ES2366962T3 - Anticuerpos frente al receptor alfa-1 de la il-13 y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une al IL-13Rα1 y que inhibe la IL-13, caracterizado por que la secuencia de aminoácidos de la parte variable de la cadena pesada CDR3 de dicho anticuerpo, se selecciona a partir del grupo de secuencias de la cadena pesada CDR3 compuesto por las Secuencias con Nº ID: 1, 3, 5 o 7 con lo que dicho anticuerpo se obtiene partir de líneas celulares de hibridoma DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 o DSM ACC2712.

Description

La presente invención se refiere a anticuerpos humanos frente al receptor alfa-1 de la IL-13 (IL-13Rα (alfa)1), los métodos para su producción y sus usos.

Antecedentes de la invención

La IL-13 es un péptido monomérico secretado y producido básicamente por las células Th2, pudiendo también ser producido por los mastocitos y las células T asesinas. Las funciones biológicas de la IL-13 incluyen la regulación de la producción de IgE y la modulación del desarrollo de los Th2. La IL-13 se une a un receptor complejo que consiste en una cadena alfa-1 receptora de IL-13 (Il-13Rα1) y una cadena alfa receptora de IL-4 (IL-4Rα). La unión de la IL13 dispara una serie de transducciones de señal mediadas principalmente por la STAT6. La IL-13 se une con baja afinidad al IL-13Rα1 aislado y no se une al IL-4Rα1. Por el contrario, la IL-4 se une al IL-4Rα aislado y no se une al IL-13Rα1 aislado. Se ha descrito otro receptor para la IL-13, el IL-13Rα2. La IL-13 se une a este receptor con alta afinidad. Es probable que este receptor actúe como señuelo.

La sobreexpresión inducible de IL-13 en ratones transgénicos genera un fenotipo que comparte muchas características con los pacientes asmáticos. Éstos muestran metaplasia del mucus e inflamación rica en macrófagos, linfocitos y eosinófilos, regulación positiva de proteasas como la MMP-9, -12, -13, -2 y –14, catepsina B, H, K y S, presentando también fibrosis subepitelial. Los ratones con el gen para la IL-13 anulado (knockout) muestran una reducción significativa en la producción de citocinas tipo Th2 debido a la disminución del desarrollo de los Th2. Estos ratones no desarrollan hiperreactividad de las vías respiratorias (airway hyperreactivity, AHR) a pesar de la presencia de inflamación con eosinófilos. La AHR se recupera mediante la administración de IL-13, indicando que la IL-13 es necesaria y suficiente para la inducción de AHR en ratón. Otras funciones biológicas importantes de la IL-13 en relación con el asma incluyen la inducción de metaplasia y producción de mucus de las células caliciformes. Actúa directamente sobre las células epiteliales de las vías respiratorias, fibroblastos y células del músculo liso, induciendo diferentes programas transcripcionales en cada uno de estos tipos celulares. Cabe destacar que la IL-13 disminuye la respuesta α-adrenérgica en las células del músculo liso, contribuyendo a un estrechamiento de las vías respiratorias. El polimorfismo del promotor de la IL-13 se asocia con un aumento del riesgo de asma alérgica. Los polimorfismos en el gen de la IL-13 se asocian con altos niveles de IgE en suero. Los polimorfismos de un único nucleótido en la secuencia intergénica entre los genes de la IL-4 y de la IL-13 se asocian con asma atópica.

Los antagonistas de la IL-13 han sido utilizados en modelos animales. Por ejemplo, se ha demostrado que una proteína de fusión soluble IL-13Rα2-IgGFc consigue revertir la AHR inducida por ovoalbúmina en ratón y reducir el número de células productoras de mucus. La reversión se obtuvo incluso cuando el tratamiento se administra tras un completo desarrollo del fenotipo. Además, el tratamiento de ratones con una molécula de fusión entre IL-13 y una citotoxina resultaba en una reducción de todas las características de la enfermedad de las vías respiratorias propias de una inflamación alérgica crónica inducida con hongos. En conclusión, la IL-13 es una mediadora clave en el disparo de la respuesta alérgica.

El IL-13Rα1 es un miembro de la superfamilia de receptores de la hematopoyetina (familia de receptores de citocinas tipo 1) y fue identificado y descrito por Obiri N. I., et al., J. Biol. Chem., 270 (1995) 8797-8804) y en la WO 96/29417. Es una proteína de 427 aminoácidos incluyendo la secuencia señal. Las secuencias de DNA y proteína se describen en la WO 97/15663 y en la SwissProt Nº P78552. La IL-13Rα1 es una proteína glicosilada que se une a la IL-13 con una baja afinidad, pero, cuando se une con IL-4Rα formando un heterodímero, se une a la IL-13 con alta afinidad. Este complejo también es receptor para la IL-4.

Los anticuerpos frente al IL-13Rα1 están descritos en WO 96/29417, WO 97/15663, WO 03/080675, Graber P., et al., Eur. J. Immunol., 28 (1998) 4286-4298; Poudrier J., et al., J. Immunol., 163 (1999) 1153-1161; Poudrier J., et al., Eur. J. Immunol., 30 (2000) 3157-3164; Aikawa M., et al., Cytokine, 13 (2001) 75-84. Los anticuerpos frente al IL13Rα se pueden obtener comercialmente de R&D Systems Inc. USA. La EP 449851 se refiere a anticuerpos de rata que se unen a la IL-13αl. El problema que resuelve el presente invento es proporcionar anticuerpos alternativos frente a la IL-13αl con una afinidad muy alta a la IL-13αl.

Resumen de la invención

El invento comprende un anticuerpo que se une al IL-13R1 y que inhibe la IL-13, caracterizado por que la secuencia de aminoácidos de la parte variable de la cadena pesada CDR3, se selecciona a partir del grupo de secuencias de la cadena pesada CDR3 compuesto por las Secuencias con Nº ID: 1, 3, 5 o 7 con lo que dicho anticuerpo se obtiene partir de líneas celulares de hibridoma DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 o DSM ACC2712.

El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo humano.

El anticuerpo se caracteriza preferiblemente por una afinidad de unión a IL-13R1 de 10-9 M (KD) o menor, preferentemente de 10-9 a 10-13 M.

De preferencia el anticuerpo se caracteriza porque la secuencia de aminoácido de cadena pesada variable CDR3 de dicho anticuerpo se elige del grupo constituido por las secuencias de cadena pesada CDR3 de con nº de ED de Sec: 1, 3, 5, 7 o 9 y comprende como regfión variable de cadena pesada con nº de ED de Sec: 1 y como región variable de cadena ligera con nº de ID de Sec: 2, como región variable de cadena pesada con nº de ID de Sec: 3, y como región variable de cadena ligera con nº de ID de Sec: 4, como región variable de cadena pesada con nº de ID de Sec: 5 y como región variable de cadena ligera con nº de ID de Sec: 6, como región variable de cadena pesada con nº de ID de Sec: 7 y como región variable de cadena ligera con nº de ID de Sec: 8 o como región variable de cadena pesada con nº de ID de Sec: 9 y como región variable de cadena ligera con nº de ID de Sec: 10.

Las secuencias para los CDR pueden determinarse de acuerdo con la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immonological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Sobre esta base, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las secuencias con Nº de ID: 1-8 tiene las siguientes secuencias:

Los CDR de cadena pesada: CDR1 (aa 31-35) de Nº ID SEC: 1, 3, 5, 7, 9, CDR2 (aa 50-66) de Nº ID SEC: 1, 3, 5, 7, 9, CDR3 (aa 99-108) de Nº ID SEC: 1, 3, 9, CDR3 (aa 99-107) de Nº ID SEC: 5, CDR3 (aa 99-112) de Nº ID SEC: 7;

Los CDR de cadena ligera: CDR1 (aa 24-34 ) de Nº ID SEC: 2, 4, 6, 10, CDR1 (aa 24-35 ) de Nº ID SEC: 8, CDR2 (aa 50-56) de Nº ID SEC: 2, 4, 6, 10, CDR2 (aa 51-57) de Nº ID SEC:8 y CDR3 (aa 89-97) de Nº ID SEC: 2, 4, 6, 10, CDR3 (aa 90-97) de Nº ID SEC: 8.

El anticuerpo se caracteriza preferentemente por contener como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 1 y como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 2, como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 3 y como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 4, como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 5 y como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 6, como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 7 y como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 8 o como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 9 y como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 10.

El anticuerpo se caracteriza preferentemente por contener

a) como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 1, como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 2, como región constante de la cadena ligera κ la SEC con Nº ID: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 la SEC con Nº ID: 12, opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A,

b) como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 3, como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 4, como región constante de la cadena ligera κ la SEC con Nº ID: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 la SEC con Nº ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A,

c) como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 5, como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 6, como región constante de la cadena ligera κ la SEC con Nº ID: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 la SEC con Nº ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A,

d) como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 7, como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 8, como región constante de la cadena ligera κ la SEC con Nº ID: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 la SEC con Nº ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A, o

e) como región variable de la cadena pesada la SEC con Nº ID: 9, como región variable de la cadena ligera la SEC con Nº ID: 10, como región constante de la cadena ligera κ la SEC con Nº ID: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 la SEC con Nº ID: 12 opcionalmente con las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A,

El anticuerpo se caracteriza preferentemente por su unión a IL-13R1 en competición con los anticuerpos LC5002002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y/o LC5002-018. El anticuerpo se caracteriza preferentemente por incluir como regiones variables las regiones variables de LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018. Las regiones variables de estos anticuerpos son las que se muestran en la SEC con Nº ID: 1-10. En el estado del arte existen unas regiones constantes muy útiles y bien caracterizadas. En las SEC con ID Nº: 11-12 se muestran algunas de ellas.

El anticuerpo es preferentemente monoclonal o producido de forma recombinante.

En una realización preferente de la invención el anticuerpo es un anticuerpo humano con alteración de clase.

En una realización preferida de la presente invención el anticuerpo contiene una cadena pesada humana 1 que incluye:

a) la secuencia de aminoácidos Pro233Val234Ala235 con deleción de la Gly236 y/o la secuencia de aminoácidos Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331

b) la secuencia de aminoácidos Ala234Ala235 o

c) los aminoácidos Ala265 y Ala297.

Preferentemente, de acuerdo con la invención, el anticuerpo inhibe la fosforilación de la Stat-6 inducida por IL-13 con un valor de CI50 de 6nM o menor, inhibe también la producción de eotaxina inducida por IL-13 con un valor de CI50 de 20nM o menor y/o inhibe la proliferación celular inducida por IL-13 o IL-4, preferentemente de células TF-1 (ATCC CRL 2003) con un valor de CI50 de 10nM o menor (IL-13) y 60nM o menor (IL-4). La fosforilación de Stat-6, producción de eotaxina e inducción de proliferación celular se determinan de acuerdo con los ejemplos 6 al 8.

El anticuerpo, de acuerdo con la invención, no se une al IL-13R1 desnaturalizado (KD de unión de 10-6 M o mayor). El anticuerpo se caracteriza preferentemente por no mostrar reacción cruzada substancial con IL-13R2 y IL-4Rα (KD de unión de 10-6 M o mayor).

La invención proporciona también líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales antagonistas frente al IL-13R 1.

Las líneas celulares de hibridoma preferidas de acuerdo con la invención (hu-MAB<h-IL-13R alfa>LC.5002-002 (DSM ACC2709), hu-MAB<h IL-13R alfa>LC.5002-003 )DSM ACC2710), ), hu-MAB<h IL-13R alfa>LC.5002-005) DSM ACC2711), hu-MAB<h IL-13R alfa>LC.5002-007 (DSM ACC2712)) fueron depositadas en el 13-01-2005 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania.

La invención proporciona además los ácidos nucleicos codificantes para los polipéptidos que conforman los anticuerpo, vectores de expresión incluyendo dichos ácidos nucleicos y células huésped para la producción recombinante de dichos anticuerpos. La invención también proporciona métodos para la producción recombinante de dichos anticuerpos.

Otra realización del invento es un ácido nucleico que codifica un anticuerpo que se une al IL-13Rα1 y que inhibe la IL-13 que comprende como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 1 y como región variable de la cadena ligera a la de Nº de SEC: 2, como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 3 y como región variable de la cadena ligera a la de Nº de SEC: 4, como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 5 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº: 6, como región variable de la cadena pesada a la región con ID de SEC Nº: 7 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº: 8 o como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 9 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº:10.

Los anticuerpos, de acuerdo con la presente invención, se han demostrado beneficiosos para pacientes con necesidad de terapia corticosteroide. Dichos anticuerpos poseen nuevas e innovadoras propiedades que benefician al paciente que sufre asma o enfermedad alérgica.

La invención incluye además el uso del anticuerpo sujeto de la invención para el tratamiento del asma y para la fabricación de compuestos farmacéuticos de acuerdo con la invención. Además, la invención incluye un método para la fabricación de un compuesto farmacéutico de acuerdo con la invención.

La invención también incluye un compuesto farmacéutico que contiene el anticuerpo sujeto de invención con una dosis farmacéutica efectiva, junto con un tampón y/o adyuvante opcional, útil para la formulación de los anticuerpos para finalidades farmacéuticas.

La invención también proporciona compuestos farmacéuticos que incluyen dichos anticuerpos en un vehículo aceptable farmacéuticamente. En una realización, la composición farmacéutica puede ser incluida en un artículo manufacturado o en un kit.

La invención incluye también un vector que contiene un ácido nucleico el cual es capaz de ser expresado en una célula huésped eucariota o procariota.

La invención también incluye una célula huésped procariota o eucariota conteniendo el vector de acuerdo con la invención.

La invención también incluye un método para la producción recombinante del anticuerpo humano sujeto de la invención, caracterizado por la expresión de un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula huésped procariota o eucariota y la recuperación de dicho anticuerpo de la célula citada. La invención también comprende el anticuerpo obtenible mediante dicho método recombinante.

La invención también comprende un método para la preparación de un compuesto farmacéutico caracterizado por seleccionar un anticuerpo frente a IL-13R1 a partir de una pluralidad de anticuerpos frente a IL-13R1 en relación con tal ensayo sin dicho anticuerpo, produciendo el citado anticuerpo mediante expresión recombinante, recuperando dicho anticuerpo y combinándolo con un tampón y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. El anticuerpo tendrá preferentemente una o más de las propiedades mencionadas más arriba.

Descripción detallada de la invención

Los términos “IL-13R1, IL-13R1 murino, IL-13, IL-13R2 e IL-4R” y sus dominios están bien definidos en el estado actual del arte y definidos por ejemplo en SwissProt P78552, O09030, P35225, Q14627 y P24394. Si no se indica lo contrario, los términos “IL-13R1, IL-13, IL-13R2 e IL-4R” denotan por lo tanto los polipéptidos humanos IL-13R1, IL-13, IL-13R2 e IL-4R.

El término “anticuerpo humano”, tal y como se usa a partir de aquí, incluye a los anticuerpos que poseen regiones constantes (dominios) que pueden ser asignados a secuencias de inmunoglobulinas pertenecientes a líneas germinales humanas definidas debido a su alta similitud de secuencias o a su identidad con tales secuencias de líneas germinales. Los anticuerpos humanos resultan bien conocidos en el estado del arte (van Dijk, M.A., y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos pueden producirse también en animales transgénicos (ej. ratones) que son capaces, tras ser inmunizados, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. La transferencia de la serie de genes de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a la línea germinal de ratones resulta en la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno (véase por ej., Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos pueden producirse también el bibliotecas de “phage display” (Hoogenboom, H.R., y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581597). Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. Están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Dentro de la definición de anticuerpo humano se incluyen diferentes formas, preferiblemente la de anticuerpos monoclonales, comprendiendo pero no estando limitado a anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos con alteración de clase y anticuerpos modificados genéticamente (anticuerpos mutantes o variantes) mientras se mantengan las propiedades características de la invención. Especialmente preferidos son los anticuerpos recombinantes humanos. El término “anticuerpo monoclonal”, tal y como se utiliza en adelante, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo, todas ellas con una composición de aminoácidos substancialmente idéntica.

El término “anticuerpo recombinante humano”, tal y como se usa a partir de aquí, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante métodos recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de células huésped tales como NSO o CHO o a partir de animales (ej: ratón) que son transgénicos para los genes de la inmunoglobulina humana o los anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en la citada célula huésped. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen unas regiones constantes y variables en disposición reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos de acuerdo con la invención han sido sujetos a una hipermutación somática in vivo. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que pueden asignarse a unas determinadas secuencias VH y VL de líneas germinales humanas, pero que pueden no existir de forma natural dentro del repertorio in vivo de las líneas germinales humanas.

El término "anticuerpo con alteración de clase" se refiere a un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo humano, que comprende una región variable, la región de unión, que proviene de una fuente de línea germinal y al menos una porción de una región constante que corresponde a una región constante de una fuente de línea germinal diferente, preparada normalmente mediante técnicas de DNA recombinante. Tales anticuerpos con alteración de clase no se encuentran de manera natural y por tanto no se pueden obtener de manera directa a partir de ratones xenoimplantados. Las formas de anticuerpos con alteración de clase incluidas en la presente invención son aquellas en las cuales la región constante presenta diferencias respecto a la secuencia silvestre de la región constante, dando como resultado un anticuerpo con propiedades diferentes de acuerdo con la invención, especialmente en relación con la unión a C1q y/o al receptor Fc (FcR), ya sea por cambio o mutación del Fc. Los anticuerpos con alteración de clase son el producto de expresión de genes para inmunoglobulina que incluyen fragmentos de DNA codificantes para las regiones variables de la inmunoglobulina y fragmentos de DNA codificantes para las regiones constantes de la inmunoglobulina. Los métodos para la producción de los anticuerpos con alteración de clase implican técnicas convencionales de DNA recombinante y transfección génica, bien conocidas en el estado del arte (véase, ej: Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes Estadounidenses números 5.202.238 y 5.204.244).

La "región variable" (región variable de la cadena ligera (VL), región variable de la cadena pesada (VH)) tal y como se aplica de aquí en adelante, se refiere a la parte de cada par de cadenas ligera y pesada que está directamente implicada en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada humanas tiene la misma estructura general y cada dominio está formado por cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas entre si por tres “regiones hipervariables” (o regiones determinantes de la complementariedad, CDRs). Las regiones marco adoptan una conformación de hoja β y los CDR pueden formar lazos de conexión entre la estructura de lámina beta. Las CDR de cada cadena se mantienen en una estructura tridimensional mediante las regiones marco y forman, en conjunto con las CDR de la otra cadena, el lugar de unión al antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, preferentemente la CDR3 de la cadena pesada, juegan un papel particularmente importante en la especificidad y afinidad de unión de los anticuerpos en concordancia con la invención y por lo tanto constituyen también objeto de la invención.

Los términos “región hipervariable” o “porción de unión al antígeno de un anticuerpo” tal y como se utilizan a partir de aquí, hacen referencia a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácido de las “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. Las regiones “marco” o regiones “FR” son aquellas regiones de dominio variable aparte de los residuos de la región hipervariable tal y como han sido definidas. Por lo tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden, desde el extremo N al C, los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. Las regiones CDR y FR están determinadas de acuerdo con las definiciones estándar dadas por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Los “dominios constantes” no están implicados de manera directa en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero poseen varias funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas clases pueden ser a su vez subdivididas en subclases (isotipos), por ej: IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1 y IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son las llamadas , , , ,y . Los anticuerpos correspondientes a la invención son preferentemente del tipo IgG1.

La parte Fc de un anticuerpo está implicada directamente en la activación del complemento, unión a C1q, activación de C3 y unión a receptor de Fc. La unión a C1q viene mediada por unos lugares de unión definidos en la parte Fc. Dichos lugares de unión son conocidos en el estado del arte actual y definidos por ej. en Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; y EP 0 307 434. Tales lugares de unión son por ej: L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numerados de acuerdo con el índice EU de Kabat, ver más abajo). Los anticuerpos de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 suelen tener acción activadora del complemento, unión a C1q y activación de C3, mientras que los anticuerpos IgG4 no activan el sistema del complemento, no se unen a Cq1 y no activan a C3. El término “fragmento Fc derivado de origen humano”, tal y como se emplea de aquí en adelante, define un fragmento Fc que preferiblemente tiene una secuencia aminoacídica correspondiente al fragmento Fc de un anticuerpo humano de la subclase IgG1, modificado de tal manera que no se puede detectar unión a c1q, activación de C3 y/o unión a Fc, o la unión está disminuida al menos en un 50%, preferiblemente en un 70%, en comparación al anticuerpo IgG1 humano. El término “parte Fc de un anticuerpo” es bien conocido para el especialista formado, siendo definido en base a la digestión con papaína de los anticuerpos. Los anticuerpos correspondientes a la invención contienen una parte Fc, preferiblemente con una secuencia de aminoácidos de una parte Fc derivada a partir de un origen humano y preferiblemente todas las demás partes de las regiones constantes humanas. Preferiblemente la parte Fc es una parte Fc humana mutada a partir de la subclase IgG1. De preferencia prioritaria son las partes Fc que incluyen una región constante 1 de la cadena pesada (un ejemplo se muestra en la SEC con Nº de ID: 11) con mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A (WO99/51642).

Las cadenas constantes humanas ej. las cadenas pesadas 1 están descritas en detalle por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), y por Brüggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Los dominios constantes preferidos en la invención no tienen unión a complemento. La “región variable” (región variable de la cadena ligera (VL), región variable de la cadena pesada (VH)) tal y como se utiliza de aquí en adelante denota cada uno del par de cadenas ligeras y pesadas que están implicadas directamente en la unión del anticuerpo al antígeno

El término ácido nucleico o molécula de ácido nucleico, tal y como se utiliza de aquí en adelante, pretende incluir todas las moléculas de DNA y RNA. Una molécula de ácido nucleico puede ser monohebra o doble hebra, pero preferiblemente es DNA de doble hebra.

Un ácido nucleico está “ligado operativamente” cuando se sitúa en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una presecuencia o señal de secreción está ligado operativamente al DNA para un polipéptido si es expresado en forma de preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un lugar de unión para ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificante si se posiciona de manera que facilita la traducción. Generalmente, “ligado operativamente” hace referencia a que las secuencias de DNA ligadas están en cis y, en el caso de una señal de secreción, de forma contigua y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por que estar contiguos ni en pauta de lectura. Esta conexión operativa puede conseguirse por ligación mediante los lugares de restricción adecuados. Si tales lugares no existen, se utilizan los adaptadores de oligonucleótido necesarios de acuerdo con práctica común.

Tal y como se usa a partir de aquí, las expresiones "célula”, "línea celular", y "cultivo celular" pueden aplicarse de manera indistinta y todas ellas incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos de allí derivados sin importar el número de transferencias. Se entiende también que toda la progenie no debe ser idéntica en su contenido de DNA, debido a mutaciones inducidas o inadvertidas. Toda la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica definida para la célula transformante original queda incluida. Donde se apliquen designaciones diferentes se pondrá en evidencia a partir del contexto.

El término “unión a IL-13R1" tal y como será utilizado a partir de aquí se refiere a la unión del anticuerpo a IL13R1 en un ensayo in vitro, preferiblemente en un ensayo de unión en el cual el anticuerpo se una a una superficie y la unión a IL-13R1 se mida mediante resonancia Plasmática de Superficie (SPR). La unión está definida por una afinidad de unión (KD) de 10-8 M o menor, preferentemente 10-13 a 10-9 M. “Sin unión” implica una KD de 10-6 M o mayor. Los anticuerpos referentes a la invención se unen al dominio extracelular de la IL-13R1 humana y preferiblemente también al IL-13R1 de ratón.

La unión a IL-13R1 puede determinarse utilizando el ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). La afinidad de la unión está definida por los términos ka (tasa constante para la asociación del anticuerpo a partir del complejo antígeno/anticuerpo), kd (tasa de disociación), y KD (kd/ka).

La unión de IL-13 a IL-13R1 es inhibida por los anticuerpos correspondientes a la invención. La inhibición se mide en términos de CI50 en un ELISA de unión de IL-13 al heterodímero IL-13R1/IL-4R. Para llevar a cabo dicho ensayo el IL-13R1 se inmoviliza y se añaden la IL-13 y el IL-4R. Los valores de CI50 de los anticuerpos de acuerdo con la invención para la unión de IL-13 a IL-13R1 no son mayores de 6nM. Los valores de IC50 se miden como valores de la media o promedio de al menos tres medidas independientes. Es posible que los valores individuales de CI50 estén fuera del rango.

Los anticuerpos sujeto de la invención muestran preferiblemente una unión a los mismos epítopos del IL-13R1 que los anticuerpos seleccionados del grupo consistente en los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018 o su unión a IL-13R1 está inhibida por impedimentos estéricos por la unión de estos anticuerpos. La inhibición de la unión puede detectarse mediante un ensayo de SPR utilizando un anticuerpo inmovilizado seleccionado a partir del grupo que incluye a los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018 y IL-13R1 a una concentración de 20-50nM, estando el anticuerpo a detectar a una concentración de 100nM. Una reducción de señal del 50% o mayor demuestra competición por parte del anticuerpo frente a un anticuerpo seleccionado del grupo de anticuerpos que incluye a LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018. El término “epítopo” se refiere a un determinante proteico capaz de unión específica frente a un anticuerpo. Un epítopo suele consistir en agrupamientos de moléculas químicamente activos, de cadenas laterales de aminoácidos o azúcares y normalmente poseen unas características de estructura tridimensional específicas, así como una carga definida. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros pero no a los últimos se pierde en presencia de agentes desnaturalizantes. La invención incluye también un anticuerpo humano que se une a IL-13R1 inhibiendo la bioactividad de IL-13, caracterizado por una afinidad de 10-9 M (KD) o menor, preferentemente de 10-9 a 10-13 M para la unión a IL-13R1 y por una afinidad de 10-7 M (KD) o menor, preferentemente de 10-8 a 10-9 M para la unión a la IL-13R1 de ratón.

En una realización preferida de la invención, los anticuerpos de acuerdo con la invención son caracterizados más a fondo por tener una o más de las características seleccionadas a partir del grupo de parámetros de unión ka, kd y KD, uniéndose al mismo epítopo al cual se une un anticuerpo seleccionado a partir del grupo compuesto por los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 o LC5002-018.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se producen de manera preferente por métodos recombinantes. Tales métodos son conocidos ampliamente en el estado del arte e incluyen expresión la de proteínas en células eucariotas y procariotas con el aislamiento subsecuente del polipéptido de anticuerpo y normalmente una purificación hasta obtener una pureza aceptable desde el punto de vista farmacológico. Para la expresión de la proteína, los ácidos nucleicos codificantes para las cadenas ligera y pesada o fragmentos de las mismas, se insertan en vectores de expresión mediante métodos estándar. La expresión se lleva a cabo en las células huésped adecuadas, eucariotas o procariotas, como las células CHO, NSO, SP/2, HEK293, COS, levadura o E.coli, siendo recuperado el anticuerpo a partir de las células (sobrenadante o tras una lisis celular).

La producción recombinante de anticuerpos es bien conocida en el actual estado del arte, estando descrita por ejemplo, en artículos de revisión como los de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

Los anticuerpos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en forma parcialmente o sustancialmente purificada. La purificación se lleva a cabo para eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ej: otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, que incluyen el tratamiento con álcali y SDS, el bandeo con CsCl, la cromatografía en columna electroforesis en gel de agarosa y otros métodos bien conocidos en el estado del arte. Ver Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

La expresión en células NSO está descrita por Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; y Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria está descrita entre otros por Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables está descrita por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y por Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK 293) es el descrito por Schlaeger, E.-J., y Christensen, K., en Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y por Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Las secuencias de control adecuadas para procariotas incluyen típicamente un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un lugar de unión para el ribosoma. Las células eucariotas se conocen por utilizar promotores, potenciadores y señales de poliadenilación.

Los anticuerpos monoclonales son separados de forma adecuada del medio de cultivo mediante protocolos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A unida a sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El DNA o RNA codificante para los anticuerpos monoclonales se puede aislar y secuenciar de manera efectiva utilizando los métodos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho DNA y RNA. Una vez aislado, el DNA puede ser insertado en vectores de expresión, que son transfectados a continuación en células huésped tales como las CHO, HEK293, o de mieloma que de otra manera no producirían inmunoglobulinas, para obtener así la síntesis de los anticuerpos monoclonales recombinantes.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen, además, a aquellos que presenten “modificaciones conservativas en la secuencia”, modificaciones de aminoácidos o de nucleótidos que no afectan o alteran a las características del anticuerpo de acuerdo con la invención, mencionadas más arriba. Pueden introducirse modificaciones mediante técnicas estándar conocidas en el estado del arte, tales como la mutagénesis dirigida y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo aminoácido con una cadena lateral similar. Las familias de aminoácidos con cadenas laterales similares han sido definidas en el estado del arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, ciseína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificaciones beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (tirosina, fenilalanina, triptófano, hisitidina). Por tanto, un residuo aminoácido con predicción de no ser esencial en un anticuerpo humano anti IL-13R1 puede ser sustituido preferentemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.

Las sustituciones de aminoácido pueden llevarse a término mediante mutagénesis basada en modelos moleculares tal y como describe Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 y Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989)10029-10033.

Las secuencias de aminoácidos variantes de los anticuerpos humanos frente a IL-13R1 se preparan mediante la introducción del cambio de nucleótido apropiado en el DNA codificante para el anticuerpo, o por síntesis peptídica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo, sin embargo, sólo dentro de un margen muy limitado como el que se describe más arriba. Por ejemplo, las modificaciones no deben alterar las características del anticuerpo mencionadas más arriba, tales como el isotipo de IgG y la unión al epítopo, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar su purificación.

Cualquier residuo de cisteína que no esté implicado en mantener la conformación adecuada del anticuerpo anti-IL13R1, puede ser también sustituido, generalmente con una serina para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la formación de puentes de azufre aberrantes. De forma complementaria se podrían añadir puentes de azufre mediados por cisteínas al anticuerpo para mejorar así su estabilidad (en especial cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como el fragmento Fv).

Otro tipo de variante de aminoácidos en el anticuerpo consistiría en la alteración del patrón original de glicosilación. Por alteración se entiende la deleción de uno o más grupos carbohidrato presentes en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más lugares de glicosilación que no estuviesen presentes en el anticuerpo originalmente. La glicosilación de los anticuerpos se suele hacer generalmente a través de la unión del grupo carbohidrato al grupo amino de la cadena lateral de la asparragina. Los tripéptidos de secuencia asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, resultan secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de la asparragina. Por tanto, la presencia de cualquiera de esos tripéptidos en un polipéptido crea un lugar potencial de glicosilación. La adición de dianas de glicosilación a un anticuerpo se puede conseguir mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de manera que pase a contener una o más de las arriba mencionadas secuencias tripetídicas (para los lugares de N-glicosilación).

Las moléculas de ácido nucleico codificantes para anticuerpos anti-IL-13R1 con secuencias de aminoácidos variantes se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos en el estado del arte. Estos métodos incluyen, aunque no se limitan a, la extracción a partir de la fuente natural (para el caso de las variantes de aminoácidos que se generen de forma natural) o la preparación por mutagénesis dirigida o mediada por oligonucleótido, mutagénesis por PCR o por mutagénesis por casete de una versión variante o no variante del anticuerpo anti-13R1 preparado con anterioridad.

Otro tipo de modificación covalente es la que implica el enlace al anticuerpo por vía química o enzimática de grupos glucosídicos. Estos procedimientos presentan la ventaja de no requerir la producción del anticuerpo en una célula huésped que tenga la capacidad de glicosilar ya sea por vía N-u O-. Dependiendo del tipo de acoplamiento utilizados, el azúcar/es puede ser unido (a) a un residuo de arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina

o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como serían el triptófano, la fenilalanina o la tirosina, o (f) al grupo amida de la glutamina. Estos métodos están descritos en WO 87/05330, y en Aplin, J.D., y Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306.

La eliminación de cualquiera de los grupos carbohidrato presentes en el anticuerpo se puede conseguir por métodos enzimáticos o químicos. La desglicosilación química puede conseguirse por la exposición del anticuerpo a ácido trifluorometanosulfónico, o a compuestos equivalentes. Este tratamiento da como resultado la separación de la mayor parte de los azúcares excepto los de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando el anticuerpo intacto, la deglicosilación química esta descrita por Sojahr, H.T., y Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 y por Edge, A.S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. La separación enzimática de los grupos carbohidrato de los anticuerpos puede conseguirse mediante el uso de una gran variedad de endo-y exoglicosilasas, tal y como está descrito por Thotakura, N.R., y Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo consiste en la unión al anticuerpo a cualquiera de toda una variedad de polímeros de carácter no proteico, como puede ser el polietilenglicol, el polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida en las patentes Estadounidenses con los números 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

En otro aspecto diferente, la invención proporciona células B aisladas a partir de animales transgénicos, por ejemplo un ratón transgénico, que expresa los anticuerpos humanos anti-IL-13R1 de acuerdo con la invención. Preferiblemente, las células B aisladas se obtienen a partir de de animales transgénicos no humanos, por ejemplo el ratón, que hayan sido inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno IL-13R1 y/o células que expresen el IL-13R1. De preferencia, el animal transgénico no humano, por ejemplo el ratón, tiene un genoma que incluye el transgen codificante para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención. Las células B aisladas son a continuación inmortalizadas para proveer una fuente (un hibridoma) de anticuerpos humanos anti-IL-13R1. En consecuencia, la presente invención también provee un hibridoma con la capacidad de producir anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con la invención. En una de las realizaciones, el hibridoma incluye una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que posee un genoma que incluye un transgen codificante para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención, fusionada con una célula inmortalizada.

En una realización particular, el animal transgénico no humano es un ratón transgénico que posee un genoma con un transgen codificante para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención. El animal transgénico no humano puede ser inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno IL-13R1 y/o células que expresen el IL-13R1. De preferencia, el animal transgénico no humano, por ejemplo el ratón transgénico, será capaz de producir anticuerpos monoclonales humanos del isotipo IgG1 frente al IL-13R1.

Los anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con al invención pueden obtenerse mediante la inmunización de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que posea un genoma con un transgen codificante para la cadena pesada humana y el transgen para la cadena ligera humana, codificando la totalidad o una parte de un anticuerpo de la invención, con una preparación purificada o enriquecida de antígeno IL-13R1 y/o células que expresen el IL-13R1. A continuación se obtienen las células B del animal (por ejemplo células B de bazo) y se fusionan con células de mieloma para conseguir células de hibridoma inmortales que secreten anticuerpos monoclonales humanos frente al IL-13R1.

En una realización preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IL-13R1 pueden ser generados, utilizando para ello ratones transgénicos portadores de partes del sistema inmunitario humano en lugar del propio del ratón. Esos ratones transgénicos, designados a partir de aquí como “ratones huMab”, contienen miniloci para genes de las inmunoglobulinas humanas no reorganizados, incluyendo los genes para las regiones constantes de las cadenas pesadas (µ e γ) y ligera κ, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci para las cadenas µ y κ endógenas (Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859). De forma correspondiente, estos ratones presentarán una reducción de la expresión de las IgM o K de ratón, y como respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos para las cadenas pesada y ligera humanas sufrirán intercambio de clase y mutaciones somáticas para generar anticuerpos monoclonales humanos IgG de alta afinidad (Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; revisado en Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N., y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; y Harding, F., y Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536546). La preparación de HuMab en ratones está descrita por Taylor, L., et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., et al., International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724; Choi, T.K., et al., Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821830; Tuaillon, N., et al., Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor, L., et al., Int. Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonberg, N., y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; Harding, F., y Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546; Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851. Para más información véanse las patentes Estadounidense número 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.545.807; 5.770.429; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; y WO 92/03918.

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a IL-13R1, los ratones HuMab pueden ser inmunizados con una preparación de antígeno IL-13R1 purificado o enriquecido y/o células que expresen IL-13R1 de acuerdo con el método general, tal y como está descrito por Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 y WO 98/24884. Preferiblemente, los ratones tendrán de 6 a 16 semanas de edad en el momento de la primera inmunización. Por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida del antígeno IL-13R1 (por ejemplo, purificado a partir de células que expresen IL-13R1) puede ser utilizada para inmunizar los ratones HuMab intraperitonealmente. Si resultase que las inmunizaciones utilizando una preparación purificada o enriquecida del antígeno IL-13R1 no diesen como resultado la producción de anticuerpos, los ratones pueden ser también inmunizados con células que expresen IL-13R1, por ejemplo una línea celular tumoral, que pudiera inducir respuesta inmunitaria. La experiencia acumulada utilizando diferentes antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos HuMab responden mejor cuando la inmunización inicial se hace por vía intraperitoneal utilizando antígeno con adyuvante completo de Freund, seguida de inmunizaciones semanales alternando la vía intraperitoneal con la subcutánea con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunitaria puede ser monitorizada a lo largo del protocolo de inmunización utilizando muestras de plasma obtenidas por sangrados retroorbitales. El plasma puede ser analizado por ELISA, y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulinas humanas anti-IL-13R1 pueden utilizarse para la inmortalización de las células B correspondientes. Los ratones pueden ser reinoculados con antígeno por vía intravenosa de 3 a 4 días antes del sacrificio y extracción del bazo y nódulos linfáticos. Cabe esperar que sea necesario llegar a realizar de 2 a 3 fusiones para cada antígeno. Varios ratones serán inmunizados para cada antígeno. Por ejemplo, se puede inmunizar un total de 5 a 12 ratones HuMab de las cepas HCo7 y HCo12.

Los ratones HCo7 tienen una disrupción JKD en los genes para su cadena ligera endógena (kappa) (tal como está descrito en Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (tal y como está descrito en el ejemplo 1 del WO 01/14424), un transgen humano KCo5 para la cadena ligera kappa (según lo descrito en Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), y un transgen HCo7 para la cadena pesada humana (según lo descrito en la patente Estadounidense Nº 5.770.429).

Los ratones HCo12 tienen una disrupción JKD en los genes para su cadena ligera endógena (kappa) (tal como está descrito en Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (tal y como está descrito en el ejemplo 1 del WO 01/14424), un transgen humano KCo5 para la cadena ligera kappa (según lo descrito en Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), y un transgen HCo12 para la cadena pesada humana (según lo descrito en el Ejemplo 2 del WO 01/14424).

Los linfocitos de ratón pueden ser aislados y fusionados con líneas celulares de mieloma para producir hibridomas utilizando protocolos estándar basados en el uso de PEG. Los hibridomas resultantes son rastreados para comprobar la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones celulares de linfocitos obtenidos de bazo o nódulo linfático a partir de ratones inmunizados son fusionadas con una sexta parte de células de mieloma de ratón no secretoras SP 2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50%. Las células se plaquean a una densidad aproximada de 2 x 105 en microplacas de fondo plano, incubándose durante unas dos semanas en medio selectivo.

Los pocillos individuales son rastreados por ELISA para detectar los anticuerpos IgM e IgG frente a IL-13R1. Una vez se ha producido el suficiente crecimiento del hibridoma, es analizado el medio, normalmente después de 10 a 14 días. Los hibridomas que secreten anticuerpos son plaqueados de nuevo y caracterizados otra vez, si siguen siendo positivos para anticuerpos humanos monoclonales del tipo IgG frente a IL-13R1, pueden ser subclonados un mínimo de dos veces por dilución limitante. Los subclones estables se cultivan in vitro para obtener medio con producción de anticuerpos para su caracterización.

Debido a que las secuencias CDR son las responsables de las interacciones entre el antígeno y el anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes de acuerdo con la invención mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan las secuencias CDR de acuerdo con la invención dentro de secuencias marco para un anticuerpo humano diferente. (véase por ejemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., et al., Nature 321 (1986) 522-525; y Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86 (1989)10029-10033).Tales secuencias marco pueden ser obtenidas a partir de las bases de datos públicas de DNA que incluyen las secuencias de los genes de las líneas germinales codificantes para anticuerpos humanos. Estas secuencias de líneas germinales se diferenciarán de las secuencias génicas maduras debido que no incluirán regiones variables reorganizadas, que se forman mediante la unión V (D) J durante la maduración de las células B. Las secuencias génicas de las líneas germinales presentan también diferencias puntuales respecto a las secuencias del repertorio secundario de anticuerpos de alta afinidad distribuidas de manera uniforme a lo largo de la región variable.

La invención incluye preferentemente un fragmento de ácido nucleico codificante para un polipéptido con capacidad de unirse al IL-13R1, donde dicho polipéptido inhibe la unión de la IL-13 al IL-13R1, seleccionado a partir del grupo que incluye

a) una cadena pesada de anticuerpo que incluya una de las CDR de cadena pesada con Nº de ID SEC: 1, 3,5, 7o 9;

b) una cadena ligera de anticuerpo que incluya una de las CDR de cadena ligera con Nº de ID SEC: 2, 4, 6, 8o 10.

Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera así reconstruidas, se combinan con las secuencias de un promotor, de iniciación de traducción, región constante, 3’ no traducida, de poliadenilación y de terminación de la transcripción para formar el constructo en el vector de expresión. Los constructos de expresión para las cadenas pesada y ligera pueden ser combinados en un único vector de expresión, transfectarse conjuntamente, de manera consecutiva o de manera separada a las células huésped que son a continuación fusionadas para conseguir una única célula huésped que exprese ambas cadenas.

Como resultado, la invención proporciona un método para la producción de un anticuerpo humano recombinante de acuerdo con la invención, incluyendo la expresión de un ácido nucleico codificante para

a) una cadena pesada de anticuerpo que incluya una de las CDR de cadena pesada con Nº de ID SEC: 1, 3,5, 7o 9;

b) una cadena ligera de anticuerpo que incluya una de las CDR de cadena ligera con Nº de ID SEC: 2, 4, 6, 8o 10.

Asimismo la invención también incluye el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la detección del IL13R1 in vitro, preferentemente por medio de un ensayo inmunológico que determine la unión entre IL-13R1 de una muestra y el anticuerpo de acuerdo con la invención.

Por otro lado, la presente invención provee una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, incluyendo uno o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos, o la parte correspondiente de unión a antígeno, de la presente invención, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tal y como se utiliza a partir de aquí, el término “vehículo farmacéutico aceptable” incluye a todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes y similares que sean fisiológicamente compatibles. De preferencia, el vehículo será adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por inyección o infusión).

El término “sal aceptable farmacéuticamente” hace referencia a una sal que retenga la actividad biológica deseada del anticuerpo sin provocar ningún efecto toxicológico indeseado (véase por ejemplo Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19). Tales sales están incluidas en la invención. Ejemplos de tales sales incluyen las de naturaleza ácida y las de naturaleza básica. Las ácidas incluyen a aquellas derivadas a partir de sales inorgánicas no tóxicas, como serían las sales de hidrocloruro.

Un compuesto de la presente invención puede ser administrado por medio de una variedad de métodos conocidos en el estado del arte. Tal como será evidente para el técnico especialista, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de cuales sean los resultados esperados.

Para administrar un compuesto de la invención a través de ciertas rutas, puede que sea necesario recubrir el compuesto con, o administrarlo conjuntamente con, un material que evite su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un sujeto mediante un vehiculante adecuado, como podrían ser los liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen las soluciones tamponantes salinas y acuosas.

Los vehículos aceptables farmacéuticamente incluyen las soluciones acuosas estériles o dispersiones y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes con sustancias farmacéuticamente activas es conocido en el estado del arte.

Las expresiones “administración parenteral” y “administrado perenteralmente”, tal y como se utilizan aquí hacen referencia a las formas de administración diferentes a la administración tópica o enteral, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitaciones, las vías intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal.

Estas composiciones pueden contener también adyuvantes tales como conservantes, humectantes, emulsificadores

o dispersantes. Para evitar la presencia de microorganismos puede aplicarse algún proceso de esterilización, en la preparación e incluir agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo: el parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar conveniente incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares, a los compuestos. Además, para garantizar la absorción prolongada de compuesto farmacéutico inyectable se pueden incluir agentes retardantes para la absorción tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.

Independientemente de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden emplearse en forma hidratada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan con una dosificación farmacológicamente aceptable mediante métodos convencionales conocidos para aquellos con conocimientos sobre la materia.

Los niveles de dosificación reales para los ingredientes activos dentro de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser variados con el fin de tener una cantidad de ingrediente activo que sea suficiente para producir la respuesta terapéutica deseada en cada paciente particular, composición o modo de administración, sin que llegue a ser tóxico para el paciente. La dosis seleccionada dependerá de una serie de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad cada uno de los compuesto de la presente invención, del éster, sal o amida, de la ruta de administración en particular, del momento de la administración, de la tasa de excreción de uno de los compuestos concretos que se emplee, de la duración del tratamiento, de otras drogas, compuestos y/o materiales administrados en combinación con las composiciones concretas empleadas, de la edad, del sexo, condición, estado general de salud e historia médica previa del paciente en tratamiento, y factores del estilo, bien conocidos por los especialistas médicos.

El compuesto debe ser estéril y fluido, en la medida que permita su administración mediante una jeringa. Además del agua, el vehículo puede ser una solución salina tamponada e isotónica, etanol, polialcohol (por ejemplo el glicerol, propilen glicol, polietilen glicol líquido y similares), y sus mezclas apropiadas.

La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, gracias al uso de recubrimientos tipo lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula deseado en el caso de una dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchas ocasiones, es preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, como el manitol o el sorbitol, y cloruro sódico. La absorción a largo plazo de los compuestos inyectables puede conseguirse por la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina.

Listado de Secuencias

Descripción del Listado de Secuencias

Nº ID SEC:1 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-002

Nº ID SEC:2 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-002

Nº ID SEC:3 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-003

Nº ID SEC:4 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-003

Nº ID SEC:5 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-005

Nº ID SEC:6 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-005

Nº ID SEC:7 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-007

Nº ID SEC:8 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-007

Nº ID SEC:9 dominio variable de la cadena pesada del HuMab LC5002-018 Nº ID SEC: 10 dominio variable de la cadena ligera del HuMab LC5002-018 Nº ID SEC: 11 región constante κ de la cadena ligera Nº ID SEC: 12 región constante 1de la cadena pesada

Descripción de las figuras

Figura 1 muestra la unión de anticuerpos anti-IL-13Rα1 al polipéptido IL-13R1 humano recombinante previamente inmovilizado. Se incluyen el anticuerpo policlonal de conejo anti-IL-13R1 humana AF152 (R&D systems) y un anti-KLH como Monoclonal humano para control negativo.

Figura 2 muestra la inhibición de la unión a IL-13 mediante anticuerpos anti-IL-13α1, utilizando un receptor IL-13R1/IL-4Rα inmovilizado.

Figura 3 muestra el bloqueo de la unión de IL-13 a células CHO (que expresan IL-13Ralpha1 e IL4R2) mediante anticuerpos anti-IL-13Rα1. Como control positivo se usa un anticuerpo anti-IL-13Rα1 comercial (AF152, R&D Systems, Minneapolis, MN).

Figura 4 muestra la unión de los anticuerpos anti-IL-13Rα1 a hIL-13R1 y las propiedades de unión a receptores relacionados funcionalmente como hIL-13R2 y hIL-4R.

Figura 5 muestra la capacidad de los anticuerpos anti-IL-13Rα1 para unirse al polipéptido recombinante de IL-13R1 murino, previamente inmovilizado. Se incluyen el anticuerpo policlonal de cabra anti-IL13R1 humana AF152 (R&D systems) y un anti-KLH como Monoclonal humano para control negativo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Generación de hibridomas

Los anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con la invención pueden ser producidos mediante la inmunización de animales transgénicos, como puede ser un ratón transgénico que tenga un genoma que incluya transgenes para las cadenas pesada y ligera codificantes para todo o una parte de un anticuerpo de la presente invención, con células que expresen el IL-13Rα humano. Tras ello se obtienen células B del bazo del animal y se fusionan con células de mieloma para conseguir líneas de hibridoma inmortales que puedan secretar anticuerpos monoclonales humanos frente a IL-13R1. Se pueden generar anticuerpos monoclonales humanos frente a IL13R1 utilizando ratones humanos portadores de partes del sistema inmunitario humano en lugar del propio. Estos ratones transgénicos se denominarán, de aquí en adelante, como ratones "HuMab", estos contienen un minilocus para la inmunoglobulina humana que incluye genes no reorganizados de las regiones constantes de las inmunoglobulinas humanas, tanto para la cadena pesada (µ e ) como ligera ĸ (kappa), junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos para las cadenas µ y kappa (Lonberg N., et al., Nature 368 (1994) 856859). Gracias a esto, los ratones muestran una expresión reducida de las IgM o ĸ de ratón, y, como respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos para las cadenas ligera y pesada humanas sufren switching de clase y mutaciones somáticas para generar anticuerpos monoclonales IgG humanos de alta afinidad para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos frente a IL-13R1, los ratones HuMab pueden inmunizarse con células que expresen IL-13R1 humano de acuerdo con el método general, tal y como está descrito por Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 y WO 98/24884. Preferiblemente, los ratones deben tener de 6 a 16 semanas de edad al recibir la primera inmunización. Por ejemplo, las células transfectadas con IL-13R1 pueden emplearse para inmunizar los ratones HuMab vía intraperitoneal. La respuesta inmunitaria puede monitorizarse a lo largo del protocolo de inmunización mediante la extracción de muestras de plasma obtenidas por sangrados periorbitales. El plasma puede ser rastreado por ELISA y/o FACS. Los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-IL-13R1 humana, pueden ser utilizados para inmortalización de las células B correspondientes. Los ratones pueden ser reinmunizados por vía intravenosa con el antígeno unos 3 o 4 días antes del sacrificio y extracción del bazo y nódulos linfáticos. Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones HuMab de las cepas HCo7 o HCo12. Los ratones HCo7 tienen una disrupción JKD en sus genes endógenos para la cadena ligera (kappa) (descrito en Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (descrito en WO 01/14424), un transgen para la cadena ligera kappa humana KCo5 (descrito en Fishwild, D.M., et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851), y un transgen para la cadena pesada humana HCo7 (descrito en Estadounidense 5.770.429). Los ratones HCo12 tienen una disrupción JKD en sus genes endógenos para la cadena ligera (kappa) (descrito en Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), una disrupción CMD en sus genes endógenos para la cadena pesada (como se describe en el ejemplo 1 de WO 01/14424)) un transgen KCo5 para la cadena ligera humana kappa (descrito en Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851, y un transgen HCo12 para la cadena pesada humana (descrito en el ejemplo 2 de WO 01/14424). Los linfocitos de ratón pueden ser aislados y fusionados con una línea de mieloma de ratón utilizando PEG según los protocolos estándar para generar hibridomas. A continuación, los hibridomas resultantes son rastreados para determinar la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones celulares de linfocitos derivados del bazo y de los nódulos obtenidas a partir de ratones inmunizados se fusionan con células de mieloma SP/2 no secretoras de ratón (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50%. Las células se ponen en cultivo a una densidad de 0,75 x 107 en microplacas de fondo plano, seguido de unas dos semanas de incubación en medio selectivo. Los pocillos individuales son rastreados por ELISA y/o FACS para la presencia de anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG anti-IL-13R1. Una vez se ha obtenido un crecimiento suficiente de los hibridomas, los que secretan anticuerpos son plaqueados de nuevo, y si se mantienen positivos para anticuerpos monoclonales IgG humanos anti-IL-13R1, pueden ser subclonados como mínimo dos veces por dilución limitante. Los subclones estables son cultivados in vitro para producir anticuerpos en medio de cultivo para su caracterización.

Procedimiento de inmunización de los ratones transgénicos

Tres ratones HCo7 (3 machos), cepa GG2201 (Medarex, San Jose, CA, USA) y 2 ratones HCo12 (1 macho y una hembra), cepa GG2198 (Medarex, San Jose, CA, USA) fueron inmunizados con 1 x 106 células HEK293, previamente transfectadas con un vector de expresión para IL-13R1. En total se procedió a ocho inmunizaciones, alternando la vía intraperitoneal (i.p.) con la subcutánea (s.c.) en la base de la cola. Para la primera inmunización se mezclaron 100 µl de células HEK293: IL-13R1 a 1 x 106 con 100 µl de adyuvante completo de Freund (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA). Para todas las demás inmunizaciones se mezclaron 100 µl de células en PBS con 100 µl de adyuvante incompleto de Freund (ICFA; Difco).

Reinoculación de los ratones

Cuando los títulos de suero de anti-IL-13R1 se demostraban suficientes, los ratones eran reinoculados de nuevo dos veces con células HEK293: IL-13R1 a 1 x106, en 200 µl de PBS (i.v.) 4 y 3 días antes de la fusión.

Ejemplo 2 Comprobación por ELISA de la unión de los HuMab al IL-13Rα1 inmobilizado

Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse a IL-13R1 recombinante, el dominio extracelular de IL-13R1 (R&D Systems, UK) fue disuelto en PBS (1µg/ml) y se adsorbió a microplacas (NUNC Maxisorb) mediante una incubación a 4°C durante toda la noche. Tras un lavado de las placas con tampón de lavado (TL = 0,9 % NaCl; 0,1% Tween® 20) los lugares de unión no específica fueron bloqueados mediante la adición de 100µl tampón de incubación (TI = PBS con 1% de proteína C y 0,1% de Tween® 20) e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Tras esto se hicieron diluciones seriadas de los HuMab y de los anticuerpos control (100µl /pocillo; diluciones en TI), estas se añadieron e incubaron durante 1h a TA. Las placas fueron lavadas de nuevo y los anticuerpos humanos unidos se detectaron mediante una incubación con anti kappa humano de conejo conjugado a peroxidasa (DAKO, Dinamarca) a una dilución final de 1:500 en TI. Los anticuerpos policlonales de cabra anti-hIL-13R1 se detectaron con un policlonal anti IgG de cabra producido en burro y conjugado con peroxidasa (Santa Cruz; dilución 1:1000 en TI). Tras incubarse durante 1h a TA y tras un nuevo paso de lavado, las placas se revelaron con solución ABTS® lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH) a TA en la oscuridad. La absorbancia a 405nM se midió en el momento en que la absorbancia de la concentración más alta alcanzaba un valor suficiente.

Todos los anticuerpos frente a IL-13Ralpha1 que se probaron fueron capaces de unirse al dominio extracelular inmovilizado del IL-13R1 humano. Los valores de EC50 que se determinaron estaban en el rango de 0,5 -2nM para los diversos anticuerpos LC testados. El anticuerpo HuMab anti-KLH que se utilizó como control negativo no se unió al dominio extracelular inmovilizado de IL-13R1. El control positivo, anticuerpo de cabra anti-IL-13R1 humano, se unió también de forma eficiente al dominio extracelular inmovilizado de IL-13R1 (Fig.1).

Ejemplo 3 Inhibición de la unión de IL-13 al hetrodímero IL-13Rα1/IL-4Rα (ELISA)

Se tapizaron microplacas con 100µl de la proteína quimérica hIL-13R1: hFc (R&D Systems, UK) disuelta en PBS a 3µg/ml durante toda la noche a 4ºC, en agitación. Tras lavar las placas con TL se añadieron diluciones seriadas de anticuerpos HuMab y controles (100 µl /pocillo; diluciones en TI) y se incubaron durante 30 minutos a TA. Las placas fueron lavadas de nuevo y tras ello se añadió una mezcla de IL-13 (R&D Systems, UK; a 0,5µg/ml; diluido con TI) con IL-4Rα (R&D Systems, UK; 0,75µg/ml; diluido con TI), incubándose durante 1h a TA. Tras el lavado de las placas, se añadieron 100µl de anticuerpo biotinilado anti IL-13 (BAF213; R&D Systems, UK) a una concentración de of 0,4µg/ml y se incubó durante 1h a TA. Tras lavar las placas, se detectó la IL-13 unida mediante estreptavidina unida a peroxidasa (Roche Diagnostics GmbH, DE) a una dilución de 1:5000 en TI (1h a TA). Finalmente, las placas fueron lavadas y reveladas con solución de ABTS® lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH, DE) a TA en la oscuridad. La absorbancia a 405 de midió tras 45 – 60 minutos.

Los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 fueron capaces de inhibir la unión de la IL-13 al receptor heterodimérico con unos valores máximos de inhibición de un 50 a un 80-85%. El control positivo era AF152 (anticuerpo policlonal de conejo). Tal y como se esperaba, el control negativo, anti-KLH, no inhibió la unión de IL-13 al receptor heterodimérico. Los valores de CI50 obtenidos estaban entre 1,5nM y 10,1nM para LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 (Fig.2).

Ejemplo 4 Ensayo de unión con radioligando

El ensayo de unión de 125I IL-13 se llevó a cabo sobre células CHO que expresan los IL-13Rα1 y IL-4Rα humanos, disueltas en tampón de unión (HEPES 25mM, NaCl 150mM, CaCl2 1mM, MgCl2 5mM, y albúmina sérica bovina al 0,5%, ajustado a pH 7,2). Se mezclaron 1x105 células por pocillo con los anticuerpos y se preincubó de 15 minutos a 1 hora. Tras esto se añadió 125I-IL-13 0,1nM y la mezcla se incubó a 4ºC durante 4 horas. La concentración de 125IIL-13 utilizada en el ensayo se determinó a partir de análisis de saturación de unión, de competición y por la determinación de la cantidad de 125I IL-13 necesaria para alcanzar el equilibrio de unión con la línea celular. Las muestras se recogieron en una placa con filtro GF/C pretratada con PEI 1% / BSA 0.5% y medidas en un contador de centelleo Packard TopCount. El análisis de los datos se llevó a cabo con el software PRISM utilizando el ajuste no lineal a una curva de regresión (GraphPad Software, San Diego, CA).

Todos los anticuerpos frente al IL-13Ralpha1 probados bloqueaban la unión de la IL-13 marcada al complejo IL13Rα1/IL-4Rα. Los valores de CI50 calculados para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002007 y LC5002-018 se encontraban entre 0,09nM y 0,32nM, con 84,8nM para el AF152 (Fig.3).

Ejemplo 5 Inhibición por parte de los anticuerpos HuMab de la regulación positiva de CD23 inducida por IL-13 en células B humanas y monocitos.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante gradiente de densidad de Ficoll Hypaque. Tras un lavado de las células con RPMI, estas fueron resuspendidas en RPMI/10% FCS y distribuidas a una densidad de 3x105 PBMC/pocillo (50 µl de volumen) en microplacas de 96 pocillos de fondo plano (Corning Incorporated Costar). Tras esto, se añadían 25 µl de anticuerpo anti CD40 humano (Immunotech) a una concentración final de 0,5 µg/ml en RPMI/10% FCS y 25 µl de anticuerpo anti IgA+IgG+IgM humanas (Immunoresearch) a una concentración final de 10 µg/ml en RPMI/10%FCS. Tras esto se añadieron diluciones seriadas de los anticuerpos HuMab y control (50µl/pocillo; diluciones en RPMI/10% FCS) y se incubaron durante 30 min en la estufa (37°C; 5% CO2). A continuación se añadió IL-13 humana recombinante (R&D Systems) a una

concentración final de 0,67 ng/ml (50 µl/pocillo), incubándose las células durante 72h a 37°C/5% CO2. Tras esta

incubación las placas fueron centrifugadas y el medio aspirado. Para desenganchar las células se añadieron 200 ul de Accutase (PAA) y se incubaron las células durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC; 5% CO2. Las células se desprenden por aclarado repetido y se transfieren a una placa de fondo redondo. Tras centrifugar y aspirar los

sobrenadantes las células fueron incubadas con 200 ul de una mezcla de anti-CD23-PE, anti-CD20-FITC y antiCD14-APC (todos ellos de BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Las células fueron incubadas durante 30 minutos a 4ºC, centrifugadas y los sobrenadantes aspirados. Este paso de lavado fue repetido nuevamente y se resuspendió las células en 200µl de PBS/0,1% albúmina de suero humano y analizadas por FACS mediante un citómetro de flujo Calibur (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) empleando el software CellQuest. En la mayor parte de los casos se adquirieron 10000 eventos, siendo seleccionados y agrupados según la dispersión de la luz, incluyendo sólo los monocitos y linfocitos viables. Las células fueron preagrupadas en linfocitos B, positivos para CD19, o en monocitos, positivos para CD14, y fueron analizados para la expresión de CD23.

Los valores observados de CI50 para la inhibición de la regulación positiva del CD 23 en linfocitos B estaban entre 0,5nM y >70nM para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 y 13,6nM para AF152. Para la inhibición de la regulación positiva de CD23 inducida por IL-13 se observó un patrón similar en los monocitos humanos. En el caso de los monocitos los valores de CI50 estaban entre 0,1nM y 62,8nM para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 y 62,9nM para AF152.

Ejemplo 6 Ensayo de proliferación de TF-1 en respuesta a estímulo por IL-13 o IL-4

Se cultivaron células TF-1 (ATCC # CRL 2003) en medio de cultivo conteniendo RPMI modificado por la ATCC, FBS al 10%, 1X Pencilina/Estreptomicina, GM-CST a 2ng/ml. Un día antes del ensayo las células se traspasaron a un medio sin GM-CSF. Se incubaron 5 x 103 células por pocillo frente a las concentraciones adecuadas de anticuerpos anti-IL-13Rα1 a 37oC durante 1 hora. A continuación las células fueron estimuladas con IL-13 humana a 2ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) o IL-4 humana a 0,1ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) e incubadas a 37oC durante 48 horas. Las células fueron expuestas a Timidina-Ci 3H a 0,5µM e incubadas a 37oC de 16 a 18 horas. Las muestras se recogieron en placas GFC que habían sido tratadas con PEI al 1%+BSA al 0,25%, utilizando el recogedor para 96 pocillos “Perkin Elmer Filtermate 96 harvester”. Las placas GFC fueron recontadas utilizando un contador de centelleo “Perkin Elmer Top count Scintillation counter”. El análisis de los datos se llevó a cabo con el software PRISM utilizando el ajuste no lineal a una curva de regresión (GraphPad Software, San Diego, CA).

Los anticuerpos anti-KLH no produjeron ningún tipo de inhibición en este ensayo. La misma afirmación resulta válida para LC5002-007. Todos los demás anticuerpos inhibieron la respuesta, incluso LC5002-007 inhibió la respuesta con valores de CI más altos que otros anticuerpo. Los valores de CI50 observados para los diferentes anticuerpos fueron de: 13,50nM para AF152, 9,21nM para LC5002-002, 3,07nM para LC5002-003 y de 0,39nM para LC5002

005. Para la proliferación de TF-1 inducida por IL-4 se obtuvo un perfil similar, sin embargo la potencia de los anticuerpos era inferior en comparación con las respuestas inducidas por IL-13. Los valores de CI50 para la proliferación inducida por IL-4 fueron de 0,02nM para el anticuerpo anti-IL4R, de 74,37nM para AF152 y para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018 de entre 4,68nM y 60nM.

Ejemplo 7 Inhibición de la producción de eotaxina como respuesta a la IL-13 en fibroblastos humanos de pulmón.

El ensayo se llevó a cabo utilizando células HFL-1 (Human Lung Fibroblast, ATCC # CCL-153). Las células fueron sembradas a una densidad de unas 100.000 células por pocillo en una placa de 12 pocillos y se incubaron a 37oC durante 72 horas hasta alcanzar confluencia. Las células fueron posteriormente mantenidas en medio libre de suero durante 24 horas y tratadas con anticuerpos anti-IL-13Rα1 a 37oC durante 1 hora. A continuación de este tratamiento las células fueron estimuladas con IL-13 a 10ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 37oC durante 48 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se determinó el contenido de eotaxina utilizando el kit comercial de R&D Systems (Cat. No. DTX00). La lectura de absorbancia se hizo con un lector de placas Spectromax y los datos se analizaron con el programa PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA).

Los anticuerpos analizados mostraron diferentes capacidades para inhibir la secreción de eotaxina. Con la excepción de LC5002-007 todos los demás anticuerpos analizados mostraron cierta inhibición. El cálculo de la CI50 promedio a partir de 3 a 4 experimentos fue de 11,5nM para AF152 y de entre 2,45nM y 19,8nM para los anticuerpos LC5002-002, LC5002-003, LC5002-005, LC5002-007 y LC5002-018.

Ejemplo 8 Inhibición de la fosforilación de Stat-6 inducida por IL-13 en células de músculo liso de bronquio humano

Se cultivaron células de músculo liso de bronquio humano (BSMC; Clonetics, Cat. No CC-2576) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células se cultivaron en placas de 12 pocillos hasta que alcanzaron confluencia. En ese momento de dejaron 24 horas en medio sin suero y se añadieron cantidades diversas de anticuerpo. Las placas se incubaron durante 1 hora y a continuación fueron estimuladas con IL-13 a 2,5ng/ml (R&D System). Los sobrenadantes se recuperaron tras una incubación de 15 minutos, las células fueron lavadas con tampón fosfato, añadiéndose finalmente 100µl de tampón de lisis. La mezcla se sonicó brevemente en hielo y se centrifugó. El lisado se empleó para detección por Western Blot de Stat-6 fosforilada. Se cargó un gel de SDS con cantidades equivalentes de proteína y se transfirió a una membrana. El anticuerpo anti-Stat-6 se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Cat. No. SC-11762R) y se utilizó un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa. La detección se llevó a cabo utilizando el sistema ECL Plus System de Amersham (Cat No RPN 2132). La cuantificación se hizo con el sistema Typhoon 9400 Imager. Los dos HuMabs analizados en este ensayo (LC50002-003 y LC5002-005) inhibían la fosforilación de Stat-6 inducida por la IL-13. La potencia observada en este ensayo fue similar a la de otros ensayos funcionales. Los valores de CI50 obtenidos fueron de 18,64nM para AF152, de 5,98nM para LC5002-003 y de 1,18nM para LC5002

005.

Ejemplo 9 Clonación y análisis de la secuencia codificante para los dominios variables (cadenas ligera-imagen1 y pesada-imagen2 1) del HuMab anti-hIL-13Rα1.

Las secuencias de nucleótidos codificantes para la región variable de la cadena ligera VL y la cadena pesada VH de los anticuerpos HuMabs anti hIL-13R1 fueron aisladas por síntesis de cDNA estándar, seguida por PCR. El RNA total fue obtenido a partir de células de hibridoma a 1x106 – 1x107 empleando para ello el kit GeneRacer™ (Invitrogen). El RNA así obtenido se utilizó como molde para la síntesis de la primera cadena del cDNA y ligación del cebador oligo dT GeneRacer™. La síntesis de la segunda cadena del cDNA y la amplificación subsecuente por PCR de los fragmentos codificantes para la VL y la VH se llevó a término con cebadores antisentido para la cadena ligera y pesada, complementarios a las secuencias de nucleótidos codificantes para la secuencia constante de la cadena ligera-ĸ y pesada-1 y con cebadores específicos 5’ GeneRacer™, respectivamente. Los productos de PCR se clonaron utilizando el kit de clonación TOPO™ TA de InvitrogenTM Life Technologies y el vector de clonación pCR4TOPO™. Los productos de PCR clonados fueron identificados por restricción de los plásmidos apropiados utilizando EcoRI para la digestión, con unos fragmentos esperados con tamaños de unos 740 y 790 pares de bases para la VL y la VH, respectivamente. La secuencia de DNA de los fragmentos de PCR clonados se determinó por secuenciación de doble cadena. Para el procesado de las secuencias de DNA se utilizó el paquete de software del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) en su versión 10.2 y el Vector-NTI 8 (InforMax, Inc). Las secuencias de DNA y proteína fueron alineadas utilizando el módulo CLUSTALW del GCG. Los alineamientos de secuencia se llevaron a cabo utilizando el programa GENEDOC (version 2.1).

Ejemplo 10 Construcción de los plásmidos de expresión para un anticuerpo IgG1 HuMab anti-hIL-13Rα1

Los genes codificantes para las cadenas ligera y pesada del HuMab anti-hIL-13R1fueron ensamblados de forma separada en vectores de expresión para células de mamífero. A continuación los segmentos codificantes para la región variable de la cadena ligera (VL) del HuMab anti-hIL-13R1 y para la región constante κ de la cadena (CL, SEC Nº ID: 11) fueron unidas del mismo modo que se hizo para los segmentos para la región variable de la cadena pesada humana (VH) y para la región constante γ1 de la cadena pesada humana del HuMab anti-hIL-13R 1 (CH1bisagra-CH2-CH3, SEC Nº ID: 12). La información general referente a las secuencias de nucleótidos de las cadenas humanas pesada y ligera, y de su uso de codón está publicado por: Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman,

K. S., y Foeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No. 91-3242.

La unidad de transcripción de la cadena ligera κ del HuMab anti-hIL-13R1 está compuesta por los siguientes 5 elementos:

•

El potenciador inmediato y temprano y el promotor del citomegalovirus humano (HCMV),

•

Un 5’-UT sintético incluyendo una secuencia Kozak,

• Una secuencia señal para la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón incluyendo el intrón de la secuencia señal,

10 • El cDNA clonado para la parte variable de la cadena ligera del HuMab anti-hIL-13R1, dispuesta con una única diana de restricción para BsmI en su extremo 5’, un lugar donante para el corte y empalme “splicing” y una única diana de restricción para NotI en el extremo 3’,

• El gen para la región constante κ humana, incluyendo el potenciador intrónico 2 de ratón para su Ig-κ (Picard, D., y Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82) y 15 • La secuencia señal para poliadenilación (“poli-A”) de la región κ de la inmunoglobulina humana.

La unidad de transcripción de la cadena pesada γ1 del HuMab anti-hIL-13R1 está compuesta por los siguientes elementos:

•

El potenciador inmediato y temprano y el promotor del citomegalovirus humano (HCMV),

•

Un 5’-UT sintético incluyendo una secuencia Kozak,

20 • Una secuencia señal para la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón incluyendo el intrón de la secuencia señal,

• El cDNA clonado para la parte variable de la cadena pesada del HuMab anti-hIL-13R1, dispuesta con una única diana de restricción para BsmI en su extremo 5’, un lugar donante para splicing y una única diana de restricción para NotI en el extremo 3’,

25 • El gen para la región constante γ1 humana, incluyendo el potenciador de ratón para su Ig-µ (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378)

• La secuencia señal para poliadenilación (“poli-A”) de la región γ1 de la inmunoglobulina humana.

Los elementos funcionales para los plásmidos de expresión de la cadena ligera κ y la cadena pesada 1de los 30 HuMab anti-hIL-13R1:

Además del casete de expresión antes descrito para la cadena ligera κ y la cadena pesada 1de los HuMab anti-hIL13R1, estos plásmidos contienen:

• Un gen de resistencia a la higromicina 35 • Un origen de replicación, oriP, del virus Epstein-Barr (EBV)

• Un origen de replicación procedente del vector pUC18 que permite la replicación del plásmido en E.coli, y

• Un gen de la ß-lactamasa que le aporta resistencia a la ampicilina en E.coli.

40 Ejemplo 11 Construcción y expresión de plásmidos para el anticuerpo mutante (variante) anti-hIL-13Rα1 IgG1 Los plásmidos de expresión codificantes para cadenas pesadas 1 mutantes de los anticuerpos anti-hIL-13R1, pueden generarse por mutagénesis dirigida sobre los plásmidos de expresión silvestres utilizando el kit de

45 mutagénesis QuickChangeTM Site-Directed (Stratagene) y están descritos en la tabla 1. Los aminoácidos están numerados de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Ed., NIH Publication No. 91-3242).

50 Tabla 1 Ejemplo 12

Mutación

Descripción

PVA-236; GLPSS331 como se especifica por E233P; L234V; L235A; delta G236;

La secuencia de aminoácidos Glu233Leu234Leu235Gly236 de la cadena pesada humana 1 se sustituye por la secuencia de aminoácidos Pro233Val234Ala235 de la cadena pesada humana 2.

A327G; A330S; P331S

La secuencia de aminoácidos Ala327Leu328Pro329Ala330Pro331 de la cadena pesada

humana 1 se sustituye por la secuencia de aminoácidos Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331 de la cadena pesada humana 4.

L234A; L235A

La secuencia de aminoácidos Leu234Leu235 de la cadena pesada humana 1 se sustituye por la secuencia de aminoácidos Ala234Ala235

Producción de HuMabs recombinantes anti-hIL-13Rα1

Los anticuerpos HuMabs recombinantes fueron generados mediante transfección transitoria de células adherentes

5 HEK293-EBNA (ATTC CRL-10852) cultivadas en medio DMEM (Gibco) complementado con un 10 % de FCS con un contenido muy bajo en IgG (Gibco), Glutamina 2 mM (Gibco), un 1% v/v de aminoácidos no esenciales (Gibco) y 250 µg/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH, DE). Para la transfección se utilizó el reactivo de transfección Fugene™ 6 (Roche Diagnostics GmbH, DE) en una proporción de reactivo (µl) respecto a DNA (µg) entre 3:1 y 6:1. Las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina fueron expresadas a partir de dos plásmidos diferentes, utilizando una

10 proporción molar de plásmidos codificantes para cadenas pesadas y ligeras de 1:2 a 2:1. Los sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpos monoclonales humanos (HuMab) fueron recuperados entre los días 4 y 11 tras la transfección.

Se puede encontrar información general referente a la expresión recombinante de anticuerpos humanos en líneas 15 como las HEK293 en: Meissner, P., et al., Biotechnol Bioeng 75 (2001) 197-203.

Ejemplo 13

a) Análisis de afinidad de los HuMabs LC5002-003, -005, and -007 frente a hIL-13Rα1: hFc quimérico

Para los análisis de interacción se empleo como instrumento el Biacore 3000. Como tampón de carrera y de

20 reacción se utilizó HBS-P (HEPES 10mM, NaCl 150mM, polisurfactante P al 0,005%, pH 7,4) a 25°C. Las moléculas capturadoras (anticuerpos de cabra anti IgG humano, específicos para Fc) se enlazaron por su amina a una concentración de 20µg/ml con un flujo de 5µl/min durante 20 minutos. Los HuMabs se inyectaron a una concentración de 1µg/ml con un flujo de 10µl/min durante 1 minuto. El bloqueo de los anticuerpos de cabra anti IgG-F, Fcγ humano que quedasen libres se hizo mediante la inyección de gammaglobulina humana 500nM a un flujo de

25 30µl/min durante 3 minutos. El analito (la proteína quimérica hIL-13R1: hFc) se inyectó durante dos minutos a cinco concentraciones diferentes, entre 5,63nM y 90nM, haciéndose un lavado con el tampón HBS-P durante cinco minutos. La regeneración de la superficie se obtuvo mediante dos inyecciones de HCl 100mM HCl durante 1 minuto. El chip, formato del ensayo y la secuencia de inyecciones, así como los datos cinéticos son los descritos en la tabla

2. Para la corrección de la deriva intrínseca de la línea base del sistema los datos del control negativo (curvas con el

30 tampón) se restaron de las curvas generadas por las muestras. Para el análisis de los sensogramos y el cálculo de los datos de afinidad se utilizó el software BiaEvaluation versión 4.01. Los datos de las cinéticas se obtuvieron por ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 de Langmuir (Tabla 2).

Tabla 2:

35 Análisis de afinidades de HuMab sobre hIL-13Rα1: hFc. Análisis de datos basado en un modelo de unión 1:1 de Langmuir

Chip

Captura dor Ligando Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)

CM5

AntihFcγ LC5002003 hIL-13 R1:hFc 2,1x105 1,4x10-6 <6,5x10-12

CM5

AntihFcγ LC5002005 hIL-13 R1:hFc 1,73x105 3,12x10-6 1,8x10-11

CM5

AntihFcγ LC5002007 hIL-13 R1:hFc 1,19x105 1x10-6 <8,4x10-12

b) Análisis de afinidad de los HuMabs LC5002-003, -005 and -007 sobre el dominio extracelular del hIL-13Rα1

40 obtenido a partir de la proteína quimérica hIL-13Rα1: hFc Para los análisis de interacción se empleo como instrumento el Biacore 3000. Como tampón de carrera y de reacción se utilizó HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, polisurfactante P al 0,005 %, pH 7,4) a 25°C. Las moléculas capturadoras (anti-hFc) se enlazaron por su amina a una concentración de 100 µg/ml con un flujo de 5µl/min durante 20 minutos. Los HuMabs se inyectaron a una concentración de 10µg/ml con un flujo de 10µl/min

45 durante 30 segundos. Las moléculas hIL-13R1 procesadas (MW40kDa) se inyectaron durante 200 segundos a siete concentraciones diferentes, entre 1,56nM y 100nM, haciéndose un lavado con el tampón HBS-P durante cinco minutos. La regeneración de la superficie se obtuvo mediante dos inyecciones de HCl 100 mM HCl durante 1 minuto cada una con un flujo de 10µl/min. El chip, formato del ensayo y la secuencia de inyecciones, así como los datos cinéticos son los descritos en la tabla 3. Los datos de las cinéticas se obtuvieron por ajuste de los datos a un modelo

50 de unión 1:1 de Langmuir.

Tabla 3:

Chip

Capturad or Ligando Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)

C1

Anti-hFcγ LC5002002 hIL-13R1 1,1x106 6,5x10-4 6,2x10-10

C1

Anti-hFcγ LC5002003 hIL-13R1 1,3x106 5,1x10-4 3,9x10-10

C1

Anti-hFcγ LC5002005 hIL-13R1 1,4x106 3,0x10-4 2,2x10-10

C1

Anti-hFcγ LC5002007 hIL-13R1 1,9x105 8,3x10-4 4,4x10-9

C1

Anti-hFcγ LC5002005, Mutante L234A; L235A hIL-13R1 1,4x106 2,9x10-4 2,1x10-10

c) Análisis comparativo de la afinidad de las variantes recombinantes de LC5002-005, empleando el domino extracelular del hIL-13Rα1 procesado a partir de la proteína quimérica hIL-13Rα1: hFc.

5 En estos experimentos se comparó la afinidad de la IgG1 original, derivada del hibridoma con las afinidades de las variante recombinante IgG1-Ala-Ala. Para los análisis de interacción se utilizó el Biacore 3000. Como tampón de carrera y de reacción se utilizó HBS-P (HEPES 10mM, NaCl 150mM, polisurfactante P al 0,005%, pH 7,4) a 25°C. Las moléculas de anticuerpo capturadoras (anti-hFc) se enlazaron por su amina a una concentración de 20µg/ml con un flujo de 5µl/min durante 20 minutos. Los HuMabs se inyectaron a una concentración de 10µg/ml con un flujo

10 de 10µl/min durante 1 minuto. Las moléculas hIL-13R1 procesadas (analito) se inyectaron durante 5 minutos a ocho concentraciones diferentes, entre 1,56nM y 200nM, haciéndose un lavado con el tampón HBS-P durante cinco minutos. La regeneración de la superficie se obtuvo mediante dos inyecciones de HCl 100mM HCl durante 1 minuto cada una. El chip, formato del ensayo y la secuencia de inyecciones, así como los datos cinéticos son los descritos en la tabla 4. Los datos de las cinéticas se obtuvieron por ajuste de los datos a un modelo de unión de analito

15 bivalente.

Tabla 4:

Ejemplo 14

Chip

Capturado r Ligando Analito ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) ka2 (1/RUs) kd2 (1/s) KD (M)

CM5

Anti-hFcγ LC5002005 hIL-13 R1 1,33x105 3,6x10-4 5,8x10-3 0,06 2,7x10-9

CM5

Anti-hFcγ IgG1 ala-ala LC5002005 hIL-13 R1 1,53x105 4,2x10-4 4,1x10-3 0,04 2,8x10-9

Comprobación por ELISA de la reacción cruzada de los HuMab frente a hIL-13Rα2 y a hIL-4Rα

20 Las proteínas quiméricas hIL-13R2: hFc y hIL-4R: hFc (R&D Systems, UK) fueron disueltas en PBS (1µg/ml) y adsorbidas a microplacas (NUNC Maxisorb) mediante una incubación durante toda una noche a 4ºC. Tras un lavado de las placas con tampón de lavado (TL = 0,9 % NaCl; 0,1% Tween® 20) los lugares de unión no específica fueron bloqueados mediante la adición de 100 µl tampón de incubación (TI = PBS con 1% de proteína C y 0,1% de Tween® 20) incubándose durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Tras esto se hicieron diluciones seriadas de los

25 HuMab y de los anticuerpos control (100µl /pocillo; diluciones en TI), estas se añadieron e incubaron durante 1h a TA. Las placas fueron lavadas de nuevo y los anticuerpos humanos unidos se detectaron mediante una incubación con anti kappa humano de conejo conjugado a peroxidasa (DAKO, Dinamarca) a una dilución final de 1:500 en TI. Tras incubarse durante 1h a TA y tras un nuevo paso de lavado, las placas se revelaron con solución ABTS® lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH) a TA en la oscuridad. La absorbancia a 405nM se midió en el momento en

30 que la absorbancia de la concentración más alta alcanzaba un valor suficiente.

Todos los anticuerpos frente al IL-13Ralpha1 analizados demostraron unión al dominio extracelular inmovilizado del IL-13R1 humano, pero no a hIL-13R2 ni a hIL-4Rα (Fig. 4).

35 Ejemplo 15 Reacción cruzada de los con el IL-13Rα1 murino La proteína quimérica murina IL-13R1: hFc (R&D Systems, UK) se disolvió en PBS (1µg/ml) incubándose en

microplacas para su adsorción (NUNC Maxisorb) mediante incubación a 4ºC toda la noche. Tras un lavado de las placas con tampón de lavado (TL = 0,9% NaCl; 0,1% Tween® 20) los lugares de unión no específica fueron bloqueados mediante la adición de 100 µl tampón de incubación (TI = PBS con 1% de proteína C y 0,1% de Tween® 20) e incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Tras esto se hicieron diluciones seriadas de los 5 HuMab y de los anticuerpos control (HuMab anti-KLH y policlonal de cabra anti-hIL-13Rα1 (R&D Systems)), se añadieron a los pocillos (100µl /pocillo; diluciones en TI), estas se añadieron e incubaron durante 1h a TA. Las placas fueron lavadas de nuevo y los anticuerpos humanos unidos se detectaron mediante una incubación con anti kappa humano de conejo conjugado a peroxidasa (DAKO, Dinamarca) a una dilución final de 1:500 en TI. Los anticuerpos policlonales de cabra anti-hIL-13R1 se detectaron con un policlonal anti IgG de cabra producido en

10 burro y conjugado con peroxidasa (Santa Cruz; dilución 1:1000 en TI). Tras incubarse durante 1h a TA y tras un nuevo paso de lavado, las placas se revelaron con solución ABTS® lista para su uso (Roche Diagnostics GmbH) a TA en la oscuridad. La absorbancia a 405nM se midió en el momento en que la absorbancia de la concentración más alta alcanzaba un valor suficiente (Fig. 5).

15 Ejemplo 16 Reacción cruzada de los HuMab frente al IL-13Rα1 de Cynomolgus El gen codificante para el IL-13R1 fue aislado por RT-PCR a partir de tejido de Cynomolgus y fue transfectado a la línea celular murina Ba/F3. Para comprobar si los anticuerpos HuMabs tenían reacción cruzada o no con la IL-13R1 de Cynomolgus, se incubaron tanto las células Ba/F3 transfectadas y estabilizadas como las Ba/F3 parentales frente

20 a HuMab a 10µg/ml y a anticuerpos control. Como control positivo se utilizó un policlonal de cabra anti-hIL-13R1(R&D Systems). Los controles negativos incluidos fueron: una proteína IgG1 de mieloma humano (Nordic) y un suero de cabra normal. Los anticuerpos unidos fueron detectados mediante análisis por FACS utilizando un anticuerpo frente a la IgG humana conjugado con FITC para detectar los HuMabs y un anticuerpo específico para las IgG de cabra conjugado con FITC para la detección de los anticuerpos de cabra. Se compararon las intensidades de

25 fluorescencia medias (IFM) para los diferentes anticuerpos probados sobre la línea transfectada Ba/F3 frente a los obtenidos con la línea parental.

Todos los HuMabs de la invención fueron capaces de unirse al IL-13R1 de Cynomolgus expresado por células Ba/F3 transfectadas. Tal y como era de esperar debido a la gran homología existente entre el IL-13R1 humano y el

30 de Cynomolgus, también el anticuerpo policlonal AF152 presentaba unión al IL-13R1 de Cynomolgus. Los anticuerpos control negativo presentaron sólo un aumento marginal de si IFM cuando se ensayaron con la línea celular Ba/F3 transfectada (Tabla 5).

Tabla 5:

Anticuerpo

IFM Ba/F3 IFM Ba/F3_Cyno_IL13Rα1 Tasa de incremento de la IFM en presencia de CynoIL13Rα1

HuMabs

LC5002-002 3,9 83,7 79,8

LC5002-003

3,4 82,4 79,0

LC5002-005

14,8 101,5 86,7

LC5002-007

4,1 19 14,9

AF152

3,2 21,2 18,0

Controles

IgG de cabra normal 3,3 5,7 2,4

IgG1 humana normal (Nordic)

3,5 10,2 6,7

Sólo IgG-FITC anti-humana

3,3 5,5 2,2

35

Ejemplo 17

Unión de HuMab anti-IL-13Rα1 a recptores de Fcγ (unión a FcγRIIIa en células T asesinas)

Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse a FcRIIIa (CD16) en células T asesinas

(NK), se aislaron en primer lugar Células Mononucleadas de Sangre Periférica (PBMCs) y se incubaron con 40 anticuerpo HuMab a 20 µg/ml y con anticuerpos control en presencia o ausencia de anticuerpo de ratón bloqueante

para FcRIIIa (anti-CD16, clone 3G8, RDI, Flanders, NJ) a 20 µg/ml, comprobándose así la unión vía FcRIIIa.

Como controles negativos se usaron IgG2 e IgG4 humana (The Binding Site), que no se unen a FcRIIIa. Las IgG1 y

IgG3 humanas (The Binding Site) se utilizaron como controles positivos para unión a FcRIIIa. Los anticuerpos

unidos a las células T asesinas se detectaron por análisis de FACS utilizando un anticuerpo anti CD56 humano 45 (marcador de superficie de las células NK) murino, marcado con ficoeritrina (PE) (BD Biosciences Pharmingen, San

Diego, CA) en combinación con un F (ab)2 de cabra anti IgG humana (Fc) marcado con FITC (Protos immunoresearch, Burlingame, CA). Determinándose la unión máxima a 20µg/ml (Umax: IFM±desv.est.) del HuMab analizado.

El LC5002-005 era capaz de unirse a FcRIIIa de forma eficiente (comparable al anticuerpo IgG1 control) tal como indicaba un valor de Umax (IFM) de 580,6±245,8. La adición de un anticuerpo de bloqueo frente a FcRIIIa reducía de forma muy importante la unión de LC5002-005 a las células NK (Umax (IFM) de 260,4±95,90) indicando una unión específica a FcRIIIa.

Listado de Referencias

Aikawa, M., et al., Cytokine 13 (2001) 75-84

Aplin, J.D., and Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306

Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)

Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123

Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270

Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19

Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95

Brueggemann M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361

Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40

Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917

Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344

Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289

Chen, J., et al., International Immunology 5 (1993) 647-656

Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830

Choi, T.K., et al., Nature Genetics 4 (1993) 117-123

Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) p. 77

Durocher, Y., et al., Nicl. Acids. Res. 30 (2002) E9

Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85

Edge, A.S., et al., Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137

EP 0 307434

Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851

Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282

Graber, P., et al., Eur. J. Immunol. 28 (1998) 4286-4298 Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546

Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546

Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168

Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388

Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184

Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555

Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258

Jones, P., et al., Nature 321 (1986) 522-525

Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), NIH Publication No. 91-3242

Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161

Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994)856-859

Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101

Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93

Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527

Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560

Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202

Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597

Meissner, P., et al., Biotechnol Bioeng 75 (2001) 197-203

Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324

Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855

Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378

Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87

Obiri, N.I., et al, J. Biol. Chem. 270 (1995) 8797-8804

Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837

Picard, D., and Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82

Poudrier, J., et al., J. Immunol. 30 (2000) 3157-3164

Poudrier J., et al., J. Immunol., 163 (1999) 1153-1161

Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033

Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327

Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83

Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 Sojahr, H.T., and Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 SwissProt No. O09030 SwissProt No. P24394 SwissProt No. P35225 SwissProt No. P78552 SwissProt No. Q14627 Taylor, L., et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295 Taylor, L., et al., Int. Immunol. 6 (1994) 579-591 Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 Thotakura, N.R., and Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359 Tuaillon, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724 Tuaillon, N., et al., Immunol. 152 (1994) 2912-2920 Patente Estadounidense Nº 4.640.835 Patente Estadounidense Nº 4.496.689 Patente Estadounidense Nº 4.301.144 Patente Estadounidense Nº 4.670.417 Patente Estadounidense Nº 4.791.192 Patente Estadounidense Nº 4.179.337 Patente Estadounidense Nº 5.202.238 Patente Estadounidense Nº 5.204.244 Patente Estadounidense Nº 5.545.806 Patente Estadounidense Nº 5.545.807 Patente Estadounidense Nº 5.569.825 Patente Estadounidense Nº 5.625.126 Patente Estadounidense Nº 5.633.425 Patente Estadounidense Nº 5.661.016 Patente Estadounidense Nº 5.770.429 Patente Estadounidense Nº 5.789.650 Patente Estadounidense Nº 5.814.318 Patente Estadounidense Nº 5.874.299 Patente Estadounidense Nº 5.877.397 van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol 5 (2001) 368-374 Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 WO 87/05330 WO 92/22645 WO 92/03918 WO 93/1227 WO 94/25585 WO 96/29417 WO 97/15663 WO 98/24884 WO 01/14424 WO 03/080675

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> Anticuerpos frente al receptor alfa-1 de la IL-13 y usos de los mismos

<130> 22922 EP

<150> EP 05002229

<151> 2005-02-03

<160> 12

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-002 VH gamma/dominio variable de la cadena pesada

<400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr

20 25 30 22

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Val Ile Ser Gly Arg Gly Ile Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Ser Ser Ser Trp Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-002 VL cadena kappa /dominio variable de la cadena

<400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp

20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-003 VH gamma/dominio variable de la cadena pesada

<400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Ile Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr

20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Arg Gly Ile Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Lys Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-003 VL kappa/dominio variable de la cadena ligera

<400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-005 VH gamma/dominio variable de la cadena pesada

<400> 5 Glu Val Gln Val Leu Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr

20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Leu Ser Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Lys Glu Gly Asp Trp Ile Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ile Val Ser Ser 115

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-005 VL kappa/dominio variable de la cadena ligera

<400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser His Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-007 VH gamma/dominio variable de la cadena pesada

<400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 Ala Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Arg Glu Gly Glu Thr Leu Asp Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-007 VL kappa/dominio variable de la cadena ligera

<400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ile Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ser Ser Leu

85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-018 VH gamma/dominio variable de la cadena pesada

<400> 9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 Ala Lys Gly Ser Ser Trp Tyr Val Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> LC5002-018 VL kappa/dominio variable de la cadena ligera

<400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

<210> 12

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 5 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 10 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 15 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 20 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo que se une al IL-13R1 y que inhibe la IL-13, caracterizado por que la secuencia de aminoácidos de la parte variable de la cadena pesada CDR3 de dicho anticuerpo, se selecciona a partir del grupo de secuencias de la cadena pesada CDR3 compuesto por las Secuencias con Nº ID: 1, 3, 5 o 7 con lo que dicho anticuerpo se obtiene partir de líneas celulares de hibridoma DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 o DSM ACC2712.

2. 2.

   Un anticuerpo que se une al IL-13Rα1 y que inhibe la IL-13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable CDR3 de dicho anticuerpo se elige del grupo constituido por las secuencias CDR3 de cadena pesada con ID de SEC nº: 1, 3 5, 7 o 9 y comprende como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 1 y como región variable de la cadena ligera a la de Nº de SEC: 2, como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 3 y como región variable de la cadena ligera a la de Nº de SEC: 4, como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 5 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº: 6, como región variable de la cadena pesada a la región con ID de SEC Nº: 7 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº: 8 o como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 9 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº:10.

3. 3.

   Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende

   a) como región variable de la cadena pesada la ID de SEC Nº: 1, como región variable de la cadena ligera la ID de SEC Nº:5, como región constante de la cadena ligera κ la ID de SEC Nº: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 la ID de SEC Nº: 12,

   b) como región variable de la cadena pesada la Nº de ID SEC: 3, como región variable de la cadena ligera la Nº de ID de SEC:4, como región constante de la cadena ligera κ la Nº de ID de SEC: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 ID de SEC Nº: 12,

   c) como región variable de la cadena pesada la Nº de ID SEC: 5, como región variable de la cadena ligera la Nº de ID de SEC:6, como región constante de la cadena ligera κ la Nº de ID de SEC: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 la ID de SEC Nº: 12,

   d) como región variable de la cadena pesada la Nº de ID SEC: 7, como región variable de la cadena ligera la Nº de ID de SEC:8, como región constante de la cadena ligera κ la Nº de ID de SEC: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 ID de SEC Nº: 12,

   e) como región variable de la cadena pesada la Nº de ID SEC: 9, como región variable de la cadena ligera la Nº de ID de SEC:10, como región constante de la cadena ligera κ la Nº de ID de SEC: 11 y como región constante de la cadena pesada γ1 ID de SEC Nº: 12.

4. 4.

   Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende en adición las mutaciones L234A y L235A o D265A y N297A.

5. 5.

   El uso de un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones de la 1 a 4 para la fabricación de un compuesto farmacéutico.

6. 6.

   Un compuesto farmacéutico que incluya un anticuerpo que esté acorde con las reivindicaciones de la 1 a 4.

7. 7.

   Una célula huésped recombinante capaz de producir un anticuerpo recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de la 1 a 4.

8. 8.

   Un método para la producción de un compuesto farmacéutico que incluya anticuerpo que esté acorde con las reivindicaciones de la 1 a 4.

9. 9.

   Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo que se une al IL-13Rα1 y que inhibe la IL-13 que comprende como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 1 y como región variable de la cadena ligera a la de Nº de SEC: 2, como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 3 y como región variable de la cadena ligera a la de Nº de SEC: 4, como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 5 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº: 6, como región variable de la cadena pesada a la región con ID de SEC Nº: 7 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº: 8 o como región variable de la cadena pesada a la región con Nº de ID SEC: 9 y como región variable de la cadena ligera a la de ID de SEC Nº:10.

10. 10.

    Un vector de expresión que incluya un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, capaz de expresar dicho ácido nucleico en una célula huésped eucariota o procariota.

11. 11.

    Una célula huésped procariota o eucariota incluyendo el vector de acuerdo con la reivindicación 10.

12. 12.

    Un método para la producción de un polipéptido con capacidad de unión a IL-13Rα1 y que inhiba la unión de IL

    13 a IL-13Rα1, caracterizado por expresar un ácido nucleico codificante para una cadena pesada y un ácido nucleico codificante para una cadena ligera de acuerdo con la reivindicación 9 en una célula huésped procariota o 5 eucariota con la recuperación de dicho polipéptido a partir de la célula citada.
13. 13. Anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 para uso en el tratamiento de un paciente que requiera terapia para el asma o antialérgica.

    10 14. Un método para la preparación del compuesto farmacéutico caracterizado por producir un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a la 4 mediante expresión recombinante, recuperación de dicho anticuerpo y combinación de dicho anticuerpo con un tampón y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables.
14. 15. Las líneas celulares de hibridoma DSM ACC2709, DSM ACC2710, DSM ACC2711 o DSM ACC2712.

    15