ES2362874T3 - Diseño de anticuerpos monoclonales desinmunizados para la protección contra la exposición al vih y el tratamiento de la infección por vih. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal desinmunizado que comprende (i) un fragmento de cadena pesada de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Numeros de Identificacion de Secuencia 5, 6, 7 y 8, (ii) un fragmento de cadena liviana de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Numeros de Identificacion de Secuencia 9, 10 y 11, y (iii) regiones constantes de IgG1 humana, en donde la Asn297 de la IgG1 se somete a N-aglicosilacion mediante la eliminacion de la Asn297 mediante mutacion a otro aminoacido.

Description

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Antecedentes de la invención

A pesar de la intensa investigación en la búsqueda de una vacuna en los 20 años transcurridos desde el descubrimiento inicial del VIH como el agente causante del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), y a 18 años de la clonación molecular y la caracterización del virus del SIDA, siguen existiendo importantes obstáculos para el desarrollo de la inmunoterapia para el tratamiento del virus del SIDA. Estos obstáculos incluyen la hipervariabilidad del VIH tipo 1 (VIH-1, el tipo de VIH más importante), las múltiples vías y/o modos de transmisión del virus, y una falta de comprensión de las respuestas inmunes necesarias para la inhibición del VIH.

En un análisis realizado por Moore et al. [1], se informa que los anticuerpos generados contra epítopos expuestos variables tienen actividad neutralizante efectiva sólo contra virus autólogos y aislados con proteínas de envoltura estrechamente relacionadas (env). Además, los anticuerpos monoclonales (mAbs) que reconocen las regiones de env más conservadas, dianas de mejor potencial inmunoterapéutico, casi nunca neutralizan claramente los aislados primarios. El conocimiento básico necesario para el logro de anticuerpos antivirales amplios sigue siendo tan enigmático que el campo de la vacunología del VIH se centra en la actualidad en enfoques que ofrecen, en el mejor de los casos, sólo la esperanza de una protección parcial contra la enfermedad [2].

Los aislados primarios de VIH-1 se obtienen mediante el cultivo limitado de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) del paciente, o el plasma del paciente con PBMC no infectadas. Son muy parecidas a las cepas de campo de VIH que son las responsables de la infección humana [3]. Los aislados primarios se diferencian fácilmente de los virus T-trópicos adaptados en laboratorio utilizados habitualmente, tales como IIIb/LAI, SF2, y MN, que se han reproducido y se encuentran bien adaptados al cultivo en líneas celulares T-linfoides humanas.

En primer lugar, la mayoría de los aislados primarios de VIH-1 son M-trópicos. No crecen fácilmente en líneas celulares T cultivadas, sino más bien son monocito- o macrófago-trópicos con la habilidad de infectar linfocitos T primarios [4]. En segundo lugar, los aislados primarios son altamente resistentes a la neutralización in vitro mediante las formas recombinantes solubles de la proteína receptora CD4 (rsCD4) de virus y requieren 200-2700 veces más rsCD4 que las cepas de laboratorio para una neutralización similar [5]. En tercer lugar, los aislados primarios también son resistentes a los anticuerpos de neutralización obtenidos mediante la utilización de vacunas gp120 [6].

Los aislados primarios incluyen tanto a los aislados inductores de sincitio (SI) como a los aislados que no inducen sincitio (NSI) en el cultivo de PBMC. La mayoría de los aislados primarios SI se replicarán en la línea celular T MT2 altamente sensible al VIH, pero pocas se pueden replicar en las líneas celulares T transformadas CEM o H9 menos permisivas que se utilizan habitualmente para cultivar los aislados adaptados en laboratorio. Los aislados primarios que no inducen sincitio (NSI) sólo pueden cultivarse en los linfocitos T primarios a partir de sangre periférica.

Hubo un equivocado optimismo inicial por las respuestas eficaces de anticuerpos a las vacunas de subunidad de la envoltura de VIH-1 recombinante (por ejemplo, las vacunas gp120 y gp160). Los sueros de los vacunados a partir de ensayos clínicos de las vacunas en base a envolturas experimentales habitualmente eran capaces de neutralizar los aislados de laboratorio de VIH-1 in vitro [7, 8]. En ese momento, las diferencias básicas entre los aislados adaptados en laboratorio y los primarios no se comprendían todavía. Este optimismo se derrumbó rápidamente cuando se descubrió que los anticuerpos en los sueros de los vacunados eran, en gran medida, inefectivos para la neutralización de los aislados primarios de VIH-1 de los pacientes [6, 9].

El optimismo inicial por la efectividad de los anticuerpos inducidos por vacunas se aportó equívocamente a partir de los estudios sobre preparaciones de virus inactivados de Virus de Inmunodeficiencia en Simios (SIV). Debido a las similitudes entre el VIH-1 y el SIV en morfología, organización genética, procesos de infección y enfermedad, la infección SIV en monos rhesus parecía ser un modelo excelente para explorar diferentes estrategias de vacunas contra el SIDA y anticuerpos contra el VIH. Los estudios iniciales en el modelo SIV mostraron que las preparaciones inactivadas de SIV cultivadas en líneas celulares T humanas y formuladas en adyuvante pueden proteger a los macacos de la infección después de la inoculación experimental con variantes patógenas altamente infecciosas de SIV cultivado en células humanas [10]. De forma inesperada, esta protección se perdió cuando se utilizó una cepa de SIV cultivada en células de mono homólogas para el desafío de animales inmunizados.

Los estudios de inmunización posteriores con SIV cultivado en células de mono y células humanas no infectadas mostraron que la protección contra la infección en aquellos primeros estudios de SIV, probablemente fueron el

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resultado de la estimulación de las respuestas inmunes a las proteínas celulares huésped humanas xenogénicas y no a los antígenos codificados por virus [11]. Los experimentos de inmunización pasiva que involucran al SIV sugirieron que determinados anticuerpos anticelulares podrían contribuir a la protección contra la infección de SIV ante la ausencia de inmunidad mediada por células [12].

No se ha delineado el mecanismo mediante el cual los anticuerpos anticelulares proporcionan inmunidad protectora contra el desafío retroviral. Un modo de acción para tal protección se puede mediar mediante el bloqueo del punto de unión del CD4 para los virus de inmunodeficiencia en las células del sistema inmune. Se sabe hace mucho tiempo que los anticuerpos monoclonales anti-CD4 bloquean la infección en una forma que depende del epítopo de CD4, no de la cepa del virus [13, 14]. El anticuerpo monoclonal 5A8, que reconoce el dominio 2 del CD4, había mostrado eficacia terapéutica en los macacos infectados con SIV [15]. Los anticuerpos monoclonales anti-CD4 Leu3A y P1, que reconocen el bucle tipo CDR2 en el dominio 1 del CD4, bloquearon la infección de los cultivos celulares mediante aislados primarios [5, 14].

Los anticuerpos anti-CD4 inhiben la transmisión de virus a célula o de célula infectada a célula no infectada tanto de las cepas SI como NSI de VIH 1 [16]. La superficie de los linfocitos T huésped parece tener un complejo de antígeno de células huésped asociado con el CD4 que facilita el vínculo y la entrada viral y actúa como diana para los anticuerpos anticélulas protectores [17, 18].

El anticuerpo monoclonal murino B4 (mAb B4) [17, 18] es un anticuerpo anticélula desarrollado mediante la utilización de linfocitos T que expresan CD4, tales como los linfocitos T mononucleares de sangre periférica, los timocitos, esplenocitos o líneas celulares T derivadas de leucemia o linfoma, por ejemplo, HPB-ALL o SUP-T1. El mAb B4 se caracterizó por su habilidad para neutralizar los aislados primarios de VIH-1 y los virus de inmunodeficiencia relacionados tanto in vitro como in vivo. Específicamente, el mAb B4 actúa mediante el bloqueo de la unión del VIH con las células huésped de CD4+. Es un inhibidor de entrada, una nueva clase de fármacos antiretrovirales para el tratamiento de la infección del VIH, proporcionando potencialmente una terapia ortogonal a la terapia antirretroviral altamente activa (HAART, por sus siglas en inglés).

El mAb B4 se dirigió contra un complejo de antígeno de superficie de célula huésped que comprendía proteína CD4 en asociación con los dominios a partir de receptores de quimiocina. El mAb B4 reconoce el CD4 mediante un punto de unión de región extracelular de CD4 en el bucle tipo CDR2 en el dominio 1. Este no coincide con el punto de unión para el Leu3A. La patente Estadounidense Número 5,912,176 revela evidencia sólida que indica que este anticuerpo B4 tiene actividades neutralizantes amplias contra los aislados a partir de todos los clados de VIH-1 y los aislados primarios de VIH tipo 2 (VIH-2) y de SIV. Al mezclar anticuerpos monoclonales con especificidades para diferentes antígenos de superficie celular, sólo aquellas mezclas que incluían mAb B3 mostraron fuerte actividad neutralizante para los aislados primarios de clado B de VIH-1. (Columna 24, líneas 1-10; Columna 47; líneas 5-10.) Además, en los ensayos de neutralización en aislados primarios de cepas de VIH-2 (es decir, VIH-2ROD) y SIV, el mAb B4 manifestó una fuerte neutralización para todas las cepas, mientras que el anticuerpo anti-V3 MN de N-terminal que previamente mostró ser efectivo en el VIH-1 MN adaptado en laboratorio no mostró ningún resultado comparativo. (Columna 45, líneas 19-35).

Los estudios adicionales de la actividad neutralizante del mAb B4 para el VIH-1 y los aislados primarios del VIH-2 y el SIV demuestran su eficacia en ratones, chimpancés, y macacos rhesus. Por ejemplo, la administración de mAb B4 después del desafío infeccioso, interrumpió la infección por VIH-1 cultivado en PBL de los ratones con inmunodeficiencia combinada severa de leucocito de sangre periférica humana (PBL) [18]. Además, la administración de mAb B4 en chimpancés después del desafío infeccioso interrumpió completamente la infección por VIH-1 adaptada a chimpancé [18]. Más aún, siguiendo el desafío con una dosis de SIVmac251 que causó una infección persistente en macacos rhesus, se descubrió que la inmunización pasiva de estos animales con una dosis modesta (4mg/kg) de mAb B4 protege de manera efectiva el 75 por ciento de los monos de la infección por un aislado primario de SIV, (Patente Estadounidense Número 5,912,176, Columna 50, líneas 15-22.)

Los requerimientos para el CD4 como receptor para la infección eficiente del VIH sugieren que la molécula de CD4 puede ser una buena diana para la inmunoterapia mediante anticuerpos anticelulares como el mAb B4, en la medida en que no existan efectos inmunomoduladores indebidos.

Sin embargo, se ha descubierto que la utilización de anticuerpos monoclonales murinos como el mAb B4 para las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico in vivo en el humano son limitadas por las respuestas inmunes a los anticuerpos murinos de los pacientes. El desarrollo de respuestas “HAMA” (anticuerpo humano anti-murino) en pacientes ha limitado la habilidad de los anticuerpos murinos de alcanzar sus dianas antigénicas y ha reducido la efectividad de los anticuerpos en la utilización terapéutica.

Las tecnologías de humanización de los anticuerpos se han diseñado para reducir la respuesta HAMA. Por ejemplo, los anticuerpos murinos se pueden convertir en anticuerpos quiméricos de ratón/humanos en donde las secuencias de codificación completa del ADN para los dominios variables de la inmunoglobulina de ratón se unen a las regiones que codifican los dominios humanos constantes [19]. Las secuencias de ADN de ratón se pueden además reducir

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para una mejor humanización mediante el injerto de una región de determinación de complementariedad (CDR). Se volvió a dar forma a una región Fv de rata para la utilización en inmunoterapia humana mediante la ablación de las regiones de codificación de ADN para los seis CDRs desde las regiones variables de la cadena liviana y pesada de la rata y el injerto de éstas en las regiones de codificación para las secuencias de la estructura de las cadenas livianas y pesadas humanas. La secuencia de codificación de la región variable a la que se volvió a dar forma se ensambló después en los dominios constantes humanos [20].

Sin embargo, los anticuerpos quiméricos e injertados en los cuales la región variable o CDRs permanece murina podrían ser todavía inmunogénicos. Además, el injerto de las CDRs en estructuras no relacionadas puede conducir a pérdidas en la afinidad del anticuerpo humanizado. Por consiguiente, la humanización de anticuerpos monoclonales murinos se aplicó además mediante el empleo de homología de secuencia y modelado molecular. Estos métodos se utilizaron para seleccionar estructuras humanas con mayor homología para las CDRs murinas que conservan afinidad altamente vinculante y minimizan la utilización de residuos murinos a tan sólo aquellos esenciales para el contacto [21].

Dado que el propósito de la humanización de los anticuerpos murinos terapéuticos es reducir la inmunogenicidad en los receptores humanos, la desinmunización es un proceso alternativo útil. La desinmunización reduce la inmunogenicidad de los dominios variables de roedor en humanos simplemente mediante la eliminación de los epítopos desde los dominios variables de los anticuerpos de roedor que tienen probabilidad de ser inmunogénicos en humanos.

En la práctica, una respuesta inmune primaria efectiva contra un anticuerpo terapéutico involucra: el procesamiento de proteínas foráneas, la presentación de péptidos antigénicos por las moléculas MHC clase II (epítopos de linfocitos T), y la estimulación de linfocitos T coadyuvantes. A su vez, estos linfocitos T coadyuvantes accionan y mejoran la producción de las células B de anticuerpos que se unen a los anticuerpos terapéuticos. Asimismo, si una o más secuencias dentro de un anticuerpo terapéutico (epítopos de célula B) se unen mediante inmunoglobulinas de superficie de célula B inmadura (sIg) en presencia de citoquinas adecuadas, la célula B se puede estimular para diferenciarse y multiplicarse para proporcionar formas solubles de la sIg original. Estas formas solubles de la sIg original se pueden transformar en un complejo con el anticuerpo terapéutico para limitar su efectividad y facilitar su depuración del paciente. Por lo tanto, para evitar una respuesta inmune primaria contra el mAb terapéutico, se deberían eliminar o modificar tanto los epítopos de células B como de linfocitos T dentro del anticuerpo que son potencialmente antigénicos en humanos.

Sin la respuesta de los linfocitos T ni de las células B, es probable que se silencie o se frene la respuesta inmunogénica primaria a un anticuerpo terapéutico. La tecnología DeImmunisation® desarrollada por Biovation Ltd. (Aberdeen, UK)[22,23] se centra en la eliminación de epítopos de células B y T potencialmente inmunogénicos. Este método se aplicó en la presente invención para desinmunizar mAb B4. La eliminación de epítopos de células B se logra mediante la ‘incrustación’ de residuos de superficie a aminoácidos sustituyentes [24]. La eliminación de los epítopos de linfocitos T se logra siguiendo la identificación de tales epítopos desde las regiones variables de los anticuerpos terapéuticos por medio de los cuales las secuencias de la región variable se pueden analizar mediante la presencia de motivos de unión MHC clase II mediante un método de "plegamiento de péptidos” tridimensional [25]. Las regiones constantes de anticuerpo del anticuerpo murino se reemplazan con las regiones constantes del anticuerpo humano en el anticuerpo desinmunizado final mediante quimerización [19].

La inmunoterapia pasiva con anticuerpos humanos humanizados o desinmunizados puede desempeñar un papel importante en el tratamiento o la prevención de la infección con VIH. Se sabe que los anticuerpos monoclonales anti-VIH humanos 2F5 y 2G12 neutralizan los aislados primarios de VIH y se han utilizados para los estudios en humanos infectados con VIH. Se observó reducción transitoria de las cargas virales e incrementos transitorios de los linfocitos T CD4+ [26]. Estos anticuerpos también se han estudiado en un modelo de primate no humano para la profilaxis inmune contra la transmisión de madre a hijo. Sin importar si los anticuerpos se administraron a través de la placenta mediante infusión intravenosa a la madre prenatalmente o mediante infusión directa a los macacos rhesus neonatos después del nacimiento, se protegió a los neonatos del desafío con el virus infeccioso de inmunodeficiencia humano/simio (SHIV). Los autores concluyeron que la inmunoprofilaxis con una combinación de anticuerpos monoclonales antivirales es un enfoque prometedor para prevenir la transmisión maternal del VIH en humanos [27]. También se ha propuesto la inmunización pasiva para la utilización en la profilaxis post-exposición contra el VIH en el caso de una exposición accidental al VIH [16, 18].

Dado que determinados anticuerpos monoclonales específicos del CD4 pueden bloquear efectivamente la infección de linfocitos y macrófagos mediante aislados primarios de VIH-1 con una amplitud mayor de la que se obtiene mediante los anticuerpos anti-VIH neutralizantes [5, 18, 28], los anticuerpos monoclonales dirigidos al receptor como el mAb B4 podrían ser aún mejores candidatos para la profilaxis contra la exposición al VIH y para la terapia contra la infección de VIH. Con este propósito, el anticuerpo monoclonal 5A8 (mAb 5A8) se ha reconfigurado previamente en un anticuerpo IgG4 humanizado mediante un método de injerto de CDR [28]. Tal como un isotipo IgG4, el mAb 5A8 humanizado no tiene un sitio de glicosilación en el dominio de CH2 que se asocia con la fijación complementaria. Esta característica debería mejorar el perfil de seguridad de anticuerpos similares haciendo que

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resulte menos probable la disminución de los linfocitos de CD4+ en los pacientes. El 5A8 humanizado se ha sometido a pruebas clínicas en pacientes infectados con VIH [29].

Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales anti-CD4 han mostrado beneficios clínicos en humanos con artritis reumatoide [30]. Un anticuerpo monoclonal humano, HuMax-CD4, se ha sometido a pruebas clínicas para el tratamiento de artritis reumatoide y psoriasis [31]. Estas aplicaciones demuestran la utilidad potencial de los anticuerpos desinmunizados tales como aquellos derivados de los anticuerpos B4 como fármacos inmunoterapéuticos contra el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y las afecciones autoinmunes mediadas por CD4.

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Resumen de la invención

La presente invención está dirigida a los anticuerpos desinmunizados derivados del anticuerpo monoclonal de ratón B4 que son útiles para la inmunoterapia contra el SIDA y otras afecciones mediadas por CD4. La presente invención también está dirigida a la utilización de los anticuerpos desinmunizados, como un medicamento para la prevención y el control de la infección de VIH en un humano. Más particularmente, los anticuerpos expresados por los clones #7, #16 y #21) que contienen los genes recombinantes B4DIVHv1/VK1#7, B4DIVHv1/VK1#16, y B4DIVHv1/VK1#21 se derivan del anticuerpo monoclonal de ratón B4 (Patente Estadounidense Número 5,912,176, emitida en junio 15, 1999) #16 y #21 no se encuentran dentro del alcance de la presente invención. El anticuerpo monoclonal de ratón B4 se caracteriza por su especificidad para el complejo receptor de VIH en los linfocitos T de CD4+ y por su habilidad para neutralizar los aislados primarios in vitro e in vivo de VIH y de los virus de inmunodeficiencia relacionados [17, 18].

Los anticuerpos recombinantes desinmunizados se generaron mediante un proceso que incluyó la expresión a partir de la fusión del ADNc o polinucleótido que codifica el fragmento Fv del mAb B4, el ADNc o polinucleótido para los 5 fragmentos Fc de IgG1 humana. Se desinmunizó después la secuencia de nucleótidos de los genes quiméricos resultantes con la región Fv murina mediante mutagénesis dirigida para eliminar los epítopos de células B “transformadas de foráneas en humanas” y linfocitos T a partir de los dominios variables de la cadena pesada murina y de la cadena κ (Vκ), de modo que sea adecuada para el tratamiento en sujetos humanos. Se proporcionan cuatro ADNc o secuencias polinucleótidas alternativas para la cadena VH desinmunizada y tres para la cadena Vk. El

10 anticuerpo desinmunizado también se diseñó en una IgG N-aglicosilada, formada mediante la utilización de mutagénesis dirigida al sitio después de glicosilación Asn 297, de modo que es incapaz de enlazar un complemento. Así, el anticuerpo desinmunizado aglicosilado no evoca lisis mediada por complemento de células CD4+ enlazadas.

Estos anticuerpos desinmunizados novedosos conservan las actividades de especificidad y neutralización del anticuerpo monoclonal murino original.

15 Se adaptaron estos anticuerpos, expresados por las células mielomas de ratón NSO y clones de células de Ovario de Hámster Chino (CHO), a un medio exento de suero para la producción a gran escala para la utilización en humanos. Los anticuerpos desinmunizados también se pueden producir a gran escala en plantas transgénicas para reducir el coste. Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para la profilaxis de la exposición a VIH, para la inmunoterapia de la infección de VIH, y para la inmunoterapia de las afecciones autoinmunes mediadas por CD4,

20 tales como la artritis reumatoide.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena pesada del

Figura 2. anticuerpo monoclonal murino B4 (NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1 y 2) y mapa de la enzima de restricción. Secuencias de ADN y aminoácidos de la cadena liviana (κ) del 25 anticuerpo monoclonal murino B4 (NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3 y 4) y

mapa de la enzima de restricción.

Figura 3. Vector de expresión de la cadena pesada pSVgptHuIgG1 con HV insertado, para la expresión de la cadena pesada de IgG1 quimérica, VH de ratón de mAb B4 fusionado a CH1 humano, en células NS0. Ig enh es potenciador de cadena pesada.

30 Figura 4. Vector de expresión de la cadena liviana pSVhygHuK con Vκ insertado, para la expresión de la cadena liviana de IgG1 quimérica, Vκ de ratón de mAb B4 fusionado a Cκ humano, en células NS0. Ig enh y Kappa enh son potenciadores de la cadena pesada y la cadena κ.

Figura 5. Las comparaciones de las secuencias de aminoácidos para la región VH de B4 murino, VHB4Mo (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2), y cuatro regiones VH desinmunizadas 35 alternativas, B4DIVHv.1-v4 (NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5-8). Las

posiciones en donde los residuos difieren de los de B4MoVH se muestran en recuadros.

Figura 6. Las comparaciones de secuencias de aminoácidos para la región Vκ de B4 murino, B4MoVK (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4), y tres regiones Vκ desinmunizadas alternativas, B4DIVKv.1-v.3 (NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 9-11). Las

40 posiciones en donde los residuos difieren de los de B4MoVK se muestran en recuadros.

Figura 7. Las comparaciones de las secuencias de nucleótidos para la región VH’ de B4 murino, B4MoVH (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1), y cuatro regiones VH desinmunizadas alternativas, B4DIVHv.1-v4 (NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 12-15). Las posiciones en donde los residuos difieren de los de B4MoVH se muestran en negrita y

45 subrayadas.

Figura 8. Las comparaciones de secuencias de nucleótidos para la región Vκ de B4 murino, B4MoVK (NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3) y tres

Figura 9. regiones Vκ desinmunizadas alternativas, B4DIVKv.1-v.3 (NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 16-18). Las posiciones en donde los residuos difieren de los de B4MoVK se

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muestran en negrita y subrayadas. Las afinidades relativas para la unión de rsCD4 por el anticuerpo quimérico B4 y los anticuerpos desinmunizados DIVH1/VK1-3.

Figura 10. Las afinidades relativas para la unión de rsCD4 por el anticuerpo quimérico B4 y los anticuerpos desinmunizados DIVH2/VK1-3.

Figura 11. Las afinidades relativas para la unión de rsCD4 por el anticuerpo quimérico B4 y los anticuerpos desinmunizados DIVH3/VK1-3.

Figura 12. El vector de expresión del gen dhfr, pSI-DHFR.

Figura 13. Vector de expresión de la cadena pesada desinmunizada, pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1-S, con B4DIVHv.1, unido a CH humano, para la expresión en células de CHOdhfr.

Figura 14. Vector de expresión de la cadena K desinmunizada, pcDNA3.1Zeo-Huk, con B4DIVKv.1, unido a Cκ humano, para la expresión en las células de CHOdhfr.

Figura 15. Vector de expresión de DHFR y de la cadena κ desinmunizada, pSI-DHFR/pcDNA3.1zeoHuK(DD11N), con B4DIVKv. 1 unido a Cκ’, para la co-expresión con dhfr en células de CHOdhfr.

Figura 16. Análisis SDS-PAGE para las variaciones en movilidad mediadas por glicosidasa y las reducciones en intensidad de la tinción de Azul de Coomassie.

La Figura 17. Pruebas de fijación de complementos. Los valores P para las comparaciones entre el B4 mAB murino y B4 #16 y #7 fueron 0,07 y 0,0001, respectivamente, mediante una prueba T de Student.

Figura 18. Las secuencias ADNc y de aminoácidos para las CDRs de mAb B4 murino y los clones #7, #16 y #21.

Descripción detallada de la invención

La desinmunización del fragmento Fv del mAb B4 murino se logró mediante la identificación y eliminación de epítopos de células B y T murinas potencialmente inmunogénicas. La eliminación de los epítopos de linfocitos T se logró siguiendo la identificación de tales epítopos desde las regiones variables de los anticuerpos terapéuticos. Se analizaron las secuencias de aminoácidos de la región variable en búsqueda de la presencia de motivos de unión MHC clase II mediante un método de “plegamiento de péptidos” tridimensional [22, 25]. La eliminación de por lo menos uno de todos los epítopos de células B de la región variable se logró mediante la “modificación” de residuos de superficie donde esto no interferirá con el reconocimiento de anticuerpos [22, 24]. Se eliminaron completamente las regiones constantes del anticuerpo murino (CH y Cκ) mediante el reemplazo de las regiones constantes murinas con regiones constantes de IgG1 humana a través de la quimerización de la secuencia de ADN para la región variable del mAb B4 con aquellas para las regiones constantes de IgG1 humana.

El ejemplo 1 más abajo describe en detalle la recuperación, clonación y secuenciación del ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas del mAb B4 murino. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de la VH de B4 murino se muestran en la Figura 1. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de la Vκ de B4 murino se muestran en la Figura 2. Las ubicaciones de las CDRs en ambas cadenas se determinan mediante la referencia a otras secuencias de anticuerpos [32]. La VH y la Vκ de B4 se pueden asignar respectivamente al Subgrupo V(B) de Cadenas Pesadas de Ratón y al Subgrupo III de Cadenas Kappa de Ratón [32]. Si se desea, se pueden obtener los anticuerpos quiméricos intermedios que contienen regiones constantes completamente humanas y regiones variables completamente murinas como se describe en el Ejemplo 2 en este documento. La confirmación de que se obtuvieron las regiones variables correctas se mostró mediante la unión del anticuerpo quimérico resultante al CD4 soluble recombinante (rsCD4).

Se compararon las secuencias polinucleótidas o de ADNc que codifican la VH y la Vκ de B4 murino con las secuencias del directorio de las secuencias de la VH [33] y la Vκ [34] de cepas microbianas humanas y también con las secuencias de la región J de cepas microbianas humanas [35]. La estructura humana de referencia seleccionada para la VH de B4 fue DP14 con JH6 humana. La estructura humana de referencia seleccionada para la Vκ de B4 fue B1. La secuencia de la región J fue Jκ2 humana.

A continuación de la identificación de las secuencias de estructuras humanas de referencia, se cambiaron determinadas secuencias de nucleótidos para los residuos de aminoácidos no idénticos dentro de las estructuras de la VH y de la Vκ de B4 a una secuencia nucléotida correspondiente en la secuencia de referencia humana. Los residuos que se consideraron críticos para la estructura y la unión del anticuerpo se excluyeron de este proceso y no

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se alteraron. Éstos incluyen la identificación de la complementariedad de la VH y Vκ de B4 que determina las regiones (CDRs) que se enumeran como NÚMEROS DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 20, 22, 24, 26, 28 y 30 en la Figura 18. Se conservaron los residuos de CDR y aquellos en las cercanías inmediatas a la estructura de las CDRs, tales como aquellos, por ejemplo, en el extremo N-terminal [24]. Otros residuos murinos que se conservaron en esta etapa fueron en gran medida residuos enterrados, no superficiales.

Este proceso produjo una secuencia que es en general similar a un anticuerpo “modificado superficialmente” dado que los residuos de superficie son principalmente humanos y los residuos enterrados son los de la secuencia murina original. Después se sometieron estas secuencias a plegamiento de péptidos para identificar epítopos de linfocito T potenciales, a través del análisis de unión a 18 alotipos diferentes de MHC clase II humanas. Se definieron las secuencias de VH y Vκ desinmunizadas primarias (B4DIVHv.1, B4DIVKv.1). Dado que la generación de las secuencias desinmunizadas primarias requiere un pequeño número de sustituciones de secuencias nucleótidas que podrían afectar la unión de la molécula desinmunizada final, se designó otras tres variantes de las VHs y otras dos de las Vκs. Las secuencias comparativas de aminoácidos de las regiones V murinas y desinmunizadas se muestran en la Figura 5 para la VH y en la Figura 6 para la Vκ‘. Las secuencias comparativas de nucleótidos de las regiones V murinas y desinmunizadas se muestran en la Figura 7 para la VH y en la Figura 8 para la Vκ‘.

El método para la construcción del fragmento de secuencias de nucleótidos para las regiones variables desinmunizadas incluyendo la secuencia de flanqueo 5’, el péptido de señal líder, el intrón líder y el promotor murino de inmunoglobulina, y la secuencia de flanqueo 3’, el sitio de empalme y las secuencias de intrón se detallan en el Ejemplo 3.

Una vez que se construyeron los genes desinmunizados de la región V de cadena liviana y pesada, se transfirieron respectivamente a los vectores de expresión que contienen regiones CH o Cκ de IgG1 humana. También se introdujeron dentro de los vectores los marcadores para la selección en células de mamíferos (Figuras 3 y 4). Los vectores recombinantes se transfectaron después en las células NS0. Los anticuerpos desinmunizados expresados se purificaron después desde el medio de cultivo y se probaron para la unión a rsCD4 y para la neutralización de actividad contra el VIH-1.

Las doce variantes de mAb B4 mostraron afinidades de unión a rsCD4 diferentes mediante el ensayo de ELISA. Las doce variantes de los anticuerpos desinmunizados B4 también mostraron diferentes actividades neutralizantes contra los aislados primarios SI a partir de los subgrupos VIH-1 A, B, C, D y E y los aislados de línea celular T HIV1MN mediante el ensayo en microplaca de MT-2 [36]. Las comparaciones de las cuatro variantes de cadena pesada (VHv.1-4), todas combinadas con la versión 1 de cadena κ desinmunizada (VKv.1), mostraron que el anticuerpo que tiene la cadena pesada versión 1 tenía alta actividad neutralizante contra todos los aislados primarios de VIH-1, con actividades que se acercan a las del mAb B4 murino para el HIV-1VL135, el HIV-1UG029 y el HIV-1TH036 (Tabla 1).

Los anticuerpos B4 desinmunizados no fueron efectivos contra el virus HIV-1MN adaptado a la línea celular T como lo fue el anticuerpo murino parental. Los anticuerpos desinmunizados que comprenden las versiones 2 y 3 de la cadena κ fueron comparables o bien tuvieron actividades neutralizantes inferiores (Tabla 2). Las comparaciones de las 12 variantes mostraron que el anticuerpo que tiene la cadena pesada de DIVHv.1 y la DIVKv.1 tenía alta actividad neutralizante contra todos los aislados primarios de VIH-1, con actividades contra el VIH-1 que se acercan a las del mAb B4 murino.

Para la producción de los presentes anticuerpos monoclonales B4 desinmunizados, se puede utilizar cualquier sistema de expresión adecuado, incluyendo las células eucarióticas, por ejemplo, las células animales, tales como las líneas celulares de mamíferos probadas, o células de plantas. Preferentemente, los presentes anticuerpos desinmunizados se expresan en células de mamíferos tales como las células NS0 o las células CHO. La NS0, un mieloma de ratón que no produce inmunoglobulina se puede obtener de la Colección Europea de Cultivos Celulares de Animales, Porton UK (ECACC número 85110505). Las células CHO a las que les falta la enzima dihidrofolato reductasa (CHOdfhr-) pueden obtenerse de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC número CRL-9096).

Para la expresión de alto rendimiento de anticuerpos recombinantes, las células CHO deficientes en la actividad dihidrofolato reductasa (dhfr)-son uno de los sistemas de expresión de mamíferos más ampliamente utilizados para la amplificación de genes. Las células CHO recombinantes son habitualmente utilizadas porque se ha descubierto que la productividad de estas células aumenta con el número de copias de genes y se ha calculado que tiene una productividad de anticuerpo específico tan alta como 100µg/106 células por día [42].

En tales casos, se puede utilizar un promotor convencional útil para la expresión en células de mamíferos. Por ejemplo, se prefiere un sistema de expresión viral que incluya al promotor inmediatamente temprano de citomegalovirus humano (CMV) [37]. De manera alternativa, pueden utilizarse otros promotores adecuados para la expresión de genes de la presente invención en células de mamíferos. Estos promotores incluyen promotores virales tales como retrovirus, virus polioma, adenovirus y virus del simio 40 (SV40) o promotores derivados de células de mamíferos tales como el promotor del factor de elongación humana 1 α [38, 39]. El promotor de inmunoglobulina se

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podría utilizar en células linfáticas tales como las células NS0. Los vectores que contienen el promotor Ig, el péptido de señal líder, el intrón líder, el sitio de empalme, las secuencias de intrón y los sitios de restricción adecuados para la inserción de cualquier casete de región variable se diseñaron y construyeron como se describe en el Ejemplo 2. Estos vectores se expresaron en células NS0 para la adecuada exploración en búsqueda de la expresión de anticuerpos desinmunizados mediante ELISA y bioactividad.

La expresión de proteínas recombinantes de alto nivel en células de mamíferos puede obtenerse mediante la selección de líneas celulares estables seguida por la amplificación de ADN transfectado. Un gen recombinante se puede co-amplificar con un gen marcador de selección durante la amplificación de ADN. Se pueden utilizar las células CHOdhfr-y el gen marcador de selección amplificable para dihidrofolato reductasa (DHFR) para establecer líneas celulares que producen cantidades clínicamente útiles de producto [40]. De manera alternativa, el gen de glutamina sintetasa (GS) también puede utilizarse como un marcador de selección dominante. Debido a la actividad GS endógena insuficiente de las líneas celulares de mieloma e hibridoma, estas líneas celulares tiene un requerimiento absoluto de glutamina. El gen de GS transfectada es capaz de conferir la habilidad de crecer en un medio exento de glutamina apropiado [41]. Preferentemente, las células CHOdfhr se utilizan para expresar el anticuerpo desinmunizado B4, y el gen de dhfr se utiliza como el marcador de selección y amplificación.

Los plásmidos para la expresión del anticuerpo y de las células DHFR en CHOdhfr-se construyeron como se describe en el Ejemplo 5. Los niveles de expresión de los genes de DHFR y anticuerpo se amplifican para una mayor producción de anticuerpos B4 desinmunizados mediante aumentos graduales en las concentraciones de metotrexata (MTX) [42].

Las células CHO recombinantes (rCHO) con productividad de anticuerpo específico de 10-30 pg/célula/día se obtuvieron a través de varias rondas de selección en un medio que contiene aumentos graduales en el nivel de MTX.

Aunque la expresión de los anticuerpos desinmunizados es preferentemente en células de mamíferos, tales como las células NS0 o CHO, para reducir el costo de la producción a gran escala, también se puede emplear la expresión en plantas transgénicas. Ver Ejemplo 10.

Todos los anticuerpos son glicoproteínas. La IgG1 contiene un carbohidrato N-unido a un complejo biantenario dentro de CH2 [43]. La presencia de este carbohidrato es importante para las funciones efectoras tales como la fijación de complemento y la citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC) que da como resultado la eliminación de la célula diana [44]. El anticuerpo B4 se dirige al complejo del receptor CD4 y puede causar la destrucción de las células de CD4+ y la inmunosupresión de la función de las células CD4+ a través de las funciones efectoras de la IgG1 que son responsables de la unión de complementos. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal B4 desinmunizado N-aglicosilado tiene el potencial de disminuir menos las células de CD4+ y ser menos inmunotóxico que un anticuerpo de IgG1 N-glicosilada. Se ha demostrado que la eliminación del sitio de N-glicosilación en la región Fc de la IgG1 mediante mutación suprime la habilidad de la IgG1 para enlazarse a la FcR1 humana, para activar complementos, y para unirse a Cl q [45].

Se había utilizado un enfoque general para eliminar los carbohidratos, a saber eliminar Asn291 mediante mutación a otro aminoácido. Los presentes anticuerpos desinmunizados se modificaron mediante la eliminación del sitio de Asn297 para glicosilación N-unida. El codón AAC para Asn297 del vector de expresión de cadena pesada se mutó al codón CAC por His mediante mutagénesis sitio dirigida por PCR. Los anticuerpos desinmunizados N-aglicosilados se expresaron en células CHO, y estas células secretaron anticuerpos N-glicosilados (Figura 16).

Las propiedades funcionales y la característica de seguridad de los anticuerpos Monoclonales desinmunizados son consideraciones importantes asociadas con su utilización como fármacos terapéuticos humanos, y necesitan ser caracterizados. En este contexto, se han evaluado sus capacidades in vitro para: (1) neutralizar los virus de VIH-1,

(2) fijar complementos, y (3) estimular linfocitos humanos para obtener respuestas inmunes.

Se evaluó la actividad de neutralización de VIH-1 de los monoclonales desinmunizados derivados de los clones CHO comparada con la contraparte mAb B4 murino mediante la utilización del ensayo en microplaca de MT-2 [36]. Los resultados de este estudio que se muestran en la Tabla 3 revelan que el anticuerpo desinmunizado DH1DK1CHO#21 (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención) expresado por el Clon 21 presentó una capacidad de neutralización de virus comparable con el anticuerpo murino producido por el hibridoma B4. Esto resultó evidente a partir de la cantidad requerida de estos anticuerpos monoclonales para lograr una neutralización del 50% de los virus representativos seleccionados a partir de cinco clados (A al E) del VIH-1 probado. El anticuerpo desinmunizado aglicosilado DH1DK1CHO#7 preparado de acuerdo con la presente invención había presentado una capacidad neutralizante significativamente mejorada contra los virus 23135 a partir del clado B, UG046 a partir del clado D y TH036 a partir del clado E comparada con el anticuerpo murino B4. (Tabla 3).

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Se empleó un ensayo de consumo de complemento para evaluar la propiedad de fijación de complementos de los anticuerpos desinmunizados comparados con sus contrapartes nativas, mAb B4 murino (Ejemplo 7). Los resultados obtenidos a partir de este ensayo mostraron que la desinmunización de 84 había conducido a una reducción de la propiedad de fijación de complementos (Figura 17). Esto resultó evidente a partir de gran cantidad de complemento restante en el supernatante recogido de la mezcla de reacción realizada con los anticuerpos desinmunizados en comparación con la reacción realizada con el monoclonal murino. Ese resultado sugiere que los anticuerpos desinmunizados enlazados al complejo CD4 en las células humanas CD4+ fueron menos capaces de iniciar una fijación de complementos que el anticuerpo murino original que fijo complementos más efectivamente cuando se encontraba enlazado al complejo de superficie de célula CD4. De este modo, el supernatante analizado a partir de la mezcla de reacción realizada con el B4 murino había contenido menos complemento capaz de lisar la SRBC sensibilizada. Los resultados obtenidos a partir de este estudio implican que los anticuerpos desinmunizados DH1DK1CH0#7 preparados de acuerdo con la presente invención y DH1DK1CH0#16 (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención) tienen mayor seguridad que el mAb B4 murino en vista de sus capacidades reducidas para la fijación de complementos, y que el anticuerpo desinmunizado N-aglicosilado, como se esperaba, tiene la menor capacidad para la unión de complementos.

La inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales murinos en sus aplicaciones como fármaco terapéutico humano podría conducir a la generación de respuestas de células tanto linfocitos T como células B humanas dirigidas contra los anticuerpos terapéuticos. Las respuestas de linfocitos T obtenidos podrían dar como resultado la producción de citoquinas capaces de modular las respuestas inmunes que los sujetos humanos podrían estar iniciando contra los agentes infecciosos particulares o el cáncer en ese momento. Una alteración causada por la presencia de citoquinas inducidas por anticuerpos murinos podría por lo tanto dar como resultado la inducción de respuestas inmunes desequilibradas o incluso débiles requeridas para combatir los patógenos invasores o el cáncer.

Las respuestas de células B obtenidas generarían anticuerpos humanos anti-ratón en el anfitrión. Esto conduciría a la formación de complejos inmunes antígeno-anticuerpo y el depósito de estos complejos en los sitios de tejidos no deseados para causar inflamación y/o condiciones patológicas en los sujetos humanos. Además, los anticuerpos humanos anti-ratón se unirían al fármaco administrado y reducirían la concentración efectiva, evitando de ese modo que el fármaco terapéutico alcanzara sus dianas deseadas, es decir las células CD4+.

En vista de las consideraciones expuestas con anterioridad, probamos la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales desinmunizados y del mAb B4 en un sistema de cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas (ver Ejemplo 8). Los resultados obtenidos a partir de este estudio se muestran en la Tabla 4. Se encontró que el anticuerpo B4 murino purificado estimuló a las PBMC humanas para que produjeran IL-10 y TNF-α; mientras que no se detectaron los IFN-γ e IL-2 los que generalmente se consideran secretados por las células Th1 CD4 activada por antígeno y otra citoquina, IL-4, producida por la Th2 CD4.

En cambio, se descubrió que los anticuerpos desinmunizados DH1DK1CH0#.16 (que no se encuentran dentro del alcance de la presente invención) y DH1DK1CH0#7 aglicosilado preparados de acuerdo con la presente invención no eran inmunogénicos a juzgar por su incapacidad de inducir a las PBMC humanas a secretar cualquiera de las 5 citoquinas probadas. Estos descubrimientos aumentan el valor de seguridad de estos anticuerpos monoclonales desinmunizados en su utilización como fármacos terapéuticos.

Están bien establecidas las ventajas regulatorias y de coste del medio de cultivo de células de mamíferos exentas de suero. La utilización de sueros animales en procesos de cultivo celular trae consigo el potencial para la introducción de agentes accidentales tales como virus y otros agentes transmisibles (por ejemplo, encefalopatía espongiforme bovina) [47]. Además, la utilización de sueros animales como materia prima impacta en forma negativa sobre los costes de los procesos de cultivo celular a gran escala. Finalmente, dado que, los agentes bioterapéuticos de proteínas producidos por células de mamíferos se secretan en el medio, la utilización de un medio exento de suero simplifica en gran medida el desarrollo y la ejecución sólida de los procesos posteriores de purificación de proteínas.

Las propiedades de cultivo dependientes de suero de las células de rCHO requieren que se lleve a cabo la adaptación de la línea celular para obtener fenotipos apropiados para los procesos de elaboración en base a cultivos en suspensión exentos de suero a gran escala. El proceso descrito en el Ejemplo 6 llevó a la exitosa adaptación de un clon de rCHO para el crecimiento en suspensión y la expresión de anticuerpo en un medio exento de suero, con la producción de anticuerpos desinmunizados a un nivel igual al de las células que crecieron en las células monocapas en un medio que contenía 10% de suero fetal bobino. El anticuerpo producido en el cultivo en suspensión exento de suero tenía una actividad de neutralización de VIH-1 igual a la de los anticuerpos secretados por las células monocapas cultivadas en un medio que contenía 10% de suero.

De modo colectivo, estos resultados apoyan con firmeza la eficacia y la seguridad de los anticuerpos desinmunizados como fármacos terapéuticos capaces de reducir la carga viral en los pacientes infectados con VIH, y evitar el establecimiento de la infección tras la exposición.

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La(s) vía(s) de administración útiles en una aplicación particular son evidentes para una persona con conocimientos en el arte. Las vías de administración de los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, parenteral, y la inyección directa en el sitio afectado. Las vías de administración parenterales incluyen pero no se limitan a la intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea.

La presente invención incluye composiciones de los anticuerpos desinmunizados descritos con anterioridad, adecuadas para la administración parenteral que incluyen, pero no se limitan a, las soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables. Tales soluciones incluyen, pero no se limitan, a la solución salina y la solución salina tamponada de fosfato para la inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o subcutánea, o la inyección directa en una articulación u otra área.

Al proporcionar los anticuerpos desinmunizados de la presente invención a un mamífero receptor, preferentemente un humano, la dosis de anticuerpos administrados variará según factores tales como la edad, peso, altura, sexo, condición médica general, historia clínica previa y similares del mamífero. La determinación de la dosis óptima y la vía óptima y la frecuencia de administración son conocidas por los expertos en el arte. Asimismo, las dosis para otros anticuerpos desinmunizados dentro del alcance de la presente invención pueden determinarse sin excesiva experimentación.

Los anticuerpos desinmunizados divulgados en este documento pueden administrarse a un paciente humano, en forma de una dosis farmacéuticamente aceptable, adecuada para la administración intravenosa, subcutánea o intramuscular. Tales formas de dosis abarcan portadores farmacéuticamente aceptables que son intrínsicamente no tóxicos y no terapéuticos. Los ejemplos de tales portadores incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como la albúmina de suero, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, manitol, ácido sórbico, ácido clorhídrico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos tales como sulfato de protamina, di-sodio hidrógeno fosfato, di-hidrógeno fosfato de potasio, cloruro de sodio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio dibásico dihidratado, hidróxido de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, pirrolidona de polivinilo, sustancias a base de celulosa, y glicol de polietileno. Los anticuerpos desinmunizados normalmente se formularán en tales vehículos en una concentración de aproximadamente entre 0,1mg/ml y 100mg/ml.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar y formular en formas de dosis mediante métodos conocidos en el arte; por ejemplo, ver Remington’s Pharmaceutical Sciences (Ciencia farmacéutica de Remington) [51].

En general, es conveniente proporcionarle al receptor una dosis candidata inicial de anticuerpos desinmunizados que se encuentra en el rango entre aproximadamente 1 y 100mg/kg, preferentemente aproximadamente 1 y 25mg/kg, más preferentemente aproximadamente 1 y 10mg/kg, más preferentemente aproximadamente 2 y 5mg/kg de anticuerpo desinmunizado, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. En general, los anticuerpos se administrarán por vía intravenosa (IV) o intramuscular (IM). Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, según la afección, el tratamiento se repite hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad o se logra la mejoría deseada de la afección del paciente. La dosis se puede administrar a intervalos comprendidos entre una semana y una vez cada seis meses. La determinación de la dosis óptima y la vía óptima y la frecuencia de administración son conocidas por los expertos en el arte. Asimismo, las dosis para otros anticuerpos desinmunizados dentro del alcance de la presente invención se pueden determinar sin demasiada experimentación.

Los anticuerpos desinmunizados de la presente invención también se pueden utilizar en combinación con anticuerpos con especificidad para VIH tales como los anticuerpos para la gp41 y la gp120 del VIH. Estos incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos designados como 2F5, que es específico para la gp41, y 2G12, que es específico para la gp120, que son descritos por Hofmann-Lehmann, et al. [27].

Una variedad de procedimientos se muestran en los ejemplos a continuación para ilustrar la presente invención y su aplicación. Estos ejemplos se presentan a modo de ilustración solamente, y no deben considerarse como limitativos del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Clonación y caracterización de los Genes mAb B4 murinos

1. Preparación de ARN total

El ARN total se extrajo a partir de 5 x 106 células de hibridoma B4 mediante la utilización de Promega (Madison, WI) SV40 Total RNA Isolation System (Cat. Nº Z3100) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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2. Amplificación de la codificación de ADNcs para la región variable de la cadena pesada de (VH) y la región variable de cadena liviana (V imagen1 ) de ratón

La síntesis de ADNc de hebra simple y la amplificación de ADNc que codifica VH y Vκ se realizaron mediante la utilización del Gene-Amp® RNA PCR Kit (Perkin Elmer, Norwalk, CT, parte Nº N808-0017), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Brevemente, los ADNcs de hebra simple que codifican la cadena pesada y la cadena liviana de ratón se sintetizaron a partir de 1µg del ARN total mediante la utilización de Transcriptasa Inversa de MuL V utilizando oligo(dT)16 como iniciador. La mezcla de reacción se incubó a 42°C p or 15 minutos, a 99°C por 5 minutos, y después a 5° C por 5 minutos.

Los ADNcs de hebra simple de VH y Vκ se amplificaron mediante ADN Polimerasa de AmpliTaq® utilizando "The Mouse specific Ig Primer Sets" (Novagen, Madison, WI, cat. Nº 69831-1) como iniciadores de amplificación. La mezcla de reacción se calentó a una temperatura inicial de 95°C durante 1 minuto 45 segundos, después se sometió a ciclos 35 veces a 95°C durante 15 segundos seguid os por 60°C durante 30 segundos. La mezcla de reacc ión se mantuvo después a 72°C durante 10 minutos. Los ADN a mplificados se purificaron por gel y se clonaron en el vector pGm® T Easy (Promega, cat. Nº A1360). Los clones VH y Vκ obtenidos se sometieron a pruebas en búsqueda de insertos del tamaño esperado mediante PCR.

Las secuencias de ADN de los clones VH y Vκ con insertos de ADN de los tamaños esperados se determinaron mediante el método de terminación de cadena dideoxi. La ubicación de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) se determinaron en referencia a otras secuencias de anticuerpos [32]. El VH B4 se puede asignar al subgrupo de cadenas pesadas de ratón V(B), y el Vκ B4 se asignó al subgrupo III de cadenas kappa de ratón [32]. Las secuencias de ADN y de aminoácidos y las CDRs de VH y Vk se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente.

Ejemplo 2

Construcción de genes de anticuerpo B4 quimérico y sus expresiones mediante células NSO

1. Construcción de genes de anticuerpos quiméricos

El anticuerpo B4 quimérico consiste en cadenas de anticuerpos ratón-humano realizadas tomando los genes de región variable para el mAb B4 murino y uniéndolos a genes humanos de región constante de inmunoglobulina, de un modo similar al descrito por Morrison et al. [19]. De este modo, las regiones variables completamente murinas se unieron a regiones constantes humanas. El anticuerpo quimérico proporciona un control no desinmunizado útil con las mismas regiones constantes humanas, para comparaciones cuando se prueban los anticuerpos derivados de B4 que tienen regiones variables desinmunizadas.

Para la construcción de B4 quimérico, se utilizaron los vectores VH-PCR1 y VK-PCR1 [20] como plantillas para introducir la secuencia de flanqueo 5’ incluyendo el péptido de señal líder, el intrón líder y el promotor murino de inmunoglobulina, y la secuencia de flanqueo 3’ incluyendo el sitio de empalme y las secuencias de intrón, alrededor de los genes murinos VH y Vκ. Los casetes murinos de expresión HV y VJ producidos se clonaron en pUC19 y se confirmó la secuencia de ADN completa.

Los casetes murinos de expresión VH y Vκ fueron extirpados a partir de pUC19 como fragmentos HindIII a BamHI. Se los transfirió a los vectores de expresión pSVgpt y pSVhyg [20] (Figuras 3 y 4), que incluyen IgG1 humana [48] o regiones constantes κ [49], respectivamente, y marcadores para la selección en células de mamíferos. Se confirmó que los fragmentos de ADN eran correctos para los VH y Vκ esperados en los vectores de expresión pSV mediante secuenciación.

2. Línea celular huésped para la expresión del anticuerpo quimérico B4

La línea celular huésped para la expresión de anticuerpo fue NSO, un mieloma de ratón que no produce inmunoglobulina, obtenido de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales, Porton UK (ECACC Nº 85110505). Los vectores quiméricos de expresión de cadena pesada y liviana se co-transfectaron en células NS0 mediante electroporación. Las colonias que expresan el gen gpt se seleccionaron en el Medio del Águila Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con 10% de suero fetal bobino, 0,8µg/ml de ácido micofenólico y 250µg/ml de xantina.

3. Detección de expresión de anticuerpo mediante ELISA IgG humana

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La producción de IgG humana se midió mediante ELISA. El método es el siguiente: se recubrieron los micro-pozos de placa de microvaloración de ELISA con anticuerpo κ anti-humano de oveja en un tampón de recubrimiento carbonato/bicarbonato pH 9.6 (Sigma, cat. Nº C3041) a 37°C durante 1 hora. Después se lavó la placa tre s veces con PBST (0,05% Tween® 20 en PBS). Este procedimiento formó el inmunoabsorbente en fase sólida para la captura de la cadena κ desde el medio.

Los medios condicionados a partir de cultivos de clones celulares transfectados se incubaron en los pozos recubiertos a 37°C durante 1 hora y se drenaron, se guido por tres lavados con PBST. El anticuerpo específico de cadena γ de conjugado peroxidasa anti-IgG humana de oveja (The Binding Site, cat. Nº AP004) fue el anticuerpo secundario y el sustrato de o-fenilendiamina (OPD) (Sigma, cat. Nº P7288) fue el informante colorimétrico. Se seleccionaron y se expandieron las líneas celulares que secretan anticuerpos humanos.

4. Producción de anticuerpos quiméricos

Se seleccionaron y se expandieron los transfectados de NS0 que secretan los niveles más altos de anticuerpo quimérico. El anticuerpo se purificó de cultivos estáticos entre 500ml y 1000ml mediante cromatografía de afinidad ProSep A (Millipore Cat. Nº 113112722). El anticuerpo se eluyó con glicina 0,1 M pH 3.0, neutralizada y dializada en PBS. La preparación de anticuerpo purificado se esterilizó mediante filtración y se almacenó a 4°C. Se det erminó la concentración de anticuerpo mediante IgG ELISA con comparaciones a estándares de referencia de IgG1 humana de 0,1; 1; 5; 10ng (The Binding Site, cat. Nº BP078).

5. Afinidad de unión relativa de anticuerpos quiméricos a rsCD4 comparados con la afinidad de unión de los anticuerpos murinos

La afinidad de unión relativa de anticuerpos quiméricos al CD4 soluble recombinante (rsCD4) se determinó mediante ELISA.

Las placas de ELISA se recubrieron directamente con rsCD4 (American Biotechnologies, Columbia MD) a 0,25µg/ml en tampón de carbonato 0,1 M pH 9,5 y se bloquearon con 3% BSA, 0,05% Tween® 20 en PBS. Se aplicaron diferentes diluciones del anticuerpo quimérico y de anticuerpo de ratón como el control positivo. La detección fue realizada con conjugado de peroxidasa anti-IgG humana de cabra y anti-ratón de oveja para los anticuerpos quiméricos y de ratón respectivamente. El color se desarrolló con OPD.

Los anticuerpos tanto quiméricos como de ratón proporcionaron aumentos en A492 en todas las concentraciones de anticuerpos cuando se agregaron al rsCD4 en fase sólida. Esta prueba confirmó que las regiones variables de cadena pesada y liviana clonadas y secuenciadas conservaron el sitio de reconocimiento correcto. El anticuerpo quimérico mostró una reducción de 10 veces en cantidad de A492 comparado con la del anticuerpo de ratón original.

Ejemplo 3

Diseño y construcción de secuencias de región variable desinmunizadas

6. Diseño de secuencias V desinmunizadas

Se compararon las secuencias de aminoácidos de la B4 VH y Vκ de ratón con las secuencias del directorio de secuencias de cepas microbianas humanas de la VH [33] y la Vκ [34] y también con las secuencias de la región J de cepas microbianas humanas [49]. Se eligieron las secuencias de cepas microbianas humanas VH, de la región J y de la Vκ con las homologías más altas a la VH y Vκ de B4 murino para ser las secuencias de estructuras humanas de referencia.

A continuación de la identificación de las secuencias de estructuras de referencia humanas, se cambiaron determinados residuos de aminoácidos no idénticos dentro de las estructuras B4 VH y Vκ que están expuestas en la superficie a los correspondientes aminoácidos en la secuencia de referencia humana [24]. Los residuos que se consideraron críticos para la estructura y la unión del anticuerpo se excluyeron de este proceso y no se alteraron. Por ejemplo, se conservaron los residuos murinos en el extremo N-terminal, que se encuentran cercanos a las CDRs en el anticuerpo final. Este proceso produce una secuencia que es en general similar a un anticuerpo “modificado” dado que los residuos de superficie son principalmente humanos y los residuos enterrados son como en la secuencia murina original.

Estas secuencias se sometieron después al proceso in silico de plegamiento de péptidos para identificar epítopos de linfocitos T potenciales [25], a través del análisis de unión a 18 alotipos diferentes de MHC clase II humanas. Se definieron las secuencias de aminoácidos VH y Vκ desinmunizadas primarias y de ADNc (B4DIVHv.1, Figuras 5 y 7; B4DIVkv.1, Figuras 6 y 8). Dado que la generación de las secuencias desinmunizadas primarias requerían un

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pequeño número de sustituciones de aminoácidos que pueden afectar la unión de la molécula desinmunizada final, se diseñaron otras tres variantes de las VHs (B4DIVHv.2, B4DIVHv3., B4DIVHv4., Figuras 5 y 7) y otras 2 de las Vκs (B4DIVkv.2, B4DIVkv.3, Figuras 6 y 8).

7. Construcción de secuencias de anticuerpos desinmunizados

Las regiones variables desinmunizadas se construyeron conforme a los diseños mencionados con anterioridad mediante el método de mutagénesis sitio dirigida por PCR (Kit mutagénesis sitio dirigida QuikChange™, Stratagene, cat. Nº 200518).

Los genes VH y Vκ murinos clonados se utilizaron como plantillas para la mutagénesis de las regiones de estructura a las secuencias desinmunizadas requeridas. Se sintetizaron los conjuntos de pares de iniciadores mutagénicos que abarcan las regiones a ser alteradas. Las regiones V desinmunizadas producidas se clonaron en pUC19 y se confirmó que la secuencia completa de ADN era correcta para cada VH y Vκ desinmunizado.

Se ablacionaron los genes de región V de cadena pesada y liviana desinmunizados de pUC19 como HindIII a los fragmentos BamHI, y se transfirieron a los vectores de expresión psvSVgpt y pSVhyg (Figuras 3 y 4). Se confirmó que las secuencias de ADN eran correctas para los VH y Vκ desinmunizados en los vectores de expresión.

Ejemplo 4

Caracterización de anticuerpos desinmunizados expresados mediante células NS0.

8. Expresión de anticuerpos desinmunizados

La línea celular huésped para la expresión de anticuerpo fue NS0, un mieloma de ratón que no produce inmunoglobulina, obtenido de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales, Porton RU (ECACC Nº 85110505).

Se co-transfectaron los vectores de expresión de cadena pesada y liviana desinmunizadas en una variedad de combinaciones (12 combinaciones) en células NS0 mediante electroporación. Las colonias que expresan el gen gpt se seleccionaron en el Medio del Águila Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bobino, 0,8mg/ml de ácido micofenólico y 250µg/ml de xantina.

Se midió la producción de IgG humana mediante clones de células transfectadas mediante ELISA para IgG humana. Se seleccionaron y se expandieron las líneas celulares que secretan anticuerpos.

9. Producción de anticuerpos B4 desinmunizados

Se expandieron los transfectados de NS0 que expresan a los anticuerpos B4 desinmunizados. Se seleccionó la línea que más produce para cada anticuerpo desinmunizado. El anticuerpo se purificó de cultivos estáticos entre 500ml y 1000ml mediante cromatografía de afinidad ProSep A (Millipore, cat. Nº 113112722). El anticuerpo se eluyó con glicina 0,1 M pH 3.0, neutralizada y dializada en PBS. La preparación de anticuerpo purificado se esterilizó mediante filtración y se almacenó a 4°C. Se determinó la conc entración de anticuerpo mediante ELISA.

10. La afinidad de unión a rsCD4 de los anticuerpos desinmunizados B4

Los resultados de la prueba de unión para cuatro cadenas pesadas de B4 desinmunizado combinadas con tres cadenas livianas desinmunizadas se muestran en las Figuras de la 9 a la 11.

Los anticuerpos compuestos de cadena pesada desinmunizada de versión 1 combinada con cadena liviana desinmunizada de versiones 1, 2, ó 3 mostraron unión a rsCD4 equivalente comparado con los anticuerpos quiméricos. La unión mediante anticuerpos compuestos de cadenas pesadas desinmunizadas de versiones 2, 3, ó 4, combinadas con cadenas livianas desinmunizadas de versiones 1 ó 2, sufrió una reducción de menos de tres veces en comparación con el anticuerpo quimérico. Los anticuerpos compuestos de cadena pesada desinmunizada de versiones 2, 3, ó 4 combinada con cadena liviana desinmunizada de versión 3 mostraron reducciones de cinco veces en la unión a rsCD4.

11. Prueba de neutralización de virus

Reservas de virus. Se obtuvo un aislado de paciente subtipo A UG/92/029 de la Red de la OMS para el Aislamiento y Caracterización del VIH. El aislado de paciente subtipo C ZIM748 fue una donación del D. Katzenstein, Stanford University. El aislado de paciente subtipo D UG266, aislado de paciente subtipo E SI TH32036, fueron suministradas

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por el U.S. Military HIV Research Program (Silver Spring, MD). El aislado de paciente subtipo E TH 32036 también se recibió como un presente de J. Bradac, NIAID (NIH, Bethesda, MD). Los aislados del paciente fueron sometidos a pases en PBMC. El aislado MN de VIH-1 adaptado a línea celular T se cultivó en células H9, excepto por una muestra de MN sometida a pases en PBMC.

Prueba de actividad de neutralización de virus de IgG desinmunizada de B4 producida en células NS0. La prueba de microplaca de MT-2 se llevó a cabo como se describió [36] excepto en que los sueros inactivados por calor fueron diluidos en serie en 50% de DMEM-alta glucosa con 15% de FBS, antibióticos, 2% de glutamina y tampón de bicarbonato, y 50% de plasma humano normal defibrinado y mezclado. Las pruebas de neutralización en PBMC estimulado con mitógeno se hicieron con VIH esencialmente como se ha descrito [50].

La actividad neutralizante de B4 IgG1 desinmunizada producida por células NS0 se definió como la concentración de anticuerpo que proporcionó una reducción del 50% en placas comparada con los controles que no contienen anticuerpos. Las concentraciones de anticuerpo para el criterio de valoración de 50% se derivaron mediante interpolación entre las diluciones de anticuerpo. Las comparaciones de las cuatro variantes de cadena pesada (VHv.1-4), todas combinadas con la versión 1 de cadena k desinmunizada (VKv.1), mostraron que el anticuerpo que tiene la cadena pesada versión 1 tenía alta actividad neutralizante contra todas los aislados primarias de VIH-1, con actividades que se acercan a las del mAb B4 murino para el HIV-lVL135, el HIV-1UG029 y el HIV-lTH036 (Tabla 1).

Los anticuerpos B4 desinmunizados no fueron efectivos contra el virus VIH-1MN adaptado a línea celular T. Los anticuerpos desinmunizados que comprenden las versiones 2 ó 3 de la cadena κ fueron comparables o bien tuvieron actividades neutralizantes inferiores (Tabla 2). Las comparaciones de las 12 variantes mostraron que el anticuerpo que tiene la cadena pesada DIVHv.1 y la DIVKv.1 tenía alta actividad neutralizante contra todos los aislados primarios de VIH-1, con actividades que se acercan a las del mAb B4 murino.

Ejemplo 5

Establecimiento del clon CHO de anticuerpo B4 desinmunizado estable y de alta expresión

Se eligieron la B4DIVHv.1 y la B4DIVKv.1 respectivamente como las cadenas pesada y liviana a ser expresadas en las células CHO.

12. Línea celular

La línea celular huésped para la expresión de anticuerpo de nivel de producción fue las células de ovario de hámster Chino a las que les falta la enzima dihidrofolato reductasa (CHOdfhr-), obtenida del Culture Collection and Research Center (CCRC, 60133) del Food Industry Research and Development Institute, Taiwán.

Las células se mantuvieron en Medio de Dulbecco Modificado por Isocove (IMDM, Sigma cat. Nº I-3390) suplementado con 10% de suero fetal bobino dializado (DFCS, Gibco cat Nº 26400-044)) más hipoxantina y timidina (Gibco, cat Nº 11067-030). El marcador DHFR se utilizó para la amplificación y la selección. La expresión mediante el gen dhfr se pudo amplificar mediante el desafío con el inhibidor de la dihidrofolato reductasa, metotrexato (MTX).

Cuando se amplifican los genes dfhr, otros genes vecinos habitualmente se co-amplifican, de modo que después de cada ronda de amplificación las células se subclonaron para seleccionar clones con tasas de producción aumentadas.

13. Construcción de plásmidos

Gen DHFR que expresa plásmidos. El ADNc para el gen dhfr se sintetizó mediante el GeneAmp® RNA PCR Kit (Perkin Elmer parte no. N808-0017) a partir de ARN total de células NS0. El ADNc para el gen dhfr se insertó en el vector de expresión de mamífero, pSI (Promega, cat. Nº E172A), en el sitio EcoR1, aguas abajo del potenciador SV40 y del promotor temprano y aguas arriba del terminador SV40, para la expresión constitutiva de alto nivel (Figura 12).

Cadena pesada B4DIVHv.1 que expresa plásmidos. El fragmento de ADN que codifica la cadena pesada de B4 quimérico se obtuvo mediante amplificación por PCR a partir de IgG quimérica de pSVgpt B4 (Figura 3) como plantilla. El gen IgG quimérico se insertó en los sitios HindIII y EcoR1 del vector de expresión de mamífero pcDNA3.1Neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat. Nº V790-20). El sitio de inserción se encuentra aguas abajo del potenciador CMV y del promotor temprano para la expresión de alto nivel, y en frente de las secuencias de señal de poliadenilación y de terminación de transcripción a partir de hormona de crecimiento bovina (BGH) para una estabilidad mRNA potenciada. Después, la región variable se reemplazó con la región variable de B4DIVHv.1 a través de la utilización del HindIII y el BamHI para obtener la cadena pesada B4DIVHv.1 que expresa plásmidos (pCDNA3.1(+)NeoDeIgG1-S, Figura 13).

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Cadena pesada B4DIVHv.1 aglicosilada que expresa plásmidos. Se ha demostrado que la eliminación del sitio de N-glicosilación en la región Fc de la IgG1 mediante mutación suprime la habilidad de la IgG1 para enlazarse a la FcyR1 humana, para activar complementos, y para enlazarse a C1q [43]. Por lo tanto, un mAb B4 desinmunizado aglicosilado tiene el potencial de disminuir menos las células CD4+ y ser menos inmunotóxico que un anticuerpo glicosilado.

Para eliminar el sitio para carbohidrato N-unido, el codón AAC para Asn297 de la cadena pesada DIVHv.1 se mutó a CAC por el His mediante mutagénesis sitio dirigida por PCR (Invitrogen).

Cadena liviana B4DIVkv.1 que expresa plásmidos. Se ensambló la cadena liviana completa B4DIVK.1 a partir de las regiones constantes de cadena κ humana y variable DIVKv.1 mediante amplificaciones de PCR. La región DIVKv.1 se copió a partir de pUC19-B4DIVKv.1 como plantilla. La región constante κ humana se copió a partir de la cadena κ quimérica de B4 (Vκ) de pSVhygHuCK como plantilla. El fragmento completo de ADN de cadena liviana B4DIVK.1 se insertó en pCDNA3.1zeo (Invitrogen, cat. Nº V860-20) en los sitios HindIII y EcoR1. El sitio de inserción se encuentra aguas abajo del potenciador CMV y del promotor temprano para la expresión de alto nivel, y aguas arriba de las secuencias de señal de poliadenilación y de terminación de transcripción a partir de BGH para una estabilidad mRNA potenciada (Figura 14).

DHFR y cadena liviana B4DIVkv.1 que co-expresan plásmidos. Se construyó un plásmido que contiene unidades de expresión de cadena liviana tanto de DHFR como de B4DIVkv.1 mediante la inserción de unidades de expresión del gen dhfr en frente de unidades de expresión de cadena κ. La unidad de expresión del gen dhfr se obtuvo a partir del producto de PCR mediante la utilización de pSI-DHFR como plantilla y se clonó en el plásmido pcDNA3.1zeoB4DIVkv.1 en el sitio BgIII (Figura 15).

14. Expresión del anticuerpo B4 DIVHv.1-DIVKv.1 en células CHOdhfr-

La pcDNA3.1zeoB4DIVHv.1 y la pcDNA3.1zeoB4DIVkv.1/DHFR se co-transfectaron en células CHOdhfr-mediante electroporación. Las colonias se seleccionaron mediante el cultivo en medio IMDM conteniendo 10% de DFCS, geneticina (Gibco, cat. Nº 10131-027) y 0,005µM MTX (Sigma, St. Louis, MO, cat Nº M8047) pero sin suplemento HT. Las células que expresan DHFR y la cadena pesada se cultivaron en este medio de selección. La producción de IgG humana se midió mediante ELISA. Se seleccionaron y se expandieron las líneas celulares que secretan anticuerpos.

15. Establecimiento de clones productores de B4 desinmunizado de alto nivel mediante amplificación de gen DFHR mediado por MTX

La expresión de DFHR e IgG se amplificó para una mayor producción de mAb B4 desinmunizado mediante aumentos graduales en las concentraciones de MTX [42]. Los clones se expusieron a concentraciones de MTX en incremento progresivo desde 0,005 a 5µM. La duración de cada tratamiento de concentración fue de 3 a 4 semanas. Entre cada ciclo de amplificación, se subclonaron las células y se seleccionaron para mayores niveles de productividad de IgG.

16. Establecimiento de líneas celulares productoras de B4 desinmunizado estables de alto nivel mediante clonación de células únicas

Se establecieron líneas clonales a partir de los subclones amplificados de mejor producción mediante la utilización de dilución limitante. Se resuspendieron los subclones en medio selectivo en concentraciones de 0,1, 0,5 y 0,25 células/200µl y se colocaron en placas de 96 pozos. Las células se cultivaron en medio selectivo de 3 a 4 semanas antes del análisis. Seguido a la incubación, se eliminó 10µl del medio de cultivo de cada cultivo para la determinación de la expresión de IgG humana mediante ELISA. Los clones de alta producción se seleccionaron y se expandieron y se hicieron las reservas de líneas celulares criogénicas. La productividad de IgG de los mejores productores a partir de estos pasos de amplificación fue aproximadamente 10 a 20 pg/célula/día. La productividad se había amplificado aproximadamente de 100 a 200 veces, desde los niveles de expresión inicial de aproximadamente 0,1 pg/célula/día.

17. Producción de anticuerpos N-glicosilados y N-aglicosilados en células CHO

Se expandieron los transfectantes de CHO con la cadena pesada de tipo salvaje y con la Asn297 de cadena H mutada a His. El anticuerpo se purificó de cultivos estáticos entre 500ml y 1000ml mediante cromatografía de afinidad ProSep A (Millipore cat. Nº 113112722). El anticuerpo se eluyó con glicina 0,1 M pH 3.0, neutralizada y dializada en PBS. La preparación de anticuerpo purificado se esterilizó mediante filtración y se almacenó a 4°C. Se determinó la concentración de anticuerpo mediante ELISA.

18. Identificación de N-aglicosilación mediante SDS-PAGE

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Los anticuerpos purificados a partir del clon con cadena pesada Asn297 y a partir de los transfectantes con Asn297 mutada a His con/sin tratamiento N-glicodiasa F se analizaron mediante 10% de SDS-PAGE y se tiñeron con tinción Azul de Coomassie y de glicoproteína (GelCode Glycoprotein Stain, cat. Nº 24562, Pierce, Rockford Illinois).

Los anticuerpos purificados a partir del clon mutado en la Asn297 a His297 mostraron una movilidad en gel más rápida y tinción de glicoproteína menos intensa que el anticuerpo desinmunizado glicosilado. El tratamiento N-glicosidasa F no cambió la movilidad en gel ni la intensidad de la tinción de glicoproteína del anticuerpo mutante pero aumentó la movilidad en gel y disminuyó la intensidad de la tinción de glicoproteína de los anticuerpos N-glicosilados salvajes. Después del tratamiento N-glicosidasa F, los anticuerpos mutados y de tipo salvaje tenían las mismas movilidades en gel (Figura 16A) y las mismas intensidades de la tinción de glicoproteína (Figura 16B), lo que confirma el estado ya aglicosilado del anticuerpo mutado.

19. Ensayo de actividad de neutralización de virus de IgG desinmunizada de B4 producida mediante células CHO.

El ensayo de microplaca de MT-2 se realizó como se ha descrito con anterioridad. La actividad neutralizante de B4 IgG1 desinmunizada producida por células CHO se definió como la concentración de anticuerpo que proporcionó la reducción del 50% para el criterio de valoración en placas comparada con los controles que no contienen anticuerpos (Tabla 3). Las concentraciones de anticuerpo para los criterios de valoración de 50% se derivaron mediante interpolación entre las diluciones de anticuerpo.

Ejemplo 6

Adaptación de clones de CHO desinmunizado de B4 a cultivos en suspensión exentos de suero

20. Adaptación de cultivo en suspensión

Un matraz 75T que tiene cultivo de CHO de B4 desinmunizado confluente se tripsinizó y se resuspendió en un matraz de agitación (Bellco, Vineland, NJ) con 50ml de Medio de Dulbecco Modificado por Isocove (IMDM, Sigma cat. Nº I-3390) suplementado con 10% de suero fetal bobino dializado (DFCS, Gibco cat. Nº 26400-044). Los cultivos en suspensión de matraz de agitación se agitaron magnéticamente y se mantuvieron en un incubador de CO2 bajo las mismas condiciones de temperatura y humedad que los cultivos en monocapa.

Cada 2 a 3 días, se determinó la densidad celular viable del cultivo y se ajustó a 1-3 x 105 célula/ml medio mediante dilución con medio nuevo. Se monitoreó atentamente la tasa de crecimiento y la viabilidad celular del cultivo durante las primeras semanas de cultivo.

21. Adaptación a medio exento de suero

Una vez que el nivel de crecimiento del cultivo en suspensión se estabilizó, el cultivo se centrifugó y las células se resuspendieron en un medio exento de suero (SFMII, Gibco BRL, Rockville, MD, cat. Nº 31033-020). Cada 2 a 3 días, se determinó la densidad celular viable del cultivo y se ajustó a 1-3 x 105 célula/ml de medio a través de dilución con medio nuevo. Se monitoreó atentamente la tasa de crecimiento y la viabilidad celular del cultivo durante las primeras semanas de cultivo.

22. Producción de anticuerpos B4 desinmunizados en cultivo en suspensión exento de suero

Los clones de B4 desinmunizados, adaptados a cultivo en suspensión en un medio exento de suero, se cultivaron inicialmente a una densidad celular de 2 x 105 en un matraz de agitación de 100ml (Bellco) en un medio Gibco SFMII. Los cultivos se incrementaron en serie mediante la transferencia a matraces de agitación de 250ml y 500ml, cuando las densidades celulares alcanzaron 6 x 105 células/ml. El anticuerpo se purificó de cultivos en suspensión exentos de suero de 500ml mediante cromatografía de afinidad ProSep A (Millipore cat. Nº 113112722). El anticuerpo se eluyó con glicina 0,1 M pH 3.0, neutralizada y dializada en PBS. La preparación de anticuerpo purificado se esterilizó mediante filtración y se almacenó a 4°C. Se determinó la concentración de anti cuerpo mediante ELISA.

Ejemplo 7

Análisis de la fijación de complementos de los anticuerpos B4 desinmunizados expresados por clones rCHO

Se utilizó un ensayo de consumo de complementos para evaluar la propiedad de fijación de complementos del B4 murino comparado con sus contrapartes desinmunizadas. El ensayo supuso la unión de cada uno de los anticuerpos monoclonales B4 al sitio del complejo CD4 sobre la superficie de células CD4+ humanas recién preparadas. A

15

25

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45

continuación se le permitió al anticuerpo fijar parcialmente una cantidad dada de complemento de conejo. El complemento restante en la reacción se probó contra los glóbulos rojos de oveja sensibilizados.

Las células CD4+ humanas utilizadas en el ensayo se fraccionaron a partir de sangre periférica heparinizada recogida mediante punción venosa de un donante de sangre sano. La sangre entera se diluyó 1:1 (v/v) con RPMI1640 exento de suero (Gibco, cat Nº 21870-076). 10,0ml de sangre diluida se estratificó después sobre 9,0ml de Ficoll Hague™ Plus (Amersham Biosciences, cat Nº 17-1440-02) en un tubo de centrífuga de 50,0ml (Nunc cat Nº 373660).

Se logró el fraccionamiento de linfocitos mediante la centrifugación de la sangre a 2000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se recogió la capa leucocitaria que contiene las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la interfaz de Ficoll Hague™ y el suero diluido, se lavó tres veces con tampón Veronal (pH 7,6) que estaba compuesto por: barbital sódico 9,1Mm (Merck, cat Nº 1063180100); barbital 15,6mM (Merck, cat Nº 1.00276.0100); cloruro de sodio 0,73M; cloruro de magnesio 2,5mM; cloruro de calcio 2,5mM. Las PBMC se resuspendieron después en 17,0 x 107 por ml en el mismo tampón Veronal.

El ensayo de fijación de complementos se llevó a cabo agregando primero 30,0µg del anticuerpo monoclonal purificado individual a 200,0µl de preparación de PBMC (3,6 x 106 células en un vial Eppendorf), y la mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente para permitir la unión. Se agregaron después noventa (90,0) µl de complemento de conejo (Rockland, cat Nº C304-0010) pre-diluido a 1:15 en tampón Veronal a la mezcla de reacción, y se permitió que se produzca el consumo de complemento mediante la incubación de la mezcla de reacción final durante 10 minutos a 37°C. Trescient os cincuenta (350) µl de glóbulos rojos de oveja sensibilizada (SRBC) (preparados mediante el tratamiento de 3,0ml de 100,0% de SRBC de Rockland, cat Nº R406 que se habían lavado dos veces con tampón Veronal con 100,0 µl de antisuero de anti-SRBC de Rockland, cat Nº 113-4139 durante 30 minutos a 37°C.)

La suspensión final de SRBC (compuesta de 10,0ml de tampón Veronal) se agregó inmediatamente después, y la mezcla de reacción entera se incubó adicionalmente por 1 hora a 37°C para probar el complemento residu al presente en la mezcla de reacción. Los viales de reacción se centrifugaron por 1 minuto a 5000 rpm en una microcentrifugadora al final del período de incubación para centrifugar cualquier SRBC entero restante.

Se detectó lisis de los SRBC mediante la alicuotación de 150,0µl de supernatante a partir de cada vial de reacción en un pozo individual de una placa de ELISA de 96 pozos (Becton Dickinson, cat Nº 353915), y la lectura de la absorbancia a 540nm en un espectrofotómetro. Los resultados se expresaron como porcentaje de lisis de control (sin anticuerpos monoclonales) (Figura 17).

Ejemplo 8

Análisis de inmunogenicidad de anticuerpos desinmunizados

Se empleó un sistema de cultivo iniciador in vitro para investigar la capacidad de los anticuerpos monoclonales individuales (por ejemplo, mAbs B4, DIVHv1/VK1 #7 preparados de acuerdo con la presente invención, o DIVHv1/VK1 #16 (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención)) para estimular a las PBMC humanas. Las PBMC utilizadas en este estudio se fraccionaron utilizando el método descrito en el Ejemplo 7 que aparece con anterioridad.

Se prepararon los cultivos de PBMC in vitro mediante la colocación en placas de 2,5 x 106 células por pozo en 1,5ml de medio completo, RPMI-1640 suplementado con Penicilina y Estreptomicina (Gibco, cat Nº 10378-016) y suero fetal bovino (Gibco, cat Nº 10099141), en placas de cultivo de tejido de 24 pozos (Corning, cat Nº 3254). Los anticuerpos monoclonales se agregaron individualmente a cada cultivo de PBMC a 10,0µg por ml. Se configuraron los cultivos separados mediante el agregado de Concanavalina A (Sigma, cat Nº C 5275) a 2,0µg por ml., o bien mitógeno Pokeweed (Sigma, cat. Nº L-8777) a 10,0µg como controles positivos, o sin mitógeno y anticuerpos monoclonal como control negativo. Los cultivos duplicados se configuraron para cada condición de estimulación probada. Se recogieron los supernatantes de cultivos en los días 3, 5, 7 y 9 después de la iniciación de cultivo, y se almacenó a -70°C hasta que se probaron.

Se probaron las citoquinas en los supernatantes de cultivo de PBMC humanos estimulados con antígeno/mitógeno en búsqueda de la presencia de Interleuquina-2 (IL-2), Interleuquina-4 (IL-4), Interleuquina-10 (IL-10), Interferóngamma (IFN-γ) y el Factor de Necrosis Tumoral Alfa (THF-α) utilizando kits citoquina adquirido de eBioscience (USA). Los kits utilizados fueron: IL-2 (cat Nº 88-7026-22); IL-4 (cat Nº 88-7046-22); IL-10 (cat Nº 88-7106-22); IFN-γ (cat Nº 88-7316-22), y TNF-α (cat Nº 88-7346-22).

Los ensayos se llevaron a cabo siguiendo los protocolos dados por el fabricante. Los resultados se obtuvieron como se muestra en la Tabla 4.

5

15

25

35

45

Ejemplo 9

Evaluación clínica de los anticuerpos desinmunizados

La seguridad, la inmunogenicidad, la farmacocinética y la eficiencia del anticuerpo monoclonal desinmunizado administrado de forma intravenosa, por ejemplo, DH1DK1NS0#16 (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención) o DH1DK1NS0#7 preparado de acuerdo con la presente invención se estudió en humanos después de la administración de una dosis única, en una prueba de incremento gradual de dosis. El estudio utiliza dos grupos de pacientes infectados con VIH (dos pacientes por grupo) que no respondieron a dos cursos de terapia HAART. No hay grupo placebo. Se dio a los grupos uno y dos el anticuerpo DH1DK1NS0#16 (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención) o DH1DK1NS0#7 preparado de acuerdo con la presente invención en dosis de 1mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente. Las dosis se dan en forma intravenosa mediante administración tipo bolus en el día 0.

Las muestras de sangre y suero se toman en el día 0 antes de la infusión, aproximadamente 10 minutos después de la infusión, y a 1 y 12 horas después de la infusión. Después, se recoge la sangre y los sueros a 24 horas, 48 horas y en los días 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, y 56.

Se evaluó la seguridad mediante examen físico, análisis bioquímico, recuento celular completo, y registro de eventos adversos. Se utilizó análisis inmunofluorocitométrico en búsqueda de marcadores de linfocitos mediante FACS para evaluar la sangre a intervalos semanales en búsqueda de evidencia de inmunosupresión.

Los métodos validados están disponibles para monitorear en búsqueda de los siguientes marcadores: CD3/CD4, CD3/CD8, CD14/CD45, CD20/CD45, y IgG1-FITC anti-humana. El DIH1DK1NS0#7 preparado de acuerdo con la presente invención o los niveles de plasma del DIH1DK1NS0#16 (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención) se siguen para cada hemorragia mediante ELISA, utilizando rsCD4 como el inmunoabsorbente en fase sólida, para la determinación de farmacocinética. Se monitorea la inmunogenicidad mediante la determinación de los niveles de suero de anti-DIH1DK1NS0#7 preparado de acuerdo con la presente invención o DIH1DK1NS0#16 (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención) mediante ELISA, utilizando el anticuerpo como inmunoabsorbente en fase sólida.

Para la eficacia, se determina los niveles de ARN de VIH en plasma semanalmente mediante prueba cuantitativa de RT-PCR.

Ejemplo 10

Producción de anticuerpos desinmunizados B4 en plantas transgénicas

Las plantas transgénicas se pueden utilizar como un medio económicamente ventajoso para producir anticuerpos desinmunizados. Una planta dicotiledónea, tabaco (Nicotiana tabacum), transformada con vectores Agrobacterium tumefaciens que presentan ADNcs para las cadenas pesadas y livianas del clon número 7 aglicosilado desinmunizado, es una planta bioreactora útil para la producción de anticuerpos desinmunizados B4.

El ADNc que codifica la cadena pesada completa del anticuerpo B4 desinmunizado DIH1DK1NS0#7, incluyendo la CH de IgG1 aglicosilada, la B4DIVHv.1 VH y la secuencia líder, se ablacionan a partir del vector pcDNA3.1(+)NeoDeIg1 (B4DIVHv.1)-S (Figura 13) utilizando las enzimas de restricción Hind III y Eco RI. El ADNc que codifica la cadena completa k de B4 desinmunizado, incluyendo la κ CH, la B4DIVKv.1 Vκ y la secuencia líder, se ablacionan a partir del vector pcDNA3.1(+) Zeo-HuK(B4DIVKv.1)-S (Figura 14) con Hind III y Eco RI. La cadena Ig que codifica los fragmentos de ADNc se ligan en pMON 530, un vector de expresión constitutiva de plantas que incluye al promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.

Los vectores recombinantes se transforman en E. coli DH5-α y se analizan los tranformantes en búsqueda de la presencia de Ig ADNc utilizando productos de PCR radiomarcados a partir de ADNcs clonados. Los plásmidos a partir de tranformantes positivos se introducen en Agrobacterium tumefaciens. Los discos de hojas a partir de N. tabacum se infectan con cultivos de la A. tumefaciens recombinante. Los brotes y las plántulas con raíces se generan a partir de células de plantas transgénicas candidatas.

Los extractos de hojas se preparan y se detecta la producción de la planta de cadenas pesadas o bien cadenas kappa mediante ELISA para las cadenas pesadas y livianas humanas. Aquellas que expresan cadenas pesadas se cruzan con las que expresan cadenas kappa, mediante polinización cruzada. Estos procedimientos se han descrito [52].

Los extractos de hojas se preparan a partir de híbridos y las plantas transgénicas que expresan el anticuerpo completo desinmunizado DIH1DK1NS0#7 se analizan mediante ELISA en búsqueda de IgG humana. Los anticuerpos expresados por plantas a partir de plantas reactivas se seleccionan para la función de unión y actividades de neutralización mediante la comparación con las actividades del anticuerpo del clon #7, utilizando el rsCD4 de ELISA y la prueba de neutralización de virus descrita en el Ejemplo 4.

De manera alternativa, una planta monocotiledónea, maíz (Zea mays), se utiliza para mejoras en el nivel de

5 expresión de productos de planta transgénica y la estabilidad, por encima de la de una planta dicotiledónea. Es particularmente ventajosa la utilización de promotores de almacenamiento de semillas para la expresión específica de tejidos en endospermos de maíz [53].

Los promotores a partir de genes de proteínas zein son particularmente útiles para este efecto. Las proteínas zein son proteínas de almacenamiento cuya síntesis se produce en endospermos de maíz en desarrollo. Los promotores

10 zein se optimizan hasta que el grano alcanza la madurez [54]. En consecuencia, los ADNcs que codifican las cadenas pesadas y κ del anticuerpo desinmunizado DIH1DK1NS0#7 se ablacionan respectivamente a partir de pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1(B4DIVHv.1)-S (Figura 13) y pcDNA3.1(+)Zeo-HuK(B4DIVKv.1)-S (Figura 14).

Los ADNcs se ligan en un vector de expresión de planta que tiene un promotor de gen zein y un gen marcador para la selección, por ejemplo, luciferasa. Los vectores recombinantes se transforman en E. coli y los transformantes se

15 analizan en búsqueda de la presencia del ADNc de Ig, como se describió con anterioridad. Las plántulas de maíz jóvenes se transforman con los plásmidos a partir de los transformantes de E. coli positivos mediante bombardeo de partículas. La preparación de partículas, el recubrimiento de ADN, el bombardeo con un dispositivo PDS1000/He (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA), y la selección de transformantes mediante mediciones fluorométricas de extractos de proteínas es como se describió [55].

20 Las plantas de maíz transgénicas separadas se generan a partir de embriones positivos y se cultivan hasta la madurez. Estos se someten después a polinización cruzada para producir plantas que producen anticuerpos B4 desinmunizados completos. La selección y la caracterización de los anticuerpos son como se describió con anterioridad.

Tabla 1 (para referencia solamente) Tabla 1 (cont.) Tabla 1 (cont.)

ACTIVIDADES DE NEUTRALIZACIÓN DE ANTICUERPOS B4 DESINMUNIZADOS, DIVHV.1-4/VKV.1 PRODUCIDOS POR CÉLULAS NS0

Aislado de VIH-1

Clado Anticuerpo B4 Concentración de anticuerpo (µg/ml) a 50% de inhibición

VL135 (PBL)

B DIVHv.1/VKv.1 0,21

DIVHv.2/VKv.1

0,53

DIVHv.3/VKv.1

0,26

DIVHv.4/VKv.1

0,26

mAb B4 murino

0,16

ACTIVIDADES DE NEUTRALIZACIÓN DE ANTICUERPOS B4 DESINMUNIZADOS, DIVHV.1-4/VKV.1 PRODUCIDOS POR CÉLULAS NS0

Aislado de VIH-1

Clado Anticuerpo B4 Concentración de anticuerpo (µg/ml) a 50% de inhibición

ZIM748 (PBL)

C DIVHv.1/VKv.1 0,45

DIVHv.2/VKv.1

0,63

DIVHv. 3/VKv.1

0,42

DIVHv.4/VKv.1

0,28

mAb B4 murino

0,21

UG029 (PBL)

A DIVHv.1/VKv.1 0,47

DIVHv.2/VKv.1

0,79

DIVHv.3/VKv.1

0,63

DIVHv.4/VKv.1

0,35

mAb B4 murino

0,44

UG046 (PBL)

D DIVHv.1/VKv.1 2,10

DIVHv.2/VKv.1

0,98

DIVHv.3/VKv.1

0,99

DIVHv.4/VKv.1

1,10

mAb B4 murino

0,40

UG266 (PBL)

D DIVHv.1/VKv.1 0,82

DIVHv.2/VKv.1

1,20

DIVHv.3/VKv.1

2,20

DIVHv.4/VKv.1

7,00

mAb B4 murino

0,40

ACTIVIDADES DE NEUTRALIZACIÓN DE ANTICUERPOS B4 DESINMUNIZADOS, DIVHV.1-4/VKV.1 PRODUCIDOS POR CÉLULAS NS0

Aislado de VIH-1

Clado Anticuerpo B4 Concentración de anticuerpo (µg/ml) a 50% de inhibición

TH036 (PBL)

E DIVHv.1/VKv.1 0,31

DIVHv.2/VKv.1

0,50

DIVHv.3/VKv.1

0,58

DIVHv.4/VKv.1

0,35

mAb B4 murino

0,25

MN (células H9)

B DIVHv.1/VKv.1 >100

DIVHv.2/VKv.1

>100

DIVHv.3/VKv.1

>100

DIVHv.4/VKv.1

>100

mAb B4 murino

14

Tabla 2 (para referencia solamente) Tabla 2 (cont.) Tabla 3 Tabla 4

ACTIVIDADES DE NEUTRALIZACIÓN DE ANTICUERPOS B4 DESINMUNIZADOS DIVHV.1-4/VKV.2-3 PRODUCIDOS POR CÉLULAS NSO

Aislado de VIH-1

Clado Anticuerpo B4 Concentración de anticuerpo (ng/ml) a 50% de inhibición

VL135 (PBL)

B DIVHv.1/VKv.2 0,24

DIVHv.2/VKv.2

0,23

DIVHv.3/VKv.2

0,35

DIVHv.4/VKv.2

0,30

DIVHv.1/VKv.3

0,39

DIVHv.2/VKv.3

0,67

ACTIVIDADES DE NEUTRALIZACIÓN DE ANTICUERPOS B4 DESINMUNIZADOS DIVHV.1-4/VKV.2-3 PRODUCIDOS POR CÉLULAS NSO

Aislado de VIH-1

Clado Anticuerpo B4 Concentración de anticuerpo (ng/ml) a 50% de inhibición

VL135 (PBL)

B DIVHv.3/VKv.3 0,62

DIVHv.4/VKv.3

0,48

mAb B4 murino

0,17

UG029 (PBL)

A DIVHv.1/VKv.2 0,73

DIVHv.2/VKv.2

0,73

DIVHv.3/VKv.2

0,92

DIVHv.4/VKv.2

0,48

DIVHv.1/VKv.3

1,00

DIVHv.2/VKv.3

1,20

DIVHv.3/VKv.3

1,10

DIVHv.4/VKv.3

1,10

mAb B4 murino

0,28

TH036 (PBL)

E DIVHv.1/VKv.2 0,51

DIVHv.2/VKv.2

0,63

DIVHv.3/VKv.2

0,70

DIVHv.4/VKv.2

0,32

DIVHv.1/VKv.3

0,77

DIVHv.2/VKv.3

0,62

DIVHv.3/VKv.3

0,44

DIVHv.4/VKv.3

0,63

mAb B4 murino

0,24

ACTIVIDADES DE NEUTRALIZACIÓN DE ANTICUERPOS B4 DESINMUNIZADOS DIVHV.1VKV.1PRODUCIDOS POR CÉLULAS CHO (CLONES #7. preparados de acuerdo con la presente invención Y #21(que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención))

Aislado de VIH-1

Clado Anticuerpo B4 Concentración de anticuerpo (ng/ml) a 50% de inhibición

UG029

A DIVHv.1/VKv.1 #7 0,25

DIVHv.1/VKv.1 #21

0,30

mAb B4 murino

0,31

23135

B DIVHv. 1/VKv.1 #7 0,032

DIVHv.1/VKv.1 #21

0,089

mAb B4 murino

0,12

ZA/98/009 C

C DIVHv.1/VKv.1 #7 0,022

DIVHv.1/VKv.1 #21

0,015

mAb B4 murino

0,033

UG046

D DIVHv.1/VKv.1 #7 0,22

DIVHv.1/VKv.1 #21

0,68

mAb B4 murino

0,43

TH036

E DIVHv.1/VKv.1 #7 0,22

DIVHv.1/VKv.1 #21

0,68

mAb B4 murino

0,43

CM235

E DIVHv.1/VKv.1 #7 0,021

DIVHv.1/VKv.1 #21

0,022

mAb B4 murino

0,022

RESPUESTAS DE CITOQUINAS IN VITRO INDUCIDAS POR MAB B4 Y SUS CONTRAPARTES DESINMUNIZADAS

Antígeno en cultivo

Concentración de citoquina en 2 x 106 cultivo de PBMC (ng/ml)

IFN-γ

IL-2 TNF-α IL-4 IL-10

PWM

> 5,0 > 5,0 0,43 BDLd > 0,93

B4a

BDLd BDLd 0,36 BDLd 0,68

DH1DK1CHO#1 6b (que no se encuentra dentro del alcance de la presente invención)

BDLd BDLd BDLd BDLd BDLd

DH1DK1CHO#7 c preparado de acuerdo con la presente invención

BDLd BDLd BDLd BDLd BDLd

a, b & c monoclonales agregados a cultivos en 10,0µg/ml d BDL, por debajo del nivel de detección

Lista de secuencias

<110> Lynn, Shugene 5 Wang, Chang Yi

<120> Anticuerpos Monoclonales desinmunizados artificiales para protección contra la exposición al VIH y tratamiento de la infección por VIH

<130> 1151-4173

<140> TBA 10 <160> 30

<170> Patente versión 3.2

<210> 1

<211> 354

<212> ADN 15 <213> ratón

<400> 1

imagen2

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> ratón

<400> 2

imagen2

<210> 3 10 <211> 333

<212> ADN

<213> ratón

<400> 3

imagen2

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> ratón

<400> 4

imagen3

<210> 5

<211> 118 <212> PRT

<213> ratón

<400> 5

imagen2

<210> 6

<211> 118

<212> PRT

<213> ratón

<400> 6 <210> 7

imagen2

<211> 118

<212> PRT

<213> ratón

<400> 7 <210> 8

imagen2

imagen2

<211> 118

<212> PRT

<213> ratón

<400> 8

imagen2

<210> 9 <211> 111

<212> PRT

<213> ratón

<400> 9

imagen4

<210> 10

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<210> 11

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<212> ADN

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<212> ADN

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<400> 15

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<212> ADN

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<213> ratón

<400> 20

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<213> ratón

20

<400> 21

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<212> PRT

25

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5

<212> ADN

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<400> 23

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<400> 24

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<212> ADN

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<400> 25

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25

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27

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<212> PRT

<213> ratón

<400> 30

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Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo monoclonal desinmunizado que comprende

   (i) un fragmento de cadena pesada de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Números de Identificación de Secuencia 5, 6, 7 y 8,

   5 (ii) un fragmento de cadena liviana de anticuerpo Fv seleccionado a partir del grupo que consiste en los Números de Identificación de Secuencia 9, 10 y 11, y

   (iii) regiones constantes de IgG1 humana,

   en donde la Asn297 de la IgG1 se somete a N-aglicosilación mediante la eliminación de la Asn297 mediante mutación a otro aminoácido.

   10 2. Anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento de la cadena pesada del anticuerpo Fv es el Número de Identificación de Secuencia: 5 y el fragmento Fv de la cadena liviana del anticuerpo es el Número de Identificación de Secuencia: 9.

2. 3. Polinucleótido que comprende las regiones codificantes para el anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

   15 4. Célula huésped recombinante que secreta el anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

3. 5.

   Anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 para la utilización como medicamento.

4. 6.

   Anticuerpo monoclonal desinmunizado de acuerdo con la reivindicación 1 para la utilización en la prevención o el tratamiento de la infección por VIH en un humano.