ES2364264A1 - Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales. - Google Patents
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Abstract
Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales.Macromoléculas altamente ramificadas sintetizadas a partir de un núcleo polifuncional, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos aniónicos que dan a la macromolécula una carga neta negativa. Además, la invención se refiere al uso de los dendrímeros como antimicrobiano y el procedimiento de obtención de los mismos.
Description
Dendrímeros carbosilanos y su uso como
antivirales.
La presente invención se refiere a
macromoléculas altamente ramificadas sintetizadas a partir de un
núcleo polifuncional, denominadas dendrímeros, de estructura
carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos aniónicos
que dan a la macromolécula una carga neta negativa. Además la
invención se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos en
biomedicina.
Los dendrímeros son moléculas hiperramificadas
de construcción arborescente, de tamaño y estructura tridimensional
bien definidos y que poseen unas propiedades químicas uniformes
debidas en parte a su baja polidispersidad. La naturaleza y
propiedades de los dendrímeros se pueden controlar actuando sobre el
núcleo de crecimiento del dendrímero, sobre las unidades o ramas de
crecimiento o sobre la periferia del dendrímero que es susceptible
de incorporar una variedad muy grande de grupos funcionales. Los
primeros trabajos describiendo la síntesis de dendrímeros fueron
publicados hace algo más de dos décadas. Desde entonces ha crecido
la capacidad de diseño de nuevas estructuras dendríticas, lo que ha
dado lugar a un gran número de publicaciones en este campo y a su
vez ha atraído la atención de investigadores de diferentes
disciplinas científicas ante la variedad de aplicaciones que pueden
presentar este tipo de compuestos. En la última década se ha
empezado a investigar el potencial de los dendrímeros en
aplicaciones biomédicas, descubriendo su utilidad en campos como por
ejemplo terapia génica, donde el dendrímero actúa como un vehículo
de transporte no viral de biomoléculas tratando de optimizar el
efecto terapéutico de estas. También se han descrito aplicaciones de
los dendrímeros como agentes de contraste de imagen en resonancia
magnética nuclear o transporte de boro 10 en la terapia de captura
de neutrones utilizada en determinados tumores. Sin embargo, es
bastante reciente el descubrimiento de que los dendrímeros por si
mismos pueden tener una actividad biológica, actuando así por
ejemplo como agentes antibacterianos o antivirales.
De esta manera, se han sintetizado moléculas
dendríticas que contienen en su superficie grupos adecuados para
formar complejos con receptores celulares o virales rompiendo la
interacción virus-célula, incluyendo la unión
inicial del virus a la pared celular. Algunas de estas moléculas han
mostrado actividad in vitro frente a una variedad de virus,
como VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana), VHS (Virus del
Herpes Simple), Virus de la gripe u otros.
La capacidad de los dendrímeros para interferir
en la interacción virus-célula sugiere que ellos
podrían actuar como microbicidas tópicos, es decir, compuestos
aplicados sobre la mucosa vaginal o rectal para impedir enfermedades
de transmisión sexual.
Los dendrímeros descritos en la bibliografía y
potencialmente útiles como agentes antivirales pueden presentar
distintos tipos de esqueletos, pero en lo que se refiere a los
grupos funcionales que presentan en su periferia, que son los
verdaderos responsables de su actividad antiviral, pueden ser
agrupados en tres tipos: carbohidratos, péptidos y aniones.
Dendrímeros funcionalizados con carbohidratos:
los glicodendrímeros han sido las macromoléculas dendríticas más
comúnmente utilizadas hasta la fecha como antivirales. Se han
estudiado frente a varios tipos de virus, pero uno de los estudios
más exhaustivos ha sido frente al virus de la gripe. Estudios in
vivo utilizando dendrímeros tipo PAMAM funcionalizados en la
periferia con ácido siálico demostró que estos compuestos protegen
completamente frente a la infección en un modelo de gripe murino,
observándose que los dendrímeros utilizados no eran tóxicos ni
inmunogénicos. También se estudiaron los efectos de estos
dendrímeros PAMAM funcionalizados con ácido siálico y sus resultados
indicaban que la especificidad del carbohidrato no era lo único que
determinaba el éxito o el fracaso en el diseño de un inhibidor
basado en carbohidratos, sino que también había que considerar como
es la unión y la orientación de los carbohidratos al esqueleto del
dendrímero. Muy recientemente, se ha descrito el uso de
glicodendrímeros basados en un esqueleto carbosilano para bloquear
la proteína hemaglutinina (HA) del virus de la gripe.
Los glicodendrímeros también han mostrado ser
efectivos frente al VIH. Así, hay estudios que muestran que
dendrímeros polipropilenimina (PPI) funcionalizados con grupos
galactosa polisulfatados producen la inhibición del
VIH-1 de forma tan eficiente como el sulfato de
dextrano utilizado como control (cfr. R.D. Kensinger, et al.,
Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48, 1614).
Dendrímeros funcionalizados con péptidos: El uso
de dendrímeros funcionalizos en su superficie con péptidos es otra
posibilidad para abordar la síntesis de nuevos microbicidas, aunque
se han estudiado menos que el uso de glicodendrímeros o de
dendrímeros aniónicos. De tal forma que algunos estudios muestran
que dendrímeros funcionalizados con péptidos inhiben la infección
viral in vitro. Otros estudios han mostrado la potencialidad
de estos dendrímeros como vacunas (cfr. L. J. Cruz, et al.,
Bioconjug. Chem., 2004, 15, 112) indicando que estos dendrímeros
son mejores inmunógenos que otros vehículos macromoleculares
funcionalizados con los mismos péptidos.
Dendrímeros funcionalizados con aniones: Existen
varios tipos de dendrímeros o polímeros dendronizados con carga neta
negativa en la superficie, ya que muchos tipos de virus, como por
ejemplo el VIH o VHS, se unen a compuestos polianiónicos. Así,
polisacáridos sulfatados son inhibidores efectivos típicos de la
inhibición viral. Dentro de este tipo de dendrímeros polianiónicos,
se han descrito por ejemplo dendrímeros polilisina con grupos
terminales carboxilato y sulfonato que son capaces de bloquear de
forma efectiva la infección por VHS (cfr. Gong, Y. et al.
Antiviral Res, 2002, 55(2), 319-329). Los
mismos autores realizaron estudios en ratones en los que mostraron
que estos dendrímeros protegían a los animales frente a la infección
vaginal y que los derivados sulfonato eran capaces de interferir en
las etapas finales de replicación del virus en las células
infectadas.
Dendrímeros similares con un esqueleto
polilisina y grupos terminales carboxilato o sulfonato, también han
mostrado ser eficaces en la inhibición del VIH en modelos celulares
in vitro (cfr. McCarthy, TD et al. Mol Pharm. 2005
Jul-Aug; 2(4):312-8) y los
dendrímeros polianiónicos inhiben la entrada del virus en la célula,
e inhiben la actividad de dos enzimas virales, la transcriptasa
reversa y la integrasa, lo que indica que estos derivados
polianiónicos pueden actuar en diferentes ciclos replicativos del
VIH dependiendo de cómo se integren y se sitúan en la célula. Otros
estudios más recientes, muestran que dendrímeros con grupos
sulfonato protegen a macacos hembra frente a la infección vaginal
del virus de la inmunodeficiencia en simios (VIS).
En este apartado, hay que destacar el dendrímero
cargado negativamente, formulado como un gel y denominado SPL7013.
Este dendrímero ha sido desarrollado por una compañía farmacéutica
australiana y los estudios realizados in vitro e in
vivo han mostrado que es el mejor candidato para acceder al
mercado, convirtiéndose en el primer dendrímero comercial con una
aplicación biomédica definida. El SPL7013 es un dendrímero basado en
lisina con grupos ácido naftaleno disulfónico en su superficie y es
el principio activo de un gel microbicida vaginal denominado
VivaGel®. Es un potente inhibidor in vitro frente a numerosas
cepas del VIH-1. Se está utilizando en la prevención
de la transmisión vaginal del VIH y del herpes genital. Así, un
estudio desarrollado por Dezutti y colaboradores ha mostrado que una
formulación de este dendrímero (5%) tiene una toxicidad muy baja en
células epiteliales y es efectivo en la prevención de la infección
por el VIH-1 en células mononucleares de sangre
periférica (CMSP), macrófagos y en la transferencia del
VIH-1 desde las células epiteliales a las CMSP.
Estudios posteriores han mostrado que la aplicación diaria del gel
SPL7013 en proporciones de 1-3% eran bien toleradas.
Además se obtuvieron resultados similares en la prevención de la
infección por el VIH-1 en la aplicación rectal del
gel. También se han realizado estudios aplicando a nivel vaginal el
gel SPL7013 en macacos y han mostrado que no produce ningún signo de
irritación de la mucosa vaginal y que es capaz de proteger de la
infección por el VIS al 100% de los macacos si se aplica en un 5%.
También se han preparado otros dendrímeros similares al SPL7013
utilizando esqueletos tipo PAMAM y PPI, que presentaban actividades
biológicas similares, pero se han descartado para su utilización
comercial debido a las dificultades en el proceso de síntesis.
Otros dendrímeros aniónicos descritos como
agentes antivirales son: el BRI2923 que es un dendrímero de tipo
poliamidoamina (PAMAM) crecido a partir de un núcleo de amoniaco y
funcionalizado en la superficie con 24 grupos ácido naftaleno
disulfónico. El BRI6195, que también es un dendrímero tipo PAMAM,
crecido en este caso a partir de un núcleo de etilendiamina y que
está funcionalizado con 32 grupos fenildicarboxilato. Estos
dendrímeros son capaces de inhibir la replicación de diferentes
cepas del VIH en la línea celular MT-4 (cfr. Y. H.
Jiang, et al., AIDS Res. Hum. Retriviruses, 2005, 21,
207).
También se ha publicado la síntesis de
dendrímeros basados en un esqueleto conteniendo átomos de fósforo,
funcionalizados en su superficie con grupos aniónicos fosfonato
(cfr. L. Griffe, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 46,
2523). Estos dendrímeros muestran una gran actividad en la
activación y multiplicación de células natural killers (NK). Estos
datos son prometedores ya que abren la puerta a la utilización de
inmunoterapias antivirales o anticancerígenas, donde un gran número
de células NK podrían ser necesarias.
En los últimos años, también ha aparecido
descrita la síntesis de nuevos dendrímeros aniónicos, que
probablemente mostrarán nuevos avances en el campo de su utilización
como agentes terapéuticos, por ejemplo una familia de dendrímeros
aniónicos solubles en agua, capaces de unirse reversiblemente de
forma electrostática a cationes de acetilcolina o dendrímeros con
diferentes grupos aniónicos como sulfato, sulfonato o carboxilato,
utilizado el método sintético conocido como
"click-chemistry" para su funcionalización.
Por otro lado, se han descrito también
dendrímeros de estructura carbosilano de naturaleza catiónica que
pueden ser potencialmente útiles como agentes de transfección en
terapia génica, ya que presentan una toxicidad baja en las líneas
celulares en las que se han ensayado, retienen eficazmente material
genético como oligonucleótidos antisentido o siRNA e internalizan
este material en el interior de las células en porcentajes similares
e incluso en algún caso superiores a las de otros transfectantes
comerciales (cfr. N. Weber, et al., J. of Controlled Released
2008, 132, 55). Así mismo, estos dendrímeros son capaces de proteger
al material genético de la unión a proteínas séricas y actuar como
agentes terapéuticos, con capacidad antibacteriana.
La presente invención proporciona macromoléculas
altamente ramificadas sintetizadas a partir de un núcleo
polifuncional, denominadas dendrímeros, de estructura carbosilano y
funcionalizados en su periferia con grupos carboxílicos, fosfónicos
o sulfónicos, preferiblemente aniónicos que dotan a la macromolécula
de una carga neta negativa. Además, la invención proporciona un
procedimiento para su obtención y sus usos en biomedicina.
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un dendrímero carbosilano que comprende:
- un núcleo polifuncional,
- al menos una generación, y
- una capa externa, que consiste, total o
parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula
(I):
- donde:
- R' es un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}),
- \quad
- p es un número entero y varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 1, y
- \quad
- X es el siguiente grupo de fórmula (II):
- donde:
- E es un grupo enlazante situado entre el silicio de la fórmula general (I) y el nitrógeno del grupo amina,
- \quad
- z es un número entero y varía entre 1 y 4,
- \quad
- R^{1} se selecciona de un grupo de la lista que comprende -COOR^{2}, -SO_{3}R^{2} o -PO_{3}(R^{2})_{2}, y
- \quad
- R^{2} es hidrógeno o un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}).
\vskip1.000000\baselineskip
Por "dendrímero carbosilano" se refiere en
la presente invención a una macromolécula muy ramificada con forma
esférica, donde el núcleo de crecimiento del dendrímero es
polifuncional, las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento
tienen esqueleto carbosilano y la capa externa, superficie o
periferia del dendrímero incorpora grupos funcionales. Esta
superficie o periferia sería la correspondiente a las extremidades
de las ramificaciones.
Por "núcleo polifuncional" se entiende en
la presente invención a un elemento o compuesto polivalente enlazado
de la manera covalente con al menos dos ramificaciones, es decir, al
menos deberá ser divalente. Preferiblemente el núcleo es
tetravalente y más preferiblemente el núcleo es de silicio.
El término "generación" se refiere al
número de ramificaciones iterativas que son necesarias para la
preparación del dendrímero.
El término "alquilo" se refiere en la
presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que
tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo,
n-butilo, tert-butilo o
sec-butilo. Preferiblemente el grupo alquilo es un
metilo.
Por "grupo enlazante" se entiende en la
presente invención cualquier grupo que une las ramificaciones, que
su vez se encuentran unidas al núcleo, con los grupos funcionales de
la capa externa del dendrímero. El grupo enlazante E se puede
seleccionar preferiblemente entre un alquilo
(C_{1}-C_{10}) o un grupo
-(CH_{2})_{x}-R^{3}, donde R^{3}
puede ser un grupo triazol o fenol y x es un número entero que varia
entre 1 y 6.
En una realización preferida el grupo enlazante
(E) es un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}) según se
describe anteriormente, más preferiblemente E es un propilo.
En otra realización preferida el grupo enlazante
(E) es el grupo -(CH_{2})_{x}-R^{3} y
R^{3} es triazol, más preferiblemente x es 4.
En otra realización preferida el grupo enlazante
(E) es el grupo -(CH_{2})_{x}-R^{3} y
R^{3} es fenol, más preferiblemente x es 1.
Cuando R^{1} es el grupo -COOR^{2} o el
grupo -SO_{3}R^{2}, preferiblemente R^{2} es hidrógeno o
metilo y más preferiblemente z es 2.
Cuando R^{1} es el grupo
-PO_{3}(R^{2})_{2}, preferiblemente R^{2} es
hidrógeno o metilo y más preferiblemente z es 1.
El dendrímero de la presente invención además
puede ser aniónico, formando los grupos carboxilato, fosfonato o
sulfonato.
Por lo tanto, la presente invención no solo
incluye los dendrímeros por si mismos, sino cualquiera de sus sales,
por ejemplo, sales de metal alcalino ó metal alcalinotérreo, que se
pueden seleccionar entre sales de sodio, potasio ó calcio,
preferiblemente las sales son de sodio.
En otra realización preferida el dendrímero es
al menos de primera generación, y se puede representar con la
siguiente fórmula (III):
- donde:
- R_{a} es un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}); y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida, el dendrímero es
al menos de segunda generación y se puede representar con la
siguiente fórmula (IV):
- donde:
- R_{a}, R_{b} y R'', son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C_{1}-C_{6});
- \quad
- m es un valor entero y tiene un valor de 1 a 3, más preferiblemente m es 2; y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida, el dendrímero es
al menos de tercera generación y se puede representar con la
siguiente fórmula (V):
- donde:
- R_{a}, R_{b}, R_{c}, R'' y R''', son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C_{1}-C_{6});
- \quad
- m y n son iguales o diferentes y tienen un valor de 1 a 3, preferiblemente m y/o n es 2; y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula (I) según se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos dendrímeros de al menos primera,
segunda y tercera generación los radicales R_{a}, R_{b} o
R_{c}, pueden ser iguales o diferentes, y preferiblemente
representan un grupo alquilo (C_{2}-C_{4}). Más
preferiblemente R'' y/o R''' representa un grupo alquilo
(C_{1}-C_{4}) y aún más preferiblemente R'' y/o
R''' son un grupo metilo.
Esta familia de dendrímeros de naturaleza
carbosilano que se describe puede ser preparada siguiendo un
procedimiento de síntesis divergente (crecimiento desde dentro hacia
fuera), a partir de un núcleo polivalente, preferiblemente de
silicio tetraalilo y posterior funcionalización de la superficie con
diferentes grupos funcionales, preferiblemente aniónicos.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere a un procedimiento de obtención de los dendrímeros según
se han descrito anteriormente, que comprende la síntesis de
dendrímeros con terminaciones -NH_{2} y posterior funcionalización
de estos grupos amino terminales con grupos carboxílicos, sulfónicos
o fosfóricos. Un esquema podría ser el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Donde: E, z y R^{1} se han descrito
anteriormente,
n representa el número de generaciones (G) y m
el número de grupos terminales, que va a depender del número de
generaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida del procedimiento
de obtención de los dendrímeros de la invención, los dendrímeros con
terminaciones -NH_{2} se pueden obtener mediante la
hidrosililación de alilamina sobre dendrímeros carbosilano de
diferentes generaciones con enlaces terminales
Si-H.
En otra realización preferida del procedimiento
de obtención de los dendrímeros de la invención, los dendrímeros con
terminaciones -NH_{2} se pueden obtener mediante la metodología
"click chemistry" para la unión de propargilamina en
dendrímeros carbosilanos sobre dendrímeros carbosilanos de
diferentes generaciones funcionalizados con grupos azida
terminales.
Sin embargo, la funcionalización de las
terminaciones aminas con los grupos carboxílicos, sulfónicos o
fosfóricos puede ser anterior a su unión a las superficies de los
esqueletos de los dendrímeros.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere a un procedimiento de obtención de los dendrímeros de la
invención, que comprende la funcionalización inicial de aminas
orgánicas con los grupos carboxílicos, sulfónicos o fosfóricos o sus
grupos precursores, y su posterior unión a dendrímeros carbosilano
de diferentes generaciones con enlaces terminales
Si-H o funcionalizados con grupos azida
terminales.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un compuesto de fórmula (VI):
- donde:
- Et es un grupo etilo y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula (I) según se ha descrito anteriormente o un grupo -(R')_{3-p}Si-[(CH_{2})_{4}-N_{3}]_{p}, donde R' es un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}), y p varía entre 1 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, otros intermedios de reacción pueden
ser los dendrímeros carbosilano funcionalizados con grupos azida
terminales que comprende:
- un núcleo polifuncional, preferiblemente de
silicio tetraalilo,
- al menos una generación, y
\newpage
- una capa externa, que consiste, total o
parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula
(VII):
- donde:
- R' y p se han descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los dendrímeros de la invención pueden tener
aplicación en diferentes campos de la biomedicina, entre los que
cabe destacar su utilización como agentes terapéuticos, antivirales,
antibacterianos o antipriónicos. Además de su actividad microbicida,
también tienen actividad antiinflamatoria, haciendo que mejore sus
propiedades profilácticas puesto que la probabilidad de infección
frente al VIH aumentan significativamente en presencia de procesos
inflamatorios. Está claro que un buen microbicida tópico vaginal
debe prevenir de la infección por el VIH y mantener íntegra la
barrera vaginal epitelial. En este sentido un proceso de inflamación
vaginal podría aumentar la infección por el VIH al activar a las
células dendríticas y reclutar células T (dianas del VIH) al sitio
de la inflamación incrementando el riesgo de la infección por el VIH
y activando el proceso de transcripción vía citoquinas, regulando el
factor de transcripción NF-kappaB que a su vez une y
activa el promotor del VIH. El factor de transcripción
NF-kappaB es una de las mayores dianas
farmacológicas para los compuestos antiinflamatorios. La propiedad
antiinflamatoria de los dendrímeros de la invención es una ventaja
adicional con respecto a otros dendrímeros con actividad
antivirales, antibacterianos o antipriónicos conocidos en el estado
de técnica.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
se refiere a los dendrímeros como medicamento per se. Siendo
este medicamento preferiblemente para la prevención y/o el
tratamiento de enfermedades causadas por virus, bacterias u hongos.
Y más preferiblemente cuando la enfermedad es causada por cepas del
VIH.
Como antiviral, el dendrímero de la invención,
de tamaño nanoscópico, impide el correcto proceso de adhesión a la
célula diana, así como la infección de esta y su correspondiente
producción de nuevas partículas virales.
Además de esta aplicación profiláctica, debido a
los resultados obtenidos en los experimentos, también los
dendrímeros de la invención tienen efecto terapéutico, ya que en
pacientes infectados por el VIH esta nanopartícula podría impedir la
infección de células aún no infectadas, sobre todo tienen efecto
terapéutico para las enfermedades de transmisión sexual (ETS)
(antiviral, antibacteriano o antifúngico).
Por "enfermedad de transmisión sexual" se
entiende en la presente invención a infecciones que se adquieren por
tener relaciones sexuales con alguien que esté infectado, y dicha
infección puede ser causada por bacterias, hongos, protozoos o
virus, por ejemplo la infección causada por el VIH. La gran mayoría
de las infecciones por el VIH ocurren debido a la carencia de
protección cuando se mantienen relaciones sexuales con una persona
seropositiva.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende al menos un dendrímero
según se ha descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Además, esta composición farmacéutica puede comprende
otro principio activo.
Los "vehículos farmacéuticamente
aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son
los vehículos conocidos por un experto en la materia.
Como ejemplos de preparaciones farmacéuticas se
incluye cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras,
cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (geles, soluciones, suspensiones
o emulsiones) para administración oral, nasal, tópica o parenteral,
preferiblemente la administración será tópica.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método de tratamiento o prevención de enfermedades
causadas por virus, bacterias u hongos en un mamífero,
preferiblemente un humano, que comprende la administración de una
cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende
al menos un dendrímero de la invención. Preferiblemente la
administración de la composición se puede realizar por vía oral,
nasal, tópica o parenteral.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de la composición calculada para producir el efecto deseado
y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las
características propias de la composición, la edad, estado y
antecedentes del paciente, la severidad de la enfermedad, y de la
ruta y frecuencia de administración.
También es posible el uso de los dendrímeros de
la invención como vehículos de transporte de moléculas,
preferiblemente moléculas con actividad farmacológica (principios
activos), y más preferiblemente moléculas con carga positiva.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura. 1. Muestra la viabilidad de las tres
generaciones de dendrímeros aniónicos con terminaciones carboxilato
(G1COO8, G2COO16 y G3COO32) y sulfonato (G1SF8, G2SF16 y G3SF32) a
una concentración de 10 \muM en HEC-1A (células
epiteliales de endometrio humano). Figura 1A, ensayo de LDH
(Liberación de Lactato DesHidrogenasa). El Tx-100
(triton x-100) al 1% representa el 100% de
toxicidad. Figura 1B, ensayo de MTT Bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol.
El DMSO al 20% representa el 100% de toxicidad. Dx (Dextrano) se
utiliza como control de molécula inocua, DxS (Dextrano Sulfonato) y
Suramin son moléculas con grupos sulfonato utilizadas como control
positivo de inhibición del VIH.
Figura 2. Muestra la viabilidad de las CMSP en
presencia de distintas concentraciones de G2COO16 y G2SF16. Figura
2A, ensayo de LDH y Figura 2B, ensayo de MTT.
Figura 3. Muestra la toxicidad del dendrímero
G2SF16 sobre eritrocitos de sangre humana (liberación de hemoglobina
al sobrenadante).
Figura 4. Representa un ensayo
linfoproliferativo de 4 días en CMSP. Se estimulan las CMSP con 2
\mug/mL de PHA (fitohemaglutinina purificada). En la Figura 4A se
muestra que el dendrímero G2SF16 no tiene efecto mitogénico. En la
Figura 4B, se muestra que el dendrímero G2SF16 inhibe el efecto
mitogénico de la PHA en las CMSP.
Figura 5. Representa un ensayo de adsorción de
las partículas virales a la monocapa de células epiteliales en
presencia de un pretratamiento con los dendrímeros, G2SF16 y
G2COO16, a distintos tiempos. Se evalúa la cantidad de VIH
realizando un inmunoensayo enzimático para la cuantificación del
Agp24 en el sobrenadante del cultivo (ELISA p24). Tras 24 horas de
infección (Figura 5A) y tras 72 horas de infección (Figura 5B).
Figura 6. Muestra un ensayo de internalización
de las partículas virales por la línea celular
HEC-1A. Se pretrataron las células durante 1 h con
los dendrímeros antes de infectarlas con el aislado X4 VIH NL4.3
durante 3 h. Tras la infección se lisaron las HEC-1A
con TX-100 al 0.2% para cuantificar las partículas
virales en el interior
celular.
celular.
Figura 7. Muestra el mecanismo de interacción
entre los dendrímeros y las partículas virales. Las cepas X4 VIH
NL4.3 y R5 VIH Bal fueron pretratadas con los dendrímeros antes de
exponerse a las CMSP. El sobrenadante viral se recogió a los 4
días.
Figura 8. Muestra la inhibición de la
transcitosis en HEC-1A. Se evaluó la cantidad de
Agp24 en el sobrenadante basolateral de los dispositivos de
transwell utilizados para simular una monocapa de la mucosa
vaginal.
Figura 9. Muestra la evaluación del efecto
profiláctico y terapéutico del dendrímero G2SF16 en CMSP. Se
trataron las CMSP a distintos tiempos antes y después de ser
infectadas por el VIH para analizar la actividad del dendrímero
G2SF16. T-20 es un inhibidor de fusión de la
membrana viral con la membrana celular a través de la proteína gp41,
inhibe la entrada del virus en la célula y el AZT es un inhibidor de
la transcriptasa inversa. En resumen ambos inhibidores de la
replicación viral y se utilizan como controles para ver que inhiben
la replicación del virus. La Figura 9A es pretratamiento, es decir,
primero se añade el dendrímero y después se infecta; la Figura 9B es
posttratamiento, es decir primero se infecta y luego se añade el
virus.
Figura 10. Muestra la inhibición de la entrada
del VIH en células dendríticas y macrófagos. Se pretrataron las
células durante 1 h con el dendrímero G2SF16. Se infectaron con las
cepas X4 VIH NL4.3(columnas negras) y R5 VIH Bal (columnas
grises).
Figura 11. Muestra el efecto bactericida de los
dendrímeros aniónicos de estructura carbosilano. Representación del
efecto dependiente de la concentración de ampicilina y los
dendrímeros G2COO16 y G2SF16 a las 24 h
post-tratamiento de S. aureus. La pendiente
del triángulo representa la disminución de la concentración de
antibiótico (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 \mug/mL) o
dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 \muM). La barra gris
representa el dendrímero a 10 \muM.
Figura 12. Muestra el efecto bacterioestático de
los dendrímeros aniónicos de estructura carbosilano. Representación
del efecto dependiente de la concentración de ampicilina y los
dendrímeros G2COO16 y G2SF16 a las 24 h
post-tratamiento de S. aureus. La pendiente
del triángulo representa la disminución de la concentración de
antibiótico (2; 1; 0.5; 0.25; 1.12; 0.6; 0.3; 0.15 \mug/mL) o
dendrímero (160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5; 1.25 \muM). La barra gris
representa el dendrímero a 10 \muM.
Figura 13. Muestra los estudio de
biocompatibilidad y efecto inhibidor de la entrada de VIH de
dendrímeros click. La Figura 13A representa una curva de toxicidad
de los dendrímeros en HEC-1A. La Figura 13B muestra
la inhibición de la entrada del VIH en células
HEC-1A tras pretratarlas con los dendrímeros
G2CKC0016 y G2CKP32 1 h antes de la infección.
Figura 14. Muestra el estudio de la inhibición
del TNF-alpha (TNF) en linfocitos T. Transfección de
células Jurkat con el plásmido pTNF-luc, en
presencia de G2SF16. aTNF es
anti-TNF-alpha.
Figura 15. Muestra la transfección de células
Jurkat con el plásmido pNF-kB-luc,
en presencia de G2SF16.
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A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la efectividad de los dendrímeros carbosilano y sus
procedimientos de síntesis.
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Se llevaron a cabo mediante dos métodos que a
continuación se detallan:
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Método
1
La síntesis de dendrímeros de estructura
carbosilano con grupos amina terminales se llevó a cabo de dos
maneras diferentes: a) hidrosililación de alilamina sobre
dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con enlaces
terminales Si-H, o b) utilización de la metodología
click chemistry para la unión de propargilamina sobre
dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con
funcionalidades azida terminales.
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Método
1(a)
En general, para simplificar la forma de nombrar
los dendrímeros que se describen en estos ejemplos se pueden
representar como G n -(Fp)x,
donde:
n indica el número de la
generación G.
F, indica la naturaleza de los grupos
funcionales situados en la periferia del dendrímero.
p indica el número de grupos funcionales
en cada rama.
x denota el número de unidades
terminales presentes en el dendrímero.
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Se prepararon dendrímeros aniónicos siguiendo
esta ruta sintética que parte de dendrímeros carbosilano con grupos
amino terminales
nG-[Si(CH_{2})_{3}NH_{2}]_{x} (n
= 0 (trietil sililo), x = 1 (1); n = 1, x = 4
(2); n = 2, x = 8 (3); n = 3, x = 16
(4)). Estos dendrímeros de diferentes generaciones se pueden
preparar siguiendo reacciones descritas en la bibliografía a través
de procedimientos divergentes (M. Ángeles
Muñoz-Fernández et al.
"Water-Soluble Carbosilane Dendrimers: Synthesis,
Biocompatibility and Complexation with Oligonucleotides; evaluation
for Medical Applications" Chem. Eur. J,. 2007, 13,
483-495). A partir de estos compuestos, la obtención
de dendrímeros aniónicos con grupos carboxilato, sulfonato o
fosfonato se produce finalmente siguiendo los procedimientos que se
describen a continuación.
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Método 1(a) para
dendrímeros
carboxilato
La síntesis de dendrímeros carboxilato aniónicos
de diferentes generaciones se realizó a través de una reacción de
adición de Michael de acrilato de metilo sobre los dendrímeros
terminados en grupos -NH_{2}, 1-4, descritos
anteriormente. Las condiciones de reacción se describen en el
esquema 1 y de esta forma se obtienen los dendrímeros
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (5); n = 1,
x = 4 (6); n = 2, x = 8 (7); n = 3,
x = 16 (8)) como aceites incoloros solubles en disolventes
orgánicos de uso común, pero insolubles en agua. Estructuras de los
dendrímeros
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silane), x = 1 (5); n = 1, x = 4 (6); n = 2, x = 8
(7); n = 3, x = 16 (8)):
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\vskip1.000000\baselineskip
Los derivados 5-8, se pueden
transformar en los correspondientes derivados carboxilato aniónicos
por tratamiento con NaOH, dando lugar a los compuestos
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (9); n = 1,
x = 4 (10); n = 2, x = 8 (11); n = 3,
x = 16 (12)), que se aíslan como sólidos blancos solubles en
agua con rendimiento elevado (esquema 1). Adicionalmente, el
tratamiento de los compuestos 9-12 con una
disolución acuosa de HCl 1M conduce a los derivados catiónicos
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N^{+}H(CH_{2}CH_{2}COOH)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (13); n = 1,
x = 4 (14); n = 2, x = 8 (15); n = 3,
x = 16 (16)) (esquema 1).
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Esquema
1
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Los derivados 13-16 también se
convierten a través de un proceso reversible en los dendrímeros
aniónicos 9-12 por tratamiento con una disolución de
NaOH, quienes revierten a los primeros si se tratan nuevamente con
una disolución acuosa de HCl 1M (esquema 1).
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Las estructuras de los dendrímeros carboxilato
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (9); n = 1, x = 4 (10); n = 2, x = 8
(11); n = 3, x = 16 (12)):
Obteniéndose también los siguientes dendrímeros
de estructuras
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N^{+}H(CH_{2}CH_{2}COOH)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (13); n = 1, x = 4 (14); n = 2, x = 8
(15); n = 3, x = 16 (16)), son estructuras similares a las de los
dendrímeros 5 a 8, tal y como se deriva del esquema 1, así por
ejemplo los dendrímeros 13 y 14 serían:
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Método 1(a) para
dendrímeros
sulfonato
La síntesis de dendrímeros aniónicos de
diferentes generaciones con grupos terminales de naturaleza
sulfonato, se ha realizado a través de una reacción de adición de
Michael de vinil sulfonato de sodio sobre los dendrímeros terminados
en grupos -NH_{2}, 1- 4. La reacción se lleva a cabo en una mezcla
de etanol-agua, calentando a 120ºC, obteniéndose los
derivados aniónicos
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}SO_{3}Na)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (17); n = 1,
x = 4 (18); n = 2, x = 8 (19); n = 3,
x = 16 (20)), como sólidos blancos solubles en agua con un
rendimiento elevado y se pueden almacenar durante largos periodos
de tiempo sin mostrar signos de descomposición. (Esquema 2).
\newpage
Esquema
2
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\vskip1.000000\baselineskip
Al igual que en los derivados carboxilato, los
dendrímeros aniónicos 17-20, se pueden protonar por
tratamiento con un exceso de una disolución de HCl 1M en agua,
obteniéndose los dendrímeros catiónicos
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N^{+}H(CH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+})_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (21); n = 1,
x = 4 (22); n = 2, x = 8 (23); n = 3,
x = 16 (24)), quienes de nuevo pueden revertir a los primeros
por tratamiento con una disolución de NaOH (esquema 2).
Los dendrímeros de estructura
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N^{+}H(CH_{2}CH_{2}
SO_{3}^{-}Na^{+})_{2}]_{x} (n = 0 (trietil
sililo), x = 1 (21); n = 1, x = 4 (22); n = 2, x = 8 (23); n = 3, x
= 16 (24)) serán estructuralmente similares a los carboxilato
descritos anteriormente.
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Método 1(a) para
dendrímeros
fosfonato
La síntesis de dendrímeros aniónicos con grupos
fosfonato en la periferia no se puede obtener a partir de
dendrímeros carbosilano con grupos -NH_{2} terminales preparados
por hidrosililación con alilamina, ya que la reacción de estos
derivados con formaldehído y fosfito de dimetilo,
HPO(OMe)_{2}, no conduce a la funcionalización de
los sistemas dendríticos con grupos fosfonato.
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Método
1(b)
Esta ruta sintética conlleva inicialmente la
preparación de dendrímeros carbosilano, crecidos a partir de un
núcleo de silicio tetraalilo, con grupos azida terminales. La
preparación de estos derivados azida se ha llevado a cabo a partir
de dendrímeros conteniendo enlaces terminales Si-H,
del tipo Gn-[Si-H]_{x}^{33}, en dos
etapas (esquema 3). Primero la reacción de hidrosililación de
nG-[Si-H]_{x} con
4-bromobuteno conduce a dendrímeros carbosilano de
diferentes generaciones con grupos -CH_{2}Br terminales,
Gn-[Si-CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (25); n = 1,
x = 4 (26); n = 2, x = 8 (27); n = 3,
x = 16 (28)). La posterior reacción de los derivados
25-28 con azida de sodio da lugar a los dendrímeros
de estructura carbosilano con grupos azida terminales
Gn-[Si-CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (29); n = 1,
x = 4 (30); n = 2, x = 8 (31); n = 3,
x = 16 (32)) (ver esquema 3).
\newpage
Esquema
3
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\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos 25 a 32 son sólidos aceitosos
estables al aire y a la humedad, solubles en la mayoría de los
disolventes orgánicos de uso común y pueden ser almacenados sin
descomposición durante largos periodos de tiempo. Los dendrímeros de
estructura:
Gn-[Si-CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (25); n = 1,
x = 4 (26); n = 2, x = 8 (27); n = 3,
x = 16 (28))
Y los dendrímeros con estructura:
Gn-[Si(CH_{2})_{4}N_{3}]_{x} (n = 0
(trietil sililo), x = 1 (29); n = 1, x = 4 (30); n = 2, x = 8 (31);
n = 3, x = 16 (32)):
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Una vez preparados los dendrímeros con grupos
azida terminales, la síntesis de dendrímeros con grupos amino
(-NH_{2}) en la superficie se produce por una reacción de tipo
click chemistry, entre los compuestos 29-32 y
propargil amina, dando lugar a los derivados
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}NH_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (33); n = 1,
x = 4 (34); n = 2, x = 8 (35); n = 3,
x = 16 (36)) (ver esquema 4).
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Esquema
4
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\vskip1.000000\baselineskip
En general los dendrímeros que se describen a
continuación se pueden simplificar, representándolos como
ck -G n -(Fp)x,
donde:
ck indica que se trata de
dendrímeros obtenidos por acoplamiento click entre un grupo
azida y un triple enlace carbono carbono.
n indica el número de la
generación G.
F, indica la naturaleza de los grupos
funcionales situados en la periferia del dendrímero.
p indica el número de grupos funcionales
en cada rama.
x denota el número de unidades
terminales presentes en el dendrímero.
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La preparación de dendrímeros aniónicos
siguiendo esta ruta sintética parte de los dendrímeros carbosilano
con grupos amino terminales
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}NH_{2}]_{x},
(33) a (36). Estructuras de los dendrímeros
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}NH_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (33); n = 1, x = 4 (34); n = 2, x = 8
(35); n = 3, x = 16 (36))
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estos compuestos, la obtención de
dendrímeros aniónicos con grupos por ejemplo carboxilato,sulfonato o
fosfonato se produce finalmente siguiendo procedimientos análogos a
los descritos en la sección anterior para los dendrímeros con grupos
-NH_{2} terminales obtenidos a partir de la hidrosililación de
alilamina. Así hemos obtenido las familias de compuestos que se
describen a continuación
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Método 1(b) para
dendrímeros aniónicos con grupos
carboxilato
La reacción de adición de Michael de acrilato de
metilo sobre los dendrímeros terminados en grupos -NH_{2},
33-36, utilizando las condiciones de reacción
descritas en el esquema 5 permiten obtener los dendrímeros
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (37); n = 1,
x = 4 (38); n = 2, x = 8 (39); n = 3,
x = 16 (40)) como aceites incoloros solubles en disolventes
orgánicos de uso común, pero insolubles en agua.
\newpage
Los dendrímeros del 37 al 40 tienen las
estructuras:
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (37); n = 1, x = 4 (38); n = 2, x =
8 (39); n = 3, x = 16 (40)):
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Los derivados 37-40, se pueden
transformar en los correspondientes derivados aniónicos carboxilato
por tratamiento con NaOH, dando lugar a los compuestos
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (41); n = 1,
x = 4 (42); n = 2, x = 8 (43); n = 3,
x = 16 (44)), que se aíslan como sólidos blancos solubles en
agua con rendimiento elevado (esquema 5).
Los dendrímeros con estructura:
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (41); n = 1, x = 4 (42); n = 2, x = 8
(43); n = 3, x = 16 (44)):
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Método 1(b) para
dendrímeros aniónicos con grupos
sulfonato
La adición de Michael de vinil sulfonato de
sodio sobre los dendrímeros terminados en grupos -NH_{2},
33-36, en una mezcla de etanol-agua
a 120ºC, da lugar a los derivados aniónicos
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}SO_{3}Na)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (45); n = 1, x = 4 (46); n = 2, x = 8 (47); n = 3, x = 16 (48)), como sólidos blancos solubles en agua con un rendimiento elevado y se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo sin mostrar signos de descomposición. (esquema 6).
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (45); n = 1, x = 4 (46); n = 2, x = 8 (47); n = 3, x = 16 (48)), como sólidos blancos solubles en agua con un rendimiento elevado y se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo sin mostrar signos de descomposición. (esquema 6).
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Esquema
6
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\newpage
Los dendrímeros con estructura:
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}SO_{3}Na)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (45); n = 1, x = 4 (46); n = 2, x = 8
(47); n = 3, x = 16 (48))
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Método 1(b) para
dendrímeros aniónicos con grupos
fosfonato
Los dendrímeros terminados en grupos -NH_{2},
33-36, reaccionan con formaldehído en THF durante 1
hora a temperatura ambiente, a continuación "in situ" se
añade fosfito de metilo, HPO(OMe)_{2,} y se calienta
la mezcla a 40ºC durante 3 horas, dando lugar a los derivados
aniónicos
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}PO(OMe)_{2})_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (49); n = 1,
x = 4 (50); n = 2, x = 8 (51); n = 3,
x = 16 (52)), como aceites incoloros con un rendimiento
elevado y se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo sin
mostrar signos de descomposición. (esquema 7). Tienen como
estructura estos dendrímeros:
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}PO(OMe)_{2})_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (49); n = 1, x = 4 (50); n = 2, x = 8
(51); n = 3, x = 16 (52)):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los derivados 49-52, se pueden
transformar en dendrímeros carbosilano aniónicos con grupos
fosfonato terminales
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}PO(ONa)_{2})_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (53); n = 1,
x = 4 (54); n = 2, x = 8 (55); n = 3,
x = 16 (56)) (Esquema 7), por tratamiento con NaOH
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
7
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Estos dendrímeros se aíslan como sólidos blancos
solubles en agua y se pueden almacenar durante largos periodos de
tiempo sin mostrar signos de descomposición. Y tienen como
estructura:
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Método
2
Para llevar a cabo la síntesis de estos
compuestos, se ha llevado a cabo inicialmente la funcionalización de
una serie de aminas orgánicas, alifáticas y aromáticas, con grupos
aniónicos o precursores de grupos aniónicos. Estas aminas, disponen
además de otro grupo funcional que va a permitir su anclaje a un
dendrímero de estructura carbosilano a través de los grupos
terminales de este:
Se sintetizaron derivados alilo que contienen
grupos carboxilato (A), sulfonato (B) o fosfonato (C) que se podrían
utilizar para su anclaje a un dendrímero carbosilano a través de una
reacción de hidrosililación con dendrímeros que contengan enlaces
Si-H terminales, del tipo G_{n}-(SiH)_{x}
(n = 0 (trietil silano), 1, 2, 3; x = 1, 4, 8 y 16).
Otra familia de compuestos sintetizada, deriva
de la funcionalización de propargil amina con grupos carboxilato
(D), sulfonato (E) o fosfonato (F). En este caso, la presencia del
triple enlace carbono-carbono presente en estos
derivados permite su unión a dendrímeros carbosilano con grupos
azida terminales, del tipo
Gn-[Si-CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}]_{x},
a través de una reacción de acoplamiento click entre el derivado propargilo y el grupo azida del dendrímero.
a través de una reacción de acoplamiento click entre el derivado propargilo y el grupo azida del dendrímero.
Un tercer tipo de compuestos preparados son
aquellos obtenidos a partir de la funcionalización del grupo
-NH_{2} de 4-amino fenol con derivados carboxilato
(G), o fosfonato (H). En este caso, la unión de estos compuestos a
dendrímeros carbosilano se realiza a través de una reacción de
fenólisis de dendrímeros que contienen enlaces terminales
Si-Cl ó SiCH_{2}-Cl (esquema
10).
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Método 2(a).
Funcionalización de
alilamina
La síntesis de los compuestos
A-B, se ha realizado a través de una reacción de
adición de Michael de alilamina con acrilato de metilo, y vinil
sulfonato de sodio respectivamente. En la síntesis del derivado A,
la adición de Michael se completa en THF a temperatura ambiente y en
tan sólo 3 horas. El derivado B se prepara a través de una adición
de Michael de vinil sulfonato de sodio sobre alilamina. En este caso
la reacción se lleva a cabo en H_{2}O como disolvente, a 120ºC y
durante 48 horas. En el caso del derivado C, su preparación se lleva
a cabo en una reacción en dos pasos, a partir de alilamina.
Inicialmente se hace reaccionar alilamina con formaldehído en THF
durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación "in
situ" se añade fosfito de dimetilo y se calienta la mezcla a
40ºC durante 3 horas, dando lugar al derivado C como un aceite
incoloro.
Una vez obtenidos los derivados alilo
A-C, la reacción de hidrosililación de estos
derivados con dendrímeros carbosilano crecidos a partir de un núcleo
de silicio tetraalilo con enlaces terminales Si-H,
de generaciones 1 a 3, del tipo Gn-(SiH)_{x} (n = 0
(trietil silano), 1, 2, 3; x = 1, 4, 8 y 16) da lugar a la síntesis
de los dendrímeros carbosilano funcionalizados con grupos acrilato
de metilo, 5-8, o sulfonato de sodio,
17-20, que ya han sido descritos en el apartado
anterior (ver esquema 8).
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Esquema
8
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Los derivados 5-8 se pueden
transformar en los dendrímeros aniónicos correspondientes, con
grupos carboxilato, 9-12, por tratamiento con una
disolución de NaOH (ver esquema 1).
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Método 2(b).
Funcionalización de propargil
amina
La síntesis de los compuestos D y E, se ha
realizado a través de una reacción de adición de Michael de
propargilamina con acrilato de metilo, y vinil sulfonato de sodio
respectivamente. En la síntesis del derivado D, la adición de
Michael se completa en THF a temperatura ambiente y en tan sólo 3
horas. El derivado E se prepara a través de una adición de Michael
de vinil sulfonato de sodio sobre propargilamina. En este caso la
reacción se lleva a cabo en H_{2}O como disolvente, a 120ºC y
durante 48 horas. En el caso del derivado F, su preparación se lleva
a cabo en una reacción en dos pasos, a partir de propargilamina.
Inicialmente se hace reaccionar propargilamina con formaldehído en
THF durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación "in
situ" se añade fosfito de dimetilo y se calienta la mezcla a
40ºC durante 3 horas, dando lugar al derivado F como un aceite
incoloro.
Una vez obtenidos los derivados
D-F, la reacción de acoplamiento click de
estos derivados con dendrímeros carbosilano crecidos a partir de un
núcleo de silicio tetraalilo con grupos terminales azida, de
generaciones 1 a 3, del tipo
Gn-[Si-CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (29); n = 1,
x = 4 (30); n = 2, x = 8 (31); n = 3,
x = 16 (32)) da lugar a la síntesis de los dendrímeros
carbosilano funcionalizados con grupos ester, 37-40,
sulfonato de sodio, 45-48 o grupos fosfonato de
metilo
ck-Gn-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}PO(OMe)_{2})_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (49); n = 1,
x = 4 (50); n = 2, x = 8 (51); n = 3,
x = 16 (52)). (Esquema 9)
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Esquema
9
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Estos dendrímeros con grupos carboxilato,
sulfonato o fosfonato ya han sido descritos anteriormente en la
presente invención.
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Método 2(c),
Funcionalización de
4-aminofenol
La síntesis del compuesto G se ha realizado a
través de una reacción de adición de Michael de acrilato de metilo
sobre 4-amino fenol. Este derivado se encuentra
descrito en la bibliografía. El derivado H se prepara a partir de
una reacción en dos pasos, a partir de 4-aminofenol.
Inicialmente se hace reaccionar 4-aminofenol con
formaldehído en THF durante 1 hora a temperatura ambiente y a
continuación "in situ" se añade fosfonato de dimetilo y
se calienta la mezcla a 40ºC durante 3 horas, dando lugar al
derivado H como un aceite incoloro.
Una vez obtenidos los derivados G y H, la
reacción de fenolisis de estos derivados con dendrímeros carbosilano
crecidos a partir de un núcleo de silicio tetraalilo con grupos
terminales Si-Cl o Si-CH_{2}Cl, de
generaciones 1 a 3, da lugar a la síntesis de los dendrímeros
carbosilano funcionalizados con grupos acrilato de metilo,
Gn-[SiCH_{2}-OC_{6}H_{4}-N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (57); n = 1,
x = 4 (58); n = 2, x = 8 (59); n = 3,
x = 16 (60)), o grupos fosfonato de metilo
Gn-[SiCH_{2}-OC_{6}H_{4}-N(CH_{2}PO(OMe)_{2})_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (61); n = 1,
x = 4 (62); n = 2, x = 8 (63); n = 3,
x = 16 (64)), esquema 10. Los compuestos
57-64 se obtienen como aceites incoloros solubles en
la mayoría de los disolventes orgánicos de uso común, pero
insolubles en agua.
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Esquema
10
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Estos dendrímeros han sido caracterizados por
análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno, resonancia
magnética nuclear de ^{1}H, ^{13}C, ^{29}Si y ^{31}P, y
espectrometría de masas. Los datos analíticos y espectroscópicos
obtenidos están de acuerdo con las estructuras propuestas.
Gn-[SiCH_{2}-OC_{6}H_{4}-N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil sililo), x = 1 (57); n = 1,
x = 4 (58); n = 2, x = 8 (59); n = 3,
x = 16 (60))
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Y las estructuras de los dendrímeros
Gn-[SiCH_{2}-OC_{6}H_{4}-N(CH_{2}PO(OMe)_{2})_{2}]_{x}
(n = 0 (trietil silano), x = 1 (61); n = 1,
x = 4 (62); n = 2, x = 8 (63); n = 3,
x = 16 (64)):
Los dendrímeros descritos en el apartado
anterior fueron caracterizados por análisis elemental de carbono,
hidrógeno y nitrógeno, resonancia magnética nuclear de ^{1}H,
^{13}C, ^{29}Si y ^{31}P, y espectrometría de masas. Los datos
analíticos y espectroscópicos obtenidos están de acuerdo con las
estructuras propuestas para estos derivados.
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Método
1
Sobre una disolución en MeOH del compuesto
G_{1}-[(CH_{2})_{3}NH_{2}]_{4} (0.88 g, 1.34
mmol), preparado como se describe en la bibliografía (S.W. Krska, D.
Seyferth, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 3604-3612),
se añade el reactivo comercial CH_{2}=CHCOOMe (1.0 ml, 11.1 mmol).
La mezcla así preparada se mantiene a temperatura ambiente y con
agitación constante durante 12 h, tras las cuales se elimina el
disolvente a vacío. De este modo se obtiene el compuesto 6 como un
aceite incoloro (1.79 g, 99%).
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Método
2
Sobre una disolución en tolueno del dendrímero
G_{1}-[Si-H]_{4} (0.24 g, 0.05 mmol), se
añade el derivado
CH_{2}=CHCH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2} (0.5 g, 2.18 mmol) y una gota de una disolución de catalizador de Karsted [(3-3.5% en Pt) en poli(dimetilsiloxano)]. La mezcla así preparada se mantiene con agitación constante a temperatura ambiente durante 12 h, tras las cuales se elimina el disolvente por evaporación a vacío. De este modo se obtiene el compuesto 6 (0.58 g, 80%).
CH_{2}=CHCH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COOMe)_{2} (0.5 g, 2.18 mmol) y una gota de una disolución de catalizador de Karsted [(3-3.5% en Pt) en poli(dimetilsiloxano)]. La mezcla así preparada se mantiene con agitación constante a temperatura ambiente durante 12 h, tras las cuales se elimina el disolvente por evaporación a vacío. De este modo se obtiene el compuesto 6 (0.58 g, 80%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.64 (s, 24H, -OMe), 2.75 (t, 16H,
-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 2.42 (m, 16H,
-NCH_{2}CH_{2}COOMe y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-),
1.32 (m, 16H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 0.54 (m, 24H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 0.37 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -0.06 (s, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 173.0
(COOMe), 57.5 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 51.5 (-OMe), 49.3 (-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 32.4 (-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 21.6
(-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.3, 18.5, 18.0 (Si(CH_{2})_{3}Si-), 13.0 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.3 (-SiMe_{2}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 0.8 (G_{0}-Si), 1.9 (G_{1}-Si). Análisis elemental C_{64}H_{128}N_{4}O_{16}Si_{5}: Calc. %: C, 56.93; H, 9.56; N, 4.15; Exp. %: C 57.09; H, 10.06; N, 4.34. GPC: PDI exp = 1.04.
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 0.37 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -0.06 (s, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 173.0
(COOMe), 57.5 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 51.5 (-OMe), 49.3 (-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 32.4 (-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 21.6
(-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.3, 18.5, 18.0 (Si(CH_{2})_{3}Si-), 13.0 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.3 (-SiMe_{2}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 0.8 (G_{0}-Si), 1.9 (G_{1}-Si). Análisis elemental C_{64}H_{128}N_{4}O_{16}Si_{5}: Calc. %: C, 56.93; H, 9.56; N, 4.15; Exp. %: C 57.09; H, 10.06; N, 4.34. GPC: PDI exp = 1.04.
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El dendrímero de segunda generación se sintetiza
siguiendo un procedimiento similar al descrito para el compuesto 6
partiendo del dendrímero
G_{2}-[(CH_{2})_{3}NH_{2}]_{8} en MeOH (0.65
g, 0.39 mmol) y de un exceso de acrilato de metilo, CH_{2}=CHCOOMe
(1 ml. 11.1 mmol). De este modo se obtiene el compuesto 7 como un
aceite incoloro (1.09 g, 92%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.64 (s, 48H, -OMe), 2.75 (m, 32H,
-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 2.42 (m, 48H,
-NCH_{2}CH_{2}COOMe y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.31 (m, 40H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 0.53 (m, 48H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.38 (m, 16H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.06 (s, 48H, -SiMe_{2}), -0.1 (s, 12H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 173.0 (-COOMe), 57.5 ((-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N--), 51.5OMe), 49.2 (-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 32.5 (-NCH_{2}CH_{2}
COOMe), 21.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.1 - 17.7 (Si(CH_{2})_{3}Si-), 12.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.3 (-SiMe_{2}) -5.0 (-SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (CDCl_{3}): \delta (G_{0}-Si no se observa), 0.78 (G_{1}-Si), 1.88 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{144}H_{292}N_{8}O_{32}Si_{13}: Calc. %: C, 57.40; H, 9.77; N, 3.72; Exp. %: C 56.76; H, 9.78; N, 3.88. GPC: PDI exp = 1.3
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.38 (m, 16H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.06 (s, 48H, -SiMe_{2}), -0.1 (s, 12H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 173.0 (-COOMe), 57.5 ((-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N--), 51.5OMe), 49.2 (-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 32.5 (-NCH_{2}CH_{2}
COOMe), 21.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.1 - 17.7 (Si(CH_{2})_{3}Si-), 12.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.3 (-SiMe_{2}) -5.0 (-SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (CDCl_{3}): \delta (G_{0}-Si no se observa), 0.78 (G_{1}-Si), 1.88 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{144}H_{292}N_{8}O_{32}Si_{13}: Calc. %: C, 57.40; H, 9.77; N, 3.72; Exp. %: C 56.76; H, 9.78; N, 3.88. GPC: PDI exp = 1.3
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El dendrímero de tercera generación se prepara
del mismo modo que los dendrímeros de 1ª y 2ª generación, partiendo
del dendrímero
G_{3}-[(CH_{2})_{3}NH_{2}]_{16} disuelto en
MeOH (0.25 g, 0.06 mmol), y de un exceso de acrilato de metilo,
CH_{2}=CHCOOMe (1 ml. 11.1 mmol). De este modo se obtiene el
compuesto 8 como un aceite incoloro
(0.39 g, 99%).
(0.39 g, 99%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.63 (s, 96H, -OMe), 2.74 (m, 64H,
-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 2.41 (m, 96H,
-NCH_{2}CH_{2}COOMe y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.31 (m, 88H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 0.53 (m, 112H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.37 (m, 32H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.07 (s, 96H, -SiMe_{2}),
-0.1 (s, 36H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H}
(CDCl_{3}): \delta 173.0 (-COOMe), 57.5
(-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 51.5 (-OMe), 49.2
(-NCH_{2}CH_{2}COOMe), 32.5
(-NCH_{2}CH_{2}
COOMe), 21.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.1 - 17.9 (Si(CH_{2})_{3}Si-), 12.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.3 (-SiMe_{2}) -5.0 (-SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (CDCl_{3}): \delta (G_{0}-Si y G_{1}-Si no se observan), 0.8 (G_{2}-Si), 1.9 (G_{3}-Si). Análisis elemental C_{304}H_{620}N_{16}
O_{64}Si_{29}: Calc. %: C, 57.60; H, 9.86; N, 3.54; Exp. %: C 58.38; H, 9.86; N, 3.08. GPC: PDI exp = 1.3.
COOMe), 21.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.1 - 17.9 (Si(CH_{2})_{3}Si-), 12.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.3 (-SiMe_{2}) -5.0 (-SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (CDCl_{3}): \delta (G_{0}-Si y G_{1}-Si no se observan), 0.8 (G_{2}-Si), 1.9 (G_{3}-Si). Análisis elemental C_{304}H_{620}N_{16}
O_{64}Si_{29}: Calc. %: C, 57.60; H, 9.86; N, 3.54; Exp. %: C 58.38; H, 9.86; N, 3.08. GPC: PDI exp = 1.3.
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Sobre una disolución del dendrímero 6 (1.80 g,
1.34 mmol) en etanol, se añade un exceso de una disolución de
hidróxido sódico de pH= 10. Esta mezcla se mantiene con agitación
constante durante 2 h a temperatura ambiente. Tras evaporar el
disolvente y lavar con éter dietílico se obtiene el compuesto 10
como un sólido blanco (1,86 g, 98%), soluble en agua.
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
2.57 (m, 8H, -NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 2.72 (m,
8H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 2.16 (m, 16H,
-NCH_{2}
CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 1.25 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.43 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.27 (t, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), -0.20 (s, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 179.9 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 55.3 (-SiCH_{2}CH_{2}
CH_{2}N-), 48.6 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 32.7 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 19.0 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 18.4, 17.5 y 15.9 (Si(CH_{2})_{3}Si), 11.4 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -4.8 (-SiMe_{2}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta 1.1 (G_{0}-Si), 1.8 (G_{1}-Si). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -322.6. Análisis elemental C_{56}H_{104}N_{4}Na_{8}O_{16}Si_{5}: Calc. %: C, 47.57; H, 7.41; N, 3.96; Exp. %: C 46,15; H, 7.53; N, 3.62.
CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 1.25 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.43 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.27 (t, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), -0.20 (s, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 179.9 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 55.3 (-SiCH_{2}CH_{2}
CH_{2}N-), 48.6 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 32.7 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 19.0 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 18.4, 17.5 y 15.9 (Si(CH_{2})_{3}Si), 11.4 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -4.8 (-SiMe_{2}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta 1.1 (G_{0}-Si), 1.8 (G_{1}-Si). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -322.6. Análisis elemental C_{56}H_{104}N_{4}Na_{8}O_{16}Si_{5}: Calc. %: C, 47.57; H, 7.41; N, 3.96; Exp. %: C 46,15; H, 7.53; N, 3.62.
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El dendrímero de segunda generación se prepara
de siguiendo un procedimiento similar al descrito para el compuesto
10. Partiendo de una disolución del dendrímero de segunda generación
7 (1.05 g, 0.35 mmol) en etanol, se añade un exceso de una
disolución de hidróxido sódico de pH= 10. Esta mezcla se deja
agitando durante 2 h a temperatura ambiente. Tras evaporar el
disolvente y lavar con éter dietílico se obtiene el compuesto 11
como un sólido blanco (1.06 g, 97%), soluble en agua.
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
2.61 (m, 32H, -NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 2.31 (m,
16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 2.17 (m, 32H,
-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 1.31 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.20 (m, 24H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.42 (m, 48H, SiCH_{2}CH_{2}
CH_{2}Si-), 0.26 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.17 (s ancho, 48H, -SiMe_{2}), -0,21 (s ancho, 12H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 180.5 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 56.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 49.7 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 33.7 (-NCH_{2}
CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 19.9 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 19.3 - 17.9 (Si(CH_{2})_{3}Si), 12.7 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.4 (-SiMe_{2}), -4.4
(-SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 1.2 (G_{1}-Si), 1.9 (G_{2}-Si). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -329. Análisis elemental C_{128}H_{244}N_{8}Na_{16}O_{32}Si_{13}: Calc. %: C, 48.96; H, 7.83; N, 3.57; Exp. %: C, 49.03; H, 7.79; N, 3.31.
-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 1.31 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.20 (m, 24H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.42 (m, 48H, SiCH_{2}CH_{2}
CH_{2}Si-), 0.26 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.17 (s ancho, 48H, -SiMe_{2}), -0,21 (s ancho, 12H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 180.5 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 56.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 49.7 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 33.7 (-NCH_{2}
CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 19.9 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 19.3 - 17.9 (Si(CH_{2})_{3}Si), 12.7 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.4 (-SiMe_{2}), -4.4
(-SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 1.2 (G_{1}-Si), 1.9 (G_{2}-Si). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -329. Análisis elemental C_{128}H_{244}N_{8}Na_{16}O_{32}Si_{13}: Calc. %: C, 48.96; H, 7.83; N, 3.57; Exp. %: C, 49.03; H, 7.79; N, 3.31.
\vskip1.000000\baselineskip
El dendrímero de tercera generación se prepara
de siguiendo un procedimiento similar al descrito para los
dendrímeros de 1ª y 2ª generación 10 y 11, partiendo de una
disolución del dendrímero 8 (0.39 g, 0.07 mmol) en etanol, sobre el
que se añade un exceso de una disolución de hidróxido sódico de pH=
10. Esta mezcla mantiene agitando durante 2 h a temperatura
ambiente. Tras evaporar el disolvente y lavar con éter dietílico se
obtiene el compuesto 12 como un sólido blanco (1.07 g, 95%) soluble
en agua.
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
2.54 (m, 64H, -NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 2.22 (m,
32H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 2.14 (m, 64H,
-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 1.20 (m, 88H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.42 (m, 112H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.25 (m, 32H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.17 (s ancho, 96H, -SiMe_{2}), -0,25 (s ancho, 36H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 181.2 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 57.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 49.6 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 34.3 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 20.3 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 19.5 - 18.0 (Si(CH_{2})_{3}Si), 13.0 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), -3.4(-SiMe_{2}), -4.5 (-SiMe).
RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si y G_{1}-Si no se observan), 1.1 (G_{2}-Si), 2.0 (G_{3}-Si).
-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 1.20 (m, 88H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.42 (m, 112H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.25 (m, 32H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.17 (s ancho, 96H, -SiMe_{2}), -0,25 (s ancho, 36H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 181.2 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 57.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 49.6 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 34.3 (-NCH_{2}CH_{2}COO^{-}Na^{+}), 20.3 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 19.5 - 18.0 (Si(CH_{2})_{3}Si), 13.0 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N), -3.4(-SiMe_{2}), -4.5 (-SiMe).
RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si y G_{1}-Si no se observan), 1.1 (G_{2}-Si), 2.0 (G_{3}-Si).
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El dendrímero de primera generación se prepara
partiendo de una disolución en MeOH del dendrímero 10 (1.36 g, 1.01
mmol), y de un exceso de HCl al 37% (2.36 mmol). La mezcla de
reacción se mantiene temperatura ambiente y con agitación constante
durante 3 h, tras las cuales se elimina el disolvente por
evaporación a vacío calentando con un baño de agua a 50ºC. El
residuo resultante se lava con dietil éter frío (2 x 25 ml), así se
obtiene el compuesto 14 como un sólido blanco (1.17 g, 84%).
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
3.30 (m, 16H, -N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 2.99 (m, 8H,
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 2.70 (m, 16H,
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 1.57 (m, 8H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 1,21 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.44 (m, 24H, SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.15 (s ancho, 6H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 174.0 (-COOH), 55.2
(-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 49.1 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 28.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 19.6, 18.5, 18.2 (Si(CH_{2})_{3}Si), 17.2 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.6 (-SiMe_{2}). RMN-^{15}N {^{1}H} (D_{2}O): \delta -325 (-N^{+}H(CH_{2}CH_{2}
COOH)_{2}). RMN-^{29}Si {^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si) no se observa, 2.2 (G_{1}-Si). Análisis elemental C_{56}H_{116}Cl_{4}N_{4}O_{16}Si_{5}: Calc. %: C, 48.61; H, 8.45; N, 4.05; Exp. C, 48.78; H, 8.41; N, 4.00.
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 1.57 (m, 8H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 1,21 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.44 (m, 24H, SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.15 (s ancho, 6H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 174.0 (-COOH), 55.2
(-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 49.1 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 28.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 19.6, 18.5, 18.2 (Si(CH_{2})_{3}Si), 17.2 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.6 (-SiMe_{2}). RMN-^{15}N {^{1}H} (D_{2}O): \delta -325 (-N^{+}H(CH_{2}CH_{2}
COOH)_{2}). RMN-^{29}Si {^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si) no se observa, 2.2 (G_{1}-Si). Análisis elemental C_{56}H_{116}Cl_{4}N_{4}O_{16}Si_{5}: Calc. %: C, 48.61; H, 8.45; N, 4.05; Exp. C, 48.78; H, 8.41; N, 4.00.
\vskip1.000000\baselineskip
El dendrímero de segunda generación se prepara
de siguiendo un procedimiento similar al descrito para el compuesto
14, partiendo de una disolución del dendrímero de segunda generación
11 (1.0 g, 0.33 mmol) en MeOH y de un exceso de HCl al 37% (2.65
mmol). De este modo se obtiene el compuesto 15 como un sólido blanco
soluble en agua (0.98 g, 96%).
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
3.30 (m, 32H, -N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 3.01 (m, 16H,
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 2.74 (m, 32H,
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 1.57 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 1.20 (m, 24H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
Si-), 0.42 (m, 64H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.14 (s ancho, 60H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 173.8 (-COOH), 55.3 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 49.1 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 28.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 19.6-17.0 (Si(CH_{2})_{3}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.5 (-SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{29}Si {^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observan), 1.1 (G_{1}-Si). 2.2 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{128}H_{268}Cl_{8}N_{8}O_{32}Si_{13}: Calc. %: C, 49.91; H, 8.77; N, 3.64; Exp. %: C, 50.64; H, 8.61; N, 3.45.
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 1.57 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 1.20 (m, 24H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
Si-), 0.42 (m, 64H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.14 (s ancho, 60H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 173.8 (-COOH), 55.3 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 49.1 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 28.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 19.6-17.0 (Si(CH_{2})_{3}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.5 (-SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{29}Si {^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observan), 1.1 (G_{1}-Si). 2.2 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{128}H_{268}Cl_{8}N_{8}O_{32}Si_{13}: Calc. %: C, 49.91; H, 8.77; N, 3.64; Exp. %: C, 50.64; H, 8.61; N, 3.45.
\vskip1.000000\baselineskip
El dendrímero de tercera generación se prepara
de siguiendo un procedimiento similar al descrito para los
dendrímeros de 1ª y 2ª generación 14 y 15, partiendo de una
disolución del dendrímero 12 (1.0, 0.17 mmol) en MeOH, sobre la que
se añade un exceso HCl al 37% (2.52 mmol). De este modo se obtiene
el compuesto 16 (0.8 g, 86%) como un sólido blanco soluble en
agua.
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
3.29 (m, 64H, -N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 3.0 (m, 32H,
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 2.71 (m, 32H,
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 1.57 (m, 32H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 1.19 (m, 56H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.40 (m, 144H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.14 (s ancho, 132H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 174.6 (-COOH), 55.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 49.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 28.9 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 19.8-17.2 (Si(CH_{2})_{3}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.5 (-SiMe_{2}), -4.4 (-SiMe). RMN-^{29}Si {^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si, G_{1}-Si y G_{2}-Si no se observan), 2.5 (G_{3}-Si). Análisis elemental C_{272}H_{572}Cl_{16}N_{16}O_{64}Si_{29}: Calc. %: C, 50.47; H, 8.91; N, 3.46; Exp. %: C, 50.99; H, 8.61; N, 2.99.
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 1.57 (m, 32H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 1.19 (m, 56H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.40 (m, 144H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.14 (s ancho, 132H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 174.6 (-COOH), 55.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 49.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 28.9 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}COOH), 19.8-17.2 (Si(CH_{2})_{3}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.5 (-SiMe_{2}), -4.4 (-SiMe). RMN-^{29}Si {^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si, G_{1}-Si y G_{2}-Si no se observan), 2.5 (G_{3}-Si). Análisis elemental C_{272}H_{572}Cl_{16}N_{16}O_{64}Si_{29}: Calc. %: C, 50.47; H, 8.91; N, 3.46; Exp. %: C, 50.99; H, 8.61; N, 2.99.
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Sobre una disolución del dendrímero
G_{1}-[CH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}]_{4} (1.16 g,
1.75 mmol) en etanol, se añade el reactivo comercial
CH_{2}=CHSO_{3}Na 30% en peso. en H_{2}O (5.16 ml, 14.0 mmol).
Esta mezcla se deja agitando durante 3 días a 120ºC. Transcurrido
este tiempo se elimina la disolución sobrenadante por filtración y
el residuo sólido se lava con MeOH. De este modo se obtiene el
dendrímero 18 como un sólido blanco (2.25 g, 73%).
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
2.86 (m, 16H, -NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 2.77
(m, 16H, -NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 2.27 (m,
8H,
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.39 (m, 8H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.21 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-) 0.42 (m, 9H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.20 (s, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 47.8 (-NCH_{2}CH_{2}
SO_{3}^{-}Na^{+}), 47.0 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.4 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 19.4, 16.9 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 18.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 12.3 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -3.8 (-SiMe_{2}). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -339.1 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}
Na^{+}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 1.8 (G_{1}-Si). Análisis elemental C_{52}H_{116}N_{4}Na_{8}O_{24}S_{8}Si_{5}: Calc. %: C, 35.44; H, 6.63; N, 3.18; S, 14.56; Exp. %: C, 34.54; H, 6.56; N, 3.02; S, 15.28.
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.39 (m, 8H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.21 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-) 0.42 (m, 9H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.20 (s, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 47.8 (-NCH_{2}CH_{2}
SO_{3}^{-}Na^{+}), 47.0 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.4 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 19.4, 16.9 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 18.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 12.3 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -3.8 (-SiMe_{2}). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -339.1 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}
Na^{+}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 1.8 (G_{1}-Si). Análisis elemental C_{52}H_{116}N_{4}Na_{8}O_{24}S_{8}Si_{5}: Calc. %: C, 35.44; H, 6.63; N, 3.18; S, 14.56; Exp. %: C, 34.54; H, 6.56; N, 3.02; S, 15.28.
\newpage
Sobre una disolución del dendrímero
G_{2}-[CH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}]_{8} (0.5 g, 0.31
mmol) en etanol, se añaden el reactivo comercial
CH_{2}=CHSO_{3}Na 30% en peso en H_{2}O (1.8 ml, 4.91 mmol).
Esta mezcla se deja agitando durante 3 días a 120ºC. Transcurrido
este tiempo se elimina la disolución sobrenadante por filtración y
el residuo sólido se lava con MeOH. De este modo se obtiene 19 como
un sólido blanco (0.91 g, 80%).
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
2.86 (m, 32H, -NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 2.76
(m, 32H, -NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 2.28 (m,
16H,
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.21 (m, 40H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.43 (m, 48H, SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.28 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.16 (s ancho, 48H, -SiMe_{2}), -0.21 (s ancho, 12H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.9 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 48.0 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 46.7 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}
Na^{+}), 20.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 18.5-17.7 (Si(CH_{2})_{3}Si), 12.4 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.5 (SiMe_{2}), -4.4 (SiMe). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -348.5 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 1.1 (G_{1}-Si), 2.1 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{112}H_{244}N_{8}Na_{16}O_{48}S_{16}Si_{13}: Calc. %: C, 36.19; H, 6.62; N, 3.01; S, 13.80; Exp. %: C, 36.06; H, 7.04; N, 2.63; S, 13.91.
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.21 (m, 40H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.43 (m, 48H, SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.28 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.16 (s ancho, 48H, -SiMe_{2}), -0.21 (s ancho, 12H, -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.9 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 48.0 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 46.7 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}
Na^{+}), 20.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 18.5-17.7 (Si(CH_{2})_{3}Si), 12.4 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -3.5 (SiMe_{2}), -4.4 (SiMe). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -348.5 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 1.1 (G_{1}-Si), 2.1 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{112}H_{244}N_{8}Na_{16}O_{48}S_{16}Si_{13}: Calc. %: C, 36.19; H, 6.62; N, 3.01; S, 13.80; Exp. %: C, 36.06; H, 7.04; N, 2.63; S, 13.91.
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre una disolución del dendrímero
G_{3}-[CH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2}]_{16} (0.52 g,
0.14 mmol) en etanol, se añade el reactivo comercial
CH_{2}=CHSO_{3}Na 30% en peso en H_{2}O (1.70 ml, 4.64 mmol).
Esta mezcla se deja agitando durante 3 días a 120ºC. Transcurrido
este tiempo se elimina la disolución sobrenadante por filtración y
el residuo sólido se lava con MeOH. De este modo se obtiene el
dendrímero 20 como un sólido blanco (0.79 g, 73%).
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
2.85 (m, 64H, -NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 2.78
(m, 64H, -NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 2.27 (m,
32H,
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.24 (m, 88H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.44 (m, 144H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.15 (s ancho, 132H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 57.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 47.9 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 47.1 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.0-18.0 (Si(CH_{2})_{3}Si), 12.7 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -3.4 (-SiMe_{2}), -4.4 (-SiMe). RMN-^{15}N {^{1}H} (D_{2}O): \delta -349.7. RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si y G_{1}-Si no se observan), 1.2 (G_{2}-Si), 2.0 (G_{3}-Si). Análisis elemental C_{224}H_{492}N_{16}Na_{32}O_{96}S_{32}
Si_{29}: Calc. %: C, 35.76; H, 6.59; N, 2.98; S, 13.64; Exp. %: C, 36.93; H, 7.19; N, 2.58; S, 12.86.
-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 1.24 (m, 88H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 0.44 (m, 144H,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), -0.15 (s ancho, 132H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 57.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 47.9 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 47.1 (-NCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N-), 20.0-18.0 (Si(CH_{2})_{3}Si), 12.7 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -3.4 (-SiMe_{2}), -4.4 (-SiMe). RMN-^{15}N {^{1}H} (D_{2}O): \delta -349.7. RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si y G_{1}-Si no se observan), 1.2 (G_{2}-Si), 2.0 (G_{3}-Si). Análisis elemental C_{224}H_{492}N_{16}Na_{32}O_{96}S_{32}
Si_{29}: Calc. %: C, 35.76; H, 6.59; N, 2.98; S, 13.64; Exp. %: C, 36.93; H, 7.19; N, 2.58; S, 12.86.
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre una disolución de un equivalente del
dendrímero 18 (0.05 g, 0.03 mmol), en agua, se añade un exceso de
una disolución de una disolución de HCl 1M en dietil éter (0.5 ml,
0.23 mmol). La mezcla así preparada se mantiene con agitación
constante durante 12 h, tras las cuales se elimina el disolvente por
evaporación a vacío. El residuo resultante se lava con éter
dietílico (2 x 25 ml) y se cromatografía en columna de sephadex con
agua como eluyente. De este modo se aísla el compuesto 22 como un
sólido blanco (0.04 g, 80%), soluble en agua.
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
3.44 (m, 16H,
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 3.16 (m,
24H, -N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+} y
-SiCH_{2}CH_{2}
CH_{2}N^{+}H-), 1.56 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y - SO_{3}^{-}Na^{+}), 1.21 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-) 0.42 (m, 9H, SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.16 (s ancho, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
N^{+}H-), 49.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 44.8 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 19.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 18.5, 18.2 (-SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 17.2 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.4 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -3.5 (-SiMe_{2}). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -338.5 (N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 2.3 (G_{1}-Si).Análisis elemental C_{46}H_{112}Cl_{4}N_{4}O_{24}S_{8}Si_{5}: Calc. %: C, 33.60; H, 6.87; N, 3.41; S, 15.60; Exp. %: C, 32.52; H, 5.87; N, 3.72; S, 14.58.
CH_{2}N^{+}H-), 1.56 (m, 16H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y - SO_{3}^{-}Na^{+}), 1.21 (m, 8H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-) 0.42 (m, 9H, SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.16 (s ancho, 24H, -SiMe_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
N^{+}H-), 49.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 44.8 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 19.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 18.5, 18.2 (-SiCH_{2}
CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), 17.2 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 11.4 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-), -3.5 (-SiMe_{2}). RMN-^{15}N{^{1}H} (D_{2}O): \delta -338.5 (N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 2.3 (G_{1}-Si).Análisis elemental C_{46}H_{112}Cl_{4}N_{4}O_{24}S_{8}Si_{5}: Calc. %: C, 33.60; H, 6.87; N, 3.41; S, 15.60; Exp. %: C, 32.52; H, 5.87; N, 3.72; S, 14.58.
\vskip1.000000\baselineskip
El dendrímero de segunda generación se prepara
de un modo similar al descrito para el compuesto 22, partiendo de
una disolución en agua del dendrímero 19 (0.07 g, 0.02 mmol) y de un
exceso de una disolución 1M en dietil éter de HCl (0.5 ml, 0.3
mmol). De este modo se obtiene el compuesto 23 como un sólido blanco
(0.04 g, 60%), soluble en agua.
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
3.47 (m, 32H,
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 3.17 (m,
48H, -N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+} y
-SiCH_{2}CH_{2}
CH_{2}N^{+}H-), 1.58 (m, 32H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y - SO_{3}^{-}Na^{+}), 1.23 (m, 24H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
Si-), 0.46 (m, 64H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.11 (s ancho, 60H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 55.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 48.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 43.9 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}
SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.5 - 17.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-, y Si(CH_{2})_{3}Si), 10.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.3 (-SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 0.7 (G_{1}-Si), 2.2 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{112}H_{268}Cl_{8}N_{8}O_{48}S_{16}Si_{13}: Calc. %: C, 36.78; H, 7.39; N, 3.06; S, 14.03; Exp. %: C, 35.93; H, 7.46; N, 3.43; S, 13.97.
CH_{2}N^{+}H-), 1.58 (m, 32H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y - SO_{3}^{-}Na^{+}), 1.23 (m, 24H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
Si-), 0.46 (m, 64H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.11 (s ancho, 60H, -SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 55.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 48.4 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 43.9 (-N^{+}HCH_{2}CH_{2}
SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.5 - 17.1 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-, y Si(CH_{2})_{3}Si), 10.6 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -3.3 (-SiMe_{2} y -SiMe). RMN-^{29}Si{^{1}H} (D_{2}O): \delta (G_{0}-Si no se observa), 0.7 (G_{1}-Si), 2.2 (G_{2}-Si). Análisis elemental C_{112}H_{268}Cl_{8}N_{8}O_{48}S_{16}Si_{13}: Calc. %: C, 36.78; H, 7.39; N, 3.06; S, 14.03; Exp. %: C, 35.93; H, 7.46; N, 3.43; S, 13.97.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
El dendrímero de tercera generación se prepara
de un modo similar al descrito para los compuestos 22 y 23,
partiendo de una disolución en agua del dendrímero 20 (0.06 g, 0.008
mmol) y de un exceso de una disolución 1M en dietil éter de HCl (0.5
ml, 0.3 mmol). De este modo se obtiene el compuesto 24 como un
sólido blanco (0.04 g, 60%), soluble en agua.
RMN-^{1}H (D_{2}O): \delta
3.47 (m, 64H,
-N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+}), 3.16 (m,
96H, -N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+} y
-SiCH_{2}CH_{2}
CH_{2}N^{+}H-), 1.57 (m, 64H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y -SO_{3}^{-}Na^{+}), 1.21(m, 56H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
Si-), 0.44 (m, 144H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.11 (s ancho, 132H, -SiMe_{2} y
-SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 45.1 y 44.9 (N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+} y -N^{+}HCH_{2}CH_{2}
SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.0-17.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H y Si(CH_{2})_{3}Si), 11.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), -3.3 (-SiMe_{2}), -4.4 (-SiMe). Análisis elemental C_{224}H_{540}Cl_{16}N_{16}O_{96}S_{32}Si_{29}: Calc. %: C, 36.34; H, 7.35; N, 3.03; S, 13.86; Exp. %: C, 35.87; H, 7.84; N, 3.34; S, 12.96.
CH_{2}N^{+}H-), 1.57 (m, 64H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H- y -SO_{3}^{-}Na^{+}), 1.21(m, 56H, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
Si-), 0.44 (m, 144H, SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si-, -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si- y -SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), -0.11 (s ancho, 132H, -SiMe_{2} y
-SiMe). RMN-^{13}C {^{1}H} (D_{2}O): \delta 56.5 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H-), 45.1 y 44.9 (N^{+}HCH_{2}CH_{2}SO_{3}^{-}Na^{+} y -N^{+}HCH_{2}CH_{2}
SO_{3}^{-}Na^{+}), 20.0-17.8 (-SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}N^{+}H y Si(CH_{2})_{3}Si), 11.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), -3.3 (-SiMe_{2}), -4.4 (-SiMe). Análisis elemental C_{224}H_{540}Cl_{16}N_{16}O_{96}S_{32}Si_{29}: Calc. %: C, 36.34; H, 7.35; N, 3.03; S, 13.86; Exp. %: C, 35.87; H, 7.84; N, 3.34; S, 12.96.
\vskip1.000000\baselineskip
En una ampolla de vidrio se disuelven 1.52 g del
dendrímero G_{1}-[Si-H]_{4} (3.52 mmol)
en hexano (5 mL) y se le añaden 1.61 mL de
4-bromobuteno (15.85 mmol). A continuación se añaden
5 gotas del catalizador de Karstedt y se agita vigorosamente durante
5 días a 60ºC. Transcurrido este tiempo la reacción se concentra a
sequedad y se redisuelve en diclorometano. La mezcla se filtra por
carbón activo y celite y se lleva a sequedad para dar un aceite
amarillento que se identifica como el dendrímero de primera
generación 26 (2.32 g, 68%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.40 (8H, t, CH_{2}Br), 1.85 (8H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 1.37 (16H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br y
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.51 (24H, m, CH_{2}
unidos a Si), -0.05 (24H, s, SiCH_{3}).
RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 36.4
(CH_{2}Br), 33.7
(SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br),
22.5(SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 20.2
(SiCH_{2}), 18.6 (SiCH_{2}), 17.6
(SiCH_{2}), 14.5 (SiCH_{2}), -3.281
(SiCH_{3}). Análisis elemental
C_{36}H_{80}Br_{4}Si_{5}: Calc. %: C, 44.44; H, 8.29; Exp.
%: C, 44.24; H, 8.18.
\vskip1.000000\baselineskip
El dendrímero de segunda generación 27, se
prepara siguiendo un procedimiento de síntesis similar a 26. De este
modo, se disuelven 0.38 g del dendrímero
G_{2}-[Si-H]_{8} en hexano (10 mL) en una
ampolla de vidrio y se añaden 0.28 mL de
4-bromobuteno (2.7 mmol). A continuación se añaden 2
gotas del catalizador de Karstedt y se agita vigorosamente durante
16 horas 60ºC. Transcurrido el tiempo de reacción la mezcla se
concentra a sequedad y se redisuelve en diclorometano. A
continuación se filtra por carbón activo y celite y se lleva a
sequedad para dar el compuesto 27 como un aceite amarillento (0.61
g, 83%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.40 (16H, t, CH_{2}Br), 1.85 (16H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 1.31 (40H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}
Br y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.53 (64H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.05 (48H, s, Si(CH_{3})_{2}), -0.09 (12H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 36.8 (CH_{2}Br), 34.0 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 22.93 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.5(SiCH_{2}CH_{2}), 19.6(SiCH_{2}CH_{2}), 19.3 (SiCH_{2}), 19.1 (SiCH_{2}), 18.9 (SiCH_{2}), 18.2 (SiCH_{2}), 14.9 (SiCH_{2}), -2.8 (SiCH_{3}), -4.5 (SiCH_{3}). Análisis elemental C_{88}H_{196}Br_{8}Si_{13}: Calc. %: C, 46.79; H, 8.75; Exp. %: C, 46.51; H, 8.75.
Br y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.53 (64H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.05 (48H, s, Si(CH_{3})_{2}), -0.09 (12H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 36.8 (CH_{2}Br), 34.0 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 22.93 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.5(SiCH_{2}CH_{2}), 19.6(SiCH_{2}CH_{2}), 19.3 (SiCH_{2}), 19.1 (SiCH_{2}), 18.9 (SiCH_{2}), 18.2 (SiCH_{2}), 14.9 (SiCH_{2}), -2.8 (SiCH_{3}), -4.5 (SiCH_{3}). Análisis elemental C_{88}H_{196}Br_{8}Si_{13}: Calc. %: C, 46.79; H, 8.75; Exp. %: C, 46.51; H, 8.75.
\vskip1.000000\baselineskip
El dendrímero de tercera generación 28, se
prepara siguiendo un procedimiento de síntesis similar a 26. Se
disuelven 0.81 g del dendrímero
G_{3}-[Si-H]_{16} (0.31 mmol) en hexano
(20 mL) en una ampolla de vidrio y se añaden 0.51 mL de
4-bromobuteno (5.04 mmol). A continuación, se añaden
2 gotas del catalizador de Karstedt y se agita vigorosamente durante
16 horas a 60ºC. Transcurrido el tiempo de reacción la mezcla se
concentra a sequedad y se redisuelve en diclorometano. A
continuación, se filtra por carbón activo y celite y se lleva a
sequedad para dar el compuesto 28 como un aceite amarillento (0.1.27
g, 86%).
\global\parskip1.000000\baselineskip
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.40 (32H, t, CH_{2}Br), 1.85 (32H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 1.30 (88H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
CH_{2}Br y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.53 (144H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.05 (120H, s, Si(CH_{3})_{2} y SiCH_{3}), -0.09 (12H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 36.4 (CH_{2}Br), 33.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 22.5 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.1 (SiCH_{2}CH_{2}), 19.0-14.5 (SiCH_{2}), -3.3 (SiCH_{3}), -4.8 (SiCH_{3}, ambas señales). Análisis elemental C_{192}H_{428}Br_{16}Si_{29}: Calc. %: C, 47.74; H, 8.93; Exp. %: C, 48.62; H, 9.00.
CH_{2}Br y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.53 (144H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.05 (120H, s, Si(CH_{3})_{2} y SiCH_{3}), -0.09 (12H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 36.4 (CH_{2}Br), 33.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}Br), 22.5 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.1 (SiCH_{2}CH_{2}), 19.0-14.5 (SiCH_{2}), -3.3 (SiCH_{3}), -4.8 (SiCH_{3}, ambas señales). Análisis elemental C_{192}H_{428}Br_{16}Si_{29}: Calc. %: C, 47.74; H, 8.93; Exp. %: C, 48.62; H, 9.00.
\vskip1.000000\baselineskip
En una ampolla de vidrio se disuelve 0.5 g del
dendrímero 26 (0.52 mmol) en DMF (20 mL), a continuación se añaden
0.34 g de azida sódica (5.16 mmol) y una punta de espátula de ioduro
sódico. La mezcla se calienta a 90ºC durante 16 horas. A
continuación se deja enfriar a temperatura ambiente y la mezcla se
concentra a sequedad. El residuo resultante se disuelve en
diclorometano (20 mL) y se lava con agua destilada (10 mL). La fase
orgánica se seca sobre MgSO_{4}, y se concentra a vacío
obteniéndose el producto 30 como un aceite amarillento (0.35 g,
81%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.24 (8H, t, CH_{2}N_{3}), 1.60 (8H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 1.35 (16H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}
N_{3} y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.52 (24H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.06 (24H, s, Si(CH_{3})_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 51.1 (CH_{2}N_{3}), 32.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 21.1 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 18.6 (SiCH_{2}), 17.5 (SiCH_{2}), 15.0 (SiCH_{2}), -3.3 (SiCH_{3}).
N_{3} y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.52 (24H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.06 (24H, s, Si(CH_{3})_{2}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 51.1 (CH_{2}N_{3}), 32.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 21.1 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 18.6 (SiCH_{2}), 17.5 (SiCH_{2}), 15.0 (SiCH_{2}), -3.3 (SiCH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
En una ampolla de vidrio se disuelve 1.00 g del
dendrímero de segunda generación 27 (0.44 mmol) en DMF (30 mL), a
continuación se añaden 0.43 g de azida sódica (6.64 mmol) y una
punta de espátula de ioduro sódico. La mezcla se calienta a 90ºC
durante 16 horas y posteriormente se deja enfriar a temperatura
ambiente. La mezcla se concentra a sequedad y el residuo resultante
se disuelve en diclorometano (30 mL) y se lava con agua destilada
(15 mL). La fase orgánica se seca sobre MgSO_{4}, y se concentra a
vacío obteniéndose el compuesto 31 como un aceite amarillento
(067 g, 78%).
(067 g, 78%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.24 (16H, t, CH_{2}N_{3}), 1.60 (16H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 1.29 (40H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
CH_{2}N_{3} y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.51 (64H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.06 (48H, s, Si(CH_{3})_{2}), -0.10 (24H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 51.1 (CH_{2}N_{3}), 32.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 21.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.5 (SiCH_{2}CH_{2}), 19.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 18.8 (SiCH_{2}), 18.6 (SiCH_{2}), 18.5 (SiCH_{2}), 17.7 (SiCH_{2}), 15.0 (SiCH_{2}), -3.3 (Si(CH_{3})_{2}), -4.9 (SiCH_{3}). Análisis elemental C_{88}H_{196}N_{24}Si_{13}: Calc. %: C, 54.04; H, 10.10; N, 17.19; Exp. %: C, 54.81; H, 9.72; N, 12.94.
CH_{2}N_{3} y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.51 (64H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.06 (48H, s, Si(CH_{3})_{2}), -0.10 (24H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 51.1 (CH_{2}N_{3}), 32.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 21.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.5 (SiCH_{2}CH_{2}), 19.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 18.8 (SiCH_{2}), 18.6 (SiCH_{2}), 18.5 (SiCH_{2}), 17.7 (SiCH_{2}), 15.0 (SiCH_{2}), -3.3 (Si(CH_{3})_{2}), -4.9 (SiCH_{3}). Análisis elemental C_{88}H_{196}N_{24}Si_{13}: Calc. %: C, 54.04; H, 10.10; N, 17.19; Exp. %: C, 54.81; H, 9.72; N, 12.94.
\vskip1.000000\baselineskip
En una ampolla de vidrio se disuelven 1.82 g del
dendrímero de tercera generación 28 (0.38 mmol) en una mezcla de DMF
(30 mL) y THF (10 mL). A continuación, se añaden 0.50 g de azida
sódica (7.70 mmol) y una punta de espátula de ioduro sódico. La
mezcla se calienta a 90ºC durante 16 horas, posteriormente se deja
enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se concentra a sequedad y
el residuo resultante se disuelve en diclorometano (30 mL) y se lava
con agua destilada (15 mL). La fase orgánica se seca sobre
MgSO_{4}, y se concentra a vacío obteniéndose el compuesto 32 como
un aceite amarillento (1.33 g, 82%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 3.24 (32H, t, CH_{2}N_{3}), 1.60 (32H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 1.32 (88H, m,
SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}
CH_{2}N_{3} y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.54 (144H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.05 (120H, s, Si(CH_{3})_{2} y SiCH_{3}), -0.09 (12H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 51.1 (CH_{2}N_{3}), 32.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 21.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.0 (SiCH_{2}CH_{2}), 19.0-17.5 (SiCH_{2}) 15.0 (SiCH_{2}), -3.3 (Si(CH_{3})_{2}), -4.9 (SiCH_{3}). Análisis elemental C_{192}H_{428}N_{48}Si_{29}: Calc. %: C, 54.59; H, 10.21; N, 15.92; Exp. %: C, 56.08; H, 9.58; N, 11.08.
CH_{2}N_{3} y SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 0.54 (144H, m, CH_{2} unidos a Si), -0.05 (120H, s, Si(CH_{3})_{2} y SiCH_{3}), -0.09 (12H, s, SiCH_{3}). RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 51.1 (CH_{2}N_{3}), 32.6 (SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}), 21.2 (SiCH_{2}CH_{2}), 20.0 (SiCH_{2}CH_{2}), 19.0-17.5 (SiCH_{2}) 15.0 (SiCH_{2}), -3.3 (Si(CH_{3})_{2}), -4.9 (SiCH_{3}). Análisis elemental C_{192}H_{428}N_{48}Si_{29}: Calc. %: C, 54.59; H, 10.21; N, 15.92; Exp. %: C, 56.08; H, 9.58; N, 11.08.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelven 0.31 g (0.38 mmol) de
G_{1}-[SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}]_{4} en
10 mL de THF, sobre éste, se añaden 0.11 mL (1.66 mmol) de
propargilamina. A continuación se añade una disolución recién
preparada de ascorbato sódico (0.04 g, 0.11 mmol) en 1.25 mL de agua
destilada y seguidamente otra disolución recién preparada de
CuSO_{4} (0.02 mg, 0.07 mmol) en 1.25 mL de agua destilada. La
mezcla se agita vigorosamente durante 16 horas. Transcurrido ese
tiempo la reacción se interrumpe añadiendo 2 mL de una disolución de
amoniaco al 15%, y la mezcla se agita 10 minutos. A continuación, se
extrae con acetato de etilo (3x10 mL), y las fases orgánicas se
juntan y se lavan con una disolución de cloruro sódico saturada. Las
fases orgánicas se secan sobre MgSO_{4} se filtran y se elimina el
disolvente a vacío, para obtener el dendrímero de primera generación
34 un aceite amarillo.
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 7.41 (4H, s, NCHCN), 4.30 (8H, t,
CH_{2}CH_{2}N), 3.97 (8H, sa, NH_{2}), 1.88
((8H, m, CH_{2}CH_{2}N), 1.27 (16H, m,
SiCH_{2}CH_{2}), 0.54 (24H, m, SiCH_{2}), 0.08
(24H, s, SiCH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelven 0.30 g del derivado
G_{1}-[SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}]_{4} en
5 mL de THF (0.37 mmol) y se añade sobre esta mezcla 0.33 g (1.46
mmol) de la propargilamina funcionalizada con grupos ester (D). A
continuación se añade una disolución recién preparada de ascorbato
sódico (35 mg, 0.18 mmol) en 0.75 mL de agua destilada y
seguidamente otra disolución recién preparada de CuSO_{4} (18 mg,
0.073 mmol) en 0.75 mL de agua destilada. La mezcla se agita
vigorosamente durante 16 horas. Transcurrido ese tiempo la reacción
se interrumpe añadiendo 4 mL de una disolución de amoniaco al 15%, y
la mezcla se agita 10 minutos. A continuación, se extrae con acetato
de etilo (3x10 mL), y las fases orgánicas se juntan y se lavan con
una disolución de cloruro sódico saturada. Las fases orgánicas se
secan sobre MgSO_{4} se filtran y se elimina el disolvente a
vacío. Tras cromatografía de exclusión de tamaños se obtiene el
dendrímero de primera generación 38 como un aceite amarillo (0.43 g,
68%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 7.43 (4H, s, NCHCN), 4.3 (8H, t,
CH_{2}CH_{2}N), 3.78 (8H, s, CCH_{2}N), 3.64
(24H, s, OCH3), 2.78 (16H, t,
NCH_{2}CH_{2}C(O)), 2.47 (16H, t,
NCH_{2}CH_{2}C(O)), 1.90 (8H, m,
CH_{2}CH_{2}N), 1.27 (16H, m, SiCH_{2}CH_{2}),
0.52 (24H, m, SiCH_{2}), -0.08 (24H, s, SiCH_{3}).
RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 172.8
(CO_{2}CH_{3}), 144.6 (NCCCH_{2}), 122.2
(NCCCH_{2}), 51.5 (OCH3), 49.9 (CH_{2}N),
48.9 (CH_{2}N), 48.7 (CH_{2}N), 34.0
(CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 32.6
(CH_{2}CO), 21.0 (CH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 20.1
(CH_{2}CH_{2}CH_{2}), 18.5 (SiCH_{2}), 17.5
(SiCH_{2}), 14.9 (SiCH_{2}), -3.4
(SiCH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelven 0.30 g (0.37 mmol) del derivado
G_{1}-[SiCH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N_{3}]_{4} en
10 mL de THF y se añade sobre esta mezcla la propargil amina
funcionalizada con grupos fosfito (F), (0.44 g, 1.46 mmol). A
continuación se añade una disolución recién preparada de ascorbato
sódico (35 mg, 0.18 mmol) en 1.25 mL de agua destilada y
seguidamente otra disolución recién preparada de CuSO_{4} (18 mg,
0.073 mmol) en 1.25 mL de agua destilada. La mezcla se agita
vigorosamente durante 16 horas. Transcurrido ese tiempo la reacción
se interrumpe añadiendo 2 mL de una disolución de amoniaco al 15%, y
la mezcla se agita 10 minutos. A continuación, se extrae con acetato
de etilo (3x10 mL), y las fases orgánicas se juntan y se lavan con
una disolución de cloruro sódico saturada. Las fases orgánicas se
secan sobre MgSO_{4} se filtran y se elimina el disolvente a
vacío, para obtener el dendrímero de primera generación 50 como un
aceite amarillo (0.16 g, 65%).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}):
\delta 7.6 (4H, s, NCHCN), 4.32 (8H, t,
CH_{2}CH_{2}N), 4.13 (8H, s, CCH_{2}N), 3.76
(48H, d, OCH3), 3.15 (4H, d, NCH_{2}P), 1.89 (8H, m,
CH_{2}CH_{2}N), 1.27 (16H, m, SiCH_{2}CH_{2}),
0.54 (24H, m, SiCH_{2}), -0.08 (24H, s, SiCH_{3}).
RMN-^{13}C {^{1}H} (CDCl_{3}): \delta 143.1
(NCCCH_{2}), 123.0 (NCCCH_{2}), 52.7 (d,
OCH_{3}), 51.2 (t, CCH_{2}N), 50.0, 49.0 (dd,
NCH_{2}P), 34.1 (CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N),
21.0 (CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}N), 20.1
(CH_{2}CH_{2}CH_{2}Si), 18.5 (SiCH_{2}), 17.5
(SiCH_{2}), 14.9 (SiCH_{2}), -3.4
(SiCH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se muestra una evaluación de la
citotoxicidad, mitogenicidad y efecto microbicida/microestático de
los nuevos dendrímeros aniónicos sintetizados según la presente
invención en distintas líneas celulares (vaginales y linfoides), en
diferentes poblaciones fisiológicas (células mononucleares de sangre
periférica, hematíes. macrófagos y células dendríticas) y en
cultivos bacterianos.
\vskip1.000000\baselineskip
Human Endometrial Carcinoma cells
(HEC-1A): línea celular endometrial humana,
derivada de un adenocarcinoma humano de endometrio. Se obtuvieron
del American Type Culture Collection (ATCC). Las
HEC-1A se cultivaron en medio completo [RPMI 1640
(Gibco) suplementado con 10% de Suero Fetal de Ternera (SFT), 2 mM
L-glutamina y antibióticos (1% cloxaciclina, 1%
ampicilina y 0.32% gentamicina)] en placas de 24 o 96 pocillos o
placas transwell de 12 pocillos con soporte permeable de
policarbonato de 0.4 \mum de poro (Costar, Cambridge, MA), en
condiciones de cultivo (37ºC en una atmósfera de 5% CO_{2} y 95%
de humedad relativa).
Células Mononucleares de Sangre Periférica
(CMSP): La sangre se obtuvo de buffy coats procedentes de
donantes sanos del Centro de Transfusiones de Madrid. Dicha sangre
se diluye ½ con solución salina tamponada con fosfato 6.7 mM (PBS,
Bio-Whittaker®) y se procede a su centrifugación en
gradiente de densidad (Ficoll-Isopaque®). Tras dicha
centrifugación se recupera el halo que contiene las CMSP y se
procede a dos ciclos de lavado-centrifugado
posteriores con PBS (10 minutos a 1500 r.p.m.). Las CMSP resultantes
se resuspenden en medio de completo y en condiciones de cultivo.
MT-2: Línea celular de
leucemia de células T con ADN de HTLV-1 integrado.
Se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC). Se
cultivaron en medio completo en diferentes formatos de placa (6, 24
o 96 pocillos) y en condiciones de cultivo.
Células Dendríticas (CD): Se realizó una
separación de CMSP por gradiente de densidad como se ha descrito
anteriormente. Los monocitos se obtuvieron por separación
inmunomagnética con anticuerpos monoclonales
anti-humano CD14 (MicroBeads) mediante separación en
columnas (MACS®, Miltenyi Biotec, Alemania). Los monocitos
purificados se resuspendieron en medio completo en placa de fondo
plano de 6 pocillos a una concentración de 2*10^{6}
células/pocillo en un volumen final de 3 mL. Se cultivaron con 50
ng/ml rh GM-CSF y 20 ng/ml rh IL-4
(ImmunoTools, Alemania), en condiciones de cultivo. Se añadió medio
fresco completo con 50 ng/ml rh GM-CSF y 20 ng/ml rh
IL-4 a los 3 días a las células inmaduras (CDi). Se
maduraron las células a los 6 días con 20 ng/ml LPS (Sigma) durante
2 días (CDm). Los marcadores de CDi y CDm se analizaron mediante un
citómetro Beckman-Coulter® de 4 colores y se utilizó
el software EPICs® de Beckman-Coulter®.
Macrófagos: Se realizó una separación de
CMSP por gradiente de densidad y una separación inmunomagnética con
anticuerpos monoclonales anti-humano CD14
(MicroBeads) como se describe anteriormente. Los monocitos
purificados se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Gibco)
suplementado con 10% de suero humano AB, 2 mM
L-glutamina y antibióticos (1% cloxaciclina, 1%
ampicilina y 0.32% gentamicina) en placa de fondo plano de 6
pocillos a una concentración de 2*10^{6} células/pocillo en un
volumen final de 3 mL. Se cultivaron con 50 ng/ml rh
M-CSF y se añadió medio fresco con 50 ng/ml rh
M-CSF a los 3 días. A los 7 días, los marcadores de
macrófagos se analizaron mediante un citómetro
Beckman-Coulter® de 4 colores y se utilizó el
software EPICs® de Beckman-Coulter®.
Línea celular T Jurkat clon E6 (ATCC; línea
celular de linfocitos T) se creció de forma rutinaria en RPMI 1640
(Biochrom KG Seromed, Berlin, Alemania) suplementado con 5% suero
fetal de ternera (FCS) inactivado por calor, 1%
penicilina/streptomicina, y 2 mM L-glutamina (ICN
Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA-U.S.A.) a 37ºC en
una atmósfera de 5% CO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de los dendrímeros carbosilano con
terminaciones sulfonato (G1SF8, G2SF16 y G3SF32) y carboxilato
(G1COO8, G2COO16, G3COO32) fue la descrita en el apartado anterior.
Además de los dendrímeros G2CKCOO16 y G2CKP32.
Los dendrímeros G1SF8, G2SF16, G3SF32 se
corresponden con los dendrímeros
Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}SO_{3}
Na)_{2}]_{x} (n = 1, x = 4 (18); n = 2, x = 8 (19); n = 3, x = 16 (20)) cuya síntesis y caracterización ha sido descrito en los apartados anteriores. De la misma forma, los dendrímeros G1COO8, G2COO16 y G3COO32 se corresponden con los dendrímeros Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{x} (n = 1, x = 4 (10); n = 2, x = 8 (11); n = 3, x = 16 (12)). Del mismo modo los dendrímeros G2CKCOO16 y G2CKP32, se corresponden con los compuestos ck-G_{2}-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{8} (43) y ck-G_{2}-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}PO(OMe)_{2})_{2}]_{8} (51) respectivamente.
Na)_{2}]_{x} (n = 1, x = 4 (18); n = 2, x = 8 (19); n = 3, x = 16 (20)) cuya síntesis y caracterización ha sido descrito en los apartados anteriores. De la misma forma, los dendrímeros G1COO8, G2COO16 y G3COO32 se corresponden con los dendrímeros Gn-[Si(CH_{2})_{3}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{x} (n = 1, x = 4 (10); n = 2, x = 8 (11); n = 3, x = 16 (12)). Del mismo modo los dendrímeros G2CKCOO16 y G2CKP32, se corresponden con los compuestos ck-G_{2}-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}CH_{2}COONa)_{2}]_{8} (43) y ck-G_{2}-[Si(CH_{2})_{4}(N_{3}C_{2}H)CH_{2}N(CH_{2}PO(OMe)_{2})_{2}]_{8} (51) respectivamente.
Esta nueva nomenclatura para esta parte de la
presente invención se ha adoptado para simplificar la representación
de estos dendrímeros en su estudio biomédico y así facilitar el
seguimiento de esta discusión de resultados.
Estos dendrímeros organosilano se pueden
preparar de diferentes generaciones con rendimientos elevados usando
reacciones bien conocidas, a través de métodos divergentes. Los
dendrímeros carboxilato y sulfonato han sido caracterizados por las
técnicas habituales de espectroscopía de RMN de ^{1}H, ^{13}C y
^{29}Si además de análisis elemental de C, H y N. Son dendrímeros
estables y solubles en agua. En función del pH podemos obtener los
dendrímeros como sales sódicas o como ácidos, lo que puede
proporcionar mayor versatilidad en sus aplicaciones futuras. Su
síntesis es relativamente sencilla, lo que facilita su obtención en
grandes cantidades.
\newpage
Además, los dendrímeros carbosilano presentan
una gran inercia química, lo que es muy útil para el estudio de
cualquier aplicación biomédica. Se presentan a continuación la
estructura química de los dendrímeros de estructura carbosilano
estudiados:
\vskip1.000000\baselineskip
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Se utilizaron distintas técnicas con el fin de
evaluar la viabilidad en diferentes aspectos: integridad de membrana
(tinciones con azul tripán y ensayo de LDH), actividad mitocondrial
(reactivo MTT) y proliferación celular (incorporación de BrdU).
Estas técnicas se aplicaron para el estudio de la toxicidad de las
generaciones de dendrímeros en HEC-1A y en CMSP
humanas. Adicionalmente, se ha estudiado la toxicidad de los
dendrímeros en hematíes humanos mediante un ensayo para evaluar la
presencia de hemaglutinación y hemólisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una solución con azul tripán (Sigma®)
al 0,8%. Las células tratadas con los dendrímeros se centrifugaron y
se decantó el sobrenadante; tras resuspender el sedimento celular,
se trató con la solución de azul tripán durante 30 segundos,
procediéndose a centrifugación-lavado posteriormente
con PBS dos veces. Las células se observaron bajo microscopía óptica
y se contaron las positivas para la presencia de azul tripán
(células azules, muertas) en relación con el porcentaje de células
negativas (células vivas). Para ello se seleccionó un campo amplio
con al menos 100 células cada vez.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta técnica se utilizó para evidenciar efectos
deletéreos sobre el metabolismo celular. Se trata de un ensayo
colorimétrico basado en la capacidad selectiva de las células
viables para reducir el bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazolio (MTT, Sigma®) en cristales insolubles de formazán. Tras
el tiempo deseado de incubación de las distintas poblaciones
celulares con diferentes concentraciones de dendrímeros en placa de
96 pocillos (100.000 células/pocillo respectivamente), y con 3
pocillos como control positivo de inactividad celular [20% de
dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma®)], el sobrenadante que contenía
dendrímero se retiró y se sustituyó por 200 \muL de un medio de
cultivo sin suero ni rojo fenol (Opti-MEM®). Además
de los 200 \muL de Opti-MEM®, se añadieron 20
\muL de MTT filtrado previamente para conseguir su esterilidad
(Azul de Tiazolil, Sigma®) en PBS a una concentración de 5 mg/mL
(concentración final en pocillo de 0,5 mg MTT/mL). Después de 4
horas de incubación en condiciones de cultivo, se procedió a la
centrifugación de la placa a 2000 r.p.m. 10 minutos y a la posterior
retirada del sobrenadante con el exceso MTT que no reaccionó. Los
cristales de formazán se observaron al microscopio de contraste de
fase y se disolvieron posteriormente con 200 \muL de DMSO. La
placa se agitó a 700 r.p.m. en un agitador Eppendorf® para asegurar
la correcta disolución de dichos cristales. La concentración de
formazán se determinó por espectrofotometría utilizando un lector de
placas a una longitud de onda de 570 nm con una referencia de 690
nm. El espectrofotómetro se calibró a 0 utilizando
Opti-MEM® sin células. La viabilidad celular
relativa (%) respecto del control (células sin tratar) se calculó en
base a la fórmula: [A] test/[A] control x 100. Cada concentración de
dendrímero se ensayó por triplicado, siguiendo las directivas del
ATCC.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta técnica (CytoTox 96®
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay) se utilizó para
evaluar el daño en la superficie de la membrana celular debido a la
presencia de los distintos grupos periféricos aniónicos de los
dendrímeros. La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima que se
libera en el citoplasma debido a la lisis celular. El ensayo de LDH,
por lo tanto, es una medida de la integridad de la membrana, que se
basa en la oxidación de LDH a piruvato y la reducción de sales de
tetrazolio a cristales de formazán por el piruvato. Se dispensaron
en placa de 96 pocillos de fondo redondo 1*10^{5} células/pocillo
en un volumen de 100 \muL de medio completo y se añadió el
dendrímero en un volumen de 100 \muL, para obtener un volumen
final en el pocillo de 200 \muL. Controles: 1. 200 \muL de medio
completo sin células (background control); 2. 100 \muL de células
+ 100 \muL de medio completo; 3. 100 \muL de células + 100
\muL de tritón X-100 al 0,2%; 4. 100 \muL de
células + 100 \muL con el dendrímero a la concentración deseada.
Se incubaron en condiciones de cultivo durante las primeras 24 hs.
Se centrifugó la placa a 1500 r.p.m. 10 minutos y se retiraron 100
\muL de sobrenadante, con cuidado de no llevarse las células. Se
añadió 100 \muL de mezcla de reacción preparada en el momento
sobre los 100 \muL de sobrenadante y se incubó a temperatura
ambiente 30 minutos y en oscuridad. Finalmente, se midió a 490 nm y
690 nm de referencia. La citotoxicidad se obtuvo de la siguiente
fórmula: Citotoxicidad(%) = (4 - 2)/(3-2) * 100.
\vskip1.000000\baselineskip
Los hematíes se obtuvieron tras ser separados de
las CMSP mediante el mismo gradiente de Ficoll detallado
anteriormente. Los mismos se diluyeron adecuadamente en PBS hasta
poder ser visualizados de forma individualizada. Después se
resuspendieron en 500 \muL de PBS y se cultivaron en placa de 24
pocillos (300.000/ pocillo). Como control positivo se utilizaron
células tratadas con Tritón X-100 al 0,2%. Control
negativo: células tratadas solo con PBS. Los hematíes se incubaron
con distintas concentraciones de dendrímero. Se evaluó la presencia
de hemaglutinación, número de células y liberación de hemoglobina a
la hora mediante la recogida de 100 \muL de sobrenadante y
medición de absorbancias por espectrofotometría utilizando un lector
de placas a una longitud de onda de 550 nm y 690 nm como
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la capacidad antigénica de los
dendrímeros, se realizó un ensayo de proliferación celular. Se
preparó el experimento por triplicado en placa de 96 pocillos de
fondo plano (100.000 células por pocillo en 200 \muL de medio
completo). El experimento incluye un control negativo de
proliferación (células sin tratar), pocillos tratados con distintas
concentraciones de dendrímero y otro control positivo de
proliferación tratado con 2 \mug/mL de fitohemaglutinina (PHA).
Tras 4 días de incubación en condiciones de cultivo, se procedió a
la retirada del sobrenadante y a la preparación de las muestras para
el Kit de proliferación celular de BrdU (Bromodeoxyuridine Cell
Proliferation Assay, Chemicon International). Se realizó el
protocolo indicado por el kit y se obtuvo la incorporación de BrdU
en ADN de nueva síntesis. A mayor incorporación de BrdU, mayor
proliferación celular.
\vskip1.000000\baselineskip
El aislado viral X4
VIH-1_{NL4-3} es una cepa viral de
laboratorio establecida y se utilizaron células MT-2
para la expansión del virus. Se lavaron 2x10^{6}
MT-2 dos veces con medio completo y se transfirieron
a un tubo cónico de 15 mL a una concentración de 2x10^{6}
células/mL en medio completo. Posteriormente, se añadió
VIH-1_{NL4-3} a una concentración
de 1 partícula por célula o lo que es lo mismo, 1 M.O.I.
(Multiplicity Of Infection). Se cultivaron las MT-2
con el virus durante 2 horas en condiciones de cultivo, agitando el
cultivo cada 15-30 minutos. Finalmente se lavaron
los cultivos (células-virus) dos veces para retirar
el virus no integrado en el genoma celular. Las células se
transfirieron a un pocillo de p6 en un volumen de
3-4 mL. Se dejó en cultivo durante
2-3 días y se observó la presencia de sincitios en
el pocillo. Cuando la presencia de sincitios alcanzó un
80-90% de producción, se añadieron 12 mL de medio
completo con 20*10^{6} MT-2 y se dispensaron en
placa petri. A los 2-3 días, se centrifugó todo el
volumen y se recogió el sobrenadante. Se añadieron 12 mL de medio
completo con 20*10^{6} MT-2 a las células
anteriores (MT-2 infectadas) y se dispensaron en
placa petri. Se repitió este proceso hasta 3 veces. El sobrenadante
se alicuotó y se almacenó en un tanque de nitrógeno líquido, para
posteriormente ser titulado.
\vskip1.000000\baselineskip
El aislado viral R5
VIH-1_{Ba-L} es una cepa de
laboratorio establecida y el proceso de expansión del virus se
realizó de forma similar al
VIH-1_{NL4-3}, pero se utilizó en
este caso CMSP estimuladas como se indica más adelante en el
apartado 3. 8. 5. El sobrenadante se alicuotó y se almacenó en un
tanque de nitrógeno líquido, para posteriormente ser titulado.
\vskip1.000000\baselineskip
El aislado viral
VIH-1_{NL4-3} y
VIH-2_{CBL23 }se tituló en la línea celular
MT-2. Se cultivaron 2x10^{4} células
MT-2 con medio completo en placas de 96 pocillos y
se añadieron 40 \muL de la preparación viral a distintas
concentraciones, para lo que se realizaron las correspondientes
diluciones. Se dispusieron las diluciones por octuplicado y se
mantuvieron en condiciones de cultivo durante una semana.
Transcurrido este tiempo se procedió a la lectura de la titulación
por visualización del efecto citopático. El título se calculó
aplicando la fórmula de Spearman-Karber. También se
tituló mediante cuantificación de proteína p24 por un inmunoensayo
enzimático (ELISA p24. INNOTEST^{TM} HIV antigen mAB,
Innogenetics®) y se establece la relación partículas infectivas por
mL y \mug de virus por mL. El aislado viral
VIH-1_{Ba-L} se tituló mediante
cuantificación de proteína p24 por ELISA. Para asegurar la pureza
del virus, las alícuotas descongeladas se filtraron a través de
filtros de 0.22 \mum antes de la cuantificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las CMSP se estimularon durante 48 horas con 2
\mug/mL de PHA y 50 UI de IL-2, para provocar una
activación policlonal; a las 48 horas se lavan las células con PBS.
La concentración deseada de células se incubó con el número de
partículas de VIH deseado en medio completo durante 2 horas en
condiciones de cultivo. Tras este tiempo se recogieron las células
del cultivo y se lavaron tres veces con PBS para eliminar el virus
no integrado en el genoma celular, tras lo cual se depositaron en
placa de 24 pocillos o 96 pocillos (dependiendo del ensayo) en medio
completo con 50 UI/mL de IL-2. MT-2,
HEC-1A, CDi, CDm y macrófagos se recogieron el día
del experimento y se lavaron 2 veces con PBS antes de ser infectadas
con el VIH durante 2 o 3 horas, según el experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estos ensayos se utilizaron
HEC-1A confluyentes en placas de 24 pocillos. Se
procedió al cultivo de 3*10^{5} células en 500 \muL de medio
completo por pocillo y se cultivaron durante 3 días. En los ensayos
de adhesión, se pre-trataron las células con los
dendrímeros 2 h, 1 h y 30 minutos antes de la infección con el
VIH-1_{NL4-3}. Una vez cumplido el
tiempo estimado, se procedió a infectar con el
VIH-1_{NL4-3} cada pocillo durante
3 horas. Tras este tiempo, se procedió a lavar 3 veces la monocapa
con PBS y se dejó en condiciones de cultivo. A las 24 h y 72 h, se
recogió sobrenadante para cuantificar antígeno p24 por ELISA. Para
el ensayo de internalización, el procedimiento inicial fue el
indicado anteriormente. Tras las 3 horas de infección, se lavó 3
veces la monocapa con PBS y se procedió a la lisis celular mediante
la adición de Tritón x-100 0,2% durante 45 minutes a
37ºC. El sobrenadante se recogió para cuantificar antígeno p24 por
ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó para este experimento una placa de 96
pocillos de fondo plano con
Poli-L-Lisina (PLL, Sigma®)
recubriendo el fondo del pocillo. Para ello, 50 uL de PLL se
incubaron a 37ºC durante una hora. Tras lavar los pocillos 3 veces
con PBS, se incubaron 4 ng de VIH toda la noche a 4ºC, para asegurar
que las partículas virales se adhirieron al fondo del pocillo. Se
lavó cada pocillo 3 veces con PBS para retirar el VIH no adherido a
la placa y se procedió al tratamiento de cada pocillo con distintas
concentraciones de dendrímero durante una hora. Tras este tiempo, se
lavó 3 veces con PBS y se añadieron CMSP previamente estimuladas. El
sobrenadante de este cultivo se recogió a los 4 días y se cuantificó
antígeno p24 por ELISA para evaluar la cantidad de VIH producida por
las CMSP en los distintos tratamientos. Se utilizó como control
positivo de lisis de las partículas virales Tritón
x-100 al 1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener un perfecta monocapa de células
epiteliales polarizadas, las HEC-1A se crecieron en
medio completo sobre un soporte de policarbonato permeable de 0.4
\mum de poro (Costar, Cambridge, MA). Se procedió al cultivo de
2*10^{5} células por pocillo y se cultivaron durante 7 días, con
cambios de medio cada 2-3 días. El dendrímero se
añadió una hora antes de la infección. Después de añadir las
partículas virales a la zona apical de la monocapa (100 ng), se
recogió el sobrenadante de la cámara de la zona basolateral a las
24/48 horas. La concentración viral se cuantificó por ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la cepa FDA209 (ATCC 6538) para
estudiar la capacidad de los dendrímeros como bactericidas. Las
bacterias se crecieron en placas de Mueller Hinton agar
(Sigma^{TM}) durante toda la noche a 37ºC antes de cada
experimento.
6.1. Experimento de biomasa: El día del
ensayo, una colonia de S. aureus se crecía en 15 mL de medio
Mueller Hinton durante 5 h. Tras este tiempo, se contaba el número
de S. aureus y se dispensaban 10^{5} S. aureus por
punto (100 \muL de medio Mueller Hinton en placa de 96 pocillos de
fondo en U). Se añadieron diluciones seriadas de los dendrímeros
evaluados hasta completar un volumen de 200 \muL por punto. Se
utiliza ampicilina (Gobemicina®, Laboratorios Normon) como control
positivo de bactericida. La cantidad de biomasa formada 24 h después
del tratamiento con el dendrímero, se cuantificó
espectrofotométricamente con un lector de placas
(Biowhittakermicroplate reader 2001, Innogenetics®. \lambda=550
nm).
6.2. Experimento de proliferación: Para
evaluar la proliferación de S. aureus en presencia del
dendrímero, se utilizó el kit de proliferación celular 24 h después
del tratamiento (Bromodeoxyuridine Cell Proliferation Assay,
Chemicon International. Lectura en Biowhittakermicroplate reader
2001, Innogenetics®. \lambda=450 y referencia \lambda=550 nm).
El número de células, tratamiento con los dendrímeros y tiempo de
exposición se describen en el experimento de biomasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimentos de inflamación: Para los
experimentos se realizaron transfección transitoria utilizando los
plásmidos indicadores pTNF-luc y
pNF-\kappaB-luc que contiene 3
copias en tandem del sitio NF-\kappaB del promotor
de la conalbúmina. La línea celular Jurkat fue nucleofectadas con el
nucleofector de AMAXA siguiendo el protocolo de la casa comercial
"cell line nucleofector kit V" y el programa específico
utilizado en el X-005. Las células transfectadas se
estimularon durante 16 horas con los diferentes estímulos que
aparecen en las gráficas (TNF-alpha, anticuerpo
monoclonal anti-TNF-alpha y
diferentes concentraciones (5 y 10 micromolar) del dendrímero
aniónico sufonato. Tras los diferentes tratamientos, las células
transfectadas se recogieron por centrifugación y se lisaron con
tampón de lisis comercial "Dual-luciferase Assay
System Kit" (Promega), según las recomendaciones del fabricante.
Se midió la cantidad de proteína en 5 microlitros de lisado celular
por el método de BSA-BCA (Pierce, Rockford, USA).
Una vez cuantificado, se normalizaron los valores de proteína de
todas las muestras a 20 microgramos para medir durante 10 segundos
la actividad luciferasa en un luminómetro 1450 Microbeta
Luminiscence Counter (Walax, Trilux). Los valores de actividad de
luciferasa de luciérnaga se expresan como inducción respecto a las
células control.
7.1 Experimento de transfección con
TNF-alpha (citocina proinflamatoria). Las
células Jurkat clon E6 transfectadas con el
pTNF-alpha fueron tratadas con un anticuerpo
monoclonal anti-TNF como control positivo de la
inhibición de la actividad transcripcional del TNF. Como se puede
observar el dendrímero sulfonato fue capaz de disminuir la actividad
promotora del plásmido pTNF-luc a las dosis de 5 y
10 micromolar (en una medida dos y tres veces inferior con respecto
al control de células sin estimular en una serie de tres
experimentos independientes). El dendrímero aniónico disminuye la
actividad transcripcional del TNF-alpha.
\newpage
7.2 Experimento de transfección con el
plásmido pNF-kB-luc. Las células
Jurkat se transfectaron con el plásmido
pNF-kB-luc, se cultivaron en
presencia de sulfonato (10 micromolar) durante 16 horas y se midió
la actividad luciferasa. Se utilizó TNF (20 ng/ml) como control
positivo. En el experimento claramente se observa una disminución de
la actividad del plásmido pNF-kB-luc
en presencia del sulfonato, similar a la obtenida cuando las células
se tratan con 10 microgramos mililitro de un anticuerpo
anti-TNF-alpha. Además, cuando se
tratan las células con sulfonato+TNF-alpha se
observa una reversión de la inducción de
NF-kB-luc. Los resultados
presentados están expresados como índice de inducción normalizado
con los valores control de células sin tratamiento y es un
experimento representativo de tres experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar una completa caracterización de
las tres generaciones de cada nuevo dendrímero sintetizado, se
elaboró un sistema de screening para determinar las concentraciones
biocompatibles que requerían un estudio más detallado. Antes de
nada, se establecieron los límites de solubilidad de los dendrímeros
de cada generación en agua. Se disolvieron los dendrímeros a
concentraciones de 3 mM, 2 mM y 1 mM, siendo esta última la que
mejor solubilidad presentaba sin la ayuda de factores físicos
adicionales para su perfecta solubilización (vortex, calor, etc).
Una vez asentada la concentración de partida en todos los
dendrímeros testados, se procedió a evaluar su citotoxicidad en las
células diana de nuestro estudio, las células epiteliales vaginales
(HEC-1A) y las CMSP. A concentraciones crecientes de
dendrímero y se contó el porcentaje de células muertas a las 24 hs
mediante la técnica de azul tripán.
Las células mostraron tinción azul superior al
control a partir de 20 \muM de dendrímero, por lo que se decidió
centrar los estudios de viabilidad en una concentración determinada,
10 \muM. Para evaluar el daño a la membrana celular que pueden
causar las cargas aniónicas de la periferia (formando poros debido a
interacción con diversos receptores celulares o por interacción
electrostática con zonas positivas de la membrana), se realizó
ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa al sobrenadante.
Estos estudios se complementaron con ensayos de actividad celular de
la mitocondria, donde la reducción de sales de tetrazolio a
cristales de formazan es un reflejo indirecto del correcto
metabolismo de las células. Véase la Figura 1, donde se evaluaron
inicialmente las 3 generaciones de los dos tipos de dendrímeros con
núcleo de silicio, obteniendo unos niveles aceptables de
biocompatibilidad y siempre dentro de los márgenes de aceptabilidad
indicados para ambos ensayos (no más del 10% de LDH en sobrenadante
y no más de una disminución del 20% en la actividad celular). Este
experimento se llevó a cabo en las células donde los dendrímeros se
expondrán más tiempo, en las células epiteliales del endometrio de
la vagina (HEC-1A). Se puede establecer una buena
viabilidad de la membrana celular a tiempos cortos por el ensayo de
LDH, ya que ningún dendrímero produce una liberación de LDH superior
al 10% tras una hora de contacto con las células. El suramin, una
molécula formada por 6 grupos ácido naftaleno disulfónico y un grupo
central de urea, no muestra toxicidad pese a su alta concentración.
A las 24 horas de tratamiento, el control de células tratadas con
una molécula inerte como el dextrano (Dx), mostró cerca de un 10% de
concentración de LDH en el sobrenadante respecto al control. El
dextrano con grupos sulfonato en la periferia (DxS) mostró similar
toxicidad. De esta manera, un 10% de LDH se consideró aceptable a
las 24 horas debido a que la presencia de una molécula externa
per se, parece estar ocasionando una ligera perturbación en
las células con una membrana celular menos íntegra. Se obtuvo
similar resultado con los dendrímeros carboxilato y sulfonato,
aunque se observó que la segunda y tercera generación de carboxilato
no mostró valores significativos de LDH.
La viabilidad celular se estableció
paralelamente cuantificando la reducción de sales de tetrazolio
(MTT) por la mitocondria de las HEC-1A tratadas 24 h
con los dendrímeros. Se obtuvieron niveles de producción de
cristales de formazán por encima de un 80% y se determinó que la
concentración de dendrímero de 10 \muM es biocompatible con el
metabolismo celular de las HEC-1A.
Para ampliar este estudio, se diseñó un
experimento para evaluar el daño celular que estos dendrímeros
pudieran ocasionar en un modelo terapéutico de tratamiento de la
infección, además de la posibilidad de impedir la infección de las
CMSP (linfocitos TCD4+) que se encuentran entre la monocapa múltiple
estratifica del epitelio vaginal y bajo la misma.
Para reproducir la toxicidad en una línea más
fisiológica, se evaluó la toxicidad en CMSP. La viabilidad en este
caso se reduce en todos los casos y se hace más visible el punto de
inflexión a partir de 10 \muM. Véase la Figura 2.
Se observó una buena integridad de la membrana a
las 24 horas con respecto al control. Otros factores pueden
modificar la lectura por espectrofotometría, y se aceptó ese ligero
aumento de la viabilidad debido a la presencia del dendrímero. El
control positivo de liberación de LDH, el Tx-100 al
0.2%, funcionó en ambos experimentos y representó el 0% de
viabilidad frente al control. La toxicidad se presentó a partir de
10 \muM, excepto para el dendrímero con terminación carboxilato.
La actividad mitocondrial se mostró estable a la concentración de 10
\muM El bajo daño que produce a la membrana de células
fisiológicas como las CMSP, unido a la óptima actividad mitocondrial
de las células en presencia de una concentración de 10 \muM,
determinó que el G2SF16 se seleccionara para poner a punto los
ensayos de inhibición de la adherencia virus-célula,
internalización e infección del VIH en células epiteliales y CMSP.
Para ver el daño que este dendrímero produce en los eritrocitos a la
concentración de uso, se enfrentaron los eritrocitos a distintas
concentraciones de dendrímero.
\global\parskip0.870000\baselineskip
Se observó un 100% de hemólisis en el control de
hematíes tratados con Tritón X-100 0.2% (las células
estaban todas muertas y rotas) y un 5% de hemólisis en el control
negativo de células tratadas sólo con PBS. Cada pocillo se expresa
como el porcentaje respecto a la D.O (densidad óptica) del Tritón
X-100 al 0.2%, que se considera el 100%; además a
ese porcentaje se le resta el 5% de hemólisis del control negativo
de células no tratadas, encontrándose una bue-
na biocompatibilidad a 10 \muM, además de una carencia de hemaglutinación al microscopio óptico. Véase la Figura 3.
na biocompatibilidad a 10 \muM, además de una carencia de hemaglutinación al microscopio óptico. Véase la Figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Es muy importante cuando se quiere conocer el
perfil de biocompatibilidad de una nueva molécula, el saber si la
misma puede constituir un estímulo antigénico inespecífico. Esto
sería un inconveniente, por cuanto las células del sistema inmune
podrían reconocer a dicha molécula como un elemento extraño contra
el cual se desencadenaría una respuesta que muy probablemente
resultaría deletérea para el organismo. Por ello, se realizó un
estudio de proliferación linfocitaria en presencia de los distintos
dendrímeros, con el fin de comparar la capacidad de estimulación
linfocitaria que tendrían los mismos en contraste con un estímulo
mitogénico clásico como es la fitohematoglutinina (PHA). Las CMSP se
cultivaron en p96, y se trataron con los diferentes estímulos
durante 4 días. Se utilizó la concentración de dendrímero de 10
\muM, seleccionada para todos los experimentos de infección con el
VIH. Los resultados se expresan en porcentaje de BrdU incorporada en
las células que han proliferado frente al control. En la figura 4A,
se aprecia un aumento de la incorporación de BrdU en el nuevo ADN
sintetizado por las células en división, debido a la presencia de
PHA. El dendrímero solo a la concentración de 10 \muM carece de
efecto mitogénico en las CMSP. El tratamiento con dendrímero a la
vez que PHA, disminuye ligeramente el efecto mitogénico. Para
comprobar si el dendrímero G2SF16 retrasa la proliferación celular
en presencia de un mitógeno, en la figura 4B se utilizaron CMSP
estimuladas previamente 3 días con PHA. Al cuarto día se trataron
las células con igual cantidad de PHA, PHA más G2SF16 y G2SF16 solo,
encontrándose una disminución de la incorporación de BrdU tras 4
días de tratamiento. Esto indica que el dendrímero está inhibiendo
el estímulo mitogénico, un dato interesante en el estudio de la
inflamación a nivel local en el momento de administrar este tipo de
dendrímero in vivo. Véase la Figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Los dendrímeros que iban a ser expuestos sobre
la monocapa de células epiteliales habían demostrado no ser tóxicos
ni mitogénicos a la concentración de 10 \muM. Para su posible uso
como microbicida, se decidió evaluar la capacidad de interaccionar
con el virus en el proceso de adhesión de éste a la superficie de la
membrana celular. La molécula de dendrímero actuaría así como una
barrera física en la prevención de la infección por VIH de las
células endometriales y de su paso a la cavidad interna del
útero.
Para evaluar la eficacia de impedimento de
adhesión a la superficie celular, así como la capacidad de frenar la
internalización del virus en las HEC-1A, se diseñó
un experimento con las segundas generaciones de dendrímeros con
terminación carboxilato y sulfonato. La idea de un uso tópico de
esta molécula hace necesario evaluar si los tiempos de tratamiento
previos a la infección (pretratamiento) son limitantes a la hora de
comprobar la eficacia.
La gráfica expuesta a continuación muestra como
el pre-tratamiento de las HEC-1A a
distintos tiempos no modifica significativamente la eficacia del 60%
de inhibición de la adhesión del VIH-1 NL4.3. Este
dato se pudo verificar recogiendo los sobrenadantes de cultivo a dos
tiempos diferentes tras la infección, el pretratamiento es durante
30 min, 1 hora y 2 horas, luego se infecta con el VIH y el cultivo
se mantiene 24 horas (Figura 5A) se recoge el sobrenadante y se mide
el Agp24 y se infecta se mantiene 72 horas (Figura 5B) se recoge el
sobrenadante y se cuantifica el Agp24. El suramin se seleccionó como
control positivo de la inhibición de la adhesión ya que se ha
demostrado su unión electrostática a la gp120 de la región V3 de
VIH, lo que impide que su maquinaria de infección funcione
correctamente. p24 representa el antígeno p24 (material genético del
virus) que es detectado en el sobrenadante de los cultivos celulares
mediante un kit de ELISA (INNOTEST^{TM} HIV antigen mAB
-Innogenetics®). Véase Figura 5.
El siguiente experimento se realizó para
cuantificar el número de partículas virales que se encontraban en el
interior de las células previamente tratadas con dendrímero. Se
comprobó que durante las 3 h de infección, la cantidad de virus
detectada por ELISA era un 70% menor que en las células control, lo
que confirma el dato anterior y refuerza la teoría de que el
dendrímero polianiónico está ejerciendo de barrera sobre las células
ante el ataque viral. Se utilizó una concentración de 10 \muM de
todos los reactivos. Véase la figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez comprobada la eficacia del dendrímero en
bloquear la adhesión e internalización de las partículas virales, se
procedió a intentar comprender el mecanismo de acción. Para ello, se
diseñó un experimento que consistía en exponer las partículas
virales a la presencia del dendrímero, para posteriormente usar esta
combinación en cultivos de CMSP estimuladas (preparadas para la
infección viral). Se utilizó VIH-1 NL4.3 (tropismo
X4) y VIH-1 BaL (tropismo R5), para analizar el
efecto que pudiera tener el dendrímero polianiónico con la V3 de la
gp120 de ambos tipos virales, y si el uso de un coreceptor distinto
variaba la eficacia de inhibición. Los resultados del ELISA de
cuantificación de antígeno p24 a los 4 días de cultivo, muestran una
mínima presencia de VIH en el sobrenadante de las CMSP tratadas con
10 \muM del dendrímero G2SF16. Esto se traduce en una capacidad
encapsuladora o interferente del dendrímero con el normal
funcionamiento del VIH para infectar las CMSP. Véase la Figura
7.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para reproducir de la mejor forma posible la
función que el dendrímero aniónico desarrollaría en la superficie
del endometrio y estudiar el paso de las viriones a través de la
mucosa estratificada del epitelio vaginal, se utilizaron
dispositivos de transwell que permiten recrear el fenómeno de
transcitosis (transporte de macromoléculas desde un espacio
extracelular a otro a través del citoplasma de una célula por medio
de una vesícula endocítica) debido a la posibilidad de formar una
monocapa perfecta de células adherentes en su interior y recolectar
información de los sobrenadantes de la cara apical y basolateral de
la monocapa. En la gráfica siguiente, se muestra el efecto del
dendrímero sobre el paso de las partículas virales a través de la
monocapa. Este efecto se reduce en un 40% en ambos casos, pero como
dato destacable indicar que en el caso de virus con tropismo R5,
nuestro control positivo (suramin) carece del efecto inhibidor. Por
tanto, la estructura interna del dendrímero está implicada en la
capacidad antiviral de la molécula Véase Figura 8, sobre la monocapa
de HEC-1A, se redujo la concentración de 10 \muM a
5 \muM de G2SF16 para evitar cualquier posible daño a la monocapa
perfectamente formada en las membranas de transwell. En esta gráfica
se muestra el efecto del dendrímero sobre el paso de las partículas
del VIH a través de la monocapa. Se recogió sobrenadante de la zona
basolateral a las 24 y a las 48 horas tras la infección.
La segunda generación de sulfonatos se evaluó
por su posible efecto profiláctico y terapéutico en CMSP mostrando
un 80% de inhibición en los ensayos de pre tratamiento de las
células con el dendrímero y un 60% en los ensayos de pos
tratamiento, lo que confirma las dos aplicaciones de este dendrímero
en un sistema más fisiológico como es una línea primaria linfoide.
Se utilizó T-20 (Fuzeon) y AZT como controles de
inhibición de la fusión viral y de la retrotranscriptasa inversa.
Véase la Figura 9. El G2SF16 mostró un 80% de inhibición en los
ensayos de pre-tratamiento de las células con el
dendrímero antes de la infección por el VIH-1 NL4.3
y un 60% en los ensayos de post-tratamiento, lo que
confirma las dos aplicaciones de este dendrímero en un sistema más
fisiológico como es una línea primaria linfoide. Se potencia de esta
forma la prevención de la infección por el VIH, así como la
inhibición de la replicación viral en células ya infectadas por el
VIH.
Se evaluó la capacidad de liberación de
partículas virales por las células dendríticas y macrófagos. Se
probaron controles como dextrano, suramin y mannan en dendríticas.
Se utilizó NL4.3 y Bal para un ensayo de internalización del virus
en presencia de nanopartículas inhibidoras. Se observó una clara
disminución de antígeno p24 en el sobrenadante de macrófagos en
presencia de G2SF16. En dendríticas inmaduras, la disminución de
antígeno p24 fue significativa para suramin, mannan y G2SF16. Véase
figura 10, donde, como se ha contado anteriormente, se evaluó la
capacidad de liberación de partículas virales por las células y se
infectó a 50 ng para asegurar una buena cuantificación. Se probaron
controles como dextrano, suramin y mannan en dendríticas. Se utilizó
NL4.3(columnas negras) y Bal (columnas blancas) para un
ensayo de internalización del virus en presencia de nanopartículas
inhibidoras. Se observó una clara disminución de antígeno p24 en el
sobrenadante de macrófagos en presencia de G2SF16. En dendríticas
inmaduras, la disminución de antígeno p24 fue significativa para
suramin, mannan y G2SF16.
También se determinó el efecto antibactericida
que tienen estos dendrímeros en presencia de bacterias. Para ello se
ha elegido Staphylococcus aureus como modelo de
experimentación. En estos experimentos hemos observado que a la
concentración utilizada de 10 \mum los dendrímeros presentan
aproximadamente un 50% de efecto bactericida (Figura 11) y un 85% de
efecto bacteriostático (Figura 12). Así mismo, hemos observado que
los dendrímeros terminados en grupos sulfonato son bactericidas más
potentes que los análogos terminados en grupos carboxilato.
Por otro lado, es importante destacar que en los
experimentos preliminares realizados se observa que los dendrímeros
descritos en la presente invención muestran un efecto
antiinflamatorio. Los datos obtenidos en los experimentos de
transfección de células Jurkat con los plásmidos
pTNF-luc (Figura 14) y
pNF-kB-luc (Figura 15) en presencia
del dendrímero aniónico G2SF16 claramente indican que el dendrímero
aniónico disminuye la actividad transcripcional de
NF-kappa y por lo tanto el proceso de
inflamación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los nuevos dendrímeros click con terminaciones
carboxilato y fosfonato (G2CKCOO16 y G2CKP32) también se evaluaron
para obtener los rangos de biocompatibilidad en la población celular
más expuesta a su acción, las células epiteliales de endometrio. En
la Figura 13A se puede apreciar la buena viabilidad celular hasta 10
\muM, mientras que en la Figura 13B se aprecia la inhibición de la
entrada en la misma línea celular pretratando estas con dendrímero
una hora antes de la infección con VIH_{NL4-3}.
Esta inhibición es dependiente de la concentración de dendrímero y
se obtiene hasta un 50% en el caso de la concentración de 10
\muM.
Estos resultados muestran que los dendrímeros
carbosilano aniónicos obtenidos con rutas sintéticas basadas en la
denominada "clik-chemistry", se comportan
también como potentes microbicidas, de forma similar a los
dendrímeros aniónicos con grupos sulfonato y carboxilato descritos
anteriormente.
Los dendrímeros previamente descritos en la
presente invención han demostrado ser capaces de inhibir la
infección causada por distintos virus, interfiriendo tanto con la
entrada del virus en las células como en pasos posteriores de
replicación viral. Ese es el caso por ejemplo del Herpes Simplex,
cuya infección se ve inhibida in vitro por efecto de
dendrímeros de polilisina modificados. También se ha conseguido
inhibir la replicación del VIH, tanto a nivel de la entrada celular
como en pasos posteriores, en este caso mediante la utilización de
dendrímeros PAMAM modificados covalentemente, que demostraron ser
capaces de interferir con la retrotranscriptasa y la integrasa del
virus. Aprovechando estas propiedades, se han desarrollado geles
vaginales para la prevención de enfermedades de transmisión sexual
con formulaciones basadas en dendrímeros, como es el caso de
VivaGel^{TM} (Starpharma), cuyo ingrediente activo es un
dendrímero de polilisina funcionalizado con restos
naftalendisulfonato que parece ser efectivo en la prevención de la
infección del VIH gracias a su capacidad de unirse a la
glicoproteína gp120 de la superficie del virus. Aunque en el diseño
de dendrímeros antivirales se tiene preferencia por aquellos que
presentan en su superficie grupos que mimetizan los que se
encuentran presentes en la superficie celular y que, por ello, son
capaces de competir con las células por la unión al virus, se ha
diseñado también un dendrímero con grupos amida de superficie que
funciona como inhibidor del virus respiratorio sincitial, se cree
que por la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos
periféricos del dendrímero con la proteína de fusión del virus, por
lo que es de esperar que dendrímeros funcionalizados con otros
grupos capaces de formar puentes de hidrógeno con proteínas virales
implicadas en la interacción con la superficie celular sean capaces
también de interferir con distintos virus, inhibiendo la infección
provocada por ellos.
En otros casos, los dendrímeros han sido
utilizados como antibacterianos o para desestructurar las membranas
celulares de algunos hongos. Cuando se diseñan para esta finalidad,
se tiene preferencia por los dendrímeros con grupos catiónicos en su
superficie, tales como aminas o grupos tetraalquilamonio, que
facilitan la adherencia de los dendrímeros a la membrana bacteriana,
causando la lisis de la bacteria. Tal es el caso de los dendrímeros
de poli(propilenimina) (PPI) con grupos alquilamonio
terciarios en su superficie, que han demostrado una amplia actividad
bactericida tanto contra bacterias Gram positivas como contra
bacterias Gram negativas [Chen, C.Z. y S.L. Cooper,
Biomaterials, 2002, 23, 3359-68; Chen C.Z.
et al, Biomacromolecules, 2000, 1, 473-80].
Estos dendrímeros presentan una mayor capacidad bactericida que
otros polímeros hiperramificados. En el caso de dendrímeros
funcionalizados con grupos aniónicos, se está estudiando el efecto
bacteriostático o fungistático que estructuras como los dendrímeros
pueden producir a nivel celular. La capacidad de agregar distintos
patógenos e impedir su crecimiento puede favorecer la eliminación de
los microorganismos por medio de las células polimorfonucleares del
sistema inmune.
Los dendrímeros de la presente invención,
funcionalizados con restos que contienen grupos aniónicos
carboxilato y sulfonato, representan una opción para ser utilizados
como microestáticos.
Los dendrímeros de la presente invención suponen
interesantes alternativas para estas áreas de la Biomedicina y se
describe aquí la naturaleza química de los dendrímeros, los estudios
referentes a su biocompatibilidad (realizados en líneas celulares,
en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y en hematíes),
los estudios de antigenicidad, los estudios de impedimento de
adherencia e internalización de partículas de VIH a la superficie
celular y estudios de inhibición de transcitosis a través de
monocapas de epitelio vaginal. Además de esta aplicación
profiláctica, también se evalúa su efecto terapéutico, ya que en
pacientes infectados el dendrímero podría impedir la progresión de
la infección a células sanas.
Claims (35)
1. Dendrímero carbosilano que comprende
- un núcleo polifuncional,
- al menos una generación, y
- una capa externa, que consiste, total o
parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula
(I):
- donde:
- R' es un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}),
- \quad
- p varía entre 1 y 3, y
- \quad
- X es el siguiente grupo de fórmula (II):
- donde:
- E es un grupo enlazante entre el silicio y el grupo amina,
- \quad
- z varía entre 1 y 4,
- \quad
- R^{1} se selecciona de un grupo de la lista que comprende -COOR^{2}, -SO_{3}R^{2} o -PO_{3}(R^{2})_{2}, y
- \quad
- R^{2} es hidrógeno o un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Dendrímero según la reivindicación 1, donde
el núcleo es de silicio.
3. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde p es 1.
4. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde R' es metilo.
5. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde E se selecciona de entre un alquilo
(C_{1}-C_{10}) o un grupo
-(CH_{2})_{x}-R^{3}, donde R^{3} es
un grupo triazol o fenol y x varia entre 1 y 6.
6. Dendrímero según la reivindicación 5 donde el
grupo alquilo de E es un propilo.
7. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde R^{2} es hidrógeno o metilo.
8. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde E es el grupo
-(CH_{2})_{x}-R^{3} y R^{3} es
triazol.
9. Dendrímero según la reivindicación 8, donde x
es 4.
10. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, donde E es el grupo
-(CH_{2})_{x}-R^{3} y R^{3} es
fenol.
11. Dendrímero según la reivindicación 10, donde
x es 1.
12. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde R^{1} es el grupo -COOR^{2}.
13. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde R^{1} es el grupo
-SO_{3}R^{2}.
14. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, donde R^{1} es el grupo
-PO_{3}(R^{2})_{2}.
15. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde z es 2.
16. Dendrímero según la reivindicación 14, donde
z es 1.
17. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, donde dicho dendrímero está en forma de sal
aniónica.
18. Dendrímero según la reivindicación 17, donde
la sal es de Na^{+}.
19. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, donde dicho dendrímero es al menos de
primera generación con la siguiente fórmula (III):
\vskip1.000000\baselineskip
- donde:
- R_{a} es un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}); y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula (I) descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, donde dicho dendrímero es al menos de
segunda generación con la siguiente fórmula:
- donde:
- R_{a}, R_{b} y R'', son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C_{1}-C_{6});
- \quad
- m tiene un valor de 1 a 3; y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula (I) descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, donde dicho dendrímero es al menos de
tercera generación con la siguiente fórmula (V):
\vskip1.000000\baselineskip
- donde:
- R_{a}, R_{b}, R_{c}, R'' y R''', son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C_{1}-C_{6});
- \quad
- m y n son iguales o diferentes y tienen un valor de 1 a 3; y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula (I) descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
\newpage
22. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, donde R_{a}, R_{b} o R_{c}, son
iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo
(C_{2}-C_{4}).
23. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, donde R'' y/o R''' son un grupo
metilo.
24. Compuesto de fórmula:
Et_{3}-R
- donde:
- Et es un grupo etilo y
- \quad
- R es el grupo terminal de fórmula (I) descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 o un grupo -(R')_{3-p}Si-[(CH_{2})_{4}-N_{3}]_{p}, donde R' es un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}), y p varía entre 1 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Dendrímero carbosilano que comprende:
- un núcleo de silicio,
- al menos una generación, y
- una capa externa, que consiste, total o
parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula
(VI):
- donde:
- R' es un grupo alquilo (C_{1}-C_{4}), y
- \quad
- p varía entre 1 ó 3.
\vskip1.000000\baselineskip
26. Dendrímero según la reivindicación 25, donde
p es 1.
27. Dendrímero según cualquiera de las
reivindicaciones 25 o 26, donde R' es un metilo.
28. Procedimiento de obtención de los
dendrímeros según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que
comprende:
- -
- síntesis de dendrímeros con terminaciones -NH_{2} y posterior funcionalización de estos grupos amino terminales con grupos carboxílicos, sulfonatos o fosfonato.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Procedimiento de obtención de los
dendrímeros según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que
comprende:
- -
- funcionalización inicial de aminas orgánicas con los grupos carboxílicos, sulfonatos, fosfonato o sus grupos precursores y su posterior unión de dichas aminas funcionalizadas a la superficie de los dendrímeros carbosilanos.
\vskip1.000000\baselineskip
30. Uso de los dendrímeros según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 23, para la elaboración de un
medicamento.
31. Uso de los dendrímeros según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 23, para la elaboración de un medicamento
para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades causadas por
virus, bacterias u hongos.
32. Uso según cualquiera de la reivindicación
31, donde la enfermedad es causado por el VIH.
33. Composición farmacéutica que comprende al
menos un dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23
y un vehículo farmacéuticamente activo.
34. Composición según la reivindicación 33, que
además comprende otro principio activo.
35. Uso de los dendrímeros según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 23 como vehículos de transporte de
moléculas.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201030233A ES2364264B2 (es) | 2010-02-18 | 2010-02-18 | Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales. |
| US13/579,849 US20130059818A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-02-17 | Carbosilane dendrimers and the use thereof as antiviral agents |
| AU2011217142A AU2011217142A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-02-17 | Carbosilane dendrimers and the use thereof as antiviral agents |
| EP11719842A EP2537880A2 (en) | 2010-02-18 | 2011-02-17 | Carbosilane dendrimers and the use thereof as antiviral agents |
| BR112012020870A BR112012020870A2 (pt) | 2010-02-18 | 2011-02-17 | dendrímeros carbosilanos e seu uso como antivarais. |
| CN2011800101295A CN102858851A (zh) | 2010-02-18 | 2011-02-17 | 碳硅烷树枝状化合物及其作为抗病毒剂的用途 |
| JP2012553360A JP2013519711A (ja) | 2010-02-18 | 2011-02-17 | カルボシランデンドリマー及び抗ウイルス剤としてのそれらの使用 |
| PCT/ES2011/070104 WO2011101520A2 (es) | 2010-02-18 | 2011-02-17 | Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201030233A ES2364264B2 (es) | 2010-02-18 | 2010-02-18 | Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2364264A1 true ES2364264A1 (es) | 2011-08-30 |
| ES2364264B2 ES2364264B2 (es) | 2012-02-15 |
Family
ID=44370707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201030233A Active ES2364264B2 (es) | 2010-02-18 | 2010-02-18 | Dendrimeros carbosilanos y su uso como antivirales. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2364264B2 (es) |
-
2010
- 2010-02-18 ES ES201030233A patent/ES2364264B2/es active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J Bermejo et al, Chemistry European Journal 2007, vol 13, páginas 483-495. "Water-soluble carbosilane dendímers: Synthesis, biocompatibility and complexation with oligonucleotides. Evaluation for medical applications" página 486 compuesto 18 * |
| P Ortega et al, Organic Biomolecular Chemistry 2008, vol 6, páginas 3264-3269. "Amine and ammonium functionalization of chloromethylsilane-ended dendrimers. Antimicrobial activity studies" página 3266 fórmula 4 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2364264B2 (es) | 2012-02-15 |
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|---|---|---|---|
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Ref document number: 2364264 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20120215 |