ES2367200T3

ES2367200T3 - USO DE LA ACTIVIDAD DE sPLA2 PARA EL DIAGNÓSTICO DE UN EVENTO CARDIOVASCULAR.

Info

Publication number: ES2367200T3
Application number: ES07804686T
Authority: ES
Inventors: Alain Tedgui; Ziad Mallat; Joëlle Benessiano
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2011-10-31
Anticipated expiration: 2027-07-31
Also published as: CA2659428A1; PL2046977T3; JP5484050B2; EP2360268A1; US20090325194A1; EP2046977A1; ATE515574T1; EP2046977B1; JP2009545306A; EP1884571A1; US8187818B2; WO2008015546A1

Abstract

Un método in vitro para determinar un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco en un paciente, que comprende: - determinar el valor de actividad de sPLA2 en una muestra obtenida de dicho paciente como un primer marcador de riesgo, y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rangos de actividades de sPLA, - determinar el valor de un segundo marcador de riesgo: el nivel de CRP, de dicho paciente, y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rangos de niveles de CRP, - estable cer los intervalos combinados obtenidos con los al menos dos de los intervalos mencionados anteriormente de dicho paciente como un tercer marcador de riesgo, estableciendo una relación de probabilidad para dichos intervalos combinados y comparar dicho valor de relación de probabilidad con relaciones de probabilidad predeterminadas de acuerdo a intervalos de rango de actividades de sPLA2 y de rango de niveles de CRP, siendo dichas relaciones de probabilidad predictivas de un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco en un paciente.

Description

La presente invención se refiere al uso de actividad de sPLA2 para el diagnóstico de un evento cardiovascular.

Los trastornos cardiovasculares se encuentran entre las principales causas de morbosidad y mortalidad en los países desarrollados, lo que convierte a la prevención de dichas aflicciones en una preocupación principal de la salud pública.

La inflamación desempeña un papel fundamental en la fisiopatología de plaquetas vulnerables y por consiguiente de eventos coronarios. La medida de marcadores en circulación para la inflamación ha atraído un considerable interés en la última década. Entre ellos, se ha descubierto que la proteína C-reactiva (CRP) es el biomarcador “novedoso” más fuerte identificado hasta el momento para predecir eventos aterotrómbicos en individuos aparentemente sanos, y para añadir un valor predictivo a todos los niveles de riesgo en base a la escala de Framingham (Ridker P.M. y col., N. Engl. J. Med. (2002); 347: 1557-1565). Como resultado, las guías recientes recomiendan que la medida de CRP debería considerarse para pacientes con un riesgo intermedio de enfermedad arterial coronaria (CAD, del inglés “coronary artery disease”) (Pearson T. A. y col., Circulation (2003); 107: 499-511). Sin embargo, aunque la medida de la CRP combinada con el factor de riesgo tradicional es un componente fundamental para la mejorar la predicción del riesgo, todavía existe un espacio importante para la mejora. Actualmente ha emergido un interés por la evaluación del impacto de asociaciones potenciales de marcadores inflamatorios con el objetivo de mejorar la predicción del riesgo absoluto de CAD en la población general (Ridker P. M. y col., Circulation (2004); 109: IV6-19).

Las enzimas de fosfolipasa A2 (PLA2) hidrolizan fosfolípidos en la posición sn-2 para generar lisofosfolípidos y ácidos grasos (Dennis J Biol Chem. (1994) 269: 13057-13060) que conducen a la activación de diversos procesos inmuno-inflamatorios relacionados con la patogénesis y con complicaciones de la aterosclerosis (Hurt-Camejo E. y col., Circ. Res. (2001); 89: 298-304). Una de las PLA2 mejor estudiadas es una PLA2 secretora del grupo IIa de bajo peso molecular (14 kDa), expresada en arterias normales y placas ateroscleróticas (Elinder y col. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (1997) 17: 2257-63) y asociada a un aumento de la susceptibilidad a la aterogénesis en animales (Ivandic B. y col., Castellani L. W. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (1999) 19: 2257-63). Un aumento de la concentración en plasma de sPLA2 de tipo IIA se ha asociado a un riesgo de eventos coronarios en pacientes estables (Kugiyama K. y col., Circulation, (1999), 100: 1280-1284). El papel de otros tipos de sPLA2 en la aterosclerosis es poco conocido. Recientemente se ha demostrado que la medida directa y precisa de la actividad enzimática de sPLA2 en circulación, que abarca varios tipos de sPLA2, es un mejor indicador de las propiedades pro-aterogénicas potenciales de dichas enzimas que la medida de un nivel de masa de sPLA2 particular (Mallat y col., EP Nº 04 291 825.0). Este patente también muestra que la actividad de sPLA2 en plasma es un predictor independiente de muerte y de infartos de miocardios nuevos o recurrentes en pacientes con síndrome coronario agudo, y que proporciona un mejor valor prognóstico que la medida de la concentración de sPLA2 de tipo IIA o de los niveles de CRP. Sin embargo, la actividad de sPLA2 y los niveles de CRP se correlacionan bastante mal (r = 0,47, P<0,0001; EP Nº 04 291 825.0).

La aterosclerosis es una enfermedad inmuno-inflamatoria crónica en la que se incriminan como posibles contribuyentes tanto lípidos oxidados como agentes infecciosos. En un estudio reciente (Mayr M. y col., J. Am. Coll. Cardiol. (2006) 47: 2436-43), se midieron los títulos de inmunoglobulina (Ig)G y de anticuerpos IgM con LDL oxidado con cobre y LDL de malondialdehído (OxLDL-AB), complejos IgG e IgM apolipoproteína B-100 inmunes (ApoB-IC) y se evaluó su relación con factores de riesgo cardiovascular, infecciones crónicas y aterosclerosis carótida incidente/progresiva. Este estudio proporciona evidencias de una asociación entre marcadores de oxLDL humanos e infecciones crónicas. Sin embargo, los autoanticuerpos OxLDL y ApoB-IC no se erigieron como predictores de riesgo independientes para la aterosclerosis carótida en análisis multivariable.

Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar nuevos marcadores combinados que puedan usarse para la prognosis y la diagnosis de trastornos cardiovasculares y que sean más fiables que los de la técnica anterior, y que proporcionen una mejor información que un solo biomarcador.

Otro objetivo de la invención es proporcionar un nuevo método prognóstico y/o diagnóstico de enfermedades cardiovasculares que se tenga significado para gente o pacientes aparentemente sanos con trastornos coronarios.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para determinar un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular en un paciente, que comprende:

-determinar el valor de actividad de sPLA2 de dicho paciente como un primer marcador de riesgo y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rangos de actividad de sPLA,

-determinar el valor de al menos un segundo marcador de riesgo, el nivel de CRP, de dicho paciente y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de nivel de CRP,

-establecer los intervalos combinados obtenidos con los dos intervalos mencionados anteriormente de dicho paciente como un tercer marcador de riesgo, establecer una relación de probabilidad correspondiente a dichos intervalos combinados y comparar dicho valor de relación de probabilidad con relaciones de probabilidad predeterminadas de acuerdo a intervalos de rango de actividad de sPLA2 y de rango de nivel de CRP, siendo dichas relaciones de probabilidad predeterminadas predictivas de un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular en un paciente.

Por “aumento de riesgo” se entiende que un paciente para el cual las relaciones de probabilidad obtenidas a partir de los intervalos combinados es superior que las relaciones de probabilidad predeterminadas, tiene mayor probabilidad de fallecer o de padecer un evento cardiaco y/o vascular que un individuo para el cual la relación de probabilidades obtenida a partir de los intervalos combinados esté por debajo de dichas relaciones de probabilidad predeterminadas.

De acuerdo con la invención, los siguientes eventos son particularmente considerados como eventos cardiacos y/o vasculares: infarto de miocardio (IM), accidente cerebral vascular, hospitalización debida a enfermedades cardiacas y/o vasculares, y procedimientos de vascularización.

La medida de la actividad de sPLA2 puede realizarse mediante un ensayo fluorimétrico según Radvanyi y col. (1989) Anal Biochem. 177: 103-9, modificado según Pernas y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 178: 12981305).

Según otro aspecto de la invención, la medida de la actividad de sPLA2 también puede llevarse a cabo mediante un ensayo fluorimétrico mejorado, usando una medida fluorimétrica automatizada, con un volumen de muestra pequeño, una relación sustrato/enzima modificada (10 nmoles/U en lugar de 50 nmoles/U) y un termostato fijado a 30ºC, que proporciona una mayor precisión y sensibilidad (2,7 % ≤ dentro del coeficiente de variación (CV) del lote ≤ 3,2 % y entre el CV de lote = 5,7 %) que el método anterior (en el lote CV < 10% y entre el lote CV < 10%) y en un tiempo sustancialmente más corto para completar el ensayo.

En particular, se usa el siguiente ensayo para una medida automatizada. Se usa sal sódica de 1-hexadecanoil-2-(1pirenodecanoil)-sn-glicero-3-fosfometanol (Interchim, Montluçon, Francia) como sustrato para sPLA2. La hidrólisis de dicho sustrato mediante sPLA2 da lugar a ácido 1-pirenodecanoico, que emite fluorescencia a 405 nm. En resumen, se distribuyó automáticamente 1 nmol de sustrato fluorescente en 0,2 mL de sustrato tampón (Tris-HCl 10 mM pH 8,7, 0,1% de albúmina, CaCl2 10 mM) en una placa de microtitulación Black Maxisorp (96 pocillos). Debido a las propiedades autolimitantes del sustrato, primero se registra una fluorescencia baja (Fmin) en un fluorímetro Fluostar Optima equipado con un dispositivo de agitación y un termostato fijado a 30ºC. La adición de 30 µL (100 U/mL) de PLA2 de veneno de abeja (Sigma Chemical Co., Francia) conduce a una rápida hidrólisis de todo el sustrato (100% de hidrólisis) y a un aumento de la fluorescencia hasta un valor máximo (Fmax). Para determinar la actividad de sPLA2 en muestras de sangre desconocidas, se distribuyeron automáticamente 30 µL de suero (E) y se añadieron a la mezcla de sustrato. Se registró la fluorescencia a un minuto (F) y que corresponde a una actividad de sPLA2 capaz de hidrolizar 1 nmol de sustrato en un minuto (Vmax). Se usó un procedimiento de dos puntos para medir la intensidad de fluorescencia corregida de cada muestra y para evaluar la actividad enzimática (expresada en nmol/min/mL). Todas las muestras fueron evaluadas por duplicado.

La actividad (A) de la muestra (expresada en nmol/mL/mL/min) se da mediante la siguiente fórmula:

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La hidrólisis del sustrato en ausencia de suero se usa como control negativo y se deduce de la actividad de PLA2. Todas las muestras se evalúan por duplicado.

A menos que se mencione lo contrario, todos los valores numéricos proporcionados en la presente memoria para la actividad de sPLA2 en suero se miden según el ensayo definido antes para la medición automatizada.

La fosfolipasa que puede usarse para llevar a cabo el ensayo es una fosfolipasa secretora o una fosfolipasa con una actividad conocida, y preferiblemente una fosfolipasa de veneno de abeja.

Los niveles de CRP se midieron con un ELISA tipo sándwich según un método descrito en bibliografía (Bruins y col., Circulation, 1997, 96: 3542-3548).

La expresión “relación de probabilidades” para un marcador dado viene dada por la siguiente fórmula:

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El número total de personas debe ser el mismo en cada intervalo.

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Una población dada de individuos puede dividirse en partes iguales (o intervalos), todos ellos con el mismo número de individuos. Se puede dividir por ejemplo en dos, tres, cuatro o cinco partes, y a continuación los intervalos se nombran respectivamente medios, terciles, cuartiles o quintiles. Por tanto, el término intervalo usado en la presente memoria significa medio, tercil, cuartil o quintil.

Cuando se divide en cuatro partes, el primer intervalo o cuartil corresponde a la parte de la población dada con la menor actividad de sPLA2, o con el menor nivel de CRP; el último cuartil corresponde a parte de la población dada con la mayor actividad de sPLA2 o el mayor nivel de CRP; el segundo y el tercer cuartiles corresponden al resto de la población.

A partir de estos intervalos o cuartiles, se puede determinar una relación de probabilidades para cada marcador, mediante un tratamiento estadístico.

A partir de los intervalos mencionados anteriormente, se puede determinar la probabilidad combinada entre dos o tres valores de intervalos combinados (sPLA2 y CRP, por ejemplo) mediante el cociente:

imagen1

En donde:

A = suma del número de eventos en un intervalo dado para cada marcador.

B = número total de individuos en dichos intervalos dados.

C = suma del número de eventos en el primer intervalo para cada marcador.

D = número total de individuos en dichos primeros intervalos.

La expresión “relación de probabilidades predeterminada” designa un valor promedio por encima del cual se juzga que una actividad de sPLA2 en plasma o suero, y un nivel en plasma o suero de al menos un segundo marcador elegido entre el nivel de CRP, es significativo de una afección presente o futura de un paciente con un evento o patología cardíaco y/o vascular relacionado.

De acuerdo con una realización particular del método definido anteriormente, el segundo marcador de riesgo es el nivel de CRP.

De acuerdo con una realización particular del método definido anteriormente, el paciente ha sido diagnosticado como sustancialmente saludable, en particular respecto a aterosclerosis y enfermedades cardiacas y/o vasculares relacionadas.

Por “sustancialmente saludable” se entiende que el paciente no presenta ningún síntoma de afección debido a una enfermedad, en particular aterosclerosis o una enfermedad cardiaca y/o vascular relacionada. Dichas enfermedades comprenden en particular: enfermedades arteriales coronarios (CAD), aterosclerosis carótida, aterosclerosis aórtica, aterosclerosis iliaca o femoral, aneurisma vascular, calcificación vascular, hipertensión, fallo de corazón y diabetes.

De acuerdo con otra realización particular del método anteriormente definido, se diagnostica que el paciente presenta uno de los siguientes trastornos coronarios:

-enfermedad arterial coronaria asintomática con isquemia silenciosa o sin isquemia,

-trastornos isquémicos crónicos sin necrosis de miocardio, tales como angina pectoris estable o de esfuerzo,

-trastornos isquémicos agudos sin necrosis de miocardio, tales como angina pectoris inestable,

-trastornos isquémicos con necrosis de miocardio, tales como infarto de miocardio de elevación de segmento ST o infarto de miocardio de no elevación de segmento ST.

La isquemia de tejido a menudo se define en términos relativos y se produce cuando las necesidades de oxígeno son mayores que el suministro de oxígeno a los tejidos. Se produce un desequilibrio entre la demanda y el suministro de oxígeno al tejido (de miocardio, por ejemplo). Esta condición de privación de oxígeno puede ir acompañada de una eliminación inadecuada de metabolitos como consecuencia de una perfusión reducida. La isquemia de miocardio se puede diagnosticar clínicamente (dolor de pecho, por ejemplo), biológicamente (aumento de la actividad de mieloperoxidasa, por ejemplo), metabólicamente, usando centelleografía, analizando trastornos de movilidad de pared regional o mediante el uso de un electrocardiograma (modificaciones típicas del segmento ST, desviación superior o inferior del segmento ST, cambios típicos en la onda T tal como inversión de la onda T u ondas T positivas altamente simétricas o de gran amplitud). La isquemia silenciosa normalmente se diagnostica usando centelleografía o un registro de electrocardiograma de 24 horas.

La angina estable y de esfuerzo se manifiesta típicamente mediante un dolor de pecho durante la realización de ejercicio y que se recupera lentamente en el reposo. Normalmente, refleja isquemia de tejido durante el ejercicio.

La angina inestable es un aumento reciente de la frecuencia y/o de la gravedad de una angina estable, un primer episodio de angina o una angina en reposo.

La necrosis miocardial se diagnostica típicamente mediante un aumento de enzimas miocardiales (por ejemplo, troponina T, CPK) en el torrente sanguíneo.

Según una realización más particular del método definido anteriormente, el paciente presenta una sospecha médica de los siguientes trastornos coronarios:

De acuerdo con otra realización particular del método anteriormente definido, no se ha diagnosticado ningún síntoma isquémico en el paciente.

La isquemia de miocardio se puede diagnosticar clínicamente (dolor de pecho, por ejemplo), biológicamente (aumento de la actividad de mieloperoxidasa, por ejemplo), metabólicamente, usando centelleografía, analizando trastornos de movilidad de pared regional o mediante el uso de un electrocardiograma (modificaciones típicas del segmento ST, desviación superior o inferior del segmento ST, cambios típicos en la onda T tal como inversión de la onda T u ondas T positivas altamente simétricas o de gran amplitud).

De acuerdo con otra realización particular adicional del método definido anteriormente, se ha diagnosticado un inicio de síntomas isquémicos en el paciente.

En otra realización preferida del método anteriormente definido, la actividad de sPLA2 medida para la muestra de plasma del paciente es superior a aproximadamente 1,8 nmol/mL/min, en particular superior a aproximadamente 2 nmol/mL/min, más particularmente superior a aproximadamente 2,5 nmol/mL/min, preferiblemente superior a aproximadamente 2,9 nmol/mL/min, y más preferiblemente superior a 3,3, tal como se determina mediante un ensayo fluorimétrico según Radvanyi y col. (1989) Anal Biochem. 177: 103-9, modificado por Pernas y col.; y/o la actividad de sPLA2 medida en una muestra de suero del paciente es superior a 3,74 nmol/mL/min y preferiblemente superior a 4,29 nmol/mL/min y preferiblemente superior a 4,95 nmol/mL/min, determinado mediante medición fluorimétrica automatizada, tal como se ha definido anteriormente. En una realización preferida del método anteriormente definido, la actividad de sPLA2 en un paciente se determina mediante un proceso basado en un ensayo fluorimétrico que comprende poner en contacto una muestra biológica que contiene dicha sPLA2 y tomada de dicho paciente, con un sustrato a una concentración entre 1 nM y 15 nM, estando el volumen de muestra de suero entre 5 µL y 50 µL y estando el volumen de sustrato entre 100 µL y 300 µL, a un intervalo de temperatura de aproximadamente 15ºC a aproximadamente 40ºC, y preferiblemente a 30ºC.

La fosfolipasa usada podría ser una fosfolipasa procedente de veneno de abeja o de veneno de serpiente, tal como veneno de Naja, preferiblemente de veneno de abeja. Podría ser una fosfolipasa recombinante procedente de cualquier especie.

El ensayo se describe en el ejemplo 2.

La ventaja de este método es el pequeño volumen de muestra de sustrato usado y el control de la temperatura, que proporciona una mayor precisión y sensibilidad.

De forma alternativa, se puede usar una variante de la medición fluorimétrica automatizada definida anteriormente que permite aliviar la imprecisión que podría resultar de un aumento no específico de la intensidad de fluorescencia debido a otros factores presentes en la muestra, interfiriendo de este modo en la medida de la actividad de sPLA2. Este método solo difiere del método de medición fluorimétrica automatizada definido anteriormente en que se usa la siguiente fórmula para determinar la actividad de sPLA2:

imagen1

en donde:

-A representa la actividad de sPLA2 expresada en nmol/min/mL;

-s representa la cantidad de sustrato expresada en nmol (normalmente 1 nmol en un volumen de 200 µL de disolución de trabajo);

-V representa el volumen de muestra expresado en mL (normalmente entre 0,30 y 0,50 mL);

-(Fmax – Fmin) representa la diferencia entre la máxima señal de fluorescencia al final de la reacción en presencia de PLA2 procedente de veneno de abeja y el control negativo;

-F representa la pendiente inicial, en un intervalo lineal, de la curva que representa la emisión de fluorescencia en función del tiempo, expresada en min-1.

La variante se describe en detalle más adelante en el Ejemplo 4.

Usando esta variante, se pudieron determinar los siguientes límites de cuartiles para la actividad de sPLA2 en muestras de plasma de una población adulta sana: el cuartil 1 corresponde a la parte de una población con la menor actividad de sPLA2 (inferior a 1,22 nmol/min/mL), el cuartil 2 corresponde a valores que oscilan entre 1,22 y 1,54 nmol/min/mL, el cuartil 3 corresponde a valores que oscilan entre 1,54 y 1,93 nmol/min/mL y el cuartil 4 corresponde a la parte de la población con la mayor actividad de sPLA2 (más de 1,93 nmol/min/mL).

Por tanto, en una realización particularmente preferida del método definido anteriormente, la actividad de sPLA2 medida para una muestra de plasma del paciente es superior a 1,22 nmol/mL/min, preferiblemente superior a 1,54 nmol/mL/min y más preferiblemente superior a 1,93 nmol/mL/min, determinada mediante la variante de la medición fluorimétrica automatizada definida anteriormente.

En otra realización preferida del método anteriormente definido, el nivel de CRP en el suero de un paciente es superior a 0,70 mg/L, en particular superior a aproximadamente 1,45 mg/L, más particularmente superior a aproximadamente 2,5 mg/L y más preferiblemente superior a aproximadamente 3,1 mg/L.

En una realización preferida del método definido anteriormente, los valores de relación de probabilidades predeterminados corresponden con las relaciones obtenidas de la asociación entre los intervalos de actividad de sPLA2 comprendidos en los tres cuartiles superiores del rango de actividades de sPLA2, y el rango de intervalos de nivel de CRP comprendido en los tres cuartiles superiores y preferiblemente en la mitad superior del rango de nivel de CRP, en particular en el mitad superior del rango de actividad de sPLA2 y en la mitad superior del rango de nivel de CRP, más particularmente en el cuartil superior de dicho rango de sPLA2 y en el cuartil superior de dicho rango de nivel de CRP.

Como se ha indicado anteriormente, una población dada se divide en cuatro partes o intervalos (cuartiles), que contienen el mismo número de individuos, correspondiendo el primer intervalo (cuartil) a la parte de dicha población con las menores actividades de sPLA2 o los menores niveles de CRP, correspondiendo el último intervalo (cuartil) a la parte de la población dada con las mayores actividades de sPLA2 o los mayores niveles de CRP, y correspondiendo el segundo y tercer intervalos (cuartiles) al resto de la población entre el primer y el último intervalo.

En otra realización preferida del método definido anteriormente, la relación de probabilidades obtenida de la asociación entre el intervalo de actividad de sPLA2 del paciente y el intervalo de nivel de CRP de dicho paciente, es igual o superior a aproximadamente 1,37, en particular igual o superior a aproximadamente 1,39, más particularmente igual o superior a 1,57 y preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,89.

En una realización preferida del método definido anteriormente, la relación de probabilidades obtenida de la asociación entre los intervalos de actividad de sPLA2 del paciente y el intervalo de nivel de CRP de dicho paciente, es igual o superior a aproximadamente 1,37, en particular igual o superior a aproximadamente 1,39, más particularmente igual o superior a 1,57, más particularmente igual o superior a aproximadamente 1,63, y más particularmente igual o superior a aproximadamente 1,94, preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,21, más preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,25, más preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,51 y más preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,89.

La relación de probabilidades del último intervalo (cuartil) de CRP es igual a 1,61 y la relación de probabilidades del último intervalo (cuartil) de actividad de sPLA2 es igual a 1,70.

Esto significa que un paciente con un valor de nivel de CRP comprendido en el último intervalo (cuartil) de intervalos predeterminados de rango de nivel de CRP tiene un incremento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular del 61% en comparación con el primer intervalo.

Este mismo paciente, con un valor de actividad de sPLA2 comprendido en el último intervalo (cuartil) de intervalos predeterminados de rango de actividad de sPLA2 tiene un incremento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular del 70% en comparación con el primer intervalo.

Cuando el valor de relación de probabilidades para este mismo paciente, determinado con los dos intervalos mencionados anteriormente, se compara con las relaciones de probabilidad predeterminadas de acuerdo con los intervalos de rango de actividad de sPLA2 y de nivel de CRP (igual a 2,89), indica que su riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular aumenta en un 189%, proporcionando una información mucho mejor sobre la predicción del riesgo absoluto de CAD que cualquier biomarcador solo (Tabla 3 y 4).

Esta información mejorada no era obvia en absoluto a partir de la determinación o del conocimiento de cada marcador considerado por separado.

En otra realización particularmente preferida del método definido anteriormente, se mide la actividad de sPLA2 en una muestra biológica, en particular una muestra de suero o de plasma, y más particularmente una muestra de suero.

La presente invención también se refiere a un método in vitro o ex vivo para la diagnosis de enfermedades cardiacas y/o vasculares en un paciente, que comprende:

-determinar el valor de actividad de sPLA2 de dicho paciente como primer marcador de riesgo y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rango de actividad de sPLA,

-determinar el valor de nivel de CRP de dicho paciente como segundo marcador de riesgo y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rango de nivel de CRP,

-establecer los intervalos combinados obtenidos con al menos dos intervalos mencionados anteriormente de dicho paciente como un tercer marcador de riesgo, estableciendo una relación de probabilidades correspondiente a dichos intervalos combinados y comparar dicho valor de relación de probabilidad con relaciones de probabilidad predeterminadas de acuerdo a intervalos de rango de actividad de sPLA2 y de rango de nivel de CRP, siendo dichas relaciones de probabilidad predeterminadas predictivas de un aumento de riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular en un paciente.

Las enfermedades cardiacas y/o vasculares contempladas son afecciones tales como: enfermedad arterial coronaria (CAD), hipertensión, aterosclerosis, aterosclerosis iliaca o femoral, aneurisma vascular, calcificación vascular, hipertensión, fallo cardiaco y diabetes.

En una realización particular del método in vitro o ex vivo definido anteriormente, una relación de probabilidad de un paciente mayor en comparación con una relación de probabilidad predeterminada es indicativa de la afección de dicho paciente con una enfermedad cardiaca y/o vascular en el momento en que se hace la determinación del valor de actividad de sPLA2 y del valor de nivel de CRP de dicho paciente, o es indicativa de una futura afección de dicho paciente con una enfermedad cardiaca y/o vascular, en particular más de 72 horas después del momento en que se realicen las determinaciones respectivamente del valor de actividad de sPLA2 y del valor del nivel de CRP de dicho paciente.

Por “afección futura” se entiende una afección cuyo inicio se produce después del momento en que se realiza la determinación de la relación de probabilidad de dicho paciente.

En otra realización particular del método in vitro o ex vivo anteriormente definido, la relación de probabilidad entre el valor de actividad de sPLA2 del paciente y el valor de nivel de CRP de dicho paciente, es igual o superior a aproximadamente 1,37, en particular igual o superior a aproximadamente 1,39, más particularmente igual o superior a 1,57 y preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,89.

En una realización preferida del método in vitro o ex vivo definido anteriormente, la relación de probabilidad entre el valor de actividad de sPLA2 del paciente y el valor de nivel de CRP de dicho paciente, es igual o superior a aproximadamente 1,37, en particular igual o superior a aproximadamente 1,39, más particularmente igual o superior a 1,57, más particularmente igual o superior a aproximadamente 1,63 y más particularmente igual o superior a aproximadamente 1,94, preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,21, más preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,25, más preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,51 y más preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,89.

En otra realización particular del método in vitro o ex vivo definido anteriormente, se mide la actividad de sPLA2 y el nivel de CRP de una muestra biológica, en particular una muestra de suero o una muestra de plasma, y más particularmente una muestra de suero.

La presente invención también se refiere al uso de medios para medir la actividad de sPLA2 y el nivel de CRP para la fabricación de un kit destinado a determinar un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular.

La invención también se refiere al uso de medios para medir la actividad de sPLA2 y el nivel de CRP para la fabricación de un kit destinado a la diagnosis de enfermedades cardiacas y/o vasculares.

De acuerdo con una realización preferida de los usos definidos anteriormente, los medios para medir la actividad de sPLA2 comprenden un compuesto que pueda ser hidrolizado por sPLA2, cuyos productos hidrolíticos puedan cuantificarse directa o indirectamente, y los medios para medir el nivel de CRP comprenden un anticuerpo monoclonal específico de CRP, un anticuerpo conjugado a enzima específico de CRP, y un sustrato para la enzima, permitiendo el cambio de color del medio cuantificar directa o indirectamente el nivel de CRP.

El compuesto que puede ser hidrolizado por sPLA2 es un sustrato natural o no natural de la enzima. En caso de que los productos no sean cuantificables por sí mismos, se pueden usar compuestos que puedan reaccionar con dichos productos y que den lugar a compuestos cuantificables, dicho método es una cuantificación indirecta.

Los medios para medir los niveles de CRP son los conocidos por el especialista en la técnica, por ejemplo un elevada sensibilidad a CRP, que comprende un anticuerpo policlonal o monoclonal específico de CRP, un anticuerpo conjugado a enzima específico de CRP, en particular una peroxidasa de rábano y un sustrato para la enzima, en particular para la peroxidasa de rábano, permitiendo el cambio de color del medio cuantificar directa o indirectamente el nivel de CRP.

Más particularmente, en los usos definidos anteriormente, el compuesto que puede ser hidrolizado por sPLA2 es un fosfolípido o un análogo de fosfolípido que comprende un resto fluorogénico o cromogénico.

En una realización preferida el fosfolípido es un glicerofosfolípido que está sustituido en la posición 2 con un acilo fluorescente; dicho glicerofosfolípido puede ser por ejemplo 1-hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3fosfometanol, y el acil fluorescente 1-pirenodecanoil, y el sustrato para peroxidasa de rábano es 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB).

Otros fosfolípidos que pueden usarse de acuerdo con la invención comprenden los fosfolípidos que pueden ser hidrolizados por sPLA2, siendo dichos fosfolípidos bien conocidos por el especialista en la técnica.

Los acilos fluorescentes que pueden usarse en la invención comprenden de forma destacable acilos sustituidos con grupos fluorescentes bien conocidos por el especialista en la técnica, tal como pireno, o fluoresceína, por ejemplo.

De forma alternativa se pueden usar glicerofosfolípidos radioactivos en el método definido anteriormente, tales como glicerofosfolípidos sustituidos en la posición 2 con acilos radioactivos, o etanolamina de fosfatidilo radioactiva.

La presente invención también se refiere a un kit destinado a determinar un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular, que comprende los siguientes elementos:

-un tampón de sPLA2,

-un compuesto que puede ser hidrolizado por sPLA2, cuyos productos hidrolíticos se pueden cuantificar directa o indirectamente, tal como 1-pirenodecanoilo,

-una muestra de control de actividad de sPLA2, y

-un tampón de CRP,

-un anticuerpo monoclonal específico de CRP,

-un anticuerpo conjugado a enzima específico de CRP,

-una muestra de control de nivel de CRP,

correspondiendo cada elemento respectivamente a sPLA2 y CRP, siendo posible que estén en unidades separadas

o comunes.

La comparación del valor de relación de probabilidad obtenido con los al menos dos intervalos de dicho paciente para relaciones de probabilidad predeterminados de acuerdo con los intervalos de rango de actividad de sPLA2 y de nivel de CRP, siendo predictivo de un aumento de riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular en un paciente.

La expresión “muestra de control de actividad de sPLA2” o “muestra de control de nivel de CRP” usada aquí se refiere a una muestra con una actividad conocida.

La invención también se refiere a un kit destinado a diagnosticar una enfermedad cardiaca y/o vascular, que comprende los siguientes elementos:

-un tampón de sPLA2,

-una muestra de control de actividad de sPLA2, y

-un tampón de CRP,

-un anticuerpo monoclonal específico de CRP,

-un anticuerpo conjugado a enzima específico de CRP,

-una muestra de control de nivel de CRP,

o comunes.

La invención además se refiere a un método para determinar la eficacia de un fármaco administrado a un individuo para el tratamiento de una enfermedad cardiovascular que comprende:

i) determinar el valor de actividad de sPLA2 de dicho individuo antes de la administración de dicho fármaco, y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rango de actividad de sPLA2,

ii) determinar el valor de nivel de CRP de dicho individuo antes de la administración de dicho fármaco, y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rango de nivel de CRP,

iii) establecer el valor de relación de probabilidad obtenido con los dos intervalos mencionados anteriormente, siendo dicha relación de probabilidad una relación de probabilidad de referencia cuando es superior que la relación de probabilidad predeterminada, y que representa una etapa predeterminada de la enfermedad,

iv)determinar la actividad de sPLA2 y el nivel de CRP de dicho individuo a quien se ha administrado el fármaco para obtener una relación de probabilidad después de la administración,

v) comparar la relación de probabilidad obtenida después de la administración con dicha relación de probabilidad, obteniéndose la diferencia entre la relación de probabilidad después de la administración e indicando la relación de probabilidad la evolución de la enfermedad cardiovascular, y permitiendo de este modo determinar el grado de eficacia del fármaco.

Según una realización particular del método definido anteriormente, el paciente ha sido diagnosticado como sustancialmente sano, en particular respecto a aterosclerosis, enfermedades cardiacas y/o vasculares relacionadas.

Con “sustancialmente sano” se indica que el paciente no presenta ningún síntoma de afección por una enfermedad, en particular por una aterosclerosis, enfermedad cardiaca y/o vascular relacionada. Dichas enfermedades comprenden en particular: enfermedad arterial coronaria (CAD), aterosclerosis carótida, aterosclerosis aórtica, aterosclerosis iliaca o femoral, aneurisma vascular, calcificación vascular, hipertensión, fallo cardiaco y diabetes.

Según otra realización particular del método definido anteriormente, al paciente se le ha diagnosticado que presenta uno de los siguientes trastornos coronarios:

-trastornos isquémicos con necrosis de miocardio, tales como infarto de miocardio de elevación de segmento ST o infarto de miocardio sin elevación de segmento ST.

La isquemia de tejido se define a menudo en términos relativos y se produce cuando las necesidades de oxígeno superan al suministro de oxígeno a los tejidos. Existe un desequilibrio entre las demandas y el suministro de oxígeno al tejido (de miocardio, por ejemplo). Esta condición de privación de oxígeno puede venir acompañada por una eliminación inadecuada de metabolitos a consecuencia de una menor perfusión. La isquemia de miocardio puede diagnosticarse clínicamente (dolor de pecho, por ejemplo), biológicamente (aumento de la actividad de mieloperoxidasa, por ejemplo), metabólicamente, usando centelleografía, analizando trastornos de movimiento de pared regional o mediante el uso de un electrocardiograma (modificaciones típicas del segmento ST, desviación superior o inferior del segmento ST, cambios típicos en la onda T tales como inversión de onda T o ondas T altamente simétricas o de gran amplitud positiva). La isquemia silenciosa se diagnostica típicamente usando centelleografía o un registro de electrocardiograma de 24h.

La angina estable y de esfuerzo se manifiesta típicamente a través de un dolor de pecho durante el ejercicio y se recupera lentamente en reposo. Normalmente refleja isquemia de tejido durante el ejercicio.

La angina inestable es un aumento reciente en la frecuencia y/o la gravedad de angina estable, un primer episodio de angina o una angina en reposo.

La necrosis de miocardio se diagnostica típicamente mediante un aumento de enzimas de miocardio (por ejemplo, troponina I, troponina T, CPK) en el torrente sanguíneo.

Según una realización más particularmente del método definido anteriormente, el paciente presenta una sospecha médica de los siguientes trastornos coronarios:

Según otra realización particular del método definido anteriormente, no se ha diagnosticado al paciente síntomas de inicio de isquemia.

La isquemia de miocardio puede diagnosticarse clínicamente (dolor de pecho, por ejemplo), biológicamente (aumento de la actividad de mieloperoxidasa, por ejemplo), metabólicamente, usando centelleografía, analizando trastornos de movimiento de pared regional o mediante el uso de un electrocardiograma (modificaciones típicas del segmento ST, desviación superior o inferior del segmento ST, cambios típicos en la onda T tales como inversión de onda T o ondas T altamente simétricas o de gran amplitud positiva).

Según otra realización particular adicional del método definido anteriormente, se ha diagnosticado al paciente un inicio de síntomas isquémicos.

En otra realización preferida del método definido anteriormente la actividad de sPLA2 del paciente es superior a aproximadamente 1,8 nmol/mL/min, en particular superior a aproximadamente 2 nmol/mL/min, más particularmente superior a aproximadamente 2,5 nmol/mL/min, preferiblemente superior a aproximadamente 2,9 nmol/mL/min, y más preferiblemente superior a 3,3, determinado mediante ensayo fluorimétrico según Radvanyi y col. (1989) Anal Biochem. 177: 103-9, modificado por Pernas y col., y/o la actividad de sPLA2 medida de una muestra de suero del paciente es superior a 3,74 nmol/mL/min y preferiblemente superior a 4,29 nmol/mL/min y preferiblemente superior a 4,95 nmol/mL/min, determinado mediante una medida fluorimétrica automatizada.

En una realización preferida del método definido anteriormente la actividad de sPLA2 en un paciente se determina mediante un proceso basado en un ensayo fluorimétrico que comprende poner en contacto una muestra biológica que contiene dicha sPLA2 y tomada de dicho paciente con un sustrato a una concentración entre 1 nM y 15 nM, siendo el volumen de muestra entre 5 µL y 50 µL y siendo el volumen de sustrato entre 100 µL y 300 µL, en un rango de temperatura de entre aproximadamente 15ºC y aproximadamente 40ºC, y preferiblemente 30ºC.

-determinar el valor de la actividad de sPLA2 de dicho paciente como un primer marcador de riesgo y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rango de actividad de sPLA,

Por enfermedades cardiacas y/o vasculares se entiende afecciones tales como: enfermedad arterial coronaria (CAD), hipertensión, aterosclerosis, aterosclerosis iliaca o femoral, aneurisma vascular, calcificación vascular, hipertensión, fallo cardiaco y diabetes.

Con “afección futura” se entiende una afección cuyo inicio se produce después del momento en el que se ha realizado la determinación de la actividad de sPLA2 de dicho paciente.

Según una realización particular del método definido anteriormente, el segundo marcador de riesgo es CRP.

Según una realización particular del método definido anteriormente, el paciente ha sido diagnosticado como sustancialmente sano, en particular con respecto a aterosclerosis, enfermedades cardiacas y/o vasculares relacionadas.

Por “sustancialmente sano” se entiende que el paciente no presenta ningún síntoma de afección por una enfermedad, en particular por una aterosclerosis, enfermedad cardiaca y/o vascular relacionada. Dichas enfermedades comprenden en particular: enfermedad arterial coronaria (CAD), aterosclerosis carótida, aterosclerosis aórtica, aterosclerosis iliaca o femoral, aneurisma vascular, calcificación vascular, hipertensión, fallo cardiaco y diabetes.

Según otra realización particular del método definido anteriormente, el paciente ha sido diagnosticado como que presenta uno de los siguientes trastornos coronarios:

En otra realización preferida del método definido anteriormente el nivel de CRP en el suero de un paciente es superior a 0,70 mg/L, en particular superior a aproximadamente 1,45 mg/L, más particularmente superior a aproximadamente 2,5 mg/L y más preferiblemente superior a aproximadamente 3,1 mg/L.

En una realización preferida del método definido anteriormente, los valores de relaciones de probabilidad predeterminados corresponden a las relaciones obtenidas de la asociación entre:

-los intervalos de actividad de sPLA2 comprendidos en los tres cuartiles superiores del rango de actividades de sPLA2,

-los intervalos de nivel de CRP comprendidos en los tres cuartiles superiores del rango de nivel de CRP,

en particular en la mitad superior del rango de actividades de sPLA2, la mitad superior de rango de nivel de CRP y la mitad inferior del rango de niveles de IgM IC de apoB 100, y más particularmente en el cuartil superior de dicho rango de sPLA2, en el cuartil superior de dicho rango de nivel de CRP, y en el cuartil inferior de dicho rango de IgM IC de apoB 100.

En otra realización particularmente preferida del método definido anteriormente, la actividad de sPLA2 y el nivel de CRP se miden en una muestra biológica, en particular una muestra de suero o una muestra de plasma, y más particularmente una muestra de suero.

-determinar el valor de actividad de sPLA2 de dicho paciente y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados del rango de actividad de sPLA,

-determinar el valor del nivel de CRP de dicho paciente y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados del rango de niveles de CRP,

-establecer los intervalos combinados obtenidos con los dos intervalos mencionados anteriormente de dicho paciente, estableciendo una relación de probabilidad correspondiente a dichos intervalos combinados y comparar dicho valor de relación de probabilidad con relaciones de probabilidad predeterminadas de acuerdo con los intervalos del rango de actividades de sPLA2 y el rango de niveles de CRP, siendo dicha relación de probabilidad predeterminada predictiva de un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular en un paciente.

En una realización particular del método in vitro o ex vivo definido anteriormente, una mayor relación de probabilidad de un paciente en comparación con una relación de probabilidad predeterminada es indicativa de la afección de dicho paciente con una enfermedad cardiaca y/o vascular en el momento de la determinación del valor de actividad de sPLA2 y del valor del nivel de CRP, es indicativo de una afección futura de dicho paciente con una enfermedad cardiaca y/o vascular, en particular más de 72 horas después del momento en que se realizaron las determinaciones respectivamente del valor de actividad de sPLA2 y del valor de nivel de CRP de dicho paciente.

Por “afección futura” se entiende una afección cuyo inicio se produce después del momento en que se realizó la determinación de la relación de probabilidad de dicho paciente.

Según una realización preferida de los usos definidos anteriormente, los medios para medir la actividad de sPLA2 comprenden un compuesto que es capaz de ser hidrolizado por sPLA2, cuyos productos hidrolíticos pueden cuantificarse directa o indirectamente, los medios para medir el nivel de CRP comprenden un anticuerpo monoclonal específico de CRP, un anticuerpo conjugado a enzima específico de CRP, y un sustrato para la enzima, permitiendo el cambio de color del medio cuantificar directa o indirectamente el nivel de CRP.

El compuesto que puede ser hidrolizado por sPLA2 es un sustrato natural o no natural de la enzima. En el caso de que los productos de hidrólisis no sean cuantificables por sí mismos, se pueden usar compuestos que reacciones con dichos productos y que den lugar a compuestos cuantificables; dicho método es una cuantificación indirecta.

Más particularmente, en los usos definidos anteriormente, el compuesto capaz de ser hidrolizado por sPLA2 es un fosfolípido o análogo de fosfolípido que comprende un resto fluorogénico o cromogénico.

En una realización preferida, el fosfolípidos es un glicerofosfolípido que está sustituido en la posición 2 con un acilo fluorescente; dicho glicerofosfolípido puede ser, por ejemplo, 1-hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3fosfometanol, y el acilo fluorescente acilo de 1-pirenodecanoilo, y el sustrato para peroxidasa de rábano es 3,3’,5,5’tetrametil-bencidina (TMB).

Otros fosfolípidos que se pueden usar de acuerdo con la invención comprenden los fosfolípidos capaces de ser hidrolizados por sPLA2, dichos fosfolípidos son bien conocidos por el especialista en la técnica.

Los acilos fluorescentes susceptibles de ser usados en la invención comprenden de forma notable acilos sustituidos con grupos fluorescentes bien conocidos por el especialista en la técnica, tales como pireno o fluoresceína, por ejemplo.

De forma alternativa, se pueden usar glicerofosfolípidos radioactivos en el método definido anteriormente, tales como glicerofosfolípidos sustituidos en la posición 2 con acilos radioactivos, o etanolamina de fosfatidilo radioactiva.

La presente invención también se refiere a un kit destinado a la determinación de un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular, que comprende los siguientes elementos:

-un tampón de sPLA2,

-un compuesto susceptible de ser hidrolizado por sPLA2, cuyos productos hidrolíticos pueden cuantificarse directa o indirectamente, tal como 1-pirenodecanoilo,

-una muestra de control de actividad de sPLA2, y

-un tampón de CRP,

-un anticuerpo monoclonal específico de CRP,

-un anticuerpo conjugado a enzima específico de CRP,

-una muestra de control de nivel de CRP.

Siendo susceptible de ir por separado o en una unidad común cada elemento respectivamente correspondiente a sPLA2 y CRP.

La comparación del valor de relación de probabilidad obtenido con los tres intervalos de dicho paciente con las relaciones de probabilidad predeterminadas según los intervalos del rango de actividades de sPLA2 y del rango de niveles de CRP es predictiva de un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular en un paciente.

Según una realización preferida de las reivindicaciones, se determina la actividad de sPLA2 en un paciente.

La presente invención también se refiere a un método para determinar un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular en un paciente, que comprende:

-determinar la actividad de sPLA2 de dicho paciente,

-comparar dicha actividad con un valor predeterminado,

siendo una mayor actividad de sPLA2 de dicho paciente en comparación con dicho valor predeterminado indicativa de un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco y/o vascular.

Por “aumento de riesgo” se entiende que un paciente para el cual la actividad de sPLA2 es superior al valor predeterminado tiene mayor probabilidad de fallecer o de ser afligido con un evento cardiaco y/o vascular que un individuo cuya actividad de sPLA2 está por debajo de dicho valor predeterminado.

Según la invención, los siguientes eventos se consideran en particular como eventos cardiacos y/o vasculares: infarto de miocardio (IM), accidente cerebrovascular, hospitalización debido a enfermedades cardiacas y/o vasculares, y procedimientos de revascularización.

Según una realización particular del método definido anteriormente, se ha diagnosticado que el paciente está sustancialmente sano, en particular con respecto a aterosclerosis, enfermedades cardiacas y/o vasculares relacionadas.

Con “sustancialmente sano” se entiende que el paciente no presenta ningún síntoma de afección por ninguna enfermedad, en particular por aterosclerosis, enfermedad cardiaca y/o vascular relacionada. Dichas enfermedades comprenden en particular: enfermedad arterial coronaria (CAD), aterosclerosis carótida, aterosclerosis aórtica, aterosclerosis iliaca o femoral, aneurisma vascular, calcificación vascular, hipertensión, fallo cardiaco y diabetes.

Según otra realización particular del método definido anteriormente, se ha diagnosticado que el paciente presenta uno de los siguientes trastornos coronarios:

-trastornos isquémicos con necrosis de miocardio, tales como infarto de miocardio con elevación de segmento ST o infarto de miocardio sin elevación de segmento ST.

La isquemia de tejido se define a menudo en términos relativos y se produce cuando las necesidades de oxígeno superan al suministro de oxígeno a los tejidos. Se produce un desequilibrio entre la demanda y el suministro de oxígeno al tejido (por ejemplo, de miocardio). Esta condición de privación de oxígeno puede venir acompañada de una eliminación inadecuada de metabolitos como consecuencia de una perfusión reducida. La isquemia de miocardio puede diagnosticarse clínicamente (dolor de pecho, por ejemplo), biológicamente (aumento de la actividad de mieloperoxidasa, por ejemplo), metabólicamente usando centelleografía, analizando trastornos de movimiento de pared regional o mediante el uso de un electrocardiograma (modificaciones típicas del segmento ST, desviación superior o inferior de segmento ST, cambios típicos en la onda T tales como inversión de la onda T u ondas T altamente simétricas o de elevada amplitud positiva). La isquemia silenciosa se diagnostica típicamente usando centelleografía o un registro de electrocardiograma de 24h.

La angina estable y de esfuerzo se manifiesta normalmente mediante un dolor de pecho durante el ejercicio y se recupera lentamente en reposo. Normalmente refleja una isquemia de tejido durante el ejercicio.

La angina inestable es un aumento reciente de la frecuencia y/o de la gravedad de la angina estable, un primer episodio de angina o una angina en reposo.

La necrosis de miocardio se diagnostica típicamente mediante un aumento de las enzimas de miocardio (por ejemplo troponina I, troponina T, CPK) en el torrente sanguíneo.

Según una realización más particular del método definido anteriormente, el paciente tiene una sospecha médica de los siguientes trastornos coronarios:

-trastornos isquémicos crónicos sin necrosis de miocardio, tal como angina pectoris estable o de esfuerzo,

-trastornos isquémicos agudos sin necrosis de miocardio, tal como angina pectoris inestable,

Según otra realización particular del método definido anteriormente, no se ha diagnosticado ningún inicio de síntomas isquémicos en el paciente.

La isquemia de miocardio se puede diagnosticar clínicamente (dolor de pecho, por ejemplo), biológicamente (aumento de actividad de mieloperoxidasa, por ejemplo), metabólicamente, usando centelleografía, analizando trastornos de movimiento de pared regional o mediante el uso de un electrocardiograma (modificaciones típicas del segmento ST, desviación superior o inferior del segmento ST, cambios típicos en la onda T tales como inversión de la onda T u ondas T altamente simétricas o de elevada amplitud positiva).

Según otra realización particular adicional del método definido anteriormente, en el paciente se ha diagnosticado un inicio de síntomas isquémicos.

En una realización preferida del método definido anteriormente, el valor predeterminado corresponde a una actividad de sPLA2 comprendida en los tres cuartiles superiores del rango de actividades de sPLA2 de un individuo sustancialmente sano, en particular en la mitad superior, más particularmente en el cuartil superior de dicho rango.

Como se ha indicado anteriormente, una población dada de individuos sustancialmente sanos es dividida en cuatro partes (o cuartiles), cada uno con el mismo número de individuos, correspondiendo el primer cuartil a la parte de dicha población con las menores actividades de sPLA2, correspondiendo el último cuartil a la parte de dicha población con las mayores actividades de sPLA2, y correspondiendo el segundo y el tercer cuartiles al resto de la población entre el primer y último cuartiles.

En una realización preferida del método definido anteriormente, la actividad de sPLA2 del paciente es superior a aproximadamente 3,74 nmol/mL/min, en particular superior a aproximadamente 4,29 nmol/mL/min, más particularmente superior a aproximadamente 4,95 nmol/mL/min.

En otra realización particularmente preferida del método definido anteriormente, la actividad de sPLA2 se mide en una muestra biológica, en particular una muestra de suero.

Nosotros describimos un método para el escrutinio de fármacos susceptibles de ser usados en la fabricación de medicamentos destinados a la prevención o el tratamiento de patologías cardiacas y/o vasculares, que se caracteriza por:

-en una primera etapa se mide in vitro la actividad de sPLA2 de un animal de ensayo, que presenta de forma constitutiva una mayor actividad de sPLA2 con respecto a animales sustancialmente sanos de la misma especie, y al que se ha administrado un fármaco del escrutinio,

-en una segunda etapa, la actividad medida se compara con la actividad de sPLA2 de dicho animal de ensayo antes de la administración de dicho fármaco del escrutinio,

-en una tercera etapa, el fármaco del escrutinio es seleccionado si la actividad medida es inferior a la actividad de sPLA2 del animal de ensayo antes de la administración de dicho fármaco del escrutinio.

En el método de escrutinio definido anteriormente, el animal de ensayo es un animal transgénico no humano, tal como un ratón o una rata.

En el método de escrutinio definido anteriormente la actividad de sPLA2 se mide en muestras de plasma del animal de ensayo.

En otra realización preferida adicional del método de escrutinio definido anteriormente, el animal es sacrificado después de que se haya medido la actividad de sPLA2.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1

La Figura 1 representa la relación entre la diferencia en fluorescencia (Fmax – Fmin) durante un minuto y la concentración de sPLA2 de veneno de abeja.

Esta figura muestra la linealidad del método de medición entre 0 y 100 U/mL de sPLA2.

Figura 2

La Figura 2 representa un análisis Kaplan-Meier de la función de distribución de supervivencia sin infarto de miocardio frente al número de días.

Los pacientes con un nivel de IgM IC de apoB100 localizado en la media inferior (< 1909, véase la Tabla 4) y una actividad de sPLA2 localizada en el tercil superior (> 2,9 nmol/mL/min) presentan un riesgo incrementado de mortalidad. Después de 300 días, su función de distribución de supervivencia sin infarto es inferior a 0,75. Esto significa que menos del 75% de los individuos sobrevivieron sin infarto de miocardio.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Actividad de fosfolipasa secretora A2 en circulación y riesgo de eventos coronarios incidentes en hombres y mujeres sanos, el estudio Epic-Norfolk

Métodos

Una descripción detallada del estudio de seguimiento de la European Prospective Investigation Into Cancer and Nutrition (EPIC-Norfolk) se ha publicado previamente (Day N. y col., Br. J. Cancer, 1999; 80 Supl. I: 95-103). En resumen, se diseñó este estudio de población prospectiva de 25.663 hombres y mujeres reclutados de registros edad-sexo de prácticas generales en Norfolk, con edades entre 45 y 79 años, para investigar determinantes dietarios y de otro tipo del cáncer. Los participantes completaron un cuestionario de línea base entre 1993 y 1997, asistieron a una visita clínica y se les hizo un seguimiento hasta noviembre de 2003, una media de aproximadamente 6 años. Todos los individuos habían sido marcados para certificación de defunción en la Office of National Statistics del Reino Unido, con un estatus vital determinado para toda la cohorte. Adicionalmente, los participantes admitidos en el hospital fueron identificados usando su número único del National Health Service mediante cotejado de datos de los residentes de Inglaterra y Gales de Norfolk. El estudio fue aprobado por el Norwich Health Authority Ethics Committee, y todos los participantes firmaron un consentimiento escrito.

Población de estudio

Se llevó a cabo un estudio de control de caso anidado entre los participantes en el estudio Epic-Norfolk. La determinación del caso se ha descrito con detalle en otra publicación (Boekholdt, S. M., Circulation, 2004; 110: 14181423). En resumen, los casos fueron aquellos individuos que fueron identificados con CAD fatal o no fatal durante el seguimiento. La CAD se define con los códigos 410-414 según la 9ª revisión de la International Classification of Diseases. Nosotros excluimos todos los individuos que presentaron un historial de ataque de corazón o de apoplejía en la visita clínica de línea base.

Los controles fueron participantes del estudio que permanecieron libres de cualquier enfermedad cardiovascular durante el seguimiento. Se ajustaron dos controles de cada caso por sexo, edad (en un intervalo de 5 años) y el momento del reclutamiento (en un intervalo de 3 meses).

Medidas de estudio

Se almacenaron muestras de sangre a -80ºC en el Departamento de Bioquímica Clínica, Universidad de Cambridge. Los niveles en suero de colesterol total, colesterol HDL (HDL-C) y triglicéridos fueron medidos en muestras nuevas con el RA 1000 (Bayer Diagnostics, Basingstoke, R.U.), y los niveles de colesterol LDL (LDL-C) fueron calculados con la fórmula de Friedewald (Friedewald W. T. y col., Clin Chem. 1972; 18: 499-502). Los niveles de CRP se midieron con un ELISA tipo sándwich, tal como se ha descrito previamente (Bruins P. y col. Circulation. 1997; 96: 3542-3548).

La actividad de sPLA2 en suero se midió mediante un ensayo fluorimétrico selectivo de Radvanyi y col. (Anal Biochem. 1989; 177: 103-109), modificado por Pernas y col. (Biophys Res Commun. 1991; 178: 1298-1305). La actividad de sPLA2 se midió usando el sustrato fluorescente 1-hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3fosfometanol, sal sódica (Interchim, Montluçon, Francia) tal como se ha descrito previamente (Mallat Z. y col. J Am Coll Cardiol. 2005; 46: 1249-1257). Se midió el cien por ciento de hidrólisis del sustrato fluorescente usando 0,1 unidades de sPLA2 de veneno de abeja (Sigma Chemical Co., Francia). La hidrólisis de sustrato en ausencia de plasma se usó como control negativo y se dedujo a partir de la actividad de PLA2. Todas las muestras fueron evaluadas por duplicado y la actividad en plasma se expresó como nmol/min/mL. La actividad mínima detectable fue 0,10 nmol/min/mL. La imprecisión del ensayo fluorimétrico de actividad de sPLA2 se determinó mediante medición de las muestras con baja actividad de sPLA2 (1,25 nmol/min/mL) y con alta actividad de sPLA2 (9,5 nmol/min/mL). Los CVs del lote oscilaron entre 2,7 % (muestra de baja actividad) y 3,2 % (muestra de alta actividad) y el CV entre lotes fue de 5,7 %.

Todas las muestras fueron analizadas en un orden aleatorio para evitar errores sistemáticos. Los investigadores y el personal del laboratorio trabajos a ciegas respecto a la información identificable, y sólo podían identificar las muestras mediante un número.

Análisis estadístico

Las características de línea base fueron comparadas entre casos y se ajustaron a los controles teniendo en cuenta el ajuste entre ellos. Se usó un modelo de efecto mixto para las variables continuas y se usó una regresión logística condicional para las variables categóricas. Debido a que los niveles de triglicéridos, CRP, antígeno de sPLA2 y la actividad de sPLA2 presentaban una distribución sesgada, los valores fueron transformados con logaritmos antes de ser usados como variables continuas en análisis estadísticos; sin embargo, en las tablas se muestran las medianas sin transformar y los rangos de intercuartiles correspondientes. Para determinar las relaciones entre la actividad de sPLA2 en plasma y los factores de riesgo cardiovasculares tradicionales, se calcularon los niveles de factor de riesgo medios por cuartil de actividad de sPLA2.

Los cuartiles se basaron en la distribución en los controles. Para los análisis específicos de sexo, se usaron los cuartiles específicos de sexo, y para los análisis agrupados se usaron los cuartiles basados en los sexos combinados.

Adicionalmente, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para determinar la relación entre la actividad de sPLA2 como una variable continua y otros biomarcadores de riesgo continuos.

Las relaciones de probabilidad y los correspondientes intervalos al 95% de confianza (ICs de 95%) como una estimación del riesgo relativo de CAD incidente usando un análisis de regresión logística condicional. Se usó el menor cuartil de actividad de sPLA2 como categoría de referencia.

Las relaciones de probabilidad se ajustaron para los siguientes factores de riesgo cardiovascular: índice de masa corporal, diabetes, presión sanguínea sistólica, LDL-C, HDL-C y ser fumador (nunca, previamente, en la actualidad).

La relación de probabilidad también se calculó después de un ajuste adicional de los niveles de CRP y del niveles de suero de concentración de sPLA2 de tipo IIA. La tendencia a lo largo de los cuartiles de actividad de sPLA2 y de CRP se evaluó introduciendo un único término ordinal para el cuartil en el modelo de regresión logístico. La desviación respecto a la linealidad se evaluó comparando modelos que contenían indicadores de cuartil con aquellos que contenían un término lineal en un ensayo de relación de probabilidad con 2 grados de libertad (gl).

Además, la contribución prognóstica adicional de cuartiles de actividad de sPLA2 a modelos que contienen otra variable, con un ensayo de relación de probabilidad, también fue evaluada. Para determinar si los niveles de actividad de sPLA2 tenían un valor predictivo en la parte superior de la escala de puntuación de riesgo de Framingham, se calcularon las relaciones de probabilidad para una futura CAD por cuartil de actividad de sPLA2, ajustando simultáneamente para la escala de riesgo de Framingham usando un algoritmo publicado previamente, que tiene en cuenta la edad, el sexo, el colesterol total, el HDL-C, la presión sanguínea sistólica y diastólica, fumar y la presencia de diabetes (Wilson P. W. y col., Circulation. 1998; 97: 1837-1847).

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo usando el software SPSS (versión 12.0.1; Chicago, Ill). Se consideró un valor-P <0,05 para indicar la significancia estadística.

Resultados

Características de línea base (Tabla 1 y Tabla 2)

Las características de línea base de los casos y de los controles se muestran en la Tabla 1. Tanto en hombres como en mujeres, los pacientes que desarrollaron CAD durante el seguimiento tenían una mayor probabilidad de haber tenido un historial previo de diabetes, hipertensión, fumar y dislipidemia que aquellos que no sufrieron ningún evento. Se observó una mayor presión sanguínea, mayores niveles de LDL-C, mayores niveles de CRP, mayores actividades de sPLA2 y menores niveles de HDL-C en los casos que en los controles. La actividad de sPLA2 estaba asociada de forma significativa a factores de riesgo cardiovascular tradicionales, con la excepción de la diabetes (Tabla 2). Se obtuvieron resultados similares para hombres y mujeres (datos no mostrados).

Actividad de sPLA2 y riesgo de enfermedad arterial coronaria incidente (Tabla 3).

Entre todas las variables introducidas en el modelo multivariable, la presencia de diabetes, es status de fumador, la presión sanguínea sistólica, el LDL-C, el CRP y la actividad de sPLA2 fueron predictores independientes de CAD incidente, mientras que el HDL-C se asoció a un riesgo reducido de CAD. La relación de probabilidad de CAD incidente asociada a un aumento de 1 nmol/min/mL de actividad de sPLA2 fue de 1,10 (1,02-1,18, P = 0,01). Un aumento de 1 ng/mL de concentración de sPLA2 de tipo IIA se asoció a una relación de probabilidad de 1,02 (1,011,03, P = 0,003). La relación de probabilidad de CAD incidente asociada a un aumento de 1 mg/L de CRP fue de 1,02 (1,01-1,03, P = 0,02).

La Tabla 3 presenta las relaciones de probabilidad de CAD incidente según aumentan los cuartiles de actividad de sPLA2 de línea base o la CRP de línea base. Tras ajustar todos los factores de riesgo tradicionales, CRP y concentración de sPLA2 de tipo IIA, las relaciones de probabilidad de CAD incidente en el segundo, tercer y cuarto cuartiles de actividad de sPLA2 fueron 1,41, 1,33 y 1,56 (P = 0,003), en comparación con el cuartil más bajo. Se observaron efectos similares en hombres y mujeres (datos no mostrados). Las relaciones de probabilidad correspondientes asociadas a cuartiles crecientes de CRP, ajustadas para los factores de riesgo tradicionales, concentración de sPLA2 de tipo IIA y actividad de sPLA2 fueron 0,93, 1,19 y 1,43 (P = 0,001). Los cuartiles crecientes de concentración de sPLA2 de tipo IIA se asociaron a un aumento modesto del riesgo de CAD incidente tras ajustar para el factor de riesgo tradicional, CRP y actividad de sPLA2 (1,02, 1,12 y 1,29, P = 0,04).

Actividad de sPLA2 y Escala de Riesgo de Framingham

Para determinar si los niveles de actividad de sPLA2 tenían un valor predictivo en la parte superior de la escala de riesgo de Framingham, se calcularon las relaciones de probabilidad de CAD incidente por cuartil de actividad de sPLA2 mediante regresión logística condicional, y se ajustaron para los componentes de la escala de riesgo de Framingham. Los cuartiles crecientes de actividad de sPLA2 permanecieron asociados de forma significativa al riesgo de CAD futura 1,0 (elegido como referencia), 1,4 (1,1-1,8), 1,3 (1,0-1,7) y 1,6 (1,3-2,1) (P = 0,001). Las relaciones de probabilidad correspondientes para los cuartiles crecientes de CRP fueron 1,0 (elegido como referencia), 1,0 (0,8-1,3), 1,3 (1,0-1,6) y 1,8 (1,4-2,3), (P<0,001).

Medida combinada de actividad de sPLA2 y de niveles de CRP para establecer el riesgo de CAD incidente (Tabla 4)

La actividad de sPLA2 y los niveles de CRP se correlacionaban mal (r = 0,15), lo que sugiere que cada biomarcador identifica diferentes grupos de riesgo elevado diferentes. La capacidad del modelo basado en la actividad de sPLA2 para discriminar eventos de no eventos fue similar a la del modelo basado en niveles de CRP. La estadística de chi cuadrado de la relación de probabilidad fue de 220 para el modelo basado en actividad de sPLA2 y de 225 para el modelo basado en CRP (10 grados de libertad para ambos). La adición de actividad de sPLA2 al modelo basado en CRP aumentó significativamente la capacidad del modelo para predecir la aparición de CAD incidente (chi cuadrado = 14,4, 1 grado de libertad; P<0,001). La medida combinada de CRP y actividad de sPLA2, pero no de concentración de sPLA2 de tipo IIA, fue particularmente informativa. Los cuartiles crecientes de actividad de sPLA2 permanecieron asociados al riesgo de CAD futura en gente con niveles de CRP muy bajos (<0,70 mg/L) (Tabla 4), quienes habrían sido considerados de bajo riesgo de CAD. Adicionalmente, los cuartiles crecientes de actividad de sPLA2 también se asociaron al riesgo de CAD futuro incluso en la gente con los mayores niveles de CRP (≥ 3,10 mg/L) (Tabla 4). Por el contrario, los cuartiles crecientes de concentración de sPLA2 de tipo IIA no se asociaron a un mayor aumento del riesgo de CAD en la gente con los mayores niveles de CRP (Tabla 5). De forma más interesante, la gente en los cuartiles superiores de actividad de sPLA2 (≥ 4,95 nmol/min/mL) y de CRP (≥ 3,10 mg/L) (n=309) presentaron una relación de probabilidad ajustada de 2,89 (IC del 95%, 1,78 a 4,68; P<0,001), en comparación con aquellos en los cuartiles inferiores para ambos marcadores (n = 176) (Tabla 4).

Ejemplo 2: Adaptación de micrométodo para la medición automatizada de actividad de fosfolipasa A2 en suero

Se usó el siguiente método para la determinación de la actividad de sPLA2 en el Ejemplo 1.

Se obtuvieron muestras de suero (n = 79) correspondientes a donantes de sangre sanos (34 hombres y 45 mujeres; rango de edades, 21 – 64 años) con consentimiento informado por escrito. También se determinó la relación entre la actividad de sPLA2 y el nivel de sPLA2 inmunorreactiva usando un kit ELISA humano, en 234 pacientes con síndrome coronario agudo, en una media de 30 horas después del inicio de los síntomas isquémicos. Se obtuvieron sueros a partir de muestras sanguíneas centrifugadas inmediatamente a 1000 g a 4ºC durante 10 minutos y se almacenaron a -70ºC hasta ser analizados. Antes del análisis, las muestras descongeladas fueron centrifugadas a 1000 g durante 60 s.

Se midió la actividad de PLA2 secretada en el suero en un ensayo fluorimétrico continuo usando las propiedades autocontrolantes del 1-hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3-fosfometanol, sal sódica (Interchim, Montluçon, Francia). La hidrólisis de este sustrato por acción de sPLA2 conduce a un aumento de la fluorescencia a 405 nm (λemisión 405 nm). Este aumento de fluorescencia se puede usar para determinar la velocidad inicial de hidrólisis del sustrato y por consiguiente la actividad de sPLA2 en una muestra desconocida. En resumen, se distribuyó automáticamente 1 nmol de sustrato fluorescente en 200 µL de tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 8,7, albúmina al 0,1%, cloruro de calcio 10 mM) en una placa de microtitulación Black Maxisorp (96 pocillos). Debido a las propiedades autocontrolantes del sustrato, primero se registra una fluorescencia baja (Fmin) en un fluorímetro Fluostar Optima equipado con un dispositivo de agitación y un termostato ajustado a 30ºC. La adición de 30 µL (100 U/mL) de PLA2 de veneno de abeja (Sigma Chemical Co., Francia) conduce a una hidrólisis rápida de todo el sustrato (100% de hidrólisis) y a un aumento de la fluorescencia hasta un valor máximo (Fmax). La diferencia de fluorescencia (Fmax – Fmin) se relaciona linealmente con la concentración de sustrato en el tampón y se mantuvo constante en todos los ensayos. La velocidad inicial de hidrólisis del sustrato se relacionó linealmente con la cantidad de PLA2 de veneno de abeja añadida (Figura 1). Para determinar la actividad de sPLA2 en muestras de sangre desconocidas, se distribuyeron automáticamente 30 µL de suero y añadieron a la mezcla de sustrato. Se registró la fluorescencia a un minuto que de este modo corresponde a una actividad de sPLA2 capaz de hidrolizar 1 nmol de sustrato en un minuto. Se usó un procedimiento de dos puntos para medir la intensidad de fluorescencia corregida de cada muestra y para evaluar la actividad enzimática (expresada en nmol/min/mL). Todas las muestras fueron evaluadas por duplicado.

El rango dinámico de este ensayo estuvo limitado sólo por la precisión de la medida de fluorescencia y el límite de detección (media + 3 SD) del ensayo fluorimétrico de actividad de sPLA2 fue de 0,15 nmol/min/mL determinado midiendo la intensidad de fluorescencia de la disolución tampón. El límite superior del ensayo se estableció cuando la hidrólisis de sustrato estaba por encima del 50%. Ninguna de las muestras anormales incluidas en este estudio exhibió una hidrólisis de sustrato superior a 50% y no necesitaron ser diluidas.

5

15

25

35

45

La imprecisión del ensayo fluorimétrico de actividad de sPLA2 se determinó mediante la medición de muestras con baja (1,25 nmol/min/mL) y alta (9,5 nmol/min/mL) actividad de sPLA2. Los CVs dentro del lote oscilaron entre 2,7 % (muestra de baja actividad, n = 10) y 3,2 % (muestra de alta actividad, n = 10) y el CV entre lotes fue del 5,7 % (n = 10). La actividad de sPLA2 no se vio afectada por el almacenamiento a -70ºC durante 6 meses. La sPLA2 en suero media (± SD) para adultos sanos se estimo en 3,25 ± 0,58 nmol/min/mL (oscilando entre 1,69 y 5,86 nmol/min/mL).

Para 234 muestras de pacientes con síndrome coronario agudo, se midieron los niveles de sPLA2 inmunrreactiva usando un kit ELISA humano adquirido de Cayman Chemical Company. Las actividades de PLA2 secretora medidas en dichas muestras se correlacionaron con las determinadas con la medición de sPLA2 inmunorreactiva (p<0,0138; r = 0,44). La media de sPLA2 evaluada mediante estos dos métodos fue de 5,57 ± 1,88 nmol/min/mL (0,9 – 16,9 nmol/min/mL) y 587,7 ± 1126,3 pg/mL (67,32 – 10090 pg/mL) para la medición fluorimétrica de actividad y el método inmunorreactivo; respectivamente.

Ejemplo 4: Ensayo de sPLA2 fluorescente automatizado en muestra de plasma o suero humano:

Alternativamente al método descrito usado en el Ejemplo 1 y detallado en el Ejemplo 2 para medir la actividad de sPLA2, se ha desarrollado el siguiente método para tener en cuenta la variabilidad que puede ser debida a un aumento no específico de la intensidad de fluorescencia que dependa de otros factores de la muestra biológica que puedan interferir con la detección de la actividad de sPLA2.

La actividad de PLA2 secretada (sPLA2) en plasma o suero se midió en un ensayo fluorimétrico continuo usando las propiedades autocontrolantes del 1-hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3 fosfometanol, sal sódica (Interchim, Montluçon, Francia). La hidrólisis de este sustrato por acción de la sPLA2 da lugar a ácido 1pirenodecanoico y conduce a un aumento de la fluorescencia a 405 nm (λexcitación 355 nm, λemisión 405 nm). Este aumento de fluorescencia puede usarse para determinar la velocidad inicial de hidrólisis del sustrato y por consiguiente la actividad de sPLA2 en una muestra desconocida. El ensayo de sPLA2 se llevó a cabo en un fluorímetro de placa de 96 pocillos (es decir, el Fluostar Optima de nuestro laboratorio, de BMG Labtech). En resumen, se distribuyeron automáticamente 200 µL de disolución de sustrato de trabajo (sustrato a una concentración final 5 µM en tampón TRIS/HCl 10 mM, pH 8,7, que contiene CaCl2 10 mM y un 0,1% de albúmina de suero bovino) en una placa de microtitulación Black Maxisorp (96 pocillos). Debido a las propiedades autocontrolantes del sustrato, en primer lugar se registró una fluorescencia baja durante 2 minutos a 30 ºC (en el menú de configuración de la placa – modo de agitación orbital: 7 – tiempo d ciclo: 5 segundos) para dar lugar a la línea base de la reacción (Fmin). La adición de disolución de trabajo de PLA2 (1000 U/mL) de PLA2 de veneno de abeja (Sigma Chemical Co., Francia) conduce a una rápida hidrólisis de todo el sustrato (100% de hidrólisis) y a un aumento de la fluorescencia hasta un valor máximo (Fmax). La ganancia del fluorímetro puede ajustarse automáticamente en el 100% de hidrólisis. La diferencia de fluorescencia (Fmax – Fmin) se correlaciona linealmente con la concentración de sustrato en el tampón y se mantuvo constante en todos los ensayos. Para determinar la actividad de sPLA2 en muestras de sangre desconocidas, la reacción se inicia con 30 – 50 µL de muestra de plasma

o de suero distribuidos automáticamente y añadidos a la mezcla de sustrato. Cada línea de 12 pocillos fue evaluada al mismo tiempo y todas las muestras fueron evaluadas por duplicado. Se registró la fluorescencia durante de 3 a 5 minutos dependiendo de la pendiente, y se determinó la pendiente por minuto. Para convertir la pendiente por minuto (F) en actividad (A) de sPLA2 expresada en nmol/min/mL, el cálculo viene dado por la siguiente fórmula:

imagen1

: 1 nmol está contenido en la disolución de sustrato de trabajo a una concentración de 5 µM.

: V es el volumen de muestra expresado en mL (de 0,30 a 0,50 mL).

: (Fmax – Fmin) la máxima señal de fluorescencia al final de la reacción en presencia de PLA2 de

veneno de abeja.

: F es la pendiente por minuto calculada.

La actividad de sPLA2 en plasma media (± SD) medida en una población adulta sana (n = 2282) se estimó en 1,63 ± 0,62 nmol/min/mL. Los cuartiles se basaron en la distribución de la población y la distribución de cuartiles de actividad de sPLA2 obtenida es: el cuartil 1 corresponde a la parte de la población dada con la menor actividad de sPLA2 (de 0,01 a 1,22 nmol/min/mL), el cuartil 2 corresponde a valores que oscilan entre 1,22 y 1,54 nmol/min/mL, el cuartil 3 corresponde a valores que oscilan entre 1,54 y 1,93 nmol/min/mL y el cuartil 4 corresponde a la parte de la población con la mayor actividad de sPLA2 (>1,93 nmol/min/mL).

Tabla 1. Características de línea base de los participantes en el estudio.

Controles: Casos P

Hombres, n: 1138 633

Edad, años: 65 ± 8 65 ± 8 Ajustado

Índice de masa corporal, kg/m2: 26,2 ± 3,0 27,2 ± 3,5 < 0,001

Diabetes, % (n): 2,0 (23) 6,8 (43) < 0,001

Fumador: - actualmente, % (n): 8,4 (96) 16,1 (102) < 0,001

- previamente, % (n): 59,5 (677) 58,6 (371) < 0,001

- nunca, % (n): 32,1 (365) 25,3 (160) < 0,001

Tensión sanguínea sistólica, mmHg: 139 ± 18 144 ± 19 < 0,001

Tensión sanguínea diastólica, mmHg: 85 ± 11 86 ± 12 < 0,001

Colesterol total, mmol/L: 6,0 ± 1,1 6,3 ± 1,1 < 0,001

LDL-c, mmol/L: 4,0 ± 1,0 4,2 ± 1,0 < 0,001

HDL-c, mmol/L: 1,2 ± 0,3 1,2 ± 0,3 < 0,001

Triglicéridos, mmol/L*: 1,7 (1,2-2,3) 1,9 (1,4-2,7) < 0,001

CRP, mg/L*: 1,4 (0,7-2,9) 2,1 (1,0-4,5) < 0,001

sPLA2, ng/mL*: 7,3 (5,3-10,9) 8,3 (5,8-12,7) < 0,001

Actividad de sPLA2, nmol/min/mL*: 4,2 (3,7-4,9) 4,5 (4,0-5,2) < 0,001

Mujeres, n: 668 358

Edad, años: 66 ± 7 67 ± 7 Ajustado

Índice de masa corporal, kg/m2: 26,1 ± 3,8 27,3 ± 4,6 < 0,001

Diabetes, % (n): 0,9 (6) 5,3 (19) < 0,001

Fumador: - actualmente, % (n): 8,1 (54) 15,4 (55) < 0,001

- previamente, % (n): 36,2 (242) 38,8 (139) < 0,001

-nunca, % (n): 55,7 (372) 45,8 (164) < 0,001

Tensión sanguínea sistólica, mmHg: 138 ± 19 142 ± 19 0,002

Tensión sanguínea diastólica, mmHg: 82 ± 11 84 ± 12 0,001

Colesterol total, mmol/L: 6,6 ± 1,1 6,8 ± 1,3 < 0,001

LDL-c, mmol/L: 4,3 ± 1,1 4,5 ± 1,1 < 0,001

HDL-c, mmol/L: 1,6 ± 0,4 1,4 ± 0,4 < 0,001

Triglicéridos, mmol/L*: 1,5 (1,1-2,1) 1,8 (1,3-2,4) < 0,001

CRP, mg/L*: 1,6 (0,7-3,4) 2,6 (1,1-6,0) < 0,001

sPLA2, ng/mL*: 10,4 (7,2-16,3) 12,4 (8,0-18,4) < 0,001

Actividad de sPLA2, nmol/min/mL*: 4,3 (3,8-5,1) 4,8 (4,0-5,6) < 0,001

Hombres y Mujeres, n: 1806 991

Edad, años: 65 ± 8 65 ± 8 Ajustado

Índice de masa corporal, kg/m2: 26,2 ± 3,3 27,3 ± 3,9 < 0,001

Diabetes, % (n): 1,6 (29) 6,3 (62) < 0,001

Fumador: - actualmente, % (n): 8,3 (150) 15,8 (157) < 0,001

20

- previamente, % (n): 50,9 (919) 51,5 (510) < 0,001

-nunca, % (n): 40,8 (737) 32,7 (324) < 0,001

Tensión sanguínea sistólica, mmHg: 139 ± 18 144 ± 19 < 0,001

Tensión sanguínea diastólica, mmHg: 84 ± 11 86 ± 12 < 0,001

Colesterol total, mmol/L: 6,2 ± 1,1 6,5 ± 1,2 < 0,001

LDL-c, mmol/L: 4,1 ± 1,0 4,3 ± 1,1 < 0,001

HDL-c, mmol/L: 1,4 ± 0,4 1,3 ± 0,4 < 0,001

Triglicéridos, mmol/L*: 1,5 (1,1-3,4) 1,8 (1,3-2,6) < 0,001

CRP, mg/L*: 1,6 (0,7-3,4) 2,2 (1,0-5,0) < 0,001

sPLA2, ng/mL*: 10,4 (7,2-16,3) 9,5 (6,4-15,0) < 0,001

Actividad de sPLA2, nmol/min/mL*: 4,3 (3,8-5,1) 4,6 (4,0-5,3) < 0,001

Los valores representan la media ± SD.

* Los valores representan las medianas y los rangos intercuartil.

Tabla 2. Características de línea base de casos y controles según cuartil de actividad de sPLA2.

Cuartiles de actividad de sPLA2

1: 2 3 4 P

Actividad de sPLA2, nmol/min/mL: < 3,74 [3,74-4,29] [4,29-4,95] ≥ 4,95

Edad, años: 64 ± 8 65 ± 8 65 ± 8 66 ± 8 < 0,001

Índice de masa corporal, kg/m2: 25,9 ± 3,4 26,3 ± 3,5 26,7 ± 3,6 27,2 ± 3,7 < 0,001

Diabetes, % (n): 2,5 (15) 3,7 (25) 4,0 (28) 2,9 (23) 0,4

Fumador: - actualmente, % (n): 7,4 (45) 11,3 (77) 11,8 (83) 12,8 (102)

- previamente, % (n): 53,4 (326) 45,8 (313) 50,3 (354) 54,5 (436) < 0,001

-nunca, % (n): 39,2 (239) 42,9 (293) 37,9 (267) 32,8 (293)

Tensión sanguínea sistólica, mmHg: 138 ± 18 139 ± 18 141 ± 19 143 ± 18 < 0,001

Tensión sanguínea diastólica, mmHg: 83± 11 83 ± 11 85 ± 12 86 ± 12 < 0,001

Colesterol total, mmol/L: 5,9 ± 1,0 6,1 ± 1,1 6,3 ± 1,1 6,8 ± 1,2 < 0,001

LDL-c, mmol/L: 3,9 ± 0,9 4,0 ± 1,0 4,1 ± 1,0 4,4 ± 1,1 < 0,001

HDL-c, mmol/L: 1,4 ± 0,4 1,4 ± 0,4 1,3 ± 0,4 1,3 ± 0,4 < 0,001

Triglicéridos, mmol/L: 1,4 ± 0,6 1,6 ± 0,6 1,9 ± 0,8 2,4 ± 1,0 < 0,001

CRP, mg/L: 3,1 ± 5,3 3,2 ± 4,8 3,7 ± 5,9 4,5 ± 7,1 < 0,001

sPLA2 tipo IIA, ng/mL: 9,6 ± 8,7 10,7 ± 8,1 11,3 ± 9,1 13,3 ± 10,2 < 0,001

Los valores representan la media ± SD.

Tabla 3. Relaciones de probabilidad ajustadas correspondientes a enfermedad arterial coronaria incidente durante el seguimiento según cuartil de actividad de sPLA2 o de CRP, medidas en línea base.

Cuartiles de actividad de sPLA2 (nmol/min/mL)

1 2 3 4 P

< 3,74 Casos/controles 160/450Modelo 1 (IC 95%) 1,00

Modelo 2 (IC 95%) 1,00

Modelo 3 (IC 95%) 1,00 [3,74-4,29] [4,29-4,95] ≥ 4,95

230/453 252/452 349/451 1,41 1,38 1,70 < 0,001 (1,10-1,83) (1,07-1,78) (1,32-2,19) 1,43 1,36 1,65 0,001 (1,10-1,84) (1,05-1,76) (1,27-2,12) 1,41 1,33 1,56 0,003 (1,09-1,82) (1,03-1,72) (1,21-2,02)

Modelo 1: igualado para sexo, edad, momento de reclutamiento, y ajustado para diabetes, status de fumador, IMC, tensión sanguínea sistólica, LDL-C, HDL-C. Modelo 2: como el Modelo 1 con un ajuste adicional para Log(CRP). Modelo 3: como el Modelo 2 con un ajuste adicional para Log(concentración de sPLA2 de tipo IIA).

Tabla 3. Fin.

Cuartiles de CRP (mg/L)

1 2 3 4 P

< 0,70 Casos/controles 160/434Modelo 1 (IC 95%) 1,00

Modelo 2 (IC 95%) 1,00

Modelo 3 (IC 95%) 1,00 [0,70-1,45] [1,45-3,10] ≥ 3,10

192/465 256/468 383/439 0,94 1,22 1,61 < 0,001 (0,72-1,22) (0,94-1,58) (1,25-2,08) 0,92 1,20 1,55 < 0,001 (0,71-1,21) (0,93-1,56) (1,20-1,99) 0,93 1,19 1,43 0,001 (0,71-1,22) (0,91-1,54) (1,11-1,86)

Modelo 2: como el Modelo 1 con un ajuste adicional para Log(actividad de sPLA2). Modelo 3: como el Modelo 2 con un ajuste adicional para Log(concentración de sPLA2 de tipo IIA).

Tabla 4. Relaciones de probabilidad ajustadas correspondientes a enfermedad arterial coronaria incidente durante el seguimiento según cuartiles combinados de actividad de sPLA2 o de CRP, medidas en línea base.

Cuartiles de actividad de sPLA2 (nmol/min/mL)

Cuartiles de CRP (mg/L) 1 (< 0,70) 2 ([0,70-1,45]) 3 ([1,45-3,10]) 4 (≥ 3,10)

1: 2 3 4

< 3,74: [3,74-4,29] [4,29-4,95] ≥ 4,95

1,00: 1,43 1,62 1,94

(0,82-2,49): (0,93-2,64) (1,10-3,41)

1,06: 1,37 1,39 1,63

(0,60-1,89): (0,79-2,36) (0,82-2,37) (0,96-2,78)

1,50: 2,21 1,57 1,94

(0,86-2,61): (1,30-3,75) (0,93-2,64) (1,16-3,25)

1,55: 2,25 2,51 2,89

(0,89-2,69): (1,34-3,78) (1,49-4,23) (1,78-4,68)

Las relaciones de probabilidad calculadas mediante regresión logística condicional, teniendo en cuenta igualar sexo, edad, momento de reclutamiento, y ajustando para diabetes, status de fumador, índice de masa corporal, tensión sanguínea sistólica, LDL-c y HDL-c.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un método in vitro para determinar un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco en un paciente, que comprende:

- determinar el valor de actividad de sPLA2 en una muestra obtenida de dicho paciente como un primer marcador de riesgo, y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rangos de actividades de sPLA,

- determinar el valor de un segundo marcador de riesgo: el nivel de CRP, de dicho paciente, y localizar dicho valor en un intervalo de un conjunto de intervalos predeterminados de rangos de niveles de CRP,

-estable cer los intervalos combinados obtenidos con los al menos dos de los intervalos mencionados anteriormente de dicho paciente como un tercer marcador de riesgo, estableciendo una relación de probabilidad para dichos intervalos combinados y comparar dicho valor de relación de probabilidad con relaciones de probabilidad predeterminadas de acuerdo a intervalos de rango de actividades de sPLA2 y de rango de niveles de CRP, siendo dichas relaciones de probabilidad predictivas de un aumento del riesgo de mortalidad o de un evento cardiaco en un paciente.
2.-Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la actividad de sPLA2 medida para la muestra de plasma del paciente es superior a aproximadamente 1,8 nmol/mL/min, en particular superior a aproximadamente 2 nmol/mL/min, más particularmente superior a aproximadamente 2,5 nmol/mL/min, preferiblemente superior a aproximadamente 2,9 nmol/mL/min, y más preferiblemente superior a 3,3 y/o la actividad de sPLA2 medida para la muestra de suero del paciente es superior a 3,74 nmol/mL/min y preferiblemente superior a 4,29 nmol/mL/min y preferiblemente superior a 4,95 nmol/mL/min.
3.-Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el nivel de CRP en suero de un paciente es superior a 0,70 mg/L, en particular superior a aproximadamente 1,45 mg/L, más particularmente superior a aproximadamente 2,5 mg/L y más preferiblemente superior a aproximadamente 3,1 mg/L.
4.-Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los valores de relaciones de probabilidad predeterminadas corresponden a las relaciones obtenidas a partir de la asociación entre los intervalos de actividad de sPLA2 comprendidos en los tres cuartiles superiores del rango de actividades de sPLA2, y los intervalos del rango de niveles de CRP comprendidos en los tres cuartiles superiores y preferiblemente en la mitad superior del rango de niveles de CRP, en particular en la mitad superior del rango de actividades de sPLA2 y en la mitad superior del rango de niveles de CRP, más particularmente en la cuartil superior de dicho rango de sPLA2 y en el cuartil superior del rango de niveles de CRP.
5.-Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la relación de probabilidad obtenida con los al menos dos intervalos combinados de actividad de sPLA2 del paciente y el intervalo de nivel de CRP de dicho paciente, es igual o superior a aproximadamente 1,37, en particular igual o superior a aproximadamente 1,39, más particularmente igual o superior a 1,57 y preferiblemente igual o superior a aproximadamente 2,89.
6.-Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el paciente es diagnosticado como sustancialmente sano, en particular con respecto a aterosclerosis, enfermedades cardiacas relacionadas.
7.-Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el paciente es diagnosticado con uno de los siguientes trastornos coronarios:

-

enfermedades arteriales asintomáticas con isquemia silenciosa o sin isquemia,

-

trastornos isquémicos agudos sin necrosis de miocardio, tales como angina pectoris inestable,

-

trastornos isquémicos con necrosis de miocardio, tales como infarto de miocardio con elevación de segmento ST o infarto de miocardio sin elevación de segmento ST.
8.-Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que no se diagnostica al paciente ningún inicio de síntomas isquémicos.
9.-Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se diagnostica al paciente un inicio de síntomas isquémicos.
10.-El uso combinado de actividad de sPLA2 y de nivel de CRP en una diagnosis in vitro de mortalidad o de un evento cardiaco.