ES2363757T3

ES2363757T3 - Procedimientos de diagnóstico del cáncer de ovarios.

Info

Publication number: ES2363757T3
Application number: ES06790705T
Authority: ES
Inventors: Cécile LE PAGE; Anne-Marie Mes-Masson; Diane Provencher; Patricia Tonin; Thomas Hudson
Original assignee: McGill University; Val Chum SC
Current assignee: McGill University; Val Chum SC
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2006-09-15
Publication date: 2011-08-16
Anticipated expiration: 2026-09-15
Also published as: EP1924710A4; WO2007030949A3; WO2007030949A2; CA2622332A1; US7910318B2; US20080248501A1; DE602006021038D1; EP1924710B1; EP1924710A2; ATE503846T1

Abstract

Un procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer ovárico epitelial en una muestra de un sujeto humano, que comprende: (a) detectar el nivel de expresión polipeptídica de cada uno de los marcadores FGF-2 y CA125 en la muestra de un sujeto, en el que dicha muestra es de sangre, plasma o suero; (b) comparar el nivel de expresión de cada marcador en a) en dicha muestra con el nivel de expresión de cada marcador en una muestra control de un sujeto sano no afectado por cáncer, en el que un nivel de expresión de cada marcador que es mayor en la muestra del sujeto que en la muestra control es una indicación de que el sujeto está afectado por cáncer de ovarios.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos in vitro de diagnóstico del cáncer ovárico epitelial y de valoración de la potencial eficacia de una terapia para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial.

Antecedentes de la invención

El carcinoma ovárico epitelial (COE) es el tumor maligno de ovarios más frecuente y representa el 80% de todas las neoplasias malignas de los ovarios (1). Se piensa que los CEO se originan en el propio epitelio de la superficie de los ovarios normales (ESE) o en las criptas y quistes de inclusión localizados en el estroma (1). Los EOC son heterogéneos y se designan de acuerdo con su subtipo histológico: seroso, endometrioide, mucinoso, de células claras, de Brenner, indiferenciado o mixto (asociación de dos o más subtipos) (2,3). Este cáncer a menudo es asintomático y más del 70% de los pacientes con cáncer ovárico son diagnosticados en una etapa avanzada de la enfermedad. Aunque hasta el 80% de los pacientes responderá inicialmente al tratamiento, generalmente se observa recurrencia dentro de unos intervalos de tiempo variables. Aunque el 10-15% de los pacientes alcanzan y mantienen una respuesta completa a la terapia, el resto de los pacientes muestran enfermedad persistente o, en última instancia, sufren recidiva que requiere tratamiento adicional. En contraste con esto, los tumores límite o de bajo potencial de malignidad (BPM), que representan el 10-20% de todos los COE, tienen un pronóstico más favorable en comparación con la forma invasiva de la enfermedad, en la que la tasa de supervivencia a los 5 años desciende por debajo del 30 %) (1,4). En la actualidad no existe un procedimiento fiable para la detección selectiva del cáncer de ovarios en una etapa temprana. El marcador en suero CA125 usado en la clínica (5) combinado con la ecografía transvaginal, ecografía tridimensional o Doppler de potencia sólo han proporcionado unos resultados mínimos (6). La menor eficacia de CA125 para la detección selectiva está muy relacionada con su mala especificidad. Aunque los niveles elevados de CA125 normalmente se asocian con la enfermedad maligna, el incremento de los niveles en suero de CA125 también se ha observado con afecciones benignas (7), trastornos no neoplásicos tales como el primer trimestre del embarazo, la menstruación, la endometriosis, la fibrosis uterina, la salpingitis aguda, hepatopatías e inflamación del peritoneo, el pericardio o la pleura, además de cáncer en otros lugares. Además, los niveles de CA124 generalmente no aumentan en las primeras etapas de la enfermedad y niveles menores también se asocian con tumores del endometrio y ováricos mucinosos (8). Por tanto, existe la necesidad de desarrollar herramientas de detección selectiva fiables para el COE, ya que serían extremadamente valiosas para mejorar la detección del cáncer, el tratamiento clínico y, después, afectarían positivamente a la supervivencia. La tecnología de micromatrices es un potente procedimiento para el análisis de la expresión génica específica de cáncer midiendo la expresión específica del tumor de miles de genes en cientos de tumores (9), que, después, se puede asociar con parámetros clínicos específicos. Los genes candidatos a marcadores diagnósticos pueden además caracterizarse en combinación con una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR) a gran escala del ARN y análisis inmunohistoquímico (IHC) de la expresión de proteínas usando matrices tisulares. No obstante, dichas técnicas diagnósticas son difíciles de implementar, ya que requieren cirugía para obtener las muestras de epitelio ovárico. Como alternativa, si el gene expresado diferencialmente codifica una proteína secretada en circulación en sangre periférica, tal como una proteína representa un potencial marcador en suero. El enfoque más habitual para el análisis de dichos marcadores en sangre periférica es a través de un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Aunque en estudios previos se ha investigado el potencial de la prostasina, la osteopontina, la mesotelina y HE4 (10-13) como marcadores diagnósticos del COE, no se ha demostrado que ningún marcador sea lo suficientemente sensible ni específico para un diagnóstico adecuado del cáncer de ovarios. Varias combinaciones de diferentes marcadores tumorales han mostrado una especificidad más elevada al diferenciar la enfermedad benigna de maligna (13,14). No obstante, la eficacia y/o la sensibilidad de estos marcadores estaban limitadas a tumores de subtipo seroso en etapa avanzada. Por tanto, el cáncer de ovarios sigue siendo una fuente fundamental de morbididad y mortalidad y existe una clara necesidad de desarrollo de nuevos procedimientos diagnósticos que tengan la sensibilidad y especificidad requeridas para una detección precoz y fiable del cáncer de ovarios. Otros objetos, ventajas y características de la presente invención serán más evidentes a partir de la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de realizaciones específicas de la misma, dadas únicamente en forma de ejemplos con referencias a las figuras anexas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de marcadores asociados con el cáncer de ovarios para el diagnostico in vitro del cáncer ovárico epitelial y la valoración de la potencial eficacia de una terapia para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial. En consecuencia, en un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer ovárico epitelial en una muestra de un sujeto humano, que comprende:

(a): detectar el nivel de expresión polipeptídica de cada uno de los marcadores FGF-2 y CA125 en la muestra

de un sujeto, en el que dicha muestra es de sangre, plasma o suero;

(b): comparar el nivel de expresión de cada marcador en a) en dicha muestra con el nivel de expresión de

cada marcador en una muestra control de un sujeto sano no afectado por cáncer, en el que un nivel de expresión de cada marcador que es mayor en la muestra del sujeto que en la muestra control es una indicación de que el sujeto está afectado por cáncer de ovarios. En una realización, el sujeto mencionado con anterioridad es asintomático para el cáncer de ovarios. En una realización, la muestra control mencionada con anterioridad es una muestra no cancerosa del sujeto obtenida antes, en la que un nivel de expresión de cada uno de los marcadores que es mayor en la muestra sujeto que en la muestra no cancerosa del sujeto tomada anteriormente es una indicación de que el sujeto está afectado por cáncer de ovarios. En una realización, la muestra control mencionada con anterioridad corresponde a un nivel de expresión umbral para cada uno de los marcadores determinada mediante curvas del operador receptor comparando la concentración de cada uno de los marcadores en una población control sin cáncer de ovarios con la de una población afectada por cáncer de ovarios. En otra realización, el nivel de expresión se determina usando un inmunoensayo. En otra realización, el inmunoensayo es un ensayo de inmunoadsorción unido a enzimas (ELISA). En una realización, el nivel de expresión de cada uno de los marcadores mencionados con anterioridad es superior a los siguientes niveles de expresión umbral predeterminados: 50 U/ml para CA125 y 37 pg/ml para FGF-2. En una realización, la etapa (a) de lo mencionado anteriormente comprende detectar el nivel de expresión polipeptídica del marcador IL-18 en la muestra. En una realización, la etapa (b) de lo mencionado anteriormente comprende detectar el nivel de expresión polipeptídica del marcador IL-18 en la muestra y el nivel de expresión de IL18 en la muestra es superior al nivel de expresión umbral predeterminado de 215 pg/ml. En otra realización, la muestra del sujeto mencionado con anterioridad es suero. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para evaluar la potencial eficacia de una terapia para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial en un sujeto humano, comprendiendo dicho procedimiento determinar el nivel de expresión polipeptídica de cada uno de los marcadores CA125 y FGF-2 en una muestra del sujeto (muestra sujeto) en la que dicha muestra es sangre, plasma o suero, antes y después de la administración de dicha terapia en dicho sujeto, en la que una disminución del nivel de expresión de dichos marcadores tras la administración de dicha terapia es indicativa de que dicha terapia es eficaz para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial. En otra realización de los procedimientos mencionados con anterioridad, la terapia mencionada con anterioridad es un compuesto problema. En una realización de los procedimientos mencionados anteriormente, los procedimientos comprenden además detectar la concentración del marcador IL18 en la muestra. En otra realización, el nivel de expresión se determina usando un inmunoensayo. En otra realización, el inmunoensayo es un ensayo de inmunoadsorción unido a enzimas (ELISA). En otra realización, la muestra mencionada con anterioridad es suero.

Descripción breve de las figuras

En las figuras adjuntas:

La Figura 1 muestra la validación de perfiles de expresión génica mediante Q-PCR en muestras de cultivo primario. (A) Dos microgramos de ARN extraído de 9 células de cultivo NOSE y 8 cultivo primario de EOC se sometieron a transcripción inversa y se cuantificaron los niveles de IL-18 y FGF-2 usando cebadores específicos (paneles de la izquierda). Cada nivel de expresión se normalizó con el del ARN control. La expresión de los cambios relativos en las proporciones es la relación entre la expresión del gen NOSE 18 y la de otras muestras. Tres microgramos de ARN extraídos de células de 12 tejidos de BOT (tumor ovárico benigno) y 22 tejidos de EOC se sometieron a transcripción inversa y se cuantificaron los niveles de IL-18 y FGF-2 como en los paneles de la izquierda (paneles de la derecha). Cada nivel de expresión se normalizó con el del ARN control. La expresión de los cambios relativos en las proporciones es la relación entre la expresión del gen BOT142 y la de las otras muestras; (B) muestra la expresión de IL-18 y FGF-2 en tejidos de epitelio superficial de ovarios normales (NOSE) y cuatro histopatologías de tejidos de COE. Se realizó IHQ usando anticuerpos contra las proteínas indicadas (izquierda). Se realizó contratinción de los núcleos con hematoxilina (azul). El color marrón demuestra tinción de peroxidasa específica; La Figura 2 muestra la medición en suero de CA125 (A) IL-18 (B) y FGF-2 (C) mediante ELISA Los sueros de los pacientes se analizaron según los niveles de CA125, IL-17 y FGF-2 y se determinaron los niveles umbral (líneas discontinuas) para cada marcador en suero. Las líneas continuas muestran la mediana del nivel del marcador en suero para cada grupo de pacientes. LMP: Pacientes con tumor de bajo potencial de malignidad (n= 5). NOSE: pacientes con epitelios de la superficie de ovarios normales (n= 11). BOT: Pacientes con tumores ováricos benignos (n= 23). TOV: Pacientes con tumores ováricos (equivalente a COE: pacientes con cáncer ovárico epitelial invasivo) (n= 42) La Figura 3 presenta las secuencias de ácido nucleico (SEC ID Nº 1) y polipeptídica (SEC ID Nº: 2) para CA125; La Figura 4 presenta las secuencias de ácido nucleico (SEC ID Nº 3) y polipeptídica (SEC ID Nº: 4) para IL18; y La Figura 5 presenta las secuencias de ácido nucleico (SEC ID Nº 5) y polipeptídica (SEC ID Nº: 6) para FGF

2.

Descripción de realizaciones ilustrativas

La presente invención se refiere a marcadores que se pueden usar para el diagnóstico in vitro del cáncer ovárico epitelial en sujetos y para la valoración de la potencial eficacia de una terapia para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial. “Selectividad” en el contexto de la presente invención se refiere a la capacidad de un marcador de la presente invención para discriminar entre una muestra afectada por cáncer de ovarios y una que no lo está, es decir un marcador con una selectividad elevada produce pocos falsos positivos. “Sensitividad” en el contexto de la presente invención se refiere a la capacidad de un marcador de la presente invención para identificar correctamente una muestra afectada por cáncer de ovarios como tal, es decir un marcador con una selectividad elevada produce pocos falsos negativos. “Marcador” en el contexto de la presente invención se refiere a, sin estar limitado a ello, un ácido nucleico o un polipéptido (o un fragmento del mismo), que está presente de forma diferencial en una muestra tomada de un sujeto que tenga cáncer de ovarios en comparación con una muestra comparable tomada de un sujeto control (p. ej., una persona con un diagnóstico negativo o cáncer no detectable, sujeto normal o sano). “Sujeto”, en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier mamífero, incluido un ratón, rata, cerdo, mono, caballo. En una realización específica, se refiere a un ser humano. Como se usa en el presente documento, las expresiones “muestra del sujeto en un momento anterior” quieren decir una muestra de un sujeto tomada en un momento en el que se sabía que el sujeto no estaba afectado por cáncer de ovarios. Los artículos “un”, “una” y “el/la” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Con el término “que incluye” o “que comprende” se usan en el presente documento se quiere decir, y se reutiliza de forma intercambiable con, las expresiones “incluidos, entre otros” y “que comprende, entre otros”. El término “tal como” se usa en el presente documento para querer decir, y se usa de forma intercambiable con, la frase “tal como, entre otros”. Opcionalmente, un marcador se puede modificar antes del análisis para mejorar su resolución o para determinar su identidad. Por ejemplo, los marcadores pueden someterse a digestión proteolítica antes del análisis. Se puede ser cualquier proteasa. Las proteasas, como la tripsina, que probablemente escindan los marcadores en un número pequeño de fragmentos, son particularmente útiles. Los fragmentos que son el resultado de la digestión funcionan como huellas para los marcadores, de modo que indirectamente permiten su detección. Esto es particularmente útil cuando hay marcadores con masas moleculares similares que podrían confundirse con el marcador en cuestión. Asimismo, la fragmentación proteolítica es útil para los marcadores de alto peso molecular porque los marcadores más pequeños se resuelven con más facilidad mediante espectrometría de masas. Asimismo, los marcadores se pueden modificar mediante la unión de un indicador de un peso molecular concreto que se une específicamente a los marcadores moleculares, lo que los distingue. Opcionalmente, después de detectar dichos marcadores modificados, la identidad de los marcadores se puede determinar adicionalmente haciendo coincidir las características físicas y químicas de los marcadores modificados en una base de datos de proteínas (p. ej., SwissProFM). En general, los niveles de expresión se pueden detectar a través de la detección de ARNm de las células y/o la detección de los productos de expresión, tales como polipéptidos y proteínas. La expresión de los transcritos y/o polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos descritos en el presente documento se puede medir mediante cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. En general, la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN) en una muestra sujeto se puede detectar mediante cualquier procedimiento o técnica adecuada de medición o detección de la secuencia o expresión de genes. Dichos procedimientos incluyen, entre otros, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR in situ, PCR cuantitativa (q-PCR), hibridación in situ, ensayo de transferencia de tipo Southern, ensayo de transferencia de tipo Northern, análisis de secuencia, análisis de micromatriz, detección de un gen indicador u otras plataformas de hibridación de ADN/ARN. Para la expresión de ARN, los procedimientos preferidos incluyen, entre otros: Extracción de ARNm celular y transferencia de tipo Northern usando sondas marcadas que hibridan con los transcritos que codifican todos o parte de uno o más de los genes de la presente invención; amplificación del ARNm expresado de uno o más de los genes de la presente invención usando cebadores específicos del gen, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa (q-PCR) y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), seguida de detección cuantitativa del producto mediante cualquiera de una diversidad de medios; extracción del ARN total de las células, que después se marca y usa para sondar ADNc u oligonucleótidos que codifican todos o parte de los genes de la presente invención, introducidos en cualquiera de una diversidad de superficies; hibridación in situ; y detección de un gen indicador. El término “cuantificar”, cuando se usa en el contexto de cuantificar niveles de transcripción de un gen, puede hacer referencia a cuantificación absoluta orto relativa. La cuantificación absoluta se puede realizar mediante inclusión de concentración(es) conocidas de uno o más ácidos nucleicos diana y haciendo referencia a la intensidad de la hibridación de ácidos nucleicos desconocidos con los ácidos nucleicos diana conocidos (p. ej., a través de la generación de una curva estándar). Como alternativa, se puede conseguir la cuantificación relativa mediante comparación de las señales de hibridación entre dos o más genes o entre dos o más tratamientos, para cuantificar los cambios en la intensidad de hibridación y, mediante implicación, en el nivel de transcripción. Como se usa en el presente documento, “muestra control” se refiere a una muestra del mismo tipo, es decir, obtenida de la misma fuente biológica (p. ej., fluido corporal, tejido, etc.) que la muestra analizada, pero de un sujeto sano (es decir, que no está afectado por cáncer de ovarios y, preferentemente, que no está afectado por ningún tipo de cáncer). La muestra control también puede ser una muestra convencional que contenga la misma concentración que los marcadores mencionados con anterioridad que normalmente se encuentran en una muestra biológica correspondiente obtenida de un sujeto sano. Por ejemplo, puede haber una muestra control convencional para las cantidades de CA125, IL-18 y FGF-2 que normalmente se encuentran en las muestras biológicas, tales como tejido, sangre, plasma y suero. Los procedimientos de la invención también se pueden poner en práctica mediante, por ejemplo, selección de una combinación de los marcadores mencionados anteriormente y uno o más marcadores adicionales para los cuales la expresión incrementada o disminuida se correlaciona con cáncer de ovarios, tales como CA72-4, hK6, hK10, HSCCE, calicreína 4, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 8, calicreína 9, calicreína 11, CA15-3, CA19-9, OVX1, ácido lisofosfatídico (ALP) o antígeno carcinoembrionario (ACE), así como otros marcadores específicos de otros tipos de cáncer. Los expertos en la técnica podrán seleccionar marcadores diagnósticos útiles para la detección en combinación con CA125, IL-18 y FGF-2. De forma similar, cuatro o más, o cinco o más, o una multitud de marcadores se pueden usar juntos para determinar un diagnóstico de un paciente. Los procedimientos para medir niveles de expresión de polipéptido de los marcadores de la presente invención incluyen, entre otros: Transferencia de tipo Western, inmunotransferencia, ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia den plasmón superficial, quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímico, espectrometría de masaspor desorción/ionización mediante láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), , microcitometría, micromatriz, microscopia, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), citometría de flujo y ensayos basados en la propiedad de la proteína, incluidos, entre otros, unión a ADN, unión a ligando o interacción con otras parejas proteicas. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de forma intercambiable en el presente documento para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido natural, así como polímeros de aminoácidos naturales, aquéllos que contienen restos modificados y polímeros de aminoácidos no naturales. En una realización, el nivel de expresión de los marcadores mencionados con anterioridad se determina usando un inmunoensayo. Un inmunoensayo es un ensayo que usa un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno (p. ej., un marcador). El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de unión específicas de un anticuerpo concreto para aislar, dirigir y/o cuantificar el antígeno. La frase “se une específicamente (o selectivamente) a un anticuerpo” o “es inmunorreactivo específicamente (o selectivamente” con, cuando hace referencia a na proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinativa de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína concreta, al menos dos veces la basal y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona según su especificidad para una proteína concreta. Por ejemplo, se pueden seleccionar anticuerpos policlonales producidos contra un marcador de especies específicas, tales como ratas, ratones o seres humanos, para obtener sólo los anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con dicho marcador y no con otras proteínas, a excepción de variantes polimórficas y alelos del marcador. Esta selección se puede efectuar restando los anticuerpos que sufren reacción cruzada con las moléculas marcadoras de otras especies. Usando los marcadores purificados y sus secuencias de ácido nucleico, se pueden preparar anticuerpos que se unen específicamente a un marcador usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Véase, p. ej., Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) y Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed. 1986). Dichas técnicas incluyen, entre otras, preparación de anticuerpos mediante selección de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores de fagos o similares, así como la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales mediante inmunización de conejos o ratones. En general, una muestra obtenida de un sujeto se puede poner en contacto con el anticuerpo que se une específicamente al marcador. Opcionalmente, el anticuerpo se puede fijar a un soporte sólido para facilitar el lavado y posterior aislamiento del complejo, antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra. Ejemplos de soportes sólidos incluyen citral o plástico en forma de, por ejemplo, una placa de microtitulación, una barra, una perla o una microperla. Preferentemente, la muestra es una muestra de fluido biológico tomada de un sujeto. La muestra se puede diluir con un eluyente adecuado antes de poner en contacto la muestra con el anticuerpo. Después de incubar la muestra con anticuerpos, la mezcla se lava y se puede detectar el complejo anticuerpo-marcador formado. Esto se puede conseguir incubando la mezcla lavada con un reactivo de detección. Este reactivo de detección puede ser, por ejemplo, un segundo anticuerpo que está marcado con un marcador. Marcadores detectables de ejemplo incluyen perlas magnéticas (p. ej., DYNABEADSTM), colorantes fluorescentes, radiomarcadores, enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otros de uso habitual en un ELISA) y marcadores colorimétricos, tales como oro coloidal o cristal coloreado o perlas de plástico. Como alternativa, el marcador en la muestra se puede detectar usando un ensayo indirecto, en el que se usa, por ejemplo, un segundo anticuerpo marcado para detectar anticuerpo específico unido a marcador y/o en un ensayo de competición o inhibición, en el que, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo distinto del marcador se incuba de forma simultánea con la mezcla. Procedimientos para medir la cantidad de, o la presencia de, complejo anticuerpo-marcador incluyen, por ejemplo detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia, birrefringencia o índice de refracción (p. ej., resonancia en plasmón superficial, elipsometría, un procedimiento de espejo resonante, un procedimiento de guía de onda con acoplador de injerto o interferometría). Procedimientos ópticos incluyen microscopia (tanto confocal como no confocal), procedimientos de imagen y procedimientos que no son de imagen. Procedimientos electroquímicos incluyen procedimientos de voltametría y amperometría. Procedimientos de radiofrecuencia incluyen espectroscopia de resonancia multipolar. Procedimientos para realizar estos ensayos se conocen fácilmente en la técnica. Ensayos útiles incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo enzimático (EIA), tal como ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA), un ensato radioinmunitario (RIA), un ensayo de transferencia de tipo western o un ensayo de transferencia en ranura. Estos procedimientos también se describen en, por ejemplo, Methods in Cell Biology Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites &Terr, eds., 7ª ed. 1991); y Harlow &Lane, anteriormente. En otra realización, el inmunoensayo mencionado anteriormente es un ensayo de inmunoadsorción unido a enzimas (ELISA). Los marcadores se pueden medir en diferentes tipos de muestras biológicas. Preferentemente, la muestra es una muestra de fluido biológico, tal como sangre, plasma y suero. Otras muestras biológicas típicas incluyen, entre otras, biopsia de tejido de tumor ovárico, esputo, fluido linfático, células sanguíneas (p. ej., células mononucleares de sangre periférica), muestras de tejido o de biopsia con aguja fina, orina, fluido peritoneal, calostros, leche materna, fluido fetal, lágrimas, fluido pleural o células de los mismos. Dado que todos los marcadores se encuentran en suero sanguíneo, el suero sanguíneo es una fuente de muestras preferida para las realizaciones de la invención. Si se desea, la muestra se puede preparar para potenciar la detectabilidad de los marcadores. Por ejemplo, para incrementar la detectabilidad de los marcadores, una muestra de suero sanguíneo del sujeto se puede fraccionar, preferentemente, mediante, por ejemplo, cromatografía en agarosa azul Cibacron™ y cromatografía de afinidad de ADN monocatenario, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de afinidad (p. ej., con anticuerpos) y similares. El procedimiento de fraccionamiento depende del tipo de procedimiento de detección usado. Se puede usar cualquier procedimiento que enriquezca la proteína de interés. Las preparaciones de muestras, tales como los protocolos pre-fraccionamiento, son opcionales y pueden no ser necesarias para aumentar la detectabilidad de los marcadores en función de los procedimientos de detección usados. Por ejemplo, la preparación de la muestra puede ser innecesaria si se usan anticuerpos que se unen específicamente a los marcadores para detectar la presencia de marcadores en una muestra. Normalmente, la preparación de la muestra implica el fraccionamiento de la muestra y la recolección de las fracciones que se ha determinado que contienen los marcadores. Los procedimientos pre-fraccionamiento incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de heparina, cromatografía de afinidad, extracción secuencia, electroforesis en gel y cromatografía de líquidos. Los analitos también se pueden modificar antes de la detección. Estos procedimientos son útiles para simplificar la muestra para análisis posteriores. Por ejemplo, pueden ser útiles para eliminar de la sangre las proteínas muy abundantes, tales como albúmina, antes del análisis. Ejemplos de procedimientos de fraccionamiento se describen en el documento WO/2003/057014. Los procedimientos para detectar estos marcadores en una muestra tienen muchas aplicaciones. Por ejemplo, se pueden medir uno o más marcadores para ayudar en el diagnostico del cáncer humano. En otro ejemplo, se pueden usar los procedimientos para la detección de los marcadores para monitorizar las respuestas en un sujeto para tratamiento de cáncer. En otro ejemplo, los procedimientos para detectar marcadores se pueden usar para analizar e identificar compuestos que modulan la expresión de estos marcadores in vivo o in vitro. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para evaluar la potencial eficacia de una terapia para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial en un sujeto humano, comprendiendo dicho procedimiento determinar el nivel de expresión polipeptídica de cada uno de los marcadores CA125 y FGF-2 en una muestra de dicho sujeto seleccionada de sangre, plasma y suero, la expresión polipeptídica de los marcadores CA125 y FGF-2 y, en más realizaciones específicas, el marcador IL-18, antes y después de la administración de dicha terapia en dicho sujeto, en la que una disminución de la expresión de dichos marcadores tras la administración de dicha terapia es indicativa de que dicha terapia es eficaz para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial. La presente invención se ilustra con detalles adicionales mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1

Muestras clínicas

Se obtuvieron muestras de tejido y sueros con el consentimiento informado de los participantes. Las muestras de tumor se obtuvieron mediante cirugías realizadas en el Centre Hospitalier de l'Universite de Montreal (CHUM). Mediante histopatología se asignaron grados y estadios de los tumores de acuerdo con los criterios de la International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO). Los controles normales se definieron con pacientes sin tumor. Los cultivos celulares primarios de muestras de epitelios normales de superficie ovárica (NOSE) y de EOC se establecieron como se ha descrito (15, 16) y se usaron para análisis de micromatrices. Las células del cultivo primario se mantuvieron en medio OSE, que consiste en medio 50:50 199:105 (Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2,5 µg/ml de anfotericina B y 50 µg/ml de gentamicina (15). Se usaron estudios de cohortes independientes para micromatriz, ELISA e IHQ de matriz tisular se estudiaron y se presentan en la Tabla 1 a continuación.

PCR cuantitativa

La amplificación lineal del ARN de células de cultivo primario se realizó como se ha descrito anteriormente (17), La síntesis de ADNc se efectuó de acuerdo con el protocolo del sistema SuperScriptTM First-Strand Synthesis System para Q-PCR (Invitrogen Life Technologies) con una cantidad de partida de 2 mg de ARN y la transcripción inversa se realizó con hexámeros aleatorios. La reacción de PCR (temperatura, especificidad) se realizó usando condiciones convencionales de PCR con un sistema de amplificación de ADN centrífuga en tiempo real Rotor-gene™ 3000 (Corbett tumor tissues Research, NSW, Australia). La mezcla de reacción QuantitectTM SYBR Green PCR (Qiagen Inc., ON, Canadá) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron diluciones en serie para generar una curva estándar para cada gen analizado con el fin de definir la eficiencia de la reacción Q-PCR y se efectuó una curva de fusión para confirmar la especificidad de la reacción. En base a la estabilidad de su expresión en experimentos de micromatriz se usaron cebadores para el gen ERK como control interno. Los experimentos se realizaron por duplicado. En todos los experimentos se introdujeron controles positivos y negativos. Las secuencias para los cebadores de IL-18 son: Directo 5'-CGCTICCTCTCGCAACAAACTAT-3' (SEC ID Nº: 7) e Inverso 5'CCGGGGTGCATIATCTCTACAGT-3' (SEC ID Nº 8); FGF-2: Directo 5'-CGCGCAGGAGGGAGGAGA-3' (SEC ID Nº: 9) e Inverso 5'-ACGCCGCCTGGGGAGAG-3' (SEC ID Nº 10) y, por último, ERK1: Directo 5'GCGCTGGCTCACCCCTACCT-3' (SEC ID Nº: 11) e Inverso 5'-GCCCCAGGGTGCAGAGATGTC-3' (SEC ID Nº 12). El análisis Pfaffl se usó como procedimiento para medir la cantidad relativa de expresión génica (18).

Preparación de ARN y micromatriz

El ARN total se extrajo con reactivo TRlzol™ (Gibco / BRL, Life Technologies Inc., Grand Island, NY, EE.UU.). El ARN se extrajo directamente de células cultivadas hasta 80% de confluencia. La calidad del ARN se monitorizó mediante electroforesis en gel y un 2100 Bioanalyzer usando el kit RNA 6000 Nano LabChipTM kit (Agilent Technologies, Alemania). La diana de hibridación biotinilada se preparó a partir del ARN total tal como se ha descrito (19). Sen realizaron experimentos de micromatriz HuGeneFITM 6800 GeneChipTM en la McGill University y el Genome Quebec Innovation Centre y los datos brutos se procesaron usando el software Affymetrix™ MAS4. En la técnica se conocen los protocolos detallados y están disponibles en www.genomequebec.mcgill.calcenter.php. Los datos brutos de cada experimento se normalizaron de acuerdo con la media de la intensidad global ajustada a 100 unidades. Las matrices con una intensidad global inferior a 100 se eliminaron. Tras la normalización, todos los valores inferiores a 20 se consideraron ruido técnico y los valores de expresión inferiores a este umbral se transformaron en este valor. Todos los EST se filtraron después, que tenían una indicación “A” (señal ambigua) en todas las muestras. Para detectar los genes expresados de forma diferencial en las muestras de tumor de ovarios frente a células de ovario normal se usaron dos pruebas estadísticas para identificar los clasificadores. Se realizaron una prueba paramétrica y una no paramétrica (Mann-Whitney (UU) usando el software GeneSpring™ (Silicon Genetics). Los genes candidato identificados en común en los dos análisis se seleccionaron para análisis posteriores.

Matriz tisular e IHQ

Los siguientes anticuerpos monoclonales se usaron en inmunohistoquímica (IHQ);anti-IL-18 (sistema R&D), antiFGF-2 (Santa Cruz Biotechnology).Se construyó una matriz tisular que contenía 94 núcleos de tejidos de epitelio ovárico (véase la Tabla 1, más adelante) y se usó para los estudios IHQ. En resumen, la matriz tisular se calentó a 60ºC durante 30 minutos, se desparafinizó en tolueno y se rehidrató en un gradiente de etanol. Para desenmascarar el antígeno, los portas se sumergieron en tampón citrato a 90ºC (ácido cítrico 0,01M + 500 µl de tween-20/l ajustado a un pH 6,0) (J.T. Baker Philipsburg, NJ) durante 15 minutos. El tejido se bloqueó con un reactivo sin suero bloqueante de proteínas (DakoCytomation Inc., Mississauga, ON) y se incubó con los diferentes anticuerpos durante la noche a 4ºC en una cámara húmeda. La concentración óptima para cada anticuerpo primario se determinó mediante diluciones en serie. Posteriormente, la actividad de peroxidasa endógena se inactivó mediante tratamiento con 3% de H2O2. Después, la matriz se incubó con un anticuerpo biotinilado secundario (DakoCytomation Inc., Mississauga, ON) durante 10 minutos, seguido de incubación con un complejo de estreptavidina-peroxidasa (Dako Diagnostics Canadá Inc.) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los productos de reacción se desarrollaron usando diaminobencidina (mancha marrón) que contiene 0,3% de H2O2 como sustrato para peroxidasa y los núcleos se sometieron a contratinción con hematoxilina diluida (mancha azul). Las zonas epiteliales se puntuaron de acuerdo con la intensidad de la tinción (valor 0 para ausencia, 1 para débil, 2 para moderada, 3 para intensidad alta). Dos observadores independientes analizaron cada matriz se analizó de forma independiente. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba T.

ELISA:

La sangre del paciente se centrifugó durante 30 minutos a 2500 rpm y el suero separado se congeló inmediatamente a -20ºC hasta su posterior uso. Antes de la medición, todos los sueros se volvieron a centrifugar durante 10 minutos a 8000 rpm. Los sueros se analizaron después mediante ELISA para determinar la concentración de CA125 (Panomics BC1 013), FGF-2 (R&D System, artículo DFB50) e IL-18 (R&D System, artículo 7620) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El límite de detección para IL-18 fue 20 pg/ml, 10 U/ml para CA125 y 20 pg/ml para FGF-2. Los experimentos independientes se calibraron con al menos dos muestras. Los análisis estadísticos se realizaron usando el software SPSS. Para un grupo de muestras pequeño (<10) se aplicó la prueba de Mann

5 Whitney U, sino el análisis estadístico se basó en la prueba T.

EJEMPLO 2

Identificación de dos genes regulados por aumento en cáncer de ovarios y que codifican citocinas

10 El análisis comparativo de los perfiles de expresión génica de células epiteliales de ovario se realizó usando 11 cultivos primarios de muestras de superficie epitelial normal de ovarios (NOSE) y39 cultivos primaros de muestras de COE. Los 39 EOC representaban diferentes grados, estadios y patologías del cáncer de ovarios (véase la Tabla 1, más adelante). Para obtener conocimientos sobre los genes que exhiben niveles de expresión dominante en

15 tumores de ovarios, los perfiles de expresión se analizaron usando dos algoritmos de clasificación supervisados diferentes. Entre un total de 177 genes candidatos comunes a ambos análisis supervisados se identificaron varios genes que codifican proteínas secretadas, pero sólo había dos genes que codifican citocinas, IL-18 y FGF-2. Con el fin de maximizar la probabilidad del muestreo de la expresión génica diferencial en suero, se seleccionaron estos últimos dos genes para su estudio posterior.

20 TABLA 1: GRUPOS DE MUESTRAS USADOS EN CADA EXPERIMENTO

Grado del tumor: Estadio del tumor

Histopatología: Tamaño de

la muestra: B 1 2 3 Mixto Bajo Alto

Grupo de micromatriz (n= 50)

Normal: 11

Seroso: 29 6 1 7 15 4 25

Endometrioide: 7 3 4 7

Mixto: 1 1 1

Células claras: 2 2 2

Tumores totales: 39 6 1 10 22 4 35

Matriz tisular (n= 114)

Normal: 20 NA NA

Seroso: 21 4 5 5 7 NA NA

Endometrioide: 27 13 7 5 2 NA NA

Células claras: 17 5 9 3 NA NA

Mixto: 5 3 2 NA NA

Mucinoso: 24 21 3 NA NA

Tumores totales: 94 25 18 17 24 6 NA NA

Grupo ELISA (n= 70)

Normal y benigno: 25

Seroso: 29 3 2 3 20 1 3 26

Endometrioide: 3 3 2 1

Células claras: 5 4 1 3 2

Mixto: 3 1 1 1 0 3

Brenner: 2 2 1 1

Mucinoso: 3 2 1 2 1

Tumores totales: 45 5 7 4 25 4 11 34

Tejidos para PCR (n= 34)

Normal y benigno: 12

Seroso: 6 1 1 2 2 4

Endometrioide: 5 1 4 5

Células claras: 7 5 2 1 6

Mucinoso: 4 2 1 1 1 2

Tumores totales: 22 3 2 3 12 2 4 18

El grado B lo forman tumores de bajo potencial de malignidad. Estadio bajo: tumores en estadio I y II; estadio alto: tumores de estadio III y IV.

EJEMPLO 3

Validación de la expresión génica diferencial de IL-18 y FGF-2

5 Se usó Q-PCR para validar la expresión diferencial del ARN de IL-18 y FGF-2 observada en el análisis en micromatriz. Para este fin se compararon 9 NOSE y 8 EOC escogidos al azar del grupo anterior de cultivos primarios, además de 12 tumores benignos (BOT) y 22 EOC de tejidos frescos, y sus niveles de expresión correlacionaron con los resultados obtenidos mediante análisis en micromatriz (Figura 1A, paneles de la izquierda).

10 En las muestras de NOSE se detectó débilmente IL-18 y FGF-2, mientras que se podían detectar fácilmente en la mayoría de las muestras malignas, de modo que sirvieron como confirmación independiente de su expresión diferencial en COE. Para determinar la expresión de IL-18 y FGF-2 en tejidos, también se analizó el ARN aislado de 12 y 22 tejidos de tumor ovárico benigno y maligno respectivamente (Tabla I). La mayoría de los tejidos malignos, con la excepción de dos tumores mucinosos y uno seroso, mostraron sobreexpresión de IL-18 (Figura 1A, paneles

15 de la derecha). Los mayores niveles de expresión de ARN de FGF-2 se observaron en tejidos endometrioides, aunque la diferencia entre tejidos benignos y malignos fue menos sorprendente (Figura 1A, paneles de la derecha).

EJEMPLO 4

20 Expresión proteica de IL-18 y FGF-2 en muestras de tejido ovárico

Para abordar la expresión de FGF-2 e IL-18 en EOC se realizó IHQ con anticuerpos específicos de IL-18 y FGF-2 en tejidos ováricos usando una micromatriz tisular que contiene 20 núcleos de tejido NOSE y 94 de EOC de 114 pacientes independientes. Los 94 núcleos de EOC representaban los diferentes grados y patologías del cáncer de

25 ovarios con la excepción de tumores de Brenner (véase la Tabla 1, anteriormente). Los resultados de la puntuación de los análisis IHQ se resumen en la Tabla 2 que se expone a continuación. IL-18 y FGF-2 se expresaron en NOSE, además de en tejidos de COE. En los tejidos de NOSE se observó heterogeneidad de la intensidad de la tinción entre los diferentes núcleos (véase la Tabla 2, que figura a continuación). Además, también se observó tinción de IL18 y FGF-2 en el estroma de tejidos NOSE, que puede deberse a su expresión directa por células estromales en

30 orto a la secreción de estoas citocinas por las células epiteliales adyacentes. Los tejidos de EOC mostraron una tinción ligeramente más marcada de IL-18 y FGF-2. La tinción fue significativamente más fuerte para IL-18 en tumores serosos, endometrioides y de células claras (p< 0,05) y para tumores endometrioides y de células claras con FGF-2 (Figura 1B y Tabla 2).

35

TABLA 2: INTENSIDAD DE LA INMUNOTINCIÓN DE LA MATRIZ TISULAR CON ANTICUERPOS ANTI-IL-18 Y ANTI-FGF-2

Histopatología: Intensidad de la tinción

p: 0 1+ 2+ 3+

Anticuerpo antiIL-18

Normal: 3 13 4 0

Células claras: < 0,001 0 1 14 2

Endometrioide: 0,001 1 9 15 2

Seroso: 0,03 0 13 8 0

Mixto: 0,05 0 2 3 0

Mucinoso: 0,20 8 11 5 0

Tumores totales: 0,005 12 36 45 4

Anticuerpo antiFGF-2

Normal: 5 7 5 3

Células claras: < 0,001 0 2 12 3

Endometrioide: 0,01 1 6 15 5

Seroso: 0,45 7 1 13 0

Mixto: 0,33 2 0 3 0

Mucinoso: 0,08 1,1 8 6 0

Tumores totales: 0,14 21 17 49 8

a0, ausencia; 1, débil; 2, moderada; 3, intensidad alta.

5 EJEMPLO 5

Proteínas IL-18 y FGF-2 en suero como marcadores de COE

IL-18 y FGF-2 se estudiaron como marcadores individuales en comparación con CA125. Con este fin se seleccionó

10 un total de 72 pacientes: 25 pacientes no tenían cáncer y 47 pacientes tenían cáncer de ovarios (véase la Tabla 1 anteriormente). Entre los pacientes sin cáncer, seis presentaron tumores ováricos benignos (BOV) o (benignos). Entre los 47 cánceres ováricos, cinco fueron tumores de bajo potencial de malignidad (LMP), ocho tumores de grado 1, cuatro de grado 2 y 26 de grado 3 (véase la Tabla 1 con anterioridad). Se representaron seis patologías diferentes en el grupo de pacientes seleccionados con EOC (seroso, endometrioide, de células claras, de Brenner, mucinoso y

15 mixto). CA125 estaba significativamente elevado en pacientes con EOC (p< 0,001) (Véase la Tabla 3 que figura a continuación). No se observaron diferencias significativas en pacientes con o sin tumores benignos (p= 0,31). Los pacientes con tumores de LMP mostraron un nivel más bajo de CA125 (mediana 75 U/ml) que el EOC maligno (mediana del nivel 350 U/ml) (véase la Figura 2 y la Tabla 3, más adelante). Esta observación fue consistente con

20 los mayores niveles de CA125, que correlacionaron con el mayor grado tumoral (r= 0,33, p= 0,004) y estadio en estudios independientes (8). El mayor nivel de CA125 también se correlacionó con la histopatología (prueba de Spearman Rho, p= 0,002), en la que los niveles de CA125 fueron más elevados en los tumores serosos que en los tumores endometrioides y de células claras (véase la Tabla 3, más adelante). Aunque los niveles de IL-19 eran también significativamente más elevados en los pacientes con EOC (mediana del

25 nivel pg/ml p= 0,003) se correlacionó con el grado del tumor (prueba de Spearman Rho, p= 0,172). Los tumores serosos mostraron el mayor nivel de expresión de IL-18 (mediana del nivel 305 pg/ml), pero no se observó una correlación significativa entre IL-18 y la enfermedad patológica (prueba de Spearmen Rho, p= 0,173). Como se ha observado con CA125, no se observaron diferencias significativas entre los pacientes con o sin tumores benignos (p= 0,99) (véase la Tabla 3 a continuación).

30 Los niveles de FGF-2 fueron mayores en los pacientes con EOC en comparación con los pacientes sin cáncer, aunque con una significación más débil en comparación con CA125 o IL-18 (p= 0,04). De acuerdo con los resultados obtenidos en las matrices tisulares, los niveles en suero de FGF-2 fueron más elevados en asociación con los tumores de células claras. También se detectó una correlación entre el incremento de los niveles en suero de FGF-2 y el grado tumoral (prueba de Spearman Rho, p= 0,02) (Tabla 3).

TABLA 3: NIVEL DE EXPRESIÓN DE LOS MARCADORES CA125, IL-18 Y FGF-2 EN SUERO

CA125 (U/ml) [Mediana/media (p*)]: IL-18 (pg/ml) [Mediana/media (p*)] FG-2 (pg/ml) [Mediana/media (p*)]

NOSE + benigno: 37/92 204/215 29/35

AU COE: 306/474 (< 0,001) 264/315 (0,001) 39/50 (0,037)

Normal: 44/114 203/212 34/43

Benigno: 32/63 (031) 207/219 (0,99) 27/25 (0,31)

LMP: 75/100 (0,30) 236/257 (0,31) 68/21 (0,175)

COE invasivo: 350/545 (<0,001) 250/327 (0,003) 49/56 (0,006)

Grado 1: 339/336 (0,03) 282/267 (0,04) 31/31 (0,70)

Grado 2: 260/285 (0,04) 251/283 (0,008) 43/36 (0,011)

Grado 3: 484/683 (<0,001) 307/370 (0,003) 66/68 (0,002)

Estadio bajo: 75/419 (0,18) 233/239 (0,62) 39/47 (0,65)

Estadio alto: 350/450 (< 0,001) 281/282 (< 0,001) 44/42 (0,016)

Seroso: 419/544 (< 0,001) 305/358 (< 0,001) 44/54 (0,11)

Endometrioide: 339/380 (0,16) 281/152 (0,37) 23/23 (0,63)

Mucinoso: 38/46 (0,79) 263/247 (0,29) 21/32 (0,68)

Células claras: 34/492 (0,55) 242/330 (0,30) 69/49 (0,10)

NOSE, epitelio normal de la superficie de ovario; EOC, cáncer ovárico epitelial; LMP, tumor de bajo potencial de malignidad; estadio bajo, estadios I y II; estadio alto, estadios III y IV, p*, prueba de Mann-Whitney.

EJEMPLO 6

5 Potencial diagnóstico de CA125, IL-18 y FGF-2 en suero como marcadores

Se usaron curvas de operador receptor para determinar los valores umbral para los tres marcadores séricos para comparar el potencial diagnóstico de los marcadores de citocinas individuales con CA125. La mayor precisión en el diagnóstico diferencial de los tumores malignos se consiguió con un umbral d 50 U/ml para CA125, 215 pg/ml para 10 IL-18 y 37 pg/ml para FGF-2. La sensibilidad, es decir la fracción de pacientes diagnosticados correctamente con cáncer de ovarios, fue más precisa al considerar CA1125 o IL-18 como marcadores individuales. La sensibilidad, determinada por CA125 e IL-18, fue del 82% y 78%, respectivamente, en comparación con el 58% con FGF-2 (Tabla 4). Para asegurar que no había ninguna diferencia en la sensibilidad entre CA125 e IL-18 se aumentó el número de muestras a 97 (datos no mostrados). En este grupo más grande, los niveles de sensibilidad de CA125 e IL-18

15 permanecieron similares (75% y 74%, respectivamente). La especificidad se definió como la fracción de muestras diagnosticadas correctamente como no malignos, incluido el suero de pacientes con ovarios normales o enfermedad benigna. El análisis individual de pacientes con ovarios normales o enfermedad benigna dio resultados similares (datos no mostrados). La especificidad fue proporcionada mejor por FGF-2 (72%). CA125 e IL-18 mostraron especificidades similares relativamente bajas del 60% y 64%,

20 respectivamente (Tabla 4). En el grupo más grande, los niveles de sensibilidad de CA125 e IL-18 permanecieron similares (61 % y 64%, respectivamente, datos no mostrados).

TABLA 4: ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE CA125, IL-18 Y FGF-2 EN ANÁLISIS UNIVARIADO Y MULTIVARIADO

Tipo de paciente: CA125 (U/ml) IL-18 (pg/ml) FGF-2 (pg/ml) CA125+IL-18+FGF-2

n>50U/ ml: %+ n>215 pg/ml %+ n>37 pg/ml %+ n %+

Especificidad NOSE+benigno: 10/25 60 9/25 64 7/25 72 5/25 80

Sensibilidad

Todos los: 37/45 82 35/45 78 26/45 58 35/45 78

EOC: 3/5 60 3/5 60 1/5 20 3/5 60

LMP: 34/42 81 34/42 81 25/42 60 32/42 76

EOC invasivo: 6/11 55 6/11 55 7/11 64 7/11 64

Estadio bajo: 31/34 91 29/34 85 30/34 59 28/34 73

Estadio alto: 28/29 97 26/29 90 19/29 66 27/29 93

Seroso: 2/3 67 2/3 67 1/3 33 1/3 33

Endometrioide: 1/5 20 3/5 60 4/5 80 3/5 60

Células claras: 1/3 33 2/3 67 1/3 33 1/3 33

Mucinoso: 2/2 100 0/2 0 0/2 0 ½ 50

Brenner: 3/3 100 2/3 67 1/3 33 2/3 67

Mixto

EOC, cáncer ovárico epitelial; LMP, tumor de bajo potencial de malignidad; estadio bajo, estadios I y II; estadio alto, estadios III y IV; % +, corresponde al porcentaje de benignos NOSE+ que no puntúan por encima del umbral (especificidad).

5 EJEMPLO 7

Potencial diagnóstico de IL-18 y FGF-2 en suero como marcadores combinados con CA125

La correlación estimada entre los tres marcadores séricos (IL-18, FGF-2 y CA125) era baja, lo que sugiere que eran complementarias entre sí y que un abordaje multivariado podría superar al ensayo con CA125 solo.

10 Para validar esta hipótesis se realizó un análisis multivariado usando un algoritmo de regresión binaria logística. Como se muestra en la Tabla 5, FGF-2, pero no IL-18, aumentó el potencial diagnóstico de CA125 (cociente de posibilidades de 5,24 a 6). No obstante, la adición de FGF-2 e IL-18 alcanzó un potencial diagnóstico superior (cociente de posibilidades= 6,94, 0,95 (1,99-24,39), p= 0,002), lo que sugiere que la combinación de IL-18 y FGF-2 con CA125 permite una mejor sensibilidad y especificidad.

15 Las muestras para puntuación como malignos también se analizaron en base a si los valores de ELISA estaban por encima del umbral para al menos dos de los tres marcadores. En este análisis (TABLA 4), se alcanzó una sensibilidad del 78%, que fue similar a la obtenida con CA125 o IL-18 solos, pero la especificidad del diagnóstico aumentó espectacularmente desde CA125 (60%), IL-18 (64%) O fgf-2 (72%) solos al 80% de la combinación de estos marcadores séricos (Tabla 4). Se obtuvo un resultado similar en un grupo más grande de muestras (77%,

20 datos no mostrados).

TABLA 5: ANÁLISIS DE REGRESIÓN BINARIA LOGÍSTICA (LBR) DE ANÁLISIS MULTIVARIADO DE CA125, IL18 Y FGF-2

p: OR Cl

LBR: CA-125 <0,001 5,24 2,07-13,33

CA125+IL18: 0,002 4,78 1,81-12,66

CA125+FGF-2: 0,002 6 1,93-18,61

IL-18-FGF-2: 0,014 2,25 0,726-6,96

CA125+IL-18+FGF: 0,002 6,94 1,99-24,39

OR+: Cociente de posibilidades: IC: Intervalo de confianza del 95%

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16. Lounis, H., Provencher, D., Godbout, C., Fink, D., Milot, M. J. y Mes-Masson, A. M. Primary cultures of normal

and tumoral human ovarian epithelium: a powerful tool for basic molecular studies. Exp. Cell Res., 215: 303-309, 5 1994.

17. Ouellet, V., Provencher, D., Maugard, C. M., Le Page, C., Ren, F., Lussier, C., Novak, J., Ge, B., Hudson, T J., Tonin, P. N. y Mes-Masson, A. M. Discrimination between serous low malignant potential and invasive epithelial ovarian tumors using molecular profiling. Oncogene, In Press, 2005.

10

18.: PfaffI, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res, 29: e45,2001.

19.: Tamayo, P., Sionim, D., Mesirov, J., Zhu, Q., Kitareewan, S., Dmitrovsky, E., Lander, E. S. y Golub, T R.

15 Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: methods and application to hematopoietic differentiation. Proc Natl Acad Sci USA. 96: 2907-2912., 1999.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer ovárico epitelial en una muestra de un sujeto humano, que comprende:

(a)

detectar el nivel de expresión polipeptídica de cada uno de los marcadores FGF-2 y CA125 en la muestra de un sujeto, en el que dicha muestra es de sangre, plasma o suero;

(b)

comparar el nivel de expresión de cada marcador en a) en dicha muestra con el nivel de expresión de cada marcador en una muestra control de un sujeto sano no afectado por cáncer,

en el que un nivel de expresión de cada marcador que es mayor en la muestra del sujeto que en la muestra control es una indicación de que el sujeto está afectado por cáncer de ovarios.
2.

El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho sujeto es asintomático para cáncer de ovarios.
3.

El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha muestra control es una muestra no cancerosa del sujeto en un momento anterior, en el que un nivel de expresión de cada uno de los marcadores que es mayor en la muestra sujeto que en la muestra no cancerosa del sujeto tomada anteriormente es una indicación de que el sujeto está afectado por cáncer de ovarios.
4.

El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra control mencionada con anterioridad corresponde a un nivel de expresión umbral para cada uno de los marcadores determinada mediante curvas del operador receptor comparando la concentración de cada uno de los marcadores en una población control sin cáncer de ovarios con la de una población afectada por cáncer de ovarios.
5.

El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el nivel de expresión se determina usando un inmunoensayo.
6.

El procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho inmunoensayo es un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).
7.

El procedimiento según la reivindicación 5, en el que el nivel de expresión de cada uno de los marcadores es superior a los siguientes niveles de expresión umbral predeterminados: 50 U/ml para CA125 y 37 pg/ml para FGF-2.
8.

El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la etapa (a) de lo mencionado anteriormente comprende detectar el nivel de expresión polipeptídica del marcador IL-18 en la muestra.
9.

El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la etapa (b) de lo mencionado anteriormente comprende detectar el nivel de expresión polipeptídica del marcador IL-18 en la muestra y en el que el nivel de expresión de IL18 en la muestra es superior al nivel de expresión umbral predeterminado de 215 pg/ml.
10.

El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra de dicho sujeto es suero.
11.

Un procedimiento para evaluar la potencial eficacia de una terapia para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial en un sujeto humano, comprendiendo dicho procedimiento determinar el nivel de expresión polipeptídica de cada uno de los marcadores CA125 y FGF-2 en una muestra del sujeto, en la que dicha muestra es sangre, plasma o suero, antes y después de la administración de dicha terapia en dicho sujeto, en la que una disminución del nivel de expresión de dichos marcadores tras la administración de dicha terapia es indicativa de que dicha terapia es eficaz para tratar o inhibir el cáncer ovárico epitelial.
12.

El procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha terapia es un compuesto de prueba.
13.

El procedimiento según la reivindicación 11 o 12, que además comprende detectar la concentración del marcador IL-18 en la muestra.
14.

El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que dicho nivel de expresión se determina usando un inmunoensayo.
15.

El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que dicho nivel de expresión se determina usando un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).
16.

El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que dicha muestra es suero.