ES2366796T3 - Adsorbentes que comprenden ligandos de coloranttes de antraquinona para la separación de materiales biológicos. - Google Patents

Adsorbentes que comprenden ligandos de coloranttes de antraquinona para la separación de materiales biológicos. Download PDF

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Abstract

Un proceso para la separación de materiales biológicos, donde se usa un adsorbente, el cual comprende un producto de reacción y un compuesto de la fórmula **Fórmula** y un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de fórmula (1) para formar un enlace covalente, en el cual B es un radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 10 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en -NR1- o -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo, R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1C4alquilen- C5-C9cicloalquileno o C1-C4alquilen-C5 C9cicloalquilen-C1-C4alquileno radical, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilen-fenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o 15 sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo, V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula **Fórmula** donde R2 es hidrógeno o C1-C4 alquilo no sustituido o sustituido o un radical **Fórmula** R3 es hidrógeno, hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi, ciano, halógeno, C1-C4alcoxicarbonilo, C1-C4-alcanoiloxi, carbamoilo o un grupo -SO2-Y, R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o ramificado, arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C120 C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2-CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y 25 n es un número 0 o 1, X es halógeno, y k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un adsorbente, que comprende un compuesto de fórmula **Fórmula** y Donde Q es sulfo o carboxi.

Description

La presente invención se relaciona con un proceso para la separación o purificación de materiales biológicos utilizando adsorbentes, que comprenden ligandos de colorantes de antraquinona, un proceso para la preparación de los adsorbentes y los adsorbentes.
Los colorantes reactivos son productos bien establecidos ampliamente utilizados en la industria de los textiles para la coloración de textiles celulósicos tale como algodón o viscosa. La molécula de un tal colorante reactivo puede verse como constituida de dos unidades entrelazadas cada una de las cuales tiene una función distinta. Una unidad es el cromóforo cuya función es impartir el color deseado y otras propiedades tintúrales al textil. La otra unidad es el grupo reactivo a la fibra, al cual, bajo condiciones de aplicación bien establecidas, reacciona químicamente con la celulosa para enlazar de forma covalente las moléculas de colorante al textil con el fin de producir un material teñido que es altamente resistente al proceso de lavado.
Mientras que los colorantes reactivos se desarrollaron inicialmente para resolver ciertos problemas encontrados en la tintura e impresión de materiales textiles celulósicos, a lo largo de los años han demostrado poseer propiedades que los hacen útiles por fuera del campo de la coloración textil.
Es bien conocido, por ejemplo, a partir de las patentes de los Estados Unidos Nºs 4,016,149 y 4,546,161, que estos colorantes pueden unirse por técnicas similares a sustratos de carbohidratos, tales como polímeros y copolímeros derivados de agarosa, dextrosa, dextranos, etc. Los productos de reacción de tales sustratos de carbohidratos y ciertos colorantes reactivos disponibles comercialmente se han utilizado en cromatografía de afinidad como adsorbentes para la separación o purificación cromatográfica de ciertos materiales proteináceos. Entre los colorantes textiles comerciales, que han sido utilizados como ligandos para separación de proteínas o enzimas, hay ciertos colorantes de antraquinona azules que comprenden una unidad estructural monoclorotriazina, tal como C.I. Azul Reactivo 2 (Cibacron Blue 3GA),
C.I. Azul Reactivo 5 y C.I. Azul Reactivo 49.
La US 6,638,740 divulga un proceso para la purificación de la proteína albúmina de suero humano por cromatografía de afinidad utilizando una resina que comprende un colorante inmovilizado del tipo Azul Reactivo, por ejemplo Azul Reactivo 2. Se proporciona albúmina altamente purificada. Sin embargo, ese documento se relaciona solamente con la purificación de dicha proteína individual.
La cromatografía de afinidad se basa en las afinidades diferenciales de las proteínas o enzimas por los ligandos de la fase estacionaria del adsorbente y crecientemente ha demostrado ser crucial en áreas de aplicación de alto nivel tales como productos biofarmacéuticos y de diagnóstico tal como se describe, por ejemplo, en WO 2004052870. La naturaleza de la interacción puede ser puentes de hidrógeno, fuerzas electroestáticas, apilamiento como resultado de geometría favorable o cualquier otro aspecto que promueva la relación ligando-objetivo. La interacción ligando-objetivo debería ser suficientemente fuerte para permitir el retiro de otras moléculas contaminantes de una muestra a la vez que mantiene el complejo ligando-objetivo intacto, esto es, las proteínas que tengan afinidad a los ligandos se enlazan a la matriz mientras que otras sin afinidad son lavadas. Las proteínas enlazadas pueden ser eludidas selectivamente bajo condiciones de pH, fuerza iónica y reguladores variables, tal como se describe, por ejemplo en P.D.G. Dean, W.S. Johnson y F.A. Middle (Ed), Affinity Chromatography: A Practical Approach, 1982. La mezcla de proteínas puede ser sometida a separación por agitación o pasando a través de una columna con el adsorbente.
La cromatografía de afinidad ha demostrado ser ventajosa en el fraccionamiento de sangre para captura fina y rápida de proteínas de las fracciones del plasma. La cromatografía de afinidad se aplica a las fracciones del plasma prepurificado por fraccionamiento clásico con etanol y/o por cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de afinidad está siendo utilizada en la producción industrial de diversos productos del plasma, tales como concentrados del factor VIII, factor IX, factor de von Willebrand, proteína C y Antitrombina III tal como se encuentra, por ejemplo, en T.Burnouf y M.Radosevich, J. Biochem. Biophys. Metods, 2001, 49, 575.
El Azul Cibacron 3GA ha sido bien estudiado en cuanto a sus interacciones con diversas proteínas y enzimas. Se ha observado que el colorante imita a la unidad estructural NAD+ y por lo tanto interactúa con las proteínas y enzimas que reconocen este sitio tal como lo describe, por ejemplo, S.Subramanian, CRC Critical Rev. Biochem., 1984, 16, 169. Se ha purificado albúmina exitosamente utilizando Azul de Cibracron 3GA inmovilizado a gran escala como se sabe, por ejemplo, a partir de M. Allary, J. Saint-Blancard, E. Boschetti y P. Girot, Bioseparation, 1991, 2, 167. El fraccionamiento de 27 proteínas de plasma se ha llevado a cabo con la ayuda de la cromatografía de afinidad utilizando Azul Cibacron 3GA inmovilizado sobre perlas de agarosa entrecruzada con un gradiente de pH como se describe, por ejemplo, en E.Gianazza y P.Arnaud, Biochem. J., 1982, 201, 129. La purificación de proteasa de serinas sobre Sefarosa Azul (Azul Cibacron 3GA inmovilizado sobre agarosa) también ha sido reportada. Se conoce, por ejemplo, de C. Koch, L. Borg, K. Skjodt y G. Hoven, J. Chromatogr. B., 1998, 718, 41 que la interacción de las proteasas de serina con Sefarosa Azul involucra el sitio activo de la enzima.
Los avances en biotecnología como la tecnología de fagos y el diseño ayudado por ordenador de ligandos artificiales ha llevado a desarrollos adicionales en la aplicación de cromatografía de afinidad para la purificación de proteínas tal como se describe, por ejemplo, en C.R. Lowe, A.R. Lowe y G. Gupta, J. Biochem. Biophys. Metods, 2001, 49, 561. Diversos ligandos sintéticos hechos a la medida, además de los bioligandos utilizados tradicionalmente tales como heparina,
5 gelatina, proteína A y proteína C, han provisto una productividad mejorada de las proteínas del plasma.
La aplicación de técnicas de ligandos artificiales para la purificación industrial de proteínas no ha sido impulsada hasta un nivel mayor y ha estado limitada primariamente al uso de Azul Cibacron 3GA. Puesto que el principio de la cromatografía de afinidad se basa en el fenómeno del reconocimiento molecular, las variaciones estructurales del ligando juegan un papel vital bien sea en la estabilización o desestabilización de las interacciones proteína-colorante.
10  Véase, por ejemplo, N. Lindner, R. Jeffcoat, C. Lowe, J. Chromatogr. 1989, 473, 227 y Y.D. Clonis, N.E. Labrou, V. Kotsira, C. Mazitsos, S. Melissis, G. Gogolas, J. Chromatogr. A, 2000, 891, 33. Las interacciones secundarias con un complejo ternario podían también haber producido un efecto profundo al exhibir afinidad hacia una proteína específica tal como se describe, por ejemplo, en N.E. Labrou, E. Eliopoulos, Y.D. Clonis, Biochem J., 1996,315,695.
De acuerdo con lo anterior, hay una necesidad de proveer adsorbentes colorante-ligando sintetizables fácilmente para
15  abordad diversos problemas de separación o purificación y para incrementar el alcance de los métodos confiables para la purificación de proteínas.
La presente invención se relaciona con un proceso para la separación de materiales biológicos, donde se usa un adsorbente, que comprende un producto de reacción de un compuesto de formula
Y un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de la formula (1) para formar un enlace covalente en el cual B es Radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en -NR1-o –O y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo, R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o B es un radical C5-C9cicloalquileno, Radical C1-C4alquilen-C5C9cicloalquileno o Radical C1-C4alquilen-C5-C9cicloalquilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, Radical C1-C4alquilen
30  fenileno o Radical C1-C4alquilen-fenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo, V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a las fibras de fórmula
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R3 es hidrógeno, hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi, ciano, halógeno, C1-C4alcoxicarbonilo, C1-C4-alcanoiloxi, carbamoilo o un grupo -SO2-Y, R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo,alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal
o ramificado, arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C1C4alquilo,C1-C4alcoxi o por halógeno,Y es vinilo o un radical -CH2-CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y n es un número 0
o 1, X es halógeno, y k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un adsorbente, que comprende un compuesto de la fórmula
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Como C1-C4alquilo en el radical B entran en consideración, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, secbutilo, tert-butilo o isobutilo, preferiblemente metilo o etilo, especialmente metilo.
Como C1-C4alcoxi en el radical B entran en consideración, por ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, tert-butoxi y isobutoxi, preferiblemente metoxi o etoxi, especialmente metoxi.
Como halógeno en el radical B entran en consideración, por ejemplo, flúor, cloro y bromo, preferiblemente cloro o bromo, especialmente cloro.
Como C2-C4alcanoilamino en el radical B entran en consideración, por ejemplo, acetilamino o propionilamino, 5 preferiblemente acetilamino.
Preferiblemente R1 es hidrógeno o metilo.
Un radical alquileno B es preferiblemente un radical C2-C6alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros –O- y es no sustituido o sustituido por hidroxil o sulfato. Se prefieren los radicales no sustituidos, en particular el radical de la fórmula
10 
Radicales B preferidos que contienen cicloalquileno son los correspondientes radicales que contienen ciclohexileno, los
15  cuales, en particular, son no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo. Un radical ciclohexileno o un radical metilenciclohexileno el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquilo, en particular un radical metilen-ciclohexileno el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquilo, se prefiere aquí en particular.
Radicales B preferidos que contienen fenileno los los radicales correspondientes que están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, halógeno o sulfo. Fenileno o metilen-fenilen-metileno los cuales están no sustituidos o
20  sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, halógeno o sulfo son preferidos en particular. Radicales especialmente preferidos son los de la fórmula
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B es preferiblemente un radical C2-C6alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxil o sulfato, o un radical ciclohexileno o un radical metilen-ciclohexileno el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquilo, o a fenileno o metilen-fenilen-metileno radical el cual es no sustituido o sustituido
30 por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, halógeno o sulfo.
B es en particular preferiblemente un radical C2-C6alquileno, un radical metilen-ciclohexileno el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquilo, o un radical fenileno o metilen-fenilen-metileno el cual es no sustituido o sustituido por C1C4alquilo, C1-C4alcoxi, halógeno o sulfo.
B es de forma especial preferiblemente
35 5 
imagen3
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Como C1-C4alquilo para R2 y R4, cada uno independientemente de los otros, entran en consideración, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, tert-butilo y isobutilo, preferiblemente metilo y etilo, y especialmente metilo. The mentioned radical R2 is unsubstituted o substituted, por ejemplo by halógeno, hidroxi, ciano, C1-C4alcoxi, C1C4alcoxicarbonilo, carboxi, sulfamoilo, sulfo o por sulfato, preferiblemente by hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi o por ciano.
10 Los radicales no sustituidos are preferred.
Cuando Y es un radical -CH2-CH2-U, el grupo saliente U puede ser, por ejemplo, -Cl, -Br, -F, -OSO3H -SSO3H OCOCH3, OPO3H2, -OCO-C6H5, OSO2-C1-C4alquilo o -OSO2-N(C1-C4alquil)2. U es preferiblemente un grupo de fórmula -CI, -OSO3H-SSO3H, -OCO-CH3, -OCO-C6H5 o -OPO3H2, especialmente -Cl o -OSO3H, y más especialmente -OSO3H.
Y es preferiblemente vinilo, β-cloroetilo, β-sulfatoetilo, β-tiosulfatoetilo, β-acetoxietilo, β-fenoxietilo o β-fosfatoetilo,
15  especialmente β-cloroetilo, β-sutfatoetilo o vinilo, más especialmente β-sulfatoetilo o vinilo, y muy especialmente vinilo. Hal es preferiblemente bromo. alk y alk1, cada uno independientemente del otro, son, por ejemplo, metileno, 1,2-etileno, 1,3-propileno, 1,4-butileno,
1,5-pentileno, 1,6-hexileno o un isómeros ramificado de los mismos alk y alk1, cada uno independientemente del otro, son preferiblemente un radical C1-C4alquileno, y especialmente un radical etileno o propileno.
20  Sigificados preferidos de arileno son un radical 1,3- o 1,4-fenileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, metilo o por metoxi, y especialmente un radical 1,3- o 1,4-fenileno no sustituido. R2 es preferiblemente hidrógeno, C1-C4alquilo o un radical de fórmula
25 
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donde R3, Y y alk en cada caso son como se definió más arriba y tienen los significados preferidos dados más arriba. R2 es especialmente hidrógeno, metilo o etilo, y muy especialmente hidrógeno.
R3 es preferiblemente hidrógeno.
R4 es preferiblemente hidrógeno, metilo o etilo, y especialmente hidrógeno.
30 La variable Q es preferiblemente -NH- o -O-, y especialmente -O-.
W es preferiblemente un grupo de fórmula -CONH- o -NHCO-, especialmente el grupo de fórmula -CONH-.
La variable n es preferiblemente el número 0.
Sustituyentes preferidos reactivos a la fibra V de fórmulas (2a) a (2f) son aquéllos donde R2 y R3 son cada uno hidrógeno, R4 es hidrógeno, metilo o etilo, Q es un radical -NH- o -O-, W es el grupo -CONH-, alk y alk1 son
35  independientemente uno del otro etileno o propileno, arileno es fenileno el cual es no sustituido o sustituido por metilo, metoxi o por sulfo, Y es vinilo, β-cloroetilo o β-sulfatoetilo, especialmente vinilo o β-sulfatoetilo, y muy especialmente vinilo, Y1 is -CHBr-CH2Br o -CBr=CH2 y n is el número 0; enre esos sustituyentes se da preferencia especial a los radicales de fórmulas (2c) y (2d).
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25 
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35 
Cuando V tiene el significado de un sustituyente reactivo a la fibra, se da preferencia muy especial a que V sea un grupo de fórmula
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especialmente (2c’), donde Y es como se definió más arriba y tiene los significados preferidos dados más arriba.
En el radical de fórmula (2c’), el átomo de nitrógeno puede ser sustituido por metilo o etilo en vez de hidrógeno.
Cuando V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos, puede ser, por ejemplo, hidroxi; C1-C4alcoxi; C1C4alquiltio el cual es no sustituido o sustituido por hidroxi, carboxi o por sulfo; amino; amino mono- o di-sustituido por C1C8alquilo, estanod el alquilo no sustituido o sustituido adicionalmente por por, por ejemplo, sulfo, sulfato, hidroxi, carboxi
o por fenilo, especialmente by sulfo o por hidroxi, y estando no interrumpido o interrumpido por un radical -O-; ciclohexilamino el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquil; morfolino; N-C1-C4alquil-N-fenilamino o fenilamino o naftilamino, estando el fenilo o naftilo no sustituido o sustituido por, por ejemplo, C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, carboxi, sulfo
o por halógeno.
Ejemplos de sustituyentes adecuados no reactivos a la fibra V son amino, metilamino, etilamino, β-hidroxietilamino, 2-(β hidroxietoxi)etilamino, N,N-di-β-hidroxietilamino, β-sulfoetilamino, ciclohexilamino, morfolino, o-, m- o p-clorofenilamino, o-, m- o p-metilfenilamino, o-, m- o p-metoxifenilamino, o-, m- o p-sulfofenilamino, disulfofenilamino, o-carboxifenilamino, 1- o 2-naftilamino, 1-sulfo-2-naftilamino, 4,8-disulfo-2-naftilamino, N-etil-N-fenilamino, N-metil-N-fenilamino, metoxi, etoxi, n- o iso-propoxi e hidroxi.
Como un radical no reactivo a la fibra se da preferencia a V con el signioficado de hidroxi;C1-C4alcoxi; C1-C4alquiltio el cual es no sustituido o sustituido por hidroxi, carboxi o por sulfo; amino; N-mono- o N,N-di-C1-C4alquilamino, el cual es no sustituido o sustituido en la unidad estructural alquilo por hidroxi, sulfato o por sulfo Y es no interrumpido o interrumpido por un radical -O-; morfolino; fenilamino o N-C1-C4alquil-N-fenilamino, donde each fenilo ring es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, cloro, acetilamino, metilo o por metoxi y donde the alquilo es no sustituido o sustituido por hidroxi, sulfo o por sulfato; o naftilamino el cual es no sustituido o sustituido por de 1 a 3 grupos sulfo.
Especialmente preferred as a non-fibre-reactive radical V corresponde a amino, N-mono- o N,N-di-C1-C4alquilamino el cual es no sustituido o sustituido en la unidad estructural alquilo por hidroxi, sulfato o por sulfo Y es no interrumpido o interrumpido por un radical -O-, morfolino, fenilamino o N-C1-C4alquil-N-fenilamino el cual es no sustituido o sustituido en el anillo fenilo por sulfo, carboxi, cloro, acetilamino, metilo o por metoxi, o naftilamino el cual es no sustituido o sustituido por de 1 a 3 grupos sulfo.
Radicales no reactivos a la fibra especialmente importantes V son β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino, N, Ndi-β hidroxietilamino, β-sulfoetilamino, morfolino, 2-, 3- o 4-sulfofenilamino, 1-sulfonaft-2-il-amino o 3,7-disulfonaft-2-ilamino.
k es preferiblemente el número 0.
m es preferiblemente el número 1.
X es, por ejemplo, flúor, cloro o bromo, preferiblemente flúor o cloro, y especialmente cloro.
En una reaización preferida de la presete invención el compuesto de fórmula (1) corresponde a un compuesto de
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fórmula
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donde B es un radical C2-C6alquileno, un radical metilen-ciclohexileno, el cual es no sustituido o sustituido por C1C4alquilo, o a fenileno o metilen-fenilen-metileno radical, el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquilo, C1C4alcoxi, halógeno o sulfo, V is amino, N-mono- o N,N-di-C1-C4alquilamino el cual es no sustituido o sustituido en la unidad estructural alquilo por hidroxi, sulfato o por sulfo Y es no interrumpido o interrumpido por un radical -O-, morfolino, fenilamino o N-C1-C4alquil-Nfenilamino el cual es no sustituido o sustituido en el anillo fenilo por sulfo, carboxi, cloro, acetilamino, metilo o por metoxi, o naftilamino el cual es no sustituido o sustituido por de 1 a 3 grupos sulfo, o V es un grupo de fórmula (2c’) o (2d’) as defined above.
En una realización preferida en particular de la presente invención el compuesto de fórmula (1) corresponde a un compuesto de fórmula (1a) como se indicó más arriba, donde B es un radical
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Una variación estructural del compuesto de formula (1) puede tenerse en cuenta para problemas particulares de separación o purificación.
El sustrato o matriz usado para preparar los adsorbentes aplicados de acuerdo con la presente invención pueden ser sustancialmente insolubles en agua. Como ejemplos de los dichos sustratos pueden mencionarse polímeros acrílicos, tales como poliacrilamidas o hidroxialquilmetacrilatos, y copolímeros de estos materiales, óxidos metálicos, tales como zirconia, titania o alúminia, sílica o vidrio poroso, pero el soporte sólido insoluble en agua preferido es un sustrato polimérico que tiene una pluralidad de grupos hidroxilo a los cuales puede enlazarse el compuesto de formula (1) a través del grupo reactivo. Sustratos especialmente adecuados son carbohidratos y carbohidratos modificados. Ejemplos de un sustrato carbohidrato adecuado son agarosa, agarosa entrecruzada, dextrosa, dextranos y versiones modificadas de los mismos, tales como los que están disponible en forma de “Sepharose” y geles de “Sephadex” (“Sepharose” y “Sephadex” son marcas registradas de GE Healthcare) y están descritos en GB 1,540,165. Otros sustratos poliméricos son poliamidas. Sustratos especialmente preferidos son agarosa y agarosa entrecruzada.
Los adsorbentes aplicados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por técnicas estándar, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de la formula (1) con un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de la formula (1) para formar un enlace covalente, por ejemplo, un sustrato carbohidrato, en presencia de un agente de enlazamiento ácido, tal como un hidróxido o carbonato de metal alcalino, por ejemplo, hidróxido de sodio o carbonato de sodio, donde las variable se definen y se prefieren como se indicó mas arriba.
Los métodos para la preparación de tales adsorbentes y columnas cromatográficas que los contienen están bien documentados, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nº’s 4,016,149 y 4,546,16. Por lo tanto, estos documentos serán incorporados como referencia.
Como ya se indicó, el sustrato o matriz, por ejemplo, agarosa, agarosa entrecruzada, dextrosa o dextranos, puede modificarse adicionalmente mediante la introducción de espaciadores de longitud variable, ventajosamente, antes de enlazar covalentemente el compuesto de la formula (1) a los espaciadores. Los espaciadores pueden permitir la interacción incrementada de colorante-ligandos con el material proteináceo que va a ser purificado, debido a una accesibilidad mejorada de colorante-ligandos, mejorando por lo tanto la selectividad y la eficiencia de los adsorbentes.
La introducción de los espaciadores se lleva a cabo, por ejemplo, por tratamiento del sustrato con epiclorhidrina en
5 
10 
15 
20 
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35 
40 
45 
50 
presencia de un agente enlazador ácido, tal como un hidróxido o carbonato de metal alcalino, por ejemplo hidróxido de sodio o carbonato de sodio, y subsecuentemente con una poliamina, bajo temperaturas adecuadas de, por ejemplo 20 a 80 ºC, preferiblemente 20 a 50 ºC.
Compuestos de poliamina adecuados para la introducción de espaciadores pueden seleccionarse del grupo consistente de poliaminas aromáticas, poliaminas alifáticas y poliaminas alicíclicas. Ejemplos típicos incluyen polivinilamina, polivinilimina, 1,2-etilendiamina, hidrazina, hidrazina-2-bis-(3-aminopropil)-amina, 1,4-diaminociclohexano, 3-amino-1
metilaminopropano, N-hidroxietiletilendiamina, N-metil-bis-(3-aminopropil)-amina, tetraetilendiamina, 1,4-diaminobutano, 1,6-hexametilendiamina, 1,8-diaminooctano, 1-aminoetil-1,2-etilendiamina, dietilentriamina, tetraetilenpentamina, pentaetilenhexamina, fenilendiamina, toluilendiamina, 2,4,6-triaminotoluen-trihidrocloruros,1,3,6-triaminonaftaleno, isoforondiamina, xililendiamina, xililendiamina hidrogenada, 4,4’-di-diaminofenilmetano, 4,4’-diaminodifenilmetano hidrogenado, y derivados de estos monómeros de poliamina.
Se prefieren las poliaminas alifáticas y/o alicíclicas. Se prefieren especialmente diaminas alifáticas y/o alicíclicas. Pueden mencionarse en particular la 1,4-diaminobutano, 1,6-hexametilendiamina y 1,8-diaminooctano. Las poliaminas pueden utilizarse individualmente o como mezclas de al menos dos poliaminas.
El material biológico puede ser cualquier material que se enlace específicamente a los compuestos de la formula (1) empleados en el proceso de la presente invención, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, proteínas, nucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos, esteroides, lípidos, hormonas. En general sin embargo, la sustancia biológica o relacionada será una enz--ima, proteína o polipéptido, por ejemplo, albúmina, peptidasas, fosfatasas, quinasas tales como gliceroquinasa, exoquinasa o uroquinasa, nucleasas, tales como endonucleasas o ribonucleasas de restricción, deshidrogenasas, tales como gliceraldeido-3-fosfato deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, deshidrogenasa de alcohol del hígado o glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, estearasas, sintetasas, proteínas de enlazamiento y receptores de ADN o ARN.
El adsorbente que comprende el compuesto de la fórmula (1) enlazado a un soporte sólido puede estar en la forma de una columna para propósitos de separación cromatográfica o en la forma de una membrana para permitir la separación que va a llevarse a cabo en un formato de separación por membrana.
La separación o proceso de purificación de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo tratando, por ejemplo, agitando, el material biológico en presencia del adsorbente que comprende el compuesto de la fórmula (1) en un ambiente acuoso de pH y fuerza iónica adecuados, separando el adsorbente, por ejemplo, por filtración, y eluyendo las proteínas enlazadas del adsorbente por una variación adecuada del pH y la fuerza iónica.
Ventajosamente, el proceso de separación o purificación de acuerdo con la presente invención se lleva a cabo mediante cromatografía de afinidad, la cual comprende:
a) La fase de contacto, donde una mezcla que contiene el material biológico se pone en contacto con el
adsorbente que comprende el compuesto de la fórmula (1) retenido sobre una columna cromatográfica.
b) La fase de lavado, donde las especies no enlazantes se retiran del adsorbente que comprende el
compuesto de la fórmula (1) haciendo pasar una solución de lavado a través del mismo, y
c) La fase de elución, donde una solución eluyente se pasa a través del adsorbente que comprende el
compuesto de la fórmula (1) para recuperar el material biológico deseado detenido desde la columna.
Mediante la selección cuidadosa del material de enlazamiento, de la solución de lavado y de solución de elución puede lograrse una purificación en una etapa de mezclas complejas de material biológico.
De acuerdo con otra aspecto de la presente invención se proporciona un adsorbente que comprende el aducto de un compuesto fórmula (1) tal como se definió más arriba y un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de la fórmula (1) para formar un enlace covalente, donde las variables se definen y se prefieren como se indicó más arriba.
Los adsorbentes de acuerdo con la presente invención son materiales altamente puros, desprovistos de comportamiento de perdida de colorante y contienen diversos niveles de concentraciones colorante-ligandos sobre la matriz. Adicionalmente, los adsorbentes de acuerdo con la presente invención son química y térmicamente estables y altamente selectivos y proporcionan diversas estructuras colorante-ligandos disponibles para selección en la cromatografía de afinidad colorante-ligando.
El rango de estructuras de colorante disponibles para la selección es un avance significativo en la cromatografía de afinidad colorante-ligando. Adicionalmente, la interacción con estas variantes estructurales podría involucrar el sitio activo de una proteína (T.Burnouf, H.Goubran, M. Radosevich, J. Chromatogr. B, 1998, 715, 65) o la interacción podría ser en cualquier lugar de la proteína (B.M.Hayden y P.C.Engel, Eur. J. Biochem., 2001, 268, 1173). Un potencial para ambos modos de enlazamiento mediante el conjunto de adsorbentes los convierte en un recurso valioso en el desarrollo de protocolos de purificación de proteínas para casi cualquier proteína de interés.
Algunos de los colorantes-ligandos utilizados de acuerdo con la presente invención son nuevos. De acuerdo con lo anterior, la presente invención se relaciona también con los compuestos de las fórmulas
imagen3
y
10 
imagen3
donde 15 V1 is β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino o morfolino, V2 y V3 cada uno independientemente del otro
son β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino, N,N-di-β-hidroxietilamino o morfolino, y Q es el número 0, 1, 2 o 3, preferiblemente 0 o 3. Se prefieren los compuestos de las fórmulas
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imagen3
Los colorantes-ligandos pueden prepararse de forma análoga a los procedimientos conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención. Las temperaturas se dan en grados Celsius. A menos que se 5 indique otra cosa, las partes son partes en peso y el porcentaje se refiere al porcentaje en peso. Las partes en peso se relacionan con las partes en volumen en una proporción de quilogramos a litros.
Preparación de los colorantes-ligandos
Ejemplo 1:
a) Se dispersan 20.17 partes de cloruro cianúrico en 100 partes de agua y 100 partes de hielo. Se
10  disuelven en forma neutra 19.26 partes de ácido 2-aminobenceno sulfónico con hidróxido de sodio en 70 partes de agua. La solución neutra, así obtenida, se agrega a la dispersión anterior de cloruro cianúrico toda de una vez y el valor de pH se mantiene en 3 durante una hora por medio de una solución acuosa de hidróxido de sodio (30%). Subsecuentemente, se incrementa el valor de pH en etapas hasta 6 y se mantiene durante un par de horas por la adición gota a gota de una solución
15 acuosa de hidróxido de sodio (30%). La temperatura se mantiene a 0-5ºC durante unas pocas horas. b) Se disuelven 40.35 partes del compuesto, al cual en la forma del ácido libre corresponde la fórmula
20 
imagen3
en 200 partes de agua y se agrega todo a la vez a la solución obtenida de acuerdo con la etapa (a). El valor de pH se eleva a 8.4-8.6 inmediatamente mediante la adición de una solución acuosa de hidróxido de sodio (30%) y la temperatura se deja incrementar hasta 20ºC. Estas condiciones se mantienen durante un par de horas. La mezcla de reacción se neutraliza, se libera de sales inorgánicas por diálisis y se concentra por evaporación. El producto se seca y se recolectan 94.3 g de un compuesto, el cual en la forma de un ácido libre corresponde la fórmula
imagen3
Ejemplo 2:
a) Se dispersan 19.36 de cloruro cianúrico en 50 partes de agua y 60 partes de hielo. Se disuelven de forma neutra 48.95 partes de un compuesto, el cual en la forma de ácido libre corresponde a la 5 fórmula
10 
imagen3
con hidróxido de sodio en 350 partes de agua. La solución neutra, así obtenida, se agrega a la dispersión anterior de cloruro cianúrico a lo largo de 20 minutos a la vez que se mantiene el valor de pH en 5 por adición gota a gota de una solución acuosa de hidróxido de sodio (30%). La mezcla de reacción se mantiene en pH 6 y la temperatura se mantiene a 0-2 ºC durante un par de horas.
15 b) Se agregan 9.58 parte de morfolina a la solución obtenida de acuerdo con la etapa (a). El valor de pH se eleva a 9 inmediatamente por adición de una solución acuosa de hidróxido de sodio (30%) y la temperatura se incrementa a 60º C. Estas condiciones se mantienen durante un par de horas. Se neutraliza la mezcla de reacción, se libera de sales inorgánicas por diálisis y se concentra por evaporación. El producto se seca y se recolectan 93.1 g de un compuesto el cual en la forma del
20  ácido libre corresponde a la fórmula
imagen8
Ejemplo 3:
a) Se dispersan 12.9 partes de cloruro cianúrico en 50 partes de agua y 50 partes de hielo. Se disuelven en forma neutra 38.42 partes de un compuesto, el cual en la forma del ácido libre corresponde a la fórmula
5 
10 
15 
5 y la temperatura se mantiene a 0º C durante un par de horas b) Se agregan 4.70 partes de etanolamina a la solución obtenida de acuerdo con la etapa (a). El valor de pH se eleva a 9 inmediatamente por adición de una solución acuosa de soda (20%) y la temperatura se 20 incrementa a 50 ºC. Estas condiciones se mantienen durante un par de horas.
c) Se agregan 35 partes de cloruro de sodio a 1750 partes de la mezcla de reacción. Después de 30 minutos, la suspensión se filtra y se seca. Se recolectan 44 partes de un compuesto, el cual en la forma del ácido libre corresponde a la fórmula
25 
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35 
Ejemplo 4: a) Se dispersan 19.36 partes de cloruro cianúrico en 50 partes de agua y 60 partes de hielo. Se disuelven de forma neutra 48.95 partes de un compuesto el cual en la forma del ácido libre corresponde a la fórmula
40 
imagen3
45 
b) 16 con hidróxido de sodio en 500 partes de agua. La solución neutra, así obtenida, se agrega a la dispersión anterior de cloruro cianúrico durante 45 minutos a la vez que se mantiene el valor de pH en 5 por adición gota a gota de una solución acuosa de hidróxido de sodio (30%). La mezcla de reacción se mantiene a pH 5 y la temperatura se mantiene a 0º C durante un par de horas. Se agregan 6.72 partes de etanolamina a la solución obtenida de acuerdo con la etapa (a). El valor de pH se eleva a 8.5 inmediatamente por adición de una solución acuosa de soda (20%) y la temperatura se incrementa a 40º C. Estas condiciones se mantienen durante un par de horas.
imagen11
c) Se agregan 150 partes de cloruro de sodio a 2000 partes de la mezcla de reacción. Después de 30 minutos la suspensión se filtra y se seca. Se recolectan 88 partes de un compuesto, el cual en la forma del ácido libre corresponde a la fórmula
Ejemplo 5:
a) Se dispersan 7.75 partes de cloruro cianúrico en 30 partes de agua y 40 partes de hielo. Se disuelven en forma neutra 19.58 partes de un compuesto el cual en la forma del ácido libre corresponde a la fórmula
15 
20 
25 
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con hidróxido de sodio en 200 partes de agua. La solución neutra, así obtenida, se agrega a la dispersión anterior de cloruro cianúrico durante 45 minutos a la vez que se mantiene el valor de pH en 5 por adición gota a
30  gota de una solución acuosa de hidróxido de sodio (30%). La mezcla de reacción se mantiene a pH 5 y la temperatura se mantiene a 0º C durante un par de horas.
b) Se disuelven previamente 13.61 partes de un compuesto, el cual en la forma del ácido libre corresponde a la fórmula
35 
40  con una solución acuosa de soda (20%) a pH 5 se agrega a la solución obtenida de acuerdo con la etapa (a). imagen3 El valor de pH se eleva a 7 inmediatamente por adición de una solución acuosa de soda (20%) y la temperatura se deja incrementar hasta 20º C. Estas condiciones se mantienen durante la noche. Se seca el producto.
c) Se forma una pasta con 98.6 partes del producto seco obtenido con (b) con 35 partes de una solución de 45 cloruro de sodio (5%). Subsecuentemente, se agregan 2 porciones de 17.5 partes de cloruro de sodio y dos porciones de 100 partes de acetona. La suspensión se agita durante 30 minutos se filtra y seca. Se recolectan
76.56 partes de un compuesto, el cual en la forma del ácido libre corresponde a la fórmula
imagen3
Ejemplos 6 a 25:
De una forma análoga a la descrita en los ejemplos 1 a 5 es posible obtener los colorantes-ligandos de las fórmulas
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imagen11
imagen7
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y
imagen12
Preparación de los Adsorbentes
5  Se lava gel de agarosa (6% entrecruzada [CL], 3 g) con agua (70 ml) y se agregan a una solución del colorante-ligando (30-60 mol) en agua (3-9 ml). La mezcla se agita durante 5 minutos y se agregan 220 g/l de solución de cloruro de sodio (0.6 ml) después de 30 minutos adicionales de agitación, se agrega lentamente carbonato de sodio 1.5 g a la suspensión anterior y se agita suavemente a 180 rpm a 60º C durante 2-16 h. La mezcla se deja enfriar, se filtra y el sólido se lava sucesivamente con agua (300 ml), cloruro de sodio acuoso 1 M (150 ml), DMSO-agua 1:1 p/p (30ml),
10  cloruro de sodio acuosa 1 M (150 ml), soluciones reguladoras (90 ml) cada una de pH 3, pH 9 y agua (300 ml). El Adsorbente drenado se almacena en metanol al 20% v/v a 4 ºC.
Las densidades del colorante ligando se calculan utilizando análisis diferencial (colorante sin reaccionar en el filtrado) o análisis por gel de acuerdo con el procedimiento siguiente.
El adsorbente (0.1 g, peso húmedo según filtra) se digiere durante una hora a 40º C en HCl 6M (25 ml) y las
15  densidades del ligando de los adsorbentes se estiman a partir de la absorbancia (a λmax) del digerido de HCl por medio de soluciones estándar con una cantidad conocida del colorante-ligando.
En algunos casos se utiliza NaOH como base en vez de carbonato de sodio y también se altera el tiempo.
Los resultados se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1: Inmovilización directa
Muestra
Agarosa Colorante de Fórmula Base Tiempo de Tratamiento Densidad Colorante-Ligando [mol/g]
BS -101
6% C L -105 Na2CO3 2 h 7.9
BS -102
4 % CL -105 Na2CO3 2 h 8.9
BS -103
6 % CL -108 Na2CO3 2 h 4.3
BS -104
6 % CL -201 Na2CO3 2 h 8.0
BS -105
4 % CL -201 Na2CO3 2 h 12.7
BS -106
6 % CL -110 Na2CO3 2 h 5.3
(continuación)
Muestra
Agarosa Colorante de Fórmula Base Tiempo de Tratamiento Densidad Colorante-Ligando [�mol/g]
BS -107
6 % CL (109) Na2CO3 2 h 7.6
BS -201
6 % CL (104) Na2CO3 4 h 2.4
BS -301
6 % CL (103) Na2CO3 16 h 8.1
BS -302
6 % CL (115) Na2CO3 2 h 6.0
BS -109
6 % CL (106) NaOH 4 h 8.9
BS -305
6 % CL (114) NaOH 4 h 1.7
BS -306
6 % CL (116) NaOH 16 h 5.5
BS -401
6 % CL (117) Na2CO3 2 h 5.7
BS -402
6 % CL (119) Na2CO3 2 h 7.5
BS -404
6 % CL (120) Na2CO3 16 h 5.0
BS -204
6%CL (112) Na2CO3 4 h 6.2
BS -203
6 % CL (111) Na2CO3 4 h 6.2
BS -205
6 % CL (113) Na2CO3 16 h 6.8
BS -113
6 % CL (107) Na2CO3 2 h 4.5
BS -501
6 % CL (101) Na2CO3 4 h 6.0
BS -502
6 % CL (125) NaOH 4 h 7.1
BS -503
6 % CL (121) Na2CO3 4 h 4.9
BS -504
6 % CL (122) Na2CO3 4 h 3.7
BS -408
6 % CL (118) Na2CO3 16 h 6.2

Ejemplo 27 (protocolo para la síntesis de una adsorbente a través de inmovilización directa):
Se lava gel de agarosa (6% entrecruzado, 3 g) con agua (70 ml) y se agrega a una solución de un colorante-ligando de fórmula
imagen3
(0.465 g, 60 mol) en agua (3 ml) la mezcla se agita durante 5 minutos y se agregan 220 g/l de solución de cloruro de sodio (0.6 ml) después de 30 minutos adicionales de agitación, se agrega lentamente carbonato de sodio (1.5) a la suspensión anterior y se agita suavemente a 180 rpm a 60º C durante 2 horas. La mezcla se deja enfriar, se filtra y el
5  sólido se lava sucesivamente con agua (30 ml), cloruro de sodio acuoso 1M (150 ml), DMSO-agua 1:1 v/v (30 ml), cloruro de sodio 1M (150 ml), soluciones reguladoras (90 ml) cada una pH 3, pH 9 y agua (300 ml). El adsorbente drenado se almacena en metanol al 20% v/v a 4 ºC.
El adsorbente (0.1 g, peso húmedo según se filtra) se digiere durante una hora a 40º C en HCl 6M (25 ml) y la densidad del ligando del adsorbente se estima a partir de la absorbancia (a λmax) del digerido de HCl como 8.0 mol/g de gel de
10  drenado.
El Ejemplo 27 es para propósitos de ilustración. El colorante-ligando de la fórmula (201) está excluido del alcance de la fórmula genérica (1) de acuerdo con la presente invención.
Ejemplo 28 (protocolo general para la síntesis de adsorbentes a través de espaciadores):
Se lava gel de agarosa (6% entrecruzado, 14 g) con agua (300 ml) y se suspende inmediatamente en agua (56 ml) en
15  un RB adecuado o un matraz cónico. Se agrega epiclorhidrina (6.72 a 25.2 mmol) seguida por una cantidad equivalente de NaOH (6.72 a 25.2 mmol) y la masa de reacción se agita a 150 rpm durante 3 horas a 27 °C. Entonces se filtra la suspensión, se lava exhaustivamente con agua (850 ml) y se drena para obtener agarosa activada con epoxi.
La agarosa activada con epoxi (13 g) se agrega a una solución de 1,6-diaminoalcan (6.24 a 9.36 mmol) en agua (52 ml). La mezcla de reacción se agita durante 4 horas a 27º C o 45° C y se filtra. El gel funcionalizado con amino resultante se
20  lava exhaustivamente con agua (750 ml) y se drena.
La agarosa funcionalizada con amino (4 g) se suspende en una solución de colorante-ligando (80 mol) en agua (16 ml) y la mezcla se agita a 150 rpm durante 16 horas a 27 °C. La suspensión se filtra y se lava el exceso de colorante-ligando con agua (250 ml), NaCl 1M (100 a 200 ml), DMSO-agua 1:1 v/v (60 a 80 ml), NaCl 1M (100 a 200 ml) y finalmente agua (250 ml). El adsorbente drenado se almacena en metanol al 20% v/v a 4°C.
25  Las densidades de los colorantes-ligando se calcularon utilizando análisis diferencial (colorantes sin reaccionar en el filtrado) o análisis por gel de acuerdo con el siguiente procedimiento.
El adsorbente (0.1 g, peso húmedo según se filtra) se digiere durante 1 hora a 40°C en HCl 6M (25 ml) y las densidades del ligando del adsorbente se estiman a partir de la absorbancia (a λmax) del digerido en HCl por medio de soluciones estándar con una cantidad conocida del colorante-ligando.
30  Los resultados se presentan en las Tablas 2 y 3.
Tabla 2: Inmovilización indirecta a través de espaciadores (continuación)
Muestra
Colorante de Fórmula Epiclorhidrina [mol/g] Diaminohexano [mol/g] Densidad/Colorante-Ligando [mol/g]
BS-111
-201 480 480 2.6
BS-112
-110 480 480 7.7
BS-114
-106 480 480 3.0
BS-115
-107 480 480 2.4
BS-116
-108 480 480 4.1
BS-118
-109 480 480 6.7
BS-308
-114 480 480 3.9
BS-309
-115 480 480 4.7
BS-310
-116 480 480 3.6
BS-409
-117 480 480 4.5
BS-410
-118 480 480 4.3
BS-411
-119 480 480 4.3
BS-412
-120 480 480 4.5
BS-505
-101 480 480 3.6
BS-506
-121 480 480 3.9
BS-507
-122 480 480 2.9
BS-211
-104 720 720 4.5
BS-212
-111 720 720 3.4
BS-213
-112 720 720 5.1
BS-214
-113 720 720 5.1
BS-314
-103 720 720 10.0
BS-508
-125 720 720 5.5
BS-124
-105 1800 480 15.3
BS-125
-106 1800 480 16.2
BS-126
-107 1800 480 13.3
BS-219
-104 1800 480 8.6
Muestra
Colorante de Fórmula Epiclorhidrina [�mol/g] Diaminohexano [�mol/g] Densidad/Colorante-Ligando [�mol/g]
BS-220
-111 1800 480 7.1
BS-221
-112 1800 480 8.8
Agarosa entrecruzada (CL) al 6% utilizada como soporte para todos los adsorbentes
Tabla 3: Inmovilización indirecta a través de espaciadores
Muestra
Colorante de Fórmula Diaminoalcano Densidad/ Colorante-Ligando [μmol/g]
BS-151
(106) Diaminoetano 4.4
BS-152
(107) Diaminoetano 3.7
BS-153
(109) Diaminoetano 5.2
BS-335
(116) Diaminoetano 5.1
BS-433
(118) Diaminoetano 3.4
BS-434
(120) Diaminoetano 1.7
BS-522
(122) Diaminoetano 2.9
BS-245
(111) Diaminoetano 1.7
BS-246
(112) Diaminoetano 2.7
BS-334
(103) Diaminoetano 6.3
BS-521
(125) Diaminoetano 6.1
BS-148
(106) Diaminobutano 7.7
BS-149
(107) Diaminobutano 6.5
BS-150
(109) Diaminobutano 9.6
BS-333
(116) Diaminobutano 9.5
BS-431
(118) Diaminobutano 8.4
BS-432
(120) Diaminobutano 10.0
BS-520
(122) Diaminobutano 6.5
(continuación)
5 
10 
15 
BS-242
(111) Diaminobutano 2.8
BS-243
(112) Diaminobutano 4.4
BS-332
(103) Diaminobutano 10.3
BS-519
(125) Diaminobutano 4.5
BS-145
(106) Diaminooctano 11.3
BS-146
(107) Diaminooctano 10.1
BS-147
(109) Diaminooctano 14.8
BS-331
(116) Diaminooctano 14.3
BS-429
(118) Diaminooctano 12.5
BS-430
(120) Diaminooctano 16.0
BS-518
(122) Diaminooctano 11.6
BS-239
(111) Diaminooctano 5.5
BS-240
(112) Diaminooctano 8.4
BS-330
(103) Diaminooctano 12.5
BS-517
(125) Diaminooctano 11.6
20  Ejemplo 29 (protocolo para la síntesis de un adsorbente a través de espaciadores):
Se lava gel de agarosa (6% entrecruzado, 14 g) con agua (300 ml) y se suspende inmediatamente en agua (56 ml) en un matraz RB de 100 ml. Se agrega epiclorhidrina (0.6216 g, 6.72 mmol) seguida por NaOH (0.268 g, 6.72 mmol) y la mezcla de reacción se agita a 150 rpm durante 3 horas a 27 °C. Luego se filtra la suspensión, se lava exhaustivamente con agua (850 ml) y se drena para obtener agarosa activada con epoxi.
25  La agarosa activada con epoxi (13 g) se agrega a una solución de 1,6-diaminohexano (0.7612 g, 6.56 mmol) en agua (52 ml). La mezcla de reacción se agita durante 4 horas a 27° C y se filtra. El gel resultante funcionalizado con amino se lava exhaustivamente con agua (750 ml) y se drena.
La agarosa funcionalizada con amino (4 g) se suspende en una solución de colorante-ligando de fórmula (106) (0.0537
g, 81.1 mol) en agua (16 ml) y la mezcla de reacción se agita a 150 rpm durante 16 horas a 27° C. La mezcla de
30  reacción se filtra y el exceso de colorante-ligando se lava con agua (250 ml), NaCl 1M (100 ml), DMSO-agua 1:1 v/v (60 ml), NaCl 1M (100 ml) y finalmente agua (250 ml). El adsorbente drenado se almacena en metanol al 20% v/v a 4° C.
El adsorbente (0.1 g, peso húmedo según se filtra) se digiere durante 1 hora a 40°C en HCl 6M (25 ml) y la densidad del ligando del adsorbente se estiman a partir de la absorbancia (a λmax) del digerido en HCl como 3.0 mol/g de gel drenado.
35  Purificación de Materiales Biológicos:
La prueba de los adsorbentes para determinar su efectividad en la purificación de proteínas se hace principalmente con dos clases de enzimas. Las clases de enzimas representativas oxidoreductasa e hidrolasa se utilizan para evaluar la eficacia de los adsorbentes. Estos ejemplos de proteínas incluyeron lacasa-NADP-glutamato deshidrogenasa (NADPGDH) (S.Noor y N.S.Punekar, Microbiology, 2005, 151, 1409), arginasa y tripsina. Excepto para la tripsina todas las otras enzimas son de origen fúngico.
5  La selección de todos los adsorbentes se lleva a cabo en un modo de enlazamiento por lote y elución. Los adsorbentes con diversidad estructural son selectivos y claramente discriminan entre las diferentes proteínas probadas. Por ejemplo, bajo un conjunto de condiciones de equilibrio, la NADP-GDH se enlaza selectivamente a BS-212 y BS-213. Uno de estos puede utilizarse en un purificación en escalas. Esta NADP-GDH sin embargo no se enlaza con el colorante de triazina Azul Cibracon 3GA usado extensamente (S.Subramanian, CRC Critical Rev. Biochem., 1984, 16, 169).
10  Tabla 4: Inmovilización directa: Resultados de prueba para adsorbentes seleccionados
Muestra
Actividad Enzimática Enlazada/Eluida (del % cargado)
Lacasa
NADP-GDH
BS-101
33 27
BS-103
42 7
BS-104
0 11
BS-106
42 5
BS-107
17 29
BS-113
9 21
BS-201
18 6
BS-203
9 0
BS-204
18 0
BS-205
0 26
BS-301
8 8
BS-302
24 6
BS-305
31 0
BS-306
0 4
BS-401
16 0
BS-402
24 0
BS-403
16 11
BS-404
31 0
BS-408
42 0
(continuación)
Muestra
Actividad Enzimática Enlazada/Eluida (del % cargado)
Lacasa
NADP-GDH
BS-501
37 9
BS-502
0 0
BS-503
23 6
BS-504
44 0
Tabla 5: Inmovilización indirecta (espaciador ECH-DAH): Resultados de prueba para adsorbentes seleccionados: (continuación)
Muestra
Actividad Enzimática Enlazada/Eluida (del % cargado)
Lacasa
NADP-GDH
BS-111
50 21
BS-112
25 20
BS-114
59 23
BS-115
75 17
BS-116
76 19
BS-118
85 5
BS-211
82 70
BS-212
90 77
BS-213
96 57
BS-214
96 59
BS-308
78 10
BS-309
80 7
BS-310
83 7
BS-314
92 14
BS-409
69 12
Muestra
Actividad Enzimática Enlazada/Eluida (del % cargado)
Lacasa
NADP-GDH
BS-410
81 14
BS-411
83 0
BS-412
69 25
BS-505
82 0
BS-506
83 0
BS-507
85 0
BS-508
78 57
Tabla 6: Inmovilización directa (espaciadores ECH- DAE, ECH-DAB, ECH-DAO): Resultados de prueba: (continuación)
Muestra
Actividad Enzimática Enlazada/Eluida (del % cargado)
Lacasa
Arginasa
BS-151
34 47
BS-152
36 46
BS-153
21 37
BS-335
30 64
BS-433
30 72
BS-434
25 71
BS-522
36 55
BS-245
23 44
BS-246
13 72
BS-334
23 65
BS-521
36 42
BS-148
74 40
BS-149
83 42
Muestra
Actividad Enzimática Enlazada/Eluida (del % cargado)
Lacasa
Arginasa
BS-150
71 38
BS-333
41 55
BS-431
39 64
BS-432
42 67
BS-520
57 51
BS-242
56 54
BS-243
42 62
BS-332
48 56
BS-519
51 44
BS-145
77 35
BS-146
94 43
BS-147
69 32
BS-331
42 56
BS-429
53 63
BS-430
45 69
BS-518
54 50
BS-239
60 48
BS-240
64 64
BS-330
40 55
BS-517
52 39
Ejemplo 30
5 Procedimiento General (Aspergillus terreus NADP-glutamato deshidrogenasa):
El hongo se cultiva sobre un medio mínimo (con nitrato como fuente de nitrógeno) hasta una fase logarítmica media y las micelios se recolectan por filtración. El extracto crudo de NADP-GDH de estas células se prepara en un regulador de extracción (fosfato 100 mM, PMSF 1mM, EDTA 1mM, 2-mercaptoetanol 4 mM) a pH 7.4. La fracción de sulfato de amonio de 30-70% se desaliniza sobre una matriz G-25 y se utiliza para las pruebas. La actividad se monitoriza 10 mediante la oxidación continua de NADPH a 340 nm. Una unidad de actividad (U se define como una mol de NADPH oxidada por minuto en una prueba estándar de un ml. En todos los estudios de enlazamiento se aplican
5 
10 
15 
20 
25 
30 
35 
40 
45 
50 
aproximadamente 100 mU de NADP-GDH de muestra a las resinas de afinidad.
Modo por lote en tubo de microcentrífugas: el adsorbente (0.3 ml, volumen empacado) se equilibra con un regulador de cromatografía (fosfato 20 mM, EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol 4 mM) a pH 7.5 en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Se aplica la muestra de NADP-GDH cruda (aproximadamente 100 mU en aproximadamente 100 l) sobre esta matriz y se incuba sobre hielo durante 15 minutos. La fracción no enlazada se recolecta como sobrenadante por centrifugación (1000 rpm durante 2 minutos). La matriz se lava dos veces con 0.5 ml del mismo regulador. Las proteínas enlazadas se eluyen dos veces (0.4 ml cada vez) por centrifugación, utilizando primero KCL a 0.3M y luego KCL a 0.5 M, en el mismo regulador. Todas las incubaciones se llevan a cabo con un tiempo de incubación de 10 minutos y todas las operaciones en una microcentrífuga de enfriamiento.
Los adsorbentes muestran distintos patrones de enlazamiento/elución con respecto a las actividades enzimáticas probadas. Proveen un rango de afinidad que es capaz de discriminar diferentes proteínas mediante diferentes enlazamientos.
Ejemplo 31:
Procedimiento General (Aspergillus niger Lacasa):
La proteína lacasa cruda se aísla a partir de micelios conidiantes de A.niger en regulador de fosfato 20 mM. La fracción de sulfato de amonio 30-80% se somete a desalinización sobre una matriz G-25 y se utiliza para las pruebas. La actividad se monitoriza mediante la oxidación continua de ABTS a 436 nm. Una unidad de actividad (U) se define como una mol de ABTS oxidado por minuto en una prueba estándar de un ml. En todos los estudios de enlazamiento se aplica aproximadamente 5 mU de muestra de la casa sobre la resinas de afinidad.
a) Modo de columna de microrrotación: la resina de afinidad (0.25 ml, volumen empacado)se equilibra con regulador de fosfato de 20 mM (pH 7.0) en una microcolumna de rotación. La muestra de lacasa cruda
(aproximadamente 5 mU en aproximadamente 100 l) se aplica sobre esta matriz y se incuba sobre hielo durante 15 minutos. La fracción no enlazada se recolecta por centrifugación (1000 rpm durante 2 minutos). La matriz se lava adicionalmente con 0.3 ml de regulador de fosfato. Las proteínas enlazadas se eluyen dos veces (0.3 ml cada vez) por centrifugación, utilizando KCL 0.6 M en el mismo regulador.
b) Modo de lote en tubo de microcentrífuga: el adsorbente (0.3 ml, volumen empacado) se equilibra con regulador de fosfato 20 mM (pH 7.0) en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. La muestra de lacasa cruda (aproximadamente 5 mU en aproximadamente 100 l) se aplica sobre esta matriz y se incuba sobre hielo durante 15 minutos. La fracción no enlazada se recolecta como sobrenadante por centrifugación (1000 rpm durante 2 minutos). La matriz se lava con 0.5 ml de regulador de fosfato. Las proteínas enlazadas se eluyen dos veces (0.4 ml cada vez) por centrifugación, usando KCL 0.6 M en el mismo regulador. Todas las incubaciones se llevan a cabo con un tiempo de incubación de 10 minutos y todas las operaciones en una microcentrífuga con enfriamiento.
Ejemplo 32
Procedimiento General (Aspergillus niger Arginasa):
El hongo se cultiva sobre un medio mínimo (con arginina como única fuente de nitrógeno) hasta una fase logarítmica media y los micelios se recolectan por filtración. El extracto de arginasa crudo a partir de estas células se prepara en un regulador de extracción (imidazol HCl 200 mM, PMSF 1mM, MnSO4 12 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM) a pH 7.5. La enzima se enriquece sobre una columna DEAE y las fracciones activas son reunidas, se llevan a sulfato de amonio al 70% para precipitar la actividad enzimática. Esta pella se disuelve en un regulador (Hepes-NaOH 25 mM, MnSO4 1.2 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, glicerol al 20%) a pH 7.5. La muestra se diluye en regulador (imidazol HCl 25 mM, MnSO4
1.2 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM) a pH 7.5 y se utiliza para las pruebas. La actividad se monitoriza mediante el método Archibald para estimación de la urea (a 478 nm) una unidad de actividad (U) se define como una mol de urea formada por minuto en una prueba estándar. En todos los estudios de enlazamiento se aplican aproximadamente 300 mU de la muestra de arginasa sobre las resinas de afinidad.
Modo en lote en tubo de microcentrífuga: el adsorbente (0.3 ml, volumen empacado) se equilibra con una regulador de cromatografía (imidazol HCl 25 mM, MnSO4 1.2 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM) a pH 7.5, en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. Se aplica la muestra de arginasa cruda (aproximadamente 300 mU en aproximadamente 100 l) a esta matriz y se incuba sobre hielo durante 15 minutos. La fracción no enlazada se recolecta como sobrenadante por centrifugación (1000 rpm durante 2 minutos). La matriz se lava dos veces con 0.5 ml del mismo regulador. Las proteínas enlazadas se eluyen dos veces (0.4 ml cada vez) por centrifugación, utilizando KCL 0.5 M en el mismo regulador. Todas las incubaciones se llevan a cabo con un tiempo de incubación de 10 minutos y todas las operaciones en una microcentrífuga de enfriamiento.
Ejemplo 33:
Purificación de NADP-GDH (A.terreus) utilizando adsorbente BS-212:
El hongo cultivado sobre un medio mínimo (con nitrato como fuente de nitrógeno) hasta la fase logarítmica media y los micelios se recolectan por filtración. El extracto crudo de NADP-GDH de estas células se prepara en un regulador de
5  extracción A (fosfato 100 mM, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM y 2-mercaptoetanol 4 mM) a pH 7.5. La fracción de sulfato de amonio al 30-70% se desaliniza sobre matriz G-25 (volumen de lecho de 20 ml) equilibrado con un regulador de fosfato 20 mM (pH 7.5) que tiene EDTA 1 mM y 2-mercaptoetanol 4 mM (regulador B). Esta proteína desalinizada se carga sobre una columna de 20 ml de BS-212 a una rata de flujo de 10 ml/hora. La columna se lava con 100 ml de regulador B a una rata de flujo de 12 ml/hora.
10  Las proteínas enlazadas se eluyen utilizando un gradiente lineal de KCL 0-0.3 M (20 ml + 20 ml) en regulador B. Para la elución, se mantiene una rata de flujo de 18 ml/hora y se recolectan fracciones (de 1.5 ml cada hora). Se mide la actividad de NADP-GDH siguiendo el cambio en absorbancia a 340 nm como se mencionó anteriormente. La prueba de aminación reductiva llevada a cabo en un volumen de reacción de 1.0 ml contenía tris-HCl 100 mM a pH 8.0, NH4Cl 10 mM, 2-oxoglutarato 10 mM y NADPH 0.1 mM.
15  Resultados: de las 10 unidades de actividad de NADP-GDH cargadas ninguna fue recuperada en las fracciones no enlazadas o del lavado. La mayor parte de la actividad se enlazó y pudo ser eluida (9.5 unidades) utilizando el gradiente de KCL mencionado anteriormente. El perfil de esta elución se muestra en la Figura 1. La purificación alcanzada por esta etapa sencilla utilizando el adsorbente fue monitorizada por el PAGE nativo de la muestra cargada y de la fracción del pico. La Figura 2 da la imagen de este gel. Claramente el adsorbente BS-212 fue capaz de enriquecer
20  sustancialmente la proteína NADP-GDH del Aspergillus (mostrada por la flecha en la Figura 2).
Descripción de las Figuras
Figura 1
Perfil de elución de NADP-GDH de A.terreus a partir de la columna de BS-212 utilizando gradiente de KCL.
Figura 2
25  PAGE nativo (7.5%) de NADP-GDH de A.terreus:
Linea 1- una fracción de sulfato de amonio (30-70%) desalinizada; Linea 2- pico de la fracción de proteína (Figura 1) de la columna de BS-212 (la flecha indica la posición de la proteína de NADP-GDH).

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para la separación de materiales biológicos, donde se usa un adsorbente, el cual comprende un producto de reacción y un compuesto de la fórmula
    imagen1
    y un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de fórmula (1)
    para formar un enlace covalente, en el cual B es un radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 10 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en -NR1- o -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo,
    sulfato, ciano o carboxilo, R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1
    C4alquilen-C5-C9cicloalquileno o C1-C4alquilen-C5 C9cicloalquilen-C1-C4alquileno radical, los cuales están no
    sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical
    C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilen-fenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o15 sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo, V es un sustituyente
    reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula
    imagen2
    imagen3
    imagen4
    10 
    15 R3 es hidrógeno, hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi, ciano, halógeno, C1-C4alcoxicarbonilo, C1-C4-alcanoiloxi, carbamoilo o un grupo -SO2-Y, R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o ramificado, arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C120 C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2-CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y 25 n es un número 0 o 1,
    X es halógeno, y k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un adsorbente, que comprende un compuesto de fórmula y
    imagen1
    Donde Q es sulfo o carboxi.
  2. 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el compuesto de fórmula (1) corresponde a un 10 compuesto de fórmula
    imagen3
    imagen5
    donde B es un radical C2-C6alquileno, un radical metilen-ciclohexileno, el cual es no sustituido o sustituido por C1-C4alquilo, o a fenileno o metilen-fenilen-metileno radical, el cual es no sustituido o sustituido por C1
    25 C4alquilo, C1-C4alcoxi, halógeno o sulfo,
    V es amino, N-mono- o N,N-di-C1-C4alquilamino el cual es no sustituido o sustituido en la unidad estructural alquilo por hidroxi, sulfato o por sulfo Y es no interrumpido o interrumpido por un radical -O-, morfolino, fenilamino o N-C1-C4alquil-Nfenilamino el cual es no sustituido o sustituido en el anillo fenilo por sulfo, carboxi, cloro, acetilamino, metilo o por metoxi, o naftilamino el cual es no sustituido o sustituido por de 1 a 3 grupos 30 sulfo, o
    V es un grupo de fórmula
    imagen1
    o
    imagen6
  3. 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, donde B es un radical
    imagen1
    5  V corresponde a β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino, N.N-di-β-hidroxietilamino, β-sulfoetilamino, morfolino, 2-, 3- o 4-sulfofenilamino, 1-sulfonaft-2-il-amino o 3,7-disulfonaft-2-il-amino, o V es un grupo de fórmula (2c’) o (2d’) como se define en la reivindicación 2.
  4. 4. Un proceso de acuerdo con una cualquier de las Reivindicaciones 1 a 3 donde
    el sustrato es un carbohidrato o un carbohidrato modificado, preferiblemente agarosa, agarosa entrecruzada, 10 dextrosa, dextranos o versiones modificadas de los mismos.
  5. 5. Adsorbentes para la separación de materiales biológicos, los cuales comprenden un producto de reacción de
    imagen7
    B es Radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en NR1- o
    -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo,
    20 R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, or
    B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1-C4alquilen-C5-C9cicloalquileno o radical C1-C4alquilen-C5C9cicloalquilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo, halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilenfenilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2
    25 C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo,
    V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula
    imagen1
    imagen1
    imagen8
    carbamoilo o un grupo -SO2-Y,15 R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o
    ramificado, arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2-CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo,
    20  W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y n es un número 0 o 1, X es halógeno, y k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un
    25  adsorbente, que comprende un compuesto de fórmula
    30 
    35 
    imagen1
    y
    5 
    10 
    imagen1
    donde Q es sulfo o carboxi.
  6. 6. Un proceso para la preparación de los adsorbentes de acuerdo con la reivindicación 5, proceso que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula
    imagen1
    en el cual
    20  B es Radical C2-C12alquileno, que puede estar interrumpido por 1, 2 o 3 miembros del grupo consistente en NR1- o -O- y es no sustituido o sustituido por hidroxilo, sulfo, sulfato, ciano o carboxilo,
    R1 es hidrógeno o C1-C4alquilo, o
    B es un radical C5-C9cicloalquileno, radical C1-C4alquilen-C5-C9cicloalquileno o radical C1-C4alquilen-C5C9cicloalquilen-C1-C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, sulfo,
    25  halógeno o carboxilo, o un radical fenileno, radical C1-C4alquilen-fenileno o radical C1-C4alquilen-fenilen-C1C4alquileno, los cuales están no sustituidos o sustituidos por C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi, C2-C4alcanoilamino, sulfo, halógeno o carboxilo,
    V es un sustituyente reactivo a materiales no fibrosos o es un sustituyente reactivo a la fibra de fórmula donde
    imagen1
    imagen9
    imagen3
    10 
    imagen10
    R3 es hidrógeno, hidroxi, sulfo, sulfato, carboxi, ciano, halógeno, C1-C4alcoxicarbonilo, C1-C4-alcanoiloxi, carbamoilo o un grupo -SO2-Y, R4 es hidrógeno o C1-C4alquilo, alk y alk1 son independientemente uno del otro C1-C6 alquileno lineal o ramificado, 15 arileno es un radical fenileno o naftileno el cual es no sustituido o sustituido por sulfo, carboxi, hidroxi, C1-C4alquilo, C1-C4alcoxi o por halógeno, Y es vinilo o un radical -CH2CH2-U y U es un grupo saliente, Y1 es un grupo -CH(Hal)-CH2(Hal) o -C(Hal)=CH2 donde Hal es cloro o bromo, W es un grupo -SO2-NR4-, -CONR4- o -NR4CO- donde R4 es como se definió más arriba, 20 Q es un radical -O- o -NR4- donde R4 es como se definió más arriba, y n es un número 0 o 1, X es halógeno, and
    k y m son independientemente uno del otro un número 0 o 1 y la suma de k+m is 1 o 2, con la excepción de un compuesto de fórmula
    imagen1
    y
    10 
    15 
    donde
    Q es sulfo o carboxi,
    con un sustrato que tiene un grupo capaz de reaccionar con un grupo reactivo en dicho compuesto de fórmula
    (1) para formar un enlace covalente en la presencia de un agente enlazante de ácido.
  7. 7.
    Compuestos de la fórmulas
    imagen11
    y donde V1 is β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino o morfolino, V2 y V3 cada uno independientemente del otro son β-hidroxietilamino, 2-(β-hidroxietoxi)etilamino, N,N-di-β-hidroxietilamino o morfolino, y Q es el número 0, 1, 2 o 3.
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