ES2365388T3 - Condroitina-polimerasa y adn que la codifica. - Google Patents
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Abstract
Proteína aislada seleccionada de entre el grupo constituido por los siguientes apartados (A) y (B): (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2; (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
Description
- 1.
- Campo de la presente invención
La presente invención se refiere a una nueva condroitina-polimerasa (condroitina-sintasa), a un ADN que la codifica, a un procedimiento para producir la condroitina-polimerasa, a un procedimiento para producir una cadena de azúcar que contiene la unidad de condroitina disacarídica repetitiva, a una sonda de hibridación para la condroitinapolimerasa y similares.
- 2.
- Breve descripción de la técnica anterior
En primer lugar, se describen las abreviaturas utilizadas frecuentemente en la presente memoria.
En las fórmulas y similares, "GlcUA", "GalNAc", "GlcNAc", "UDP" y "-" representan ácido D-glucurónico, N-acetil-Dgalactosamina; N-acetil-D-glucosamina; uridina 5'-difosfato y un enlace glucosídico, respectivamente.
Condroitina es una cadena de azúcar que comprende una estructura disacarídica repetitiva del resto GlcUA y del resto GalNAc (-GlcUAβ(1-3)-GalNAcβ(1-4)); denominada también en lo sucesivo "estructura de condroitina") y una cadena de azúcar en la que la condroitina que está más sulfatada es el sulfato de condroitina.
En cuanto a una enzima que sintetiza condroitina procedente de un donante de GlcUA y de un donante de GalNAc transfiriendo alternativamente GlcUA y GalNAc a un aceptor (condroitina-polimerasa o condroitina-sintasa) y ADN que codifica la misma, solamente se conoce una condroitina-sintasa de Pasteurella multocida (J. Biol. Chem., 215(31), 24124-24129 (2000)).
Además, determinadas cepas de Escherichia coli (serotipo 05:K4(L):H4 de Escherichia coli, denominado en lo sucesivo "cepa K4 de Escherichia coli") producen un polisacárido con estructura de condroitina, como antígeno capsular, pero su estructura es una estructura trisacarídica repetitiva en la que la fructosa está unida a una cadena lateral del resto GlcUA en la posición β2-3. Por consiguiente, no estaba claro si la cepa K4 de Escherichia coli realmente tiene una condroitina-polimerasa como su propio sistema de síntesis del antígeno capsular.
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una nueva condroitina-polimerasa, un ADN que codifica la misma, un procedimiento para producir la condroitina-polimerasa, un procedimiento para producir la cadena de azúcar que contiene la unidad de condroitina polisacarídica repetitiva, una sonda de hibridación para la condroitina-polimerasa y similares.
Este y otros objetivos de la presente invención se alcanzan mediante una nueva condroitina-polimerasa con las propiedades específicas descritas a continuación.
La figura 1 presenta una cartografía de restricción de los clones del fago λ que contienen una parte de la zona R-I o de la zona R-III del grupo génico del antígeno K de la cepa K4 de Escherichia coli.
La figura 2 presenta el marco abierto de lectura (ORF) de la región R-II del grupo génico del antígeno K de la cepa K4 de Escherichia coli.
La figura 3 es un gráfico que presenta la transferencia de GalNAc al hexasacárido del sulfato de condroitina C por la enzima de la presente invención.
La figura 4 es un gráfico que presenta la transferencia de GalNAc al hexasacárido del sulfato de condroitina C por la enzima de la presente invención y las dimensiones de la cadena de azúcar producida.
La figura 5 es un gráfico que presenta la transferencia de cada monosacárido cuando se utilizó como donante UDP-GlcUA, UDP-GlcNAc o UDP-GalNAc, y se utilizó como aceptor hexasacárido o heptasacárido de sulfato de condroitina C.
La figura 6 es un gráfico que presenta la influencia de la temperatura sobre la actividad de la enzima de la presente invención.
La figura 7 es un gráfico que presenta los modelos de filtración en gel de los productos de la reacción enzimática después de varios periodos de reacción enzimática.
La figura 8 es un gráfico que presenta la relación entre el periodo de reacción enzimática y la cantidad de incorporación de radioactividad.
La figura 9 es un gráfico que presenta la relación entre la radioactividad incorporada (V) y la concentración en el sustrato de UDP-azúcar (S).
La figura 10 es un gráfico que presenta representaciones recíprocas dobles.
Los presentes inventores han llevado a cabo intensos estudios y han descubierto una nueva condroitina-polimerasa producida por microorganismos específicos (cepa 4 de Escherichia coli (serotipo 05:K4(L):H4 de Escherichia coli, ATCC 23502)), ADNc aislado que codifica la condroitina-polimerasa, y ha logrado preparar la condroitina-polimerasa utilizando el ADNc. De este modo, se ha realizado la presente invención.
Además, este y otros objetivos de la presente invención se han alcanzado mediante un procedimiento para producir la condroitina-polimerasa aislando el ADNc que codifica la condroitina-polimerasa y utilizando el ADNc. La expresión "síntesis de condroitina" tal como se utiliza en la presente memoria es un concepto que incluye el alargamiento de la cadena de azúcar de condroitina transfiriendo y agregando monosacáridos a una cadena de azúcar tal como condroitina. Por consiguiente, la reacción para alargar la cadena de azúcar de condroitina transfiriendo alternativamente y añadiendo los monosacáridos (GlcUA y GalNAc) a la cadena de azúcar para sintetizar la condroitina está incluida en un concepto de "síntesis de condroitina".
En la presente memoria se describe una condroitina-polimerasa (en lo sucesivo denominada también "enzima de la presente invención) que tiene las propiedades siguientes:
- (1)
- Acción:
la polimerasa transfiere GlcUA y GalNAc alternativamente a un terminal no reducido de una cadena de azúcar de un donante de GlcUA y de un donante de GalNAc, respectivamente;
- (2)
- Especificidad de sustrato:
la polimerasa transfiere GlcUA a un oligosacárido que tiene GalNAc en su terminal no reducido y una estructura de condroitina de un donante de GlcUA, pero no transfiere sustancialmente GalNAc al oligosacárido de un donante de GalNAc;
la polimerasa transfiere GalNAc a un oligosacárido que tiene GlcUA en su terminal no reducido y una estructura de condroitina de un donante de GalNAc, pero no transfiere sustancialmente GlcUA al oligosacárido de un donante de GlcUA;
(3) Influencia de los iones metálicos y similares:
La polimerasa actúa en presencia de ión Mn2+ pero no actúa sustancialmente en presencia de ión Ca2+, ión Cu2+
o ácido etilendiamintetraacético.
La enzima descrita en la presente memoria procede preferentemente de Escherichia coli.
La presente invención se refiere a una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por los siguientes apartados (A) y (B) (denominada en lo sucesivo "proteína de la presente invención"):
- (A)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2;
- (B)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
La presente invención se refiere a un ADN que comprende uno de los siguientes apartados (a) a (c) (denominado en lo sucesivo "ADN de la presente invención"):
- (a)
- ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2;
- (b)
- ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de
aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa;
- (c)
- ADN que se hibrida con
- (i)
- el ADN en (a), o
- (ii)
- el ADN complementario al ADN en (a) en condiciones severas en las que la hibridación se realiza a 42ºC en una solución que contiene 50% de formamida, 4 x SSC, HEPES 50 mM (pH 7,0), 10 x solución de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y que codifica una proteína que tiene actividad de condroitinapolimerasa.
El ADN en el apartado (a) está representado preferentemente por SEC. ID. nº 1.
La presente invención se refiere a un vector que comprende el ADN de la presente invención (denominado en lo sucesivo "el vector de la presente invención").
El vector de la presente invención es preferentemente un vector de expresión.
La presente invención se refiere a un transformante en el que se transforma un hospedador con el vector de la presente invención (en lo sucesivo denominado también "transformante de la presente invención").
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una condroitina-polimerasa, que comprende: cultivar el transformante de la presente invención; y recoger la condroitina-polimerasa del material cultivado (denominado en lo sucesivo "procedimiento de producción enzimática de la presente invención").
La presente invención se refiere a un agente para la síntesis de la cadena de azúcar, que comprende la proteína de la presente invención y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula
(3) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GalNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente (denominado en lo sucesivo "procedimiento 1 de producción de la cadena de azúcar de la presente invención"):
GlcUA-X-R1 (1) GalNAc-GlcUA-X-R1 (3)
en las que X representa GalNAc o GlcNAc; R1 representa un grupo cualquiera; y los demás símbolos tienen los mismos significados descritos anteriormente.
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula
(4) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GlcNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente (denominado en lo sucesivo "procedimiento 2 de producción de la cadena de azúcar de la presente invención"):
GlcUA-X-R1 (1) GlcNAc-GlcUA-X-R1 (4)
en las que todos los símbolos tienen los mismos significados descritos anteriormente.
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula
(5) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente (denominado en lo sucesivo "procedimiento 3 de producción de la cadena de azúcar de la presente invención"):
GalNAc-GlcUA-R2 (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R2 (5)
en las que R2 representa un grupo cualquiera; y los demás símbolos tienen los mismos significados descritos anteriormente.
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula
(6) y (8) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GalNAc un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente (denominado en lo sucesivo "procedimiento 4 de producción de la cadena de azúcar de la presente invención"):
GlcUA-X-R1 (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R1 (6) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R1 (8)
en las que n es un número entero de 1 ó más, y los demás símbolos tienen los mismos significados descritos anteriormente.
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por las fórmulas (7) y (9) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GalNAc, un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente (denominado en lo sucesivo "procedimiento 5 de producción de la cadena de azúcar de la presente invención"):
GalNAc-GlcUA-R2 (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R2 (7) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R2 (9)
en las que todos los símbolos tienen los mismos significados descritos anteriormente.
La presente invención se refiere a una sonda de hibridación que comprende una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº 1 (denominada también en los sucesivo "sonda de la presente invención").
La presente invención se refiere a un catalizador de transferencia de glucosilo (denominado en los sucesivo "catalizador de la presente invención") que comprende la proteína de la presente invención y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
La presente invención se explica a continuación con más detalle.
<1> Enzima de la presente invención y proteína de la presente invención.
La enzima descrita en la presente memoria es una condroitina-polimerasa que tiene las propiedades (1) a (3) siguientes.
(1) Acción:
La enzima descrita en la presente memoria transfiere GlcUA y GalNAc alternativamente a un terminal no reducido de una cadena de azúcar de un donante de GlcUA y de un donante de GalNAc, respectivamente.
Como donante de GlcUA, se prefiere un difosfato de nucleósido-GlcUA, y en particular se prefiere UDP-GlcUA. Además, como donante de GalNAc, se prefiere un difosfato de nucleósido-GalNAc, y en particular se prefiere UDP-GalNAc.
La enzima descrita en la presente memoria transfiere GlcUA y GalNAc alternativamente a un terminal no reducido de una cadena de azúcar (aceptor) de estos respectivos donantes de sacáridos. Por ejemplo, cuando GlcUA se transfiere en primer lugar a un terminal no reducido de una cadena de azúcar (aceptora), los monosacáridos se transfieren de tal manera que a continuación se transfiere GalNAc, a continuación se transfiere GlcUA, a continuación se transfiere GalNAc y así sucesivamente. De la misma manera, cuando GalNAc se transfiere en primer lugar a un terminal no reducido de una cadena de azúcar (aceptora), los monosacáridos se transfieren de tal manera que a continuación se transfiere GlcUA, a continuación se transfiere GalNAc, a continuación se transfiere GlcUA y así sucesivamente. Como resultado, una estructura de disacárido repetitiva de resto de GlcUA y de resto de GalNAc, es decir un esqueleto de condroitina, es sintetizada por la enzima de la presente invención.
Como cadena de azúcar que se convierte en aceptora de monosacáridos, es preferible una cadena de azúcar que tenga un esqueleto de condroitina. Como cadena de azúcar que tiene un esqueleto de condroitina, se pueden poner como ejemplos sulfato de condroitina y condroitina. Entre los sulfatos de condroitina, es preferible un sulfato de condroitina que está compuesto principalmente por un esqueleto de 6-sulfato de condroitina y también contiene una pequeña cantidad de una estructura de 4-sulfato-condroitina (denominada en lo sucesivo "sulfato C de condroitina").
Además, la cadena de azúcar que se convierte en un aceptor es más preferentemente un oligosacárido. El tamaño del oligosacárido no está específicamente restringido, pero cuando el aceptor es un oligosacárido de sulfato C de condroitina, es preferible el hexasacárido o heptasacárido, y el tetrasacárido o el hexasacárido es preferible cuando es un oligosacárido de condroitina.
Además, es preferible que la enzima descrita en la presente memoria sea capaz de transferir más GalNAc a una cadena de azúcar que tiene una estructura de ácido hialurónico (una estructura de disacárido repetitiva del resto GlcUA y del resto GlcNAc) procedente de un donante de GalNAc. Es preferible que la cadena de azúcar que tiene una estructura de ácido hialurónico sea también un oligosacárido. El tamaño del oligosacárido no está particularmente restringido, pero los que están compuestos de aproximadamente hexasacáridos son particularmente preferibles.
(2) Especificidad de sustrato:
La enzima descrita en la presente memoria transfiere GlcUA a un oligosacárido que tiene GalNAc en su terminal no reducido y una estructura de condroitina procedente de un donante de GlcUA, pero no transfiere sustancialmente GalNAc al oligosacárido procedente de un donante de GalNAc.
La enzima descrita en la presente memoria transfiere GalNAc a un oligosacárido que tiene GlcUA en su terminal no reducida y un esqueleto de condroitina procedente de un donante de GalNAc, pero no transfiere sustancialmente GlcUA al oligosacárido procedente de un donante de GlcUA.
Es preferible que la enzima descrita en la presente memoria además no transfiera sustancialmente GlcNAc desde un donante de GlcNAc a un oligosacárido que tiene GalNAc en su terminal no reducido y además tiene un esqueleto de condroitina. Además, es preferible que la enzima descrita en la presente memoria transfiera más GlcNAc desde un donante de GlcNAc a un oligosacárido que tiene GlcUA en su terminal no reducido y también tiene un esqueleto de condroitina. Sin embargo, es preferible que GlcUA no sea transferido sustancialmente desde un donante de GlcUA a un oligosacárido producido por la transferencia de GlcNAc.
Además, es preferible que la enzima descrita en la presente memoria transfiera GlcNAc desde un donante de GlcNAc a un oligosacárido que tiene GlcUA en su terminal no reducido y que tiene también un esqueleto de ácido hialurónico, pero no transfiere sustancialmente GlcUA desde un donante de GlcUA.
(3) Influencia de los iones metálicos y similares:
La enzima descrita en la presente memoria actúa en presencia de ión Mn2+ pero no actúa sustancialmente en presencia de ión Ca2+, ión Cu2+ o ácido etilendiamintetraacético.
Además, es preferible que la enzima descrita en la presente memoria actúe además en presencia del ión Fe2+ o Mg2+ . Por otra parte, es preferible que el grado de actuación (actividad enzimática) de la enzima descrita en la presente memoria en presencia de ión Mn2+ sea superior a su grado de actuación (actividad enzimática) en presencia del ión Fe2+ o Mg2+ .
Además, se observó que cuando una reacción se realiza utilizando la enzima descrita en la presente memoria a una temperatura de 25ºC o más, el tamaño del producto de reacción (cadena de condroitina) se vuelve pequeño a medida que aumenta la temperatura de reacción (véanse, los ejemplos mostrados a continuación). Por consiguiente, se considera que la actividad enzimática de la enzima descrita en la presente memoria disminuye a medida que la temperatura de reacción aumenta a 25ºC o más en las condiciones de reacción descritas en los siguientes ejemplos.
Es preferible que la enzima descrita en la presente memoria proceda de Escherichia coli. En particular, es preferible la cepa de Escherichia coli que tiene un gen relacionado con la producción del polisacárido capsular, y es más preferible la cepa de Escherichia coli, cuyo antígeno capsular (K) es "K4".
Como cepa de Escherichia coli cuyo serotipo del antígeno capsular es "K4", se puede citar preferentemente la cepa K4 de Escherichia coli (serotipo 05:K4(L):B4 de Escherichia coli), y más específicamente, se pueden citar preferentemente ATCC 23502, NCDC U1-41, número 2616 de la colección Freiburg y similares.
La enzima de la presente invención es una proteína seleccionada de entre los apartados (A) y (B) siguientes:
- (A)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2;
- (B)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
Aunque la mutación tal como la sustitución, eliminación, inserción, transposición y similares puede suceder en las secuencias de aminoácidos de las proteínas existentes en la naturaleza producida por las reacciones de modificación dentro de las células o durante la purificación de proteínas después de su formación, además del polimorfismo y mutación de las moléculas de ADN que las codifican, es sabido que determinadas proteínas con dichas mutaciones presentan actividades fisiológicas y biológicas que son sustancialmente idénticas a las correspondientes proteínas que no tienen mutaciones. Dichas proteínas que presentan ligeras diferencias estructurales pero no diferencias significativas en sus funciones se describen también en la presente memoria. Es el mismo caso en el que la mutación anterior se introduce artificialmente en la secuencia de aminoácidos de la proteina. En dicho caso, es posible preparar variedades mayores de mutantes. Por ejemplo, es sabido que un polipéptido preparado sustituyendo un resto de cisteína en la secuencia de aminoácidos de la interleucina 2 humana (IL-2) por un resto de serina mantiene la actividad de la interleucina 2 (Science, 224, 1431 (1984)). Además, es sabido que determinada proteína tiene una zona peptídica que no es esencial para su actividad. Por ejemplo, un péptido señal que existe en una proteína que se segrega en el resto extracelular y una pro-secuencia que puede encontrarse en un precursor de proteasa o similar corresponde a este caso, y la mayoría de estas zonas se eliminan después de la traducción de las proteínas o durante su conversión en proteínas activas. Dichas proteínas son proteínas que están presentes de diferentes formas desde el punto de vista de su estructura primaria pero finalmente tienen funciones similares.
La expresión "unos pocos restos de aminoácidos" tal como se utiliza en la presente memoria significa el número de aminoácidos que pueden producir mutación en tal grado que la actividad de la condroitina-polimerasa no se pierde, y en el caso de la proteína compuesta por 600 restos de aminoácidos por ejemplo, significa el número de aproximadamente 2 a 30, preferentemente de 2 a 15, y más preferentemente de 2 a 8.
Además, la proteína de la presente invención puede contener una secuencia de aminoácidos de otra proteína o péptido, con tal de que contenga la secuencia de aminoácidos del apartado (A) o (B) anterior. Es decir, la proteína de la presente invención puede ser una proteína de fusión con otra proteína o péptido.
Por ejemplo, las proteínas de fusión de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el apartado (A) o (B) anterior con un péptido marcador y similar están también incluidas en la proteína de la presente invención. Dichas proteínas de la presente invención tienen la ventaja de que su purificación puede realizarse fácilmente. Ejemplos del péptido marcador anterior incluyen la proteína A, la secuencia señal de la insulina, His, FLAG, CBP (proteína de unión a la calmodulina), GST (glutatión S-transferasa) y similares. Por ejemplo, su proteína de fusión con la proteína A puede purificarse convenientemente por cromatografía de afinidad utilizando una fase sólida unida a IgG. De la misma manera, una fase sólida a la que el níquel magnético se une puede utilizarse para una proteína de fusión con la etiqueta His, y una fase sólida a la que un anticuerpo anti-FLAG está unido puede utilizarse para una proteína de fusión con FLAG. Además, ya que una proteína de fusión con señal de insulina se segrega en el resto extracelular (un medio o similar), las operaciones de extracción tales como la disgregación celular y similares se vuelven innecesarias. Es preferible que la proteína de la presente invención (la enzima de la presente invención) sea soluble.
Los ejemplos preferidos incluyen una proteína de fusión con un péptido (etiqueta His) representado por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 11. Es preferible realizar la fusión de esta etiqueta de His continuamente en una posición justo antes de la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2. La proteína de fusión puede producirse expresando un ADN en el que la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº 4 está conectada continuamente a una posición justo antes de la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº 1. La proteína de fusión es soluble.
La "actividad de la condroitina-polimerasa" puede detectarse según un método analítico de glucosiltransferasa utilizado generalmente. Específicamente, puede detectarse como actividad para sintetizar transfiriendo GlcUA y GalNAc alternativamente a un terminal no reducido de una cadena de azúcar (aceptor), utilizando un donante de GlcUA, un donante de GalNAc y una cadena de azúcar que se convierte en el aceptor.
Por ejemplo, cuando GlcUA se transfiere desde un donante de GlcUA a una cadena de azúcar que tiene GalNAc en su terminal reducido, se transfiere desde un donante de GalNAc a una cadena de azúcar que tiene un GlcUA en su terminal no reducido, puede interpretarse que tiene actividad para transferir GlcUa y GalNAc alternativamente a una terminal no reducido de la cadena de azúcar, a saber actividad de condroitina-polimerasa. Es preferible emplear el método de medición de actividad enzimática descrito en los Ejemplos siguientes. Mediante dicho método puede seleccionarse fácilmente, la eliminación, sustitución, inserción o transposición de aminoácidos que conservan la actividad de condroitina-polimerasa.
Los procedimientos para la producción de la enzima de la presente invención y de la proteína de la presente invención no están particularmente restringidos, y pueden producirse expresando el ADN de la presente invención descrito a continuación en células apropiadas. Además, las que se aíslan de los recursos naturales y se producen por síntesis química y similares están incluidas en la enzima de la presente invención y en la proteína de la presenten invención como algo corriente. Los procedimientos de producción de la enzima de la presente invención (la proteína de la presente invención) que utilizan en ADN de la presente invención se describirán a continuación.
<2> ADN de la presente invención
- (a)
- ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2;
- (b)
- ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o
transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa;
- (c)
- ADN que se hibrida con
- (i)
- el ADN en (a), o
- (ii)
- el ADN complementario al ADN en (a) en condiciones severas en las que la hibridación se realiza a 42ºC en una solución que contiene 50% de formamida, 4 x SSC, HEPES 50 mM (pH 7,0), 10 x solución de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y que codifica una proteína que tiene actividad de condroitinapolimerasa.
El ADN está representado preferentemente por la SEC. ID. nº 1.
Las "condiciones severas" tal como se utiliza en la presente memoria significa las condiciones bajo las cuales se forma un denominado híbrido específico pero no se forma un híbrido no específico (véase Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y similares). Ejemplo de "condiciones severas" incluyen las condiciones en las que se lleva a cabo la hibridación a 42ºC en una solución que contiene formamida al 50%, 4 x SSC, HEPES 50 mM (pH 7,0), 10 x solución de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y se lava el producto con 2 x SSC, solución SDS al 0,1% a temperatura ambiente y a continuación con 0,1 x SSC, solución SDS al 0,1% a 50ºC.
El ADN de la presente invención se obtiene generalmente a partir de la cepa de Escherichia coli que tiene el antígeno K4, pero las muestras de ADN obtenidas de otras especies de organismo transformadas y producidas por síntesis química y similares están también incluidas en la presente memoria como algo corriente. Los procedimientos para la producción del ADN de la presente invención no están tampoco específicamente limitados, pero es preferible utilizar, por ejemplo, el procedimiento descrito en los ejemplos siguientes.
Los expertos en la materia entienden fácilmente que los ADN que tienen varias secuencias nucleotídicas diferentes debido a la degeneración del código genético están presentes como ADN de la presente invención.
<3> Vector de la presente invención
El vector de la presente invención es un vector que comprende el ADN de la presente invención. Preferentemente el ADN en el vector de la presente invención es el mismo descrito en el apartado <2> anterior. Además, ya que el vector de la presente invención se utiliza preferentemente en el proceso de producción de enzimas de la presente invención que se describirá después, es preferentemente un vector de expresión.
El vector de la presente invención puede prepararse insertando el ADN de la presente invención en un vector conocido.
Como vector en el que se inserta el ADN de la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, un vector apropiado que puede expresar el ADN introducido (un vector de fago, un vector de plásmido o similar) y puede seleccionarse opcionalmente en respuesta a cada célula hospedadora en la que el vector de la presente invención está insertado. Ejemplos del sistema de vector hospedador incluyen una combinación de una célula de mamífero tal como célula COS, 3LL-HK46 o similar con un vector de expresión para célula de mamífero tal como pGIR201 (Kitagawa, H. y Paulson, J. C., J. Biol. Chem., 269, 1394-1401 (1994)), pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acid Res., 18, 5322 (1990)), pCXN2 (Niwa, H., Yamamura, K. y Miyazaki, J., Gene, 108, 193-200 (1991)), pCMV-2 (preparado por Eastman Kodak), pCEV18, pME18S (Maruyama et al., Med. Immunol., 20, 27 (1990)), pSVL (preparado por Pharmacia Biotech) o similares y una combinación de Escherichia coli con un vector de expresión para células procarióticas tal como pTrcHis (fabricado por Invitrogen), pGEX (preparado por Pharmacia Biotech), pTrc99 (preparado por Pharmacia Biotech), pKK233-3 (preparado por Pharmacia Biotech), pEZZZ18 (preparado por Pharmacia Biotech), pCH110 (preparado por Pharmacia Biotech), pET (elaborado por Stratagene), pBAD (elaborado por Invitrogen), pRSET (elaborado por Invitrogen), pSE420 (elaborado por Invitrogen) o similares. Además, una célula de insecto, levadura, Bacillus subtilis y similares pueden servir como ejemplo también como la célula hospedadora y varios vectores correspondientes a la misma. Entre los sistemas de vector para hospedador anteriores, es preferible una combinación de Escherichia coli con pTrcHis.
Además, a medida que el vector en el que se inserta el ADN de la presente invención, un vector construido de tal manera que expresa una proteína de fusión de la proteína de la presente invención (enzima de la presente invención) con un péptido marcador, puede utilizarse también, el cual, como se describió en el apartado <1> anterior, es particularmente preferible cuando se purifica la condroitina-polimerasa expresada utilizando el vector de la presente invención. Específicamente, es preferible un vector que comprende una secuencia nucleotídica que expresa His (por ejemplo, la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº 4).
Cuando se utiliza alguno de los vectores anteriores, el ADN de la presente invención puede estar conectado con el vector después de tratar a ambos con enzimas de restricción y similares y opcionalmente llevando a cabo la terminación suave y la conexión de un terminal cohesivo de modo que la conexión del ADN de la presente invención con el vector se hace posible.
Como procedimiento de producción del vector de la presente invención puede utilizarse y es preferible, por ejemplo, el procedimiento descrito en los siguientes ejemplos.
<4> Transformante de la presente invención
El transformante de la presente invención es un transformante en el que un hospedador se transforma con el vector de la presente invención.
El "hospedador" tal como se utiliza en la presente memoria puede ser cualquier hospedador en el que puede realizarse la recombinación por el vector de la presente invención pero es preferible uno que pueda ejercer la función del ADN de la presente invención o un vector recombinante en el que se inserta el ADN de la presente invención. Ejemplos de hospedador incluyen las células animales, células vegetales y células microbianas, y están incluidas las células de mamíferos tales como las células COS (célula COS-1, células CO-7 y similares), célula 3LLHK46, etc., Escherichia coli, células de insecto, levaduras, Bacillus subtilis y similares. El hospedador puede seleccionarse opcionalmente en respuesta a cada vector de la presente invención, pero, por ejemplo, cuando se utiliza un vector de la presente invención preparado basándose en pTrcHis, es preferible seleccionar la cepa de Escherichia coli.
El hospedador puede ser transformado por el vector de la presente invención de la manera habitual. Por ejemplo, el hospedador puede transformarse introduciendo el vector de la presente invención en el hospedador por un procedimiento que utiliza un reactivo de transfección disponible en el mercado, un procedimiento con DEAEdextrano, electroporación o similares.
El transformante de la presente invención obtenido de esta manera puede utilizarse en el proceso de producción enzimática de la presente invención descrito a continuación.
<5> Proceso de producción enzimática de la presente invención
El proceso de producción enzimática de la presente invención es un proceso para producir una condroitinapolimerasa, que comprende cultivar el transformante de la presente invención; y recolectar una condroitinapolimerasa del material de cultivo.
El término "cultivo" tal como se utiliza en la presente memoria significa una idea general que incluye el cultivo de células o de microorganismos como el propio transformante de la presente invención y el cultivo de un animal, insecto o similar en el que se incorporan las células como el transformante de la presente invención. Además, la expresión "material de cultivo" tal como se utiliza en la presente memoria significa un concepto que incluye un medio (sobrenadante del medio de cultivo) y células hospedadoras cultivadas después del cultivo del transformante de la presente invención, la materia segregada, la materia excretada y similares.
Las condiciones de cultivo (medio, condición de cultivo y similares) se seleccionan apropiadamente basándose en el hospedador que va a utilizarse.
Según el proceso de producción enzimática de la presente invención, pueden producirse varias formas de condroitina-polimerasa, basándose en el transformante que va a utilizarse.
Por ejemplo, cuando se cultiva un transformante transformado con un vector de expresión construido para expresar una proteína de fusión con un péptido marcador, se produce una condroitina-polimerasa fusionada con el péptido marcador. Específicamente, por ejemplo, una condroitina-polimerasa fusionada con la etiqueta His se produce para cultivar un transformante transformado con un vector de expresión construido para efectuar la expresión de una proteína en la que la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 11 se fusiona continuamente a una posición justo antes de la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2. Particularmente, es preferible utilizar un transformante transformado con un vector de expresión construido conectando la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID. nº 4 continuamente a una posición justo antes de la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID. nº 1.
La condroitina-polimerasa puede recogerse del material cultivado por procedimientos de extracción y purificación de proteínas basados en la forma de la condroitina-polimerasa producida.
Por ejemplo, cuando se produce la condroitina-polimerasa en forma soluble segregada en un medio (sobrenadante del medio de cultivo), el medio puede recogerse y utilizarse directamente como condroitina-polimerasa. Además, cuando la condroitina-polimerasa se produce en forma soluble segregada en el citoplasma o en forma insoluble (fijación a la membrana), la condroitina-polimerasa puede extraerse por disgregación celular tal como un procedimiento que utiliza un aparato de cavitación de nitrógeno, homogeneización, molino de bolas de vidrio, tratamiento con ultrasonidos, un método de choque osmótico, congelación-descongelación, etc., extracción con tensioactivo, una combinación de los mismos o similares, y el extracto puede utilizarse directamente como condroitina-polimerasa.
La condroitina-polimerasa puede purificarse más en el medio o extractos, lo cual es preferible. La purificación puede ser purificación imperfecta (purificación parcial) o purificación perfecta, que puede seleccionarse de manera apropiada basándose, por ejemplo, en el objeto que utiliza la condroitina-polimerasa, y similares.
Ejemplos del procedimiento de purificación incluyen el salado con sulfato amónico, sulfato sódico, etc., centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía en fase inversa, filtración en gel, cromatografía de penetración en gel, cromatografía por afinidad, electroforesis, una combinación de los mismos y similares.
La producción de la condroitina-polimerasa puede confirmarse analizando su secuencia de aminoácidos, acciones, especificidad del sustrato y similares.
<6> Agente sintetizador de la presente invención
El agente sintetizador de la presente invención es un agente sintetizador de la cadena de azúcar, que comprende la proteína de la presente invención y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
El agente sintetizador de la presente invención es el resultado de aplicar la "acción de transferencia de GalNAc", "acción de transferencia de GlcNAc" y de "acción de transferencia de GlcUA" de la enzima de la presente invención y la proteína de la presente invención como agente sintetizador de la cadena de azúcar.
El agente sintetizador de la presente invención se utiliza para la síntesis de las cadenas de azúcar. La expresión "síntesis de las cadenas de azúcar", tal como se utiliza en la presente memoria significa un concepto que incluye el alargamiento de una determinada cadena de azúcar transfiriendo y añadiendo un monosacárido a dicha cadena. Por ejemplo, un concepto de transferencia y adición de un monosacárido tal como GlcUA, GalNAc, GlcNAc o similares a una cadena de azúcar tal como condroitina, sulfato de condroitina, ácido hialurónico y similares para alargar la cadena de azúcar está incluido en la expresión "síntesis de la cadena de azúcar" tal como se utiliza en la presente memoria.
La forma del agente sintetizador de la presente invención no está limitada, y puede ser cualquiera de entre una forma de solución, una forma congelada, una forma liofilizada y una forma de enzima inmovilizada en la que está unida a un vehículo. Además, puede contener otros compuestos (por ejemplo, vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo que es aceptable para el reactivo, etc.), con tal de que no tenga influencia sobre la actividad de la condroitina-polimerasa.
<7> Procedimiento de producción de la cadena de azúcar de la presente invención
El procedimiento de producción de la cadena de azúcar de la presente invención utiliza el agente sintetizador de la presente invención y se divide en los cinco métodos siguientes en respuesta a los sustratos donantes y aceptores del azúcar.
(1) Procedimiento de producción de la cadena de azúcar de la presente invención 1
Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (3) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GalNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente :
GlcUA-X-R1 (1) GalNAc-GlcUA-X-R1 (3)
(2) Procedimiento de producción de la cadena de azúcar de la presente invención 2
Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (4) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GlcNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente:
GlcUA-X-R1 (1) GlcNAc-GlcUA-X-R1 (4)
(3) Procedimiento de producción de la cadena de azúcar de la presente invención 3
Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (5) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente:
GalNAc-GlcUA-R2 (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R2 (5)
(4) Procedimiento de producción de la cadena de azúcar de la presente invención 4
Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (6) y (8) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GalNAc y un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente:
GlcUA-X-R1 (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R1 (6) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R1 (8)
(5) Procedimiento de producción de la cadena de azúcar de la presente invención 5
Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por las fórmulas (7) y (9) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la presente invención ponerse en contacto con un donante de GalNAc, un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente:
GalNAc-GlcUA-R2 (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R2 (7) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R2 (9)
En cada una de las fórmulas, X representa GalNAc o GlcNAc, y R1 y R2 representa cada uno cualquier grupo. R1 y R2 son iguales o diferentes entre sí.
Los ejemplos de R1 y R2 incluyen una cadena de azúcar que tiene un esqueleto de condroitina, una cadena de azúcar que tiene un esqueleto de ácido hialurónico y similares.
La cadena de azúcar representada por la fórmula (1) es preferentemente sulfato de condroitina (específicamente sulfato de condroitina C), condroitina o ácido hialurónico que tiene GlcUA en su terminal no reducido, o un oligosacárido de los mismos.
La cadena de azúcar representada por la fórmula (2) es preferentemente sulfato de condroitina (específicamente sulfato de condroitina C) o condroitina que tiene GalNAc en su terminal no reducido, o un oligosacárido de los mismos.
Como donante de GalNAc, es preferible un nucleósido difosfato de GalNAc, y en particular es preferible UDP-GalNAc. Además, como donante de GalNAc, es preferible un nucleósido difosfato de GlcNAc, y en particular es preferible UDP-GlcNAc. Por otra parte, como donante de GlcUA, es preferible el nucleósido difosfato de GlcUA, y en particular es preferible UDP-GlcUA.
El procedimiento para realizar el "contacto" no está particularmente limitado, siempre que la reacción enzimática se genere por contacto mutuo de las moléculas de la enzima de la presente invención (o la proteína de la presente invención) contenida en el agente sintetizador de la presente invención, un donante y un aceptor (cadena de azúcar). Por ejemplo, el contacto puede realizarse en una solución en la que se disuelven los tres componentes. Además, la reacción enzimática puede realizarse continuamente utilizando una enzima inmovilizada en la que la condroitina-polimerasa contenida en el agente sintetizador de la presente invención está unido a una fase sólida apropiada (perlas o similares) o a un reactor de tipo membrana que utiliza membrana de ultrafiltración, membrana de diálisis o similares. Además, la reacción enzimática puede realizarse conectando el aceptor a una fase sólida similar al método descrito en el documento WO 00/27437. Además, un birreactor que regenera (sintetiza) el donante puede utilizarse en combinación.
Además, en los procedimientos (4) y (5) anteriores, no es siempre necesario poner en contacto el donante GalNac y el donante GlcUA simultáneamente con el agente sintetizador de la presente invención y la cadena de azúcar representadas por las fórmulas (1) ó (2), y los donantes pueden entrar en contacto alternativamente.
Las condiciones para llevar a cabo la reacción enzimática no están específicamente limitadas, siempre y cuando sean condiciones bajo las cuales la enzima de la presente invención (o la proteína de la presente invención) pueden funcionar, pero es preferible llevar a cabo la reacción a pH aproximadamente neutro (por ejemplo, aproximadamente pH 7,0 a 7,5) y es más preferible llevar a cabo la reacción en un tampón con una acción tamponante bajo el pH. Además, la temperatura en este caso no está específicamente limitada, siempre y cuando la actividad de la enzima de la presente invención (o la proteína de la presente invención) se mantenga, pero una temperatura de aproximadamente 25ºC a 30ºC puede servir como ejemplo. Además, cuando existe una sustancia que aumenta la actividad de la enzima de la presente invención (o la proteína de la presente invención), puede añadirse la sustancia. Por ejemplo, es preferible dejar que coexista Mn2+ y similares. La duración de la reacción puede ser determinada opcionalmente por los expertos en la materia en respuesta a las cantidades del agente sintetizador de la presente invención, del donante y del aceptor que va a utilizarse y de otras condiciones de la reacción.
El aislamiento y similares de la cadena de azúcar procedente del producto formado puede llevarse a cabo por procedimientos conocidos.
Además, puede producirse un sacárido sulfatado tal como sulfato de condroitina o similar utilizando el agente sintetizador de la presente invención (condroitin-polimerasa) y una sulfato transferasa en combinación.
Por ejemplo, puede producirse un sacárido sulfatado tal como sulfato de condroitina o similar llevando a cabo simultáneamente la formación de condroitina y la transferencia del grupo sulfato en el proceso de producción de la cadena de azúcar anterior, permitiendo además que coexista un donante del grupo sulfato (5’-fosfosulfato de 3’fosfoadenosina (PAPS) o similar) y una sulfotransferasa. La sulfotransferasa puede utilizarse como enzima inmovilizada uniéndola a una fase sólida apropiada (perlas o similar) similar al caso anterior o se permite reaccionar continuamente utilizando un reactor de tipo membrana que utiliza membrana de ultrafiltración, membrana de diálisis
o similar. En este caso, puede utilizarse en combinación un biorreactor que regenera (sintetiza) el donante del grupo sulfato.
La sulfotransferasa que puede utilizarse en la presente memoria puede ser cualquier enzima que pueda transferir un grupo sulfato a la condroitina y puede seleccionarse apropiadamente a partir de las enzimas conocidas basándose en el tipo de sulfato de condroitina deseado. Además, dos o más tipos de sulfotransferasas que tienen posiciones diferentes de transferencia del grupo sulfato pueden utilizarse en combinación.
La condroitina 6-O-sulfotransferasa (J. Biol. Chem., 215 (28), 21075-21080 (2000)) puede servir como ejemplo como sulfotransferasa. Sin embargo, no hay ninguna limitación a ésta y pueden utilizarse también otras enzimas.
<8> Sonda de la presente invención
La sonda de la presente invención es una sonda de hibridación que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº 1.
La sonda de la presente invención puede obtenerse preparando un oligonucleótido que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia nucleotídica representada por la SEC. ID. nº 1, y marcándola con un marcador adecuado para hibridación (por ejemplo, radioisótopo).
El tamaño del oligonucleótido se selecciona apropiadamente basándose en las condiciones y similares de la hibridación que utiliza la sonda de la presente invención.
Es de esperar que la sonda de la presente invención llegue a ser una herramienta útil para examinar las funciones biológicas del sulfato de condroitina. Esto es debido a que el sulfato de condroitina se expresa ampliamente y desempeña una función importante en un gran número de tejidos, particularmente en el cerebro. Se considera que la sonda sirve también para la búsqueda de la relación entre genes y enfermedades.
<9> Catalizador de la presente invención
El catalizador de la presente invención es un catalizador de transferencia de glucosilo que comprende la proteína de la presente invención y que tiene una actividad de condroitina polimerasa.
El catalizador de la presente invención es un resultado de aplicar la "acción de transferencia de GalNAc", “la acción de transferencia de GlcNAc”, y "acción de transferencia de GlcUA" de la enzima de la presente invención y de la proteína de la presente invención como catalizador de la transferencia de glucosilo.
El catalizador de la presente invención puede utilizarse para la transferencia de GlcUA, GalNAc o GlcNAc. Por ejemplo, puede utilizarse para transferir un monosacárido, tal como GlcUA, GalNAc o GlcNAc o similar a un terminal no reducido de una cadena de azúcar tal como condroitina, sulfato de condroitina, ácido hialurónico y similares.
La forma del catalizador de la presente invención no está restringida, y puede ser cualquiera de una forma en solución, una forma congelada, una forma liofilizada y una forma de enzima inmovilizada en la que está unido a un vehículo. Además, puede contener otros componentes (por ejemplo, vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo que es aceptable para reactivo, etc.), siempre y cuando no tenga influencia sobre la actividad de transferencia de GlcUA, GalNAc o GlcNAc.
Dado que la enzima de la presente invención y la proteína de la presente invención pueden transferir GlcUA y GalNAc alternativamente, como una molécula única, son notablemente útiles como herramientas para la producción a gran escala de la cadena de azúcar que tiene un esqueleto de condroitina (condroitina, sulfato de condroitina, y similares), como ingredientes activos del agente sintetizador de la presente invención y el catalizador de la presente invención, reactivos o similares. Además, el ADN de la presente invención es muy útil como herramienta para la producción a gran escala de dicha enzima de la presente invención y de la proteína de la presente invención. El vector de la presente invención es muy útil, porque puede retener el ADN de la presente invención de manera estable y funcionar con eficacia y eficiencia. El transformante de la presente invención es además muy útil, porque no solamente puede retener el vector de la presente invención de manera estable y funcionar eficaz y eficientemente, sino que también puede utilizarse como tal para la producción a gran escala de la enzima de la presente invención y de la proteína de la presente invención. Además, el proceso de producción de la enzima de la presente invención es muy útil para la producción a gran escala de la enzima de la presente invención y de la proteína de la presente invención. También, el proceso de producción de la cadena de azúcar de la presente invención es muy útil para la producción a gran escala de la cadena de azúcar que tiene el esqueleto de condroitina (condroitina, sulfato de condroitina, y similares). El agente sintetizador de la presente invención y el catalizador de la presente invención son muy útiles, porque pueden utilizarse en el proceso de producción de la cadena de azúcar de la presente invención.
Ya que la alta calidad y la condroitina-polimerasa uniforme pueden producirse de manera conveniente y a gran escala mediante la presente invención, pueden proporcionarse productos a bajo coste para el campo industrial y por consiguiente la presente invención tiene muy alta disponibilidad.
La presente invención se explica con detalle basándose en los ejemplos, sin embargo, la presente invención no se limita a los mismos.
UDP-[14C]GlcUA, UDP-[3H]GalNAc y UDP-[14C]GlcNAc utilizados en los ejemplos se adquirieron en NEN Life Sciences. Además, UDP-GlcUA, UDP-GalNAc y UDP-GlcNAc se adquirieron en Sigma.
Ejemplo 1
Clonación del gen de condroitina-polimerasa:
(1) Preparación del banco de ADN
La cepa K4 (serotipo O5:K4(L):H4, ATCC 23502) de Escherichia coli, se cultivó a 37ºC durante la noche en 50 ml de medio LB. Se recogieron las células por centrifugación (3.800 rpm, 15 minutos), se pusieron suspensión en suspensión en 9 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) que contiene ácido etilendiamintetraacético 1 mM (EDTA) (denominado en lo sucesivo "TE") y a continuación se trata a 37ºC durante 1 hora, añadiendo 0,5 ml de SDS al 10% y 50 µl de proteinasa K (20 mg/ml, Boehringer Mannheim). A la suspensión, se añadieron 10 ml de solución PCI (fenol:cloroformo:alcohol isoamílico = 25:24:1), seguido de agitación durante 30 minutos, y la mezcla resultante se centrifugó (3.800 rpm, 15 minutos ) para recoger la capa de agua y la materia insoluble de la capa intermedia y se centrifugó (10.000 rpm, 30 minutos) otra vez. Se recuperó el sobrenadante y se añadieron 50 µl de ARNasa A (20 mg/ml, Sigma) a ésta para la reacción a 37ºC durante 1 hora. A la solución tratada se añadieron 10 ml de solución PCI, seguido de agitación durante 30 minutos, y la mezcla resultante se centrifugó (3.800 rpm, 15 minutos), para recoger la capa de agua y se centrifugó (10.000 rpm, 30 minutos) otra vez. Se recuperó el sobrenadante y se dializó frente a 2.000 ml de TE a 4ºC durante la noche, y la solución (7,5 ml) dializada de este modo se utilizó como solución de ADN cromosómico (concentración de ADN, 0,9 mg/ml). La solución de ADN cromosómico (120 µl) procedente de la cepa K4 obtenido de este modo se digirió utilizando una enzima de restricción Sau3A1 (4 unidades: NEB) a 37ºC durante 30 minutos y a continuación se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,3%, y después se cortó el gel de agarosa correspondiente al ADN de aproximadamente 7 a 11 kpb. El gel cortado de este modo se colocó en un tubo de 1,5 ml de capacidad con un orificio en su fondo picado con una aguja y, junto con el tubo, se insertó en un tubo de 2 ml de capacidad y se centrifugó (8.000 rpm, 1 minuto) para romper el gel. El fenol neutralizado en casi el mismo volumen de gel se añadió a éste, seguido de agitación intensa y a continuación la mezcla resultante se congeló a -80ºC. Treinta minutos después, la temperatura se volvió a la temperatura ambiente y se fundió la mezcla, seguido de centrifugación (13.000 rpm, 5 minutos). La capa acuosa resultante se recogió, se añadió a ésta el mismo volumen de solución de PCI seguido de agitación, y a continuación se centrifugó la mezcla
(13.000 rpm, 5 minutos). Se recogió la capa acuosa, 1/10 de volumen de solución de acetato sódico 3 M y el mismo volumen de 2-propanol se añadieron a esto para precipitar el ADN, y el precipitado se recogió a continuación por centrifugación (13.000 rpm, 30 minutos). Al precipitado recogido de este modo, se añadió solución de etanol al 70%, seguido de centrifugación (13.000 rpm, 5 minutos), y a continuación el precipitado resultante se disolvió añadiendo 100 µl de TE. Para concentrar la solución resultante, se precipitó el ADN añadiendo 10 µl de solución de acetato sódico 3 M y 300 µl de etanol y a continuación se recuperó por centrifugación (13.000 rpm, 20 minutos). Al precipitado recogido de este modo, se añadió solución de etanol al 70%, seguido de centrifugación (13.000 rpm, 5 minutos), y el precipitado resultante se disolvió en 4 µl de agua purificada para obtener una solución de fragmento de ADN cromosómico. La solución del fragmento de ADN (2 l) se insertó en un vector de fago λ (λ EMBL3: STRATAGENE) que se había tratado con enzimas de restricción (BamHi (80 unidades: NEB) y EcoRI (80 unidades: NEB)) y se sometió a embalaje utilizando un kit de embalaje (Gigapack III Gold Packaging Extract, STRATAGENE) según las instrucciones del fabricante, y a continuación la cepa de Escherichia coli (NM 539) se infectó con el fago λ y se propagó para preparar el banco de ADN cromosómico K4.
(2) Preparación de la sonda
Entre 3 regiones del resto del grupo génico del antígeno K de la cepa K5 de Escherichia coli (serotipo 010:K5(L):H4, ATCC 23506) que tienen secuencias conocidas (Mol. Microbiol., 17(4), 611-620 (1995)), a la vez que se interpone la región R-II específica del polisacárido del antígeno K (banco de genes nº de registro X77617), una serie de cebador (CS-S 5’-ACCCAACACTGCTACAACCTATATCGG-3’ (SEC. ID. nº 5); CS-AS 5’GCGTCTTCACCAATAAATACCCACGAAACT-3’ (SEC. ID. nº 6)) para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb del terminal 3’ de la región R-I (banco de genes nº de registro X74567) y otra serie de cebador (TM-S 5’-CGAGAAATACGAACACGCTTTGGTAA-3’ (SEC. ID. nº 7); TM-AS 5’-ACTCAATTTTCTTTCAGCTCTTCTTG-3’ (SEC. ID. nº 8)) para obtener el fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb procedente del terminal 5’ de la región R-III (banco de genes nº de registro X53819) se seleccionaron y prepararon.
Utilizando los respectivos conjuntos de cebador para respuesta inmunitaria para R-I y R-III y utilizando, como plantilla, fragmentos de ADN genómico de la cepa K4 extraída y purificada tras el tratamiento con Sau3AI y posterior electroforesis en gel de agarosa en el apartado (1) anterior, se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (94ºC, 1 min.-(94ºC, 45 s-47ºC, 30 s-72ºC, 5 min.) 30 ciclos-72ºC, 10 min. (para R-I), 94ºC, 1 min.-(94ºC, 45 s-50ºC, 30 s-72ºC, 5 min.) 30 ciclos-72ºC, 10 min. (para R-III) para obtener el fragmento de ADN de la región R-I de 1,3 kpb (K4RI3) procedente de K4 de la región R-III de 1,0 kpb (K4RIII5). Se determinaron las secuencias nucleotídicas de los fragmentos de ADN obtenidas de este modo utilizando el analizador genético ABI PRISM 310 (Perkin-Elmer). La homología con la cepa K5 del ADN en las mismas posiciones genéticas fue 96% y 95%, respectivamente.
(3) Clonación genética de la región K4R-II
Utilizando como sondas los fragmentos (K4RI3 y K4RIII5) de ADN de la región R-I y de la región R-III respectivas, se identificaron los grupos génicos del antígeno K4 del banco de ADN cromosómico K4 obtenido en el apartado (1) anterior. El cultivo de Escherichia coli (cepa NM539) (30 µl) se infectó con el banco de ADN cromosómico K4 (40 µl de fago λ) (37ºC, 15 minutos), 10 ml de agarosa de la parte superior se añadieron a ésto, la mezcla resultante se extendió sobre el medio en la placa LB contenido en cinco placas Petri de 10 x 14 cm, seguido de cultivo a 37ºC por 9,5 horas para formar placas. Se prepararon dos membranas de 9 x 13 cm (Hybond-N+: Amersham Pharmacia Biotech) para cada placa, y la primera y segunda membranas se colocaron en el medio durante 1 minuto y 3 minutos, respectivamente. Después de eliminar el exceso de humedad, cada membrana se empapó durante 2 minutos en NaOH 0,5 M que contenía NaCl 1,5 M para llevar a cabo el tratamiento de desnaturalización y a continuación se empapó durante 3 minutos en Tris-HCl 1 M (pH 7,4) que contenía NaCl 1,5 M para llevar a cabo el tratamiento de neutralización. Después de secar, la membrana se desecó a 80ºC durante 2 horas para preparar un filtro. El filtro se sometió a tratamiento de prehibridación a 65ºC durante 1 hora, se hibridó con K4RI3 marcado con [32P] a 64ºC durante la noche (15 horas) en tampón fosfato Church 0,5 M (pH 7,2), EDTA 1 mM y SDS al 7%, y a continuación se lavó tres veces con tampón fosfato Church 40 mM (7,2) que contenía SDS al 1% (65ºC, cada uno durante 15 minutos). El filtro se secó y después se expuso a una película de rayos X para obtener de este modo 30 placas positivas. La presencia de K4RI3 se confirmó para cada una de ellas por PCR, y 7 placas de entre ellas se sometieron a una segunda identificación. A continuación, el filtro hibridado con K4RI3 se hirvió en solución SDS al 0,5% durante 3 minutos para eliminar K4RI3 y después se secó para utilizarlo como filtro de hibridación K4RIII5. El filtro se sometió a tratamiento de prehibridación a 65ºC durante 1 hora, se hibridó con K4RIII5 marcado con [32P] a 64ºC durante la noche y a continuación se lavó tres veces con tampón fosfato Church 40 mM que contenía SDS al 1%. Se secó el filtro y a continuación se expuso a una película de rayos X para obtener de este modo 29 placas positivas. Se confirmó la presencia de K4RIII5 para cada una de ellas por PCR, y 18 placas de entre ellas se sometieron a una segunda identificación. En la segunda identificación, se utilizó medio de la placa LB de Φ 9 cm, y se obtuvieron placas positivas por el mismo procedimiento de la primera identificación.
Tras la primera y segunda identificación, se obtuvieron clones del fago 4 λ de la región R-I y 10 clones de la región R-III. Cada uno de los clones se sometió a tratamiento enzimático con EcoRI (10 unidades: NEB), SaII (10 unidades: NEB) y BamHI (10 unidades: NEB) cada una independiente o simultáneamente en varias combinaciones, y se prepararon sus cartografías de restricción basándose en el tamaño de los fragmentos observados por electroforesis (figura 1).
Entre estos clones, un clon (CS23, región de inserción de 15,4 kpb) es un clon de ADN preparado basándose en la sonda de la región R-III, pero dado que también presentaba una reacción lábil con la sonda de la región R-I, se examinó la secuencia del terminal en 5’ de la región de inserción para hallar una secuencia que coincidía completamente con el extremo 3’ de la sonda con la región R-I. Dado que ambos fragmentos de ADN de la región RI y de la región R-III estaban contenidos en la región de inserción, se consideró el clon como un clon que contiene toda la región R-II del grupo genético del antígeno K de la cepa K4.
- (4)
- Análisis genético de la región R-II de K4
Se realizó la subclonación del clon SC23 anterior para llevar a cabo su secuenciado. En primer lugar, cada uno, de los fragmentos de aproximadamente 3 kpb y 8 kpb, obtenidos tratando el clon SC23 con EcoRI y los fragmentos de ADN de 2 kpb, 5 kpb y 7 kpb, obtenidos tratándolo con SalI se ligó con un vector de clonación (pBluescript II KS(-)) y se integró en la cepa (XLI-Blue) de Escherichia coli para obtener un clon con diferente dirección de inserción. Repitiendo el "tratamiento de los puntos de multiclonación del vector con la transformación por ligadura de varias enzimas de restricción" en el clon, se obtuvieron 22 plásmidos que tienen fragmentos parciales de ADN de la región R-II. Realizando un secuenciado de los fragmentos de inserción del ADN y conectándolos, se determinó la secuencia genética completa de la región R-II de K4 (SEC. ID. nº 3).
- (5)
- Identificación del gen de condroitin-polimerasa
Como resultado del análisis de la secuencia de ADN de la región R-II de la cepa K4, se predijo la presencia de 8 marcos de lectura abierta (ORF) (figura 2).
Entre ellos, el ORF en tercera posición contando a partir del lado R-III (2.061 pb (nucléotidos números 3.787 a 5.847 en la SEC. ID. nº 3, la secuencia de 2058 pb excluyendo el codón de terminación se muestra en la SEC. ID. nº 1), 686 como número de aminoácidos, peso molecular obtenido por cálculo 79.276 (SEC. ID. nº 2)) presentó el 59% de homología con una ácido hialurónico sintasa de Pasteurella multocida (tipo pmHAS de clase 2; J. Biol. Chem., 273(14), 8454-8458 (1998)). Además, el recuento de ORF en la primera posición a partir del lado R-III (1.017 pb (nucleótidos números 643 a 1.649 en la SEC. ID. nº 3, 339 como número de aminoácidos) presentaba el 60% de homología con UDP-4-epimerasa de Pasteurella multocida (propuesta (29-OCT.-1996) Genetics and Microbiology, Universidad Autónoma de Barcelona, Edificio C, Bellaterra, BCN 08193, España), ORF en cuarta posición (1.332 pb (nucleótidos números 5.877 a 7.207 en la SEC. ID. nº 3)) presentaba gran homología (98%) con la secuencia 2 de inserción (Nucleic Acids Res., 6(3), 1.111-1.122 (1979)) y el ORF en séptima posición (1.167 pb (nucleótidos números 11.453 a 12.619 en la SEC. ID. nº 3), 389 como número de aminoácidos) presentaba 65% de homología con el gen kfiD(Mol. Microbiol., 174(4), 611-620 (1995)) (codifica la UDP-glucosa-deshidrogenasa) de la cepa (K5) de Escherichia coli. Además, dado que el ORF en octava posición (1.035 pb (nucleótidos números 13.054 a 14.088 en la SEC. ID. nº 3), 345 como número de aminoácidos) contenía un motivo DXD común a la glucosiltransferasa, se consideró que tiene actividad de transferir azúcar. En cuanto a los tres ORF restantes (nº 2, nº 5 y nº 6 (nucleótidos números 1.849 a 3.486, 7.210 a 8.673 y 9.066 a 10.631, respectivamente, en la SEC. ID. nº 3), no se encontró ninguna homología.
Ejemplo 2
Expresión y actividad enzimática de la proteína condroitina-polimerasa
(1) Para confirmar que el ORF de la región R-II de K4 (nº 3) es un gen de condroitina-polimerasa, se prepararon los cebadores con puntos de corte de la enzima de restricción y que interponen el correspondiente resto de ORF (K4CSP 5’-CGGGATCCCGATGAGTATTCTTAATCAAGC-3’ (SEC. ID. nº 9); K4C-AS 5’GGAATTCCGGCCAGTCTACATGTTTATCAC-3’ (SEC. ID. nº 10)) y se llevó a cabo la PCR (94ºC, 1 min.-(94ºC, 30 s-59ºC, 30 s-74ºC, 3 min.) 20 ciclos-74ºC, 10 min.). El producto de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,7% y se extrajo y purificó utilizando un kit de extracción en gel (QIAGEN). Después del tratamiento con las enzimas de restricción (BamHI y EcoRI), el producto se sometió de nuevo a electroforesis en gel de agarosa al 0,7% y se extrajo y purificó de la misma manera para utilizarse como inserción.
La inserción preparada en el párrafo anterior se insertó en un vector de expresión (pTrcHisC: Invitrogen; que contenía la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID. nº 4) que se había tratado con las enzimas de restricción (BamHI y EcoRI) y CIP, a 16ºC pasando 1 hora en presencia de T4 ADN ligasa, y se transformó en la cepa (TOP10) de Escherichia coli. Cultivando la cepa de Escherichia coli (medio de la placa LB que contenía ampicilina, 37ºC, durante la noche), se obtuvieron 7 colonias. Un clon que contenía un plásmido en el que se insertó correctamente la inserción anterior se seleccionó de entre ellos. Se cultivó Escherichia coli (a 37ºC durante la noche) en 1,5 ml de medio LB que contenía amplicilina (100 µg/ml) y 50 µl de la suspensión de las células cultivadas se inoculó en 50 µl de medio LB que contenía amplicilina (100 µg/ml) y se cultivó a 37ºC hasta que la DO600 fue de 0,6. Al cultivo se añadió 1 ml de isopropil 1-tio-β-D-galactósido (IPTG) 0,5 M (concentración final: 1 mM) y la inducción se realizó a 37ºC durante 3 horas. Se recogieron las células por centrifugación (10.000 rpm, 30 minutos) y se pusieron en suspensión añadiendo 4 ml de un tampón de lisis (NaB2PO4 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM e imidazol 10 mM). A la suspensión, se agregaron 4 mg de lisozima (Sigma), la mezcla resultante se dejó en reposo en hielo durante 30 minutos y a continuación se destruyeron las células tres veces por exposición a ultrasonidos, cada una durante 10 segundos, utilizando un baño con ultrasonidos. Se recogió el sobrenadante por centrifugación
(10.000 rpm, 30 minutos) y se aplicó a la columna de agarosa con Ni-NTA (1 ml de vehículo, equilibrado con tampón de lisis, QIAGEN), seguido de agitación con un agitador C durante 1 hora. El vehículo se sumergió instalando la columna y a continuación la columna se lavó dos veces utilizando 4 ml para cada uno, uno era un tampón (NaH2PO4 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM e imidazol 20 mM). Después, se eluyeron las proteínas pasando 4 veces 0,5 ml de cada una de un tampón de elución (NaH2PO4 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 300 mM e imidazol 250 mM). El eluido que contenía la proteína de interés (1 ml) se dializó a 4ºC durante 2 días frente a 500 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contenía glicerol al 20% para obtener de este modo aproximadamente 0,5 ml (contenido de proteína 0,4 mg/ml) de una solución dializada (solución de la enzima de la presente invención (proteína de la presente invención)).
La inmunotrasferencia Western de la proteína obtenida de este modo se llevó a cabo por electroforesis en dodecil sulfato sódico con gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). En la SDS-PAGE se utilizó gel al 10%. La proteína se detectó por tinción con azul brillante de Coomassie. Se realizó la inmunotrasferencia Western transfiriendo la proteína al gel SDS-PAGE en una membrana de nitrocelulosa, bloqueando la membrana con leche descremada al 5% (disuelta en Tris-HCl 25 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,05% (esta solución se denominó TBS-T) y a continuación tratándola con anticuerpo anti-tetra-His (Qiagen). Después de lavar varias veces con TBS-T, esta membrana se trató con IgG anti-ratón unida a peroxidasa. Después de lavar con TBS-T, la proteína reaccionada se detectó por el sistema de detección ECL (Amersham).
Como resultado, la proteína presentaba una banda a alrededor de 80 kDa por análisis de inmunotransferencia Western utilizando SDS-PAGE y anticuerpo anti-tetra-His. Por otra parte, en el extracto de cultivo de una referencia no se detectó una banda que reacciona inmunológicamente (vector de expresión sin inserción).
(2) Análisis de actividad enzimática (análisis de actividad de transferencia de GalNAc)
La enzima de la presente invención (2 µg) hexasacárido de sulfato C de condroitina del cartílago del tiburón, purificado por degradación con hialuronidasa testicular, como aceptor (70 pmol) y UDP-GalNAc (3 nmoles), UDP-GlcUA (3 nmoles) y UDP-[3H]GalNAc (0,1 nmol, 0,1 µCi) se añadieron como donantes a Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) que contenía MnCl2 20 mM, (NH4)2SO4 0,1 M y etilenglicol 1 M y el volumen total se ajustó a 50 µl, y a continuación, se llevó a cabo la reacción a 30ºC durante 30 minutos y la enzima se inactivó térmicamente. A la solución de reacción, se añadieron 3 volúmenes de etanol al 95% que contenían acetato de potasio al 1,3%, y la muestra se centrifugó a 10.000 x g durante 20 minutos. El precipitado se disolvió en 50 µl de agua destilada y se aplicó a una columna de péptido Superdex (300 x Φ10 mm: Amersham Biosciences, condiciones de cromatografía; tampón: NaCl 0,2 M, caudal: 0,5 ml/min) y el eluido se fraccionó a 0,5 ml y se midió la radioactividad (recuento de [3H]) de cada fracción utilizando un contador de centelleo. Se determinó la actividad sintetizadora de la condroitina calculando la cantidad de radioactividad incorporada en las fracciones de peso molecular más alto que el sustrato del aceptor. Los resultados se muestran en la figura 3. En la figura 3, los cuadrados en negro indican radioactividad cuando se utilizó el hexasacárido del sulfato C de condroitina como aceptor, los triángulos en blanco indican la radioactividad cuando se trató el producto de la reacción enzimática con condroitinasa ABC y los círculos en negro indican la referencia (en la que se utilizó la enzima inactivada térmicamente de la presente invención).
Como resultado, la posición de la elución de la radioactividad apareció en el lado del peso molecular más alto que el del hexasacárido de sulfato de condroitina C (el pico ancho que tiene su parte superior a alrededor de 5.000 Da) (cuadrados en negro en la figura 3). Además, cuando el producto de la reacción enzimática se trató con condroitinasa ABC, el pico del peso molecular alto se desplazó a una posición correspondiente a la fracción de disacárido (triángulos en blanco en la figura 3). Cuando la composición del disacárido de este digesto de condroitinasa ABC se analizó utilizando una cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), solamente se detectó un disacárido (ΔdiOS) de condroitina insaturado y no sulfatado.
Además, el producto de la reacción enzimática fue digerido completamente por tratamiento con condroitinasa ACII también, pero no fue digerido por hialuronidasa de Streptomyces ni por heparitinasa I.
Basándose en lo anterior, se demostró que la enzima de la presente invención obtenida de este modo por lo menos transfiere GalNAc al hexasacárido del sulfato de condroitina C desde UDP-GalNAc (donante). Esta actividad específica fue de 3,25 ± 0,64 nmoles de GalNAc/min/mg de proteína.
(3) Análisis del tamaño del producto de la reacción enzimática
El tamaño del producto de la reacción enzimática se examinó llevando a cabo la reacción enzimática y la cromatografía de la misma manera que en el "apartado (2) Análisis de actividad enzimática" anterior. Los resultados se presentan en la figura 4.
Se confirmó a partir de la figura 4 que la enzima de la presente invención obtenida anteriormente por lo menos transfiere GalNAc a un aceptor (oligosacárido que tiene un esqueleto de condroitina (hexasacárido de sulfato de condroitina C preparado utilizando hialuronidasa testicular)) del donante GalNAc (UDP-GalNAc) para formar de este modo condroitina que tiene un peso molecular de 10.000 a 20.000 o más.
(4) Análisis de especificad del sustrato del donante
Utilizando UDP-[14C]GlcUA, UDP-[10C]GlcNAc o UDP-[3H]GalNAc como donante, se examinó la actividad de transferencia de los siguientes aceptores según el procedimiento descrito en el "apartado (2) Medición de la
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50 UDP-[3H]GalNAC UDP[14C]GlcNAc UDP[14C]GlcUA
UDP-[3H]GalNAc UDP[14C]GlcUA UDP[14C]GlcNAC UDP[14C]GlcUA
actividad enzimática" anterior. Los productos después de la reacción enzimática se analizaron por filtración en gel.
Los resultados de la utilización de los hexasacárido o heptasacárido de sulfato de condroitina C como aceptor se muestran en la figura 5. Además, el círculo en negro en la figura 5 indica una referencia (un caso en el que se utilizó la enzima inactivada térmicamente de la presente invención).
(A) Hexasacárido de sulfato de condroitina C (producto purificado al degradar sulfato de condroitina C del cartílago de tiburón con hialuronidasa testicular, y el terminal no reducido es GlcUA).
Se sintetizó el heptasacárido solo cuando se utilizaba UDP-GalNAc solo como donante (pastillas en negro en la figura 5).
La transferencia sustancial no se encontró cuando se utilizaba UDP-GlcUA solo como donante (triángulo en negro en la figura 5).
Aunque se encontró muy poca transferencia de GlcNAc cuando se utilizaba UDP-GlcNAc solo como donante. Esta actividad de transferencia era el 6,3% basada en la actividad al 100% en el caso de la utilización de UDP-GalNAc como donante (cuadrado en negro en la figura 5). Sin embargo, los polisacáridos que tienen un tamaño de octasacárido o más no se obtuvieron aun cuando se utilizaba tanto UDP-GlcNAc como UDP-GlcUA junto con éste.
Además, ya que la incorporación de la radioactividad no se encontraba en ausencia del sustrato aceptor, se sugirió que el sustrato aceptor es esencial para la síntesis de la condroitina por esta enzima.
(B) Heptasacárido de sulfato de condroitina C (producto obtenido dejando que la enzima de la presente invención reaccione con el anterior hexasacárido de sulfato de condroitina C y uniendo de este modo un resto de GalNAc al terminal no reducido del hexasacárido).
Se sintetizó octasacárido solo cuando se utilizaba UDP-GlcNAc como donante (triángulo en blanco en la figura 5).
Cuando se utilizaba UDP-GalNAc o UDP-GlcNAc solo como donante, no se encontró transferencia sustancial en cada caso (respectivamente, pastilla en blanco y cuadrado en blanco en la figura 5).
Además, en la Tabla 1 se muestran los resultados de llevar a cabo pruebas similares independientemente cada una. Además, el término "SC" en la Tabla 1 significa sulfato de condroitina C. Además, los paréntesis en la Tabla muestran la longitud de la cadena de azúcar después de la reacción de la enzima y "-" significa que el azúcar marcado con UDP no se transfirió al sulfato de aceptor correspondiente.
Tabla 1
Actividad específica de condroitina-polimerasa (nmoles/min/mg de proteína)
Sustrato del donante Sustrato del aceptor
Azúcar marcado con UDP Azúcar sin marcar con UDP Hexasacárido de SC Heptasacárido de SC
ninguno ninguno ninguno
UDP-GlcUA
UDP-GalNAc
UDP-GlcUA
UDP-GlcNAc
A partir de los resultados anteriores, se demostró que la enzima de la presente invención obtenida en lo anterior transfiere GalNAc desde UDP-GlcNAc a una cadena de azúcar (aceptor) que tiene un esqueleto de condroitina cuyo terminal no reducido es GlcUA. Además, se demostró que cuando se utiliza el aceptor, la enzima de la presente invención obtenida en lo anterior presenta la actividad para transferir GlcNAc desde UDP-GlcNAc, pero la actividad es mucho menor que su actividad de transferencia de GalNAc.Además, se demuestra que cuando se utiliza el aceptor, la enzima de la presente invención obtenida en lo anterior no tiene sustancialmente actividad para transferir GlcUA desde UDP-GlcUA. Basándose en estos resultados, se demostró que la enzima anterior de la presente invención no es capaz de transferir GlcUA al terminal GlcUA no reducido pero es capaz de transferir un resto de GalNAc (o, bastante ligero, GlcNAc).
Además, se demostró que la enzima de la presente invención obtenida en lo anterior transfiere GlcUA desde UDP-GlcUA a una cadena de azúcar (aceptor) que tiene un esqueleto de condroitina cuyo terminal no reducido es GalNAc. Además, se demostró que cuando se utiliza el aceptor, la enzima de la presente invención obtenida en lo anterior sustancialmente no tiene actividades para transferir GalNAc desde UDP-GalNAc y para transferir GlcNAc
0,59 ± 0,16 (hepta)
0,04 ± 0,02 (hepta)
0,0 ± 0,0 (-)
3,25 ± 0,64 (poli)
2,75 ± 0,28 (poli)
0,05 ± 0,02 (poli)
0,0 ± 0,0 (-)
0,0 ±0,0 (-)
0,0 ±0,0 (-)
0,53 ± 0,08 (octa)
no medido
no medido
no medido
no medido
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desde UDP-GlcNAc. Basándose en estos resultados, se demuestra que la enzima anterior de la presente invención no es capaz de transferir GalNAc al terminal GalNAc no reducido pero es capaz de transferir un resto de GlcUA.
Basándose en lo anterior, se demostró que la enzima anterior de la presente invención es capaz de transferir GlcUA y GalNAc alternativamente, desde un donante GlcUA y un donante GalNAc, respectivamente, al terminal no reducido de la cadena de azúcar.
(5) Análisis de especificidad del sustrato aceptor
Utilizando tetrasacárido (140 pmoles) o hexasacárido (140 pmoles) de sulfato de condroitina C degradado y purificado que utiliza hialuronidasa testicular, tetrasacárido (260 pmoles) o hexasacárido (175 pmoles) de condroitina degradada y purificada por el método de Nagasawa (Carbohydrate Research, 97, 263-278 (1981)), hexasacárido (175 pmoles) de ácido hialurónico degradado y purificado utilizando hialuronidasa testicular, sulfato de condroitina C (peso molecular 20.000), condroitina (peso molecular 10.000), sulfato de dermatán (peso molecular 15.000), ácido hialurónico (peso molecular 20.000), o heparina (peso molecular 10.000) como aceptor, se examinó la actividad de transferencia por el método siguiente. Además, las cadenas de azúcar se adquirieron en Seikagaku Corporation.
La enzima de la presente invención (2 µg), UDP-GalNAc (Sigma) (60 pmoles), UDP-GlcUA (Sigma) (0,6 nmoles) y UDP-[3H]GalNAc (0,1 nmoles, 0,1 µCi) como donantes de cada una de las anteriores cadenas de azúcar como aceptor se añadieron a Tris-HCl 50 mM que contenía MnCl2 20 mM, 0,1 M (NH4)2SO4 y etilenglicol 1 M, y el volumen total se ajustó a 50 µl, y a continuación se llevó a cabo la reacción enzimática a 30ºC durante 30 minutos y la enzima se inactivó térmicamente. Se aplicó la solución de reacción a una columna Superdex Peptide (300 x Φ10 mm: Amersham Biosciences, condiciones de la cromatografía; tampón: NaCl 0,2 M, caudal: 0,5 ml/min) y se fraccionó el eluido en 0,5 ml y se midió la radioactividad (recuento de [3H]) de cada fracción utilizando un contador de centelleo. Los resultados se presentan en la Tabla 2. Los numerales entre paréntesis en la Tabla son valores relativos cuando la cantidad de radioactividad (cantidad de GalNAc transferida) mediante la utilización del hexasacárido del sulfato de condroitina C como aceptor se definió como 100%.
Tabla 2
Sustrato del aceptor Actividad específica de incorporación de [3H] nmoles/min/mg de proteína %
- Sulfato de condroitina C
- Tetrasacárido 1,44 ± 0,24 43,0
- Hexasacárido
- 3,34 ± 0,50 100,0
- Polisacárido (PM 20.000)
- 3,41 ± 0,48 100,0
- Condroitina
- Tetrasacárido 1,12 ± 0,21 33,5
- Hexasacárido
- 1,24 ± 0,45 37,0
- Polisacárido (PM 10.000)
- 0,53 ± 0,13 15,8
- Ácido hialurónico
- Hexasacárido 0,80 ± 0,15 24,0
- Polisacárido
- 0,27 ± 0,02 8,2
- (PM 20.000)
- Sulfato de dermatán
- Polisacárido 0,06 ± 0,02 1,9
- (PM 15.000)
- Heparina
- Polisacárido 0,0 ± 0,0 0,0
- (PM 10.000)
Basándose en los resultados anteriores, se demostró que el hexasacárido de sulfato de condroitina C se vuelve el sustrato aceptor más adecuado. El hexasacárido de condroitina también funcionó como un sustrato aceptor, pero su actividad fue baja (37%) en comparación con el caso del hexasacárido de sulfato de condroitina C. La incorporación en el tetrasacárido del sulfato de condroitina o en tetrasacárido de condroitina fue la misma (43% y 33,5%, respectivamente). Para sorpresa de los autores, el hexasacárido del ácido hialurónico y el ácido hialurónico (peso molecular 20.000) funcionaron también como sustratos aceptores. El nivel de incorporación del sulfato de condroitina C (peso molecular 20.000) fue similar al del hexasacárido de condroitina C. La incorporación no fue tan alta en el caso de la condroitina (peso molecular 10.000).
Resumiendo los resultados anteriores, se demostró que la enzima anterior de la presente invención utiliza oligosacáridos y polisacáridos que tienen esqueleto de condroitina (por lo menos tetrasacárido, hexasacárido y heptasacárido de sulfato de condroitina C, tetrasacárido y hexasacárido de condroitina, sulfato de condroitina C (peso molecular 20.000) y condroitina (peso molecular 10.000)) y oligosacáridos y polisacáridos de ácido hialurónico (por lo menos hexasacárido de ácido hialurónico y ácido hialurónico (peso molecular 20.000)) como aceptores.
Por otra parte, la incorporación de la radioactividad no se encontró en el sulfato de dermatán (peso molecular 15.000) ni heparina (peso molecular 10.000) lo que demuestra que no funcionan sustancialmente como sustratos
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aceptores.
(6) Análisis de la influencia de la temperatura
La reacción enzimática se realizó de la misma manera que en el "apartado (2) Análisis de actividad enzimática" anterior, cambiando la temperatura de la reacción enzimática a 25, 30, 37, 40, 45 ó 100ºC, y la solución después de la reacción se aplicó a una columna Superdex 74 (30 x Φ10 mm: Amersham Biosciences, condiciones de la cromatografía; tampón: NaCl 0,2 M, caudal: 0,5 ml/min). Se fraccionó el eluido en porciones de 1 ml y se midió la radioactividad (recuento de [3H]) de cada fracción utilizando un contador de centelleo. Los resultados se muestran en la figura 6. Además, las marcas de la pastilla, cuadrado, triángulo, signo x y * en la figura 6 presentan los resultados de 25, 30, 37, 40, 45 ó 100ºC, respectivamente. Además, el círculo en la figura 6 presenta el resultado de una referencia (en la que se utilizó la enzima inactivada térmicamente de la presente invención).
Como se muestra en la figura 6, en las condiciones de reacción y en el intervalo de temperatura examinado esta vez, el peso molecular del producto de reacción se volvió pequeño a medida que se aumentaba la temperatura. La incorporación más alta se encontró a 30ºC, pero el producto con el peso molecular mayor se obtuvo a 25ºC.
Se considera a partir de los resultados que la actividad enzimática de la enzima anterior de la presente invención disminuye a medida que aumenta la temperatura de reacción comenzando a 25ºC en las condiciones de reacción de esta vez.
(7) Análisis de la influencia de los iones metálicos y similares
La reacción enzimática se realizó de la misma manera que en el "apartado (2) Análisis de actividad enzimática" anterior, excepto que cada una de las diversas sales metálicas (MnCl2, FeCl2, MgCl2, CaCl2 o CuCl2) o se añadió EDTA en lugar de MnCl2, y la solución después de la reacción se aplicó a una columna Superdex 75 (300 x Φ100 mm. Amersham Biosciences, condiciones de la cromatografía; tampón: NaCl 0,2 M, caudal: 0,5 ml/min). Se fraccionó el eluido en 1 ml y se midió la radioactividad (recuento de [3H]) de cada fracción utilizando un contador de centelleo. Los valores relativos de radioactividad cuando está presente MnCl2 se definió como 100% se presentan a continuación.
Tabla 3
Sal metálica Valor relativo de radioactividad (%) MnCl2 100,0 FeCl2 30,6 MgCl2 30,7 CaCl2 0,0 CuCl2 0,0 EDTA 0,0
Basándose en estos resultados, la enzima anterior de la presente invención presentaba la actividad mayor en presencia de ión Mn2+. Además, en presencia del ión Fe2+ o Mg2+, presentaba aproximadamente el 30% de actividad en comparación con el caso de la presencia del ión Mn2+. Además, se demostró que no actúa sustancialmente en presencia del ión Ca2+ o Cu2+ o del ácido etilendiamintetraacético.
Además, se demostró que la enzima anterior de la presente invención actúa en presencia del ión Fe2+ o Mg2+ también, y su actividad enzimática en presencia del ión Mn2+ es mayor que la actividad enzimática en presencia del ión Fe2+ o Mg2+ .
- (8)
- pH óptimo de reacción
Cuando el pH óptimo de reacción de la enzima de la presente invención se examinó cambiando el pH del "apartado
- (2)
- Análisis de actividad enzimática" anterior a varios niveles, era de pH 7,0 a 7,5.
- (9)
- Relación con el tiempo de reacción enzimática
Ajustando el tiempo de reacción enzimática en 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 6 horas o 18 horas, la reacción enzimática se realizó de la misma manera que en el "apartado (2) Análisis de actividad enzimática" anterior, y se analizó la radioactividad incorporada en el producto de la reacción enzimática. Los patrones de filtración en gel de [3H]GalNAc después de varios periodos de reacción se presentan en la figura 7, y las cantidades totales de incorporación de radioactividad después de varios periodos de reacción enzimática en la figura 8. El círculo blanco, el círculo negro, el triángulo blanco, el triángulo negro, el cuadrado blanco y el cuadrado negro, presentan los resultados después de 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 6 horas y 18 horas, respectivamente. Además, la flecha con "20 k", "10 k", "5 k", "14", "8" ó "6" presenta la posición de elución del peso molecular 20.000, 10.000, 5.000, tetradecasacárido (peso molecular: aproximadamente 2.800), octasacárido (peso molecular: 1.600) o hexasacárido (peso molecular: aproximadamente 1.200) de ácido hialurónico (patrón), respectivamente.
Se demostró a partir de los resultados de la figura 8 que en las condiciones de ensayo, la incorporación rápida de [3H]GalNAc se encuentra después de 3 horas y de 6 horas, pero la incorporación se vuelve lenta a medida que la reacción se acerca a 20 horas.
Además, a partir de los resultados de la figura 7, se demostró que la incorporación aumenta y se obtiene un producto de reacción de alto peso molecular después de un largo periodo de tiempo de reacción.
Además, un producto de peso molecular elevado se obtuvo rápidamente cuando el sustrato aceptor (hexasacárido) se puso a concentración más baja, y un producto de bajo peso molecular se obtuvo cuando el sustrato aceptor (hexasacárido) se puso a alta concentración.
(10) Determinación de la constante de Michaelis (Km)
La radioactividad incorporada en el producto de la reacción enzimática se midió según el "apartado (2) Análisis de actividad enzimática" anterior, colocando la cantidad de la enzima de la presente invención a 1,3 µg, que contenía el sustrato donante (UDP-azúcar; UDP-GlcUA o UDP-GalNAc) en una concentración fija (240 µM) y añadiendo a ésta el otro sustrato donante radiomarcado (radiación UDP-azúcar; UDP-[3H]GalNAc o UDP-[14C]GlcUA) con varias concentraciones (0,6 a 200 µM). Se realizaron ensayos independientes tres veces, y el valor promedio se utilizó como valor medido.
La relación entre la radioactividad incorporada (V) y la relación entre sustrato (S) de UDP-azúcar se muestra en la figura 9, y su doble representación recíproca en la figura 10. El círculo negro y el cuadrado blanco en los dibujos presenta los resultados sobre UDP-GlcUA y UDP-GalNAc, respectivamente.
Como resultado, la Km para UDP-GlcUA y la Km para UDP-GalNAc se calculó que eran 3,44 µM y 31,6 µM, respectivamente.
<110> Seikagaku Corporation
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<221> CDS
<222> (1).. (2058)
<400> 1
y
<210> 2
<211> 686
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
<210> 3
5 <211> 14483
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<220> 10 <221> CDS
<222> (3787)..(5847)
<400> 3
<210> 4
5 <211> 108
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <221> CDS
<222> (1).. (108)
<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos His-tag
<400> 4 15
- 20
- <210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 25
- <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del cebador CS-S <400> 5
- acccaacact gctacaacct atatcgg
- 27
- 30
- <210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 35
- <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del cebador CS-AS
- <400> 6
- 40
- gcgtcttcac caataaatac ccacgaaact 30
- <210> 7
- <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del cebador TM-S
- <400> 7
- cgagaaatac gaacacgctt tggtaa
- 26
- <210> 8 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del cebador TM-AS
- <400> 8
- actcaatttt ctctttcagc tcttcttg
- 28
- <210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del cebador K4C-SP
- <400> 9
- cgggatcccg atgagtattc ttaatcaagc
- 30
- <210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia del cebador K4C-AS
- <400> 10
- ggaattccgg ccagtctaca tgtttatcac
- 30
- <210> 11 <211> 36 <212> PRT <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos His-tag
- <400> 11
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1. Proteína aislada seleccionada de entre el grupo constituido por los siguientes apartados (A) y (B):
- (A)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2;
- (B)
- una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácido(s) en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
-
- 2.
- Proteína según la reivindicación 1, en la que la proteína está en forma soluble.
-
- 3.
- ADN que comprende uno de los siguientes apartados (a) a (c):
- (a)
- ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos representada por la SEC. ID. nº 2;
- (b)
- ADN que codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos en la que 1 a 30 resto(s) de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por SEC. ID. nº 2 se eliminan, sustituyen, insertan o transponen, y que tiene actividad de condroitina-polimerasa;
- (c)
- ADN que se hibrida a
- (i)
- el ADN en el apartado (a), o
- (ii)
- un ADN complementario al ADN en el apartado (a) en condiciones severas en las que la hibridación se realiza a 42ºC en una solución que contiene 50% de formamida, 4 x SSC, HEPES 50 mM (pH 7,0), 10 x solución de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón, y que codifica una proteína que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
-
- 4.
- ADN según la reivindicación 3, en el que el ADN en el apartado (a) esta representado por la SEC. ID. nº 1.
-
- 5.
- Vector que comprende el ADN de la reivindicación 3 ó 4.
-
- 6.
- Vector según la reivindicación 5, que es un vector de expresión.
-
- 7.
- Transformante en el que un hospedador se transforma con el vector de la reivindicación 5 ó 6.
-
- 8.
- Procedimiento para producir una condroitina-polimerasa, que comprende: cultivar el transformante de la reivindicación 7; y recoger la condroitina-polimerasa del material cultivado.
-
- 9.
- Agente para la síntesis de la cadena de azúcar, que comprende la proteína de la reivindicación 1 ó 2 y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
-
- 10.
- Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (3) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente:
GlcUA-X-R1 (1) GalNAc-GlcUA-X-R1 (3)en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAco GlcNAc en la que GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; -representa un enlace glucosídico y R1 representa cualquier grupo. - 11. Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (4) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc y una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente:GlcUA-X-R1 (1) GlcNAc-GlcUA-X-R1 (4)en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAco GlcNAc en la que GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; -representa un enlace glucosídico y R1 representa cualquier grupo.
- 12. Procedimiento para producir una cadena de azúcar representada por la fórmula (5) siguiente, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GlcUA y una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente:GalNAc-GlcUA-R2 (2) GlcUA-GalNAc-GlcUA-R2 (5)en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAco GlcNAc en la que GlcNAc representa N-acetil-D-glucosamina; -representa un enlace glucosídico y R2 representa cualquier grupo.
- 13. Procedimiento para producir una cadena de azúcar seleccionada de entre las fórmulas (6) y (8) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc, con un donante de GlcUA y con una cadena de azúcar representada por la fórmula (1) siguiente:GlcUA-X-R1 (1) (GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R1 (6) GalNAc-(GlcUA-GalNAc)n-GlcUA-X-R1 (8)en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; X representa GalNAco GlcNAc en la que GlcNAc representa N-acetil-D-glucosamina; -representa un enlace glucosídico; R1 representa cualquier grupo; y n es un número entero de 1 ó más.
- 14. Procedimiento para producir una cadena de azúcar seleccionada de entre las fórmulas (7) y (9) siguientes, que comprende por lo menos una etapa que permite al agente sintetizador de la reivindicación 9 ponerse en contacto con un donante de GalNAc, con un donante de GlcUA y con una cadena de azúcar representada por la fórmula (2) siguiente:GalNAc-GlcUA-R2 (2) (GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R2 (7) GlcUA-(GalNAc-GlcUA)n-GalNAc-GlcUA-R2 (9)en las que GlcUA representa ácido D-glucurónico; GalNAc representa N-acetil-D-glucosamina; -representa un enlace glucosídico; R2 representa cualquier grupo; y n es un número entero de 1 ó más.
-
- 15.
- Sonda de hibridación que comprende una secuencia nucleotídica complementaria de la secuencia nucleotídica representada por SEC. ID. nº 1.
-
- 16.
- Catalizador de transferencia de glucosilo que comprende la proteína de la reivindicación 1 ó 2 y que tiene actividad de condroitina-polimerasa.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| ES02017764T Expired - Lifetime ES2365388T3 (es) | 2001-08-10 | 2002-08-09 | Condroitina-polimerasa y adn que la codifica. |
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2002
- 2002-08-09 ES ES02017764T patent/ES2365388T3/es not_active Expired - Lifetime
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