ES2364896T3 - Proceso para degradar zearalenona en un producto de alimentación para animales utilizando lacasa. - Google Patents
Proceso para degradar zearalenona en un producto de alimentación para animales utilizando lacasa. Download PDFInfo
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Abstract
Proceso para degradar la micotoxina zearalenona en un producto de alimentación para animales, proceso que comprende tratar dicho producto de alimentación para animales con una lacasa.
Description
[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en forma legible por ordenador.
[0002] La presente invención se refiere a un método para destoxificación de productos alimenticios contaminados por la micotoxina zearalenona.
[0003] Diferentes especies de Fusarium de plantas patógenas y/o post-cosecha en cereales producen sustancias tóxicas de interés considerable para los ganaderos y avicultores, por ejemplo, desoxinivalenol, toxina T-2, toxina HT-2, diacetoxiscirpenol y zearalenona.
[0004] Zearalenona se encuentra a nivel mundial en un número de brotes de cereales, tales como maíz, cebada, avena, trigo, centeno, arroz, milla y sorgo. La producción de zearalenona no parece ocurrir en cantidades significantes antes de la cosecha, pero bajo condiciones medioambientales apropiadas, es fácilmente producida en maíz y granos pequeños durante el almacenamiento.
[0005] Cuando el grano de cereal se usa en la producción de etanol y el almidón se consume, la zearalenona se concentra en los subproductos de fermentación, por ejemplo, en el grano seco de la destiladora. El contenido de zearalenona en los subproductos de fermentación puede ser aumentado triplemente con respecto al grano de cereal.
[0006] La toxina es termoestable, y no se destruye por un largo almacenamiento, por asado, o por la adición de ácido propiónico o retardadores de molde.
[0007] A pesar de su desemejanza estructural a los estrógenos esteroidales, la zearalenona y varios de sus derivados poseen actividad estrogénica. La zearalenona sufre un pliegue de manera que grupos hidróxilo o hidróxilo potenciales se vuelven apropiadamente orientados para facilitar la unión a receptores tisulares que normalmente se enlazan a estrógenos.
[0008] La zearalenona es la toxina primaria causante de infertilidad, aborto u otros problemas de la gestación, especialmente en puercos. Los síntomas son especialmente severos en los lechones prepubertales incluyendo mamas aumentadas, hinchazón del útero y la vulva, y atrofia de los ovarios. En casos severos, puede ocurrir un prolapso de la vulva y el recto. Los jabalíes muestran mamas aumentadas y testículos atrofiados.
[0009] La zearalenona está presente en la carne de animales que se alimentan con grano contaminado al igual que en pan cocido a partir de trigo contaminado. Mientras casos de envenenamiento de seres humanos son raros hay interés sobre el efecto de la exposición de seres humanos a tal actividad estrogénica durante un periodo largo.
[0010] La inactivación de micotoxinas, incluyendo la zearalenona, usando epoxidasa o lactonasa se describe en WO9612414.
[0011] El documento de patente WO 2007/133263 A (GENENCOR INTERNATIONAL, INC., 22 Noviembre 2007) divulga un proceso para degradar micotoxinas en productos de alimentación para animales utilizando transferasas de acilo en combinación con peróxido de hidrógeno.
[0012] El resumen DATABASE WPI Week 200281 Derwent Publications Ltd., AN 2002-743666 (correspondiente al documento de patente japonesa JP 2002 153257 A (IDEMITSU KOSAN CO LTD, 28 de mayo de 2002)) divulga un proceso para degradar sustancias de hidrocarburo halogenado tóxico en la tierra utilizando lacasas.
[0013] Hay una necesidad de más métodos de destoxificación de productos de alimentación para animales, por ejemplo, tal como fermentación de subproductos, incluyendo grano seco y húmedo de destilería, contaminado por la micotoxina zearalenona.
Resumen de la invención
[0014] Los inventores de la presente invención han descubierto que zearalenona en un producto de alimentación para animales se puede degradar en sustancias no tóxicas tratando el producto de alimentación para animales con una lacasa. Por consiguiente, en un primer aspecto la invención proporciona un proceso para degradar zearalenona en un producto de alimentación para animales, dicho proceso comprende tratar dicho producto de alimentación para animales con una lacasa.
[0015] En un segundo aspecto la invención proporciona un uso de una lacasa para degradar zearalenona.
Zearalenona
[0016] En el contexto de esta invención el término "zearalenona" comprende la micotoxina zearalenona producida a partir de ciertas Fusarium sp. El nombre de la IUPAC es (4S,12E)-15, 17-Dihidroxi-4-metil-3-oxabiciclo[12.4.0]octadeca-12, 15, 17, 19-tetraeno-2, 8-diona. El término "zearalenona" también comprende cualquier derivado de zearalenona que comprende uno
o más grupos hidróxilo susceptibles de modificación por una lacasa.
Productos de alimentación para animales
[0017] El término "animal" incluye todos los animales, incluyendo seres humanos. Ejemplos de animales son ganado bovino, (incluyendo pero no limitado a vacas y terneros); animales mono-gástricos, por ejemplo cerdos o puercos (incluyendo, pero no limitado a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos y pollos (incluyendo pero no limitado a pollos para asar, gallinas ponedoras); y peces (incluyendo pero no limitado a salmón).
[0018] El término "alimentación para animales" o "producto de alimentación para animales" significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada para la ingesta por un animal.
[0019] El producto de alimentación para animales puede ser un producto que aparte de un nivel indeseado de zearalenona es conveniente para el consumo por un animal. El producto de alimentación para animales puede también ser un producto sospechoso de comprender un nivel indeseado de zearalenona, y/o un producto con un nivel desconocido de zearalenona, incluyendo productos que no comprenden un nivel detectable de zearalenona.
[0020] Preferiblemente el producto de alimentación para animales es un producto a base de grano. Preferiblemente el producto a base de grano comprende cereal(es), por ejemplo, uno o más de maíz, trigo, cebada, centeno, arroz, sorgo y mijo. En una forma de realización, el producto de alimentación para animales puede por ejemplo derivar solamente de cereal(es), y en otra forma de realización parcialmente de leguminosas, por ejemplo de semilla de soja, y parcialmente de cereales. El producto a base de grano puede comprender grano molido o entero, por ejemplo, grano molido seco o húmedo, incluyendo producto a base de grano que comprende fracciones de grano molido seco o húmedo, por ejemplo, fracciones de gluten, proteína, almidón, y/o aceite. También se prefieren productos que comprenden subproducto de procesos de elaboración y/o de fermentación, por ejemplo, granos agotados. Granos agotados son los subproductos de la producción de bebidas alcohólicas y combustibles de etanol. Grano agotado de cervecería (BSG) es el residuo de producción de cerveza en cervecerías, usando la cebada malteada como la materia prima principal. Grano agotado de destilería (DSG) es el producto dejado en destilerías después de que el alcohol haya sido eliminado por destilación de los granos fermentados tales como maíz, trigo, cebada, arroz, y centeno. Grano agotado de destilería es también conocido como grano de destilería. Grano húmedo de destilería (WDG) se seca para producir grano seco de destilería (DDG) que se usa principalmente como alimentación para animales.
Lacasas
[0021] En el contexto de esta invención el término "lacasas" incluye enzimas comprendidas por la clasificación enzimática
E.C. 1.10.3.2.
[0022] Preferidas son las enzimas mencionadas más abajo, especialmente enzimas recombinantes y/o sustancialmente purificadas.
[0023] Preferiblemente, la lacasa empleada se deriva de una cepa de Polyporus sp., en particular una cepa de Polyporus pinisitus o Polyporus versicolor, o una cepa de Myceliophthera sp., por ejemplo M. thermophila o una cepa de Rhizoctonia sp., en particular una cepa de Rhizoctonia praticola o Rhizoctonia solani, o una cepa de un Rhus sp., en particular Rhus vemicifera.
[0024] En formas de realización específicas de la invención la lacasa es una lacasa de Polyporus sp. especialmente la lacasa de Polyporus pinisitus (también llamada lacasa de Trametes villosa) descrita en WO 96/00290 o una lacasa de Myceliophthera sp. especialmente la lacasa Myceliophthera thermophila descrita en WO 95/33836.
[0025] Además, la lacasa puede ser una lacasa de Scytalidium sp., tal como la lacasa de S. thermophilium descrita en WO 95/33837 o una lacasa de Pyricularia sp., tal como la lacasa de Pyricularia oryzae que se puede comprar a SIGMA bajo la marca registrada SIGMA Nº. L5510, o una lacasa de Coprinus sp., tal como una lacasa de C. cinereus, especialmente una lacasa de C. cinereus IFO 30116, o una lacasa Rhizoctonia sp., tal como una lacasa de R. solani, especialmente la lacasa neutra de R. solani descrita WO 95/07988 con un pH óptimo en el intervalo de 6,0 a 8,5.
[0026] La lacasa puede también ser derivada de un hongo tal como Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Aspergillus, Neurospora, Podospora, Phlebia, por ejemplo P. radiata (WO 92/01046), Coriolus sp., por ejemplo C. hirsitus (JP 2-238885),
o Botrytis.
[0027] En formas de realización preferidas la lacasa es una lacasa de Myceliophthora thermophila (MtL) con la secuencia de aminoácidos depositada como GENESEQP: AAR88500 y mostrada aquí como SEC ID NO:1., una lacasa de Polyporus pinsitus (PpL) con la secuencia de aminoácidos depositada como UNIPROT: Q99044 y mostrada aquí como SEC ID NO:2, una lacasa de Streptomyces coelicolor ScL con la secuencia de aminoácidos depositada como SWISSPROT: Q9XAL8 y mostrada aquí como SEC ID NO:3, o una lacasa con una secuencia de aminoácidos homóloga a cualquiera de estas secuencias.
[0028] La lacasa debe estar presente en el medio que debe ser destoxificada en cantidades eficaces. Preferiblemente la lacasa está presente en concentraciones de 0,01-100 mg de proteína enzimática por kg de materia seca, preferiblemente 0.1-10 mg de proteína enzimática por kg de materia seca, o más preferiblemente 1-5 mg de proteína enzimática por kg de materia seca.
El mediador
[0029] En una forma de realización un mediador que actúa como donante electrónico para la lacasa se usa con la lacasa. El mediador debería estar presente en el medio para ser destoxificado en cantidades eficaces.
[0030] Varios mediadores son conocidos; véase por ejemplo WO9412620, WO9412621, WO9501626, WO9600179 y WO9923887.
[0031] Preferido para la invención es un mediador seleccionado de metilsiringato (MES), ácido fenotiazina-10-propiónico (PPT), N-(4-cianofenil)acetohidroxámico (NCPA), acetosiringona, siringaldehido, ácido p-cumárico, 2,2'-Azinobis(3etilbenztiazolina-6-sulfonato), 1-hidroxibenzotriazol, 2,4-pentanodiona, y fenotiazina.
[0032] Dichos mediadores están disponibles comercialmente o pueden ser hechos por métodos conocidos en la técnica.
El medio
[0033] En una forma de realización la lacasa está degradando la zearalenona en un medio que comprende el producto de alimentación para animales. El medio es preferiblemente acuoso y puede ser un líquido, una pasta o un compuesto acuoso. Para formar un agua de medio adecuado se puede adicionar al producto de alimentación para animales. La lacasa y el mediador pueden ser comprendidos, bien separadamente o juntos, en formulaciones sólidas o líquidas adecuadas para la aplicación a dicho medio.
[0034] En una forma de realización la lacasa está degradando la zearalenona a una extensión por la cual el contenido de zearalenona por kg de producto de alimentación para animales en materia seca se reduce a menos del 50%, menos del 60%, menos del 70%, preferiblemente menos del 80%, más preferiblemente menos del 85%, aún más preferiblemente menos del 90%, y de la forma más preferible menos del 95% de la cantidad inicial.
[0035] La eficiencia de destoxificación de la invención depende de por ejemplo disponibilidad de oxígeno, pH, temperatura y tampón del medio. Por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a un valor de pH en el que la actividad relativa de la lacasa real es al menos del 50, o 60, o 70, o 80 o 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a una temperatura en la que la actividad relativa de la lacasa real es al menos del 50, o 60, o 70, o 80 o 90%. La actividad relativa se calcula con respecto a la actividad al valor de pH donde la actividad máxima es observada.
Oxígeno en el medio más O2, se puede añadir oxígeno adicional, por ejemplo como aire atmosférico presurizado o como oxígeno puro presurizado.
pH en el medio
[0037] Dependiendo, entre otras cosas, de las características de la lacasa y del mediador empleado, el pH en el medio empleado debería normalmente estar en el intervalo de 5-11, preferiblemente en el intervalo 6-10, por ejemplo 6,5-8,5.
Temperatura en el medio
[0038] Preferiblemente se aplica una temperatura de reacción que está próxima de la temperatura óptima para la lacasa. En numerosas formas de realización de la invención, temperaturas en el intervalo de 10-65°C, más preferiblemente 30-50°C, deberían ser empleadas.
Duración del tratamiento
[0039] La duración del tratamiento depende, entre otras cosas, del tipo de tratamiento, del tipo de artículo para ser tratado, de las propiedades del medio, por ejemplo temperatura y pH y del tipo y cantidades de enzima y mediador empleado.
[0040] La reacción enzimática es continuada hasta que el resultado deseado es conseguido, tras lo cual éste puede o no ser detenido inactivando la enzima, por ejemplo, por una etapa de tratamiento térmico.
[0041] Para fines de destoxificación, los tiempos de tratamiento se pueden emplear en el intervalo de 1 minuto a 1 semana. En muchos casos un tiempo de tratamiento en el intervalo de 6 a 48 horas será adecuado.
Identidad
[0042] La relevancia entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos es descrita por el parámetro "identidad".
[0043] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Bio /. 48: 443-453) según está implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización abierta de hueco de 10, penalización de extensión de hueco de 0.5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle marcado "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:
[0044] Para objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de desoxirribonucleótido es determinado usando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) según está implementado en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización abierta de hueco de 10, penalización de extensión de hueco de 0.5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle marcado "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:
Secuencia homóloga
[0045] El término "secuencia homóloga" se define como una proteína predicha que da un valor E (o puntuación de expectación) inferior a 0,001 en una búsqueda rápida (Pearson, W.R., 1999, en Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener y S. A. Krawetz, ed., págs. 185-219) con una secuencia especifica.
[0046] El término "secuencia homóloga" puede también ser definida como una secuencia que tiene un grado de identidad de al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%,
o incluso 100%, a una secuencia especifica.
EJEMPLOS Ejemplo 1
5
Enzimas
[0047] Una lacasa de Myceliophthora thermophila (MtL) con la secuencia de aminoácidos mostrada aquí como SEC ID NO:1.
10 Una lacasa de Polyporus pinsitus (PpL) con la secuencia de aminoácidos mostrada aquí como SEC ID NO:2. Una lacasa de Streptomyces coelicolor (ScL) con la secuencia de aminoácidos mostrada aquí como SEC ID NO:3.
Mediadores
15 [0048] Metilsiringato (MeS) Ácido fenotiazina-10-propiónico (PPT)
[0049] Ensayo: Las reacciones fueron realizadas en volúmenes de 300 microL en tubos eppendorf comprendiendo zearalenona 30 microM, mediador 0.2 mM, acetato sódico 100 mM y enzima 0.1 mg EP/ml. En reacciones de control el
20 volumen enzimático fue sustituido una cantidad equivalente de H2O. Las reacciones fueron incubadas 24 horas a 37°C antes de ser terminadas añadiendo 600 microL de una solución de parada de acetonitrilo de 100 microM. Las reacciones fueron almacenadas a -20° C hasta el análisis cromatográfico.
[0050] Análisis cromatográfico: Las muestras fueron centrifugadas y el sobrenadante analizado para zearalenona por HPLC
25 DAD como se describe por Smedsgaard (J. Chromatogr. A, 1997, 760, 264-270). El DAD escaneado de 200-600 nm. La separación fue hecha en un Phenomenex (Torrance; CA) Luna C18(2) 10x2 mm ID, 3 micrómetro, columna 2, usando una forma de movimiento de gradiente lineal del 5% al 100% de acetonitrilo en 20 min. La zearalenona residual fue calculada con respecto al control. Los resultados se presentan en tablas 1 y 2.
30 Tabla 1. Zearalenona residual (ZEA) después de 24 horas de incubación con 3 lacasas diferentes y dos mediadores a pH 4,5.
- Enzima
- Mediador pH ZEA residual (%)
- Control
- MeS 4.5 100
- MtL
- MeS 4.5 8,8
- PpL
- MeS 4.5 4
- ScL
- MeS 4.5 43,2
- Control
- PPT 4.5 100
- MtL
- PPT 4.5 0
- PpL
- PPT 4.5 0
- ScL
- PPT 4.5 0
35 Tabla 2. Zearalenona residual (ZEA) después de 24 horas de incubación con 3 lacasas diferentes y dos mediadores a pH 6.
- Enzima
- Mediador pH ZEA residual (%)
- Control
- MeS 6.0 100
- MtL
- MeS 6.0 0
- PpL
- MeS 6.0 0
- ScL
- MeS 6.0 0
- Control
- PPT 6.0 100
- MtL
- PPT 6.0 0
- PpL
- PPT 6.0 0
- ScL
- PPT 6.0 0
LISTADO DE SECUENCIAS
[0051]
5 <110> Novozymes A/S
<120> LACASA PARA DESTOXIFICACIÓN DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS
<130> 11338.204-WO 10
<160> 3
<170> Versión de patentIn 3.5 15 <210> 1
<211> 620
<212> PRT
<213> Myceliophthora thermophila 20 <220>
<221> mat_péptido
<222> (1)..(620)
<400> 1
<210> 2
<211> 520
5 <212> PRT
<213> Polyporus pinsitus
<220>
<221> mat_péptido 10 <222> (1)..(520)
<400> 2
<210> 3
<211> 343
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<220>
<221> mat péptido 13
<222> (1)..(343)
<400> 3
Claims (13)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Proceso para degradar la micotoxina zearalenona en un producto de alimentación para animales, proceso que comprende tratar dicho producto de alimentación para animales con una lacasa.
-
- 2.
- Proceso según la reivindicación 1 donde la dosificación de la lacasa es 0,01-100 mg de proteína enzimática por kg de materia seca, 0.1-10 mg de proteína enzimática por kg de materia seca, o 1-5 mg de proteína enzimática por kg de materia seca.
-
- 3.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde se usa un mediador.
-
- 4.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el mediador es metilsiringato o ácido fenotiazina-10propiónico.
-
- 5.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el producto de alimentación para animales es un producto de alimentación para animales a base de grano.
-
- 6.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el producto de alimentación para animales comprende uno o más productos seleccionados de maíz, trigo, cebada, centeno, arroz, sorgo y mijo.
-
- 7.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde el producto de alimentación para animales es una composición de alimentación para animales.
-
- 8.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el producto de alimentación para animales es un subproducto de un proceso de fermentación.
-
- 9.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el producto de alimentación para animales comprende bagazo, grano agotado de destilería, grano mojado de destilería, y/o grano seco de destilería.
-
- 10.
- Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el producto de alimentación para animales es un producto de alimentación para puercos.
-
- 11.
- Uso de una lacasa para la degradar la micotoxina zearalenona.
-
- 12.
- Uso según la reivindicación 11 en un producto de alimentación para animales a base de grano.
-
- 13.
- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, donde la dosificación de la lacasa es 0,01-100 mg de proteína enzimática por kg de materia seca, 0.1-10 mg de proteína enzimática por kg de materia seca, o 1-5 mg de proteína enzimática por kg de materia seca.
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