Transferencia en PSMA SEC ID Nº de secuencia de ácido nucleico (cadena codificante) SEC ID Nº de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº de secuencia de ácido nucleico (cadena complementaria)

H12

3/E7 70 25 100 kD 19 20 23

D7

3/F11 40 24 100 kD 21 22 24

* IFM = Valores de intensidad de fluorescencia media en condiciones de saturación después de la sustracción de la tinción de fondo con un anticuerpo de control con isotipo igual irrelevante o inmunoglobulina anti-ratón en solitario.

Ejemplo 15

Construcción y citotoxicidad de una inmunotoxina H12-PE40 e inmunotoxina D7-PE40.

La construcción de la inmunotoxina H12-PE40 y D7-PE40 fue similar a las inmunotoxinas A5 y E8 descritas en el Ejemplo 11. PE-40 representa el fragmento exotóxico de Pseudomonas.

La citotoxicidad se ensayó como se ha descrito en el ejemplo 12.

La inmunotoxina promovió la muerte de células LNCaP de una manera dependiente del tiempo; se pudieron observar los efectos citotóxicos más elevados después de 48 h de incubación.

En este momento se observaron valores de CI50 de aproximadamente 200 pM para H12-PE40 y D7-PE40 (Figura 17).

Adicionalmente, se ensayó la citotoxicidad de H12-PE40 y D7-PE40 en las líneas celulares negativas para PSMA DU145, PC-3, MCF7 y HCT 15. No se observó citotoxicidad en estas líneas celulares a concentraciones de hasta

25.000 pM.

Ejemplo 16

Construcción de un diacuerpo anti-PSMA/CD3

Se generó un diacuerpo biespecífico específico para PSMA y la cadena CD3 del complejo de receptor de células T. El diacuerpo biespecífico se expresó en E. coli usando un vector que contiene el operon dicistrónico para cosecreción de scFv de VhCD3-VIA5 y VhA5-VICD3 (Figura 18). Para la construcción de diacuerpo anti-A5/CD3 se usaron los plásmidos pKID 19x3 y pKID 3x19 [Kipriyanov, Int. J. Cancer 1998, pág. 763]. La expresión y purificación

Claims (9)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo que

   a) se une a antígeno prostático específico de membrana en su forma nativa que está presente en la superficie de células tumorales

   5 b) se puede internalizar por una célula tumoral. c) se une de forma marcada a células LNCAP pero no se une o se une únicamente de forma mínima a células que carecen de la expresión de antígeno prostático específico de membrana y d) se une a un marcador o a un agente citotóxico, caracterizado porque e) el mismo comprende las CDR que tienen SEC ID Nº: 11 a SEC ID Nº: 16 o las CDR designadas como CDR

   10 H1, H2, H3, L1, L2 y L3 como se muestra en la Figura 20 o las regiones de CDR correspondientes como se muestra en la Figura 21.
2. 2. Anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque la intensidad de fluorescencia de PE (IFM) del mAb es mayor que 1000 y la del scFv mayor que 40 a saturación de antígeno.

   15 3. Anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 que muestra una actividad de unión elevada a células LNCAP que alcanza el 50% de la saturación de los sitios de PSMA a concentraciones entre 1 nM y 120 nM.
3. 4. Anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las

   reivindicaciones 1-3 caracterizado porque el marcador es una partícula que emite radiación radiactiva o de 20 fluorescencia.

4. 5.

   Anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 caracterizado porque el agente citotóxico es una sustancia tóxica a células seleccionada entre el grupo que consiste en toxinas.

5. 6.

   Anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 5,

   25 caracterizado porque la toxina se selecciona entre el grupo de taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y/o puromicina.
6. 7. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del 30 mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. 8.

   Un anticuerpo monoclonal aislado o parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en el tratamiento de cáncer.

8. 9.

   Kit diagnóstico para la detección de células tumorales que comprende un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

   35 10. Un procedimiento para la identificación in vitro de células tumorales caracterizado porque las células tumorales a identificar se ponen en contacto con un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
9. 11. Un anticuerpo monoclonal aislado o una parte de unión a antígeno del mimo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la identificación de diagnóstico de células tumorales.

   40 12. Uso de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia contigua de al menos 20 nucleótidos de cualquier secuencia del grupo que consiste en SEC ID Nº: 17, 18, 19, 21, 23 y 24 en la preparación de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

   28