ES2366622T3 - Cepas de bcg recombinante con capacidad potenciada para escapar del endosoma. - Google Patents

Abstract

Mycobacterium que se modifica mediante ingeniería genética para incluir una proteína endosomalítica que puede expresarse y secretarse que es activa a un pH de 6-8, en el que la proteína se selecciona del grupo de perfringolisina O, pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, α-hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La invención proporciona cepas de Mycobacterium que tienen una capacidadpotenciada para provocar una respuesta inmunitaria. Experimentos in vivo han demostrado, por ejemplo, una respuesta inmunitaria de células T CD8+ con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido. En particular, la invención proporciona cepas de Mycobacterium que expresan una proteínaperfringolisina O (PfoA) que permite el escape del Mycobacterium de los endosomas, y preparaciones de vacuna que contienen las cepas de Mycobacterium.

Antecedentes

Mycobacterium tuberculosis (M. tb) ha infectado a un tercio de la populación mundial, provocando enfermedad activa en 8 millones y muriendo1,6-2,2 millones de individuos cada año, la mayoría de los cuales viven enpaíses en desarrollo. La tuberculosis (TB) es una epidemia de proporcionesglobales que está creciendo y que se ha vuelto incluso más mortal al cruzarsecon la propagación del VIH. TB es la principal causa de muerte de personas con SIDA.

El bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa atenuada de Mycobacterium bovis y la vacuna frente a la TB ampliamente usada actualmente, se desarrollóhace más de 80 años y cuando se ha sometido a prueba ha tenido tasasampliamente variables de eficacia frente a la tuberculosis pulmonar,incluyendo falta de eficacia en el último gran ensayo de campo realizado enIndia (Fine et al., Vaccine, 16(20):1923-1928; 1998; Anónimo, Indian J MedRes., Aug; 110:56-69; 1999). No obstante, la Organización Mundial de la Saludrecomienda actualmente BCG en el nacimiento o primer contacto con losservicios sanitarios para todos los niños (excepto aquellos con síntomas deenfermedad de VIH/ SIDA) en países con TB extendida. Esta política se basa enla evidencia de que BCG protege frente a formas infantiles graves de TB(Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24(5):1042-1049; 1995; Rodrigues et al.,J Epidemiol Community Health 45(1): 78-80; 1991). La protección mediante BCG frente a TB más allá de la primera infancia es un objeto controvertido condatos limitados que dan resultados mixtos. La alta incidencia de TB pediátrica y adulta en países en desarrollo donde se practica ampliamente lainmunización con BCG en lactantes, indica sin embargo que BCG tal como seadministra actualmente no es altamente eficaz durante los muchos años en quelas personas están en riesgo de enfermedad de TB. Por tanto, se considera que BCG es una herramienta de salud pública inadecuada para la intervención y elcontrol de la TB.

Aproximadamente el 70 por ciento de los seres humanos expuestos a microorganismos de TB, y que tienen los sistemas inmunitarios normales, nollegan a infectarse, y de los que llegan a infectarse sólo aproximadamente el5 por ciento desarrolla enfermedad en el plazo de los primeros dos años. La mayoría de los individuos infectados eliminan la infección, que está asociadacon el desarrollo de respuestas inmunitarias celulares fuertes frente a antígenos de M. tb. Un 5 por ciento adicional se reactiva posteriormentecuando la inmunidad disminuye. Tanto la enfermedad primaria como la de reactivación son mucho más comunes en personas con VIH/SIDA, lo que pone de relieve de nuevo el papel de la inmunidad en la prevención y el control deinfección.

Puesto que la mayoría de los seres humanos pueden controlar la TB, haybuenos motivos para esperar que mediante la inducción de la inmunidad delarga duración de la clase apropiada, debería ser posible desarrollar vacunas eficaces que previenen la infección inicial tras la exposición, prevenir laevolución temprana de la enfermedad, prevenir la reactivación del estadolatente, y prevenir la recidiva tras el tratamiento. Por último, la combinación del uso de vacuna sistemática más la intervención quimioterápica es lo que eliminará finalmente a M. tb como patógeno humano.

En vista del papel fundamental que se piensa que desempeña la vacunación de BCG infantil en la prevención de TB aguda, es difícil sustituir el BCG enensayos para evaluar vacunas candidatas frente a la TB sin superar laevidencia de que la nueva vacuna frente a la TB sea un producto superior. Elproblema es que M. tb es un patógeno específico de seres humanos y losmodelos animales sólo imitan partes de la interacción huésped-patógeno. Por tanto, la evidencia definitiva de que una nueva vacuna frente a la TB tiene potencia mejorada sólo puede obtenerse a partir de ensayos de campocontrolados en seres humanos. Esta realidad ha llevado a muchos investigadores a concluir que una etapa clave hacia una vacuna frente a la TBmejorada será potenciar la inmunogenicidad de BCG.

Un ejemplo de una estrategia de este tipo es mejorar la capacidad de BCGpara inducir o activar células T para potenciar la respuesta inmunitaria. Elpapel fundamental de las células T CD8+ con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido en la inmunidad frente a M. tb se demuestra por la incapacidad de ratones deficientes en 2-microglobulina (2m)para controlar la infección por M. tb experimental (Flynn et al., PNAS USA,89(24): 12013-12017; 1992). El papel fundamental de células T CD8+ con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido se demostró de manera convincente por la incapacidad de ratones deficientes en 2microglobulina (2m) para controlar la infección por M. tuberculosis experimental (Flynn et al., citado anteriormente, 1992). Debido a que estosratones mutantes carecen del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I, no pueden desarrollarse células T CD8+ funcionales. A diferencia de la infección por M. tuberculosis, los ratones deficientes en 2m pueden controlar determinadas dosis infecciosas de la cepa de vacuna de BCG (Flynn et al.,citado anteriormente, 1992; Ladel C. H., et al., Eur J Immunol, 25: 377-384; 1995). Además, la vacunación de BCG de ratones deficientes en 2m sólo prolonga la supervivencia tras la infección por M. tuberculosis, mientras queC57BL/6 inmunizados con BCG resistieron a M. tuberculosis (Flynn et al.,citado anteriormente, 1992).

Esta dependencia de células T CD8+ diferencial entre M tuberculosis yBCG puede explicarse tal como sigue: los antígenos de M. tuberculosis consiguen mejor acceso al citoplasma que los antígenos de BCG, lo que conducea presentación en complejo mayor de histocompatibilidad de clase I máspronunciada (Hess y Kaufmann, FEMS Microbiol. Immunol 7:95-103; 1993). Porconsiguiente, se genera una respuesta de células T CD8 más eficaz mediante M. tuberculosis. Esta idea se apoyó recientemente por el aumento de la presentación en el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de unantígeno irrelevante, ovoalbúmina, mediante la infección simultánea con M. tuberculosis, en vez de con BCG, de las células presentadoras de antígenos(APC) (Mazzaccaro et al., Proc Natl Acad Sci USA, Oct 15:93(21):11786-91; 1996).

Por tanto, los antígenos de M. tb acceden el citoplasma de la célula huésped mejor que los antígenos de BCG, lo que conduce al aumento de lapresentación en el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (Hess et al., citado anteriormente, 1993) y a una respuesta de células T CD8+ elevada frente a M. tb. Además, M. tb estimula las células T CD4+ cooperadoras concomplejo mayor de histocompatibilidad de clase II restringido específicas deantígeno así como las células T CD8+ citotóxicas con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido en ratones y seres humanos (Kaufmann, Annu Rev Immunol 11:129-163; 1993). Por extensión, este hechoindica que las células infectadas por M. tb son susceptibles de reconocimiento por las células T CD8+ citotóxicas con complejo mayor dehistocompatibilidad de clase I restringido. Dado que el 70 por ciento de losseres humanos inmunocompetentes expuestos a los microorganismos de TB nollegan a infectarse, la inmunidad inducida por la infección de M. tb es altamente eficaz en el control de este microorganismo en la inmensa mayoríade los casos. Se cree, por tanto, que la eficacia de la cepa de vacuna de BCGfrente a la TB existente mejorará mediante el aumento de la capacidad de BCGpara inducir respuestas de células T CD8+ citotóxicas con complejo mayor dehistocompatibilidad de clase I restringido (Kaufmann, Fundamental Immunology,1997).

Como norma, los antígenos expresados por los patógenos que permanecenunido al fagosoma se presentan principalmente por moléculas del complejomayor de histocompatibilidad de clase II a las células T CD4+ pero son poco reconocidas por las células T CD8+, que normalmente reconocen los antígenospresentados en el contexto de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (Kaufmann, citado anteriormente, 1997). Por el contrario, las bacterias intracelulares, tales como Listeria monocytogenes (por ejemplo, N.º de ATCC 13932), que escapan del fagosoma y se replican en el citoplasma de las células huésped son eficaces en el acceso a la ruta depresentación de antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de claseI y en provocar respuestas de las células T CD8+ (Berche et al., J Immunol,138:2266-2276; 1987). Esta función de escape del endosoma de Listeria monocytogenes se transfirió recientemente a Salmonella atenuada, que residenormalmente en el fagosoma, introduciendo las secuencias que codifican paralisteriolisina (Llo); se demostró que las cepas resultantes escapaban delendosoma y eran más eficaces en la inducción de respuestas de las células TCD8+ (Bielecki et al., Nature (Londres), 354:175-176; 1990; Gentschev et al.,Infect Immun 63(10):4202-4205; 1995; Hess et al., Host Response to Intracellular Pathogens, 75-90; 1997). Más recientemente se aplicó esteenfoque a BCG; así se construyeron cepas de BCGr que secretaban Llo paramejorar la capacidad de BCG para inducir respuestas inmunitarias con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido (Hess et al., PNAS USA,95(9):5299-5304; 1998. Aunque la evidencia inicial sugirió que una cepa deBCGr-Llo+ era más hábil en provocar células T CD8+, la cepa demostró no poderescapar del endosoma. Por tanto, una limitación de este enfoque es que lafunción hemolítica de Llo, que se requiere para el escape del endosoma, sólo es completamente activa a pH 5,5 y casi inactiva a pH 7,0. En el documento US2002/0177569 Al se describe una vacuna de BCG transformada para expresarlisteriolisina. Sin embargo, la listeriolisina no puede escapar del endosomaa pH neutro. Puesto que las micobacterias mantienen el pH del endosoma a un valor de aprox. 7,0, es lógico suponer que Llo en las cepas de BCGr-Llo hastaahora notificadas son disfuncionales debido a que el entorno en el que seexpresan no es óptimo para la magnitud de actividad hemolítica (Geoffrey et al., Infect Immun 55(7): 1641-1646; 1987). Por tanto, el beneficio deinmunopotenciación de este enfoque no se logrará hasta que se desarrolle unaestrategia que permita que Llo funcione en endosomas manipulados por BCG.

La técnica anterior hasta ahora no ha proporcionado un BCGr con unacapacidad mejorada para el escape del endosoma, y en el que pueda aumentarsede ese modo la inducción de, por ejemplo, respuestas de células T CD8+ citotóxicas con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I restringido.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un aspecto a modo de ejemplo de la presente invención proporciona cepasde BCG recombinantes (BCGr) que tienen una capacidad potenciada para provocaruna respuesta inmunitaria de células T CD8+ con complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC) restringido. Estas cepas de BCGrnovedosas se han modificado mediante ingeniería genética para expresar una proteína endosomalítica funcional que es bioactiva a valores de pH próximos ala neutralidad (por ejemplo, aproximadamente pH 6-8 o aproximadamente de 6,5a 7,5). La proteína endosomalítica es por tanto activa dentro endosomas que contienen micobacterias, que normalmente tienen un pH interno próximo a laneutralidad. La actividad de la proteína endosomalítica producida por BCGr dacomo resultado la ruptura del endosoma, permitiendo que BCGr escape del endosoma y vaya al interior del citoplasma de la célula. Los BCGr se exponende ese modo en el citoplasma, y provocan una respuesta de células T fuerte,particularmente una respuesta de células T CD8+ citotóxicas con MHC-I restringido fuerte. En una realización de la invención, la proteínaendosomalítica que se introduce en el BCGr mediante modificación poringeniería genética es perfringolisina O (PfoA) de Clostridium perfringens.

La invención proporciona por tanto un Mycobacterium que se modificamediante ingeniería genética para expresar y secretar una proteínaendosomalítica funcional que es activa a pH neutro. En algunas realizaciones,la proteína formadora de poros endosomalítica funcional es PfoA o PfoAmutante codificada por SEQ ID NO: 3 (denominada en el presente documentoPfoAG137Q). La expresión de la proteína endosomalítica funcional por Mycobacterium permite el escape de BCGr de los endosomas. El Mycobacterium que se modifica mediante ingeniería genética de ese modo puede ser un Mycobacterium atenuado tal como BCG. La invención también proporciona: unMycobacterium que se modifica mediante ingeniería genética para expresar ysecretar PfoA; y, un Mycobacterium que se modifica mediante ingenieríagenética para expresar y secretar una PfoAG137Q codificada por SEQ ID NO: 3.

La presente invención proporciona además un método para permitir que underivado de Mycobacterium escape de los endosomas. El método comprende la etapa de modificar mediante ingeniería genética el Mycobacterium paracontener, expresar y secretar una proteína endosomalítica funcional tal comoPfoA o PfoAG137Q tal como la codificada por SEQ ID NO: 3. En algunasrealizaciones, el Mycobacterium es un Mycobacterium atenuado tal como BCG.

La invención proporciona además una preparación de vacuna, que comprende un Mycobacterium que se modifica mediante ingeniería genética para expresar ysecretar una proteína endosomalítica funcional que es activa a pH neutro. Laproteína endosomalítica funcional puede ser, por ejemplo, PfoA o PfoAG137Q tal como la codificada por SEQ ID NO: 3. La expresión de la enzima endosomalítica funcional por Mycobacterium permite el escape del Mycobacterium recombinante de los endosomas. En algunas realizaciones, el Mycobacterium es un Mycobacterium atenuado tal como BCG.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. El mapa para el vector suicida pAF102. La denotación para cadauno de los segmentos de ADN es tal como sigue: flanco L y flanco R: los flancos izquierdo y derecho del gen ureC respectivamente; pfoA es el gen quecodifica para la forma mutante de perfringolisina O (número de registro deGenBank: BA000016) con un cambio de único aminoácido en 137G(Q); LPpAg85B es la secuencia de ADN que codifica para el péptido líder del antígeno 85B (esdecir Rv1886c); PAg85A es la secuencia promotora del gen 85A de antígeno (es decir Rv3804c); aph es el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (número de registro de GenBank: X06402), que confiere resistencia a kanamicina para el plásmido; OriE es el origen de replicación de pUC (número de registro deGenBank: AY234331); Ble es el gen (número de registro de GenBank: L36850) queconfiere resistencia a zeocina para el plásmido; SacB es el gen (número deregistro de GenBank: Y489048) que codifica para levansacarasa, que confieresensibilidad de las bacterias a sacarosa; Phsp60 es la secuencia promotora delgen de las proteínas de choque térmico (es decir Rv0440); MCS son los sitiosde clonación múltiple para las enzimas de restricción indicadas. Obsérveseque el casete entre dos sitios PacI puede estar sustituido con otros genes deenzima endosomalítica cuando sea aplicable.

Figuras 2A y B. A, La secuencia génica de PfoA de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 1); B, la secuencia proteica de PfoA de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 2).

Figura 3. La secuencia génica de un mutante preferido, PfoAG137Q (SEQ ID NO: 3).

Figura 4. Diagrama de flujo para las etapas principales del intercambio alélico.

Figura 5. Digestión con enzima de restricción para el plásmido pAF102 de intercambio alélico.

Carril 1: marcador de tamaño molecular de ADM 1 Kb plus; Carril 2:Plásmido pAF102 digerido por la enzima de restricción EcoRI; Carril 3: plásmido pAF102 no digerido control; Carril 4: plásmido de vector pAF100 sin inserto de casete de PFO digerido por la enzima de restricción EcoRI. Carril

5: Plásmido de vector pAF100 sin inserto de casete de PFO no digeridocontrol. A partir de esta figura, el plásmido pAF100 se lineariza para producir una única banda de 4,4 kb en tamaño mediante la enzima de restricción EcoRI según lo esperado. El plásmido pAF102 produjo dos bandascon tamaño de 2,3 kb y 6,0 kb respectivamente mediante la enzima derestricción EcoRI según lo esperado.

Figura 6. Análisis por PCR de las colonias seleccionadas para el genotipo de ureC::pfoA. La PCR se llevó a cabo tal como se describe en Materiales y métodos. Se analizó el producto de PCR mediante electroforesisen gel de agarosa al 1,2%. El marcador de tamaño molecular de ADN usado fue1Kb plus convencional adquirido de Invitrogen. Carriles 1-6: PCR para lascolonias enumeradas de 105-1 a 105-6 respectivamente; carril 7 y carril 8:PCR para las colonias enumeradas 142-7 y 142-10, respectivamente. Carril 9:PCR para cepa danesa 1331 de BCG.

Figura 7. Crecimiento y sensibilidad a kanamicina de AFV102. Seinocularon bacterias de las cepas AFV102, danesa 1331 de BCG y constructomerodiploide de PfoA (Pfo105 MI) en los medios de crecimiento 7H9 y secomparó el crecimiento de cada cepa midiendo la densidad óptica a 600 nm endiferentes momentos. Para la prueba de la sensibilidad a kanamicina, seañadió antibiótico hasta una concentración final de 50 ug/ml y se midió elcrecimiento tal como anteriormente. Abreviaturas en la leyenda: Ctrl: medio de control sin ninguna inoculación bacteriana; +Kan o -Kan: con o sin kanamicina en el medio.

Figura 8. Prueba de citotoxicidad para AFV102 en células J774A.1. Seinfectaron las células con o bien AFV102 o bien danesa 1331 de BCG. En los momentos indicados tras la infección, se midió la viabilidad celular tal comose describe en Materiales y métodos mediante la comparación con el control noinfectado.

Figura 9. Pruebas de AFV102 para determinar su capacidad de supervivencia en macrófagos. Se infectaron células J774A.1 en monocapas conlas cepas AFV102 o danesa 1331 de BCG, y en los momentos indicados tras lainfección se contaron las bacterias intracelulares tal como se describe en Materiales y métodos.

Figura 10. Prueba de AFV102 para determinar su capacidad para secretarla proteína Pfo con actividad hemolítica independiente del pH. Se preparó elcultivo de AFV102 tal como se describió anteriormente y se sometió a pruebael sobrenadante para determinar su capacidad para lisar glóbulos rojos a pH7,0 y 5,5. Se midió la actividad de hemolisina tal como se describe enMateriales y métodos.

Figuras 11A-D. Ilustración esquemática de los resultados para le ejemplo

3. A, La bacteria (óvalo oscuro) invade un macrófago (óvalo gris) dentro deuna célula (hexágono) en la que estimula la formación de endosomas tempranos;B, BCG detiene la maduración del endosoma y BCG se protege dentro del endosoma temprano; C, las bacterias AFV102 que expresan PfoA se encuentran inicialmente en endosomas tempranos tras la invasión; sin embargo, comenzarán a secretar PfoA y escaparán del endosoma; D, puede observarse que lasbacterias AFV102 que expresan PfoA emergen del endosoma o están libres en lacélula.

Figura 12. El mapa para el vector pAF105 de sobreexpresión de antígenos.La denotación para cada uno de los segmentos de ADN es tal como sigue: PRv3130 es la secuencia promotora del antígeno Rv3130c; PAg85B es la secuencia promotora del antígeno Rv1886c. Los genes en el casete de expresión sonRv0288; Rv1886c y Rv3804c; aph es el gen aminoglucósido fosfotransferasa(número de registro de GenBank: X06402), que confiere resistencia a kanamicina; OriE es el origen de replicación de pUC (número de registro deGenBank: AY234331); leuD es el gen que codifica para 3-isopropilmalatodeshidratasa (es decir Rv2987c); OriM es el origen de replicación enMycobacterium (n.º de registro de Genbank: M23557).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un BCGr que puede escapar de losendosomas y acceder al citoplasma de la célula huésped de las células a lasque infecta. Como resultado, se provoca una respuesta de células T CD8+ superior frente a BCGr en las células.

El BCGr se modifica mediante ingeniería genética para contener unaendosomalisina funcional que se expresa y secreta por BCGr, y que media elescape endosómico de BCGr. El término endosomalisina en el presente documentose refiere a una proteína que puede romper la membrana endosómica losuficiente como para permitir que una célula bacteriana pase del endosoma al interior del citosol. El término endosomalítico en el presente documento serefiere a una proteína que tiene dicha actividad de ruptura. El términoendosomalisis en el presente documento se refiere al proceso de ruptura de lamembrana endosómica lo suficiente como para permitir que una célula bacteriana pase del endosoma al interior del citosol. La proteínaendosomalítica es activa en entornos con valores de pH próximos a la neutralidad, tal como dentro de los endosomas de células infectadas con micobacterias, y por tanto media el escape de las bacterias al interior del citoplasma.

En una realización de la presente invención, la proteína endosomalíticafuncional que se introduce en las cepas de BCGr de la presente invención es PfoA de Clostridium perfringens, o una variante funcional de la misma. PfoAes una citolisina secretada por Clostridium perfringens que está codificada por el gen pfoA (n.º de registro de Genbank CPE0163). Las secuencias génica yproteica se muestran en la figura 2 A y B, respectivamente. PfoA media elescape bacteriano de los fagosomas, tanto en Clostridium como cuando se expresa por B. subtilis (Portnoy et al., Infect Immun. Jul; 60(7): 2710-7;1992). A diferencia de Llo, PfoA es activa tanto a pH 5,0 como a pH 7,0 y portanto permanece activa en el citosol y provoca daño a células huéspedinfectadas (Portnoy et al., citado anteriormente, 1992). Por tanto, cuando se expresó PfoA en L. monocytogenes en lugar de Llo, se permitió que la cepaescapara de los fagosomas (Jones y Portnoy, Infect Immun. Dec; 62(12): 560813; 1994). Sin embargo, su expresión también provocó daño a las célulashuésped. Llo presenta propiedades similares a PfoA, excepto que Llo es activade manera óptima a pH 5,5 y presenta poca actividad a pH 7,0. Por tanto, Llomedia el escape del endosoma una vez que el pH del endosoma disminuye hasta pH 5,5 pero no afecta a célula huésped porque el pH del citosol, que está próximo a la neutralidad, impide la actividad de Llo.

Portnoy et al. han demostrado además que cuando PfoA se expresa en L. monocytogenes en una forma de mutante con un cambio de único aminoácido, laforma de mutante de PfoA ya no es tóxica para las células huésped, aunquetodavía puede mediar el escape bacteriano de una vacuola, y llevar a cabo elcrecimiento intracelular (Portney et al., citado anteriormente, 1992). Lacepa DP-12791 particular, con una mutación que cambia Gly137 a Cln137 en Pfo (es decir PfoAG137Q), puede escapar del fagosoma de una manera similar al tipo natural, pero sin producir un efecto tóxico sobre las células huésped.Además, PfoAG137Q es activa tanto a pH 5,6 como a pH 7,4 con una semividacitosólica reducida. La secuencia génica de PfoAG137Q se muestra en la figura 3 (SEQ ID NO: 3).

La expresión de PfoA permite el escape de los endosomas debido a que laactividad de formación de poros de PfoA conduce al daño de la membrana celular eucariota. PfoA forma poros en membranas que contienen colesterolmediante la inserción espontánea de su dominio en una bicapa. Esto sucede através de la unión al colesterol, que actúa como receptor. Tras la unión, latoxina forma entonces una interfaz monómero-monómero (que se requiere para elensamblaje de oligómero), se oligomeriza y realiza particiones en la membranacambiando su estructura, que es dependiente de la unión a la membrana. Laformación de oligómeros unidos a la membrana conduce al daño de la membrana ya la lisis final (Ramachandran et al., Nature Structure and Molecular Biology, 11(8), 697-705 (1995). PfoAG137Q puede mediar la lisis de la vacuola de esta manera. La PfoAG137Q preferible tiene actividad limitada en elcitoplasma de la célula huésped infectada, debido a su sensibilidad a lasproteasas del huésped.

En una realización de la invención, la enzima endosomalítica funcional que se expresa por BCGr es PfoA que se deriva o se aísla de C. perfringens. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que también existen otras proteínas endosomalíticas que son activas a o cerca de la neutralidad quepodrían ser adecuadas para su uso en la presente invención, concretamente pneumolisina (producida por Streptococcus pneumoniae), estreptolisina O (producida por Streptococcus pyogenes), cerolisina (producida por Bacilus

cereus), -hemolisina (producida por Staphylococcus aureus), etc., yvariantes funcionales de las mismas.

Mediante “proteína endosomalítica funcional” o “forma funcional” de unaproteína (o el producto génico de un gen que “se expresa funcionalmente”), sequiere decir que la forma de la proteína que se produce por la bacteria BCGrmuestra la magnitud de actividad característica que se conoce para laproteína nativa o natural (“tipo natural”) en su organismo nativo. La magnitud de actividad de la forma funcional de la proteína producida por BCGres, en general, al menos aproximadamente el 50 por ciento de la actividad habitual de la proteína de tipo natural cuando se somete a ensayo encondiciones convencionales tal como reconocen los expertos en la técnica. Lamagnitud de actividad de la proteína puede determinarse midiendo cualquiercaracterística física observable, tal como unión a un ligando, o producción de un efecto, tal como escape de BCGr de los endosomas. Preferiblemente, lamagnitud de actividad es al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,100%, o más de la magnitud de actividad convencional de la proteína de tiponatural cuando se somete a ensayo en condiciones convencionales tal comoreconocen los expertos en la técnica.

Mediante “variante funcional” de una proteína, se quiere decir unpolipéptido cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos aproximadamente el 70% a la de una proteína “de referencia” de tipo natural,y que conserva la magnitud de actividad funcional (tal como se describióanteriormente) de la proteína de tipo natural. La secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia de tipo natural se usa normalmente como punto departida para mutaciones y alteraciones que se llevan a cabo por modificaciónmediante ingeniería genética.

Preferiblemente, una variante funcional es un polipéptido con unasecuencia de aminoácidos que presenta aproximadamente el 75%, 80%, 85%, 90%,95% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de referencia. Tales variantes funcionales incluyen pero sin limitarse a secuencias de polipéptidos en las que se ha(n) realizado una o más substituciones de aminoácidos conservativas. Las substituciones de aminoácidos conservativas se conocen bien los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la substitución de un aminoácido cargado positivamente por otro, de un aminoácido cargado negativamente por otro, de un aminoácido hidrófobo porotro, etc. Los polipéptidos variantes pueden contener una o más de talessubstituciones, siempre que el polipéptido variante resultante conserve lamagnitud de actividad funcional tal como se ha definido en el presentedocumento. “Variantes funcionales” también engloba otros cambios en la secuencia primaria del polipéptido de interés. Ejemplos de cambios incluyen pero sin limitarse a deleciones y adiciones de aminoácidos, o la modificación de aminoácidos (por ejemplo modificaciones químicas tales como sulfonación,desamidación, fosforilación, hidroxilación, etc.). Tales cambios pueden serel resultado de la modificación mediante ingeniería genética de una secuencia de aminoácidos de referencia, o puede ser el resultado de modificaciones tras la traducción de la proteína, o ambos. Además, las variantes funcionales deuna enzima pueden ser el resultado de mutaciones naturales tales como las quese producen entre proteínas análogas con las mismas actividades o similaresque se aíslan de diferentes cepas de una especie, o de diferentes especies, ode diferentes organismos individuales dentro de una especie. Las proteínas detales variantes que se producen de manera natural pueden servir también como la proteína de referencia, y la secuencia de aminoácidos de una variantenatural de este tipo puede servir como la secuencia de referencia. En cualquier caso, todas las variantes funcionales de este tipo de una proteína de referencia conservan la magnitud de actividad de la proteína, tal como sedescribe en el presente documento.

Las homologías e identidades de secuencia tal como se describe en elpresente documento no pretenden incluir secuencias heterólogas de aminoácidosque se derivan de fuentes distintas de la secuencia de referencia y que seunen a o se incluyen en la secuencia de polipéptido de una proteína paraotros fines diversos. Ejemplos de tales secuencias heterólogas incluyen perosin limitarse a secuencias que facilitan el aislamiento del polipéptido (por ejemplo colas de histidina), secuencias que facilitan la secreción o localización del polipéptido dentro de la célula, (por ejemplo diversassecuencias líder o de direccionamiento), y secuencias que codifican parasitos de glicosilación (secuencias de glicosilación), etc.

En cualquier caso, la variante funcional conservará la magnitud deactividad de la proteína de la que es una variante hasta el grado de que lavariante funcional presente al menos aproximadamente el 50 por ciento, y demanera preferible aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más, de lamagnitud de actividad de la proteína de la que es una variante, cuando sesomete a ensayo en condiciones convencionales tal como reconocen los expertosen la técnica.

Además, la presente invención también incluye secuencias de ácidonucleico que codifican para proteínas y variantes funcionales de proteínasutilizadas en la presente invención. Las secuencias de ácido nucleico pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o formas modificadas de cualquiera de ellos, y pueden ser mono o bicatenarias. Las secuencias deácido nucleico de la presente invención incluyen cualquiera que las enumeradas en el presente documento, y también pretenden abarcar variantes delas mismas. Por ejemplo, puede que las variantes de ácidos nucleicos no sean idénticas a las secuencias enumeradas aunque todavía pueden codificar para una secuencia de aminoácidos idéntica debido a la redundancia del códigogenético. Alternativamente, pueden realizarse algunos cambios en las secuencias de la presente invención (por ejemplo substituciones, deleciones o adiciones) que dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos codificada, siempre que la secuencia de aminoácidos codificada sea unavariante funcional de la secuencia de aminoácidos de referencia tal como se describió anteriormente. Ejemplos incluyen pero sin limitarse a: cambios queprovocan sustituciones de aminoácidos conservativas en la enzima; y cambiosque dan como resultado substituciones no conservativas, o deleción o adiciones en las secuencias de aminoácidos. Tales cambios pueden introducirsepor cualquier motivo, por ejemplo con el fin de alterar las modificaciones tras la traducción de la enzima; para aumentar o reducir la solubilidad; paraprevenir o introducir interacciones estéricas en el polipéptido traducido,etc. En general, las variantes de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención mostrarán al menos aproximadamente el 50 por ciento, y de manera preferible aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 100% dehomología con las secuencias de referencia, tal como se determina medianteprocedimientos comparativos que son bien conocidos por los expertos en latécnica. Tales variantes también se caracterizan por mostrar la capacidad deunirse a las secuencias utilizadas en la presente invención en condiciones dealta rigurosidad. Los ensayos de unión de alta rigurosidad son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden aplicarse fácilmente a posiblesvariantes de prueba de las secuencias de la presente invención.

Homologías de secuencia tal como se describe en el presente documento nopretende referirse a secuencias de ácido nucleico que codifican parasecuencias de aminoácidos heterólogas que se derivan de fuentes distintas dela secuencia de aminoácidos de referencia, y que se unen a o se incluyen enla secuencia de polipéptidos de una proteína para otros fines diversos. Porejemplo, tales secuencias de ácido nucleico pueden codificar para secuenciasde aminoácidos heterólogas incluyendo pero sin limitarse a: secuencias quefacilitan el aislamiento de polipéptidos (por ejemplo colas de histidina),secuencias que facilitan la secreción o localización del polipéptido dentrode la célula, (por ejemplo, diversas secuencias líder o secuencias de direccionamiento), y secuencias que codifican para los sitios de glucosilación (secuencias de glucosilación), etc.

Otras variaciones de las secuencias de ácido nucleico de la presenteinvención que la presente invención pretende abarcar son las secuencias que se han alterado por conveniencia o mejora en la modificación mediante ingeniería genética de las secuencias de ácido nucleico, o en la expresión delas secuencias de aminoácidos para las que codifican. En general, tales alteraciones no afectarán a la secuencia del polipéptido que se traduce finalmente a partir de la secuencia de ácido nucleico; o el polipéptidotodavía cumplirá los criterios expuestos anteriormente para una variantefuncional. Ejemplos de este tipo de alteración incluyen pero sin limitarse a: la inclusión de sitios de endonucleasa de restricción convenientes en una secuencia de ácido nucleico para facilitar la manipulación de la secuencia(por ejemplo para la inserción de una secuencia en un vector); la inclusión,deleción, u otro cambio en una secuencia o secuencias implicada(s) en laexpresión de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo inclusión de cualquierade diversas secuencias promotoras y/o potenciadoras, señales de detención, superpromotores, promotores inducibles, y otras secuencias diversas quemodifican la expresión de la secuencia de ácido nucleico); la inclusión delas secuencias que facilitan la interacción de un vector con el ácidonucleico de un organismo huésped; etc.

Además, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención puedenmodificarse químicamente o incluir bases no tradicionales por cualquiera demuchos motivos que son bien conocidos por los expertos en la técnica, porejemplo, para potenciar la estabilidad del ácido nucleico, o para conferiruna conformación estérica deseada.

Mediante “activo a pH neutro” y “activo a un pH de aproximadamente 7,0” se quiere decir que la enzima se activa a un valor de pH en el intervalo dedesde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 8,0, y preferiblemente en unintervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.

La presente invención proporciona micobacterias recombinantes. En una realización preferida de la invención, las micobacterias se atenúan, tal como se muestra a modo de ejemplo mediante BCG. Sin embargo, los expertos en latécnica reconocerán que existen otras micobacterias atenuadas y no atenuadasque también podrían ser adecuadas para su uso en la presente invención.Ejemplos de tipos adicionales de micobacterias incluyen pero sin limitarse a la cepa CDC1551 de M. tuberculosis (véase, por ejemplo Griffith et al., Am.

J. Respir. Crit. Care Med. Aug; 152(2):808; 1995), cepa Beijing de M. tuberculosis (Soolingen et al., 1995), cepa H37Ra de M. tuberculosis (N.º de ATCC: 25177), cepa H37Rv de M tuberculosis (N.º de ATCC: 25618), M. bovis (N.º de ATCC: 19211 y 27291), M. fortuitum (N.º de ATCC: 15073), M. smegmatis (N.º de ATCC: 12051 y 12549), M. intracellulare (N.º de ATCC: 35772 y 13209),

M. kansasii (N.º de ATCC: 21982 y 35775) M. avium (N.º de ATCC: 19421 y 25291), M. gallinarum (N.º de ATCC: 19711), M. vaccae (N.º de ATCC: 15483 y 23024), M. leprae (N.º de ATCC:), M. marinarum (N.º de ATCC: 11566 y 11567) y

M. microtti (N.º de ATCC: 11152).

Ejemplos de cepas de Mycobacterium atenuadas incluyen pero sin limitarse a cepa auxótrofa para pantotenato de M. tuberculosis (Sambandamurthy, Nat.Med. 2002 8(10):1171; 2002), cepa mutante para rpoV de M. tuberculosis (Collins et al., Proc Natl Acad Sci USA. 92(17): 8036; 1995), cepa auxótrofa para leucina de M. tuberculosis (Hondalus et al., Infect. Immun. 68(5):2888;2000), cepa danesa de BCG (N.º de ATCC 35733), cepa japonesa de BCG (N.º deATCC 35737), cepa de Chicago de BCG (N.º de ATCC 27289), cepa de Copenhague de BCG (N.º de ATCC: 27290), cepa de Pasteur de BCG (N.º de ATCC: 35734),cepa de Glaxo de BCG (N.º de ATCC: 35741), cepa Connaught de BCG (N.º de ATCC 35745), BCG Montreal (N.º de ATCC 35746).

En una realización adicional de esta invención, las cepas de Mycobacterium atenuadas se modifican para potenciar la apoptosis, induciendotales cepas fuertes respuestas inmunitarias celulares. Apoptosis es la muertecelular programada, que difiere espectacularmente de la muerte celular necrótica en lo que se refiere a su inducción y consecuencias. De hecho, el proceso por el que la apoptosis de células que contienen el antígeno da comoresultado la inducción de inmunidad celular potente se ha denominado sensibilización cruzada (Heath et al., Immunol Rev 199; 2004; Gallucci et al., Nature Biotechnology. 5:1249; 1999; Albert et al., Nature 392:86; 1998).Existen varios mecanismos para la inducción de apoptosis que conducen a unaumento de la inmunidad mediada por células específica de antígeno. La apoptosis mediada por caspasa 8 conduce a protección inmunitaria celularespecífica de antígeno (Sheridan et al., Science 277:818; 1997).

Otra realización de la presente invención, por tanto, proporciona cepas de Mycobacterium atenuadas que presentan propiedades de pro-apoptosispotenciadas, tales como pero sin limitarse a SodA secretada por secAl quecarece de un péptido líder de Salmonella enteriditis (n.º de registro deGenBank 1068147), Escherichia coli (n.º de registro de GenBank 1250070) o Shigella flexneri (n.º de registro de GenBank 1079977) o alternativamente unaproteína SodA que no se secreta de manera natural tal como la SodA deListeria monocytogenes EGD-e (n.º de registro de GenBank 986791). Tales cepas de Mycobacterium atenuadas no producen Sod extracelular y por tanto no suprimen respuestas inmunitarias del huésped, aunque sí expresan Sod intracelular, permitiendo así la supervivencia de dicho Mycobacterium (Edwards et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164(12): 2213-9; 2001).Alternativamente, las cepas de Mycobacterium atenuadas que presentanpropiedades de pro-apoptosis potenciadas portan un gen de Rv3238c inactivado.

Alternativamente, la expresión de Salmonella SopE (n.º de registro de GenBank AAD54239, AAB51429 o AAC02071) o caspasa-8 (n.º de registro de GenBank AAD24962 o AAH06737) en el citoplasma de las células huésped porMycobacterium atenuado en la presente invención conferirá un método poderosopara inducir muerte celular programada en el contexto de antígenos expresadospor dicho Mycobacterium atenuado, produciendo altos niveles de inmunidadcelular específica de antígeno.

El receptor de muerte 5 (DR-5) también conocido como TRAIL-R2 (receptorde TRAIL 2) o TNFR-SF-10B (miembro 10B de la superfamilia de factores denecrosis tumoral) también media la apoptosis mediada por la caspasa 8 (Sheridan et al., 1997). La apoptosis inducida por reovirus está mediada por TRAIL- DR5 que conduce a una eliminación posterior del virus (Clarke et al.,

J. Virol. 74:8135; 2000). La expresión de DR-5, tal como DR- 5 humano (n.º deregistro de GenBank BAA33723), herpesvirus-6 (HHV-6) homólogo de DR-5 (n.º deregistro de GenBank CAA58423) etc., por Mycobacterium atenuado en la presenteinvención proporciona un efecto adyuvante potente para la inducción deinmunidad celular específica de antígeno frente a antígenos de M. tb.

Además, también pueden inducirse que las células presentadoras deantígenos del huésped (tales como macrófagos y células dendríticas)experimenten apoptosis a través del ligamiento con Fas, que es un estímulofuerte para la inducción de respuestas inmunitarias celulares especificas deantígeno (Chattergoon et al., Nat. Biotechnol. 18:974; 2000). Por tanto,Mycobacterium atenuado que expresa Fas o proteína de fusión ectodominio deCD4/dominio citoplásmico de FAS inducirá apoptosis y aumentará las respuesta inmunitarias celulares específicas de antígeno.

En resumen, las cepas de Mycobacterium atenuadas que potencian lainducción de apoptosis proporcionan una herramienta potente para la inducciónde respuestas celulares que conducen a destrucción celular mediada por el sistema inmunitario de células infectadas por M. tb, con eliminación, reducción o prevención posterior de la infección por M. tb.

Aún en otra realización de la presente invención, la vacuna frente a laTB de dos componentes pueden incluir cepas de Mycobacterium atenuadas quesobreexpresan al menos un antígeno de Mycobacterium, incluyendo pero sinlimitarse a Rv0125, Rv0203, Rv0287, Rv0288, Rv0603, Rv1196, Rv1223, Rv1271c,Rv1733c, Rv1738 Rv1804c, Rv1886, Rv2031c, Rv2032, Rv2253, Rv2290, Rv2389c, Rv2626c, Rv2627c, Rv2779c, Rv2873, Rv2875, Rv3017c, Rv3407, Rv3804c, Rv3810,

o Rv3841. Alternativamente, los antígenos de Mycobacterium sobreexpresadospueden estar en forma de una proteína de fusión compuesta por una o más dedichas proteínas de fusión de Mycobacterium, tales como Mtb72f (Brandt et al., Infect. Immun., 72:6622-6632; 2004; Skeiky et al., J. Immunol., 172:7618-7628; 2004), Hybrid-1 (Olsen et al., Infect, Immun., 72:6148-6150; 2004; Langermans et al., Vaccine, 23:2740-2750; 2005), Hyvac-4 (Dietrich et al., J. Immunol., 174:6332-6339; 2005), etc.

Esta invención tiene utilidad en el desarrollo de vacunas frente a especies de Mycobacterium patógenas y en el desarrollo de vectores de vacuna de administración de antígeno. Un vector de Mycobacterium se define en el presente documento como cualquier cepa de Mycobacterium modificada poringeniería genética para expresar al menos una secuencia de nucleótidospasajera (denominada en el presente documento “PNS”) compuesta por ADN o ARNy que codifica para cualquier combinación de antígenos, adyuvantes o factoresinmunorreguladores, tal como se expone a continuación. La PNS puede introducirse en el cromosoma o como parte de un vector de expresión usandocomposiciones y métodos bien conocidas en la técnica (Jacobs et al., Nature327:532-535; 1987; Barletta et al., Res Microbiol. 141:931-939; 1990;Kawahara et al., Clin Immunol. 105:326-331; 2002; Lim et al., SIDA Res HumRetroviruses. 13:1573-1581;1997; Chujoh et al., Vaccine, 20:797-804; 2001; Matsumoto et al., Vaccine, 14:54-60; 1996; Haeseleer et al., Mol Biochem Parasitol., 57:117-126; 1993).

En la presente invención, el vector de Mycobacterium puede portar un PNSque codifica para un inmunógeno, que puede ser o bien un inmunógeno extrañode patógenos virales, bacterianos y parasitarios, o un inmunógeno endógeno, tal como pero sin limitarse a un antígeno autoinmunitario o un antígenotumoral. Los inmunógenos pueden ser la proteína nativa de longitud completa, fusiones quiméricas entre el inmunógeno extraño y una proteína endógena o mimética, un fragmento o fragmentos de los mismos de un inmunógeno que seorigina a partir de patógenos virales, bacterianos y parasitarios.

Tal como se usa en el presente documento, “inmunógeno extraño” quieredecir una proteína o fragmento de la misma, que no se expresa normalmente enla célula o tejido del animal receptor, tal como, pero sin limitarse a,proteínas virales, proteínas bacterianas, proteínas parasitarias, citocinas, quimiocinas, agentes inmunorreguladores o agentes terapéuticos.

Un “inmunógeno endógeno” quiere decir una proteína o parte de la mismaque está presente de manera natural en la célula o tejido del animalreceptor, tal como, pero sin limitarse a, una proteína celular endógena, unagente inmunorregulador, o un agente terapéutico. Alternativa o adicionalmente, el inmunógeno puede estar codificado por un gen sintético ypuede construirse usando métodos de ADN recombinante convencionales conocidospor los expertos en la técnica.

El inmunógeno extraño puede ser cualquier molécula que se expresamediante cualquier patógeno viral, bacteriano o parasitario antes de odurante la introducción, colonización de, o replicación en su animal huésped;el vector de Mycobacterium puede expresar inmunógenos o partes de los mismos que se originan a partir de patógenos virales, bacterianos o parasitarios.Estos patógenos pueden ser infecciosos en huéspedes humanos, de animalesdomésticos o de animales salvajes.

Los patógenos virales, de los que se derivan los antígenos virales,incluyen pero sin limitarse a, ortomixovirus, tales como virus influenza (ID de taxonomía: 59771; retrovirus, tales como RSV, HTLV-1 (ID de taxonomía: 39015), y HTLVII (ID de taxonomía: 11909), herpesvirus tales como EBV (ID detaxonomía: 10295); CMV (ID de taxonomía: 10358) o virus del herpes simple(N.º de ATCC: VR-1487); lentivirus, tales como VIH-1 (ID de taxonomía: 12721)y VIH-2 (ID de taxonomía: 11709); rabdovirus, tales como el virus de larabia; picornavirus, tales como poliovirus (ID de taxonomía: 12080);poxvirus, tales como vaccinia (ID de taxonomía: 10245); rotavirus (ID detaxonomía: 10912); y parvovirus, tales como el virus adenoasociados 1 (ID detaxonomía: 85106).

Ejemplos de antígenos virales pueden encontrarse en el grupo que incluyepero sin limitarse a los antígenos del virus de la inmunodeficiencia humanaNef (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository N.º de Cat. 183; n.º de registro de GenBank AF238278), Gag, Env (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository N.º de Cat. 2433; n.º de registro de GenBank U39362), Tat (National Institute of Allergy andInfectious Disease HIV Repository N.º de Cat. 827; n.º de registro de GenBank

M13137), derivados mutantes de Tat, tales como Tat-31-45 (Agwale et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. En prensa 8 de julio de 2002), Rev (National Instituteof Allergy and Infectious Disease HIV Repository N.º de Cat. 2088; n.º deregistro de GenBank L14572), y Pol (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository N.º de Cat. 238; n.º de registro de GenBankAJ237568) y epítopos de células B y T de gp120 (Hanke y McMichael, AIDSImmunol Lett., 66:177; 1999); (Hanke, et al., Vaccine, 17:589; 1999); (Palker et al., J. Immunol., 142:3612-3619; 1989) derivados quiméricos de Env y gp120de VIH-1, tal como pero sin restringirse a fusión entre gp120 y CD4 (Fouts et al., J. Virol., 74:11427-11436; 2000); derivados truncados o modificados de env de VIH-1, tales como pero sin restringirse a gp140 (Stamatos et al., JViral, 72:9656-9667; 1998) o derivados de Env y/o gp140 de VIH-1 de losmismos (Binley, et al., J Virol, 76:2606-2616; 2002); (Sanders, et al., JVirol, 74:5091-5100; 2000); (Binley, et al., J Virol, 74:627-643; 2000), elantígeno de superficie de la hepatitis B (n.º de registro de GenBankAF043578); (Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:4726-4730; 1989);antígenos de rotavirus, tales como VP4 (n.º de registro de GenBank AJ293721;Mackow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:518-522; 1990) y VP7 (n.º deregistro de GenBank AY003871;) (Green et al., J. Virol., 62:1819-1823; 1988),antígenos del virus influenza tales como hemaglutinina o (n.º de registro de GenBank AJ404627); (Pertmer y Robinson, Virology, 257:406; 1999);nucleoproteína (n.º de registro de GenBank AJ289872); (Lin et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 97: 9654-9658; 2000) antígenos de virus del herpes simpletales como timidina cinasa (n.º de registro de GenBank AB047378); (Whitley et al., New Generation Vaccines, 825-854; 2004).

Los patógenos bacterianos, de los que se derivan los antígenosbacterianos, incluyen pero sin limitarse a, Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp., y Borellia burgdorferi.

Ejemplos de antígenos protectores de patógenos bacterianos incluyen losantígenos somáticos de E. coli enterotoxigénica, tal como el antígeno fimbrial CFA/I (Yamamoto et al., Infect. Immun., 50:925-928; 1985) y la subunidad B no tóxica de la toxina termolábil (Klipstein et al., Infect.Immun., 40:888-893; 1983); pertactina de Bordetella pertussis (Roberts et al., Vacc., 10:43-48; 1992), adenilato ciclasa-hemolisina de B. pertussis (Guiso et al., Micro. Path., 11:423-431; 1991), fragmento C de toxina tetánica de Clostridium tetani (Fairweather et al., Infect. Immun., 58:13231326; 1990), OspA de Borellia burgdorferi (Sikand, et al., Pediatrics, 108:123-128; 2001); (Wallich, et al., Infect Immun, 69:2130-2136; 2001),proteínas de la capa superficial paracristalina protectora de Rickettsia prowazekii y Rickettsia typhi (Carl, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87:82378241; 1990), la listeriolisina (también conocida como “Llo” y “Hly”) y/o lasuperóxido dismutasa (también conocida como “SOD” y “p60”) de Listeria monocytogenes (Hess, et al., Infect. Immun. 65:1286-92; 1997; (Hess, et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1458-1463; 1996); (Bouwer, et al., J. Exp. Med.175:1467-71; 1992), la ureasa de Helicobacter pylori (Gomez-Duarte, et al.,Vaccine 16, 460-71; 1998); Corthesy-Theulaz, et al., Infección & Immunity 66,581-6; 1998), y el dominio de unión al receptor de toxina letal y/o elantígeno protector de Bacillus anthrax (Price, et al., Infect. Immun. 69, 4509-4515; 2001).

Los patógenos parasitarios, de los que se derivan los antígenos parasitarios, incluyen pero sin limitarse a, Plasmodium spp., tal como Plasmodium falciparum (N.º de ATCC: 30145); Trypanosome spp., tal como Trypanosoma cruzi (N.º de ATCC: 50797); Giardia spp., tal como Giardia intestinalis (N.º de ATCC: 30888D); Boophilus spp., Babesia spp., tal como Babesia microti (N.º de ATCC: 30221); Entamoeba spp., tal como Entamoeba histolytica (N.º de ATCC: 30015); Eimeria spp., tal como Eimeria maxima (N.ºde ATCC 40357); Leishmania spp. (ID de taxonomía: 38568); Schistosome spp.,Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp. y Onchocerea spp.

Ejemplos de antígenos protectores de patógenos parasitarios incluyen los antígenos del circumsporozoíto de Plasmodium spp. (Sadoff et al., Science240:336-337; 1988), tal como el antígeno del circumsporozoíto de P. bergerii

o el antígeno del circumsporozoíto de P. falciparum; el antígeno de superficie de merozoíto de Plasmodium spp. (Spetzler et al., Int. J. Pept.Prot. Res., 43:351-358; 1994); la lectina específica de galactosa de Entamoeba histolytica (Mann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:32483252; 1991), gp63 de Leishmania spp. (Russell et al., J. Immunol., 140:12741278; 1988); (Xu y Liew, Immunol., 84: 173-176; 1995), gp46 de Leishmania major (Handman et al., Vaccine, 18: 3011-3017; 2000), paramiosina de Brugia malayi (Li et al., Mol. Biochem. Parasitol., 49:315-323; 1991), la triosafosfato isomerasa de Schistosoma mansoni (Shoemaker et al., Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 89:1842-1846; 1992); la proteína de tipo globina secretadade Trichostrongylus colubriformis (Frenkel et al., Mol. Biochem. Parasitol., 50:27-36; 1992); la glutatión-S-transferasa de Frasciola hepatica (Hillyer et al., Exp. Parasitol., 75:176-186; 1992), Schistosoma bovis y S. japonicum (Bashir et al., Trop. Geog. Med., 46:255-258; 1994); y KLH de Schistosoma bovis y S. japonicum (Bashir et al., citado anteriormente, 1994).

Tal como se mencionó anteriormente, el vector de Mycobacterium puedeportar una PNS que codifica para un inmunógeno endógeno, que puede ser cualquier proteína celular, agente inmunorregulador, o agente terapéutico, opartes de los mismos, que pueden expresarse en la célula receptora,incluyendo pero sin limitarse a inmunógenos autoimmunitarios, de trasplante y de tumor, o fragmentos y derivados de inmunógenos autoimmunitarios, de trasplante y de tumor de los mismos. Por tanto, en la presente invención, elvector de Mycobacterium puede portar una PNS que codifica para los inmunógenos autoimmunitarios, de trasplante y de tumor, o partes o derivadosde los mismos. Alternativamente, el vector de Mycobacterium puede portar PNSsintéticas (tal como se describió anteriormente), que codifican para losinmunógenos autoimmunitarios, de trasplante y de tumor o partes de losmismos.

Ejemplos de antígenos específicos de tumor incluyen el antígenoespecífico de próstata (Gattuso et al., Human Pathol., 26: 123-126; 1995), TAG-72 y CEA (Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers, 9:53-60; 1994), MAGE-1 y tirosinasa (Coulie et al., J. Immunothera., 14:104-109; 1993).Recientemente, se han demostrado en ratones que la inmunización con célulasno malignas que expresan un antígeno tumoral proporciona un efecto de vacuna, y también ayuda el animal generar una respuesta inmunitaria para eliminar lascélulas tumorales malignas que presentan el mismo antígeno (Koeppen et al.,Anal. N.Y. Acad. Sci., 690:244-255; 1993).

Ejemplos de antígenos de trasplante incluyen la molécula de CD3 en células T (Alegre et al., Digest. Dis. Sci., 40:58-64; 1995). Se hademostrado que el tratamiento con un anticuerpo frente al receptor de CD3elimina rápidamente las células T circulantes e revierte el rechazo detrasplantes mediado por célula (Alegre et al., citado anteriormente, 1995).

Ejemplos de antígenos autoimmunitarios incluyen cadena de IAS (Topham et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 8005-8009; 1994). Se ha demostradoque la vacunación de ratones con un péptido de 18 aminoácidos de la cadena  de IAS proporciona protección y tratamiento a ratones con encefalomielitisautoimmunaria experimental (Topham et al., citado anteriormente, 1994).

Vectores de Mycobacterium que expresan un adyuvante

Es viable construir vectores de Mycobacterium que portan PNS quecodifican para un inmunógeno y un adyuvante, y son útiles para provocarrespuestas del huésped aumentadas frente al vector y el inmunógeno codificadopor PNS. Alternativamente, es viable construir vectores de Mycobacterium queportan PNS que codifican para un adyuvante, que se administran en mezclas conotros vectores de Mycobacterium que portan PNS que codifican para al menos uninmunógeno para aumentar las respuestas del huésped frente a dicho inmunógenocodificado por el vector de Mycobacterium asociado.

El adyuvante particular codificado por PNS insertado en dicho vector deMycobacterium no es crítico en la presente invención y puede ser la subunidadA de la toxina colérica (es decir CtxA; n.º de registro de GenBank X04171,AF175708, D30053, D30052,), o partes y/o derivados mutantes de los mismos(por ejemplo el dominio A1 de la subunidad A de Ctx (es decir CtxAl; n.º deregistro de GenBank K02679)), de cualquier Vibrio cholerae clásico (por ejemplo cepa 395 de V. cholerae, N.º de ATCC 39541) o la cepa El Tor de V. cholerae (por ejemplo cepa 2125 de V. cholerae, N.º de ATCC 39050).Alternativamente, puede usarse cualquier toxina bacteriana que sea miembro dela familia de exotoxinas bacterianas que ribosilan adenosina difosfato(Krueger y Barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8:34; 1995), en lugar de CtxA, porejemplo la subunidad A de la toxina termolábil (denominada en el presentedocumento EltA) de Escherichia coli enterotoxigénica (n.º de registro deGenBank M35581), subunidad S1 de la toxina pertúsica (por ejemplo ptxS1, n.ºde registro de GenBank AJ007364, AJ007363, AJ006159, AJ006157, etc.); comoalternativa adicional, el adyuvante puede ser uno de adenilato ciclasahemolisina de Bordetella pertussis (N.º de ATCC 8467), Bordetella bronchiseptica (N.º de ATCC 7773) o Bordetella parapertussis (N.º de ATCC15237), por ejemplo los genes cyaA de B. pertussis (n.º de registro de GenBank X14199), B. parapertussis (n.º de registro de GenBank AJ249835) o B. bronchiseptica (n.º de registro de GenBank Z37112).

Vector de Mycobacterium que expresa un agente inmunorregulador

Aún otro enfoque supone el uso del vector de Mycobacterium que porta almenos una PNS que codifica para un inmunógeno y una citocina, que se usanpara provocar respuestas de huésped aumentadas frente al vector de Mycobacterium con inmunógeno codificado por PNS. Alternativamente, es posibleconstruir un vector de Mycobacterium que porta una PNS que codifica paradicha citocina sola, que se usan en mezclas con al menos otro vector de Mycobacterium que porta una PNS que codifica para un inmunógeno para aumentarlas respuestas del huésped frente a los inmunógenos codificados por PNS expresados por el vector de Mycobacterium asociado.

La citocina particular codificada por el vector de Mycobacterium no es crítica en la presente invención e incluye, pero sin limitarse a,interleucina-4 (denominada en el presente documento “IL-4”; n.º de registro de GenBank AF352783 (IL-4 murina) o NM 000589 (IL-4 humana)), IL-5 (n.º deregistro de GenBank M010558 (IL-5 murina) o NM000879 (IL-5 humana)), IL-6 (n.º de registro de GenBank M20572 (IL-6 murina) o M29150 (IL-6 humana)), IL10 (n.º de registro de GenBank NM010548 (IL-10 murina) o AF418271 (IL-10humana)), Il-12p40 (n.º de registro de GenBank NM008352 (IL-12 p40 murina) o AY008847 (IL-12 p40 humana)), IL-12p70 (n.º de registro de GenBank NM008351/NM008352 (IL-12 p35/40 murina) o AF093065/AY008847 (IL-12 p35/40humana)), TGF (n.º de registro de GenBank NM011577 (TGF1 murino) o M60316 (TGF1 humano)), y TNF n.º de registro de GenBank X02611 (TNFmurino) oM26331 (TNFhumano)).

El método específico usado para introducir un gen que codifica para un gen Pfo en el genoma de BCG no es una característica crítica de la invencióny puede seleccionarse de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (Parish et al., Microbiology, 145:3497-3503; 1999). Un método preferido supone el direccionamiento del gen Pfo al locus de ureC, dando comoresultado de ese modo la inactivación de este último gen y creando un marcador para la selección de cepas modificadas (Qadri et al., J ClinicMicro. 20(6), 1198-1199; 1984). Para realizar esto, puede modificarse unplásmido de intercambio alélico sintético, tal como el plásmido descrito enla sección de ejemplos a continuación, para albergar secuencias de 1 kb queflanquean los extremos 5-prima y 3-prima del gen ureC (base de datos degenoma n.º Mb1881). Entonces se inserta el gen PfoA (Base de datos del genoman.º CPE0163) entre las secuencias flanqueantes bajo el control del promotor Ag85B. Para secretar la proteína PfoA, se usa una secuencia de péptido líderAg85B en lugar de la secuencia señal PfoA nativa para garantizar la secrecióneficaz de las cepas de BCG recombinante.

El método mediante el que introducen plásmidos de intercambio alélico en las cepas de BCG diana no es una característica crucial de la presenteinvención y puede llevarse a cabo mediante protocolos de electroporaciónconvencionales para Mycobacterium. De manera similar, el método especificopara efectuar el intercambio alélico e introducir el alelo Pfo en el locus de ureC no es una característica crucial de la invención y puede seleccionarsede métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Un vector suicidatal como el representado en la figura 1 proporciona un método preferido, ya que este plásmido contiene dos marcadores de selección de antibiótico,minimizando así la selección de mutantes resistentes a antibiótico espontáneos. Durante el intercambio alélico, el segmento del gen de PfoA sustituye al gen ureC como resultado de la recombinación homologa de lassecuencias flanqueantes izquierda y derecha, dando como resultado de ese modola integración cromosómica estable y la expresión de PfoA. Una ventaja deeste enfoque es que no se requieren antibióticos para mantener el productofinal, y no está presente el fenotipo o genotipo resistente a antibióticos enla cepa final. Esta es la realización preferida para los productos para usohumano (están “libres de antibióticos”). Un fenotipo negativo para UreCmarcará cepas que han experimentado el intercambio alélico y ha sustituido ureC por Pfo, entendiéndose que el fenotipo positivo para UreC también puede emplearse en determinadas aplicaciones.

En la presente invención, la ubicación de pfoA en el BCG no se limita a ureC. Otras ubicaciones incluyen pero sin limitarse a pfoA integrado en unplásmido, y el sitio de attB en el cromosoma. Los expertos en la técnicaconocerán otras ubicaciones del cromosoma que son posibles sitios para laexpresión e integración de pfoA.

La presente invención también proporciona preparaciones de vacuna para su uso para provocar una respuesta inmunitaria frente a tuberculosis. Laspreparaciones de vacuna incluyen al menos una cepa de BCGr tal como se describe en el presente documento, y un vehículo farmacológicamente adecuado.La preparación de tales composiciones para su uso como vacunas es bien conocida por los expertos en la técnica. Normalmente, tales composiciones sepreparan o bien como suspensiones o bien como disoluciones líquidas, sin embargo, también se contemplan formas sólidas tales como comprimidos,píldoras, polvos y similares. También pueden prepararse formas sólidasadecuadas para disolución en, o suspensión en, líquidos antes de la administración. La preparación también puede emulsionarse. Los principiosactivos pueden mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptablesy compatibles con los principios activos. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, rafinosa, glicerol, etanol ysimilares, o combinaciones de los mismos. Además, la composición puedecontener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agenteshumectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH, y similares. Además,la composición puede contener otros adyuvantes.

Si se desea administrar una forma oral de la composición, puedenañadirse varios espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes,adyuvante de dispersión o aglutinantes y similares. La composición de lapresente invención puede contener cualquier componente adicional de este tipopara proporcionar la composición en una forma adecuada para la administración. La cantidad final de bacterias de BCGr en las formulaciones puede variar. Sin embargo, en general, la cantidad en las formulaciones irádesde aproximadamente el 1-99 por ciento. Las preparaciones de vacuna de lapresente invención pueden comprender además un adyuvante, incluyendo losejemplos adecuados de los mismos, pero sin limitarse a, Seppic, Quil A,Alhydrogel, etc. Además, las preparaciones de vacuna de la presente invenciónpueden contener un único tipo de BCGr. Alternativamente, puede utilizarse másde un tipo de BCGr en una vacuna.

La presente invención también proporciona métodos que provocan una respuesta inmunitaria frente a tuberculosis y métodos de vacunación de unmamífero frente a tuberculosis. Por provocar una respuesta inmunitaria, sequiere decir que la administración de la preparación de vacuna de la presenteinvención provoca la síntesis de anticuerpos específicos (en un título en elintervalo de 1 a 1 x 106, preferiblemente 1 x 103, más preferible en el intervalo de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 106, y lo más preferiblemente superior a 1 x 106) y/o proliferación celular, tal como semide, por ejemplo mediante la incorporación de 3H timidina. Los métodos implican administrar una composición que comprende una cepa de BCGr de lapresente invención en un vehículo farmacológicamente aceptable a un mamífero.Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden administrarsemediante cualquiera de los muchos medios adecuados que son bien conocidos porlos expertos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a mediante inyección, por vía oral, por vía intranasal, mediante ingestión de unproducto alimenticio que contiene el BCGr, etc. En realizaciones preferidas, el modo de administración es subcutáneo o intramuscular.

Los siguientes ejemplos son para considerarse a modo de ejemplo dediversos aspectos de la presente invención y no pretenden ser limitativos conrespecto a la práctica de la invención. Los expertos habituales en la técnica apreciarán que pueden variarse los procedimientos, condiciones y materialesalternativos y seguir estando dentro de la capacidad del experto habitual sin apartarse del alcance general de la invención tal como se enseña en la memoria descriptiva.

EJEMPLOS

Se ha demostrado el papel fundamental de las células T CD8+ con MHC declase I restringido en la protección inmunitaria frente a TB (Flynn et al.,citado anteriormente, 1992). En un esfuerzo para mejorar la respuesta de las células T CD8, se ha modificado mediante ingeniería genética una cepa de BCGrecombinante para que exprese listeriolisina de Listeria monocytogenes. Sin embargo, este BCG recombinante (BCGr) no presenta una capacidad aumentada deescape endosómico, y por tanto no produce una inducción aumentada de, porejemplo, respuestas de células T citotóxicas CD8+ con MHC de clase I restringido. Cuando se examina, la cepa presenta menos de un 1% de escape del endosoma. Esto no es sorprendente porque la actividad de la listeriolisina esaltamente sensible al pH, por lo que la enzima probablemente no es activa alpH dentro endosoma. Pese a este inconveniente, la protección y seguridad deesta cepa recombinante mejoraron ambas drásticamente. Basándose en estaobservación, se ha construido una nueva cepa de BCGr introduciendo PfoAG137Q,derivado de Clostridium perfringens en el cromosoma de BCG. PfoAG137Q tiene un cambio de aminoácido en la posición 137 desde G hasta Q. Este cambio de únicoaminoácido da como resultado la pérdida de toxicidad de PfoA de tipo naturalen células de mamífero, aunque la enzima conserva su función endosomolítica.Se ha demostrado que la cepa resultante es segura e inmunogénica en un modelo de ratón.

Materiales y métodos: General

Para cada experimento descrito en las secciones siguientes, se usaron endonucleasas de restricción (en el presente documento “ER”); New EnglandBiolabs Beverly, MA), ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) yTaq polimerasa (Life Technologies, Gaithersburg, MD) según los protocolos delos fabricantes; se preparó ADN de plásmido usando kits de purificación deADN de plásmidos a pequeña escala (kit MiniprepR de Qiagen, Santa Clarita, CA)

o a gran escala (kit MaxiprepR de Qiagen, Santa Clarita, CA) según losprotocolos del fabricante (Qiagen, Santa Clarita, CA); se adquirieron aguamili-Q de calidad para biología molecular libre de nucleasa, Tris-HCl (pH 7,5), EDTA pH 8,0, MgCl2 1 M, etanol al 100% (v/v), agarosa ultrapura, y tampón de electroforesis en gel de agarosa de Life Technologies,Gaithersburg, MD. Se realizaron digestiones con ER, PCR, reacciones deligación de ADN y electroforesis en gel de agarosa según procedimientos bien conocidos (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 2, 3; 1989); (Straus, et al., Proc Natl Acad Sci USA. Mar; 87(5): 1889-93; 1990).Se llevó a cabo la secuenciación de nucleótidos para verificar la secuenciade ADN de cada plásmido recombinante descrito en las secciones siguientesmediante técnicas de secuenciación de ADN automatizadas convencionales usando un secuenciador automático de Applied Biosystems, modelo 373A.

Se adquirieron cebadores de PCR de vendedores comerciales tales como Sigma (St. Louis, MO) o se sintetizaron usando un sistentizador de ADN deApplied Biosystems (modelo 373A). Se usaron cebadores de PCR a una

concentración de 150-250 M y se determinaron las temperaturas de hibridaciónpara las reacciones de PCR usando el software Clone manager versión 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC). Se realizaron las PCR en un dispositivo Strategene Robocycler, modelo 400880 (Strategene, La Jolla,CA). Los cebadores de PCR para las amplificaciones se diseñaron usando elsoftware Clone Manager® versión 4.1 (Scientific and Educational Software Inc.,Durham NC). Este software permite el diseño de los cebadores de PCR e identifica los sitios de ER que son compatibles con los fragmentos de ADN específicos que se están manipulando. Se realizaron PCR en un dispositivotermociclador, tal como el dispositivo Strategene Robocycler, modelo 400880 (Strategene), y se establecieron los tiempos de hibridación, elongación ydesnaturalización del cebador en los PCR según procedimientos convencionales(Straus et al, citado anteriormente 1990). Las digestiones por ER y los PCRse analizaron posteriormente mediante electroforesis en gel de agarosa usandoprocedimientos convencionales (Straus et al, citado anteriormente 1990; y Sambrook et al., citado anteriormente 1989). Un clon positivo se define como uno que presenta el patrón de ER y/o el patrón de PCR apropiados. Losplásmidos identificados a través de este procedimiento se evaluaron adicionalmente usando procedimientos de secuenciación de ADN convencionales, tal como se describió anteriormente.

Se adquirieron cepas de Escherichia coli, tales como DH5 y Sable2R, de Life Technologies (Bethesda, MD) y sirvieron como huésped inicial de losplásmidos recombinantes. Los plásmidos recombinantes se introdujeron en lascepas de E. coli mediante electroporación usando un dispositivo de electropulsación de alto voltaje, tal como el Gen Pulser (BioRad

Laboratories, Hercules, CA), fijado a 100-200 , 15-25 F y 1,0-2,5 kV, tal como se describe (Straus et al, citado anteriormente 1990). Se identificaronlas condiciones de electroporación óptimas determinando los parámetros quedaban como resultado tasas de transformación máximas por mcg de ADN porbacteria.

Normalmente las cepas bacterianas se hacen crecer en agar de tripticasa y soja (Difco, Detroit, MI) o en caldo de tripticasa y soja (Difco, Detroit,MI), que se realizó según las indicaciones del fabricante. A menos que seestablezca lo contrario, las bacterias se hicieron crecer a 37ºC en CO2 al 5% (v/v) con agitación suave. Cuando fue apropiado, los medios se complementaroncon antibióticos (Sigma, St. Louis, MO). Las cepas bacterianas se almacenaronnormalmente a -80ºC suspendidas en (Difco) que contenía glicerol al 30% (v/v) (Sigma, St. Louis, MO) a aproximadamente 109 unidades formadoras de colonias (denominadas en el presente documento “ufc”) por ml.

Intercambio alélico en BCG. La técnica anterior enseña métodos paraintroducir alelos alterados en cepas de Mycobacterium y los expertos en latécnica podrán interpretar y ejecutar los métodos (Parish et al.,Microbiology, 146:1969-1975; 2000). Un método novedoso para generar unplásmido de intercambio alélico supone el uso de ADN sintético. La ventaja deeste enfoque es que el producto de plásmido tendrá una historia altamentedefinida y cumplirá con las normativas federales, mientras que los métodos usados anteriormente, aunque eficaces, tenían registros de cultivos delaboratorio escasamente documentados y por tanto, es poco probable quecumplieran con las normativas federales. El cumplimiento de estas normativas es esencial si va a aprobarse un producto para su uso en seres humanos por las autoridades normativas de Estados Unidos y Europa.

Un vector suicida para intercambio alélico en Mycobacterium es un plásmido que tiene capacidad de replicarse en cepas de E. coli pero que no puede replicarse en Mycobacterium spp., tal como M. tb y BCG. El vectorsuicida específico para su uso en procedimientos de intercambio alélico en lapresente invención no es importante y puede seleccionarse de los disponiblesde fuentes académicas (Parish et al., citado anteriormente, 2000) ycomerciales. En la figura 1 se muestra un diseño preferido de un plásmido suicida para el intercambio alélico. El plásmido está compuesto por lossiguientes segmentos de ADN: una secuencia de oriE para que el plásmido sereplique en E. coli (N.º de registro de Genebank L09137), una secuencia resistente a kanamicina para la selección tanto en E. coli como en Mycobacterium (N.º de registro de Genebank AAM97345), y un marcador deselección de antibióticos adicional, por ejemplo el gen de resistencia azeocina (N.º de registro de Genebank AAU06610), que está bajo el control deun promotor de Mycobacterium (por ejemplo el promotor hsp60). El segundomarcador de selección de antibióticos no es esencial pero puede incluirse para permitir una selección doble para evitar el crecimiento en exceso de aislados espontáneos resistentes a kanamicina durante el proceso de intercambio alélico.

La construcción de tales vectores suicidas puede llevarse a cabo usandotécnicas de ADN recombinante convencionales. Sin embargo, los criteriosnormativos actuales (por ejemplo, las normas federales) han aumentado laamenaza de introducir partículas de priones adquiridas de productos expuestosa productos bovinos que contienen material infectado por BSE. Por tanto, paraevitar introducir materiales (por ejemplo, secuencias de ADN) en la cepa diana de origen desconocido, es preferible que todos los ADN en el vector suicida se obtengan de manera sintética de fuentes comerciales (por ejemplo Picoscript, Inc.). Por consiguiente, un método preferido para construirvectores suicidas es preparar una planificación de las secuencias de ADNusando software de ADN (por ejemplo, Clone Manager), y luego sintetizar elADN según se necesite por cualquier proveedor comercial que ofrezca un servicio de este tipo (por ejemplo, Picoscript Inc.). Este procedimiento seusó para diseñar y obtener el vector suicida utilizado en la sección deejemplos a continuación.

El vector suicida de configuración descrito anteriormente (figura 1)tiene ventajas, puesto que este plásmido contiene dos marcadores de selecciónde antibióticos, minimizando así la selección de mutantes espontáneos quepresentan resistencia a un antibiótico, lo que se produce en aproximadamente1/108 por generación. La resistencia espontánea a dos antibióticos es extremadamente rara y sólo se produce en aproximadamente 1/1016 porgeneración. Por tanto, hay menos de una probabilidad de 1/106 de que surjancepas resistentes dobles en los cultivos usados para ejecutar el proceso deintercambio alélico.

Para la selección negativa durante el proceso de intercambio alélico, puede incluirse un gen sacB (N.º de registro de Genebank NT01BS4354), queconfiere un fenotipo sensible a sacarosa, para enriquecer los cultivos con cepas que han experimentado la etapa de recombinación de ADN final y hancompletado el intercambio alélico.

Cultivo de Mycobacterium. Se hacen crecer en cultivo cepas de BCG seleccionadas en medios líquidos, tales como medio sintético Saulton oMiddlebrook 7H9, preferiblemente a 37ºC. Las cepas pueden mantenerse comocultivos estáticos o agitados. Además, la tasa de crecimiento de BCG puedemejorarse mediante la adición de ácido oleico (0,06% v/v; Research Diagnostics Cat. N.º 01257) y detergentes tales como Tyloxapol (0,05% v/v;Research Diagnostics N.º de Cat. 70400). La pureza de los cultivos de BCG puede evaluarse extendiendo uniformemente alícuotas de 100 mcl del cultivo deBCG diluido en serie (por ejemplo etapas de 10 veces a partir de Neat - 10-8)en solución salina tamponada con fosfato (denominada en el presente documento PBS) en placas de 3,5 pulgadas que contenían 25-30 ml de medios sólidos, tales como Middlebrook 7H10. Además, la pureza del cultivo puede evaluarse adicionalmente usando medio disponible comercialmente tal como medio detioglicolato (Science Lab, número de catálogo 1891) y medio de soja-caseína(BD, número de catálogo 211768).

Se almacenan lotes de BCG sembrados a -80ºC a una densidad de 0,1-2 x 107 ufc/ml. Normalmente, los cultivos líquidos se recogen a una densidadóptica (600 nm) de 0,2 - 4,0 con respecto a un control estéril; los cultivosse colocan en tubos de centrífuga de un tamaño apropiado y los microorganismos se someten a centrifugación a 8.000 x g durante 5-10 min. Elsobrenadante se desecha y los microorganismos se resuspenden en disolución dealmacenaje que está compuesta por Middlebrook 7H9 que contiene glicerol al10-30% (v/v) a una densidad de 0,1-2 x 107 ufc/ml. Estas suspensiones sedispensan en viales de congelación estériles de 1,5 ml de silicato de boro en alícuotas de 1 ml y luego se colocan a -80ºC.

EJEMPLO 1. Construcción de cepas de BCGr-PfoA que pueden escapar del endosoma

Se llevó a cabo la construcción de cepas de BCGr-PfoA que pueden escapardel endosoma mediante intercambio alélico de las regiones flanqueantes delgen ureC. Como resultado, el segmento del gen de PfoA sustituyó al gen ureC,lo que permite la expresión cromosómica estable de PfoA. A continuación sedescriben los detalles específicos.

Construcción del plásmido de intercambio alélico:

El plásmido de intercambio alélico está compuesto por los siguientessegmentos de ADN: una secuencia de oriE para que el plásmido se replique en

E. coli, una secuencia de gen resistente a kanamicina para la selección tantoen E. coli como en Mycobacterium, y un marcador de selección de antibióticos adicional (gen resistente a zeocina), que se expresa por el promotor Hsp60.El segundo marcador se usó para marcar una selección doble, evitando así laresistencia espontánea a kanamicina durante el proceso. Para la selecciónnegativa durante el proceso de intercambio alélico, se usó un gen sensible asacarosa. Finalmente, se incluyeron las secuencias flanqueantes de 1 kbizquierda y derecha del gen ureC para la cepa Danesa 1331 diana de BCG con elgen de PfoA entre ellas. El gen de PfoA se expresa bajo el control delpromotor Ag85B. Se usó la secuencia de péptido líder Ag85B en lugar de lasecuencia de señal de secreción original de PfoA para la secreción de PfoA. Finalmente, Picoscript Inc (Houston, TX) sintetizó y unió todos estoscomponentes. El plásmido resultante es un vector suicida micobacteriano y seobtuvo el mapa para el plásmido tal como se muestra en la figura 1. Elconstructo de plásmido resultante se confirmó tal como se muestra en lafigura 5.

Introducción del plásmido de intercambio alélico en la cepa Danesa 1331 deBCG de Mycobacterium bovis

El proceso de intercambio de alelo se ilustra esquemáticamente en lafigura 4, que explica resumidamente las principales etapas del procedimiento.Estas etapas se describen en detalle a continuación.

Se hizo crecer en cultivo la cepa Danesa 1331 de BCG en medio 7H9 conaporte complementario del 10% de OADC (ácido oleico-albúmina-dextrosacatalasa) (BD Gibco) y el 0,05% (v/v) de Tyloxapol (Research and DiagnosticLab). Cuando el cultivo alcanzó la fase logarítmica, se recogieron lasbacterias y se prepararon tal como se describió anteriormente (Sun et al.,2004) para electroporación. Se introdujeron cinco microgramos del plásmido deintercambio alélico en células electrocompetentes preparadas recientemente usando metodologías convencionales.

El plásmido de intercambio alélico construido anteriormente se introdujo en la cepa Danesa 1331 de BCG de M. bovis mediante el protocolo deelectroporación de micobacterias convencional para Mycobacterium. Tras la electroporación, se cultivaron las células durante la noche en medio 7H9 conaporte complementario del 10% (v/v) de OADC y el 0,05% (v/v) de Tyloxapol.Entonces se sembraron en placas las células en placas 7H10 que contenían 50 ug/ml tanto de kanamicina como de zeocina. Las colonias resultantes se recogieron y se cultivaron en medio 7H9 que contenía un 10% (v/v) desacarosa. El cultivo obtenido se sembró en placa en placas 7H10 paraclonación para obtener colonias individuales, que se identificaron paradeterminar la presencia del gen de PfoA en lugar de ureC. En la figura 4 sefacilita un diagrama de flujo que explica resumidamente las principalesetapas de este procedimiento y la tabla 1 describe el vector suicida, pAF102, que también se representa en la figura 1.

Tabla 1. Vector suicida usado en la invención

Nombre

Estructura principal Alelo específico para el intercambioalélico

pAF102

pAF 100 Gen de PfoA flanqueado por flancos de1 kb del gen ureC

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El ejemplo 1 muestra que la cepa de BCG de Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar una proteína endosomalítica seleccionada que es activa a pH neutro, lo que permite el escape delMycobacterium de los endosomas al interior del citoplasma de la célula.

EJEMPLO 2. Validación de la cepa de BCGr-PfoA

Materiales y métodos para el ejemplo 2.

Cultivo de Mycobacterium: Para los experimentos siguientes, se cultivaroncepas de BCG a 37ºC en medios Middlebrook 7H9 (BD biosciences) con aporte complementario del 10% de OADC. Se usó Tyloxapol (0,05% v/v, Research Diagnostics N.º de Cat. 70400) para dispersar las bacterias. En experimentosen los que se comparó el crecimiento entre diferentes cepas, se midió ladensidad óptica (600 nm) a diferentes tiempos tras la inoculación. Para someter a prueba la sensibilidad a kanamicina, se preparó el cultivo y semidió el crecimiento como anteriormente excepto que se añadió la kanamicina hasta una concentración final de 50 ug/ml. Cuando se usó medio sólido paracultivar las bacterias, se usó agar Middlebrook 7H10 (BD biosciences). Cuandofue apropiado, se añadió la kanamicina hasta una concentración final de 50ug/ml, y se añadió sacarosa hasta una concentración final del 3%.

Prueba de la actividad ureasa: Las colonias resultantes de las placas de sacarosa descritas en el ejemplo 1 se examinaron en primer lugar paradeterminar una falta de actividad ureasa usando el kit de prueba de ureasa(BD Difico) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se resuspendió un asa llena de bacterias en el tampón de prueba suministrado porel fabricante en un tubo transparente. Se usó la cepa Danesa 1331 de BCG como control positivo de ureasa. Se usó tampón solo como control negativo. Seincubó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos y sejuzgó el resultado basándose en las instrucciones del fabricante.

Análisis del genotipo de cepas de BCGr que portan ureC:pfoA. Se realizaron PCR con cebador directo [acggctaccgtctggacat] (SEQ ID NO: 4) y cebador inverso [cgatggcttcttcgatgc] (SEQ ID NO: 5) para amplificar lasecuencia de ADN del alelo de inserción específico de Pfo y las secuenciasgenómicas de BCG del ADN que flanquea el gen ureC. Los parámetros de la PCRfueron los siguientes: Etapa 1: 95ºC 4 minutos un ciclo; Etapa 2: 95ºC unminuto, 60ºC 1 minuto, y luego 72ºC un minuto durante un total de 30 ciclos;Etapa 3: 72ºC 10 minutos con un ciclo. Etapa 4: almacenamiento a 4ºC. Losproductos resultantes de las PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se secuenció mediante técnicas de secuenciación automáticas dedidesoxinucleótidos, y se confirmó la presencia de un gen de longitudcompleta de PfoA en lugar del gen ureC (es decir ureC::PfoA).

Crecimiento de AFV102 en macrófagos: Se sometió a prueba el crecimiento de la cepa AFV102 de BCG in situ en células de tipo macrófago J774A.1determinando las unidades formadoras de colonias (UFC) de micobacterias enlos macrófagos infectados. Se determinó la eficacia de la fagocitosis demicobacterias sometiendo a prueba las UFC intracelulares tres horas tras la infección de las células J774A.1. Posteriormente se realizó un estudio de la supervivencia intracelular a largo plazo mediante la lisis de las célulaspara liberar las bacterias intracelulares para contar las UFC tras lavar conPBS cinco veces, tal como se describió anteriormente (Sun et al., 2004).

Análisis de la actividad hemolítica de la Pfo expresada por AFV102: Para evaluar la secreción de PfoA por AFV102, se hizo crecer la cepa hasta fase semilogarítmica, tal como se describió anteriormente. Luego se recogieron los sobrenadantes de cultivo y las bacterias. Se resuspendió el sedimento

bacteriano de AFV102 en 100 l de PBS (pH 7,0) que contenía un 0,1% de BSA enuna placa de 96 pocillos con fondo en V. Para someter a prueba si la proteínaPfoA se secretaba en el sobrenadante del cultivo, se centrifugó el cultivolíquido y se usó el sobrenadante para la prueba. Para someter a prueba laPfoA expresada para determinar su actividad de hemólisis independiente delpH, se prepararon las muestras como anteriormente, excepto que se usó tampón PBS con diferentes valores de pH como el tampón de reacción. Se añadieron a cada pocillo 100 l de eritrocitos de oveja lavados al 1%. Se mezcló suavemente la reacción y se incubó a 37ºC durante 1 h con agitación. Se usóla bacteria de la cepa Danesa 1331 de BCG como control negativo de hemólisis.

Se usó -hemolisina (Sigma) con unidades conocidas de actividad de hemolisinaen dilución en serie como control positivo de hemólisis. Al final de laincubación, se sedimentó la reacción mediante centrifugación a 500 g durante15 minutos, y luego se transfirió el sobrenadante de la placa de fondo en V aubicaciones equivalentes en una placa de fondo plano de 96 pocillos y semidió la densidad óptica (absorbancia a 450 nm menos la absorbancia a 540nm). Se cuantificó la actividad hemolítica de la molécula de PfoA midiendo ladensidad óptica del cambio de color tras la hemolisis. La intensidad delcolor medida es proporcional a la cantidad de hemolisis, que entonces esproporcional a la cantidad de hemolisina. Entonces se leen los valores de lamuestra sobre una curva patrón a través del uso de patrones conocidos. Lasunidades hemolíticas se definieron como la dilución de la muestra a la que se lisó el 50% de los glóbulos rojos de oveja.

Citotoxicidad de AFV102 para macrófagos: Se determinó la citotoxicidad de la cepa recombinante en macrófagos J774A.1 (N.º de ATCC A TIB-67) midiendola lactato deshidrogenada (LDH) liberada de las células infectadas usando unkit de “ensayo de proliferación celular en disolución acuosa Cell Titer 96”(Promega, N.º de Cat. G3580) según la instrucción del fabricante. En resumen, se infectaron las células con bacterias AFV102 a la multiplicidad de infección de 10. En diferentes momentos tras la infección, se midió elsobrenadante para determinar la cantidad de LDH liberada de las células, que luego se comparó con la de la cepa Danesa 1331 de BCG. Se usaron célulasnormales no infectadas como control negativo. Se calculó el porcentaje decélulas viables basándose en la cantidad de LDH liberada de las células infectadas con respecto a la de las células de control negativo (100% de viabilidad celular).

Resultados para el ejemplo 2.

Construcción de AFV102: Durante la construcción de AFV102, las bacteriasmerodiploides seleccionadas, que albergan el plásmido deficiente entero en sucromosoma a través del intercambio alélico de su segmento de ADN homólogo conel del plásmido deficiente, se cultivaron en placas de Middlebrook 7H10 quecontenían sacarosa para el intercambio alélico final para sustituir el genureC por el casete de expresión de PfoA. De las colonias producidas en las placas de sacarosa, se encontró que una colonia Pfo-105-5 (con el nuevonombre de AFV102) era negativa para ureasa, lo que sugiere que el gen ureC se había sustituido por el casete de expresión de PfoA. Esta colonia bacterianase sometió adicionalmente a análisis del genotipo mediante PCR para determinar el genotipo de ureC::pfoA. Se analizó la reacción de PCR resultante mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1,2% y losresultados se presentan en la figura 6. Como puede observarse, la PCR que usa esta bacteria como molde produjo un producto de PCR del tamaño esperado, quees mayor que el de la cepa Danesa 1331 de BCG parental. El tamaño esperado dela banda de ADN para el genotipo de ureC::pfoA es 2180 pb, mientras que para la cepa Danesa 1331 de BCG parental el tamaño es de 1967 pb. Se purificóen gel adicionalmente el producto de PCR para la colonia 105-5 y se secuenció en la instalación de secuenciación comercial de la Universidad Johns Hopkins (Baltimás, MD). El resultado de la secuenciación mostró que esta coloniatenía el genotipo esperado de ureC::pfoA. Además, la PCR dirigida a amplificar el gen de kanamicina y el gen sacB de la cepa AFV102 no produjo ningún producto de PCR (datos no mostrados). Estos hallazgos sugieren que AFV102 ha experimentando la etapa de intercambio alélico final y tiene el

genotipo deseado de ureC::pfoA.

Prueba de sensibilidad a kanamicina y caracterización del crecimientopara AFV102: Basándose en la prueba de la actividad ureasa y en losresultados del genotipado, el clon 105-5 (con el nuevo nombre de AFV102)

mostró el fenotipo esperado y el genotipo deseado ureC::pfoA. Entonces se sometió a prueba adicionalmente AFV102 para determinar su capacidad paracrecer en medio de crecimiento 7H9 en comparación con la de la cepa Danesa1331 de BCG parental. El resultado se muestra en la figura 7. Como puedeobservarse, el constructo de AFV102 tiene una curva de proliferación muysimilar en medio de crecimiento 7H9 a la de la cepa parental. Además, enpresencia de kanamicina, el crecimiento de AFV102 disminuyó hasta un grado similar al de la cepa Danesa 1331 de BCG parental, lo que sugiere que, tal como se esperaba, tiene una sensibilidad a kanamicina similar.

Citotoxicidad de AFV102: Se ha notificado que el cambio de un únicoaminoácido en la proteína PfoA (mutación de sustitución en el codón 137 degga, que codifica para Gly, a cag, que codifica para Gln) da como resultadola pérdida de toxicidad para células de mamífero. Sin embargo, la proteínaconserva la capacidad de mediar el escape bacteriano de una vacuola (Portnoy citado anteriormente, 1996). Se evaluó la toxicidad de la proteína expresadaa partir de AFV102 infectando células J7741A con bacterias AFV102. Cuando secomparó con la célula normal no infectada control en diferentes puntos detiempo tras la infección, AFV102 ya no produjo muerte celular más significativa que la cepa de vacuna Danesa 1331 de BCG usada actualmente(figura 8).

Supervivencia en una línea celular de macrófagos alveolares: Para investigar si el constructo puede sobrevivir sin macrófagos, se usaron cultivos en fase semilogarítmica para infectar macrófagos alveolares J774A.1.Se infectaron las células con una multiplicidad de infección (MOI) de 1:1. Semonitorizó la supervivencia intracelular de Mycobacterium mediante recuento en placa de la bacteria a diversos intervalos de tiempo tras la infección.Como puede observarse en la figura 9, el constructo de AFV102 mostró unfenotipo de persistencia similar al de la cepa parental, lo que sugiereausencia de defecto en la supervivencia intracelular para este constructo encélulas J774A.1.

Secreción de la proteína PfoA por AFV102: Se sometió a prueba lasecreción de la proteína PfoA por bacterias que contienen el constructoAFV102 midiendo el sobrenadante del cultivo bacteriano para determinar laactividad hemolítica potenciada en comparación con la de la cepa Danesa 1331 de BCG. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo tanto para AFV102 comopara la cepa Danesa 1331 de BCG a la misma densidad óptica y se compararon para determinar la capacidad para lisar glóbulos rojos. Los resultados se muestran en la figura 10. De acuerdo con el informe anterior, el sobrenadantedel cultivo de BCG mostró un nivel inicial de actividad hemolítica como resultado de los metabolitos que liberan las bacterias durante el crecimiento, lo que puede dar como resultado la hemolisis (Grode et al.,Journal of Clinical Investigation, 115:2472-2479; 2005). En cambio, elsobrenadante del cultivo de AFV102 tuvo un nivel superior significativo deactividad hemolítica en comparación con la de la cepa Danesa 1331 de BCG, loque está de acuerdo con la secreción de moléculas de PfoA en el sobrenadantedel cultivo. Además, se sometió a prueba adicionalmente la actividad hemolítica independiente del pH de PfoA y se comparó a los pH de 5,5 y 7,0, ylos resultados se muestran en la figura 10. Como puede observarse, elsobrenadante de AFV102 tuvo una capacidad hemolítica similar tanto a pH 5,5 como a 7,0, lo que sugiere que la actividad hemolítica secretada por laproteína PfoA es independiente del pH, tal como se esperaba.

El ejemplo 2 muestra que la cepa construida tiene las actividades biológicas previstas y que Pfo fabricada por la cepa se secreta y tieneactividad independiente del pH.

Ejemplo 3. Prueba de inmunogenicidad en animales y escape endosómico derBCGr-PfoA

Un paradigma fundamental de la patogénesis de Mycobacterium tuberculosis es la detención de la maduración fagosómica. Armstrong y Hart (1971)establecieron que los fagosomas de M. tuberculosis no se mezclan con lisosomas marcados con ferritina, lo que se denomina la inhibición de lafusión fagosoma-lisosoma. También se encontró que la cepa de vacuna M. bovis (BCG) reside en el compartimento fagosómico, aislado de los organelosendocíticos terminales (Clemens y Horwitz, 1995; Hasan et al., 1997; Via et al., 1997). Clemens y Howitz (1995) encontraron que los fagosomas de micobacterias se tiñen de manera persistente para el receptor de transferrina(TfR) a densidades similares a las de la membrana plasmática. El receptor detransferían normalmente se elimina rápidamente (t½ en minutos) de losendosomas y se transporta de nuevo a la membrana plasmática; sin embargo, enlos fagosomas de micobacterias este proceso se detiene y los fagosomascontendrán el receptor de transferían. Este fenómeno es el que permitióvisualizar los fagosomas que contenían las micobacterias. Los fagosomas semarcaron con anticuerpos frente al receptor de transferrina. Al mismo tiempo,se tiñeron las micobacterias con un colorante fluorescente que permite lamonitorización visual del destino de las bacterias una vez dentro del fagosoma. Los resultados mostraron que el constructo de BCGr-Pfo podíaescapar del endosoma tras infectar las células.

Materiales y método para la prueba de escape endosómico: Bacterias ycélulas: Se hicieron crecer la cepa Danesa 1331 de BCG y ureC:: pfoAG137Q BCGr-(AFV102) en medio 7H9 con aporte complementario del 10% (v/v) de OADC yel 0,05% (v/v) de Tyloxapol (del medio de crecimiento) a una DO600 de aproximadamente 0,8-1,0. Antes de la infección, las células bacterianas semarcaron con succinimidil éster Alexa Fluor 568 (Molecular Probes, Eugene,OR) en PBS a temperatura ambiente durante 1-1,5 horas según las instrucciones del fabricante. Este colorante forma enlaces de amida muy estables con lasaminas primarias ubicadas en las proteínas en la superficie bacteriana. Enresumen, se sedimentaron 10 ml del cultivo bacteriano y se resuspendieron en 25 ml de 0,625 ug/ml de Alexa Fluor 568 en PBS (pH 7,2) y se incubaron atemperatura ambiente durante 1-1,5 horas para marcar las bacterias. Entonces se lavaron las células bacterianas marcadas tres veces con PBS y seresuspendieron en medio de crecimiento 7H9 y se almacenaron en la neveradurante la noche. Se cultivaron células J774A.1 en medio DMEM tal como se describió anteriormente (Sun et al, 2004) en placas de cultivo celular de 6pocillos en portaobjetos recubiertos con fibronectina humana. Se sembraron enplaca las células a una densidad de 3 x 106 células/pocillo y se cultivaron durante 2 días en un incubador a 37ºC con CO2 al 5% y humedad. Durante la infección, se sedimentaron las bacterias marcadas y se resuspendieron en DMEM

+ el 10% de medio FBS y se añadieron directamente a las células J774A.1 conuna multiplicidad de infección (MOI) de 10 por cada célula. Tras 20 min., 8horas y 24 horas, se lavaron las células con solución salina tamponada confosfato (PBS, pH 7,2) a temperatura ambiente (TA). Entonces se fijaron lascélulas durante 20 minutos a TA con paraformaldehído al 2% en PBS (pH 7,2).Entonces se permeabilizaron las células fijadas con Triton X-10 al 0,1% enPBS (pH 7,2) durante 10 minutos a TA seguido por lavado dos veces con PBS (pH7,2). Se realizó el bloqueo durante al menos 2 horas a TA o durante la nochea 4ºC con albúmina sérica bovina (BSA) al 3%, suero de cabra normal (NGS) al5% y azida sódica al 0,5% en PBS (pH 7,2). Se eliminó el tampón de bloqueo yluego se añadió anticuerpo de rata anti-receptor de transferencia de ratón-FITC (US Biological, Swampscott, MA) a una dilución de 1:50 en PBS (pH 7,2) que contenía BSA al 1%, NGS al 3% y azida sódica al 0,5% seguido porincubación a TA durante al menos 1 hora. Entonces se lavaron las células 2-3 veces con PBS y se montaron con medios de montaje Vectsheild en portaobjetosde vidrio. Se realizó el análisis a 1500 aumentos usando un microscopioinvertido Nikon TE2000 equipado con una cámara digital con filtro IR,refrigerada de 12 bit Retiga EXI Mono para la obtención de imágenes.

Resultado: Cuando se examinan bajo el microscopio, se encontró que lascélulas huésped habían internalizado tanto las bacterias BCG como BCGr-PfoA quince minutos tras la infección. Sin embargo, a las 8 horas tras lainfección, se encontraron bacterias BCGr-PfoA fuera del endosoma, a diferencia de las bacterias BCG, que se encontraron ubicadas principalmente dentro del fagosoma del huésped. Estos resultados se ilustran esquemáticamente en la figuras 11A-D, que ilustra la invasión bacteriana deun macrófago (figura 11A), la persistencia de BCG dentro del endosoma (figura11B), la bacteria AFV102 dentro de un endosoma temprano (figura 11C) y lasbacterias AFV102 que escapan del endosoma al interior del citoplasma de lacélula (figura 11D) debido a la secreción de PfoA recombinante. El recuentode las bacterias demostró que 100 AVF102 de las 138 habían escapado delendosoma (72%) después de 8 horas tras la infección, mientras que sólo 29 BCGde 100 (26%) habían escapado del fagosoma. El examen de las bacterias en lamuestra 24 horas tras la infección dio un resultado similar. Este hallazgomuestra que la expresión de PfoA aumenta la liberación de AVF102 de losfagosomas.

Se llevó a cabo la confirmación adicional de este resultado usando un sistema diferente en el que se usó un colorante sensible al pH para marcarendosomas y lisosomas (Lysotracker-Red, Molecular probes, número de catálogoL-7528) con un procedimiento y parámetros experimentales similares a losanteriores. Las bacterias se visualizaron a emisiones de longitud de onda de 568, mientras que los fagosomas se visualizaron a emisiones de longitud deonda de 488. El resultado concordó con las observaciones anteriores.

El ejemplo 3 muestra que la cepa AVF102 recombinante podía escapar delendosoma mientras que la cepa de BCG era mucho menos eficaz escapando del endosoma. Por tanto, es mucho más probable que la cepa AVF102 provoque unarespuesta inmunitaria del complejo mayor de histocompatibilidad de clase Ique BCG, y sería útil en aplicaciones de vacunas.

Referencias para el ejemplo 3.

Armstrong J, Hart PD. 1971. Response of cultured macrophages to Mycobacterium tuberculosis, with observations on fusion of lysosomes withphagosomes. J Exp Med. 134:713-40.

Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibitarrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68(9):5154-66.Hasan Z, Schlax C, Kuhn L, Lefkovits I, Young D, Thole J, Pieters J. 1997. Isolation and characterization of the mycobacterial phagosome: segregationfrom the endosomal/lysosomal pathway. Mol Microbiol 25(2):427

Via LE, Deretic D; Ulmer RJ, Hibler NS, Huber LA, Deretic V. Arrest ofmycobacterial phagosome maturation is caused by a block in vesicle fusionbetween stages controlled by rab5 and rab7. J Biol Chem. 1997. 272(20):13326

31.

Sun R, Converse PJ, Ko C, Tyagi S, Morrison NE, Bishai WR. 2004.Mycobacterium tuberculosis ECF sigma factor sigC is required for lethality inmice and for the conditional expression of a defined gen set. Mol Microbiol.52(1): 25-38

EJEMPLO 4. Estrategias de formulación y vacunación.

La estrategia para la formulación de vacunas se basa en estudios paradeterminar la viabilidad y estabilidad máximas a lo largo de todo el proceso de fabricación. Esto incluye la determinación de la viabilidad máxima del microorganismo (vivos con respecto a muertos) durante el cultivo utilizando una variedad de medios usados comúnmente para el cultivo de micobacteriasincluyendo la adición de glicerol, azúcares, aminoácidos y detergentes osales. Tras el cultivo, se recogen las células mediante centrifugación o filtración de flujo tangencial y se resuspenden en un medio de estabilización que permite la protección de las células durante la congelación o liofilización. Los agentes de estabilización usados comúnmente incluyenglutamato de sodio, aminoácidos o derivados de aminoácidos, glicerol,azúcares y sales usadas comúnmente. La formulación final proporcionará suficientes microorganismos viables para administrarse mediante administración oral, perfusión, inyección percutánea o intradérmica conestabilidad suficiente para mantener una semivida adecuada para la distribución y el uso.

Evaluación preclínica de las vacunas de TB

Prueba de seguridad general. Se infectan ratones BALB/c en grupos de 6 por vía intraperitoneal con 2 x 106 UFC de la(s) cepa(s) de BCGr de interés y las cepas parentales análogas. Se monitorizan los animales para comprobar lasalud general y el peso corporal durante 14 días tras la infección. Losanimales que reciben las cepas de BCG y de BCGr se mantienen sanas, y nipierden peso ni presentan señales manifiestas de enfermedad durante elperiodo de observación.

Virulencia de las cepas de BCGr novedosas en ratones inmunocompetentes.Se infectan grupos de 15 ratones BALB/c inmunocompetentes por vía intravenosacon 2 x 106 cepas de BCGr y BCG parentales, respectivamente. En el día 1 trasla infección, se sacrifican tres ratones en cada grupo y se analizan las UFCen bazo, pulmón e hígado para garantizar que cada animal tenía una dosis igual de infección. En las semanas 4, 8, 12 y 16 tras la infección, sesacrifican tres ratones en cada grupo y se obtienen las UFC en bazo, hígado ypulmón para evaluar el crecimiento in vivo de las cepas de BCGr en comparación con la cepa de BCG parental.

Prueba de seguridad rigurosa en ratones inmunocomprometidos. Se infectan ratones inmunocomprometidos que poseen el fenotipo SCID (inmunodeficienciacombinada grave) en grupos de 10 por vía intravenosa con 2 x 106 ufc de BCGr yla cepa de BCG parental. En el día 1 tras la infección, se sacrifican tres ratones en cada grupo y se evalúan las ufc en bazo, hígado y pulmón paraverificar la dosis de inoculación. Se monitorizan los siete ratones restantes en cada grupo para comprobar la salud general el peso corporal. Se realiza unseguimiento de la supervivencia de estos ratones y se compara la supervivencia de los ratones infectados por BCGr con la de los animalesinfectados con la cepa parental durante todo el periodo de observación.

Prueba de seguridad en cobayas. También se evalúa la seguridad de lascepas de BCGr en el modelo de cobaya en comparación con la vacuna de BCG parental, que tiene un perfil de seguridad bien establecido en seres humanos. En primer lugar, se examina el efecto de la vacuna sobre el estado de saludgeneral de los animales, incluyendo el aumento de peso. Se inmunizan lascobayas por vía intramuscular con 107 (100x de dosis de vacunación) UFC de las cepas recombinante y parental, y se monitoriza a los animales para comprobarla salud general y el peso corporal durante seis semanas. Se realiza elexamen post mortem para los animales que mueren antes del periodo de seis semanas. Se sacrifican todos los animales al final de las seis semanas tras la infección y se realiza anatomía patológica macroscópica. Para la confirmación según esta prueba, no se observó ni pérdida de peso corporal nicomportamiento anómalo, y todos los órganos parecen normales en la autopsia alas seis semanas, y/o no se observan efectos adversos en la salud para lavacuna de BCGr-PfoA, y los animales vacunados con BCGr-PfoA aumentan de pesoa la tasa normal en comparación con los animales inoculados con la cepaparental.

Al mismo tiempo, se monitorizan los niveles bacterianos en los órganosde los animales. Se sacrifican las cobayas inmunizadas con vacuna o bienparental o bien recombinante a diversos intervalos tras la inoculación, tras lo que se someten a ensayo los pulmones, bazos y ganglios linfáticosregionales (inguinales) para determinar las UFC de BCG o BCGr.

Prueba de toxicidad. Para evaluar la toxicidad de las cepas de BCGr, sevacunan cobayas (12 en cada grupo) por vía intradérmica con 1 dosis, cuatroveces superior a la dosis individual o cuatro veces inferior a la dosisindividual de cepas de BCGr, cepa de BCG parental o solución salina para usoen seres humanos. En el día 3 tras la vacunación, se sacrifican seis animalespara determinar los efectos agudos de la vacuna en estos animales. En el día28 tras la vacunación, se sacrifican los seis animales restantes para evaluar los efectos crónicos en los animales. En ambos puntos de tiempo, se obtieneel peso corporal de cada animal y se realiza anatomía patológica macroscópicay se examina el aspecto de los sitios de inyección. Se extrae sangre para labioquímica sanguínea y se realiza la histopatología de los órganos internos y los sitios de inyección.

Estudio de protección murina. Se inmunizan ratones C57B1/6 (hembras, 5-6semanas de edad) en grupos de 13 por vía subcutánea con 106 UFC de BCGr, BCGparental o solución salina. Se usa otro grupo de ratones como controlessanos. Ochos semanas tras la inmunización, se expone a los ratones a la cepaErdman de M. tb (o a la cepa H37Rv resistente a kanamicina) mediante un aerosol generado a partir de una suspensión celular individual de 10 ml quecontiene un total de 107 UFC de la cepa a la que se ha expuesto, una dosis queadministra ~100 bacterias vivas a los pulmones de cada animal, tal como sedescribió anteriormente (Brodin et al., J Infect Dis., 190(1):115-122; 2004). Se monitorizan a los animales inoculados para determinar la supervivenciajunto con los animales no expuestos. Tras la exposición, se monitorizan a losanimales para comprobar la pérdida de peso y la salud general. En el día 1tras la exposición, se sacrifican tres ratones en cada grupo para determinarlas UFC de pulmón para confirmar la dosis de exposición y se sacrifica unanimal para determinar la histopatología de bazo y pulmón. Cinco semanas trasla exposición, se sacrifican nueve animales en cada grupo y se realizananálisis de histopatología y microbiología de los animales. Se evalúantejidos de pulmón y bazo de seis ratones para los recuentos de UFC (se usanplacas con aportes complementarios de selección para distinguir la cepa devacuna de la cepa de exposición). Si se exponen a la cepa H37Rv resistente akanamicina, se usa Kan o TCH (hidrazida de ácido tiofeno-2-carboxílico) paradistinguir la cepa de exposición de la cepa de vacuna. Si se usa la cepa Erdman de M. tb para la exposición, se usa TCH para distinguir la cepa devacuna de la cepa de exposición (BCG es sensible, pero M. tb es resistente de manera natural).

Inducción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) cutánea. Se inmunizan cobayas libres de patógeno (SPF) específicas por vía intradérmicacon 103 cepas de BCGr o BCG parentales. Nueve semanas tras la inmunización, se afeita el lomo de los animales y se les inyecta por vía intradérmica 10 g dePPD (derivado de proteína purificado) en 100 l de solución salina tamponadacon fosfato. Tras 24 horas, se medirá el diámetro de la induración dura(DTH). Las cepas de BCGr inducen DTH igual a o superior al inducido por lascepas de BCG parentales.

Estudio de exposición en cobayas. Para determinar la eficacia de las vacunas de BCGr frente a la exposición con M. tb, se inmunizan cobayas(machos adultos jóvenes SPF Hartley, de 250-300 gramos) en grupos de 12, cadauna con cepa de BCGr, de BCG parental o solución salina. Las vacunas y los controles se administran por vía intradérmica con 106 ufc. A las 10 semanas tras la inmunización, se exponen los animales inmunizados con BCGr, BCG y coninmunización simulada a M. tb mediante aerosol generado a partir de unasuspensión celular individual de 10 ml que contiene un total de 107 ufc de M. tb; este procedimiento administra ~100 bacterias vivas a los pulmones de cada animal, tal como se describió anteriormente (Brodin et al., 2004). Tras laexposición, se monitorizan a los animales para determinar la supervivencia,el peso corporal y la salud general junto con un grupo sano de animales novacunados no expuestos. Se sacrifican seis animales en cada grupo a las 10semanas tras la exposición y los seis restantes en cada grupo a las 70semanas tras la exposición para la evaluación a largo plazo. En ambos puntos de tiempo, se realizan análisis de histopatología y microbiología de losanimales. Se evalúan los tejidos de pulmón y bazo para la histopatología y el recuento de UFC (se usan placas con aportes complementarios de selección para distinguir la cepa de vacuna de la cepa de exposición). Si se exponen a lacepa H37Rv resistente a kanamicina, entonces se usa Kan o TCH para distinguirla cepa de exposición de la cepa de vacuna. Si se usa la cepa Erdman de M tb para la exposición, se usa entonces TCH para distinguir la cepa de vacuna dela cepa de exposición (BCG es sensible pero M. tb es resistente de manera natural). Durante un estudio de exposición satisfactorio, los animales coninmunización simulada mueren lo más rápidamente tras la exposición, y losanimales inmunizados con BCGr sobreviven más tiempo que los animales inmunizados con la cepa de BCG parental.

Estudio de exposición y seguridad en primates. Más recientemente, se hanusado primates no humanos para la evaluación de vacunas contra M. tb. La relación evolutiva entre seres humanos y primates no humanos y las manifestaciones clínicas y patológicas de la tuberculosis en estas especiesha convertido al modelo de primates no humanos en atractivo para estudiosexperimentales de la enfermedad de TB y la eficacia de vacunas.

Este modelo, caracterizado por el desarrollo de cavitación pulmonar, parece ser aplicable a la TB humana. Se realiza un seguimiento del transcurso de la infección y la enfermedad mediante radiografía y la pérdida de peso,así como por una variedad de pruebas hematológicas, incluyendo la velocidad de sedimentación eritrocitaria (ESR), la proliferación y producción decitosina en células mononucleares en sangre periférica (PBMC), la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las respuestas de anticuerpos. Trasla infección, el mono Cynomolgus desarrolla patología de pulmón con lesiones características y, dependiendo de las dosis de exposición, se produce muertepor infección respiratoria aguda en el plazo de cuatro a seis meses tras lainfección. Dosis de infección inferiores pueden conducir a infeccionescrónicas sin enfermedad, muy similar a los seres humanos.

El estudio compara directamente diversas dosis de la cepa de BCG parental frente a BCG recombinante administradas o bien solas o seguidas por dos dosis de refuerzo posteriores con la vacuna que comprende secuencias que están sobreexpresadas en constructos de BCGr. Esta última se administramediante cualquiera de varios medios conocidos, incluyendo pero sin limitarse

a: como proteína recombinante basada en una formulación adyuvante adecuada,como ADN o como un constructo de Ad35.

El primer estudio evalúa la eficacia protectora de los constructos BCGparenteral frente a BCGr sin una dosis de refuerzo. Este estudio comprendetres grupos con 10 animales en cada grupo: comprendiendo cada grupo BCG, BCGry solución salina. Se somete a prueba la piel de dos animales de cada grupocon los antígenos sobreexpresados en los constructos de BCGr así como con PPDy solución salina convencionales como controles. Una induración positiva ymayor en el grupo de BCGr en comparación con el de BCG es indicativa de administración de vacuna in vivo y de que se provoca una respuestainmunitaria. Los ocho animales restantes de cada grupo se exponen medianteaerosol a una dosis baja de la cepa Erdman de M tb y se mide la protección mediante la reducción de la carga bacteriana a las 16 semanas tras la exposición con la supervivencia como criterio de valoración.

El protocolo de sensibilización a BCG de seguimiento es esencialmenteigual al anterior, excepto que los animales se vacunan en primer lugar con BCG, BCGr y solución salina seguido por dos dosis de refuerzo con los antígenos sobreexpresados.

El estudio de inmunogenicidad y protección en el modelo de primates no humanos investiga los aspectos inmunobiológicos e inmunopatológicos de latuberculosis en macacos para estudios de eficacia en constructos de BCGr. Los animales son de crías a adultos jóvenes criados en cautividad con un peso promedio de 2 a 3 kg que se han acondicionado completamente antes del comienzo del experimento. Los estudios de pre-inoculación incluyen análisisde sangre iniciales que incluyen estudios hematológicos de rutina yvelocidades de sedimentación de eritrocitos, así como ensayos de proliferación de linfocitos. Se realizan pruebas cutáneas con PPD paragarantizar la falta de sensibilidad a tuberculina y se obtienen radiografíasde tórax como parte del perfil previo a la infección. El periodo de inmunización dura 21 semanas en total, lo que cubre la vacunación primariacon BCG o BCGr en la semana = 0, y los refuerzos de antígeno en las semanas12 y 16. Se evalúa la inmunidad específica de antígeno midiendo la

proliferación y la secreción de interferón  (IFN ) en pruebas de

estimulación de linfocitos. Se determina la frecuencia de linfocitos queproducen IFN  mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISPOT) o el clasificador celular activado por fluorescencia (FACS). Para este fin, se extraen muestras de sangre en las semanas 0, 4, 8, 12, 16 y 20con respecto a la vacunación primaria.

Cuatro a seis semanas tras la última inmunización, se exponen losanimales mediante instilación intratraqueal de 3 ml (1.000 ufc) de la cepaErdman de M. tuberculosis en el mismo día y con la misma preparación. Seevalúa el transcurso de la infección para determinar la pérdida de peso,fiebre, velocidad de sedimentación eritrocitaria (ESR) elevada, DTH a PPD,respuesta proliferativa in vitro de PBMC estimulados con PPD y sobreexpresiónde antígeno en BCGr seguido por mediciones de los niveles de producción de

IFN-. Se realizan radiografías de tórax para detectar anomalías queconcuerden con TB pulmonar, y finalmente, se realiza la autopsia a las 12-16semanas tras la exposición.

Evaluación clínica de vacunas y vectores frente a la TB

Se realizan estudios de seguridad y toxicidad preclínicos tal comoobligan las normativas federales según los estudios de toxicología yseguridad preclínicos tal como se describió anteriormente. Tras estos estudios, se realizan estudios de seguridad en seres humanos. Estos estudios se realizan inicialmente en adultos sanos negativos para Quantiferon, seguidopor disminución de la edad a niños y neonatos.

Estudios de inmunogenicidad: Los estudios de inmunogenicidad en ratonesy primates utilizan, pero no se limitan a, métodos convencionales de evaluación de la inmunidad celular tales como INF, ELISPOT, citometría deflujo con estimulación de péptido o antígeno a corto y largo plazo, etc. Seutilizan metodologías similares para la evaluación de respuestas humanas. Seemplean estudios de tetrámeros para la evaluación de las respuestas de CD4 yCD8 tras la vacunación de seres humanos.

Optimización de estrategias de refuerzo de sensibilización: BCGr funciona bien como una vacuna independiente frente a la TB u otras enfermedades para las que se ha modificado mediante ingeniería genética paraque expresen antígenos relevantes. BCGr, tal como se describe en el presente documento como vacuna para la TB o que expresa antígenos para proteger frentea otras enfermedades, también funciona extremadamente bien para sensibilizarel sistema inmunitario para una inmunización de refuerzo con proteínasrecombinantes mezcladas con adyuvantes, o antígenos con vectores virales obacterianos. Tanto en estudios preclínicos con animales como en estudios conseres humanos, las sensibilizaciones con BCG seguidas por refuerzos de vector

o proteína recombinante/adyuvante están optimizadas en lo que se refiere a los regímenes y las dosis. Estas estrategias de refuerzo de sensibilizaciónconstituyen el medio más potente para inducir inmunidad en seres humanosdebido a la potencia de la sensibilización con BCG obtenida en la presenteinvención, seguido por centrarse en y potenciar la respuesta a la dosis derefuerzo del sistema inmunitario mediante vector o proteína recombinante.

Estudios de vacunas terapéuticas tras la exposición en animales: Se usarán ratones C57BL/6 pero sin limitarse a este animal para establecer infección latente; se administrarán vacunas terapéuticas a los ratones en elmomento en que sólo se haya inducido una inmunidad específica insignificante frente a M tb mediante infección de dosis baja y un punto de tiempo posterioren el que la inmunidad específica frente a M. tb ha disminuido y en ella predominan las células T de memoria. Entonces, se evaluará el beneficio terapéutico de las vacunas en ratones 2 y 5 meses tras la última administración de vacuna terapéutica mediante el recuento de las ufc en pulmones y bazos en ratones individuales. Se analizarán los recuentos de ufc mediante métodos estadísticos convencionales en los grupos de ratones y seusarán los resultados para determinar si la vacunación terapéutica reducesignificativamente la infección latente por M tb en ratones. Se utilizan metodologías similares para la evaluación de respuestas de otros animalescuando sea necesario.

Evaluación clínica de vectores de BCG: administración oral de vacunas de BCGr. La vacunación oral del animal diana con el BCGr de la presenteinvención se logra usando métodos descritos previamente (Miller et al., Can Med Assoc J. 121(1):45-54; 1979). La cantidad de BCGr de la presenteinvención administrado por vía oral variará dependiendo de la especie delsujeto, así como de la enfermedad o estado que se está tratando. Generalmente, la dosificación empleada es de aproximadamente de 103 a 1011 microorganismos viables, y preferiblemente de aproximadamente 105 a 109 microorganismos viables.

El BCGr se administra generalmente junto con un vehículo o diluyentefarmacéuticamente aceptable. El vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable particular empleado no es crítico para la presente invención.Ejemplos de diluyentes incluyen solución salina tamponada con fosfato, tampónpara tamponar frente al ácido gástrico en el estómago, tal como tampón citrato (pH 7,0) que contiene sacarosa, tampón bicarbonato (pH 7,0) solo (Levine et al., J. Clin. Invest, 79:888-902; 1987; y Black et al., J. Infect.Dis., 155:1260-1265; 1987), o tampón bicarbonato (pH 7,0) que contiene ácidoascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo (Levine et al., citado anteriormente, 1989; Lancet, II: 67-470; 1988). Ejemplos de vehículos incluyen proteínas, por ejemplo, las encontradas en la leche desnatada,azúcares, por ejemplo, sacarosa, o polivinilpirrolidona. Normalmente estosvehículos se usarían a una concentración de aproximadamente el 0,1-90% (p/v)pero preferiblemente a un intervalo del 1-10% (p/v).

EJEMPLO 5. Seguridad en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID)

Tal como se mencionó anteriormente, la expresión de Llo en BCG demostróser relativamente ineficaz en potenciar el escape del endosoma, probablementedebido a la baja actividad de Llo a pH neutro en el microentorno del endosomamodificado en el que reside BCG (Hess, et al., Proc Natl Acad Sci 95:5299; 1998; Grode et al., J. Clin. Invest, J Clin Invest. 115(9):2472; 2005). Noobstante, la expresión de Llo modificó aparentemente el endosoma lo suficiente como para reducir la virulencia de BCG-Llo+ en ratones SCID (Grode et al., 2005). Esta observación sugiere que el redireccionamiento de BCG alcitoplasma de células huésped tiene la posibilidad de mejorar tanto lainmunogenicidad como la seguridad de esta antigua vacuna viva frente a la TB.El objetivo de este estudio, por tanto, es determinar la seguridad de la cepa AFV102 que escapa del endosoma que expresa PfoAG137Q en ratones SCID.

Para este fin, se hicieron crecer cepas Danesa 1331 de BCG parental (BCG1331) y el derivado de BCG1331 que expresa PfoAG137Q, cepa AFV102 en matraces de 2 l con agitación (150 oscilaciones por minuto) hasta la fase logarítmicatardía (densidad óptica a 540 nm de 6,5-7,5). Se recogieron las bacteriasmediante centrifugación y se almacenaron a 1,5 x 109 ufc/ml a -80ºC ensolución salina + el 0,05% (v/v) de Tyloxapol + el 10% (v/v) de glicerol.

5 Se prepararon los inóculos descongelando los viales en masa en hielo y realizando conjuntos de diluciones en serie en solución salina normal librede endotoxina (<0,05 UE/ml) (NaCl al 0,85% p/v). Estas diluciones se usaronpara inocular grupos de 6 ratones SCID por vía subcutánea con las dosisrespectivas mostradas en la tabla 2 suspendidas en un volumen de 0,1 ml.

10 Tabla 2. Diseño del estudio de seguridad en ratón SCID

Grupo

Vacuna Dosis

1

PBS

2

BCG1331 3 x 104

3

BCG1331 3 x 105

4

BCG1331 3 x 106

5

BCG1331 3 x 107

6

AFV102 3 x 105

7

AFV102 3 x 106

8

AFV102 3 x 107

9

AFV102 3 x 108

Tras la inoculación, se monitorizan a los ratones para determinar la supervivencia a lo largo de un periodo de 100 días tras la inoculación. Los resultados de este estudio muestran que los ratones inoculados con AFV102

15 sobreviven más que los ratones que reciben la dosis análoga de BCG1331.

El uso de una vacuna de dosis de refuerzo heteróloga para reforzar la inmunidad provocada por BCG ha atraído la atención recientemente. Por tanto, seres humanos y animales de laboratorio estimulados con BCG desarrollanrespuestas inmunitarias celulares excelentes tras un refuerzo heterólogo

20 compuesto por virus vaccinia Ankara modificado (MVA) que codifica para el antígeno de M. tb 85A (en el presente documento “Ag85A”; también conocidocomo Rv3804c; Vordemeier et al., Immunol. 112(3):461; 2004; McShane et al.,Nature Med. 10(11):1240; 2004); por el contrario, los individuos que no hanrecibido la dosis desarrollan respuestas relativamente mediocres al vector

25 MVA-Ag85A vector (McShane et al., 2004). Además, hay estudios independientes que muestran que animales de laboratorio sensibilizados con BCG y conrefuerzo o bien con MVAAg85A (Williams et al., Infect Immun. 73(6):3814; 2005) o bien con vacuna de subunidad M. tb72f (Brandt et al., Infect. Immun.72(11): 6622; 2004) desarrollan niveles superiores de resistencia a una

30 exposición a M. tb que la que logran mediante la vacunación con BCG solo, loque constituye un apoyo reforzado para este enfoque. Aunque estos estudios nodefinían las correlaciones de protección, está claro que las estrategias devacunación heterólogas de sensibilización-refuerzo ofrecen un medio eficazpara producir protección frente a M. tb.

35 El objetivo de este ejemplo y del siguiente, por tanto, es evaluar la cepa AFV102 que escapa del endosoma en un régimen de vacunación de sensibilización-refuerzo. El objetivo del experimento en este ejemplo esoptimizar el intervalo en un régimen de sensibilización-refuerzo en el que seusa la cepa AFV102 que escapa del endosoma como sensibilización y se usa un

40 vector de vacuna de adenovirus serotipo 35 con replicación deficiente (Vogels et al., J Virol. 77(15):8263-71; 2003; Barouch et al., J. Immunol. 172(10):6290; 2004) que alberga un casete de expresión que codifica para unaproteína de fusión compuesta por los genes de M. tb Rv3804c-Rv1886-Rv0288 bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (Vogels et al., J

5 Virol. 77(15):8263-71; 2003) como refuerzo. El refuerzo se administra por vía intranasal (i.n.), puesto que los adenovirus que expresan antígenos de TB sonmás eficaces por esta vía que por las vías de administración parenteralesconvencionales (Wang et al., J. Immunol. 173(10):6357; 2004).

Por consiguiente, se inmunizaron grupos de 10 cobayas Hartley macho SPF10 (250-300 gramos) tal como se muestra en la tabla 3 para evaluar intervalos de sensibilización-refuerzo de 14, 18 y 21 semanas.

Tabla 3. Diseño de estudio de régimen en cobayas

Grupo

Sensibilización 1 (Día 1) Sensibilización II (Semana 3) Sensibilización II (Semana 7) Refuerzo (Semana 21)

1

Solución salina (i.d.) - - -

2

AFV102 (i.d.) - - Ad35-TBS (i.n.)

3

- AFV102 (i.d.) - Ad35-TBS (i.n.)

4

- - AFV102 (i.d.) Ad35-TBS (i.n.)

5

- - - Ad35-TBS (i.n.)

Nota: Ad35-TBS indica un vector de vacuna de adenovirus serotipo 35 con

15 replicación deficiente (Vogels et al., J Virol. 77(15): 8263-71; 2003; Barouche et al., J.Immunol. 172(10): 6290; 2004) que alberga un casete deexpresión que codifica para una proteína de fusión compuesta por los genes de

M. tb Rv3804c-Rv1886-Rv0288 bajo el control del promotor temprano de citomegalovirus (Vogels et al., J Virol. 77(15):8263-71; 2003).

20 Las sensibilizaciones se administran por vía intradérmica a una dosis de 106 ufc en 0,1 ml de glicerol al 10%. A los ratones control se les administran0,1 ml de glicerol al 10% por vía intradérmica sólo. A las 14 semanas tras lasensibilización, se administra a los cobayas un refuerzo compuesto por Ad35TBS y se les administra por vía intranasal a una dosis de 109 unidades

25 formadoras de placa (es decir Vogels et al., 2003; Barouch et al. 2004)suspendido en 10 l de PBS.

A las 14 semanas tras el refuerzo, se expone a los animales mediante aerosol a la cepa Erdman de M. tb mediante un aerosol generado a partir deuna suspensión celular individual de 10 ml que contiene un total de 107 ufc de

30 M. tb; este procedimiento administra ~100 bacterias vivas a los pulmones de cada animal, tal como se describió anteriormente (Brodin et al., 2004). A las5 semanas tras la exposición, se sacrifican los animales en cada grupo y serecogen los pulmones y los bazos para el análisis histológico ymicrobiológico. En este último caso, se evalúan tejidos de pulmón y bazo de

35 los cobayas para los recuentos de las ufc. Puesto que se usa la cepa Erdmande M. tb para la exposición, se añade TCH a los medios para distinguir la cepa de vacuna, que es sensible a TCH, de la cepa de exposición.

Los resultados de este estudio identifican el intervalo óptimo entre lasensibilización con BCGr y el refuerzo con Ad35-TBS.

40 EJEMPLO 6. Exposición de inmunización

Para medir la potencia de la cepa AFV102 candidata para vacuna frente ala TB contra la exposición de M. tb, se inmunizan grupos de 8 (cobayas Hartley SFP adultos jóvenes (250-300 gramos) tal como se muestra en la tabla

4. Tabla 4: Diseño de estudio de exposición en cobayas

Grupo

Sensibilización 1 (Día 1) Refuerzo (Semana n*) Exposición(refuerzo + 14semanas)

1

Solución salina (i.d.) - 100 ufc de Erdman

2

Danesa 1331 de BCG (i.d.) - 100 ufc de Erdman

3

Solución salina (i.d.) Ad35-TBS (i.n.) 100 ufc de Erdman

4

AFV102 (i.d.) AFV102 (i.d.) 100 ufc de Erdman

5

AFV102 (i.d.) Ad35-TBS (i.n.) 100 ufc de Erdman

5

10

15

20

25

30

35

40

Nota:

1.

n* indica que el intervalo entre la sensibilización y el refuerzoserá el valor definido en el ejemplo anterior.

2.

Ad35-TBS indica un vector de vacuna de adenovirus serotipo 35 conreplicación deficiente ((Vogels et al., J Virol. 77(15): 8263-71;2003; Barouche et al., J. Immunol. 172(10): 6290; 2004) que alberga un casete de expresión que codifica para una proteína de fusión compuesta por los genes de M. tb Rv3804c-Rv1886-Rv0288 bajo elcontrol del promotor temprano de citomegalovirus (Vogels et al., J Virol. 77(15):8263-71; 2003).

Las sensibilizaciones en los grupos 4 y 5 se administran por víaintradérmica a una dosis de 106 ufc en 0,1 ml de glicerol al 10%. A losratones control en los grupos 1 y 3 se les administran 0,1 ml de glicerol al10% por vía intradérmica sólo. A los ratones control en el grupo 2, 106 ufc de la cepa Danesa 1331 de BCG en 0,1 ml de glicerol al 10%.

A las 14 semanas tras la sensibilización, se administra a los cobayas un refuerzo. En el grupo 5, el refuerzo está compuesto por AFV102 y seadministra por vía intradérmica a una dosis de 106 ufc en 0,1 ml de glicerolal 10%. En los grupos 4 y 6, los refuerzos están compuestos por Ad35-TBS y se administran por vía intranasal a una dosis de 109 unidades formadoras de placas (es decir Vogels et al., 2003; Barouch et al. 2004) suspendidos en 10

l de PBS.

A las 14 semanas tras la inmunización final, se expone a los animalesmediante un aerosol a M. tb mediante un aerosol generado a partir de unasuspensión celular individual de 10 ml que contiene un total de 107 UFC de M. tb; este procedimiento administra ~100 bacterias vivas a los pulmones de cada animal, tal como se describió anteriormente (Brodin et al., 2004). Tras laexposición, se monitorizó a los animales para determinar la supervivenciajunto con un grupo sano de animales no vacunados no expuestos. También semonitorizan a los animales para determinar la pérdida de peso y la salud general.

Los resultados de este estudio demuestran que los animales con inmunización simulada mueren lo más rápidamente tras la exposición, losanimales vacunados con BCG por vía intradérmica sin refuerzo muestran untiempo medio intermedio hasta la muerte y los animales inmunizados con AFV102y con refuerzo por vía intranasal con Ad35-TBS son los que sobreviven más tiempo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

EJEMPLO 7. Apoptosis

La apoptosis es la muerte celular programada que difiere drásticamentede la muerte celular necrótica en lo que se refiere a su inducción yconsecuencias. La apoptosis de las células que contienen antígenos extraños es un estímulo poderoso conocido de inmunidad celular contra tales antígenos. El proceso por el que la apoptosis de las células que contienen el antígeno conduce a inmunidad celular se ha denominado en ocasiones de sensibilización cruzada. 1,2,3 Existen varios mecanismos para la inducción de apoptosis queconducen a un aumento de la inmunidad mediada por células específica deantígeno. La apoptosis mediada por caspasa 8 conduce a protección inmunitaria celular específica de antígeno. 4 La producción de caspasa 8 en el citoplasma celular por BCG recombinante que escapa del endosoma será un método adicional poderoso para inducir la muerte celular programada en el contexto de antígenos extraños expresados por BCG recombinante, contra BCG y otrosantígenos de la tuberculosis sobreexpresados por BCG recombinante, así como contra los propios antígenos de BCG conduciendo a altos niveles de inmunidad celular específica de antígeno. El receptor 5 de muerte (DR-5) también conocido como TRAIL-R2 (receptor de TRAIL 2) o TNFR-SF-10B (miembro 10B de lasuperfamilia de factores de necrosis tumoral) también media la apoptosismediada por caspasa 8. 4 La apoptosis inducida por retrovirus está mediada por TRAIL- DR5 que conduce a una eliminación posterior del virus.5 La expresión de DR-5 por BCG recombinante que escapa del endosoma debe proporcionar unpotente efecto adyuvante para la inducción de la inmunidad celular específica de antígeno contra los antígenos expresados por BCGr. También puede inducirseque las células que expresan los antígenos experimenten apoptosis a través del ligamiento de Fas, que es un fuerte estímulo para la inducción de respuestas inmunitarias celulares específicas de antígeno. 6 El BCG recombinante que escapa del endosoma que expresa Fas o la proteína de fusiónectodominio de CD4/dominio citoplasmático de FAS inducirá apoptosis yrespuestas inmunitarias celulares específicas de antígeno.

La potenciación de la inmunidad celular mediante las cepas que escapandel endosoma de BCGr o mediante las cepas que escapan del endosoma de BCGr que producen potenciadores de apoptosis adicionales descritas anteriormenteno se limita a antígenos de BCG o antígenos específicamente codificados para la sobreexpresión por BCGr, sino que incluyen cualquier antígeno en la célula eucariota en la que pueda invadir el BCGr mencionado anteriormente. Comoejemplo, si un BCGr de este tipo se administra a células tumorales en las quese induce apoptosis, entonces se inducirá la inmunidad celular contra antígenos tumorales importantes con eliminación, reducción o prevención deltumor y/o la metástasis. Este efecto antitumoral se producirá además del efecto antitumoral general que genera BCG cuando se administra localmente tal como es el caso con el cáncer de vejiga.

En una realización adicional de esta invención, BCGr con escape deendosoma o BCGr con escape de endosoma potenciado mediante la producción demediadores específicos de la apoptosis, administrado dentro del tumor u otras células en las que tal BCGr también produce antígenos extraños contra los quese generarán respuestas inmunitarias celulares fuertes, inducirán la producción de respuestas celulares fuertes contra esas células tumorales uotras células eucariotas que contienen estos antígenos. Estas respuestas celulares conducirán a la destrucción de las células tumorales mediada por el sistema inmunitario, además de la sensibilización cruzada e inducción deinmunidad celular contra antígenos tumorales u otros antígenos importantescon la posterior eliminación, reducción o prevención del tumor y/o la metástasis. Como ejemplo de un antígeno extraño de este tipo está un antígenode HLA diferente del HLA de la célula huésped contra el que se generará unarespuesta celular heteróloga fuerte.

BCGr con escape de endosoma o BCGr con escape de endosoma cuyaspropiedades de inducción apoptótica están potenciadas mediante la expresiónde mediadores específicos de la apoptosis que también producen antígenos tumorales específicos inducirán respuestas celulares específicas de antígeno fuertes contra estos antígenos tumorales, incluyendo interrupción de ciertatolerancia para estos antígenos que conduce a eliminación, reducción oprevención de tumores y/o metástasis sin necesidad de administración directa del BCGr en el propio tumor.

La apoptosis tras el daño al ADN o la caspasa 9 induce tolerancia aciertos antígenos. La inducción de tolerancia es importante en el control ola prevención de enfermedades autoinmunitarias tales como, pero sin limitarsea, diabetes, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino y esclerosis múltiple. La producción de caspasa 9

o de otras proteínas que inducen tolerancia mediada por apoptosis por BCGr

que escapa del endosoma en células tales como, pero sin limitarse a, células pancreáticas , células colorrectales y nerviosas, producirá apoptosis limitada que inducirá tolerancia contra dianas antigénicas de autoinmunidaden esas células tratando o evitando de esa manera el estado patológicoautoinmunitario. La identificación de antígenos específicos implicados enreacciones autoinmunitarias permitirá la inducción de tolerancia contra estosantígenos diana autoinmunitarios a través la producción por BCGr que escapa del endosoma tanto de estos antígenos como de caspasa 9 u otras moléculas que pueden inducir tolerancia mediada por apoptosis. Tal BCGr tratará y/o evitaráestas enfermedades autoinmunitarias.

Referencias para el ejemplo 7.

1.

Heath, W.R., G.T. Belz, G.M. Behrens, C. M. Smith, S.P. Forehan,I.A., Parish, G.M. Davey, N. S. Wilson, F. R. Carbone, y J. A. Villandangos.2004. Cross-presentation, dentritic cell subsets, and the generation ofimmunity to cellular antigens. Immunol Rev 199:9.

2.

Gallucci, S., M. Lolkema, y P. Matzinger. 1999. Natural adjuvants:Endogenous activators of dendritic cells. Nature Biotechnology. 5:1249.

3.

Albert, M.L., B. Sauter, y N. Bhadrdwaj. 1998. Dendritic cellsacquire antigen from apoptotic cells and induce class I -restricted CTLs. Nature 392:86

4. Sheridan, J.P., S.A. Marsters, R.M. Pitti, A. Gruney, M. Skutbatch,

D. Baldwin, L. Ramakrishnan, C.L. Gray, K. Baker, W.I. Wood, A.D. Goddard, P.Godowski, y A. Ashkenazi. 1997. Control of Trail induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors. Science 277:818.

5. Clarke, P., S. M. Meintzer, S. Gibson, C. Widmann, T.P. Garrington,

G.L.

Johnson, y K.L. Tyler. 2000. Reovirus-induced apoptosis is mediated byTRAIL. J. Virol 74:8135.

6. Chattergoon, M.A., J.J. Kim, J.S. Yang, T. M. Robbinson, D. J. Lee,

T.

Dentchev, D.M. Wilson, V. Ayyavoo, y D.B. Weiner. 2000. Targeted antigendelivery to antigen-presenting cells including dendritic cells by engineeredFas-mediated apoptosis. Nat Biotechnology 18:974.

7. Hugues, S., E. Mougneau, W. Ferlin, D. Jeske, P. Hofman, D. Homann,

L.

Beaudoin, D. Schrike, M. Von Herrath, A. Lehuen, y N. Glaichenenhaus.2002. Tolerance to islet antigens and prevention from diabetes induced bylimited apoptosis of pancreatic beta cells. Immunity 16:169.

EJEMPLO 8. Sobreexpresión de antígenos de vacuna en una cepa de BCGr que puede escapar del endosoma

Para sobreexpresar antígenos de TB en la cepa AFV102 de BCGr, seinsertaron secuencias que codifican para el promotor de Rv3031 unidasfuncionalmente a secuencias que codifican para Rv3804c (también conocido comoAg85A), Rv1886 (también conocido como Ag85B) y Rv0288 (también conocido como TB10.4) en el sitio PacI de pAF100. El plásmido resultante, pAF105 (figura12), se digirió posteriormente con la endonucleasa de restricción NdeI para eliminar el gen de resistencia a kanamicina y el replicón de E. coli, y se recircularizó mediante ligamiento con ligasa de T4. Este ADN (1-2 g) se introdujo en la cepa AFV102 de BCGr mediante electroporación. Se cultivaron las bacterias en placas de 8,75 cm que contenían 25-30 ml de medios sólidos(Middlebrook 7H10). Tras una preselección mediante PCR para detectar colonias que albergan el plásmido de expresión de antígeno, una colonia de BCGr seleccionada, que es positiva para PfoA y contiene el casete de expresión delantígeno de TB, se designa AFV 112 y se expande hasta 500 ml en medios líquidos agitados (Middlebrook 7H9) a 37ºC. Una vez que el cultivo alcanza lafase logarítmica tardía, se añade glicerol al cultivo de 500 ml hasta una concentración final del 10% (v/v) y se almacena la cepa premadre en alícuotasde 5 ml a -80ºC.

Se evalúa la pureza de los cultivos de BCG y BCGr extendiendo uniformemente alícuotas de 100 l del cultivo de BCG diluido en serie (por ejemplo etapas de 10 veces a partir de Neat -10-8) en solución salinatamponada con fosfato (PBS) en placas de 8,75 cm que contienen 25-30 ml de medios sólidos (Middlebrook 7H10). Se usa análisis de PCR y endonucleasa derestricción del ADN del plásmido para confirmar que el genotipo deseado está presente en cada aislado de BCGr. Además, se secuencian los fragmentos de ADNgenerados por PCR mediante técnicas de secuenciación automática de didesoxinucleótidos para confirmar la presencia de genes de longitud completa.

Para evaluar la secreción de PfoA por AFV102 y AFV112 que albergan el plásmido de expresión de antígeno de TB, se hicieron crecer ambas cepas hastala fase semilogarítmica, tal como se describió anteriormente. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo de estos cultivos y se filtraron a través defiltros de membrana de 0,2-mm, tal como se describió anteriormente (Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95:5299-304; 1998). Entonces se evalúan las proteínas del filtrado de cultivo para determinar la actividad hemolítica,tal como se describió anteriormente. Los resultados muestran que AFV102 yAFV112 presentan niveles similares de actividad hemolítica y que AFV112

conserva el alelo ureC::ΩPfoAG137Q y expresa una proteína PfoA funcional.

Finalmente, se evalúa la expresión de los antígenos de TB en proteínas de sobrenadantes de cultivo separadas en geles de SDS-PAGE al 10-15%. Losresultados muestran la expresión aumentada de Rv3804c y Rv1886. Puesto que nose espera que Rv0288 se sobreexprese en el sobrenadante de cultivo, lasobreexpresión de esta proteína de 10 kDa, que se expresa en el mismo ARNm que Rv3804c y Rv1886, se deduce por la observación de que Rv3804c y Rv1886 sesobrexpresan.

Tomado como un todo, este ejemplo demuestra que es posible generar unacepa de BCGr que tanto exprese PfoA como sobreexprese antígenos de TB. Unacepa de este tipo puede servir como vacuna frente a la TB de segunda generación.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Mycobacterium que se modifica mediante ingeniería genética para incluiruna proteína endosomalítica que puede expresarse y secretarse que esactiva a un pH de 6-8, en el que la proteína se selecciona del grupo de

   perfringolisina O, pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidos es homólogaen al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

2. 2.

   Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que dicha proteínaendosomalítica que puede expresarse o secretarse es perfringolisina O ouna variante funcional de la misma que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

3. 3.

   Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que una secuencia deaminoácidos de dicha proteína endosomalítica que puede expresarse osecretarse se representa mediante SEQ ID NO. 2.

4. 4.

   Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que dicha proteínaendosomalítica que puede expresarse o secretarse se codifica por unasecuencia génica específica para perfringolisina O o una variantefuncional de la misma que tiene la actividad de la proteína dereferencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un70% a la de la proteína de tipo natural.

5. 5.

   Mycobacterium según la reivindicación 4, en el que dicha secuenciagénica se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO.

6. 3.

7. 6.

   Mycobacterium según la reivindicación 1, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar adicionalmente una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis.

8. 7.

   Mycobacterium según la reivindicación 6, en el que dicha proteínaapoptótica o dicho potenciador de apoptosis se selecciona del grupo que consiste en caspasa 8, receptor de muerte 5, Fas y proteína de fusiónectodominio de CD4/dominio citoplásmico de FAS.

9. 8.

   Mycobacterium según la reivindicación 1, modificándose dicho Mycobacterium mediante ingeniería genética para expresar de manerafuncional un gen de interés.

10. 9.

    Mycobacterium según la reivindicación 1, modificándose dicho Mycobacterium mediante ingeniería genética para expresar de manera funcional

    una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis; y

    un gen de interés.

11. 10.

    Mycobacterium según la reivindicación 1, siendo dicho Mycobacterium BCG.

12. 11.

    Método de permitir que un Mycobacterium escape de endosomas, que comprende la etapa de

    modificar mediante ingeniería genética dicho Mycobacterium paracontener, expresar y secretar una proteína endosomalítica que es activaa un pH de 6 a 8, en el que la proteína se selecciona del grupo de

    perfringolisina O, pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia de aminoácidoses homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tipo natural.

13. 12.

    Método según la reivindicación 11, en el que dicha proteínaendosomalítica es perfringolisina O o una variante funcional de la mismaque tiene la actividad de la proteína de referencia y cuya secuencia deaminoácidos es homóloga en al menos un 70% a la de la proteína de tiponatural.

14. 13.

    Método según la reivindicación 12, en el que dicha proteínaendosomalítica es una perfringolisina O mutante codificada por SEQ IDNO: 3.

15. 14.

    Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium es un Mycobacterium atenuado.

16. 15.

    Método según la reivindicación 14, en el que dicho Mycobacterium atenuado es BCG.

17. 16.

    Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar adicionalmente unaproteína apoptótica o un potenciador de apoptosis.

18. 17.

    Método según la reivindicación 16, en el que dicha proteína apoptótica

    o dicho potenciador de apoptosis se selecciona del grupo que consiste en caspasa 8, receptor de muerte 5, Fas y proteína de fusión ectodominio de CD4/dominio citoplásmico de FAS.

19. 18.

    Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar de manera funcionalun gen de interés.

20. 19.

    Método según la reivindicación 11, en el que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresar de manera funcional

    una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis; y

    un gen de interés.
21. 20. Preparación de vacuna, que comprende

    un Mycobacterium según la reivindicación 1 modificado mediante ingeniería genética para expresar y secretar una proteínaendosomalítica funcional seleccionada del grupo de perfringolisina O,

    pneumolisina, estreptolisina O, cerolisina, -hemolisina o una variante funcional de las mismas que tiene la actividad de la proteína dereferencia y cuya secuencia de aminoácidos es homóloga en al menos un70% a la de la proteína de tipo natural, en la que dicha proteínaendosomalítica funcional es activa a pH neutro.

22. 21.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicha proteína endosomalítica es perfringolisina O.

23. 22.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 21, en la que dicha proteína endosomalítica es una variante funcional de perfringolisina Ocodificada por SEQ ID NO: 3.

24. 23.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium es un Mycobacterium atenuado.

25. 24.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 23, en la que dicho Mycobacterium atenuado es BCG.

26. 25.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresaradicionalmente una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis.

27. 26.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 25, en la que dicha proteína apoptótica o dicho potenciador de apoptosis se selecciona del

    grupo que consiste en caspasa 8, receptor de muerte 5, Fas y proteína defusión ectodominio de CD4/dominio citoplásmico de FAS.

28. 27.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresaradicionalmente de manera funcional un gen de interés.

29. 28.

    Preparación de vacuna según la reivindicación 20, en la que dicho Mycobacterium se modifica mediante ingeniería genética para expresaradicionalmente de manera funcional

    una proteína apoptótica o un potenciador de apoptosis;

    y un gen de interés.

30. 29.

    Mycobacterium según las reivindicaciones 8 y 9, método según las reivindicaciones 18 ó 19 o preparación de vacuna según las reivindicaciones 27 ó 28, en los que dicho Mycobacterium es una cepa de Mycobacterium atenuada que sobreexpresa un gen de interés que codifica para antígenos de Mycobacterium tuberculosis, seleccionándose en particular dichos antígenos del grupo que consiste en Rv0125, Rv0203,Rv0287, Rv0288, Rv0603, Rv1196, Rv1223, Rv1271c, Rv1733c, Rv1738,Rv1804c, Rv1886, Rv2031c, Rv2032, Rv2253, Rv2290, Rv2389c, Rv2626c,Rv2627c, Rv2779c, Rv2873, Rv2875, Rv3017c, Rv3407, Rv3804c, Rv3810 yRv3841.

31. 30.

    Mycobacterium según las reivindicaciones 8 y 9, método según las reivindicaciones 18 y 19 o preparación de vacuna según las reivindicaciones 27 ó 28, en los que el Mycobacterium es una cepa de Mycobacterium atenuada que expresa un gen de interés que codifica paraun antígeno parasitario derivado de Plasmodium spp., en particular, de Plasmodium falciparum.