ES2367302T3 - Usos de la citoquina il-23 de mamífero; reactivos relacionados. - Google Patents

Abstract

El uso de un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para tratar una herida o para mejorar la cicatrización de heridas, en el que el agonista comprende: a. IL-23 b. una proteína de fusión de IL-23; o c. un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

Description

Campo de la invención

La presente invención versa, en general, acerca de usos de moléculas similares a la citoquina de mamífero y reactivos relacionados. Más específicamente, la invención versa acerca de la identificación de proteínas similares a la citoquina de mamíferos e inhibidores de las mismas que modulan la cicatrización de la piel o de heridas, por ejemplo, afecciones inflamatorias de la piel.

Antecedentes de la invención

Las citoquinas son proteínas pequeñas que median la señalización y la comunicación entre células del sistema inmunitario, por ejemplo células T, células B, células dendríticas, y macrófagos. Estas proteínas median un número de actividades celulares, incluyendo la proliferación, el crecimiento, la diferenciación, la migración, la activación celular, y la respuesta a infecciones, antígenos extraños, y heridas.

Una familia particularmente importante de citoquinas es la familia de interleucina-6 (IL-6). Estas citoquinas exhiben una amplia gama de funciones biológicas, que a menudo se solapan, que son transmitidas por medio de receptores sobre la superficie celular de múltiples cadenas, que están formados normalmente mediante cadenas receptoras específicas de citoquina de alta afinidad y cadenas transductoras de señales de menor afinidad. A menudo, se comparten las subunidades receptoras entre los miembros de esta subfamilia de citoquinas.

Recientemente, se ha identificado una citoquina helicoidal novedosa que tiene una homología estructural con la familia IL-6 de citoquinas. Esta proteína fue designada p19, y se demostró que es parte de un factor compuesto novedoso que consiste en un complejo con un puente disulfuro entre las subunidades p19 y p40 de la IL-12. Este complejo p19p40 novedoso, también conocido como IL-23, es expresado de forma natural por células dendríticas activadas de ratón y de ser humano y tiene actividades biológicas que son similares pero distintas de la IL-12 (véase, por ejemplo, Oppmann et al. (2000) Immunity 13:715-725). La subunidad p19 de la IL-23 también es conocida como “IL-23p19”.

La presente revelación identifica y proporciona IL-23, agonistas de la IL 23, y variantes y derivados de los mismos, como moduladores de trastornos cutáneos, por ejemplo, para ser utilizados en el tratamiento o diagnóstico de afecciones y trastornos cutáneos o en la cicatrización de heridas, véanse, por ejemplo, Fitzpatrick, et al. (eds.) (1993) Dermatology in General Medicine 4ª ed., McGraw-Hill, Nueva York, EE. UU.; Bos (ed.) (1989) Skin Immune System, CRC Press, Boca Ratón, Florida, EE. UU.; Callen (1996) General Practice Dermatology, Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut, EE. UU.; Rook, et al. (eds.) (1998) Textbook of Dermatology, Blackwell Publ., Malden, Massachusetts, EE. UU.; Habifor y Habie (1995) Clinical Dermatology: A Color Guide to Diagnosis and Therapy, Mosby, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.; Grob (ed.) (1997) Epidemiology, Causes and Prevention of Skin Diseases, Blackwell, Malden, Massachusetts, EE. UU.; Hess y Salcido (2000) Wound Care, Springhouse Pub. Co., Springhouse, Pensilvania, EE. UU.; Mani, et al. (1999) Chronic Wound Sealing: Clinical Measurement and Basic, Balliere Tindall Ltd., Londres, Reino Unido; Wyngaarden y Smith (eds.) (1985) Cecil’s Textbook of medicine, W.B. Saunders Co., Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.; Berkow (ed.) (1982) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, West Point, Pensilvania, EE. UU.; Braunwald, et al. (eds.) (1991) Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12ª ed., McGraw-Hill, Inc., Nueva York, EE. UU.

La presente revelación proporciona procedimientos y reactivos para el tratamiento, la prevención, y el diagnóstico de heridas y de la cicatrización de heridas, por ejemplo, quemaduras, heridas de cartílago, de los nervios y de la médula espinal, de los músculos, de los tejidos blandos, de los vasos sanguíneos, y angiogénesis, úlceras y llagas por decúbito, fracturas óseas y osteoporosis, y para promover el crecimiento cutáneo, por ejemplo, en sitios cosechados o donantes utilizados en un injerto cutáneo (véanse, por ejemplo, Yamaguchi y Yoshikawa (2001) J. Dermatol. 28: 521-534; Cairns, et al. (1993) Arch. Surg. 128: 1246-1252; Horn, et al. (2002) Facial Plast. Surg. 18: 41-52; Hackam y Ford (2002) Surg. Infect. (Larchmt) 3(Supl. 1): 523-535; Oshima, et al. (2002) Hum. Cell. 15: 118128; Lal, et al. (2000) Growth Horm. IGF Res. 10 (Supl. B): S39-S43; Rose y Hemdon (1997) Burns 23: S19-S26; Schryvers, et al. (2000) Arch. Phys. Med Rehabil. 81: 1556-1562; Hidaka, et al. (2002) Orthhop. Clin. North Am. 33: 439-446; Dagum (1998) J. Hand Ther. 11: 111-117; Coutts, et al. (2001) Clin. Orthop. 391 (Supl.): S271-S279; Larsson (2002) Scand J. Surg. 91: 140-146; Goldstein (2000) Clin. Orthop. 379 (Supl.): S113-119; Lieberman, et al. (2002) Mol. Therapy 6: 141-147; Tuli, et al. (2003) Arthritis Res. Ther. 5: 235-238; Li, et al. (2003) Microsc. Res. Tech. 60: 107-114; van Hinsbergh, et al. (2001) 936: 426-437; Conway, et al. (2001) Cardiovasc. Res. 49: 507-521). El documento US 6 001 357 describe el uso de anticuerpos anti IL-5 para la cicatrización de heridas.

La cicatrización de heridas cutáneas supone un número de fases: inflamación, en primer lugar con una inflamación de neutrófilos y luego de monocitos/macrófagos, la formación de tejido nuevo, incluyendo la formación de matrices y la diferenciación de un neoepitelio, y finalmente la remodelación y maduración. La fase inflamatoria inicial permite la formación de coágulos, controla la infección, y promueve la vascularización, y produce factores de crecimiento. Si no se controla de forma apropiada, la inflamación puede dar lugar a una cicatrización patológica, por ejemplo, úlceras o cicatrices.

Los fibroblastos depositan matriz o tejido provisional de granulación, mientras que la matriz provisional recién formada se degrada más tarde en un procedimiento de remodelación del tejido. La degradación de la matriz extracelular es mediada por proteasas, tales como metaloproteasas de matriz (MMP), gelatinasa, y colagenasa, al igual que inhibidores de la proteasa. Un desequilibrio en la formación de la matriz y la degradación da lugar, en un extremo, a úlceras crónicas y, en el otro extremo, a fibrosis. Por ejemplo, los queloides, una “respuesta de sobrecicatrización”, son hipertrofias de tejido fibroso (Michalik, et al. (2001) J. Cell Biol. 154: 799-814; Okada, et al. (1997) J. Cell Biol. 137: 67-77; Fedyk, et al. (2001) J. Immunol. 166: 5749-5755; Ravanti y Kahari (2000) Int. J. Mol. Med. 6: 391-407; Peled, et al. (2000) Clin. Past. Surg. 27: 489-500).

La formación de matrices y la reepitelialización dependen de la angiogénesis (Montesinos, et al. (1997) J. Exp. Med.

186: 1615-1620; Malinda, et al. (1998) J. Immunol. 160: 1001-1006).

Los factores de crecimiento utilizados en la cicatrización de heridas inducen la expresión de factores antimicrobianos, por ejemplo, defensinas, catelicidinas, inhibidor de la proteasa secretora, y lipocalina asociada a la gelatinasa (de neutrófilos) (Sorensen, et al. (2003) J. Immunol. 170: 5583-5589).

En la cicatrización de heridas, las células tales como plaquetas, monocitos/macrófagos, células T, y otras células inmunitarias, infiltran la herida y producen factores que regulan el crecimiento del tejido. Estos factores incluyen TGF, factor de necrosis tumoral (TNF), IL-1, IL-4, IL-6, oncostatina M, GRO-alfa, diversos factores angiogénicos, y quimioquinas. A su vez, estos factores estimulan, la expresión, por ejemplo, de la matriz extracelular y el inhibidor de tejido de metaloproteasas (TIMP). (Ihn y Tamaki (2000) J. Immunol. 165: 2149-2155; Feugate, et al. (2002) J. Cell. Biol. 156: 161-172). Los miofibroblastos, células que son fibrogénicas, son importantes para el cierre y la contracción de las heridas. Los estados de enfermedad caracterizados por la acumulación de miofibroblastos incluyen la fibrosis pulmonar y la escleroderma (Feugate, et al. (2002) J. Cell Biol. 156: 161-172).

La cicatrización de heridas de la piel y otros tejidos es un procedimiento complejo que supone la proliferación y migración de células inmunitarias, células endoteliales, fibroblastos, células estromales, miofibroblastos, células de músculo liso, periocitos, y queratinocitos.

Los parámetros utilizados para medir la cicatrización incluyen la tasa de cicatrización, la resistencia a la fractura de las heridas cicatrizadas, el grado de epitelialización, el espesor del tejido de granulación, y la densidad de la matriz extracelular (Matsuda, et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 297-306).

La isquemia o la reperfusión de la isquemia, según se producen por una lesión traumática y “descarga muscular” (reposo crónico en cama), tienen como resultado una infiltración de neutrófilos, en la que los neutrófilos producen a menudo un mayor daño tisular que el daño causado por la isquemia. En coherencia con este efecto adverso de los neutrófilos sobre la cicatrización es que la administración de antagonistas de la citoquina, incluyendo los antagonistas la IL-1 o el TNF, también puede mejorar la cicatrización de heridas bajo ciertas condiciones, incluso cuando se requiere la citoquina en última instancia para una reparación normal (véanse, por ejemplo, Ley (2003) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Compo Physiol. 285: R718-R719; Graves, et al. (2001) J. Immunol. 167: 5316-5320). La presente invención proporciona procedimientos que utilizan un antagonista de la IL-23 para inhibir una lesión tisular inducida por neutrófilos, por ejemplo, después de un trauma, de la inflicción de una herida, o un reposo prolongado en cama.

Una cicatrización incorrecta de heridas, por ejemplo, de heridas cutáneas, puede tener como resultado una molestia

o desfiguración crónica, y puede dar lugar a complicaciones adicionales, por ejemplo, infecciones o deshidratación. Por lo tanto, existe una necesidad de un tratamiento eficaz, tanto profiláctico como curativo, para aliviar los síntomas de esas afecciones. De forma alternativa, serán útiles los procedimientos de diagnóstico, por ejemplo, de cicatrización anormal o modificada de esos tejidos. La presente invención proporciona ambos.

Resumen de la invención

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que una proteína de fusión de IL-23, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende la subunidad p19 enlazada a la subunidad p40, mejoró la respuesta a una cicatrización de heridas en diversos modelos de ratón.

La presente revelación incluye aspectos y realizaciones de la invención, que son como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En consecuencia, en un primer aspecto, la invención proporciona el uso de un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para tratar una herida o mejorar la cicatrización de heridas, en el que el agonista comprende: a. IL-23; b. una proteína de fusión de IL-23; o c. un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico que codifica un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para tratar una herida o mejorar la cicatrización de heridas, en el que el agonista comprende: a. IL-23;

b. una proteína de fusión de IL-23; o c. un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para aumentar la angiogénesis, en el que el agonista comprende: a. IL-23; b. una proteína de fusión de IL-23; o c. un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico que codifica un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para aumentar la angiogénesis, en el que el agonista comprende: a. IL-23; b. una proteína de fusión de IL-23; o c. un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R. La invención también proporciona agonistas de la IL-23 para ser utilizados en el tratamiento de heridas o para aumentar la angiogénesis, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La revelación proporciona un procedimiento de tratamiento de la cicatrización, o para mejorar la misma, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un agonista o antagonista de la IL-23. También se da a conocer el anterior procedimiento, en el que el agonista o antagonista comprende un polipéptido de la IL-23, o un derivado o variante del mismo; una composición de unión derivada de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R; o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la IL-23, o un derivado o variante del mismo. Además, la revelación proporciona el anterior procedimiento en el que el derivado o variante comprende una hipercina IL-23; en el que el agonista comprende un complejo de una secuencia madura de ID de SEC nº: 10; y una secuencia madura de ID de SEC nº: 12; o el anterior procedimiento en el que el ácido nucleico comprende, además, un vector de expresión.

En otro aspecto, la revelación proporciona un procedimiento para el tratamiento de la cicatrización, o para mejorar la misma, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un agonista o antagonista de la IL-23, en el que la cicatrización es de una herida cutánea o de la piel; de una úlcera o de un injerto; o es una cicatrización incorrecta. También se proporciona el anterior procedimiento en el que el tratamiento o la mejora aumentan una presión requerida para romper una herida cicatrizada o en proceso de cicatrización; una rigidez de una herida cicatrizada o en proceso de cicatrización; una tasa de cicatrización de una herida; un espesor de una capa de granulación de una herida cicatrizada o en proceso de cicatrización; un reclutamiento de una célula para una herida

o hacia la misma, o una actividad antimicrobiana. En otro aspecto más, la revelación proporciona el anterior procedimiento en el que la célula es una célula CD11b+ del MHC de clase II+; un monocito/macrófago; una célula endotelial CD31+; o una célula inmunitaria. También se da a conocer el anterior procedimiento, en el que el reclutamiento es en un tejido de granulación, o hacia el mismo, en el que la presión aumentada de la rotura de la herida es aproximadamente un aumento de un 15% o aproximadamente un 20% de la presión de la rotura de la herida; o la mayor rigidez tiene un aumento de rigidez de aproximadamente un 15% o aproximadamente un 20%. En otro caso, la presente revelación proporciona el anterior procedimiento en el que el tratamiento o la mejora comprenden una mayor angiogénesis; o vigilancia inmunitaria; o el anterior procedimiento en el que la mayor angiogénesis está mediada por ICAM-1 o -2; o la mayor vigilancia inmunitaria está mediada por células dendríticas.

Otro aspecto más de la presente revelación proporciona un procedimiento para el tratamiento de la cicatrización, o para mejorar la misma, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un agonista o antagonista de la IL-23, en el que el tratamiento o la mejora comprende una mayor expresión de un ácido nucleico o de proteína de una citoquina además de la IL-23; una molécula de señalización; una molécula antimicrobiana; una proteasa o un inhibidor de la proteasa, o una molécula de la matriz extracelular; o el anterior procedimiento en el que el ácido nucleico o proteína de la citoquina es IL-17, IL-6, GRO-alfa, o GM-CSF; o en el que el ácido nucleico o proteína es lactoferrina; DEC-205; CD50; óxido nítrico sintasa; o inhibidor de la leucoproteasa secretora, o CD40L.

También se da a conocer el anterior procedimiento, en el que el antagonista comprende un ácido nucleico; un anticuerpo de bloqueo de la IL-23 o el IL-23R; o un receptor soluble derivado de una parte extracelular del IL-23R; el anterior procedimiento en el que el ácido nucleico comprende un ácido nucleico antisentido; o ARN de interferencia.

Otro aspecto más de la presente revelación proporciona un agonista de la IL-23 derivado de la ubicación de unión de un anticuerpo que se une específicamente a un receptor de la IL-23, siendo el anterior agonista un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal; un fragmento Fab, Fv, o F(ab’)2 humanizado; un péptido mimético o etiquetado de forma detectable. En otra realización, la presente revelación proporciona el anterior agonista que comprende un complejo de un polipéptido de la secuencia madura de la ID de SEC nº: 10 y un polipéptido de la secuencia madura de la ID de SEC nº: 12; comprendiendo el anterior agonista un complejo de dos polipéptidos de la secuencia madura de la ID de SEC nº: 10 y dos polipéptidos de la secuencia madura de la ID de SEC nº: 12. Además, la revelación proporciona el anterior agonista en el que el contacto del agonista con una célula que expresa hIL-23R e hIL12beta1 tiene como resultado un aumento en la proliferación de la célula. También se da a conocer un kit que comprende el anterior agonista y un compartimento; o instrucciones para su uso o desecho. También se da a conocer un ácido nucleico que codifica un agonista de la IL-23 derivado de la ubicación de unión de un anticuerpo que se une específicamente a un receptor de la IL-23. Los agonistas, o ácidos nucleicos, de la revelación pueden ser utilizados en la invención en la medida en que está abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

Según se utilizan en el presente documento, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de las palabras tales como “un”, “una” y “el”, “la” incluyen sus referencias plurales correspondientes a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario.

I. General.

La interleucina-23 (IL-23) es una citoquina heterodimérica compuesta de una subunidad p19 novedosa (también conocida como IL-B30) y la subunidad p40 de la IL-12 (Oppann, et al., supra). La subunidad p19 fue identificada durante una búsqueda por cálculo de miembros de la familia IL-6 de citoquinas helicoidales caracterizada por su haz único de cuatro hélices-α. Un análisis genético de la familia, de la que son miembros la oncostatina-M, la IL-11, la cardiotrofina-1, y el factor inhibidor de la leucemia, muestra que el vecino evolutivo más cercano de p19 es la subunidad p35 de la IL-12. Al igual que p35, p19 requiere la expresión conjunta de p40 para una actividad biológica (Wiekowski, et al. (2001) J. Immunol. 166: 7563-7570). El receptor de la IL-23 (IL-23R) comprende una subunidad receptora novedosa (IL-23R), que une p19, e IL-12Rβ1, que une p40 (Parham, et al. (2002) J. Immunol. 168: 56995708). Estas dos subunidades receptoras forman el complejo de señalización funcional y son expresados en células T CD4+CD45Rblo de memoria al igual que macrófagos de médula ósea activados por interferón-gamma (IFNgamma) (Parham, et al., supra).

La caracterización preliminar de la IL-23 sugiere que tiene efectos potentes sobre las células T de memoria tanto de seres humanos como de ratones, según son medidos por la proliferación y la producción de IFNgamma. En coherencia con las propiedades inmunoestimulatorias de la IL-23, los ratones en los que las células hematopoyéticas expresan de forma constitutiva p19 transgénica tienen una inflamación generalizada de múltiples órganos que tiene como resultado la muerte prematura (Wiekowski, et al., supra). La enfermedad inflamatoria se caracteriza por una infiltración intensa de macrófagos, neutrofilia, y niveles elevados de monoquinas proinflamatorias tales como IL-y TNF, lo que sugiere que la IL-23 también puede actuar sobre células mieloides.

Estudios recientes que analizan la necesidad de la IL-12 en la resistencia a enfermedades infecciosas han producido resultados divergentes, dependiendo de si se utilizan ratones p35-/-o p40-/-. Aquellos, que carecen específicamente de la IL-12 pero expresan la IL-23, son resistentes a las infecciones, mientras que estos, incapaces de expresar tanto la IL-12 como la IL-23, son más susceptibles.

Los ratones transgénicos con falta de la subunidad p19 de la IL-23 (IL-23p19) fueron resistentes a EAE, una enfermedad autoinmune del SNC mediada por células TH1 y por macrófagos inflamatorios, mientras que los ratones de control de tipo salvaje y heterocigotos de p19 fueron altamente susceptibles. Los ratones con falta de la subunidad p40 de la IL-12 (ratones con falta de IL-12p40) también fueron resistentes a EAE, mientras que los ratones con falta de la subunidad p35 de la IL-12 (ratones con falta de IL-12p35) fueron muy susceptibles a EAE. Esto es indicativo de un papel de la IL-23 en la inducción de la EAE.

Los ratones con falta de p19 tuvieron una respuesta alterada notable de cicatrización de las heridas después de una inyección subcutánea de una emulsión de aceite en los ratones. Los ratones con falta de p19 también eran deficientes en una variedad de modelos de enfermedades de ratones que requerían una activación de los monocitos/macrófagos. Se conoce que los monocitos/macrófagos estimulan la reparación de heridas; véase, por ejemplo, Schaffer y Nanney (1996) Intl. Rev. Cytol 169: 151-181. En particular, a continuación se muestra que la administración de polipéptido de IL-23 en la piel del ratón podría atraer poblaciones de CD11b+/Clase II+ activadas por monocitos/macrófagos.

II. Definiciones.

“Agonista de la IL-23” e “IL-23 agonista” abarcan un anticuerpo agonístico que se une específicamente al receptor de la IL-23 (IL-23R) y aumenta las propiedades de señalización del IL-23R. Agonista de la IL-23 también abarca un anticuerpo agonístico que se une específicamente al complejo de IL-23R e IL-Rbeta 1.

Un “anticuerpo de bloqueo” abarca, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 y evita o reduce una señalización mediada por la IL-23 y el IL-23R. Un anticuerpo de bloqueo también abarca un anticuerpo que se une específicamente al IL-23R y evita o reduce la señalización mediada por el IL-23R, o mediada por la IL-23 y el IL-23R.

“Variantes modificadas de forma conservadora” es aplicable tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias particulares de ácidos nucleicos, las variantes modificadas de forma conservadora hacen referencia a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias idénticas o esencialmente idénticas de aminoácidos, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido a secuencias esencialmente idénticas de ácido nucleico. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos pueden codificar cualquier proteína dada.

En cuando a secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que una sustitución individual a una secuencia de ácido nucleico, de péptido, de polipéptido, o de proteína que sustituye un aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada para un aminoácido conservado es una “variante modificada de forma conservadora”. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Un ejemplo de una sustitución conservadora es el intercambio de un aminoácido en uno de los siguientes grupos por otro aminoácido del mismo grupo (patente U.S. nº 5.767.063 expedida a Lee, et al.; Kyte y Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132):

(1)

Hidrófobo: Norleucina, Ile, Val, Leu, Phe, Cys, o Met;

(2)

Hidrófilo neutral: Cys, Ser, Thr;

(3)

Acídico: Asp, Glu;

(4)

Básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5)

Residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6)

Aromático: Trp, Tyr, Phe;

(7)

Aminoácidos pequeños: Gly, Ala, Ser.

La expresión “cantidad eficaz” significa una cantidad suficiente para mejorar un síntoma o signo de la afección médica. Los anfitriones mamíferos típicos incluyen ratones, ratas, gatos, perros y primates, incluyendo seres humanos. Una cantidad eficaz para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la afección que está siendo tratada, la salud general del paciente, la vía de administración y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios. Cuando está en combinación, una cantidad eficaz se encuentra en una relación con una combinación de componentes y el efecto no está limitado únicamente a componentes individuales.

Un “punto final” para evaluar o diagnosticar una cicatrización mejorada, por ejemplo, una cicatrización de heridas, incluye, sin limitación: una presión de rotura de la herida; rigidez, blandura; vigilancia inmunitaria; angiogénesis; actividad antimicrobiana relacionada con la herida; inflamación, por ejemplo, por neutrófilos, grado de expresión de genes o polipéptidos indicativa de la inflamación, angiogénesis, reepitelialización, acción antimicrobiana, y remodelación, por ejemplo, formación de matriz, descomposición de matriz o de granulación.

Como se determina mediante un punto final adecuado, la presente invención proporciona un procedimiento para mejorar la cicatrización un 10% o más, más generalmente un 15% o más, lo más generalmente un 20% o más, típicamente un 25% o más, más típicamente un 30% o más, lo más típicamente un 35% o más, habitualmente un 40% o más, más habitualmente un 50% o más, lo más habitualmente un 60% o más, normalmente un 70% o más, más normalmente un 80% o más, lo más normalmente un 90% o más, idealmente un 100% (es decir, el doble) o más, más idealmente cuatro veces o más, y lo más idealmente ocho veces o más. Según se determina mediante un punto final adecuado, la presente invención también proporciona un procedimiento para mejorar la cicatrización aproximadamente un 10%, más generalmente aproximadamente un 15%, lo más generalmente aproximadamente un 20%, típicamente aproximadamente un 25%, más típicamente aproximadamente un 30%, lo más típicamente aproximadamente un 35%, habitualmente aproximadamente un 40%, más habitualmente aproximadamente un 50%, lo más habitualmente aproximadamente un 60%, normalmente aproximadamente un 70%, más normalmente aproximadamente un 80%, lo más normalmente aproximadamente un 90%, idealmente aproximadamente un 100% (es decir, el doble), más idealmente aproximadamente cuatro veces, y lo más idealmente aproximadamente ocho veces.

“Cicatrización incorrecta de heridas” abarca la ausencia o una progresión anormalmente lenta de la cicatrización de una herida, por ejemplo, una reepitelialización retrasada. Se puede encontrar una cicatrización incorrecta de heridas, por ejemplo, en úlceras y abscesos diabéticos, úlceras por decúbito, heridas infectadas, quemaduras, edad avanzada, perfusión inadecuada, y obesidad. Cicatrización incorrecta de heridas también abarca lesiones que dejan cicatrices o que son persistentes a infecciones, véanse, por ejemplo, Singer y Clark (1999) New Engl. J. Med. 341: 738-746; Calhoun, et al. (2002) Adv. Skin Wound Care 15: 31-45; Rico, et al. (2002) J. Surg. Res. 102: 193-197; Thomas (2001) Cleve. Clin. J. Med. 68: 704-722; Ashcroft et al. (2002) Biogerontology 3: 337-345; Thomason (1999) Home Care Provid. 4: 156-161; Gallagher (1997) Ostomy. Wound Manage. 43: 18-27.

Los parámetros y puntos finales utilizados para evaluar la cicatrización de las heridas y la respuesta a agentes terapéuticos, farmacológicos y diagnósticos, incluyen un número de parámetros histológicos, fisiológicos y bioquímicos, por ejemplo, infiltración, activación, o diferenciación de neutrófilos, monocitos y macrófagos, por ejemplo, diferenciación de monocitos con respecto a macrófagos reparativos, y aparición de nuevos estromas, vasos sanguíneos, y nervios. Los parámetros adecuados también incluyen niveles de expresión de agentes de señalización, por ejemplo, factor de crecimiento de transformación, interleucina-1, y factor de crecimiento similar a la insulina. Mediciones de la epitelialización, por ejemplo, tasa y espesor, migración de las células epidérmicas, espesor de granulación, degradación y maduración de la matriz extracelular, por ejemplo, también son parámetros adecuados la matriz provisional en función de la matriz colagenosa, la resistencia de la herida (resistencia a la rotura), y la tasa de proliferación de fibroblastos, y el fenotipo de los mismos. Un mayor espesor de tejido de granulación puede tener como resultado heridas cicatrizadas más resistentes (véanse, por ejemplo, Singer y Clark, supra, Werner y Grose (2002) Physiol. Rev. 83: 835-870; Matsuda, et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 297-306; Wankell, et al. (2001) EMBO J. 20: 5361-5372).

Una composición que está “etiquetada” es detectable bien de forma directa o bien de forma indirecta, por ejemplo, mediante procedimientos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, metabólicos, inmunoquímicos, isotópicos, o químicos. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen identificadores de epítopo, flouretos, 32P, 33P, 15S, 14C, 3H, 125I, isótopos estables, compuestos fluorescentes, reactivos densos en electrones, sustratos, o enzimas, por ejemplo, según se utilizan en inmunoanálisis ligados al complejo enzima-sustrato, véanse, por ejemplo, Invitrogen (2002) Catalogue, Carlsbad, California, EE. UU.; Molecular Probes (2002) Catalogue, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE. UU.; Rozinov y Nolan (1998) Chem. Biol. 5: 713-728.

Un aumento en la “actividad antimicrobiana” abarca un aumento de la expresión, concentración, o nivel de un mediador de la actividad antimicrobiana, tanto en presencia como en ausencia de una reducción demostrada de la actividad biológica, concentración, población, o número de microbios en contacto con un sujeto o anfitrión animal o ser humano. El mediador de la actividad antimicrobiana puede ser, por ejemplo, una célula inmunitaria sensible a un antígeno bacteriano, viral, fúngico, o protozoario, o parasitario, o una molécula antimicrobiana, tal como una defensina. “Actividad antimicrobiana” abarca, por ejemplo, la fagocitosis y cualquier actividad que esté asociada generalmente o normalmente con la fagocitosis, por ejemplo, exposición de un microbio a oxígeno tóxico. “Actividad antimicrobiana” también abarca un cambio en la expresión, concentración, o nivel de un gen, una célula, una proteína, o una molécula pequeña que está asociado generalmente o normalmente con una acción antimicrobiana, por ejemplo, un aumento en la expresión de un gen en los neutrófilos. “Actividad antimicrobiana” no está limitada a un aumento en la expresión, es decir, también abarca una reducción en la expresión, cuando esa reducción promueve una actividad antimicrobiana.

La “proliferación” o “tasa de proliferación” puede ser medida, por ejemplo, al evaluar el aumento del número de células durante un periodo o intervalo predeterminado de tiempo, o por el número o proporción de células en la fase S en cualquier punto dado de tiempo.

III. Agonistas y antagonistas.

La presente revelación proporciona procedimientos de uso de agonistas de la IL-23, incluyendo la proteína de citoquina de longitud completa (ID de SEC nº: 2 o 4). También se proporciona una proteína de fusión, también conocida como “hipercina IL-23” (ID de SEC nº: 6 u 8), que comprende p19 enlazada a p40 con una secuencia de BANDERA como se ha descrito para la IL-6 de la misma, por ejemplo, en Oppmann, et al., supra; Fischer, et al. (1997) Nature Biotechnol. 15:142-145; Rakemann, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:1257-1266; y Peters, et al. (1998)

J. Immunol. 161: 3575-3581. La revelación también proporciona anticuerpos agonísticos anti-IL-23R que son agonísticos al receptor de la IL-23, por ejemplo, anticuerpos que estimulan el receptor de la IL-23 en ausencia o presencia de la IL-23.

Se utilizarán los péptidos de esas secuencias, o variantes de las mismas, para inducir una señalización del receptor. La presente revelación también contempla moléculas pequeñas que también inducen una señalización del receptor. Los agonistas de la presente revelación serán útiles en el tratamiento de diversos trastornos cutáneos inflamatorios, incluyendo pero sin limitación, la cicatrización de heridas, trastornos cutáneos asociados con un reclutamiento reducido de células mieloides/monocitas.

También se dan a conocer en el presente documento antagonistas de la IL-23, por ejemplo, un anticuerpo de bloqueo que se une a la IL-23, un anticuerpo de bloqueo que se une al IL-23R, un receptor soluble basado en la porción extracelular del IL-23R, y ácidos nucleicos. Los antagonistas de la IL-23 de la presente revelación abarcan los ácidos nucleicos que son ácidos nucleicos antisentido y ácidos nucleicos de interferencia del ARN (véanse, por ejemplo, Arenz y Schepers (2003) Naturwissenschaften 90: 345-359; Sazani y Kole (2003) J. Clin. Invest. 112: 481486; Pirollo, et al. (2003) Pharmacol. Therapeutics 99: 55-77; Wang, et al. (2003) Antisense Nucl. Acid Drug Devel.

13: 169-189).

III. Anticuerpos y reactivos relacionados.

Se dan a conocer los anticuerpos y composiciones de unión derivadas de una ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo. Estos incluyen anticuerpos humanizados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, y fragmentos de unión, tales como fragmentos Fab, F(ab)2 y Fv, y versiones diseñadas de los mismos. El anticuerpo o composición de unión puede ser agonístico o antagonístico. Se contemplan los anticuerpos que se unen de forma simultánea a un ligando y a un receptor. Los anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con al menos un KD de aproximadamente 1 mM, más normalmente al menos aproximadamente 300 µM, típicamente al menos aproximadamente 100 µM, más típicamente al menos aproximadamente 30 µM, preferentemente al menos aproximadamente 10 µM, y más preferentemente al menos aproximadamente 3 µM o mejor.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados. Véanse, por ejemplo, Sheperd y Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nueva York, Nueva York, EE. UU.; Kontermann y Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Nueva York, EE. UU.; Harlow y Lane (1998) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU., pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165: 6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160: 1029; Tang, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 27371-27378).

Se describen anticuerpos de cadena única, anticuerpos de dominio único y anticuerpos biespecíficos. Véanse, por ejemplo, Malecki, et al. (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 213-218; Conrath, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 7346-7350; Desmyter, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 26285-26290; Kostelney, et al. (1992) J. Immunol. 148: 15471553; patentes U.S. nos 5.932.448; 5.532.210; 6.129.914; 6.133.426; 4.946.778.

La invención también abarca composiciones desamidadas de unión, por ejemplo, anticuerpos, y procedimientos para utilizar composiciones desamidadas de unión (véanse, por ejemplo, Zhang y Czupryn (2003) J. Pharm. Biomed. Anal. 30: 1479-1490; Perkins, et al. (2000) Pharm. Res. 17: 1110-1117; Lehrman, et al. (1992) J. Protein Chem. 11: 657-663).

Los fragmentos de antígeno pueden estar unidos a otros materiales, tales como polipéptidos fusionados o unidos de forma covalente, para ser utilizados como inmunogenes. Un antígeno y sus fragmentos pueden ser fusionados o enlazados de forma covalente a una variedad de inmunogenes, tal como hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero bovino, u ovalbúmina (Goligan, et al. (1994) Current Protocols in Immunol., Vol. 2, 9:3-9:4, John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York, EE. UU.). Los péptidos de antigenicidad adecuada pueden ser seleccionados del polipéptido objetivo, utilizando un algoritmo, tal como los de Parker, et al. (1986) Biochemistry 25: 5425-5432; Welling, et al. (1985) FEBS Lett. 188: 215-218; Jameson y Wolf (1988) Cabios 4: 181-186; o Hopp y Woods (1983) Mol. Immunol. 20: 483-489.

No es necesaria la purificación del antígeno para la generación de anticuerpos. La vacunación puede llevarse a cabo mediante una vacunación con vectores de ADN. Véase, por ejemplo, Wang, et al. (1997) Virology 228: 278-284. De forma alternativa, se pueden vacunar los animales con células que portan el antígeno de interés. Entonces, se pueden aislar los esplenocitos de los animales vacunados, y se puede fusionar los esplenocitos con una línea celular de mieloma para producir un hibridoma. Se pueden investigar los hibridomas resultantes en busca de la producción del anticuerpo deseado mediante análisis funcionales o análisis biológicos, es decir, análisis que no dependen de la posesión del antígeno purificado. La vacunación con células puede demostrar que es superior para la generación de anticuerpos que la vacunación con antígeno purificado (Meyaard, et al. (1997) Immunity 7: 283-290; Wright, et al. (2000) Immunity 13: 233-242; Preston, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 1911-1918; Kaithamana, et al. (1999) J. Immunol. 163: 5157-5164).

Se puede medir la afinidad de anticuerpos, es decir, las propiedades de unión del anticuerpo al antígeno, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón de superficie o análisis por absorción ligada al complejo enzima-sustrato (ELISA) (véanse, por ejemplo, Maynard y Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed End. 2: 330-376; Karlsson, et al. (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240; Neri, et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 1271-1275; Jonsson, et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Friguet, et al. (1985) J. Immunol. Methods 77: 305-319; Hubble (1997) Immunol. Today

18: 305-306).

Los anticuerpos de la presente revelación se unirán normalmente con al menos un KD de aproximadamente 10-3 M, 10-6 10-7 10-8

más normalmente de al menos M, típicamente al menos M, más típicamente de al menos M,

10-10

10-9

preferentemente al menos aproximadamente M, y más preferentemente al menos M, y lo más preferentemente al menos 10-11 M (véanse, por ejemplo, Presta, et al. (2001) Thromb. Haemost. 85: 379-389; Yang, et al. (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38: 17-23; Camahan, et al. (2003) Clin. Cancer Res. (Supl.) 9: 3982s-3990s; Wilchek, et al. (1984) Meth. Enzymol. 104: 3-55).

Los anticuerpos del IL-23R, teniendo el anticuerpo anti-IL-23R sustancialmente la misma secuencia de ácido nucleico y de aminoácido que las enumeradas en el presente documento, pero que posee sustituciones que no afectan sustancialmente a los aspectos funcionales de la secuencia de ácido nucleico o de aminoácido, se encuentran dentro de la definición de la revelación. Las variantes con truncamientos, deleciones, adiciones, y sustituciones de regiones que no cambian sustancialmente las funciones biológicas de estos ácidos nucleicos y polipéptidos también se encuentran dentro de la definición de la revelación.

Un anticuerpo humanizado abarca un anticuerpo de un ser humano, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena única, y similares, que tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo procedentes de una fuente que no es humana (anticuerpo de importación). Los aminoácidos utilizados para el injerto pueden comprender todo el dominio variable de la fuente, una o más de las regiones de determinación complementaria (CDR) de la fuente, o las seis CDR del anticuerpo fuente. Al injertar las regiones de aminoácidos o de polipéptidos de importación en el anticuerpo anfitrión, se eliminan generalmente los aminoácidos o regiones correspondientes del anticuerpo anfitrión. Un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos estos, y normalmente dos dominios variables (Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc, Fv) en los que todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las regiones de entramado son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Las regiones de entramado y las CDR están sumamente conservadas en secuencia y conformación y pueden predecirse de forma precisa, por ejemplo, para ser utilizadas en CDR de injerto en un aceptor de entramado de anticuerpo humano. Las regiones CDR pueden ser injertadas en un entramado aceptor humano que se encuentra de forma natural, o en un entramado de consenso derivado de muchos anticuerpos humanos. Se han identificado un número de secuencias de consenso de ligeras variables (VL) y pesadas variables (VH) humanas. Para la humanización, se puede comparar una cadena del anticuerpo de ratón con las cadenas disponibles del entramado humano, en las que se escoge la cadena humana de homología más cercana para ser injertada (véanse, por ejemplo, Maynard y Georgiou, supra; Li, et al. (2002) Immunol. Revs. 190: 53-68; Co, et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 2869-2873; Sims, et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296-2308; Sato, et al. (1994) Mol. Immunol. 31:371-381; Morea, et al. (2000) Methods 20: 267-279; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ª ed., vol. 4, U.S. Department of Health Human Services, NIH, EE. UU.; patente U.S. nº 6.538.111, expedida a Koike, et al.; patente U.S. nº 6.329.511, expedida a Vasquez, et al.).

El anticuerpo humanizado de la presente revelación también abarca sustituciones, deleciones, y/o inserciones, utilizando técnicas estándar de mutagénesis dirigida a sitios, por ejemplo, las utilizadas para un barrido de alaninas, véanse, por ejemplo, Jin y Wells (1994) Protein Sci. 3: 2351-2357; Cunningham y Wells (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 457-462; Jones, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 11667-11674; patente U.S. nº 4.816.567 expedida a Cabilly, et al.

Las realizaciones de la presente revelación abarcan proteínas de fusión, identificadores de purificación e identificadores de epítopo, en un N-terminal, en un C-terminal, o en posiciones en el polipéptido, por ejemplo, el identificador de BANDERA y la proteína de fusión GSH-S transferasa. Los cambios de aminoácido pueden alterar, añadir, o eliminar procedimientos post-traduccionales del anticuerpo agonista anti-IL-23R, por ejemplo, sitios para O y N-glicosilación, y posiciones de los residuos de cisteína utilizados para la formación de disulfuro, véanse, por ejemplo, Wright y Morrison (1997) Trends Biotechnol. 15: 26-32; Kunkel, et al. (2000) Biotechnol. Prog. 16: 462-470.

Se pueden mejorar las propiedades de unión del anticuerpo humanizado mediante el siguiente procedimiento, por ejemplo, que supone mutagénesis dirigida a sitios. Una modelación informática permite la visualización de qué residuos de aminoácido de entramado de ratón son probables que interactúen con las CDR del ratón. Entonces, se superponen estos aminoácidos “de contacto” del entramado de ratón sobre el entramado humano homólogo. Cuando la superposición indica que el aminoácido “de contacto” del entramado de ratón es distinto del aminoácido correspondiente del entramado humano, se cambia el aminoácido humano al aminoácido correspondiente del entramado de ratón. “Contacto” significa un contacto entre cadenas entre una cadena ligera y una cadena pesada, en el que, por ejemplo, se predice que los aminoácidos se encuentran a menos de 3 angstroms el uno del otro.

También puede ser deseable una mutagénesis dirigida a sitios cuando el aminoácido del entramado humano es raro para esa posición y el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina de ratón es común para esa posición en las secuencias de inmunoglobulina humana. Aquí, se puede mutar el aminoácido del entramado humano al aminoácido correspondiente del entramado donante; véanse, por ejemplo, la patente U.S. nº 6.407.213, expedida a Carter et al.; la patente U.S. nº 6.180.370, expedida a Queen, et al.; Jung, et al. (2001) J. Mol. Biol. 309: 701-716.

El anticuerpo humanizado puede comprender al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, por ejemplo, de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo puede incluir, opcionalmente, las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede estar seleccionado de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4. Se pueden utilizar procedimientos estándar para mejorar, o eliminar, la función efectora. La función efectora incluye una unión a FcRn, FcgammaR, y al complemento. Se puede mejorar la vida media, por ejemplo, al utilizar subclases IgG2 o IgG4 humanas o al alterar residuos en la región bisagra (véanse, por ejemplo, Clark (2000) Immunol. Today 21: 397-402; Presta, et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30: 487-490; Morea, et al. (2000) Methods 20: 267-279).

Las regiones CDR y el entramado del anticuerpo humanizado no necesitan corresponderse de forma precisa con las secuencias de importación o anfitrionas, por ejemplo, estas secuencias pueden ser mutagenizadas mediante sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo, de forma que el residuo en el sitio no se corresponda ya sea con el consenso o con el anticuerpo de importación. Sin embargo, tales mutaciones no serán grandes. Normalmente, al menos un 75% de los residuos del anticuerpo humanizado se corresponderán con los de las secuencias parentales FR y CDR, más habitualmente un 90%, y lo más preferentemente más de un 95%.

Normalmente, las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-23R humanizado tendrán una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia del aminoácido con las secuencias originales de aminoácido del anticuerpo humanizado bien de la cadena pesada o bien de la ligera (por ejemplo, como en la ID de SEC nos: 2 y 4), más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, y lo más preferentemente al menos un 95%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia está definida en el presente documento como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos anti-IL-23R humanizado, después de alinear las secuencias y de introducir espacios, si fuese necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. No se interpretará que ningún N-terminal, C-terminal, ni extensiones internas, deleciones, ni inserciones en la secuencia del anticuerpo afecten la identidad u homología de la secuencia.

Una alternativa a la humanización es utilizar bibliotecas de anticuerpos humanos representadas en bibliotecas de fagos o anticuerpos humanos contenidos en ratones transgénicos (véanse, por ejemplo, Vaughan, et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 309-314; Barbas (1995) Nature Med. 1: 837-839; de Haard, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 1821818230; McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-554; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1991)

J. Mol. Biol. 222: 581-597; Mendez, et al. (1997) Nature Genet. 15: 146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21: 371-377; Barbas, et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU.; Kay, et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, California, EE. UU.; de Bruin, et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 397-399).

IV. Ácidos nucleicos, vectores, y purificación de proteínas.

Un “vector de expresión” es una construcción de ácido nucleico, generada de forma recombinante o sintética, con uno o más elementos predeterminados de ácido nucleico que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular. Normalmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que va a ser transcrito enlazado de forma operativa a un promotor.

La cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-23R agonístico pueden ser codificadas por un ácido nucleico, cuando la expresión de la cadena ligera está enlazada de forma operativa a un primer promotor, y cuando la expresión de la cadena pesada está enlazada de forma operativa a un segundo promotor. De forma alternativa, tanto la cadena ligera como la pesada pueden ser codificadas por un ácido nucleico, cuando la expresión de ambas cadenas está enlazada de forma operativa a un promotor. El o los ácidos nucleicos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada pueden estar proporcionados como uno o como dos vectores. Los procedimientos de la presente revelación abarcan la incorporación del o de los dos vectores en el genoma de una célula anfitriona (véanse, por ejemplo, Chadd y Chamow (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 188-194; Houdebine (2000) Transgenic Res. 9: 305320; Stoger, et al. (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13: 161-166).

El ácido nucleico que codifica la cadena ligera puede comprender, además, un primer vector, mientras que el ácido nucleico que codifica la cadena pesada puede comprender, además, un segundo vector. De forma alternativa, un vector puede comprender los ácidos nucleicos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada.

Para una expresión a largo plazo o aumentada del anticuerpo anti-IL-23R agonístico, se puede incorporar un vector, que contiene los ácidos nucleicos que codifican tanto la cadena ligera como la cadena pesada, en el genoma anfitrión, por ejemplo, cuando la incorporación es en un punto o en una pluralidad de puntos en el genoma anfitrión. La expresión conjunta de la cadena ligera y de la cadena pesada en una célula anfitriona produce un anticuerpo soluble. La célula anfitriona puede ser, por ejemplo, una célula de un mamífero, transformada o inmortalizada, de un insecto, de una planta, de una levadura o bacteriana. La célula anfitriona puede comprender, además, un animal transgénico. Se contemplan las combinaciones de las realizaciones anteriores, por ejemplo, cuando la cadena ligera es expresada de forma simultánea por un vector que está incorporado en el genoma de la célula anfitriona y por un vector que no está incorporado en el genoma.

La purificación de un anticuerpo, o de fragmentos del mismo, puede suponer una cromatografía de intercambio iónico, una inmunoprecipitación, identificadores de epítopo, una cromatografía de afinidad, una cromatografía líquida a alta presión, y el uso de agentes estabilizantes, detergentes o emulsionantes (Dennison y Lovrien (1997) Protein Expression Purif. 11: 149-161; Murby, et al. (1996) Protein Expression Purif. 7: 129-136; Ausubel, et al. (2001) Curr. Protocols Mol. Biol., vol. 3, John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York, EE. UU, pp. 17.0.1-17.23.8; Rajan, et al. (1998) Protein Expression Purif. 13: 67-72; Amersham-Pharmacia (2001) Catalogue, Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., pp. 543-567, 605-654; Gooding y Regnier (2002) HPLC of Biological Molecules, 2ª ed., Marcel Dekker, Nueva York, EE. UU.).

V. Kits.

También se dan a conocer un anticuerpo anti-IL-23R agonístico, fragmentos del mismo, ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-IL-23R agonístico, o fragmentos de los mismos, en un kit diagnóstico. Se da a conocer el uso de composiciones de unión, que incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, para la detección de IL23R y metabolitos y productos de la descomposición del mismo, y para la detección de actividades dependientes del IL-23R, por ejemplo, una actividad bioquímica o celular. Los anticuerpos conjugados son útiles para fines diagnósticos o de kit, e incluyen anticuerpos acoplados con una etiqueta o polipéptido, por ejemplo, un tinte, isótopos, enzima, o metal, véanse, por ejemplo, Le Doussal, et al. (1991) J. Immunol. 146: 169-175; Gibellini, et al. (1998) J. Immunol. 160: 3891-3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162: 2804-2811; Everts, et al. (2002) J. Immunol. 168: 883-889.

La revelación proporciona un kit, comprendiendo el kit un compartimento que contiene un anticuerpo anti-IL-23R agonístico, un fragmento antigénico del mismo, o un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-IL-23R agonístico, o un fragmento del mismo. En otro caso, el kit tiene un compartimento, un ácido nucleico, por ejemplo, una sonda, un cebador, o una baliza molecular, véanse, por ejemplo Zammatteo, et al. (2002) Biotech. Annu. Rev. 8: 85-101; Klein (2002) Trends Mol. Med 8: 257-260.

El kit puede comprender, por ejemplo, un reactivo y un compartimento, un reactivo e instrucciones para su uso, o un reactivo tanto con un compartimento como con instrucciones para su uso. Un kit para determinar la unión de un compuesto de prueba, por ejemplo, adquirido de una muestra biológica o de una biblioteca química, puede comprender un compuesto de control, un compuesto etiquetado, y un procedimiento para separar el compuesto etiquetado libre del compuesto etiquetado unido. Se pueden utilizar análisis de diagnóstico con las matrices biológicas tales como células vivas, extractos y lisatos de células, células fijas, cultivos celulares, fluidos corporales,

o muestras forenses. Existen diversos formatos de análisis, tales como radioinmunoanálisis (RIA), ELISA, y laboratorio en un chip (patentes U.S. nos 6.176.962 y 6.517.234).

El procedimiento puede comprender, además, poner en contacto una muestra de un sujeto de control, un sujeto normal, o tejido o fluido normal del sujeto de prueba, con la composición de unión. Además, el procedimiento puede comprender, adicionalmente, comparar la unión específica de la composición al sujeto de prueba con la unión específica de la composición con el sujeto normal, el sujeto de control, o tejido o fluido normal del sujeto de prueba. Se puede comparar la expresión o actividad de una muestra de prueba o de un sujeto de prueba con la de una muestra de control o de un sujeto de control. Una muestra de control puede comprender, por ejemplo, una muestra de tejido no afectado o no inflamado en un paciente que padece un trastorno inmunológico. Se puede proporcionar la expresión o actividad de un sujeto de control o una muestra de control como un valor predeterminado, por ejemplo, adquirido de un grupo estadísticamente apropiado de sujetos de control.

VI Usos diagnósticos; Composiciones terapéuticas; Procedimientos.

La presente invención versa acerca de procedimientos para el tratamiento y el diagnóstico de la cicatrización, de una cicatrización incorrecta, de una cicatrización de heridas y de una cicatrización incorrecta de heridas, por ejemplo, de la piel. Como se define en las reivindicaciones adjuntas, se proporcionan usos de agonistas de la IL-23, y agonistas de la IL-23 para ser utilizados para mejorar una cicatrización normal de heridas, por ejemplo, al aumentar la tasa de cicatrización, y para tratar una cicatrización incorrecta de heridas, por ejemplo, heridas caracterizadas por úlceras o exceso de fibrosis. Además, la invención versa acerca de procedimientos para tratar y evitar infecciones relacionadas con las heridas.

Se puede llevar a cabo una terapia génica de trastornos cutáneos utilizando una variedad de procedimientos. Los vehículos de administración están bien descritos en la técnica, véanse, por ejemplo, Boulikas (1998) Gene Therapy and Molecular Biology, vol. 1, Gene Therapy Press, Palo Alto, California, EE. UU.; Jolly, et al. (1994) Cancer Gene Therapy 1: 51-64; Kimura, et al. (1994) Human Gene Therapy 5: 845-852; y Kaplitt, et al. (1994) Nat. Genetics 6: 148-153.

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen una citoquina o un agonista de molécula pequeña, se mezcla la entidad con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, que es preferentemente inerte. La preparación de tales composiciones farmacéuticas es conocida en la técnica, véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, EE. UU. (1984).

Normalmente, las citoquinas son administradas parenteralmente, preferentemente de forma intravenosa. Dado que tales proteínas o péptidos pueden ser inmunogénicos son administrados, preferentemente, lentamente, bien mediante un conjunto IV de administración convencional o a partir de un depósito subcutáneo, por ejemplo, como enseña la patente U.S. 4.732.863 de Tomasi, et al. Se pueden aplicar medios para minimizar las reacciones inmunológicas. Las entidades de molécula pequeña pueden ser activas oralmente. Para el tratamiento de trastornos cutáneos, la presente invención también puede ser administrada tópicamente, véanse, por ejemplo, Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª ed., Pergamon Press; y Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, EE. UU.

Se puede administrar una terapéutica parenteral en vehículos acuosos tales como agua, solución salina, o vehículos tamponados con o sin diversos aditivos y/o agentes diluyentes. De forma alternativa, se puede preparar una suspensión, tal como una suspensión de cinc, que incluya el péptido. Tal suspensión puede ser útil para una inyección subcutánea (SQ) o intramuscular (IM), véanse, por ejemplo, Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 2ª ed., Dekker, Nueva York, EE. UU.; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, 2ª ed., Dekker, Nueva York, EE. UU.; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, Nueva York, EE. UU.; Fodor, et al. (1991) Science 251: 767-773; Coligan (ed.) Current Protocols in Immunology; Hood et al. Immunology Benjamin/Cummings: Paul (ed.) Fundamental Immunology, Academic Press; Parce, et al. (1989) Science 246: 243-247; Owicki, et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci USA 87: 4007-4011; y Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, Nueva York, EE. UU.

La selección de un régimen de administración para una terapéutica depende de varios factores, incluyendo el suero

o la tasa de renovación del tejido de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad de la entidad, y la accesibilidad de las células objetivo, el momento de la administración, la absorción a través de las capas epiteliales, etc. Preferentemente, un régimen de administración maximiza la cantidad terapéutica administrada al paciente coherente con un nivel aceptable de efectos secundarios. En consecuencia, la cantidad de compuestos biológicos administrada depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la afección que esté siendo tratada. La directriz para seleccionar las dosis apropiadas de citoquina o moléculas pequeñas se determina utilizando metodologías estándar.

El clínico toma la determinación de la dosis apropiada, por ejemplo, utilizando parámetros o factores conocidos o sospechados en la técnica para efectuar el tratamiento o que se predice que afectan al tratamiento. En general, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y es aumentada en pequeños incrementos a partir de entonces hasta que se consigue el efecto deseado u óptimo con respecto a cualquier efecto secundario negativo. Importantes medidas diagnósticas incluyen las de síntomas, por ejemplo, de la inflamación o del nivel producido de citoquinas inflamatorias. Preferentemente, un compuesto biológico que será utilizado está derivado de estas mismas especies que el animal seleccionado para ser tratado, minimizando de ese modo una respuesta humoral al reactivo.

Se pueden proporcionar los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpo y las citoquinas mediante infusión continua, o mediante dosis a intervalos de, por ejemplo, un día, una semana, o 1-7 veces por semana. Se pueden proporcionar las dosis de forma intravenosa, subcutánea, tópicamente, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral, o mediante inhalación. Un protocolo preferente de dosis es aquel que implica una dosis o frecuencia de dosis máxima que evita efectos secundarios significativos no deseables. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 µg/kg de peso corporal, más generalmente de al menos 0,2 µg/kg, lo más generalmente de al menos 0,5 µg/kg, típicamente de al menos 1 µg/kg, más típicamente de al menos 10 µg/kg, lo más típicamente de al menos 100 µg/kg, preferentemente de al menos 0,2 mg/kg, más preferentemente de al menos 1,0 mg/kg, lo más preferentemente de al menos 2,0 mg/kg, óptimamente de al menos 10 mg/kg, más óptimamente de al menos 25 mg/kg, y lo más óptimamente de al menos 50 mg/kg, véanse, por ejemplo, Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349: 427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346: 1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451-456; Portielji, et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 133-144. La dosis deseada de un compuesto terapéutico de molécula pequeña, por ejemplo, un péptido mimético, un producto natural, o una sustancia química orgánica, es aproximadamente igual que para un anticuerpo o polipéptido, medida en moles/kg.

La presente invención también proporciona la administración de compuestos biológicos en combinación con terapias conocidas, por ejemplo, esteroides, glucocorticoides en particular, que alivian los síntomas, por ejemplo, asociados con la inflamación, o antibióticos o antiinfectivos. Las dosis diarias para glucocorticoides variarán desde al menos aproximadamente 1 mg, generalmente al menos aproximadamente 2 mg, y preferentemente al menos aproximadamente 5 mg por día. En general, la dosis será inferior a aproximadamente 100 mg, típicamente inferior a aproximadamente 50 mg, preferentemente inferior a aproximadamente 20 mg, y más preferentemente al menos aproximadamente 10 mg por día. En general, los intervalos serán desde al menos aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 100 mg, preferentemente desde aproximadamente 2 mg hasta 50 mg por día. También son conocidas las combinaciones adecuadas de dosis con antibióticos, antiinfectivos, o antiinflamatorios.

La presente revelación proporciona agonistas y antagonistas de la IL-23 para modular genes relacionados con una cicatrización, por ejemplo, de cicatrización de heridas. También se dan a conocer procedimientos de diagnóstico de cicatrización, por ejemplo, que suponen detectar la expresión o cambios en la expresión de genes y productos genéticos modulados con IL-23. Estos genes y productos genéticos incluyen, por ejemplo, de óxido nítrico sintasa 2 (NOS2), lactoferrina, IL-19, DEC-205, CD50 (ICAM-2), IL-25, TNFSF7 (CD27L), proteína básica eosinofílica, y otros.

La revelación proporciona un procedimiento para modular la expresión de MMP-7, por ejemplo, para el tratamiento de la cicatrización de heridas. La proteólisis de la matriz es un distintivo de la inflamación. Se utiliza matrilisina, una metaloproteasa, en la reparación de heridas (véanse, por ejemplo, Parks, et al. (2001) Chest 120: 36S-41S; Wilson, et al. (1999) Science 286: 113-117).

La presente revelación proporciona procedimientos para modular actividades y proteínas relacionadas con los neutrófilos, tales como quimioatrayentes de neutrófilos y proteínas y metabolitos expresados por los neutrófilos. La IL-23 estimula la expresión de la IL-17 que, a su vez, estimula la producción de quimioquinas que atraen a los neutrófilos. Se encuentra una mayor expresión o actividad de respuesta de los neutrófilos, lactoferrina, IL-17, IL-6, y óxido nítrico, en un número de afecciones inflamatorias, y puede desempeñar un papel en la modulación de la cicatrización de heridas (véanse, por ejemplo, Tsokos, et al. (2002) Virchows Arch. 441: 494-499; Linden (2001) Int. Arch. Allergy Immunol. 126: 179-184; Sheppard (2002) Chest 121: 21S-25S; Redington (2000) Monaldi Arch. Chest Dis. 55: 317-323; Vignola, et al. (2001) Curr. Allergy Asthma Rep. 1: 108-115).

Se dan a conocer procedimientos para modular la expresión de lactoferrina, una proteína producida por los neutrófilos (véanse, por ejemplo, Boyton, et al. (2002) Brit. Medical Bull. 61: 1-12; Singh, et al. (2002) Nature 417: 552-555; Gómez, et al. (2002) Infect. Immun. 70: 7050-7053).

Se dan a conocer procedimientos para modular la expresión de elastasa de los neutrófilos, por ejemplo, para modular una cicatrización de heridas (véanse, por ejemplo, Tkalcevic, et al. (2000) Immunity 12: 201-210; Aprikyan, et al. (2001) Curr. Opinion Immunol. 13: 535-538; Tremblay, et al. (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4: 556-565; Lee, et al. (2001) Curr. Opinion Crit. Care 7: 1-7; Shapiro (2002) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 26: 266-268).

También se dan a conocer procedimientos para modular atrayentes para promover una cicatrización de heridas, por ejemplo, IL-17, óxido nítrico, y GRO-alfa. La IL-17 modula el reclutamiento de neutrófilos (véanse, por ejemplo Ye, et al. (2001) J. Exp. Med 194: 519-527; Ye, et al. (2001) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25: 335-340). Óxido nítrico, sintetizado mediante óxido nítrico sintasa, puede promover una cicatrización de las heridas, por ejemplo, al atraer monocitos y neutrófilos a la herida, véanse, por ejemplo, Schwentker, et al. (2002) Nitric Oxide 7: 1-10; MacMicking, et al. (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 323-350. El CXCL-1 (también conocido como GRO-alfa) promueve una cicatrización de las heridas, por ejemplo, al atraer neutrófilos a las heridas y estimulando la proliferación de queratinocitos y angiogénesis (véanse, por ejemplo, Gillitzer, et al. (2001) J. Leukoc. Biol. 69: 513-521; Li y Thornhill (2000) Cytokine 12: 1409-1413).

La IL-6 promueve la cicatrización de lesiones, por ejemplo, heridas cutáneas, véanse, por ejemplo, Gallucci, et al. (2001) J. Interferon Cytokine Res. 21: 603-609; Sugawara, et al. (2001) Cytokine 15: 328-336; Erdag, et al. (2002) Ann. Surg. 235: 113-124; Nadeau, et al. (2002) Microbes Infect. 4: 1379-1387; Imanishi, et al. (2000) Prog. Retin. Eye Res. 19: 113-129; Gregory, et al. (1998) J. Immunol. 160: 6056-6061.

El interferón-gamma (IFNgamma) media una cicatrización apropiada de heridas, por ejemplo, al modular el contenido de actina y de colágeno, la capacidad de contracción, y la formación de cicatrices, véanse, por ejemplo, Moulin, et al. (1998) Exp. Cell Res. 238: 283-293; Ahdieh, et al. (2001) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281: C2029C2038; Cornelissen, et al. (2000) J. Dent. Res. 79: 1782-1788; Shtrichman, et al. (2001) Curr. Opin. Microbiol. 4: 251-259; Ikeda, et al. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13: 95-109; Rottenberg, et al. (2002) Curr. Opin. Immunol.

14: 444-451).

La producción de IFNgamma es estimulada por CD27 (también conocido como TNFRSF7). El CD27 también estimula la proliferación celular y está implicado en la activación y el desarrollo de las células T, y en la producción de anticuerpos dependientes de las células T, incluyendo la producción de IgE, mediante células B (véanse, por ejemplo, Takeda, et al. (2000) J. Immunol. 164: 1741-1745; Nagumo, et al. (1998) J. Immunol. 161: 6496-6502; Tomiyama, et al. (2002) J. Immunol. 168: 5538-5550; Busse y Lemanske (2001) New Engl. J. Med. 344: 350-362).

El MUC5ac cumple varias funciones biológicas, incluyendo la cicatrización de heridas, véanse, por ejemplo, Dohrman, et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1406: 251-259; Rose, et al. (2000) J. Aerosol. Med. 13: 245-261; Rogers (2000) Monaldi Arch. Chest Dis. 55: 324-332; Enss, et al. (2000) Inflamm. Res. 49: 162-169.

Se comprende mejor el amplio alcance de la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten la invención a las realizaciones específicas.

Ejemplos

I. Procedimientos generales.

Se describen procedimientos estándar de bioquímica y de biología molecular, o se hace referencia a los mismos, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU.; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU.; Wu (1993) Recombinant DNA, vol. 217, Academic Press, San Diego, California, EE. UU.; Innis, et al. (eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Nueva York, EE. UU. También se encuentran procedimientos estándar en Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes 1-4, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, Nueva York, EE. UU., que describe la clonación en células bacterianas y mutagénesis de ADN (vol. 1), clonación en células de mamíferos y levadura (vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteínas (vol. 3), y bioinformática (vol. 4). Se describen procedimientos para producir proteínas de fusión. Véanse, por ejemplo, Invitrogen (2002) Catalogue, Carlsbad, California, EE. UU.; Amersham Pharmacia Biotech (2002), Catalogue, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.; Liu, et al. (2001) Curr. Protein Pept. Sci. 2: 107-121; Graddis, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 285-297. Se describen procedimientos estándar de histología (Carson (1997) Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2ª ed., Am. Sco. Clin. Pathol. Press, Chicago, Illinois, EE. UU.; Bancroft y Gamble (eds.) (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5ª ed., W.B. Saunders Co., Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.).

Hay disponibles procedimientos para una citometría de flujo, incluyendo una separación de células activadas por fluorescencia (FACS), véanse, por ejemplo, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, Nueva Jersey, EE. UU.; Givan (2001) Flow Cytometry, 2ª ed.; Wiley-Liss, Hoboken, Nueva Jersey, EE. UU.; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, Nueva Jersey, EE. UU.

Se describen procedimientos estándar de histología del sistema inmunitario, véanse, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York, Nueva York, EE. UU.; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, Nueva York, EE. UU.

Se describen procedimientos para la producción y modificación de anticuerpos, por ejemplo, en Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, EE. UU.; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU.); Harlow y Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU.; Einhauer, et al. (2001) J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465. Se describen procedimientos para diseño y transfección de adenovirus, por ejemplo, en células o mamíferos (Hurst, et al. (2002) New Engl. J. Med.

169: 443-453; Danthinne y Imperiale (2000) Gene Ther. 7: 1707-1714; Carlisle (2002) Curr. Op. Mol. Ther. 4: 306

312.

Se describen procedimientos para la purificación de proteínas tales como la inmunoprecipitación, la cromatografía en columna, la electroforesis, el enfoque isoeléctrico, la centrifugación, y la cristalización (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, EE. UU.). Se describe el análisis químico, la modificación química, la modificación postraduccional, y la glicosilación de proteínas. Véanse, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, EE. UU.; Walker (ed.) (2002) Protein Protocols Handbook, Humana Press, Towota, Nueva Jersey, EE. UU.; Lundblad (1995) Techniques in Protein Modification, CRC Press, Boca Raton, Florida, EE. UU. Se describen técnicas para caracterizar interacciones de unión (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, vol. 4, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, EE. UU.; Parker, et al. (2000) J. Biomol. Screen. 5: 77-88; Karlsson, et al. (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240; Neri, et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 1271-1275; Jonsson, et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Friguet, et al. (1985) J. Immunol. Methods 77: 305-319; Hubble (1997) Immunol. Today

18: 305-306; Shen, et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 47311-47319).

Se lleva a cabo un análisis informático utilizando software para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias de señal y delantera, plegado de proteínas, y dominios funcionales que hay disponibles. Véanse, por ejemplo, Vector NTI® Suite (Informax, Inc., Bethesda, Maryland, EE. UU.); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, California, EE. UU.), y DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada, EE. UU.); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742. También se utilizaron bases de datos públicas de secuencias, por ejemplo, de GenBank y otras.

II. Generación de heridas en ratones con falta de p19.

Se inyectó a ratones con falta de la subunidad p19 de la IL-23 (ratones de control p19; ratones p19KO) con 1 mg de Mycobacterium tuberculosis (cepa H37 RA) muerta por calor emulsionada en adyuvante incompleto de Freund (IFA) en cuatro ubicaciones dorsal-ijar. Después de 14-18 días posteriores a la exposición al antígeno bacteriano, los ratones p19KO mostraron una pérdida de pelo y lesiones cutáneas significativas. Estos resultados sugieren que en ausencia de la IL-23, los ratones tienen una respuesta inmunitaria anormal a un desafío de antígeno bacteriano, lo que da lugar a una respuesta reducida de cicatrización de las heridas.

III. Generación de herida por incisión y evaluación de las respuestas histológicas.

Se llevó a cabo la inflicción de una herida por incisión (5 mm) en la piel dorsal de los ratones de tipo salvaje (WT) y p19KO como se ha descrito (véase, por ejemplo, Cohen y Mast (1990) Advances in Understanding Trauma and Burn Injury 30: S149-S 155). Dieciocho horas después de la inflicción de una herida lineal por incisión, se cosecharon muestras de la piel que rodeaba la incisión y fueron sometidas a una microscopía confocal. Se tincionaron las secciones de tejido con anti IA-FITC y anti-CD11b-APC. Los ratones p19KO mostraron un reclutamiento retrasado de células CD11b+ MHC de clase II positiva, es decir, un retraso en el reclutamiento de monocitos derivados de la médula ósea durante el proceso de cicatrización de la herida.

Se descubrió que la IL-23 induce el reclutamiento de monocitos/macrófagos activados. Se inyectó a ratones C57BL/6 con 10 microgramos de IL-23 recombinante (rIL-23) en una ubicación dorsal intradérmica. Se tincionaron muestras cutáneas con anti-IA-FITC y anti-CD11b-APC y se analizaron mediante microscopía confocal. La IL-23 indujo el reclutamiento de monocitos CD11b+ MHC de clase II+ a la ubicación de la inyección de citoquina. Las muestras cutáneas tratadas con PBS parecieron negativas para el reclutamiento de estos monocitos. Tomada en conjunto, la respuesta alterada de cicatrización de los ratones p19KO a la Mycobacterium tuberculosis inyectada y el reclutamiento de la IL-23 de monocitos/macrófagos activados sugiere un papel de la IL-23 en la respuesta de la cicatrización de heridas.

La IL-23 también indujo un reclutamiento de monocitos/macrófagos en el tejido de granulación del lecho de la herida. Se administraron diez microgramos de rIL-23 intradérmicamente en ocho ubicaciones en torno a las dos heridas escisionales dorsales con un grosor completo de 6 mm inmediatamente posterior a la inflicción de la herida. En el día 3, se escindieron las dos heridas y la piel circundante, fueron congeladas en OCT, seccionadas y tincionadas con anti-CD11b. Se realizó una contratinción con hematoxilina (azul). El tejido de la herida tratado con la IL-23 exhibió una mayor infiltración de monocitos/macrófagos que el control de tampón 3 días posterior a la inflicción de la herida. Se encontraron resultados similares para la migración de células endoteliales CD31+.

Se descubrió que la IL-23 recombinante aumenta la cicatrización de las heridas. Inmediatamente después de la inflicción de la herida se administraron diez microgramos de rIL-23 intradérmicamente en ocho ubicaciones en torno a las heridas escisionales con un espesor completo de 6 mm en los lomos de ratones de tipo salvaje Balb/c con capacidad de cicatrización. En el día 3 posterior a la inflicción de la herida se escindieron dos heridas escisionales además de piel circundante adicional. Las heridas fueron fijadas en formaldehído, embebidas en parafina y tincionadas con hematoxilina y eosina. Los portaobjetos de histología fueron evaluados para encontrar la profundidad del tejido de granulación. Los ratones tratados con la IL-23 exhibieron un mayor espesor de la capa tisular de granulación en comparación con los ratones tratados con un tampón de control. Es imprescindible un aumento de la capa tisular de granulación para una cicatrización de heridas de etapa tardía (véase, por ejemplo, Schaffer y Nanney, supra). Se obtuvieron resultados similares en los días 3, 6 y 10 posteriores a la inflicción de la herida.

Se utilizó el mismo procedimiento para determinar si la IL-23 aumenta la reepitelialización normal que se produce en la cicatrización de heridas. Los ratones tratados con IL-23 exhibieron capas de queratinocitos más gruesas que los ratones de control de tampón.

IV. Cicatrización de las heridas por incisión y evaluación de la resistencia a la rotura.

Se afeitaron ratones macho C57B1/6NT de doce semanas y se eliminó el pelo del dorso utilizando un depilatorio (Nair®, Church and Dwight Co., Princeton, Nueva Jersey, EE. UU.). Se crearon dos heridas por incisión de 0,5 cm aproximadamente 4 cm por debajo desde la nuca y 1 cm alejadas de la línea media utilizando tijeras quirúrgicas. Cada ratón recibió cuatro inyecciones intradérmicas de 20 microlitros bien con solución salina o bien con mIL-23 (10 microgramos por ratón) en torno a la periferia de cada herida para abarcar toda la longitud de la incisión en ambos lados. Se cerró cada herida utilizando un adhesivo médico (Mastisol®, Ferndale Labs., Ferndale, Michigan, EE. UU.) y un apósito transparente (OpSite 3000®, Smith and Nephew, Largo, Florida, EE. UU.). Tres días después, se anestesiaron los ratones con un cóctel de ketamina/xilacina y se analizaron las heridas in vivo utilizando un caracterizador tisular biomecánico (BTC-2000, SRLI Technologies, Nashville, Tennesee, EE. UU.), según las instrucciones del fabricante. El BTC-2000 utiliza un láser de disparo de alta resolución y vacío para medir la deformación cutánea en un intervalo de presión negativa y de tiempo. Se aplicó una presión negativa a una tasa de 1,33 kPa/segundo hasta que se produjo una ruptura de la herida.

Se analizaron los datos al trazar la deformación cutánea como una función de presión negativa para dar: 1) la rigidez de la herida en proceso de cicatrización (pascales de presión negativa requeridos para deformar el tejido) y 2) la resistencia total de la herida en proceso de cicatrización (es decir, pascales de presión negativa requeridos para romper la herida). Las pruebas comparando los controles tratados con solución salina con objetos de experimentación tratados con mIL-23 demostraron que se requería un 46% más de presión negativa para romper las heridas tratadas con mIL-23 (26,08 kPa) que para romper las heridas tratadas con solución salina (17,88 kPa). Además, la herida en proceso de cicatrización después del tratamiento con mIL-23 (35,02 kPa/mm) era más rígida en comparación con los controles tratados con solución salina (26,45 kPa/mm).

Se contempla la administración de un agonista de la IL-23 para tener como resultado un aumento deseable de la rigidez (o reducción de la blandura) de la herida cicatrizada, más allá de lo cual, se produce un aumento no deseable de la rigidez (o reducción no deseable de blandura). Por lo tanto, se proporciona un antagonista de la IL-23 para reducir cualquier rigidez no deseable (o reducción no deseada de blandura) de una herida en proceso de cicatrización natural o de una herida tratada con agonista de la IL-23. De forma alternativa, por ejemplo, se contempla un agonista de la IL-23 para tener como resultado una reducción de la rigidez no deseable, por ejemplo, debido a un exceso de fibrosis. Por lo tanto, se proporciona un agonista de la IL-23 para reducir cualquier rigidez no deseable.

V. El tratamiento con IL-23 aumenta el tejido de granulación.

La respuesta de cicatrización de las heridas en el modelo escisional de los lomos de ratón está mediada por la combinación de una mayor formación de tejido de granulación, reepitelialización, y contracción de las heridas. Una fase de la contracción de la herida en este modelo se produce muy pronto y contribuye de forma significativa al cierre general de la herida. Para confirmar que las actividades de promoción de la IL-23 de cicatrización de heridas también eran vistas en un modelo de ratón que no tenía un aspecto prominente de contracción temprana de la herida a la respuesta de cicatrización, se escogió el modelo escisión en la cabeza del ratón.

Se administraron 10 microgramos de IL-23 recombinante intradérmicamente a 4 ubicaciones en torno a una herida escisional de grosor completo de 3 mm en la coronilla de la cabeza de los ratones Balb/c inmediatamente posterior a la inflicción de la herida. En el día 3 posterior a la inflicción de la herida, se escindieron la herida y la piel circundante. Las heridas fueron fijadas en formaldehído, embebidas en parafina, y tincionadas con hematoxilina y esoína (H/E). Se evaluaron los portaobjetos de histología del centro de la herida para encontrar la profundidad del tejido de granulación.

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30

35

Los datos del día 3 posterior a la inflicción de la herida indican que la mayor actividad de tejido de granulación resultante del tratamiento con IL-23 fue vista antes del inicio de la contracción de etapa posterior y, por lo tanto, es independiente de la contracción de la herida de la fase temprana. Se hace notar que en este modelo también se produce una fase posterior de contracción de la herida, pero solo se produce después del día 4-6.

VI. Terapia génica.

Se administra IL-23 a la ubicación de una herida cutánea utilizando tecnología de terapia génica. La administración terapéutica a la piel se lleva a cabo mediante procedimientos ex vivo o in vivo (véanse, por ejemplo, Khavari (1997) Mol. Med. Today 3: 533-538 y Khavari, et al. (2002) J. Int. Med. 252: 1-10).

Se preparó una preparación adenoviral recombinante por medio de técnicas convencionales, véanse, por ejemplo, Srivastava en WO 93/09239, Samulski et al. (1989) J Virol. 63: 3822-3828; Mendelson et al. (1988) Virol. 166: 154165; y Flotte et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10613-10617). Se administró intradérmicamente un número creciente de partículas adenovirales que codifican hipercina IL-23 de ratón o proteína fluorescente verde (GFP) o diluyente salino en 8 ubicaciones en torno a dos heridas escisionales con un espesor total de 6 mm en los lomos de los ratones Balb/c inmediatamente posterior a la inflicción de la herida. En el día 3 posterior a la inflicción de la herida, se escindieron las dos heridas y la piel circundante. Las heridas fueron fijadas en formaldehído, embebidas en parafina, y tincionadas con hematoxilina y esoína (H/E). Se evaluaron los portaobjetos de histología del centro de la herida para encontrar la profundidad del tejido de granulación. La administración de mIL-23 mediante este procedimiento tuvo como resultado una mayor respuesta de cicatrización de heridas en comparación con el vehículo por sí solo.

VII. Expresión génica con un tratamiento de hipercina mIL-23.

Se crearon heridas escisionales en los lomos de ratones C57BI6/NT. Las heridas fueron tratadas con 10 microgramos de hipercina mIL-23 o un control de solución salina mediante inyección intradérmica (i.d.) en torno a la periferia de la herida. Las heridas fueron cosechadas en el día 1 y en el día 3 posterior a la inflicción de la herida. Se obtuvieron muestras cutáneas distales a la ubicación de la inflicción de la herida como controles “no heridos”. Se llevó a cabo un análisis PCR Taqman® en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.) en las muestras tisulares. Los datos de expresión fueron relativos a la expresión de ubiquitina, fijándose la expresión de ubiquitina a uno (1,0). Entonces, se compararon los datos de expresión según los pares indicados de conjuntos de datos.

Se examinó la expresión con y sin un tratamiento de hipercina IL-23, en ausencia de la inflicción de una herida (Tabla 1) y con y sin hipercina IL-23 con inflicción de herida (Tabla 2). Se trataron ratones C57BI6/NT con hipercina IL-23 o solución salina, seguido de la determinación de la expresión del gen indicado por el análisis PCR Taqman® en tiempo real (Tabla 1). Se inyectó intradérmicamente a cada ratón, en el lomo, bien con solución salina o bien con 10 microgramos de hipercina IL-23. Se tomaron muestras tisulares y fueron extraídas 1, 3 o 7 días después de la inyección, agrupándose las muestras de los tres días fueron, y luego fueron utilizadas para un análisis Taqman®. Se muestra (Tabla 1) la relación de expresión génica con y sin un tratamiento de hipercina IL-23. La hipercina IL-23 provocó un aumento de la expresión, de 2 veces o más, de 15 de los 157 genes probados. Estos incluyeron IL-6 (33 veces), IL-19 (32 veces), y CXCL-1 (GRO-alfa) (11 veces) (Tabla 1).

Tabla 1. Relación de [Expresión génica con IL-23] / [Expresión génica con solución salina]. Se adquirieron los datos de control (solución salina) y experimentales (IL-23) sin inflicción de herida.

IL-6

33

IL-19

32

CXCL-1 (GRO-alfa)

11

IL-17

9

mMUC-Sac.fcgi

8

inhibidor de la leucoproteasa secretora (SLPI)

5

factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)

5

TNFSF5 (CD40L)

3

MAdCAM-1

3

interferón-gamma (IFN-gamma)

3

IL-9

3

12-lipoxigenasa

2

Inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1)

2

IL-1alfa

2

IL-17RC

2

Se muestran (Tabla 2) los datos de expresión del día 1 (1 día después de la inflicción de la herida) y del día 3 (3 días después de la inflicción de la herida) La IL-23 con inflicción de herida estimuló un aumento en la expresión con respecto a la encontrada con la inflicción de una herida únicamente para un número de genes asociados con una respuesta de cicatrización o de neutrófilos, incluyendo la IL-17, óxido nítrico sintasa, lactoferrina, y metaloproteasas de matriz (Tabla 2).

Tabla 2. Relación de [Expresión génica con IL-23, con herida] / [Expresión génica con solución salina, con herida] Las tendencias dependientes de la IL-23 en la expresión génica en común con dos cepas de ratón (ratón C57B1/6NT; ratón Balb/c) fueron como sigue. Se investiga un panel de 158 genes para determinar cuáles son regulados por el tratamiento de IL-23 durante una cicatrización de heridas. Solo fueron regulados al alza cinco de estos genes al menos 2 veces (Tabla 3), y solo fueron regulados a la baja tres de los genes 2 veces o más (Tabla 3).

Día 1

Día 3

IL-17

234 6,7

Óxido nítrico sintasa 2 (NOS2)

17 ⎯

lactoferrina

5,3 8,9

IL-12 (subunidad p35)

3,9 ⎯

IL-12 (subunidad p40)

3,6 ⎯

CD107 (LAMP-2; mac-3)

3,5 ⎯

cadena integrina beta7

3,4 ⎯

TNFSF11 (RANKL)

3,3 ⎯

CD11a (cadena LFA-1a)

3,0 ⎯

IL-19

2,9 2,0

endoperoxidasa sintasa tipo II (COX-2)

2,8 ⎯

IL-1RA

2,8 ⎯

IL-17RA

2,7 ⎯

CD29 (integrina bl)

2,6 ⎯

leucotrieno A4 hidrolasa

2,5 ⎯

MMP-13

2,4 ⎯

MMP-8 (colagenasa 2)

2,4 ⎯

receptor de leucotrieno B4

2,4 ⎯

TNFRSF11a (RANK)

2,4 ⎯

M-CSF1

2,3 ⎯

TIMP-1

2,3 ⎯

CD14

2,3 ⎯

enzima de conversión del TNF-alfa (TACE)

2,3 ⎯

Día 1

Día 3

subunidad Mac-1 alfa (CD11b)

2,3 ⎯

DEC-205

2,2 ⎯

CD50 (ICAM-1)

2,2 ⎯

CCL3 MIP-1alfa

2,2 ⎯

CD86 (B7-2)

2,2 ⎯

CD80 (B7-1)

2,1 ⎯

IL-80

2,1 ⎯

fibronectina

2,0 ⎯

TNFRSF6a (FAS)

2,0 ⎯

elastasa de neutrófilo

0,1 13,7

interferón-gamma (IFN-gamma)

0,7 8,7

matrilsina (MMP-7)

0,1 5,3

TNFRSF7u (CD27)

0,8 4,9

IL-13Ra2

1,4 4,8

IL-12Rb1

1,6 3,8

mieloperoxidasa

1,1 2,7

Proteína básica mayor del eosinófilo

0,4 2,7

proteinasa 3

1,6 2,6

IL-15

1,4 2,5

5 Se ha demostrado que la IL-17 regula genes importantes para la remodelación en otros sistemas tisulares. La IL-17 potencia tanto la expresión de MMP-3 y TIMP-1 como la secreción estimulada por TNF e IL-1 en miofibroblastos subepiteliales colónicos humanos (Bamba, et al. (2003) J Gastroenterol. 38: 548-554). En osteoblastos humanos, la IL-17 sinergiza con TNF-alfa, TNF-beta, e IFN-gamma para estimular la producción de MMP-13 (Rifas y Arackal (2003) Arthritis Rheum. 48: 993-1001). Dado que la IL-17 por sí sola tiene efectos mínimos en estos modelos, el

10 papel fundamental de la IL-17 puede ser amplificar la respuesta de remodelación. La IL-19 se encuentra en la piel y ha sido asociada con la psoriasis (Ghoreschik, et al. (2003) Nature Med. 9: 40-46; Gallagher, et al. (2000) Genes Immunity 1: 442-450). La lactoferrina es una proteína de unión al hierro presente en gránulos de neutrófilos maduros con un número de funciones biológicas que incluyen propiedades antimicrobianas y pueden proteger, de esta manera, contra una infección bacteriana en la herida (Masson, et al. (1969) J. Exp. Med. 130: 643-658; Farnaud y

15 Evans (2003) Mol Immunol. 40: 395-405). La ICAM-2 se expresa de forma constitutiva en todas las células endoteliales vasculares, lo que sugiere que la IL-23 puede promover una angiogénesis en la herida (Yasuda, et al. (2002) Am. J. Physiol. 282: C917-C925; Sakurai, et al. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44: 2743-2749; Moromizato, et al. (2000) Am J. Pathol. 157: 1277-1281). La DEC-205 es un marcador de célula dendrítica implicada en la maduración de las células dendríticas (Anjuere, et al. (1999) Blood 93: 590-598; Bonifax, et al. (2002) J. Exp.

20 Med. 196: 1627-1638). Por lo tanto, la IL-23 de la presente invención puede promover una vigilancia inmunitaria en la piel.

Tomado conjuntamente, el tratamiento de IL-23 en heridas puede tener efectos pleiotrópicos para acelerar la respuesta de cicatrización de heridas. El tratamiento de IL-23 también redujo la expresión de 3 genes en el entorno de la herida, es decir, la IL-25, el TNSF7, y la proteína básica eosinofílica. La infusión de ratones con IL-25 indujo 25 una expresión génica de la IL-4, la IL-5 y la IL-13 asociada con una patología de remodelación pulmonar (Fort, et al.

(2001) Immunity 15: 985-995). Por lo tanto, la IL-23 puede modular o reducir un exceso de fibrosis en una cicatrización de heridas.

La metodología relevante fue como sigue. Se afeitó el pelo y se eliminó con Nair del dorso de ratones macho C57B1/6NT de 9 semanas y Balb/c de 8 semanas. Se crearon dos heridas escisionales con un diámetro de 6 mm, 5 aproximadamente 3,5 cm por debajo de la nuca y 0,6 cm alejadas de la línea media utilizando una herramienta de biopsia por punción. Se le administró a cada ratón hipercina mIL-23 (10 microgramos por ratón) o solución salina en cuatro inyecciones intradérmicas de 20 microlitros en torno a la periferia de cada herida. Se aplicó un apósito transparente y se permitió que los ratones se recuperasen y cicatrizaran. Un día después, los ratones fueron sacrificados y las heridas fueron escindidas con un margen de aproximadamente 1,5 mm. Además, se obtuvo una

10 muestra de piel no herida de cada ratón. Todas las muestras fueron congeladas rápidamente en nitrógeno líquido y fueron almacenadas a -80 grados Celsius para un procesamiento adicional. Se extrajo ARN de cada muestra, se reunió en grupos apropiados, y se analizó mediante PCR en tiempo real para encontrar la expresión de un panel de 158 genes candidatos.

Tabla 3. Modulación de expresión génica, al menos 2 veces, en respuesta a la IL-23 tanto en ratones C57B 1/6NT 15 como en ratones Balb/c.

Genes regulados al alza.

Ratón C57B1/6NT Ratón Balb/c

IL-17

234,5 207,9

Lactoferrina

5,3 3,3

IL-19

2,9 2,2

DEC-205

2,3 2,8

CD50 (ICAM-2)

2,3 2,1

Genes regulados a la baja.

Ratón C57B 1/6NT Ratón Balb/c

IL-25

5,88 5,56

TNSF7-CD27L

3,45 100

Proteína básica eosinofílica

2,13 2,33

VIII. Anticuerpos anti-IL-23R agonistas.

Se prepararon anticuerpos anti-IL-23R de ratón contra IL-23R humano utilizando procedimientos estándar. Estos anticuerpos anti-IL-23R resultantes fueron investigados en busca de una actividad agonista utilizando células transfectadas con hIL-23R e hIL-12Rbeta1, determinándose la actividad agonista por medio de aumentos en la

20 proliferación celular. Se midió la proliferación de células Ba/F3 transfectantes por medio de procedimientos colorimétrico utilizando azul de Alamar, un tinte indicador del crecimiento.

Se midió la proliferación celular después del cultivo en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, suero fetal bovino (10%), 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, glutamina, penicilina, estreptomicina, e interleucina-3 de ratón (mIL-3) (10 ng/ml). Las células fueron incubadas en presencia de una concentración de anticuerpo, variando las 25 concentraciones entre 0,01 y 10.000 ng/ml. La referencia de proliferación celular fue la que hubo en ausencia del anticuerpo. La proliferación máxima con los anticuerpos probados se produjo en el intervalo de concentración de 1000 hasta 10.000 ng/ml. “Estimulación detectable”, por ejemplo de actividad celular, proliferación celular, o una actividad predeterminada, hace referencia, por ejemplo, a una comparación de proliferación en presencia y ausencia, por ejemplo, de un agonista de la IL-23. “Detectable” puede ser una función del contexto, por ejemplo, de

30 los reactivos, de la instrumentación, o del sistema biológico.

Los anticuerpos que estimularon la expresión incluyeron TC48-8B10.D5 (cadena ligera, ID de SEC nos: 9 y 10; cadena pesada, ID de SEC nos: 11 y 12), TC48-1H3.G5, TC48-2C9A5, y TC48-5B12.C9. De estos anticuerpos, TC48-8B10.D5 mostró la mayor actividad agonista, en términos de concentración de anticuerpo provocando un aumento máximo de ½ en la proliferación celular. Una proliferación celular de un 100% significa un aumento máximo

35 en la proliferación celular en respuesta al anticuerpo, en curvas de valoración (Tabla 4). El punto de escisión predicho para la secuencia de señal de la cadena ligera de TC48-8B 10.D5 es entre los aminoácidos 22 (Ala) y 23 (Glu) de la ID de SEC nº: 10, mientras que el punto de escisión predicho para la cadena pesada es entre los aminoácidos 19 (Ser) y 20 (Gln) de la ID de SEC nº: 12.

Tabla 4. Proliferación de células Ba/F3-2.21o en respuesta a anticuerpos agonísticos.

Anticuerpo

Aumento máximo de la proliferación celular en respuesta al anticuerpo (unidades de OD570-600 nm) Concentración del anticuerpo que proporciona un aumento máximo de ½ en la proliferación celular.

TC48-8B10.D5 (ID de SEC nos: 9-12)

0,026 10 ng/ml

TC48-2C9A5

0,021 20 ng/ml

TC48-1H3.G5

0,018 50 ng/ml

TC48-5B12.C9

0,026 100 ng/ml

La invención proporciona un anticuerpo murino agonístico que se une específicamente al IL-23R humano, TC488B10.D5. Este anticuerpo comprende un ácido nucleico (ID de SEC nº: 9) y polipéptido (ID de SEC nº: 10) de la cadena ligera, y el ácido nucleico (ID de SEC nº: 11) y el polipéptido (ID de SEC nº: 12) de la cadena pesada de

5 TC48-8B10.D5. También se proporcionan los ácidos nucleicos y los polipéptidos que comprenden las regiones hipervariables de las ID de SEC nos: 9-12.

Las regiones hipervariables de la cadena ligera son: ITSTDIDDDMI (aminoácidos 46-56); EGNTLRP (aminoácidos 72-78); y LQSDNMPLT (aminoácidos 111-119), de la ID de SEC nº: 10. Las regiones hipervariables de la cadena pesada son: GYT-FTSYWMN (aminoácidos 45-54); MIDPLDSETHYNQMFKD (aminoácidos 69-87); y GDNYYAMDY

10 (aminoácidos 118-126), de la ID de SEC nº: 12.

IX. Anticuerpos IL-23R antirratón de rata y cicatrización de heridas.

Los anticuerpos contra el IL-23R de ratón fueron desarrollados en ratas utilizando procedimientos estándar, teniendo como resultado anticuerpos denominados 5C10, 29A5, y 10E11 1 (Tabla 5). Se preparó una hipercina IL-23 que comprende una subunidad p19 y una subunidad p40 conectadas de forma covalente por medio de un conector

15 elástico (InvivoGen, San Diego, California, EE. UU.), y fue denominada “elasticina IL-23”. Los anticuerpos IL-23R antirratón, la elasticina IL-23 (control), el anticuerpo 36E10 (control de isotipo), y la solución salina (control) fueron probados en un análisis de cicatrización de heridas. Los resultados demostraron una estimulación de la cicatrización de las heridas con la elasticina IL-23, y una estimulación menor con el anticuerpo 5C10 (Tabla 5):

Tabla 5. Cicatrización de heridas; espesor del tejido de granulación (micrómetros).

Control de solución salina

170 micrómetros

control de elasticina IL-23

300

control de isotipo 36E10

170

5C10

205

29A5

170

10E11

125

20 Se resumen las secuencias en el listado de secuencias (Tabla 6): Tabla 6. Secuencias en el listado de secuencias.

ID de SEC nº:

Ácido nucleico o polipéptido

1

Ácido nucleico de IL-19 de ratón

2

Polipéptido de IL-19 de ratón

3

Ácido nucleico de IL-19 humana

4

Polipéptido de IL-19 humana

5

Ácido nucleico de hipercina de ratón

6

Polipéptido de hipercina de ratón

ID de SEC nº:

Ácido nucleico o polipéptido

7

Ácido nucleico de hipercina humana

8

Polipéptido de hipercina humana

9

Ácido nucleico de cadena ligera de Ab agonista antihumano de ratón

10

Polipéptido de cadena ligera de Ab agonista antihumano de ratón

11

Ácido nucleico de cadena pesada de Ab agonista antihumano de ratón

12

Polipéptido de cadena pesada de Ab agonista antihumano de ratón

Listado de secuencias

<110> Schering Corporation

<120> Usos de citoquina de mamífero; reactivos relacionados

<130> DX01578K

5

<150> US 60/436274 <151> 2002-12-23

<160> 12

<170> Patente en versión 3.1

<210> 1

<211> 1203

10

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (113)..(700)

15

<223>

<220>

<221> mat_péptido

<222> (176)..(700)

<223>

20

<400> 1

cgcttagaag

tcggactaca gagttagact cagaaccaaa ggaggtggat agggggtcca 60

caggcctggt

gcagatcaca gagccagcca gatctgagaa gcagggaaca ag atg ctg 118

Met

Leu

-20

gat

tgc aga gca gta ata atg cta tgg ctg ttg ccc tgg gtc act cag 166

Asp

Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val Thr Gln

-15

-10 -5

ggc

ctg gct gtg cct agg agt age agt cct gac tgg gct cag tgc cag 214

Gly

Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys Gln

-1

1 5 10

cag Gln

ctc Leu 15 tct Ser egg Arg aat Asn ctc Leu tgc Cys 20 atg Met cta Leu gcc Ala tgg Trp aac Asn 25 gca Ala cat His gca Ala cca Pro 262

gcg Ala 30

gga Gly cat His atg Met aat Asn cta Leu 35 cta Leu aga Arg gaa Glu gaa Glu gag Glu 40 gat Asp gaa Glu gag Glu act Thr aaa Lys 45 310

aat Asn

aat Asn

gtg Val ccc Pro cgt Arg 50 atc Ile cag Gln tgt Cys gaa Glu gat Asp 55 ggt Gly tgt Cys gac Asp cca Pro caa Gln 60 gga Gly 358

ctc Leu

aag Lys gac Asp aac Asn 65 agc Ser cag Gln ttc Phe tgc Cys ttg Leu 70 caa Gln agg Arg atc Ile cgc Arg caa Gln 75 ggt Gly ctg Leu 406

gct Ala

ttt Phe tat Tyr 80 aag Lys cac His ctg Leu ctt Leu gac Asp 85 tct Ser gac Asp atc Ile ttc Phe aaa Lys 90 ggg Gly gag Glu cct Pro 454

gct Ala

cta Leu 95 ctc Leu cct Pro gat Asp agc Ser ccc Pro 100 atg Met gag Glu caa Gln ctt Leu cac His 105 acc Thr tcc Ser cta Leu cta Leu 502

gga Gly 110

ctc Leu agc Ser caa Gln ctc Leu ctc Leu 115 cag Gln cca Pro gag Glu gat Asp cac His 120 ccc Pro cgg Arg gag Glu acc Thr caa Gln 125 550

cag Gln

atg Met ccc Pro agc Ser ctg Leu 130 agt Ser tct Ser agt Ser cag Gln cag Gln 135 tgg Trp cag Gln cgc Arg ccc Pro ctt Leu 140 ctc Leu 598

cgt Arg

tcc Ser aag Lys atc Ile 145 ctt Leu cga Arg agc Ser ctc Leu cag Gln 150 gcc Ala ttt Phe ttg Leu gcc Ala ata Ile 155 gct Ala gcc Ala 646

cgg Arg

gtc Val ttt Phe 160 gcc Ala cac His gga Gly gca Ala gca Ala 165 act Thr ctg Leu act Thr gag Glu ccc Pro 170 tta Leu gtg Val cca Pro 694

aca Thr

gct Ala 175 taaggatgcc caggttccca tggctaccat gataagacta atctatcagc 750

ccagacatct

accagttaat taacccatta ggacttgtgc tgttcttgtt tcgtttgttt 810

tgcgtgaagg

gcaaggacac cattattaaa gagaaaagaa acaaacccca gagcaggcag 870

ctggctagag

aaaggagctg gagaagaaga ataaagtctc gagcccttgg ccttggaagc 930

gggcaagcag

ctgcgtggcc tgaggggaag ggggcggtgg catcgagaaa ctgtgagaaa 990

acccagagca

tcagaaaaag tgagcccagg ctttggccat tatctgtaag aaaaacaaga 1050

aaaggggaac

attatacttt cctgggtggc tcagggaaat gtgcagatgc acagtactcc 1110

agacagcagc

tctgtacctg cctgctctgt ccctcagttc taacagaatc tagtcactaa 1170

gaactaacag

gactaccaat acgaactgac aaa 1203

<210> 2

<211> 196

<212> PRT

<213> Mus musculus

5

<400> 2

Met

Leu -20 Asp Cys Arg Ala Val -15 Ile Met Leu Trp Leu -10 Leu Pro Trp Val

Thr -5

Gln Gly Leu Ala -1 Val 1 Pro Arg Ser Ser 5 Ser Pro Asp Trp Ala 10 Gln

Cys

Gln Gln Leu 15 Ser Arg Asn Leu Cys 20 Met Leu Ala Trp Asn 25 Ala His

Ala

Pro Ala 30 Gly His Met Asn Leu 35 Leu Arg Glu Glu Glu 40 Asp Glu Glu

Thr

Lys 45 Asn Asn Val Pro Arg 50 Ile Gln Cys Glu Asp 55 Gly Cys Asp Pro

Gln 60

Gly Leu Lys Asp Asn 65 Ser Gln Phe Cys Leu 70 Gln Arg Ile Arg Gln 75

Gly

Leu Ala Phe Tyr 80 Lys His Leu Leu Asp 85 Ser Asp Ile Phe Lys 90

Gly

Glu

Pro Ala Leu 95 Leu Pro Asp Ser Pro 100 Met Glu Gln Leu His 105 Thr Ser

Leu

Leu

Gly 110 Leu Ser Gln Leu Leu 115 Gln Pro Glu Asp His 120 Pro Arg Glu

Thr

Gln 125 Gln Met Pro Ser Leu 130 Ser Ser Ser Gln Gln 135 Trp Gln Arg Pro

Leu 140

Leu Arg Ser Lys Ile 145 Leu Arg Ser Leu Gln 150 Ala Phe Leu Ala Ile 155

Ala

Ala

Arg Val Phe 160 Ala His Gly Ala Ala 165 Thr Leu Thr Glu Pro 170 Leu

Val

Pro Thr Ala 175

<210> 3

<211> 570

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(567)

<223>

<220>

10

<221> mat_péptido

<222> (64)..(567)

<223>

<400> 3

atg Met

ctg Leu -20 ggg Gly agc Ser aga Arg gct Ala gta Val -15 atg Met ctg Leu ctg Leu ttg Leu ctg Leu -10 ctg Leu ccc Pro tgg Trp aca Thr 48

gct Ala -5

cag Gln ggc Gly aga Arg gct Ala -1 gtg Val 1 cct Pro ggg Gly ggc Gly agc Ser 5 agc Ser cct Pro gcc Ala tgg Trp act Thr 10 cag Gln 96

tgc Cys

cag Gln cag Gln ctt Leu 15 tca Ser cag Gln aag Lys ctc Leu tgc Cys 20 aca Thr ctg Leu gcc Ala tgg Trp agt Ser 25 gca Ala cat His 144

cca Pro

cta Leu gtg Val 30 gga Gly cac His atg Met gat Asp cta Leu 35 aga Arg gaa Glu gag Glu gga Gly gat Asp 40 gaa Glu gag Glu act Thr 192

aca Thr

aat Asn 45 gat Asp gtt Val ccc Pro cat His atc Ile 50 cag Gln tgt Cys gga Gly gat Asp ggc Gly 55 tgt cys gac Asp ccc Pro caa Gln 240

gga Gly 60

ctc Leu agg Arg gac Asp aac Asn agt Ser 65 cag Gln ttc Phe tgc Cys ttg Leu caa Gln 70 agg Arg atc Ile cac His cag Gln ggt Gly 75 288

ctg Leu

att Ile ttt Phe tat Tyr gag Glu 80 aag Lys ctg Leu cta Leu gga Gly tcg Ser 85 gat Asp att Ile ttc Phe aca Thr ggg Gly 90 gag Glu 336

cct Pro

tct Ser ctg Leu ctc Leu 95 cct Pro gat Asp agc Ser cct Pro gtg Val 100 gcg Ala cag Gln ctt Leu cat His gcc Ala 105 tcc Ser cta Leu 384

ctg Leu

ggc Gly ctc Leu 110 agc Ser caa Gln ctc Leu ctg Leu cag Gln 115 cct Pro gag Glu ggt Gly cac His cac His 120 tgg Trp gag Glu act Thr 432

cag Gln

cag Gln 125 att Ile cca Pro agc ser ctc Leu agt Ser 130 ccc Pro agc Ser cag Gln cca Pro tgg Trp 135 cag Gln cgt Arg ctc Leu ctt Leu 480

ctc Leu 140

cgc Arg ttc Phe aaa Lys atc Ile ctt Leu 145 cgc Arg agc Ser ctc Leu cag Gln gcc Ala 150 ttt Phe gtg Val gct Ala gta Val gcc Ala 155 528

gcc Ala

cgg Arg gtc Val ttt Phe gcc Ala 160 cat His gga Gly gca Ala gca Ala acc Thr 165 ctg Leu agt Ser ccc Pro taa 570

<210> 4

<211> 189

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5

<400> 4

Met

Leu -20 Gly Ser Arg Ala Val -15 Met Leu Leu Leu Leu -10 Leu Pro Trp Thr

Ala -5

Gln Gly Arg Ala -1 Val 1 Pro Gly Gly Ser 5 Ser Pro Ala Trp Thr 10 Gln

Cys

Gln Gln Leu 15 Ser Gln Lys Leu Cys 20 Thr Leu Ala Trp Ser 25 Ala His

Pro

Leu Val 30 Gly His Met Asp Leu 35 Arg Glu Glu Gly Asp 40 Glu Glu Thr

Thr

Asn 45 Asp Val Pro His Ile 50 Gln Cys Gly Asp Gly 55 Cys Asp Pro Gln

Gly 60

Leu Arg Asp Asn Ser 65 Gln Phe Cys Leu Gln 70 Arg Ile His Gln Gly 75

Leu

Ile Phe Tyr Glu 80 Lys Leu Leu Gly Ser 85 Asp Ile Phe Thr Gly 90 Glu

Pro

Ser Leu Leu 95 Pro Asp Ser Pro Val 100 Ala Gln Leu His Ala 105 Ser Leu

Leu

Gly Leu 110 Ser Gln Leu Leu Gln 115 Pro Glu Gly His His 120 Trp Glu Thr

Gln

Gln 125 Ile Pro Ser Leu Ser 130 Pro Ser Gln Pro Trp 135 Gln Arg Leu Leu

Leu 140

Arg Phe Lys Ile Leu 145 Arg Ser Leu Gln Ala 150 Phe Val Ala Val Ala 155

Ala

Arg Val Phe Ala 160 His Gly Ala Ala Thr 165 Leu Ser Pro

<210> 5

<211> 1610

<212> ADN

<213> Mus musculus

5

<220>

<221> CDS

<222> (7)..(1599)

<223>

<400> 5

agatct

atg Met 1 tct Ser gca Ala ctt Leu ctg Leu 5 atc Ile cta Leu gct Ala ctt Leu gtt Val 10 gga Gly gct Ala gca Ala gtt Val 48

gct Ala 15

gac Asp tac Tyr aaa Lys gac Asp gat Asp 20 gac Asp gac Asp aag Lys ctt Leu atg Met 25 tgg Trp gag Glu ctg Leu gag Glu aaa Lys 30 96

gac Asp

gtt Val tat Tyr gtt Val gta Val 35 gag Glu gtg Val gac Asp tgg Trp act Thr 40 ccc Pro gat Asp gcc Ala cct Pro gga Gly 45 gaa Glu 144

aca Thr

gtg Val aac Asn ctc Leu 50 acc Thr tgt Cys gac Asp acg Thr cct Pro 55 gaa Glu gaa Glu gat Asp gac Asp atc Ile 60 acc Thr tgg Trp 192

acc Thr

tca Ser gac Asp 65 cag Gln aga Arg cat His gga Gly gtc Val 70 ata Ile ggc Gly tct Ser gga Gly aag Lys 75 acc Thr ctg Leu acc Thr 240

atc Ile

act Thr 80 gtc Val aaa Lys gag Glu ttt Phe ctr Xaa 85 gat Asp gct Ala ggc Gly cag Gln tac Tyr 90 acc Thr tgc Cys cac His aaa Lys 288

gga Gly 95

ggc Gly gag Glu act Thr ctg Leu agc Ser 100 cac His tca Ser cat His ctg Leu ctg Leu 105 ctc Leu cac His aag Lys aag Lys gaa Glu 110 336

aat

gga att tgg tcc act gaa att tta aaa aat ttc aaa aac aag act 384

Asn

Gly Ile Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr

115

120 125

ttc

ctg aag tgt gaa gca cca aat tac tcc gga cgg ttc acg tgc tca 432

Phe

Leu Lys Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser

130

135 140

tgg

ctg gtg caa aga aac atg gac ttg aag ttc aac atc aag agc agt 480

Trp

Leu Val Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser

145

150 155

agc

agt tcc cct gac tct cgg gca gtg aca tgt gga atg gcg tct ctg 528

Ser

Ser

Ser

Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu

160

165 170

tct

gca gag aag gtc aca ctg gac caa agg gac tat gag aag tat tca 576

Ser

Ala Glu Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr

Ser

175

180 186 190

gtg

tcc tgc cag gag gat gtc acc tgc cca act gct gag gag acc ctg 624

Val

Ser Cys Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu

195

200 205

ccc

att gaa ctg gcg ttg gaa gca cgg cag cag aat aaa tat gag aac 672

Pro

Ile Glu Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn

210

215 220

tac

agc acc agc ttc ttc atc agg gac atc atc aaa cca gac ccg ccc 720

Tyr

Ser Thr Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro

225

230 235

aag

aac ttg cag atg aag cct ttg aag aac tca cag gtg gag gtc agc 768

Lys

Asn Leu Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser

240

245 250

tgg

gag tac cct gac tcc tgg agc act ccc cat tcc tac ttc tcc ctc 816

Trp

Glu Tyr Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu

255

260 265 270

aag

ttc ttt gtt cga atc cag cgc aag aaa gaa aag atg aag gag aca 864

Lys

Phe Phe Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr

275

280 285

gag

gag

ggg tgt aac cag aaa ggt gcg ttc ctc gta gag aag aca tct 912

Glu

Glu

Gly Cys Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser

290

295 300

acc

gaa gtc caa tgc aaa ggc ggg aat gtc tgc gtg caa gct cag gat 960

Thr

Glu Val Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp

305

310 315

cgc

tat tce aat tcc tcr tgc agc aag tgg gca tgt gtt ccc tgc agg 1008

Arg

Tyr Tyr Asn Ser Xaa Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys

Arg

320

325 330

gtc

cga tcc tct aga ggt gga tca ggc tcc gga ggt agt gga ggt ggg 1056

Val

Arg Ser Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly

335

340 345 350

gga

tct aag ctt ctg gct gtg cct agg agt agc agt cct gac tgg gct 1104

Gly

Ser Lys Leu Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala

355

360 365

cag

tgc cag cag ctc tct egg aat ctc tgc atg cta gcc tgg aac gca 1152

Gln

Cys Gln Gln Leu ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala

370

375 380

cat His

gca Ala cca Pro 385 gcg Ala gga Gly cat His atg Met aat Asn 390 cta Leu cta Leu aga Arg gaa Glu gaa Glu 395 gag Glu gat Asp gaa Glu 1200

gag Glu

act Thr 400 aaa Lys aat Asn aat Asn gtg Val ccc Pro 405 cgt Arg atc Ile cag Gln tgt Cys gaa Glu 410 gat Asp ggt Gly tgt Cys gac Asp 1248

cca Pro 415

caa Gln gga Gly ctc Leu aag Lys gac Asp 420 aac Asn agc Ser cag Gln ttc Phe tgc Cys 425 ttg Leu caa Gln agg Arg atc Ile cgc Arg 430 1296

caa Gln

ggt Gly ctg Leu gtt Val ttt Phe 435 tat Tyr aag Lys cac His ctg Leu ctt Leu 440 gac Asp tct Ser gac Asp atc Ile ttc Phe 445 aaa Lys 1344

ggg Gly

gag Glu cct Pro gct Ala 450 cta Leu ctc Leu cct Pro gat Asp agc Ser 455 ccc Pro atg Met gag Glu caa Gln ctt Leu 460 cac His acc Thr 1392

tcc Ser

cta Leu cta Leu 465 gga Gly ctc Leu agc Ser caa Gln ctc Leu 470 ctc Leu cag Gln cca Pro gag Glu gat Asp 475 cac His ccc Pro cgg Arg 1440

gag Glu

acc Thr 480 caa Gln cag Gln atg Met ccc Pro agc Ser 485 ctg Leu agt Ser tct Ser agt Ser cag Gln 490 cag Gln tgg Trp cag Gln cgc Arg 1488

ccc Pro 495

ctt Leu ctc Leu cgt Arg tcc Ser aag Lys 500 atc Ile ctt Leu cga Arg agc Ser ctc Leu 505 cag Gln gcc Ala ttt Phe ttg Leu gcc Ala 510 1536

ata Ile

gct Ala gcc Ala cgg Arg gtc Val 515 ttt Phe gcc Ala cac His gga Gly gca Ala 520 gca Ala act Thr ctg Leu act Thr gag Glu 525 ccc Pro 1584

tta Leu

gtg Val cca Pro aca Thr 530 gct Ala taagcggccg c 1610

<210> 6

<211> 531

<212> PRT

<213> Mus musculus

5

<220>

<221> característica_misc

<222> (85)..(85)

<223> La “Xaa” en la ubicación 85 representa Leu.

<220>

10

<221> característica_misc

<222> (324)..(324)

<223> La “Xaa” en la ubicación 324 representa Ser.

<400> 6

Met 1

Ser Ala Leu Leu 5 Ile Leu Ala Leu Val 10 Gly Ala Ala Val Ala 15 Asp

Tyr

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val

20

25 30

Tyr

Val Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val

35

40 45

Asn

Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser

50

55 60

Asp

Gln Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr

65

70 75 80

Val

Lys Glu Phe Xaa Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly

85

90 95

Glu

Thr Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly

100

105 110

Ile

Trp Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu

115

120 125

Lys

Cys Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu

130

135 140

Val

Gln Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser

145

150 155 160

Ser

Pro Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala

165

170 175

Glu

Lys Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser

180

185 190

Cys

Gln Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile

195

200 205

Glu

Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser

210

215 220

Thr

Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn

225

230 235 240

Leu

Gln Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu

245

250 255

Tyr

Pro Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe

260

265 270

Phe

Val Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu

275

280 285

Gly

eys Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu

290

295 300

Val

Gln Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr

305

310 315 320

Tyr

Asn Ser Xaa Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg

325

330 335

Ser

Ser

Arg Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

Ser

340

345 350

Lys

Leu Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys

355

360 365

Gln

Gln

Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala

370

375 380

Pro 385

Ala Gly His Met Asn 390 Leu Leu Arg Glu Glu 395 Glu Asp Glu Glu Thr 400

Lys

Asn Asn Val Pro 405 Arg Ile Gln Cys Glu 410 Asp Gly Cys Asp Pro 415 Gln

Gly

Leu Lys Asp 420 Asn Ser Gln Phe Cys 425 Leu Gln Arg Ile Arg 430 Gln

Gly

Leu

Val Phe 435 Tyr Lys His Leu Leu 440 Asp Ser Asp Ile Phe 445 Lys Gly Glu

Pro

Ala 450 Leu Leu Pro Asp Ser 455 Pro Met Glu Gln Leu 460 His Thr Ser Leu

Leu 465

Gly Leu Ser Gln Leu 470 Leu Gln Pro Glu Asp 475 His Pro Arg Glu Thr 480

Gln

Gln

Met Pro Ser 485 Leu Ser Ser Ser Gln 490 Gln Trp Gln Arg Pro 495 Leu

Leu

Arg Ser Lys 500 Ile Leu Arg Ser Leu 505 Gln Ala Phe Leu Ala 510 Ile Ala

Ala

Arg Val 515 Phe Ala His Gly Ala 520 Ala Thr Leu Thr Glu 525 Pro Leu Val

Pro

Thr 530 Ala

<210> 7

<211> 1580

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5

<220>

<221> CDS

<222> (7)..(1569)

<223>

<400> 7

agatct

atg Met 1 tct Ser gca Ala ctt Leu ctg Leu 5 atc Ile cta Leu gct Ala ctt Leu gtt Val 10 gga Gly gct Ala gca Ala gtt Val 48

gct Ala 15

gac Asp tac Tyr aaa Lys gac Asp gat Asp 20 gac Asp gac Asp aag Lys ctt Leu ata Ile 25 tgg Trp gaa Glu ctg Leu aag Lys aaa Lys 30 96

gat Asp

gtt Val tat Tyr gtc Val gta Val 35 gaa Glu ttg Leu gat Asp tgg Trp tat Tyr 40 ccg Pro gat Asp gcc Ala cct Pro gga Gly 45 gaa Glu 144

atg Met

gtg Val gtc Val ctc Leu 50 acc Thr tgt Cys gac Asp acc Thr cct Pro 55 gaa Glu gaa Glu gat Asp ggt Gly atc Ile 60 acc Thr tgg Trp 192

acc Thr

ttg Leu gac Asp 65 cag Gln agc Ser agt Ser gag Glu gtc Val 70 tta Leu ggc Gly tct Ser ggc Gly aaa Lys 75 acc Thr ctg Leu acc Thr 240

atc

caa gtc aaa gag ttt gga gat gct ggc cag tac acc tgt cac aaa 288

Ile

Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys

80

85 90

gga

ggc gag gtt cta agc cat tcg ctc ctg ctg ctt cac aaa aag gaa 336

Gly

Gly

Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu

95

100 105 110

gat

gga att tgg tcc act gat att tta aag gac cag aaa gaa ccc aaa 384

Asp

Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys

115

120 125

aat

aag acc ttt cta aga tgc gag gcc aag aat tat tct gga cgt ttc 432

Asn

Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe

130

135 140

acc

tgc tgg tgg ctg acg aca atc agt act gat ttg aca ttc agt gtc 480

Thr

Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val

145

150 155

aaa

agc agc aga ggc tct tct gac ccc caa ggg gtg acg tgc gga gct 528

Lys

Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala

160

165 170

gct

aca atc tct gca gag aga gtc aga ggg gac aac aag gag tat gag 576

Ala

Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu

175

180 185 190

tac

tca gtg gag tgc cag gag gac agt gcc tgc cca gct gct gag gag 624

Tyr

Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu

195

200 205

agt

ctg ccc att gag gtc atg gtg gat gcc gtt cac aag ctc aag tat 672

Ser

Leu Pro Ile Glu val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr

210

215 220

gaa

aac tac acc agc agc ttc ttc atc agg gac atc atc aaa cct gac 720

Glu

Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp

225

230 235

cca

ccc aac aac ttg cag ctg aag cca tta aag aat tct cgg cag gtg 768

Pro

Pro

Asn Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn ser Arg Gln Val

240

245 250

gag

gtc agc tgg gag tac cct gac acc tgg agt act cca cat tcc tac 816

Glu

Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr

255

260 265 270

ttc

tcc ctg aca ttc tgc gtt cag gtc cag ggc aag agc aag aga gaa 864

Phe

Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu

275

280 285

aag

aaa gat aga gtc ttc acc gac aag acc tca gcc acg gtc atc tgc 912

Lys

Lys

Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys

290

295 300

cgc

aaa aat gcc agc att agc gtg cgg gcc cag gac cgc tac tat agc 960

Arg

Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser

305

310 315

tca

tct tgg agc gaa tgg gca tct gtg ccc tgc agt ggt agc ggc tct 1008

Ser

Ser

Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly

Ser

320

325 330

tct

aga ggt gga tca ggc tcc gga ggt agt gga ggt ggg gga tct aag 1056

Ser

Arg Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys

335

340 345 350

ctt Leu

aga Arg gct Ala gtg Val cct Pro 355 ggg Gly ggc Gly agc Ser agc Ser cct Pro 360 gcc Ala tgg Trp act Thr cag Gln tgc Cys 365 cag Gln 1104

cag Gln

ctt Leu tca Ser cag Gln 370 aag Lys ctc Leu tgc Cys aca Thr ctg Leu 375 gcc Ala tgg Trp agt Ser gca Ala cat His 380 cca Pro cta Leu 1152

gtg Val

gga Gly cac His 385 atg Met gat Asp cta Leu aga Arg gaa Glu 390 gag Glu gga Gly gat Asp gaa Glu gag Glu 395 act Thr aca Thr aat Asn 1200

gat Asp

gtt Val 400 ccc Pro cat His atc Ile cag Gln tgt Cys 405 gga Gly gat Asp ggc Gly tgt Cys gac Asp 410 ccc Pro caa Gln gga Gly ctc Leu 1248

agg Arg 415

gac Asp aac Asn agt Ser cag Gln ttc Phe 420 tgc Cys ttg Leu caa Gln agg Arg atc Ile 425 cac His cag Gln ggt Gly ctg Leu att Ile 430 1296

ttt Phe

tat Tyr gag Glu aag Lys ctg Leu 435 cta Leu gga Gly tcg Ser gat Asp att Ile 440 ttc Phe aca Thr ggg Gly gag Glu cct Pro 445 tct ser 1344

ctg Leu

ctc Leu cct Pro gat Asp 450 agc ser cct Pro gtg Val gcg Ala cag Gln 455 ctt Leu cat His gcc Ala tcc Ser cta Leu 460 ctg Leu ggc Gly 1392

ctc Leu

agc Ser caa Gln 465 ctc Leu ctg Leu cag Gln cct Pro gag Glu 470 ggt Gly cac His cac His tgg Trp gag Glu 475 act Thr cag Gln cag Gln 1440

att Ile

cca Pro 480 agc Ser ctc Leu agt Ser ccc Pro agc Ser 485 cag Gln cca Pro tgg Trp cag Gln cgt Arg 490 ctc Leu ctt Leu ctc Leu cgc Arg 1488

ttc Phe 495

aaa Lys atc Ile ctt Leu cgc Arg agc Ser 500 ctc Leu cag Gln gcc Ala ttt Phe gtg Val 505 gct Ala gta Val gcc Ala gcc Ala cgg Arg 510 1536

gtc Val

ttt Phe gcc Ala cat His gga Gly 515 gca Ala gca Ala acc Thr ctg Leu agt Ser 520 ccc Pro taagcggccg c 1580

<210> 8

<211> 521

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5

<400> 8

Met 1

Ser Ala Leu Leu 5 Ile Leu Ala Leu Val 10 Gly Ala Ala Val Ala 15 Asp

Tyr

Lys Asp Asp 20 Asp Asp Lys Leu Ile 25 Trp Glu Leu Lys Lys 30 Asp Val

Tyr

Val Val 35 Glu Leu Asp Trp Tyr 40 Pro Asp Ala Pro Gly 45 Glu Met Val

Val

Leu 50 Thr Cys Asp Thr Pro 55 Glu Glu Asp Gly Ile 60 Thr Trp Thr Leu

Asp 65

Gln Ser Ser Glu Val 70 Leu Gly Ser Gly Lys 75 Thr Leu Thr Ile Gln 80

Val

Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly

85

90 95

Glu

Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly

100

105 110

Ile

Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys

115

120 125

Thr

Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys

130

135 140

Trp

Trp

Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser

145

150 155 160

Ser

Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr

165

170 175

Leu

Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser

180

185 190

Val

Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu

195

200 205

Pro

Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn

210

215 220

Tyr

Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro

225

230 235 240

Asn

Asn

Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val

245

250 255

Ser

Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe

Ser

260

265 270

Leu

Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys

275

280 285

Asp

Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys

290

295 300

Asn

Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser

305

310 315 320

Trp

Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Ser Gly Ser Ser Arg

325

330 335

Gly

Gly

Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Leu Arg

340

345 350

Ala

Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln Cys Gln Gln Leu

355

360 365

Ser

Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His Pro Leu Val Gly

370

375 380

His

Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr Thr Asn Asp Val

385

390 395 400

Pro

His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly Leu Arg Asp

405

410 415

Asn

Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Ile Phe Tyr

420

425 430

Glu

Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu Leu

435

440 445

Pro

Asp 450 Ser Pro Val Ala Gln 455 Leu His Ala Ser Leu 460 Leu Gly Leu Ser

Gln 465

Leu Leu Gln Pro Glu 470 Gly His His Trp Glu 475 Thr Gln Gln Ile Pro 480

Ser

Leu Ser Pro Ser 485 Gln Pro Trp Gln Arg 490 Leu Leu Leu Arg Phe 495 Lys

Ile

Leu Arg Ser 500 Leu Gln Ala Phe Val 505 Ala Val Ala Ala Arg 510 Val Phe

Ala

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<213> Mus musculus

5

<400> 9

atgaccatgc

tctcactagc tcctctcctc agccttcttc tcctctgtgt ctctgattct 60

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aacctcctaa gctccttatt tcagaaggca atactcttcg tcctggagtc 240

ccatcccgct

tctccagcag tggctatggc acagattttg tttttacaat tgaaaacacg 300

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ggtgctggga

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ccaccatcca

tggaacagtt aacatctgga ggtgccacag tcgtgtgctt cgtgaacaac 480

ttctatccca

gagacatcag tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaaca acgagatggt 540

gtcctggaca

gtgttactga tcaggacagc aaagacagca cgtacagcat gagcagcacc 600

ctctcgttga

ccaaggttga atatgaaagg cataacctct atacctgtga ggttgttcat 660

aagacatcat

cctcacccgt cgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta g 711

<210> 10

<211> 236

<212> PRT

<213> Mus musculus

10

<400> 10

Met 1

Thr Met Leu Ser 5 Leu Ala Pro Leu Leu 10 Ser Leu Leu Leu Leu 15 Cys

Val

Ser Asp Ser 20 Arg Ala Glu Thr Thr 25 Val Thr Gln Ser Pro 30 Ala Ser

Leu

Ser Val 35 Ala Thr Gly Glu Lys 40 Val Thr Ile Arg Cys 45 Ile Thr Ser

Thr

Asp 50 Ile Asp Asp Asp Met 55 Ile Trp Tyr Gln Gln 60 Lys Pro Gly Glu

Pro 65

Pro Lys Leu Leu Ile 70 Ser Glu Gly Asn Thr 75 Leu Arg Pro Gly Val 80

Pro

Ser Arg Phe Ser 85 Ser Ser Gly Tyr Gly 90 Thr Asp Phe Val Phe 95 Thr

Ile

Glu Asn Thr 100 Leu Ser Glu Asp Val 105 Ala Asp Tyr Tyr Cys 110 Leu Gln

Ser

Asp Asn 115 Met Pro Leu Thr Phe 120 Gly Ala Gly Thr Lys 125 Val Glu Leu

Lys

Arg 130 Ala Asp Ala Ala Pro 135 Thr Val Ser Ile Phe 140 Pro Pro Ser Met

Glu 145

Gln Leu Thr Ser Gly 150 Gly Ala Thr Val Val 155 Cys Phe Val Asn Asn 160

Phe

Tyr Pro Arg Asp 165 Ile Ser Val Lys Trp 170 Lys Ile Asp Gly Ser 175 Glu

Gln

Arg Asp Gly 180 Val Leu Asp Ser Val 185 Thr Asp Gln Asp Ser 190 Lys Asp

Ser

Thr Tyr 195 Ser Met Ser Ser Thr 200 Leu Ser Leu Thr Lys 205 Val Glu Tyr

Glu

Arg 210 His Asn Leu Tyr Thr 215 Cys Glu Val Val His 220 Lys Thr Ser Ser

Ser 225

Pro Val Val Lys Ser 230 Phe Asn Arg Asn Glu 235 Cys

<210> 11

<211> 1406

<212> ADN

<213> Mus musculus

5

<400> 11

atgggatgga

gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtccaactgc

agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagg gaagctgtcc 120

tgcaaggctt

ctggctacac cttcaccagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc

ttgaatggat tggtatgatt gatcctttag acagtgaaac tcactataat 240

caaatgttca

aggacaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca

gcctgacatc tgaggactat gcggtctatt actgtgcaag aggggataac 360

tactatgcta

tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agccaaaacg 420

acacccccat

ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 480

accctgggat

gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 540

ggatccctgt

ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 600

ctgagcagct

cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 660

gttgcccacc

cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 720

tgtaagcctt

gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 780

cccaaggatg

tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 840

agcaaggatg

atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 900

gctcagacgc

aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 960

cccatcatgc

accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 1020

gctttccctg

cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1080

caggtgtaca

ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1140

tgcatgataa

cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1200

ccagcggaga

actacaagaa cactcagccc atcatggact cagatggctc ttacttcgtc 1260

tacagcaagc

tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1320

gtgttacatg

agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1380

aaatgatccc

agagtccagt ggcccc 1406

<210> 12

<211> 467

<212> PRT

<213> Mus musculus

5

<400> 12

Met 1

Gly Trp Ser Cys 5 Ile Ile Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly

Val

His Ser Gln 20 Val Gln Leu Gln Gln 25 Pro Gly Ala Glu Leu 30 Val Arg

Pro

Gly Ala 35 Ser Gly Lys Leu Ser 40 Cys Lys Ala Ser Gly 45 Tyr Thr Phe

Thr

Ser 50 Tyr Trp Met Asn Trp 55 Val Lys Gln Arg Pro 60 Gly Gln Gly Leu

Glu 65

Trp Ile Gly Met Ile 70 Asp Pro Leu Asp Ser 75 Glu Thr His Tyr Asn 80

Gln

Met Phe Lys Asp 85 Lys Ala Thr Leu Thr 90 Val Asp Lys Ser Ser 95 Ser

Thr

Ala Tyr Met 100 Gln Leu Ser Ser Leu 105 Thr Ser Glu Asp Tyr 110 Ala Val

Tyr

Tyr

Cys 115 Ala Arg Gly Asp Asn 120 Tyr Tyr Ala Met Asp 125 Tyr Trp Gly

Gln

Gly 130 Thr Ser Val Thr Val 135 Ser Ser Ala Lys Thr 140 Thr Pro Pro Ser

Val 145

Tyr Pro Leu Ala Pro 150 Gly Ser Ala Ala Gln 155 Thr Asn Ser Met Val 160

Thr

Leu Gly Cys Leu 165 Val Lys Gly Tyr Phe 170 Pro Glu Pro Val Thr 175 Val

Thr

Trp Asn Ser 180 Gly Ser Leu Ser Ser 185 Gly Val His Thr Phe 190 Pro Ala

Val

Leu Gln 195 Ser Asp Leu Tyr Thr 200 Leu Ser Ser Ser Val 205 Thr Val Pro

Ser

Ser 210 Thr Trp Pro Ser Glu 215 Thr Val Thr Cys Asn 220 Val Ala His Pro

Ala 225

Ser Ser Thr Lys Val 230 Asp Lys Lys Ile Val 235 Pro Arg Asp Cys Gly 240

Cys

Lys Pro Cys Ile 245 Cys Thr Val Pro Glu 250 Val Ser Ser Val Phe 255 Ile

Phe

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260

265 270

Val

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275

280 285

Phe

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290

295 300

Pro

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305

310 315 320

Pro

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325

330 335

Val

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340

345 350

Thr

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355

360 365

Lys

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370

375 380

Asp

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385

390 395 400

Pro

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Ser Asp Gly

405

410 415

Ser

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420

425 430

Ala

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435

440 445

His

His

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys Ser Gln Ser

450

455 460

Pro

Val Ala

465

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1. El uso de un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para tratar una herida o para mejorar la cicatrización de heridas, en el que el agonista comprende:

   a.

   IL-23

   b.

   una proteína de fusión de IL-23; o

   c.

   un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

2. 2. El uso de la Reivindicación 1(a), en el que la IL-23 comprende un complejo de:

   a.

   un polipéptido que comprende p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

   b.

   un polipéptido que comprende p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

3. 3. El uso de la Reivindicación 1(b), en el que la proteína de fusión de IL-23 comprende:

   a.

   p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

   b.

   p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

4. 4. El uso de un ácido nucleico que codifica un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para tratar una herida o mejorar la cicatrización de heridas, en el que el agonista comprende:

   a.

   IL-23;

   b.

   una proteína de fusión de IL-23; o

   c.

   un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

5. 5.

   El uso de la Reivindicación 4, en el que el ácido nucleico comprende, además, un vector de expresión.

6. 6.

   El uso de la Reivindicación 1, en el que la herida es:

   a.

   una herida cutánea o de la piel;

   b.

   una úlcera o un injerto.

7. 7.

   El uso de la Reivindicación 1, en el que el tratamiento de una herida o la mejora de la cicatrización de la herida comprende

   una mayor:

   a.

   angiogénesis; o

   b.

   vigilancia inmunitaria.

8. 8. El uso de un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para aumentar la angiogénesis, en el que el agonista comprende:

   a.

   IL-23;

   b.

   una proteína de fusión de IL-23; o

   c.

   un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

9. 9. El uso de la Reivindicación 8(a), en el que la IL-23 comprende un complejo de:

   a.

   un polipéptido que comprende p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

   b.

   un polipéptido que comprende p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

10. 10. El uso de la Reivindicación 8(b), en el que la proteína de fusión de IL-23 comprende:

    a.

    p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

    b.

    p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

11. 11. El uso de un ácido nucleico que codifica un agonista de la IL-23 en la preparación de un medicamento para aumentar la angiogénesis, en el que el agonista comprende:

    a.

    IL-23;

    b.

    una proteína de fusión de IL-23; o

    c.

    un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

12. 12.

    El uso de la Reivindicación 11, en el que el ácido nucleico comprende, además, un vector de expresión.

13. 13.

    Un agonista de la IL-23 para ser utilizado en el tratamiento de una herida, en el que el agonista comprende:

    a.

    IL-23;

    b.

    una proteína de fusión de IL-23; o

    c.

    un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

14. 14.

    El agonista a utilizar de la Reivindicación 13(a), que comprende un complejo de:

    a.

    un polipéptido que comprende p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

    b.

    un polipéptido que comprende p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

15. 15.

    El agonista a utilizar de la Reivindicación 13(b), que comprende una proteína de fusión que comprende:

    a.

    p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

    b.

    p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

16. 16.

    Un ácido nucleico que codifica un agonista de la IL-23 para ser utilizado en el tratamiento de una herida, en el que el agonista comprende:

    a.

    IL-23;

    b.

    una proteína de fusión de IL-23; o

    c.

    un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

17. 17.

    El ácido nucleico a utilizar de la Reivindicación 16, que comprende, además, un vector de expresión.

18. 18.

    El agonista a utilizar de la Reivindicación 13, en el que la herida es:

    a.

    una herida cutánea o de la piel;

    b.

    una úlcera o un injerto.

19. 19.

    Un agonista de la IL-23 para un uso in vivo para aumentar la angiogénesis, en el que el agonista comprende:

    a.

    IL-23;

    b.

    una proteína de fusión de IL-23; o

    c.

    un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

20. 20.

    El agonista a utilizar de la Reivindicación 19 (a), que comprende un complejo de:

    a.

    un polipéptido que comprende p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

    b.

    un polipéptido que comprende p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

21. 21.

    El agonista a utilizar de la Reivindicación 19(b), que comprende una proteína de fusión que comprende:

    a.

    p19, o una variante de la misma modificada de forma conservadora; y

    b.

    residuos de p40, o una variante de la misma modificada de forma conservadora.

22. 22. Un ácido nucleico que codifica un agonista de la IL-23 para un uso in vivo para aumentar la angiogénesis, en el 5 que el agonista comprende:

    a.

    IL-23;

    b.

    una proteína de fusión de IL-23; o

    c.

    un anticuerpo o composición de unión que comprende la ubicación de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a la IL-23 o al IL-23R.

    10 23. El ácido nucleico a utilizar de la Reivindicación 22, que comprende, además, un vector de expresión.