ES2365962B1 - Plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia a estrés abiótico. - Google Patents

Abstract

Plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia a estrés abiótico. La presente invención describe plantas transgénicas que han sido transformadas con un vector de expresión que codifica para el factor de transcripción CDF3. Las plantas transgénicas de la invención presentan una mayor tolerancia y/o resistencia a diferentes tipos de estrés abiótico, simultáneamente, como por ejemplo exceso de salinidad, temperaturas extremas, sequía, etc. Además, la presente invención describe el procedimiento de obtención de las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3. La sobreexpresión del gen CDF3 en plantas transgénicas es muy útil para su utilización en la transformación de plantas de interés agronómico, mejorando así la tolerancia de los cultivos de las mismas frente a condiciones ambientales adversas.

Description

Plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia a estrés abiótico.

Campo de la invención

La presente invención puede englobarse dentro del campo de la ingeniería genética y de la fisiología vegetal. Se refiere al desarrollo de nuevas herramientas genéticas para la mejora de plantas de interés agronómico frente a condiciones ambientales adversas que limitan su rendimiento. De forma más concreta esta invención se fundamenta en la utilización del factor de transcripción, CDF3, para generar plantas transgénicas que presenten mayor tolerancia simultánea a diferentes tipos de estrés abiótico.

Antecedentes

Las plantas durante su desarrollo tienen que enfrentarse a condiciones ambientales adversas que afectan negativamente tanto a su crecimiento como a su productividad, y que provocan cambios muy importantes en diferentes aspectos de las plantas: fisiológicos, morfológicos, bioquímicos y moleculares. En términos generales, los tipos de estrés abiótico más comunes, a los que se enfrentan las plantas son, las temperaturas extremas, la sequía y los suelos salinos. De hecho se estima que, a nivel global, el 22% de la tierra cultivable presenta problemas de salinidad (FAO 2004) y además en la actualidad se está observando que las áreas afectadas por la sequía y las temperaturas extremas se están expandiendo de una forma rápida y se presume que seguirán creciendo debido en parte a los efectos del cambio climático (Burke et al 2006). Por otro lado, el impacto de los distintos tipos de estrés abiótico sobre los cultivos de interés agronómico es muy complejo porque, a menudo, ocurren de forma simultánea varios tipos de estrés y usualmente afectan a todos los estados de desarrollo de la planta. De forma general, además, los mecanismos de resistencia de las plantas a los diferentes tipos de estrés abiótico, dependen de caracteres poligénicos (Fernández-Muñoz, 2005, Tuberosa and Salvi, 2006), lo que implica, a su vez, también una mayor complejidad a la hora de comprender los mecanismos genéticos ligados a la respuesta a dicho estrés.

Cuando una planta es sometida a un estrés de tipo abiótico, se ha observado que una gran cantidad de genes cambian sus niveles de expresión, lo que provoca, de forma general, cambios en los niveles de proteínas y metabolitos, muchos de los cuales tienen una función protectora frente al estrés (Fernie et al 2006; Vij and Tyagi, 2007). Estos genes se pueden catalogar, de forma general, en dos grupos: 1) genes que codifican para proteínas que están implicadas en el desarrollo de la tolerancia y 2) genes que codifican proteínas con función reguladora. Entre los primeros cabría destacar genes implicados en la biosíntesis de chaperonas y osmolitos compatibles y en la producción de compuestos con función protectora. Entre los genes que codifican proteínas de función reguladora destacan, por su abundancia y variedad, los factores de transcripción, que tienen la capacidad de controlar a grupos más o menos grandes de genes implicados directamente en la respuesta al estrés, o de actuar en la biosíntesis de moléculas reguladoras como la fitohormona ácido abscísico (ABA).

Los distintos programas para la mejora de la tolerancia de plantas de interés agronómico a diferentes tipos de estrés abióticos han tenido un éxito reducido. Esto se debe a que la tolerancia a condiciones adversas está basada en caracteres complejos, con herencia poligénica, (Fernández-Muñoz, 2005). Los intentos iniciales para desarrollar plantas de interés agronómico más tolerantes a las condiciones ambientales adversas mediante una estrategia basada en la “transformación genética”, utilizaron un procedimiento que se basa en la utilización de genes de función protectora de “acción única”, como por ejemplo genes responsables de la modificación de un metabolito que confiere resistencia a la sal o la sequía. Sin embargo, esta estrategia se está abandonado, debido a que, como numerosos programas de mejora e investigación han demostrado, la respuesta al estrés abiótico es compleja y en general involucra la acción de muchos genes al mismo tiempo (es de carácter poligénico) y que por tanto, la utilización de solo uno de ellos tiene un efecto menor (Fernández-Muñoz, 2005, Tuberosa and Salvi, 2006).

Una solución que se ha desarrollado recientemente para obtener plantas más tolerantes a las condiciones ambientales adversas, ha sido utilizar, para los programas de mejora de plantas, genes que codifiquen para proteínas con función reguladora (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2005; Chinnusamy et al 2005). La utilización de este tipo de genes tiene como principal ventaja el poder regular simultáneamente la acción de muchos otros genes implicados en la resistencia al estrés y, por tanto, conseguir una eficacia mayor en el desarrollo de la tolerancia. Diferentes tipos de análisis de expresión han permitido identificar numerosos tipos de factores de transcripción cuyos niveles de expresión cambian en respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico (Riechman et al 2000; Chen et al 2002). La mayoría de ellos pertenecen a grandes familias de factores de transcripción de plantas como son el tipo bZIP, AP2/ERF, MYC, NAC, HSF, WRKY y DOF (Qu and Zhu, 2006; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2006), lo que sugiere que participan distintos mecanismos de regulación transcripcional de la respuesta al estrés mediado por la salinidad, la deshidratación y las temperaturas extremas. En este sentido, las patentes americanas US2008/0229448 y US2008/0163397 divulgan plantas transgénicas transformadas con diferentes vectores de expresión que comprenden secuencias de polinucleótidos recombinantes que codifican para un factor de transcripción mutado de tipo AP2 y para diferentes factores de transcripción que se unen a regiones CCAA, respectivamente. Las plantas transgénicas descritas en ambas patentes americanas muestran una mayor tolerancia a diferentes tipos de estrés de tipo abiótico (baja concentración de nitrógeno en el medio, sequía, desecación, salinidad, congelación y temperaturas altas y bajas) que las plantas silvestres no transformadas.

En Arabidopsis, se han identificado 36 factores transcripcionales del tipo “DNA-Binding with One Finger” (DOF). Éstos se han dividido en cuatro grupos (A-D) en función de su homología de secuencia (Riechmann y col., 2000; Lijavetzky y col., 2003). Distintos análisis de secuencia han puesto de manifiesto que dentro del grupo D se incluyen los denominados “Cycling Dof Factors” (CDF), llamados así porque su expresión oscila con el ritmo circadiano. Hasta el momento, la función conocida de los CDF ha sido su implicación en los procesos de floración dependientes del fotoperiodo, a través de la represión del factor de transcripción CONSTANS (CO), que promueve la floración cuando los días se hacen más largos (Imaizumi y col, 2005; Fornara y col., 2009). Por otro lado, se han descrito en otras plantas genes que codifican para ciertos factores de transcripción pertenecientes a la familia DOF cuyos niveles de expresión aumentan en respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico (factores de transcripción tipo DOF en plantas de trigo, taDof14, taDof15 y taDof1), sin embargo hasta la fecha, no se ha probado su relación funcional con la adaptación a dichas condiciones ambientales adversas (Sawh LM y col.; 2009, Yanagisawa S.; 2002).

En la presente invención se ha descubierto que la sobreexpresión en plantas del gen CDF3 de Arabidopsis thaliana, que codifica para un factor de transcripción del tipo DOF, hace que dichas plantas presenten una mayor tolerancia a distintas condiciones ambientales adversas simultáneamente, tales como una mayor tolerancia a la deshidratación, al exceso de sales en el medio y a temperaturas extremas (frío y calor). Por lo tanto, estos resultados demuestran que el factor de transcripción de tipo DOF, CDF3, puede utilizarse como una nueva herramienta para la mejora de la tolerancia a diversos tipos de estrés a la vez. Así la presente invención describe plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 de A. thaliana y que presentan una mejora de la tolerancia a diversos tipos de estrés abiótico simultáneamente. Las plantas transgénicas pueden ser de cualquier género y especie, preferentemente que tengan interés agronómico, tales como maíz, arroz, tomate, patata, etc.

Además, en la presente invención también se describe el procedimiento para la obtención de las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 de A. thaliana, y que presentan esa mejora en la tolerancia simultánea al estrés, que las plantas control no transformadas.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La presente invención describe plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 (Nº Acceso GenBank: AT3G47500.1) de A. thaliana (SEQ ID NO:4), de aquí en adelante las llamaremos plantas transgénicas de la invención, al ser transformadas con el vector de expresión CECT 7674 portador de dicha secuencia génica. El análisis detallado de la expresión del factor de transcripción CDF3 en plantas de Arabidopsis no transformadas con el vector de la invención (WT), indica que sus niveles aumentan de forma destacable en respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico, tales como, la sequía, la salinidad o las temperaturas extremas (frío y calor), así como a tratamientos con la fitohormona ácido abscísico (ABA), poniendo de manifiesto que el factor de transcripción CDF3 presenta funciones relacionadas con la tolerancia a dichos tipos de estrés (Figura 1). El análisis fenotípico de las plantas transgénicas de la invención indica que son más resistentes que las plantas control no transformadas, tanto a condiciones de deshidratación, como a condiciones extremas de temperaturas de congelación.

Además la presente invención describe el procedimiento para la obtención de dichas plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 (AT3G47500) de A. thaliana (SEQ ID NO: 4) al ser transformadas con el vector de expresión CECT 7674, que codifica para dicho factor de transcripción, y que presentan una mayor tolerancia simultánea a diferentes tipos de estrés abiótico. Cabe destacar que también entra dentro del alcance de la presente invención, cualquier secuencia génica ortóloga del gen CDF3 de A. thaliana, entendiéndose por secuencia génica ortóloga, aquella/s que son semejantes en distintas especies que tienen un antepasado común.

A efectos de la presente invención se hacen constar los siguientes términos:

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Tolerancia: es la capacidad de un individuo, en la presente invención, plantas, para soportar el estrés abiótico sin apenas consecuencias para su correcto funcionamiento fisiológico (crecimiento, apariencia y rendimiento).

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CDF3: gen que codifica para un factor de transcripción de la familia DOF. En la presente invención se utiliza el gen CDF3 (No de Acceso al GenBank: AT3G47500.1) de A. thaliana. Incluye: secuencias génicas que se produzcan por degeneración del código genético; secuencias capaces de hibridar, bajo “stringent conditions” con la secuencia de la invención, pueden ser, por ejemplo, las variantes de dicha secuencia, incluidas las variantes alélicas o empalme; secuencias que codifican genes ortólogos o genes parálogos del gen de la invención, secuencias génicas con al menos un 70% de identidad en homología con la secuencia génica de CDF3 y que lleven a cabo idéntica función; métodos de hibridación de ácidos nucleicos se den a conocer en detalle en Kashima et al. (1985) y en Haymes et al. (1985) Numerosas variaciones conocidas para un experto medio en la materia, son posibles en las condiciones y los medios por los cuales la hibridación de ácidos nucleicos puede realizarse para aislar secuencias de polinucleótidos relacionados con similitud con secuencias conocidas en el estado de la técnica y no se limitan a mencionadas aquí.

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Stringent conditions: a los efectos de la presente invención, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de las cadenas de ADN cuyas secuencias son altamente complementarias.

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Genes Parálogos: a los efectos de la presente invención se refiere a genes estructuralmente relacionadas dentro de una única especie, que se derivan de un evento de duplicación.

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Genes Ortólogos: a efectos de la presente invención se refiere a genes estructuralmente relacionados, pero que provienen de especies diferentes y que se derivan de un evento de especiación.

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Homología de secuencia: a los efectos de la presente invención, se entiende como secuencias de bases que den lugar a cambios conservativos de aminoácidos.

Descripción de las figuras

Figura 1. Análisis de expresión de CDF3 en respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico. Análisis de expresión mediante experimentos tipo Northern. Plantas control no transformadas de Arabidopsis thaliana de 3 semanas crecidas en condiciones de fotoperiodo 16:8 (16 horas de luz y 6 de oscuridad), a 20ºC (C). Posteriormente, dichas plantas fueron sometidas a diferentes tipos de tratamiento: 4ºC durante 24 h (4ºC), 38ºC durante 5 h (38ºC), tratamiento con 100 μM de ABA, 5 h (ABA), deshidratadas hasta una pérdida del 50% peso fresco (DH), y regadas con 250 mM NaCl durante 24 h (NaCl). Se han utilizado sondas específicas para el gen CDF3 (SEQ ID NO:3) y para el gen LTI78, utilizado como control.

Figura 2. Análisis de la expresión del gen CDF3 en plantas transformadas que sobreexpresan el gen CDF3.La figura muestra los resultados obtenidos mediante experimentos de Northern blot, en los que se ha utilizado hojas de plantas control que no sobreexpresan el gen CDF3 (WT) y en tres líneas independientes de plantas transformadas que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3). Ambos grupos de plantas han sido cultivados durante 3 semanas en condiciones de fotoperiodo 16:8, a una temperatura de 20ºC.

Figura 3. Tolerancia de las plantas transgénicas 35S::CDF3 a condiciones de sequía frente a las plantas control no transformadas.

(A)

Fotografía que muestra el fenotipo de plantas control no transformadas (WT) y de plantas transgénicas 35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) después de crecerse durante 4 semanas en tierra bajo condiciones óptimas de riego y posteriormente ser sometidas a un déficit de riego durante 10 días.

(B)

Comparación de la velocidad en la pérdida de agua de hojas de plantas control no transformadas con el gen CDF3 (WT) (línea discontinua) y de hojas de plantas transgénicas 35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) (línea continua). Las hojas de ambos grupos (WT y 35S::CDF3) de plantas de 4 semanas se dejaron secar al aire y se estimó el peso fresco en los tiempos indicados. La perdida de agua se estimó como porcentaje del peso fresco inicial. En el eje de abscisas se representa el tiempo expresado en minutos y en el eje de ordenadas se representa el porcentaje de peso fresco.

Figura 4. Análisis de la conductancia estomática (A) y de la eficiencia en el uso del agua (B) en las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3) frente a las plantas control no transformadas (WT), después de crecerse durante cuatro semanas en tierra bajo condiciones óptimas de riego. La conductancia estomática se expresa como molH2O/m2s y la eficiencia en el uso del agua se expresa como μmol CO2/mmol H2O.

Figura 5. Tolerancia a las temperaturas de congelación de las plantas transgénicas 35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3). Plantas control no transformadas (WT) y plantas transformadas (35S::CDF3) de 2 semanas crecidas en condiciones de día largo (16 horas de luz/8 h de oscuridad) y a una temperatura de 20ºC, fueron sometidas a diferentes temperaturas de congelación durante 6 h. La tolerancia a las temperaturas de congelación se estimó como porcentaje de supervivencia a cada temperatura específica y después de un periodo de recuperación de las plantas de 7 días. (A) Tolerancia de plantas control no transformadas (WT, barras negras) y plantas transgénicas 35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3, barras blancas), que no han sido sometidas a periodo previo de aclimatación, a temperaturas de -5ºC y -6ºC. En el eje de abscisas se representa la temperatura en ºC y en el eje de ordenadas se representa el % de supervivencia. (B) Fotografía que muestra un ejemplo representativo de plantas control no transformadas (WT) y plantas transgénicas 35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3), 7 días después de ser expuestas a una temperatura de -6ºC durante 6 h. (C) Tolerancia de plantas control no transformadas (WT, barras negras) y plantas transformadas que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3, barras blancas), después de ser sometidas a temperaturas de -9ºC y -10ºC, las cuales han sido sometidas a un tratamiento previo de aclimatación de 7 días a una temperatura de 4ºC. En el eje de abscisas se representa la temperatura en ºC y en el eje de ordenadas se representa el % de supervivencia. (D) Fotografía que muestra un ejemplo representativo de plantas control no transformadas (WT) y plantas transgénicas 35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) 7 días después de ser expuestas a una temperatura de -10ºC durante 6 h.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe plantas transgénicas caracterizadas por haber sido transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el factor de transcripción CDF3.

En una realización preferida, las plantas transgénicas de la invención se caracterizan porque son transformadas con el vector de expresión es Agrobacterium tumefaciens CECT 7674.

En otra realización preferida, las plantas transgénicas de la invención se caracterizan porque la secuencia nucleotídica que codifica para el factor de transcripción CDF3 es la SEQ ID NO: 4, que se elige preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la especie A. thaliana.

Las plantas transgénicas de la invención se caracterizan porque presentan mayor tolerancia a múltiples tipos de estrés abiótico simultáneamente, en comparación con las plantas control sin transformar.

En otra realización preferida, las plantas transgénicas de la invención se caracterizan porque el estrés abiótico se selecciona preferentemente entre: exceso de salinidad, sequía, temperaturas extremas de frío o de calor y tratamiento con fitohormonas.

En otra realización preferida, las plantas transgénicas de la invención se caracterizan porque se seleccionan preferentemente entre plantas del género Arabidopsis, preferentemente Arabidopsis thaliana y entre cualquier planta de interés agronómico tanto hortícolas: lechuga, pimiento, tomate, melón, patata etc.; cereales: arroz, maíz, trigo, cebada etc, frutales: melocotón, albaricoque, ciruela, cereza, pera, manzana, etc.

Otro objeto de la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de las plantas transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés abiótico, simultáneamente, que se caracteriza por la transformación de la planta silvestre con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el factor de transcripción CDF3.

En una realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque el vector de expresión es Agrobacterium tumefaciens CECT 7674.

En otra realización preferida, el procedimiento de la invención se caracteriza porque la secuencia nucleotídica comprendida en el vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674 es la SEQ ID NO: 4, que se selecciona preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la especie A. thaliana.

Otro objeto de la presente invención se refiere al vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674 caracterizado por comprender el plásmido p35S::CDF3, es cual comprende la secuencia SEQ ID NO:4, que codifica para el factor de transcripción CDF3. Dicha secuencia SEQ ID NO:4 se selecciona preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la especie A. thaliana.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso del vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674 para la transformación de plantas y que presenten una mayor tolerancia a diferentes tipos de estrés abiótico, simultáneamente, en comparación con las plantas control sin transformar.

Otro objeto de la presente invención, se refiere al uso de una secuencia nucleotídica codificante para el factor de transcripción CDF3, preferentemente SEQ ID NO:4, en la producción de plantas transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés abiótico, simultáneamente.

Depósito de microorganismos según el tratado de Budapest

Los microorganismos utilizados en la presente invención fueron depositados el 29 de enero de 2010 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España), con nº de depósito:

CECT 7674: A. tumefaciens cepa C58C1 transformada con el plásmido p35S::CDF3, que porta la secuencia del gen CDF3.

Los ejemplos que se detallan a continuación tienen como objetivo ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1

Clonaje del gen CDF de Arabidopsis thaliana

Mediante técnicas rutinarias de clonación y manipulación del DNA (Maniatis y cols 1989), se clonó el cDNA del gen CDF3 de A. thaliana (No de Acceso al GenBank: AT3G47500.1) (SEQ ID NO:4) en el vector de expresión pROK2 (Baulcombe y cols 1986), flanqueado por el promotor del mosaico de la coliflor (CaMV) (Cauliflower Mosaic Virus) y por una secuencia de poliadenilación. El vector de expresión obtenido contiene:

a) Resistencia al antibiótico kanamicina (para seleccionar en E. coli y A. tumefaciens).

b) Resistencia a kanamicina para selección de la línea transgénica.

c) Secuencias de T-DNA, son las secuencias que se van a transferir y se integrarán en la planta.

d) El sitio de clonaje flanqueado por el promotor 35S de CaMV y una secuencia de poliadenilación.

El gen CDF3 se amplificó mediante técnicas de PCR utilizando los cebadores específicos definidos por las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. El producto de PCR obtenido fue clonado en el vector pGEM-T easy (Promega) dando lugar al plásmido p35S::CDF3 (Esquema 1). Posteriormente se secuenció el gen CDF3 para verificar la integridad de su secuencia.

Esquema 1

Plásmido p35S::CDF3

LB: Borde izquierdo; NPTII: Neomicina Fosfotransferasa II; RB: Borde derecho.

Obtenido el plásmido p35S::CDF3, se procedió a la transformación de bacterias del género Agrobacterium tumefaciens, cepa C58C1 con dicho plásmido. Posteriormente las bacterias transformadas se utilizaron para transformar plantas del género Arabidopsis thaliana mediante infiltración (Clough and Bent 1998). Las semillas de las plantas transformadas se seleccionaron en placas que contienen medio de cultivo GM (Murashige and Skoog, 1% sacarosa) y kanamicina. La selección se repitió hasta obtener plantas T3 homocigotas, correspondientes a la tercera generación después de la selección de las mismas. Se obtuvieron diferentes líneas de plantas transgénicas transformadas con el vector de expresión CECT 7674 y que sobreexpresan el gen CDF3.

Para analizar los niveles de expresión del gen CDF3 en las líneas de plantas transgénicas transformadas con el vector CECT 7674, se realizaron ensayos de tipo Northern blot. Mediante técnicas bioquímicas convencionales se extrajo el RNA total de las distintas líneas de plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3)yde las plantas control no transformadas (WT). La sonda del gen CDF3 utilizada para la hibridación de la membrana del Northern blot con las muestras del RNA extraído, corresponde con los últimos 150bp del cDNA del gen CDF3 (SEQ ID NO: 3).

Como se observa en la figura 2 los niveles de expresión del gen CDF3 son mucho mayores en las líneas de plantas que han sido transformadas con el plásmido 35S::CDF3 (línea 5.4 y línea 2.1), que en las plantas control no transformadas (WT), por lo que para el resto de estudios posteriores se utilizaron plantas transformadas con el vector de expresión CECT 7674 de las líneas 5.4 y 2.1.

Ejemplo 2

Respuesta de las plantas transgénicas 35S::CDF3 que sobreexpresan el gen CDF3 frente a condiciones de deshidratación

Con el objetivo de analizar si la sobreexpresión del gen CDF3 confiere a las plantas transgénicas de la invención un aumento en la tolerancia de las mismas a condiciones de deshidratación frente a las plantas control no transformadas, se realizaron 3 tipos de ensayos:

a) En primer lugar, se sometieron plantas control no transformadas (WT) y plantas transgénicas 35S::CDF3, de 4 semanas a un déficit hídrico que se mantuvo durante un periodo de 10 días. En este caso, las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3) solo muestran leves síntomas de estrés por sequía, mientras que las plantas control no transformadas (WT) presentan severos síntomas de deshidratación (Figura 3A), demostrándose que las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3) muestran una tolerancia mejorada frente a la deshidratación que las plantas control no transformadas (WT).

b) En segundo lugar, se analizó la velocidad de pérdida de agua de plantas control no transformadas (WT) y de plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3). Para lo cual se cortaron hojas de plantas transgénicas (35S::CDF3) y de plantas control (WT) de 3 semanas y se dejaron secar a una temperatura de 20ºC, determinándose posteriormente el peso fresco de las mismas a diferentes intervalos de tiempo. Como se observa en la figura 3B, cuando se exponen las plantas a condiciones de deshidratación, la planta control no transformada (WT) pierde agua más rápidamente que la planta transgénica de la invención, que sobreexpresa el gen CDF3, lo que se traduce en que las plantas control no transformadas (WT, línea discontinua) presentan una mayor sensibilidad a la deshidratación que las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3, línea continua).

c) En tercer lugar, se midieron dos procesos internos de las plantas, la fotosíntesis y la conductancia estomática, tanto en plantas control no transformadas (WT), como en las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3). Para medir ambos parámetros se utilizó una máquina LI-COR Li-6400. Las mediciones tanto de la fotosíntesis como de la conductancia estomática, fueron realizadas entre las 10-11 horas de la mañana con unas condiciones ambientales de 400 p.p.m. CO2, una temperatura de 22ºC y una humedad del 70%. Los resultados obtenidos indican que mientras la tasa de fotosíntesis de ambas líneas de plantas presenta valores similares (datos no mostrados), los valores de conductancia estomática de las plantas transformadas de la invención (35S::CDF3) son significativamente menores que los valores que presentan las plantas control no transformadas (WT) (Figura 4A). En consecuencia, la eficiencia del uso del agua es mayor en las líneas que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) que en las plantas control que no sobreexpresan dicho gen (WT) (Figura 4B).

En resumen estos resultados indican que las plantas que sobreexpresan el factor de transcripción CDF3 son más resistentes a la deshidratación. Esto es debido en parte, a que presentan menores pérdidas de agua a través de sus estomas y por tanto hacen un uso más eficiente de dicha agua.

Ejemplo 3

Respuesta de las plantas transformadas que sobreexpresan el gen CDF3 frente a tratamientos con temperaturas de congelación

Para analizar la respuesta de las plantas transformadas de la invención frente a temperaturas extremas, preferentemente temperaturas de congelación, se utilizaron plantas de dos semanas, que se dividieron en dos grupos. Uno de los grupos fue sometido a un proceso previo de aclimatación a bajas temperaturas, que consistió en exponer a dicho grupo de plantas transgénicas a temperaturas de 4ºC durante 7 días. Este proceso de aclimatación previo a bajas temperaturas favorece que las plantas adapten su metabolismo a esas condiciones adversas, para que posteriormente si son sometidas a condiciones más extremas, muestren una respuesta de aclimatación positiva, es decir, presenten mayor resistencia a esas condiciones adversas, que plantas que no han sido sometidas al proceso previo de aclimatación.

Los tratamientos a los que fueron sometidas las plantas transgénicas de la invención (aclimatadas o no aclimatadas) y las plantas control no transformadas, consistieron en 6 horas de exposición a diferentes temperaturas de congelación (desde -5ºC hasta -10ºC). Pasadas las 6 horas las plantas se sometieron a un proceso de recuperación que consistió en una semana a una temperatura de 20ºC. Posteriormente se determinó el porcentaje de supervivencia a cada temperatura específica.

La comparación de los porcentajes de supervivencia de las plantas transgénicas de la invención no sometidas al proceso de aclimatación a bajas temperaturas, frente a las plantas control no transformadas ni sometidas al proceso de aclimatación previo, indica que los valores de supervivencia obtenidos para las plantas transgénicas de la invención son superiores a los valores obtenidos en las plantas control no transformadas. En la figura 5A se observa que tanto a la temperatura de -5ºC como a la temperatura de -6ºC, el porcentaje de supervivencia de las plantas transformadas de la invención (barras blancas) es mayor que el porcentaje de supervivencia de las plantas control no transformadas (barras negras) (98% de supervivencia de las plantas transgénicas de la invención frente a un 89% de supervivencia de las plantas control no transformadas a la temperatura de -5ºC y un 63% de supervivencia de las plantas transgénicas de la invención frente a un 46% de supervivencia de las plantas control no transformadas a la temperatura de -6ºC). En la figura 5B, se muestran fotografías representativas de plantas transgénicas de la invención que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) y plantas control no transformadas (WT), ambos grupos de plantas no fueron sometidos al proceso previo de aclimatación a bajas temperaturas. Estos resultados indican que la tolerancia intrínseca a temperaturas de congelación de las plantas transgénicas de la invención que sobreexpresan el gen CDF3, es superior a la tolerancia intrínseca de las plantas control no transformadas con el gen CDF3.

De una forma similar, se analizó la tolerancia de las plantas transgénicas de la invención y de las plantas control no transformadas, pero en este caso ambos grupos de plantas fueron aclimatados a condiciones de bajas temperaturas como se ha mencionado anteriormente. Se observa que las plantas transgénicas de la invención que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3, barras blancas), son más resistentes a temperaturas de congelación (-9ºC) que las plantas control no transformadas (WT, barras negras) (Figura 5C). Cabe destacar que cuando las plantas que habían sido sometidas a un proceso previo de aclimatación son sometidas a -10ºC, las plantas no transformadas (WT) no se recuperan, mientras que las plantas transgénicas de la invención (35S:CDF3) sobreviven alrededor de un 45% de las mismas (Figura 5C). En las figura 5D se muestran fotografías representativas de plantas aclimatadas sometidas a temperaturas de congelación. Dichas fotografías ponen de manifiesto la mayor tolerancia a las temperaturas de congelación de las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3) frente a las plantas control no transformadas. Por tanto, las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 presentan una tolerancia superior a temperaturas extremas de congelación que las plantas control no transformadas, aumentando tanto la tolerancia intrínseca (plantas no aclimatadas) como la tolerancia adquirida por el proceso de aclimatación a las temperaturas bajas (plantas aclimatadas).

Estos resultados demuestran que el factor de transcripción CDF3 puede ser utilizado como una nueva herramienta para la mejora de la tolerancia simultánea a condiciones ambientales adversas tales como la deshidratación y las temperaturas extremas, preferentemente temperaturas de congelación. La aplicación más directa es su utilización para la mejora de la tolerancia simultánea a diferentes tipos de estrés de cultivos de interés agronómico. Por ello la presente invención debe cubrir cualquier planta transgénica de interés agronómico que se genere empleando el gen CDF3 de Arabidopsis thaliana.

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Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Planta transgénica caracterizada por haber sido transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el factor de transcripción CDF3.

2. 2.

   Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque el vector de expresión es Agrobacterium tumefaciens CECT 7674.

3. 3.

   Planta transgénica según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia nucleotídica que codifica para el factor de transcripción CDF3 es la SEQ ID NO: 4.

4. 4.

   Planta transgénica según la reivindicación 3 caracterizada porque la secuencia SEQ ID NO: 4 se selecciona preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la especie A. thaliana.

5. 5.

   Planta transgénica según las reivindicaciones1a4 caracterizada por presentar mayor tolerancia, a múltiples tipos de estrés abiótico en comparación con las plantas control sin transformar.

6. 6.

   Planta transgénica según la reivindicación 5 caracterizada porque el estrés abiótico se selecciona preferentemente entre: exceso de salinidad, sequía, temperaturas extremas de frío o calor.

7. 7.

   Planta transgénica según las reivindicaciones 1 a 6 caracterizadas porque se selecciona preferentemente entre plantas del género Arabidopsis, preferentemente Arabidopsis thaliana y entre cualquier planta de interés agronómico, preferentemente hortícolas, cereales y frutales.

8. 8.

   Procedimiento para la obtención de plantas transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés abiótico caracterizado por la transformación de la planta silvestre con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el factor de transcripción CDF3.

9. 9.

   Procedimiento según la reivindicación 8 caracterizado porque el vector de expresión es Agrobacterium tumefaciens CECT 7674.

10. 10.

    Procedimiento según las reivindicaciones 8 o 9 caracterizado porque la secuencia nucleotídica comprendida en el vector de expresión utilizado para transformar la planta silvestre es la SEQ ID NO: 4.

11. 11.

    Procedimiento según la reivindicación 10 caracterizado porque la secuencia SEQ ID NO: 4 se selecciona preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la especie A. thaliana.

12. 12.

    Vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674 caracterizado por comprender el plásmido p35S::CDF3 que comprende la secuencia SEQ ID NO:4, que codifica para el factor de transcripción CDF3.

13. 13.

    Vector de expresión según la reivindicación 12 caracterizado porque la secuencia SEQ ID NO:4 se selecciona preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la especie A. thaliana.

14. 14.

    Uso del vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674 para la transformación de plantas y que presenten una mayor tolerancia a múltiples tipos de estrés abiótico en comparación con las plantas control sin transformar.

15. 15.

    Uso de una secuencia nucleotídica codificante para el factor de transcripción CDF3, preferentemente SEQ ID NO:4, en la producción de plantas transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés abiótico.

    LISTA DE SECUENCIAS

    <110> Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) Universidad Politécnica de Madrid (UPM)

    <120> PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE PRESENTAN MAYOR TOLERANCIA A ESTRÉS ABIÓTICO

    <130> P-03338

    <160> 5

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

    <220> <223> Cebador directo del gen CDF3

    <400> 1

    agatcttaat gatgatggag actagagat

    29

    <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

    <220> <223> Cebador inverso del gen CDF3

    <400> 2

    ctcgagctaa atctgttcat cgaaa

    25

    <210> 3 <211> 151 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana

    <220> <221> característica miscelánea <222> (1)..(151) <223> sonda para la hibridación del gen CDF3 en experimentos de Northern

    <400> 3

    <210> 4

    <211> 1347

    <212> DNA

    <213> Arabidopsis thaliana

    <220>

    <221> CDS

    <222> (1)..(1347)

    <223> Secuencia codificante del gen CDF3

    <400> 4

    <210> 5

    <211> 448

    <212> PRT

    <213> Arabidopsis thaliana

    <400> 5

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.º solicitud: 201030360

    ESPAÑA

    Fecha de presentación de la solicitud: 11.03.2010

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : C12N15/82 (2006.01)

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categoría

    Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    X A

    WO 0216655 A2 (THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE. SYNGENTA PARTICIPATIONS AG) 28.02.2002, páginas 559-561. WO 2007064724 A2 (CROPDESIGN N.V. TECHNOLOGIEPARK) 07.06.2007 1-15 1-15

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

    Fecha de realización del informe 28.09.2011

    Examinador I. Rueda Molins Página 1/4

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    Nº de solicitud: 201030360

    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

    búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 201030360

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.09.2011

    Declaración

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 2, 9, 12-14 1, 3-8, 10, 11 y 15 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-15 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 201030360

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    WO 0216655 A2 (THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE. SYNGENTA PARTICIPATIONS AG) 28.02.2002

    D02

    WO 2007064724 A2 (CROPDESIGN N.V. TECHNOLOGIEPARK) 07.06.2007

16. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La solicitud de patente divulga plantas transgénicas con mayor tolerancia a estrés abiótico.

    El documento D01, que es el que refleja el estado de la técnica más cercano, muestra plantas transgénicas que presentan una mayor tolerancia frente a determinados tipos de estrés.

    NOVEDAD (Artículo 6 LP 11/1986)

    En las reivindicaciones 1, 3 -7 se reivindica una planta transgénica caracterizada por haber sido transformada con un vector de expresión que codifica para el factor de transcripción CDF3 (SEQ ID NO: 4) y presentar mayor tolerancia a múltiples tipos de estrés abiótico.

    En las reivindicaciones 8, 10 y 11 se reivindica un procedimiento para la obtención de plantas transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés abiótico caracterizado por la transformación de la planta silvestre con un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica para el factor de transcripción CDF3 (SEQ ID NO: 4).

    En la reivindicación 15 se reivindica el uso del factor de transcripción CDF3 (SEQ ID NO: 4) en la producción de plantas transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés.

    El documento D01 divulga (en las reivindicaciones 46, 51-54 y 64) un método para producir plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia frente a determinados tipos de estrés que han sido transformados con la secuencia SEQ ID NO: 1489.

    Teniendo en cuenta la información divulga en el documento D01 y que las secuencias SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 1489 son exactamente iguales las reivindicaciones 1, 3-8, 10, 11 y 15 no presentan novedad según lo establecido en el Artículo 6 LP 11/1986.

    ACTIVIDAD INVENTIVA (Artículo 8 LP 11/1986)

    Las reivindicaciones 12 -14 reivindican un vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674 caracterizado por comprender el plásmido p35S::CDF3 que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4. En la reivindicación 2 (dependiente de la reivindicación 1) se reivindica una planta transgénica que emplea dicho vector y en la reivindicación 9 (dependiente de la reivindicación 8) se reivindica un procedimiento que también emplea el citado vector.

    Teniendo en cuenta que en el documento D01 se divulga (en las reivindicaciones 46, 51-54 y 64) la secuencia SEQ ID NO: 1489 que es exactamente igual que la secuencia SEQ ID NO: 4 para la producción de plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia frente a determinados tipos de estrés y que el promotor empleado en la construcción de dicho vector es ampliamente conocido en el estado de la técnica, la creación del vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674 no presentaría dificultad técnica para un experto en la materia y su uso para el aumento de la tolerancia frente a determinados tipos de estrés resultaría evidente a partir de la información divulgada en el documento D01. Por tanto, la reivindicaciones 2, 9 y 12 – 14 no presentan actividad inventiva según lo establecido en el Artículo 8 LP 11/1986.

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/4