ES2368039T3

ES2368039T3 - Métodos y composiciones para interferencia de rna.

Info

Publication number: ES2368039T3
Application number: ES03732052T
Authority: ES
Inventors: Emily Bernstein; Amy Caudy; Gregory J. Hannon; Patrick J. Paddison; Douglas Conklin; Hammond Scott
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Priority date: 2002-01-22
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2011-11-11
Anticipated expiration: 2023-01-22
Also published as: EP1546174A2; EP1546174B1; WO2003062394A2; JP4758067B2; JP2005533484A; EP1546174A4; JP2011135882A; CA2473944A1; US20030084471A1; WO2003062394A3; SI1546174T1; HK1073660A1; DK1546174T3; ATE513911T1; WO2003062394A9

Abstract

Un método para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método introducir en la célula de mamífero in vitro, un vector de expresión que se integra cromosómicamente que comprende una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA se expresa en la célula de mamífero y comprende una región bicatenaria de una longitud de entre 20 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con los cual se atenúa la expresión del gen diana.

Description

Fundamento de la invención

"Interferencia de RNA", "silenciamiento postranscripcional de genes", "acallamiento (quelling)" – estos diferentes nombres describen efectos similares que resultan de la sobre-expresión o falta de expresión de transgenes o de la introducción deliberada de RNA bicatenario en células (revisado por Fire A., (1999) Trends Genet 15: 358-363; Sharp PA., (1999) Genes Dev. 13: 139-141; Hunter C., (1999) Cur. Biol. 9: R440-R442; Baulcombe DC., (1999) Curr. Biol. 9: R599-R601; Vaucheret et al., (1998) Plant J. 16: 1-659). La inyección de RNA bicatenario en el nemátodo Caenorhabditis elegans, por ejemplo, actúa sistemáticamente causando el empobrecimiento postranscripcional del RNA endógeno homólogo (Fire et al., (1998) Nature 391: 806-811; y Montgomery et al., (1998) PNAS 95: 1550215507). La interferencia de RNA usualmente conocida como RNAi, ofrece un modo de inactivar específicamente y potencialmente un gen clonado, y está demostrando ser una potente herramienta para investigar la función de los genes. Aunque el fenómeno es interesante por sí mismo, el mecanismo ha sido bastante misterioso, pero la investigación reciente - por ejemplo el trabajo recientemente descrito por Smardon et al., (2000) Curr. Biol. 10: 169-178 – está empezando a derramar luz sobre la naturaleza y evolución de los procesos biológicos que subyacen en la RNAi.

La RNAi fue descubierta cuando los investigadores intentaron usar el método del RNA antisentido para inactivar un gen de C. elegans y encontraron que la inyección de un RNA de cadena con sentido era realmente tan eficaz como el RNA antisentido en inhibir la función del gen (Guo et al., (1995) Cell 81: 611-620). Posterior investigación reveló que el agente activo era cantidades modestas de RNA bicatenario que contaminan las preparaciones de RNA in vitro. Los investigadores determinaron rápidamente las ’reglas’ y efectos de la RNAi que ha llegado a ser el paradigma para el pensamiento sobre el mecanismo que media este efecto. Se requieren secuencias de exones, mientras que las secuencias de intrones y promotores, aunque ineficaces, no parecen comprometer la RNAi (aunque para esta regla puede haber excepciones específicas de genes). La RNAi actúa sistémicamente pues la inyección en un tejido inhibe la función de los genes en las células de todo el animal. Los resultados de una variedad de experimentos, en C. elegans y otros organismos, indican que la RNAi actúa desestabilizando el RNA celular después del procesamiento del RNA.

La potencia de la RNAi inspiró a Timmons and Fire (1998, Nature 395: 854) a realizar un sencillo experimento que produjo un resultado asombroso. Dichos autores alimentaron a bacterias de nemátodos que habían sido manipuladas por ingeniería genética para expresar RNA bicatenario correspondiente al gen unc-22 de C. elegans. Asombrosamente estos nemátodos desarrollaron un fenotipo similar al de mutantes de unc-22 que era dependiente de su fuente de alimentos. La capacidad de exponer condicionalmente grandes números de nemátodos a RNA bicatenarios específico de genes formó la base de un cribado muy potente para seleccionar mutantes de C. elegans defectuosos para la RNAi y luego identificar los genes correspondientes.

Los RNA bicatenarios (abreviadamente a veces en lo sucesivo dsRNA por la expresión inglesa double-stranded RNA) pueden provocar silenciamiento de genes en numerosos contextos in vivo incluyendo Drosophila, Caenorhabditis elegans, planaria, hydra, tripanosomas, hongos y plantas. Sin embargo, la capacidad para repetir este fenómeno en eucariotas superiores, particularmente células de mamíferos, no ha sido conseguida en la técnica. Tampoco la técnica anterior demostró que se pudiera observar este fenómeno en células eucariotas cultivadas. Adicionalmente, las ''reglas'' establecidas por la técnica anterior han pensado que la RNAi requiere secuencias de exones, y por tanto no se creyó que construcciones que consisten en intrones o promotores fueran reactivos eficaces en mediar la RNAi. La presente invención aborda cada una de estas deficiencias de la técnica anterior y proporciona pruebas tanto de que la RNAi puede ser observada en células eucariotas cultivadas como de que las construcciones de RNAi que consisten en secuencias no exónicas pueden reprimir efectivamente la expresión de genes.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención proporciona un método para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método introducir en la célula de célula de mamífero in vitro, un vector de expresión que se integra cromosómicamente que comprende una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (abreviadamente shRNA por la expresión inglesa short hairpin RNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 20 y 29 bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con lo cual se atenúa la expresión del gen diana.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un vector de expresión que se integra cromosómicamente para uso en un método de atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 19 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana.

La presente invención proporciona además el uso de un vector de expresión que se integra cromosómicamente para la fabricación de un medicamento para uso en terapia, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 19 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con lo cual se atenúa la expresión del gen diana.

En ciertas realizaciones, la célula está en suspensión en cultivo; mientras que en otras realizaciones la célula está en un animal completo, tal como un mamífero no humano.

La célula puede ser manipulada por ingeniería genética con: (i) un gen recombinante que codifica actividad de Dicer,

(ii) un gen recombinante que codifica una actividad de Argonaut, o (iii) ambos. Por ejemplo, el gen recombinante puede codificar, por ejemplo, una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 50 por ciento idéntica a la SEQ ID NO. 2 o 4; o ser definida por una secuencia codificadora que se hibrida en condiciones de lavado de 2 x SSC a 22ºC con la SEQ ID NO. 1 o 3. En ciertas realizaciones, el gen recombinante puede codificar, por ejemplo, una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 50 por ciento idéntica a la secuencia Argonaut mostrada en la Figura 24. En ciertas realizaciones, el gen recombinante puede codificar una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos al menos 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, o 95 por ciento idéntica a la SEQ ID NO. 2 o 4. En ciertas realizaciones, el gen recombinante puede ser definido por una secuencia codificadora que se hibrida en condiciones rigurosas, que incluyen una etapa de lavado seleccionada de 0,2X-2,0X SSC a 50ºC-65ºC, con la SEQ ID NO. 1 o 3.

En lugar de usar una(s) construcción(es) de secuencia(s) de expresión heteróloga(s), se puede activar un gen Dicer

o un gen Argonaut endógenos, por ejemplo, por tecnología de activación de genes, expresión de factores de transcripción activados u otra(s) proteína(s) de transducción de señal, que induce(n) la expresión del gen o por tratamiento con un factor endógeno que sobre-regula el nivel de expresión de la proteína o inhibe la degradación de la proteína.

El gen diana puede ser un gen endógeno de la célula o el gen diana puede ser un gen heterólogo con respecto al genoma de la célula, tal como un gen patógeno, por ejemplo, un gen viral.

La célula puede ser tratada con un agente que inhibe la apoptosis activada por proteína-quinasa activada por RNA (abreviadamente PKR por la expresión inglesa Protein kinase RNA-activated), tal como por tratamiento con agentes que inhiben la expresión de la PKR, causan su destrucción, y/o inhiben la actividad de quinasa de la PKR.

La célula puede ser una célula de primate, tal como una célula humana.

En ciertas realizaciones preferidas, el dsRNA tiene una longitud de al menos 20, 21 o 22 nucleótidos, por ejemplo, correspondiendo en tamaño a los productos de RNA producidos por escisión dependiente de Dicer.

La expresión del gen diana puede ser atenuada en al menos 5 veces, y más preferiblemente al menos 10, 20 o incluso 50 veces, por ejemplo, con respecto a la célula no tratada o tratada con una construcción de dsRNA que no corresponde al gen diana.

De acuerdo con la invención la expresión de un gen diana en células cultivadas, comprende introducir un vector de expresión que tiene una "secuencia codificadora" que, cuando se transcribe, produce RNA bicatenario (dsRNA) en la célula en una cantidad suficiente para atenuar la expresión del gen diana, en donde el dsRNA comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos del gen diana. De acuerdo con la invención el vector incluye una secuencia codificadora que forma una horquilla. Los vectores están integrados cromosómicamente, por ejemplo, para producir una línea celular establemente transfectada. Los vectores preferidos para formar dichas líneas celulares estables se describen en la patente de EE.UU. 6.025.192 y en la publicación PCT WO/9812339.

En consecuencia la presente invención proporciona un RNA bicatenario (dsRNA) para inhibir la expresión de un gen de mamífero. El dsRNA comprende una primera secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas, que incluyen una etapa de lavado de 0,2X SSC a 65ºC, con una secuencia de nucleótidos de al menos un gen de mamífero y una segunda secuencia de nucleótidos que es complementaria con la primera secuencia de nucleótidos.

En una realización la primera secuencia de nucleótidos de dicho RNA bicatenario tiene una longitud de al menos 20, 21, 22, 25 nucleótidos.

De acuerdo con la invención, la primera secuencia de nucleótidos de dicho RNA bicatenario puede ser idéntica a al menos un gen de mamífero. La primera secuencia de nucleótidos de dicho RNA bicatenario se puede hibridar en condiciones rigurosas con al menos un gen humano. La primera secuencia de nucleótidos de dicho RNA bicatenario puede ser idéntica a al menos un gen humano.

El RNA bicatenario tiene forma de horquilla, y puede ser expresado de modo transitorio o estable. De acuerdo con la invención, el RNA bicatenario es una horquilla que comprende una primera secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de al menos un gen de mamífero y una segunda secuencia de nucleótidos que es una repetición invertida complementaria de dicha primera secuencia de nucleótidos y se hibrida con dicha primera secuencia de nucleótidos para formar una estructura de horquilla.

La primera secuencia de nucleótidos de dicho RNA bicatenario se hibrida con la secuencia codificadora de al menos un gen de mamífero. La primera secuencia de nucleótidos de dicho RNA bicatenario se hibrida con una secuencia codificadora de al menos un gen de mamífero. La primera secuencia de nucleótidos de dicho RNA bicatenario puede ser idéntica a una secuencia codificadora de al menos un gen de mamífero.

La presente invención puede ser usada en un método para inhibir la RNAi inhibiendo la expresión o actividad de una enzima de RNAi. Por tanto, el método considerado puede incluir inhibir la actividad de Dicer y/o el RNA de 22 meros.

Incluso otro uso se refiere a un método para alterar la especificidad de una RNAi modificando la secuencia del componente de RNA de la enzima de RNAi.

En otro uso, la expresión de genes en una célula madre no diferenciada, o su progenie diferenciada, es alterada por introducción del dsRNA de la presente invención. Las células madre pueden ser células madre embrionarias. Las células madre embrionarias se obtienen de mamíferos no humanos, preferiblemente de primates no humanos.

Las células madre embrionarias no humanas puede ser aisladas por métodos conocidos por los expertos en la técnica de la masa celular interna (abreviadamente ICM por la expresión inglesa inner cell mass) de los embriones en la fase de blastocisto. En una realización las células madre embrionarias se obtienen de líneas celulares previamente establecidas. En una realización adicional, las células madre embrionarias no humanas se obtienen de novo por métodos estándares.

Las células madre embrionarias no humanas pueden ser el resultado de transferencia nuclear. Los núcleos donado-res se obtienen de cualquier tejido adulto, fetal o embrionario por métodos bien conocidos en la técnica. Los núcleos donadores pueden ser transferidos a un ovocito receptor que ha sido modificado previamente. El ovocito puede ser modificado usando uno o más dsRNA. Modificaciones ilustrativas del ovocito receptor incluyen cambios en la expresión de genes o proteínas que impiden que un embrión procedente de dicho ovocito modificado pueda ser implantado satisfactoriamente en la pared del útero. Puesto que el implante en la pared del útero es esencial para que los embriones de mamíferos fertilizados progresen desde más allá de la fase de blastocisto, los embriones resultantes de dichos ovocitos modificados podrían no dar lugar a organismos viables. Ejemplos no limitativos de tales modificaciones incluyen los que disminuyen o eliminan la expresión de receptores de la superficie celular (es decir, las integrinas) requeridos para el reconocimiento entre el blastocisto y la pared del útero, modificaciones que disminuyen

o eliminan la expresión de proteasas (es decir, colagenasa, estromelisina y activador de plasminógeno) requeridos para digerir la matriz en el revestimiento uterino y permitir por tanto el implante y las modificaciones apropiadas que disminuyen o eliminan la expresión de proteasas (es decir, estripsina) necesarias para que el blastocisto se incube en la zona pelúcida. Dicha incubación es requerida para el implante.

En otra variación, las células madre embrionarias no humanas pueden ser obtenidas de la fertilización de ovocitos modificados, o de sus progenie diferenciada, y pueden ser modificadas o más modificadas con uno o más dsRNA. En una variación preferida, la modificación disminuye o elimina la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (abreviadamente MHC por la expresión inglesa major histocompatibity complex). Las células modificadas de este modo serán toleradas por el receptor, evitando de este modo que surjan complicaciones de rechazo del injerto. Dichas células modificadas son adecuadas para trasplante a un paciente con parentesco o sin parentesco con el donante para tratar un estado caracterizado por daño celular o pérdida de células.

En otra aplicación de la invención, la célula madre no diferenciada es una célula madre adulta. Las células madre adultas ilustrativas incluye, pero sin limitación, células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, células madre cardíacas, células madre pancreáticas y células madre neuronales. Las células madre adultas ilustrativas incluyen cualquier célula madre capaz de formar derivados ectodérmicos, mesodérmicos o endodérmicos diferenciados. Ejemplos no limitativos de tipos de células diferenciadas que proceden de células madre adultas incluyen: células de sangre, musculatura esquelética, miocardio, endocardio, pericardio, hueso, cartílago, tendón, ligamento, tejido conjuntivo, tejido adiposo, hígado, páncreas, piel, tejido neural, pulmón, intestino delgado, intestino grueso, vesícula bilial, recto, ano, vejiga, conducto reproductor de hembra o macho, genitales y los revestimientos de la cavidad corporal.

Una célula madre adulta no diferenciada, o su progenie diferenciada, pueden ser alteradas con uno o más dsRNA para disminuir o eliminar la expresión del MHC. Las células modificadas de este modo serán toleradas por el receptor, evitando así las complicaciones que surgen del rechazo de injertos. Dichas células modificadas son adecuadas para el trasplante a un paciente con parentesco o sin parentesco con el donante para tratar un estado caracterizado por daño celular o pérdida de células.

En otra aplicación de la invención, una célula madre embrionaria no humana, una célula madre adulta no diferenciada, o la progenie no diferenciada de la célula madre embrionaria no humana o adulta, es alterada con uno o más dsRNA para disminuir o eliminar la expresión de los genes requeridos para la infección el VIH. En una aplicación la célula madre es una capaz de dar lugar a células hematopoyéticas. Las células modificadas con potencial hematopoyético pueden ser trasplantadas a un paciente como una terapia preventiva o tratamiento para el VIH o SIDA.

Las preparaciones pueden ser usadas para identificar compuestos, especialmente pequeñas moléculas orgánicas, que inhiben o potencian la actividad de la RNAi. Se pueden usar inhibidores constituidos por moléculas pequeñas, por ejemplo, para inhibir las respuestas al dsRNA en células que para ese fin están siendo deliberadamente transfectadas con un virus que produce RNA bicatenario.

La construcción de dsRNA puede comprender una o más cadenas de ribonucleótido polimerizado. Puede incluir modificaciones en la cadena principal de fosfato-azúcar o el nucleósido. La estructura bicatenaria está formada por una sola cadena de RNA auto-complementario. La formación de dúplex de DNA puede ser iniciada dentro o fuera de la célula. La construcción de dsRNA puede ser introducida en una cantidad que permita el suministro de al menos una copia por célula. Dosis superiores de material bicatenario pueden proporcionar más inhibición eficaz. La inhibición es específica de secuencia porque las secuencias de nucleótidos correspondientes a la región dúplex del RNA son dirigidas para la inhibición genética. En ciertas realizaciones, las construcciones de dsRNA que contienen una secuencia de nucleótidoss idéntica a una porción del gen diana son preferidas para la inhibición. Las secuencias de RNA con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales sencillas respecto a la secuencia diana (es decir, secuencias del RNA similares a la secuencia diana) se han encontrado eficaces para la inhibición. Por tanto, la identidad de secuencias puede ser optimizada por algoritmos de alineamiento conocidos en la técnica y que calculan la diferencia porcentual entre las secuencias de nucleótidos. Alternativamente, la región del dúplex del RNA puede ser definida funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con una porción del transcrito del gen diana. También se pueden usar secuencias con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales sencillas con respecto a la secuencia no codificadora diana.

La presente invención se puede usar para desarrollar mamíferos no humanos transgénicos que incluyen un transgén que codifica una construcción de dsRNA, en donde el dsRNA es idéntico o similar a la secuencia codificadora del gen diana, preferiblemente que esté integrado establemente en el genoma de células en el cual ocurre. Los animales no humanos puede ser obtenidos por microinyección de ovocitos, por ejemplo, en cuyo caso las totalidad de las células nucleadas del animal incluirán el transgén o puede ser obtenidas usando células madre embrionarias (abreviadamente en lo sucesivo ES por la expresión inglesa embryonic stem) que han sido transfectadas con el transgén, en cuyo caso el animal es una quimera y solamente una porción de sus células nucleadas incluirá el transgén. En ciertos casos, la respuesta al dsRNA independiente de la secuencia, por ejemplo, la respuesta de la PKR, es inhibida también en las células que incluyen el transgén.

En incluso otras realizaciones, el dsRNA por si mismo puede ser introducido en una célula madre embrionaria (ES) en cultivo para efectuar el silenciamiento de genes, y el fenotipo será llevado durante al menos varias rondas de división, por ejemplo, en la progenie de esa célula.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: RNAi en células S2. (a) Células S2 de Drosophila fueron transfectadas con un plásmido que dirige la expresión de lacZ desde el promotor de copia en combinación con los dsRNA correspondientes a CD8 humanas o lacZ, o sin dsRNA, como se indica. (b) Células S2 fueron co-transfectadas con un plásmido que dirige la expresión de una proteína de fusión GFP-US9 y los dsRNA de lacZ o ciclina E, como se indica. Los paneles superiores muestran los perfiles de clasificación de células activada por fluorescencia (abreviadamente FACS por la expresión inglesa fluorescence-activated cell sorting) de la población en masa. Los paneles inferiores muestran los perfiles de FACS de células GFP-positivas. (c) El RNA total se extrajo de células transfectadas con dsRNAs de lacZ, ciclina E, fizzy o ciclina A, como se indica. Las transferencias Northern se hibridaron con secuencias no presentes en los dsRNA transfectados.

Figura 2: RNAi in vitro. (a) Transcritos correspondientes a los primeros 600 nucleótidos de ciclina E de Drosophila, (E600) o los primeros 800 nucleótidos de lacZ (Z800) fueron incubados en lisados procedentes de células que habían sido transfectadas con los dsRNAs de lacZ o ciclina E (cycE), como se indica. Los puntos de tiempo fueron 0, 10, 20, 30, 40 y 60 minutos para la ciclina E y 0, 10, 20, 30 y 60 minutos para lacZ. (b) Los transcritos fueron incubados en un extracto de células S2 que habían sido transfectadas con dsRNA de ciclina E (recuadro con sombreado diagonal, debajo). Los transcritos correspondían a los primeros 800 nucleótidos de lacZ o los primeros 600, 300, 220 o 100 nucleótidos de ciclina E, como se indica. Eout es un transcrito derivado de la porción del cDNA de la ciclina E no contenido dentro del dsRNA transfectado. E-ds es idéntico al dsRNA que había sido transfectado en células S2. Los puntos de tiempo fueron 0 y 30 minutos. (c) Transcritos sintéticos complementarios al cDNA completo de ciclina E (Eas) o los 600 nucleótidos finales (Eas600) o 300 nucleótidos finales (Eas300) fueron incubados en extracto durante 0 o 30 minutos.

Figura 3: Requisitos del sustrato de RISC. Los extractos se prepararon a partir de células transfectadas con dsRNA de ciclina E. Se incubaron partes alícuotas durante 30 minutos a 30ºC antes de la adición de sustrato ciclina E (E600) o lacZ (Z800). Se pre-incubaron como se indica partes alícuotas individuales de 20 µl con CaCl2 1mM y EGTA 5 mM; CaCl2 1mM y 60 U de nucleasa de micrococo; CaCl2 1mM y 60 U de nucleasa de micrococo o 10 U de DNasa I (Promega) y EGTA 5mM. Después de 30 minutos de pre-incubación, se añadió EGTA a las muestras a las que faltaba. Se añadió RNA de transferencia (abreviadamente tRNA) de levadura (1 µg) a todas las muestras. Los puntos de tiempos fueron a 0 y 30 minutos.

Figura 4: RISC contiene un RNA guía potencial. (a) Transferencias Northern de RNA de un lisado en bruto o de la fracción S 100 (que contiene la actividad de nucleasa soluble, véase Métodos) se hibridaron con una ribosonda derivada de la cadena con sentido del mRNA de la ciclina E. (b) La actividad de nucleasa específica de ciclina E soluble se fraccionó como se describe en Métodos. Las fracciones de la resina cambiadora de iones se incubaron con lacZ, sustrato de control (panel superior) o el sustrato ciclina E (panel central). El panel inferior, RNA de cada fracción se analizó por transferencia Nothern con un transcrito uniformemente etiquetado derivado de la cadena con sentido del cDNA de la ciclina E. Los oligonucleótidos de DNA se usaron como marcadores de tamaño.

Figura 5: La generación de 22 meros y degradación de mRNA se llevan a cabo por complejos enzimáticos distintos.

(a) Extractos preparados a partir de embriones de Drosophila de 0-12 horas o de células S2 de Drosophila (véase Métodos) se incubaron durante 0, 15, 30 o 60 minutos (de izquierda a derecha) con un RNA bicatenario etiquetado uniformemente correspondiente a los primeros 500 nucleótidos de la región codificadora de la ciclina E de Drosophila. M indica un marcador preparado por transcripción in vitro de un molde sintético. El molde se diseñó para proporcionar un transcrito de 22 nucleótidos. El doblete resultó más probablemente de la iniciación inapropiada en la posición +1. (b) Se prepararon extractos celulares completos de células S2 que habían sido transfectadas con un dsRNA correspondiente a los primeros 500 nucleótidos (abreviadamente nt. en la figura) de la región codificadora de la luciferasa. Los extractos de S10 se centrifugaron a 30.000xg durante 20 minutos, que representa nuestro extracto de RISC estándar. Los extractos de S100 se prepararon por más centrifugación de los extractos de S10 durante 60 minutos a 10.000xg. Los ensayos para la degradación del RNA se llevaron a cabo como se ha descrito previamente durante 0, 30 o 60 minutos (de izquierda a derecha en cada conjunto) con un mRNA monocatenario de luciferasa o un mRNA monocatenario de ciclina E como se indica. (c) Los extractos de S10 o S100 se incubaron con los dsRNA de ciclina E durante 0, 60 o 120 minutos (Izquierda a derecha).

Figura 6: Producción de 22 meros por CG4792/Dicer recombinante. (a) Células S2 de Drosophila fueron transfectados con plásmidos que dirigen la expresión de versiones etiquetadas con el epítopo T7 de Drosha, GC4792/Dicer-1 y Homeless. Las proteínas etiquetadas fueron purificadas a partir de lisados de células por inmunoprecipitación y s fueron incubadas con dsRNA de ciclina E. Para comparación las reacciones se realizaron en embrión de Drosophila y extractos de células S2. Como control negativo se prepararon inmunoprecipitados a partir de células transfectadas con el vector de expresión de β-galactosidasa. Los pares de pistas muestran las reacciones realizadas durante 0 o 60 minutos. El marcador sintético (M) es como se describe en la leyenda de la Figura 1. (b) En la representación diagramática se muestran las estructuras de los dominios CG4792/Dicer-1, Drosha y Homeless. (c) Se prepararon inmunoprecipitados a partir de lisados en detergente de células S2 usando un antisuero producido contra los 8 aminoácidos del extremo C- terminal de Dicer-1 de Drosophila (CG4792). Como controles, se produjeron preparaciones similares con un suero pre-inmunitario y con un suero inmunitario que había sido pre-incubado con un exceso de péptido antigénico. Se muestran las reacciones de escisión en las cuales cada uno de estos precipitados se incubó con un fragmento de ~500 nucleótidos de ciclina E de Drosophila. Para comparación, se sometió a electroforesis en paralelo una incubación del sustrato en extracto de embrión de Drosophila. (d) Los inmunoprecipitados de Dicer se incubaron con sustratos dsRNA en presencia o ausencia de ATP. Para comparación, el mismo sustrato se incubó con extractos de S2 que contenían ATP añadido o estaban empobrecidos en ATP usando glucosa y hexoquinasa (véase Métodos). (e) Células S2 de Drosophila fueron transfectadas con dsRNA marcado con 32P uniformemente correspondiente a los primeros 500 nucleótidos de la proteína fluosecente verde (abreviadamente GFP, por la expresión inglesa green fluorescent protein). El complejo RISC fue purificado por afinidad usando una versión con etiquetada con histidinas de Drosophila Ago-2, un componente recientemente identificado del complejo RISC (Hammond et al., in prep). RISC se aisló en condiciones en las cuales permanece el ribosoma asociado (bajo contenido en sal) o en condiciones que lo extraen del ribosoma en una forma soluble (alto contenido en sal). Para comparación se muestra el espectro de los RNA marcados en el lisado total. (f) Los RNA guía producidos por incubación del dsRNA con un inmunoprecipitado por Dicer se comparan con los RNA guía presentes en un complejo RISC purificado por afinidad. Estos co-emigran precisamente en un gel que tiene una resolución de un solo nucleótido. La pista marcada como control es una selección por afinidad para RISC a partir de una célula que habia sido transfectada con dsRNA marcado, pero no con Drosophila Ago-2 con etiqueta de epítopos.

Figura 7: Dicer participa en la RNAi. (a) Células S2 de Drosophila se transfectaron con dsRNA correspondientes a los dos Dicer de Drosophila (CG4792 y CG6493) o con un dsRNA de control correspondiente a la caspasa 9 de múridos. Los extractos citoplásmicos de estas células se ensayaron respecto a actividad de Dicer. La transfección con dsRNA de Dicer redujo la actividad en los lisados en 7,4 veces. (b) El antisuero de Dicer-1 (CG4792) se usó para preparar inmunoprecipitados de células S2 que habían sido tratadas como se ha descrito antes. El dsRNA de Dicer redujo la actividad de Dicer-1 en este ensayo en 6,2 veces. (c) Las células que habían sido transfectadas dos días previamente con dsRNA de caspasa 9 de ratón o con dsRNA de Dicer fueron co-transfectadas con un plásmido de expresión de GFP y control, dsRNA de luciferasa o dsRNA de GFP. Se cuantificaron por FACS tres experimentos independientes. Se muestra una comparación del porcentaje relativo de células GFP-positivas para poblaciones de control (plásmido de GFP más dsRNA de luciferasa) o silenciadas (plásmido de GFP más dsRNA de GFP) en células que previamente habían sido transfectadas con control (caspasa 9) o dsRNA de Dicer.

Figura 8: Dicer es una nucleasa conservada en el curso de la evolución. (a) Un modelo para la producción de 22 meros por Dicer. Basándonos en el mecanismo de acción propuesto de la ribonucleasa III, los inventores proponemos que Dicer actúa sobre su sustrato con forma de un dímero. El posicionamiento de los dos dominios de ribonucleasa (RIIIa y RIIIb) dentro de la enzima determinaría, por tanto, el tamaño del producto escindido. Se podría pensar en un modelo alternativo igualmente plausible en el cual los dominios RIIIa y RIIIb de cada enzima Dicer escindirían concertados en una sola posición. En este modelo, el tamaño del producto de escisión estaría determinado por la interactuación entre dos enzimas Dicer vecinas. (b) Comparación de las estructuras de los dominios de homólogos de Dicer potenciales en diversos organismos (Drosophila - CG4792, CG6493, C. elegans - K12H4.8, Arabidopsis

- CARPEL FACTORY, T25K16.4, AC012328_1, Helicasa-MOI humana y S. pombe - YC9A_ SCHPO). Los dominios ZAP fueron identificados tanto por análisis de secuencias individuales con Pfam como por búsquedas por el programa informático Psi-blast. El dominio ZAP en Dicer de S. pombe Dicer supuesto no es detectado por PFAM, pero es identificado por Psi-Blast y por tanto es mostrado en un color diferente. Para comparación se muestra una estructura de dominio de la familia RDE1/QDE2/ARGONAUTE. Debe advertirse que los dominios ZAP son más similares dentro de cada una de las familias Dicer y ARGONAUTE que están entre los dos grupos. (c) Se muestra un alineamiento de los dominios ZAP en miembros seleccionados de las familias Dicer y ARGONAUTE. El alineamiento fue producido usando el programa informático ClustalW.

Figura 9: Estrategia de purificación para RISC. (Segunda etapa en el modelo de la RNAi).

Figura 10: Fraccionamiento de la actividad de RISC en columnas de separación por tamaños. La actividad se fracciona como un complejo de 500 KDa. También, un anticuerpo para Argonaute 2 de Drosophila se co-fracciona con actividad.

Figuras 11-13: Fraccionamiento de RISC en columnas monoS, monoQ, de hidroxiapatito. La proteína Argonaute 2 de Drosophila también se co-fracciona.

Figura 14: Alineamiento de Argonaute 2 de Drosophila con otros miembros de la familia.

Figura 15: Confirmación de Argonaute 2 de Drosophila. Las células S2 fueron transfectadas con dsRNA marcado y Argonaute con etiqueta de His. Argonaute se aisló sobre níquel-agarosa y el componente de RNA se identificó en un gel de acrilamida al 15%.

Figura 16: Se analizaron extractos de células S2 y embriones para actividad generadora de 22 meros.

Figura 17: RISC puede ser separado de actividad generadora de 22 meros (Dicer). Extractos de centrifugación (S100) pueden eliminar la actividad de RISC del líquido sobrenadante (panel izquierdo) sin embargo, los centrifugados S100 todavía contienen actividad de Dicer (panel derecho).

Figura 18: Dicer es específica para dsRNA y prefiere sustratos más grandes.

Figura 19: Dicer fue fraccionada en varias columnas.

Figura 20: Identificación de Dicer como enzima que puede procesar dsRNA en 22 meros. Diversos miembros de la familia de RNasaIII fueron expresados con n etiquetas terminales, inmunoprecipitados, y analizados para actividad generadora de 22 meros (panel izquierdo). En el panel derecho, los anticuerpos para Dicer podrían también precipitar actividad generadora de 22 meros.

Figura 21: Dicer requiere ATP.

Figura 22: Dicer produce RNA que son del mismo tamaño que los RNA presentes en RISC.

Figura 23: Una homóloga humana de Dicer cuando se expresa e inmunoprecipita tiene actividad generadora de 22 meros.

Figura 24: Secuencia de Argonaute 2 de Drosophila. Se muestran subrayados los péptidos identificados por microsecuenciación.

Figura 25: Caracterización molecular de Argonaute 2 de Drosophila. La presencia de un intrón en la secuencia codificadora se determinó por transferencia Northern usando una sonda intrónica. Esto da como resultado un marco de lectura en 5’ diferente del de la secuencia genómica publicada. El número de repeticiones de poliglutamina se determinó por PCR genómica.

Figura 26: En células humanas se puede crear actividad de Dicer por expresión del gen Dicer humano. La célula hospedante fue 293. Extractos en bruto tenían actividad de Dicer, mientras que la actividad estaba ausente de las células no transfectadas. La actividad no es distinta de la vista en extractos de embriones de Drosophila.

Figura 27: Un fragmento de 500 nucleótidos del gen que ha de ser silenciado (X) se inserta en el vector modificado como repetición directa estable usando métodos de clonación estándares. El tratamiento con cre-recombinasa comercialmente disponible invierte las secuencias dentro de los sitios Iox P (L) para crear una repetición invertida. Esto se puede mantener y amplificar establemente en una cepa mutante bacteriana sbc (DL759). La transcripción in vivo desde el promotor de elección (P) proporciona un RNA con forma de horquilla que causa silenciamiento. Se incluye un marcador de resistencia a zeocina para asegurar el mantenimiento de las estructuras de repetición directa e inversa; sin embargo, este no es esencial in vivo y podría ser eliminado por pre-empalme de mRNA, si se desea. (Smith et al., (2000) Nature 407: 319-20).

Figura 28: RNAi en células de carcinoma embrionario P19. Placas de 10 cm de células de P 19 fueron transfectadas usando 5 µg del plásmido con GFP y 40 µg del dsRNA indicado (o sin RNA). Las células fueron fotografiadas por microscopía fluorescente (panel superior) y contraste de fases (panel del fondo) 72 horas después de la transfección; el silenciamiento fue también claramente evidente a las 48 horas postransfección.

Figura 29: RNAi de luciferasa de luciérnaga y de Renilla en células P19. (A y B) células P19 fueron transfectadas con plásmidos que dirigen la expresión de luciferasa de luciérnaga y Renilla y 500 meros de dsRNA (25 o 250 ng, como se indica en A y B, respectivamente), que fueron homólogos al mRNA de luciferasa de luciérnaga (ds-FF) (FF corresponde al término inglés para luciérnaga, firefly) o no homólogos (dsGFP). Las actividades de luciferasa se analizaron en diversos momentos después de la transfección, como se indica. Las relaciones de actividad de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla se normalizan para los controles de dsGFP. (C y D) células P19 en placas de cultivo de 12 pocillos (2 mL de medios) se transfectaron con 0,25 µg de una mezcla 9:1 pGL-3-control y pRLSV40, así como 2 µg del RNA indicado. Los extractos se prepararon 9 horas después de la transfección. (C) Se muestra la relación de luciferasa de Renilla a luciferasa de luciérnaga. (D) Se muestra la relación de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla. Los valores están normalizados a dsGFP. Se muestra la media de tres experimentos independientes. Las barras de error indican la desviación típica.

Figura 30: Los paneles de la derecha muestran la expresión de proteína fluorescente roja (abreviadamente RFP por la expresión inglesa red fluorescent protein) o GFP que sigue a la transfección transitoria en células de P19 de tipo natural. Los paneles de la izquierda demuestran la supresión específica de la expresión de GFP en clones de P19 que expresan establemente una horquilla de GFP bicatenario de 500 nucleótidos. Los clones de P19 que expresan establemente la horquilla de GFP bicatenario fueron transfectados transitoriamente con RFP o GFP y se determinó por inspección visual la expresión de RFP o GFP.

Figura 31: Silenciamiento específico de la expresión de luciferasa por dsRNA en células madre embrionarias de múridos. Células madre embrionarias de ratón en placas de cultivo de 12 pocillos (1 mL de medios) fueron transfectadas con 1,5 µg de dsRNA junto con 0,25 µg de una mezcla 10:1 de los plásmidos informadores pL3-Control y pRLSV40. Se prepararon extractos y se analizaron 20 horas después de la transfección. La relación de expresión de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla se muestra para FF ds500 (FF abreviatura de luciérnaga en inglés firefly); la relación de expresión de luciferasa de Renilla a luciferasa de luciérnaga se muestra para Ren ds500. Ambas están normalizadas a las relaciones desde la transfección de dsGFP. Se muestra la media de tres experimentos independientes. Las barras de error indican la desviación típica.

Figura 32: RNAi en células de mioblasto de múridos C2C12. (A) Células de ratón C2C12 en placas de cultivo de 12 pocillos (1 mL de medios) fueron transfectadas con 1 µg del dsRNA indicado junto con 0,250 µg de los plásmidos informadores pL3-Control y pRL-SV40. Se prepararon extractos y se analizaron 24 horas después de la transfección. Se muestra la relación de expresión de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla: los valores están normalizados a las relaciones de control sin dsRNA. Se muestra la media de tres experimentos independientes; las barras de error indican la desviación típica. (B) Células C2C12 co-transfectadas con 1 µg de un plásmido solo o un plásmido que contiene un mutante hiperactivo del virus vaccinia K3L (Kawagishi-Kobayashi et al., Virology 276:424-434). Se muestran las cuentas absolutas de actividad de luciferasa de Renilla y de luciérnaga. (C) Las relaciones de actividad de luciferasa de luciérnaga/Renilla de B, normalizadas a los controles sin dsRNA.

Figura 33: Líneas celulares HeLa, de ovario de hásmster chino y P19 (pluripotentes de carcinoma embrionario de ratón) transfectadas con plásmidos que expresan luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) y pensamiento de mar (Renilla reniformis) y con 500 meros de dsRNA (400 ng), homólogo a mRNA (dsLUC) de luciferasa de luciérnaga o no homólogo (dsGFP). Se efectuaron análisis de luciferasa duales usando un luminómetro modelo 3010 de Analytical Scientific Instrument. En este análisis la luciferasa de Renilla sirve como un control interno para la supresión específica de dsRNA de la actividad de luciferasa de luciérnaga. Estos datos demuestran que el dsRNA de 500 meros puede suprimir específicamente la expresión in vivo de genes similares.

Figura 34: La expresión de un RNA con forma de horquilla produce líneas celulares EC P19 que silencian establemente el gen GFP. (A) Una representación del casete FLIP usado para construir la horquilla de GFP. GFP representa los primeros 500 pares de bases codificadores de proteína fluorescente verde potenciada (abreviadamente EGFP de enhanced GFP), Zeo, gen de resistencia a zeocina; L, Lox; P, el promotor de citomegalovirus en el plásmido de expresión pcDNA3. Se clonan primeramente fragmentos de GFP homólogos como repeticiones directas en el casete FLIP. Para crear repeticiones invertidas para la producción de horquillas la segunda repetición es volteada usando Cre-recombinasa. Cuando se transcribe la repetición invertida forma un dsRNA de GFP con un bucle de horquilla.

(B): Las líneas celulares P19 que expresan establemente el plásmido con forma de horquilla de GFP, GFPhp.1 (clon 10) y GFPhp.2 (clon 12), junto con wtP19 fueron transfectadas con 0,25 µg cada una de genes informadores de GFP y RFP. Se tomaron microfotografías de fluorescencia usando filtros apropiados para GFP y RFP. El aumento es 200.

(C): Células P19 GFPhp.1 fueron transfectadas con pEGFP y 0, 0,5 o 1 µg de Dicer o dsRNA de luciérnaga. Las

microfotografías de fluorescencia fueron tomadas a las 48 horas de la transfección y se superponen con imágenes de campo brillante para revelar las células que no expresan GFP. El aumento es 100. Procesamiento in vivo e in vitro de dsRNA en células P19. Los análisis de Dicer se realizaron en células S2 y tres extractos de P19 preparados independientemente usando dsRNA marcado con 32P (30ºC durante 30 minutos). Una transferencia Northern de RNA extraído de control y células GFPhp.1 P19 muestra la producción de especies de RNA de ~22 meros en células que expresan horquilla pero no en las células de control. Las transferencias fueron sondadas con transcrito de GFP con “sentido” marcado con 32P.

Figura 35: El dsRNA induce silenciamiento en el nivel postranscripcional. Extractos de células P19 se usaron para traducción in vivo de mRNA de luciferasa de luciérnaga y Renilla (100 ng de cada una) Las reacciones de traducción fueron programadas con diversas cantidades de 500 meros de dsRNA, homólogo al mRNA de luciferasa de luciérnaga (dsLUC) o no homólogo (dsGFP). El análisis con luciferasa se llevó a cabo después de 1 hora de incubación a 30ºC. Las relaciones de actividad de luciferasa de luciérnaga/Renilla están normalizadas a controles sin dsRNA. Se muestran las desviaciones típicas de la media.

Figura 36: Se usaron fracciones S10 de lisados de células P19 para traducciones in vitro de mRNA que codifica luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) y pensamiento de mar (Renilla reniformis). Las reacciones de traducción fueron programadas con 500 meros de dsRNA, RNA monocatenario (ssRNA) o RNA antisentido (asRNA), complementario al mRNA de luciferasa de luciérnaga (dsREN, ssREN o asREN) o no complementario (dsGFP). Las reacciones se llevaron a cabo a 30ºC durante 1 hora, después de 30 minutos de incubación con dsRNA, ssRNA o asR-NA. Se efectuaron análisis de luciferasa duales usando un luminómetro modelo 3010 de Analytical Scientific Instrument. En la parte izquierda de la figura la luciferasa de Renilla sirve como un control interno para supresión específica de dsRNA de actividad de luciferasa de luciérnaga. En la parte derecha, la luciferasa de luciérnaga sirve como un control interno para supresión específica de dsRNA de actividad de luciferasa de Renilla. Estos datos demuestran que el RNA bicatenario (dsRNA) de 500 meros, pero no el RNA monocatenario (ssRNA) o el RNA anti-sentido (asR-NA) suprime la expresión de genes similares in vitro de un modo concordante con el silenciamiento transcripcional de genes.

Figura 37: Células P19 se hicieron crecer en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos hasta aproximadamente 60% de confluencia. Se añadieron a cada pocillo cantidades variables de dsRNA homólogo para el mRNA (dsLUC) de luciferasa de luciérnaga o no homólogo (dsGFP), y se incubaron durante 12 horas en condiciones normales de cultivo de tejido. Las células fueron transfectadas luego con plásmidos que expresan luciferasas de luciérnaga (Photinus pyralis) y pensamiento de mar (Renilla reniformis) y con 500 meros de dsRNA (500 ng). Se efectuaron análisis de luciferasa duales durante 12 horas después de la traducción usando un luminómetro modelo 3010 de Analytical Scientific Instrument. En este análisis la luciferasa de Renilla sirve como control interno para la supresión específica del dsRNA de la actividad de luciferasa de luciérnaga. Estos datos muestran que el dsRNA de 500 meros puede suprimir específicamente la expresión de genes similares in vivo sin transfección en condiciones normales de de cultivo de tejidos.

Figura 38: Los métodos previos para generar los siRNA requerían costosas síntesis. La invención proporciona un método in vitro para sintetizar siRNAs usando reacciones estándares de transcripción de RNA.

Figura 39: Las horquillas cortas suprimen la expresión de genes en células S2 de Drosophila. (A) Secuencias y estructuras secundarias predichas de RNA representativos sintetizados químicamente. Las secuencias corresponden a las posiciones 112-134 (siRNA) y 463-491 (shRNAs) de luciferasa llevadas en pGL3-Control. Un siRNA dirigido a la posición 463-485 de la secuencia de luciferasa era virtualmente idéntico al 112-134 (siRNA = RNA de interferencia corto) en suprimir la expresión, pero no se muestra. (B) Las horquillas cortas suministradas exógenamente suprimen la expresión del gen diana de luciferasa de luciérnaga in vivo. Placas de seis pocillos de células S2 fueron transfectadas con 250 ng/pocillo de plásmidos que dirigen la expresión de luciferasa de luciérnaga y de Renilla y 500 ng/pocillo del RNA indicado. Las actividades de luciferasa se analizaron 48 horas después de la transfección. Las relaciones de actividad de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla fueron normalizadas para un control transfectado con un siRNA dirigido a la proteína fluorescente verde (GFP). Se muestra la media de tres experimentos independientes; las barras de error indican la desviación típica. (C) Las horquillas cortas son procesadas por la enzima Dicer de Drosophila. Las horquillas transcritas por T7 shFfL22, shFfL29 y shFfS29 fueron incubadas con (+) y sin (-) extractos embrionarios de Drosophila y 0-2-horas. Los incubados con extractos produjeron siRNA de ~22 nucleótidos, concordantes con la capacidad de estas horquillas de inducir interferencia de RNA. Como control se usó un aporte de dsRNA grande (500 meros de ciclina E). Las reacciones de escisión se realizaron como se describe en Bernstein et al., 2001, Nature, 409:363-366.

Figura 40: Función de las horquillas cortas en células de mamíferos. Células HEK 293T, HeLa, COS-1 y NIH 3T3 fueron transfectadas con plásmidos y RNA como en la Figura 1 y se sometieron a análisis dual de luciferasa 48 horas pos-transfección. Las relaciones de actividad de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla fueron normalizadas para un control transfectado con un siRNA dirigido a la proteína fluorescente verde (GFP). Se muestra la media de tres experimentos independientes; las barras de error indican la desviación típica.

Figura 41: Los siRNA y horquillas cortas transcritas in vitro suprimen la expresión de genes en células de mamíferos.

(A) Secuencias y estructuras secundarias predichas de siRNA representativos transcritos in vitro. Las secuencias corresponden a las posiciones 112-134 (siRNA) y 463-491 (shRNA =RNA con forma horquillas cortas) de luciferasa de luciérnaga llevadas en pGL3-Control. (B) Los siRNA transcritos in vitro suprimen la expresión in vivo del gen de luciferasa de luciérnaga diana. Las células HEK 293T fueron transfectadas con plásmidos como en la Figura 2. La presencia de residuos de guanosina con bases no apareadas en el extremo 5' de los siRNA altera significativamente estructura del extremo predicha y suprime la actividad de los siRNA. (C) Secuencias y estructuras secundarias predichas de los shRNA representativos transcritos in vitro. Las secuencias corresponden a las posiciones 112-141 de luciferasa de luciérnaga llevada en pGL3-Control. (D) Las horquillas cortas transcritas in vitro suprimen la expresión in vivo del gen de la luciferasa de luciérnaga diana. Las células HEK 293T fueron transfectadas con plásmidos como en la Figura 2.

Figura 42: Transcripción de shRNA funcionales in vivo. (A) Vista esquemática del vector pShhl. Se sintetizan secuencias que codifican shRNA con entre 19 y 29 bases de homología con el gen diana como oligonucleótidos de DNA bicatenario de 60-75 pb y se ligan en un sitio EcoRV inmediatamente hacia el extremo 3' del promotor U6. (B) Secuencia y estructura predicha de la horquilla Ff1. (C) Un shRNA expresado del vector pShh1 suprime la expresión de luciferasa en células de mamíferos. Las células HEK 293T, HeLa, COS-1 y NIH 3T3 fueron transfectadas con plásmidos informadores como en la Figura 1 y el vector pShh1, siRNA de luciérnaga o construcciones de pShh1 de luciérnaga como se indica. Las relaciones de actividad de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla se determinaron 48 horas después de la transfección y representan la media de tres experimentos independientes; las barras de error indican la desviación típica.

Figura 43: Se requiere Dicer para silenciamiento de genes mediado por shRNA. Células HEK 293T fueron transfectadas con plásmidos informadores de luciferasa, así como pShh1-Ff1 y un siRNA que se dirige a Dicer humana sola

o en combinación, como se indica. La secuencia de siRNA de Dicer (TCA ACC AGC CAC TGC TGG A) corresponde a las coordenadas 3137-3155 de la secuencia de Dicer humana. Las relaciones de actividad de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla se determinaron 26 horas después de la transfección y representan la media de tres experimentos independientes; las barras de error indican la desviación típica.

Figura 44: Silenciamiento de genes mediado por shRNA estable de un gen endógeno. (A) Secuencia y estructura predicha de la horquilla p53. El tallo del extremo 5' de shRNA contiene una secuencia de 27 nucleótidos procedente de p53 de ratón (nucleótidos 166-192), mientras que el tallo del extremo 3' aloja la secuencia complementaria antisentido. (B) Evitación de la senescencia en fibroblastos de embriones de ratón primarios (abreviadamente MEF, por la expresión inglesa mouse embryo fibroblasts) que expresan un shRNA dirigido a p53. MEF de tipo natural, de 5 pases, fueron transfectados con pBabe-RasV12 con plásmido de control o con p53hp (5 µg cada uno FuGENE; Roche). Dos días después de la transfección las células fueron tripsinizadas, contadas y cultivadas en placas a una densidad de 1 x 105/placa de 10 cm en medios que contenían 2,0 µg/mL de puromicina. Las células de control cesan en la proliferación y muestran una morfología senescente (panel izquierdo). Las células que expresan la horquilla p53 continúan creciendo (panel derecho). Las fotografías fueron tomadas 14 días después de la transfección.

Figura 45: Una mezcla de dos horquillas cortas, ambas correspondientes a luciferasa de luciérnaga no da como resultado una supresión sinérgica de la expresión de los genes. Se examinó la supresión de los genes de luciferasa de luciérnaga resultante de la transfección de una mezcla de las dos diferentes horquillas cortas (HP Nº 1 y HP Nº 2). La mezcla de HP Nº 1 y HP Nº 2 no tuvo un efecto más robusto sobre la supresión de la expresión del gen de la luciferasa de luciérnaga que la expresión de HP Nº 1 sola.

Figura 46: Las horquillas cortas codificadas suprimen específicamente la expresión de genes in vivo. Oligonucleótidos de DNA que codifican horquillas de 29 nucleótidos correspondientes a la luciferasa de luciérnaga se insertaron en un vector que contenía el promotor U6. Se examinaron tres construcciones independientes en cuanto a su capacidad de suprimir específicamente la expresión del gen de la luciferasa de luciérnaga en células 293T. siOligo1-2, siOligo1-6 y siOligo 1-19 (construidos en la orientación correcta) cada uno suprimió la expresión de genes tan eficaz mente como siRNA. En contraste siOligo1-10 (construido en la orientación incorrecta) no suprimió la expresión de genes. Una construcción independiente seleccionada como diana para una porción diferente del gen de la luciferasa de luciérnaga no suprimió eficazmente la expresión de genes en cualquier orientación (siOligo2-23, siOligo2-36).

Figura 47-49: Estrategias para la expresión estable de dsRNA cortos.

Figura 50: Se realizaron análisis de luciferasa duales como se describe en detalle en las figuras 28-35, sin embargo las células usadas en estos experimentos fueron PKR-/-fibroblastos embrionarios de múridos (MEF). Resumidamente, la RNAi que usa dsRNA largos desencadena una respuesta no específica en los MEF (debido a la actividad de PKR). Para evaluar el efecto de las construcciones de dsRNA largos para inhibir específicamente la expresión de genes en los MEF, se examinó la RNAi en PKR-/-MEF. Dichas células no responden a los dsRNA con una respuesta no específica. Los datos resumidos en esta Figura demuestran que en ausencia de respuesta de PKR no específica, las construcciones de dsRNA largos suprimen específicamente la expresión de genes en los MEF.

Figura 51: Es una representación esquemática del promotor de tirosinasa de ratón. Se usaron cebadores para amplificar tres regiones separadas en el promotor próximo o para amplificar la secuencia correspondiente a un potenciador localizado aproximadamente 12 kb en dirección al extremo 5'.

Figura 52: Secuencias de plásmidos de expresión informadores y de siRNA usadas en las Figuras X e Y. PGL-3Control y Pluc-NS5B son los plásmidos de expresión usados para la transfección en hígado de ratón. La secuencia de nucleótidos de los siRNA usados en el estudio se muestran subrayadas.

Figura 53: Interferencia de RNA en ratones adultos usando siRNA. (a) Imágenes representativas de luz emitida de ratones co-transfectados con el plásmido de luciferasa pGL-control y sin siRNA, siRNA de luciferasa o siRNA no relacionado. Una imagen en seudocolor que representa la intensidad de la luz emitida (roja, más intensa; azul, menos intensa) superpuesta en una imagen de referencia en una escala de grises (para orientación) muestra que el RNAi funciona en ratones adultos. Los siRNA de 21 nucleótidos reasociados (40 µg; Dharmacon) fueron coinyectados en los hígados de ratones con 2 µg de DNA de pGL-control (Promega) y 800 unidades de RNasina (Promega) en 1,8 mL de tampón de PBS en 5 -7 s. Después de 72 horas, los ratones fueron anestesiados y se les administraron 3 mg de luciferina intraperitonealmente 15 minutos antes de la toma de imágenes, (b) Resultados de siRNA (seis ratones por grupo) a partir de un experimento representativo. Los ratones que recibieron siRNA de luciferasa emitieron significativamente menos luz que los controles con solo plásmidos informadores (ensayo ANOVA de una vía con ensayo de Fisher post hoc). Los resultados para el plásmido informador solo y siRNA no relacionado fueron estadísticamente similares. Los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices de The US National Institutes of Health de EE.UU. para el cuidado de animales y las directrices de la Universidad de Stanford.

Figura 54: Interferencia de DNA en ratones adultos usando los shRNA. (a) Imágenes representativas de luz emitida de ratones co-transfectados con el plásmido de luciferasa control, pShh1-Ff1 y pShh1-Ff1rev. pShh-F1f, pero no pShh1-Ff1rev redujeron la expresión de luciferasa en ratones con relación al control informador solo. pShh1-Ff1 o pShh1-Ff1rev (10 µg) fueron co-inyectados con 2 µg de pGL-control en 1,8 ml de tampón de PBS. (b) Valor medio de tres experimentos con shRNA (n = 5). Los valores medios para el grupo solo con el plásmido informador se denominan como 100% en cada uno de los tres experimentos. Los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices de The US National Institutes of Health para el cuidado de animales y las directrices de la Universidad de Stanford.

Figura 55: Represión heredable de la expresión de Neill por RNAi en diversos tejidos. (a) La expresión de mRNA de Neill en los hígados de tres ratones que contenían el transgén Neill shRNA (shRNA positivo) o tres hermanos que carecían del transgén (shRNA-negativo) fue analizado por RT-PCR (la fila superior es Neill). Se realizó una RT-PCR de β-actina para asegurar que cantidades iguales de mRNA fueron ensayadas en cada ratón (segunda fila). Similarmente se ensayó la expresión del gen de resistencia a neomicina (neo), llevada a cabo en el vector de shRNA (tercera fila). Finalmente, los ratones fueron genotipados usando DNA genómico que fue amplificado por PCR con cebadores específicos del vector (fila del fondo). (b) Estudios similares fueron realizados en el corazón. (c) Estudios similares fueron realizados en el bazo. Los métodos que emplean animales han sido aprobados por el comité SUNY, Stony Brook Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Figura 56: La reducción en la proteína Neill está correlacionada con la presencia de los siRNA. (a) Se examinó la expresión de la proteína Neil 1 en extractos proteínicos de hígados de ratones que llevan el transgén de shRNA (shRNA-positivo) o hermanos que carecen del transgén (shRNA-negativo) por transferencia Western con antisuero específico de Neill. Se usó una transferencia Western para PCNA para normalizar la carga. (b) La presencia de los siRNA en RNA procedía de los hígados de ratones transgénicos como se analizó por transferencia Northern usando una sonda de 300 nucleótidos, parte de la cual era complementaria a la secuencia del shRNA. Advertimos la presencia de los siRNA solamente en ratones transgénicos para el casete de expresión de shRNA.

Descripción detallada de ciertas realizaciones preferidas

Se ha de apreciar que algunos aspectos de las siguientes realizaciones se facilitan para referencia de los fundamentos y no forman parte de la invención.

I. Visión general

La presente invención proporciona métodos para atenuar la expresión de genes en una célula que usa RNA bicatenario (dsRNA) dirigido a un gen. El dsRNA contiene una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones fisiológicas de la célula con la secuencia de nucleótidos de al menos una porción del gen que ha de ser inhibido (el gen "diana"). La secuencia de nucleótidos se hibrida con la secuencia codificadora del gen diana.

Un aspecto significativo para ciertas realizaciones de la presente invención se refiere a la demonstración en la presente solicitud de que la RNAi se puede conseguir de hecho tanto en células de mamíferos cultivadas como en organismos vivos. Esto no ha sido descrito previamente en la técnica.

Otro aspecto sobresaliente de la presente invención se refiere a la capacidad de producir RNAi en eucariotas superiores, particularmente en células no ovocíticas de mamíferos, por ejemplo, células de mamíferos adultos.

Como se describe con más detalle más adelantes, los diversos aspectos de la presente invención se basan en el descubrimiento de que el fenómeno de la RNAi está mediado por un conjunto de actividades enzimáticas, incluyendo un componente esencial de RNA, que se han conservado en el curso de la evolución en eucariotas desde plantas hasta mamíferos.

Una enzima contiene un componente esencial de RNA. Después de purificación parcial, una nucleasa multicomponente (denominada en la presente memoria "nucleasa RISC ") se co-fracciona con una especie de RNA de 22 nucleótidos, diferenciada, que puede conferir especificidad a la nucleasa a través de homología los mRNA sustratos. Las moléculas de RNA cortas son generadas por una reacción de procesamiento a partir de un dsRNA de entrada. Sin vincularse a una teoría particular, se cree que estos RNA guías de 22 meros pueden servir como secuencias de guía que ordenan a la nucleasa RISC destruir mRNA específicos correspondientes a las secuencias del dsRNA.

Como se ha ilustrado con ejemplos las formas bicatenarias del RNA guía de 22 meros pueden tener suficiente longitud para inducir la inhibición, del dsRNA dependiente de la secuencia, de la expresión de genes. En el ejemplo ilustrado las construcciones de dsRNA se administran a las células que tienen un gen recombinante informador de luciferasa. En la célula de control, por ejemplo, sin RNA añadido exógenamente, el nivel de expresión del informador de luciferasa está normalizado al valor de "1". Como se ilustra, tanto las construcciones de dsRNA largas (500 meros) como las cortas (22 meros) complementarias al gen de la luciferasa podían inhibir la expresión de ese producto génico con respecto a la célula de control. Por otro lado, los dsRNA de tamaño similar complementarios a la secuencia codificadora para otra proteína, la proteína fluorescente verde (GFP), no efectuaron significativamente la expresión de luciferasa, lo que indica que los fenómenos inhibidores eran en cada caso dependientes de las secuencias. Análogamente, los 22 meros monocatenarios de luciferasa no inhibieron la expresión de ese gen, lo que indica que los fenómenos inhibidores son dependientes de las formas bicatenarias.

Los ejemplos anexos también identifican una enzima, Dicer, que puede producir los supuestos RNA guías. Dicer es un miembro de la familia de la RNAsa III de nucleasas que escinden específicamente los dsRNA y se ha conservado en el curso de la evolución en gusanos, moscas, plantas, hongos y, como se describe en la presente memoria, en mamíferos. La enzima tiene una estructura diferenciada que incluye un dominio de helicasa y restos duales de RNAsa III. Dicer también contiene una región de homología para la familia RDEI/QDE2/ARGONAUTE, cuyos miembros han sido genéticamente vinculados a la RNAi en eucariotas inferiores. Realmente, la activación de Dicer, o su sobre-expresión, puede ser suficiente en muchos casos para permitir la interferencia de RNA en células de otro modo no receptivas, tales como células eucariotas cultivadas o células (no ovocíticas) de mamíferos o en organismos cultivados.

En ciertas realizaciones las células pueden ser tratadas con uno o más agentes inhibe(n) la(s) respuesta(s) general(es) al RNA por las células hospedantes, de tal modo que pueden dar lugar a una apoptosis independiente de secuencia. Por ejemplo, las células pueden ser tratadas con agentes que inhiben la proteína-quinasa dependiente de dsRNA conocida abreviadamente PKR (RNA activado por proteína-quinasa). Los RNA bicatenarios en células de

mamíferos activan típicamente la proteína-quinasa PKR y conducen a la apoptosis. El mecanismo de acción de PKR

15: 358). También se ha descrito quelainduc-Trends Genet (Fire (1999)
ן incluye fosforilación y activación de eIF2

ción de NF-κB por PKR está implicada en la responsabilidad de la apoptosis y este proceso está mediado a través de una forma de respuesta inmunitaria primitiva, puesto que la presencia de dsRNA es un aspecto común de muchos ciclos de vidas virales.

Como se describe en la presente memoria, los Solicitantes han demostrado que la respuesta de la PKR puede ser superada en favor de la respuesta de la RNAi específica de secuencia. Sin embargo, en ciertos casos, puede ser deseable tratar las células con agentes que inhiben que la expresión de la PKR, causan su destrucción, y/o inhiben

la actividad de quinasa de la PKR, y dichos métodos están específicamente contemplados para uso en la presente

. Otros
ן invención. Análogamente puede usarse la sobre-expresión de agentes que activan ectópicamente eIF2

agentes que se pueden usar para suprimir la respuesta de la PKR incluyen inhibidores de fosforilación por IKK de I κB, inhibidores de ubiquitinación por IκB, inhibidores de degradación de lκB, inhibidores de translocación nuclear de NF-κB e inhibidores de interactuación de NF-κB con elementos de respuesta a κB.

Otros inhibidores de la respuesta al dsRNA independiente de secuencia en células incluyen el producto génico del virus vaccinia E3L. El producto del gen E3L contiene dos dominios distintos. Se ha mostrado que un dominio carboxi terminal conservado se une a un RNA bicatenario (dsRNA) e inhibe la respuesta al dsRNA antiviral por células. La expresión de al menos esa porción del gen E3L en la célula hospedante o el uso de polipéptido o sus péptidomiméticos, puede ser usado para suprimir la respuesta general al dsRNA. Los inhibidores de caspasa sensibilizan a las células para destruir RNA bicatenario. Por consiguiente, la expresión ectópica o la activación de caspasas en la célula hospedante se puede usar para suprimir la respuesta general al dsRNA.

En otras realizaciones, el método objeto se lleva a cabo en células que tienen poca o ninguna respuesta general al RNA bicatenario, por ejemplo, tienen respuesta al dsRNA no dependiente de la PKR, al menos en las condiciones de cultivo. Como se ilustra en las Figuras 28-32, las células CHO (células de ovario de hámster chino) y P19 se pueden usar sin tener que inhibir las respuestas de la PKR u otras respuestas generales al dsRNA.

Por tanto, la presente invención proporciona un proceso y composiciones para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero. En ciertas realizaciones, el proceso comprende la introducción de RNA (la "construcción de dsRNA") con carácter bicatenario doble o parcial en la célula o el ambiente extracelular. La inhibición es específica porque una secuencia de nucleótidos de una porción del gen diana es elegida para producir la construcción del dsRNA. El dsRNA puede ser idéntico o similar a la secuencia codificadora del gen diana. En una aplicación preferida el método utiliza una célula en la cual las actividades de Dicer y/o Argonaute se expresan recombinantemente o de otro modo se activan ectópicamente. Este proceso puede ser eficaz: (1) en atenuar la de expresión genes, (2) específico para el gen diana, y (3) general en permitir la inhibición de muchos tipos diferentes de gen diana.

II. Definiciones

Por conveniencia se recogen a continuación ciertos términos empleados en la parte descriptiva de la memoria, los ejemplos y las reivindicaciones anexas.

Tal como se usa en la presente memoria el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido enlazado. El vector es un vector genómico integrado o "vector integrado", que puede llegar a quedar integrado en el cromosoma de la célula hospedante. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente enlazados se denominan en la presente memoria "vectores de expresión". En la presente memoria "plásmido" y "vector" se usan intercambiablemente a no ser que de otro modo quede claro en el contexto.

Tal como se usa en la presente memoria el término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (DNA), y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (RNA). El término debe ser entendido que incluye, cuando sea aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos monocatenarios (tales como con sentido o antisentido) y bicatenarios.

Tal como se usa en la presente memoria el término "gen" o "gen recombinante" se refiere a un ácido nucleico que se refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que comprende que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo tanto secuencias de exones como de (opcionalmente) intrones. El ácido nucleico también puede incluir opcionalmente secuencias no codificadoras, tales como secuencias de promotores o potenciadores. Un "gen recombinante" se refiere a ácido nucleico que codifica dichos polipéptidos reguladores, que pueden incluir opcionalmente secuencias de intrones que proceden del DNA cromosómico. El término "intrón" se refiere a una secuencia de DNA presente en un gen que no se traduce a proteína y que generalmente se encuentra entre exones.

Una "secuencia codificadora de proteína" o una secuencia que "codifica" un polipéptido o péptido particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del DNA) y se traduce (en el caso del mRNA) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora están determinados por un codón de iniciación en el extremo 5’ (amino) y un codón de parada en el extremo 3’ (carboxi). Una secuencia codificadora puede incluir pero, sin limitación, cDNA de mRNA procariótico o eucariótico, secuencias de DNA genómico de DNA procariótico o eucariótico, e incluso secuencias de DNA sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción estará usualmente localizada en 3’ respecto a la secuencia codificadora.

Análogamente, "codifica", a menos que sea evidente de su contexto, significará incluir secuencias de DNA que codifican un polipéptido, como se usa típicamente el término, así como secuencias de DNA que se transcriben en moléculas antisentido inhibidoras.

El término "pérdida de función", cuando se refiere a genes inhibidos por el método de RNAi objeto se refiere a una disminución en el nivel de expresión de un(os) gen(es) en presencia de una o más construcción(es) de dsRNA cuando se compara con el nivel en ausencia de dicha(s) construcción(es) de dsRNA.

El término "expresión" con respecto a una secuencia de gen se refiere a la transcripción del gen, cuando sea apropiado, a la traducción del mRNA transcrito a una proteína. Por tanto, como será claro del contexto, la expresión de una secuencia codificadora de proteína resulta de la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora.

"Células", "células hospedantes" o "células hospedantes recombinantes" son términos que se usan intercambiable-mente en la presente memoria. Se entiende que dichos términos se refieren no solamente a la célula objeto particular, sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. A causa de ciertas modificaciones puede ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, que tal progenie, de hecho, no pueda ser idéntica a la de la célula precursora, pero todavía están incluidas dentro del alcance del término, tal como se usa en la presente memoria.

El término "células cultivadas" se refiere a células suspendidas en cultivo, por ejemplo, dispersadas en cultivo o en la forma tejido. Sin embargo, no debe incluir ovocitos o embriones enteros (incluyendo blastocistos y similares) que pueden estar dispuestos en el cultivo. En ciertas realizaciones, las células cultivadas son células adultas, por ejemplo, no embrionarias.

Por "virus recombinante" se quiere decir un virus que ha sido alterado genéticamente, por ejemplo, por la adición o inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo en la partícula.

Tal como se usa en la presente memoria los términos "transducción " y "transfección " está reconocidos en la técnica y significan la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, en una célula receptora por transferencia de genes mediada por ácido nucleico. "Transformación”. Tal como se usa en la presente memoria se refiere a un proceso en el cual un genotipo de células es cambiado como resultado de la absorción DNA o RNA exógenos, y, por ejemplo, la célula transformada expresa una construcción de dsRNA.

"Transfección transitoria" (con fines de fundamento) se refiere a los casos en los que el DNA exógeno no se integra en el genoma de una célula transfectada, por ejemplo, cuando el DNA episomal se transcribe en mRNA y se traduce a proteína.

Una célula ha sido "transfectada establemente" con una construcción de ácido nucleico cuando la construcción de ácido nucleico es capaz de ser heredada por las células hijas.

Tal como se usa en la presente memoria una "construcción de gen informador" es un ácido nucleico que incluye un "gen informado" enlazado operativamente a al menos una secuencia reguladora transcripcional. La transcripción de un gen informador es controlada por estas secuencias a las que está enlazado. La actividad de al menos una o más de estas secuencias de control puede estar regulada directamente o indirectamente por la proteína receptora diana. Las secuencias de control transcripcional ilustrativas son las secuencias de promotores. Un gen informador quiere decir incluir una construcción promotor-informador que se expresa heterólogamente en una célula.

Tal como se usa en la presente memoria "células transformadas" se refiere a células que se han convertido espontáneamente en un estado de crecimiento no restringido, es decir, han adquirido la capacidad de crecer a través de un número indefinido de divisiones en cultivo. Las células transformadas pueden ser caracterizadas per términos tales, como neoplásticas, anaplásticas y/o hiperplásticas, con respecto a sus pérdidas del control del crecimiento. Para los fines de la invención, los términos "fenotipo transformado de células malignas de mamíferos", "fenotipo transformado " están destinados a abarcar, pero sin limitación, cualquiera de los siguientes rasgos fenotípicos asociados con la transformación celular de células de mamíferos: inmortalización, transformación morfológica o del crecimiento y tumorigenicidad, como es detectada por crecimiento prolongado en cultivo de células, crecimiento en medios semi-sólidos o crecimiento tumorígeno en animales inmuno-incompetentes o singeneicos.

Tal como se usa en la presente memoria "proliferar" y "proliferación" se refieren a células que experimentan mitosis.

Tal como se usa en la presente memoria "células inmortalizadas" se refiere a células que han sido alteradas por medios químicos, genéticos y/o recombinantes de tal modo que las células tienen la capacidad de crecer a través de un número indefinido de divisiones en cultivo.

El "estado de crecimiento" de una célula se refiere a la velocidad de proliferación de la célula y al estado de diferenciación de la célula.

"Antígeno MHC", tal como se usa en la presente memoria se refiere a un producto proteínico de uno o más genes MHC; el término incluye fragmentos o análogos de productos de los genes MHC que pueden evocar una respuesta inmunitaria en un organismo receptor. Ejemplos de antígenos MHC incluyen los productos (y sus fragmentos o análogos) de los genes MHC humanos, es decir, los genes de antígenos de leucocitos humanos (abreviadamente HLA, por la expresión inglesa human leukocyte antigens).

El término "histocompatibilidad" se refiere a la similitud de tejido entre individuos diferentes. El nivel de histocompatibilidad describe que de bien son compatibles el paciente y el donante. Los determinantes de histocompatibilidad principales son los antígenos de leucocitos humanos (HLA). La determinación del tipo de HLA se realiza entre el donante potencial de médula y el receptor potencial del trasplante para determinar qué grado de similitud de los HLA tienen los dos. Cuanto más próximo sea el grado de similitud menos reaccionará la médula del donante y el cuerpo del paciente entre sí.

El término "antígenos de leucocitos humanos" o "HLA", se refiere a proteínas (antígenos) encontrados en la superficie de los leucocitos y otros tejidos que se usan para igualar donante y paciente. Por ejemplo, un paciente y un donante potencial pueden tener sus leucocitos analizados para los antígenos HLA como, HLA-A, B y DR. Cada individuo tiene dos conjuntos de estos antígenos, uno heredado de cada progenitor. Por esta razón, es mucho más probable para un hermano o hermana actuar como donante para el paciente que un individuo con el que no tenga parentesco y mucho más probable para personas de los mismos grupos raciales y étnicos que sean similares entre sí.

III. Realizaciones ilustrativas y método de aislamiento.

Un aspecto de la invención proporciona un método para potenciar la RNAi por inducción o activación ectópica de una enzima RNAi en una célula in vivo o in vitro o en mezclas libres de células. En realizaciones preferidas la actividad de RNAi es activada o añadida a una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana, la cual célula puede ser proporcionada in vitro o como parte de un organismo completo. En otras realizaciones, el método objeto se lleva a cabo usando células eucarióticas generalmente (excepto para los ovocitos) en cultivo. Por ejemplo, la enzima Dicer puede ser activada en virtud de ser expresada recombinantemente o puede ser activada por uso de un agente que: (i) induce la expresión del gen endógeno, (ii) estabiliza la proteína de la degradación, y/o (iii) modifica alostéricamente la enzima para aumentar su actividad (alterando sus Kcat, Km o ambas).

A. Actividades de Dicer y Argonaut

En ciertas realizaciones, al menos una de las enzimas de RNAi es Dicer, o una de sus homólogas. En ciertas realizaciones preferidas, el presente método proporciona activación ectópica de Dicer. Tal como se usa en la presente memoria el término "Dicer" se refiere a una proteína que: (a) media una respuesta de RNAi y (b) tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50 por ciento idéntica, y más preferiblemente al menos 75, 85, 90 o 95 por ciento idéntica a la SEQ ID NO. 2 o 4, y/o que puede estar codificada por una ácido nucleico que se hibrida en condiciones de lavado de 2 x SSC a 22ºC, y más preferiblemente 0,2 x SSC a 65ºC, con una secuencia de nucleótidos representad por la SEQ ID NO. 1 o 3. Por consiguiente, el método puede comprender introducir una construcción de dsRNA en una célula en la cual Dicer ha sido expresada recombinantemente o activada ectópicamente de otro modo.

En cierta realización, al menos una de las enzimas de RNAi activadas es Argonaut, o una de sus homólogas. En ciertas realizaciones preferidas, el presente método proporciona activación ectópica de Argonaut. Tal como se usa en la presente memoria el término "Argonaut" se refiere a una proteína que: (a) media una respuesta de RNAi y (b) tiene una secuencia de aminoácidos al menos 50 por ciento idéntica, y más preferiblemente al menos 75, 85, 90 o 95 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 24. Por consiguiente, el método puede comprender introducir una construcción de dsRNA en una célula Argonaut en la cual ha sido recombinantemente expresada o activada de otro modo ectópicamente.

Esta invención también proporciona vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido Dicer o Argonaut, enlazado operativamente a al menos una secuencia reguladora transcripcional. Con la expresión enlazada operativamente se quiere decir que la secuencia de nucleótidos está enlazada a una secuencia reguladora de un modo que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión de las proteínas Dicer o Argonaut objeto. Por consiguiente, el término secuencia reguladora transcripcional incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Dichas secuencias reguladoras están descritas en el trabajo de Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión, secuencias que controlan la expresión de una secuencia de DNA cuando están enlazadas operativamente a dicha secuencia, se pueden usar en estos vectores para expresar secuencias de DNA que codifican polipéptidos Dicer o Argonaut de esta invención. Dichas secuencias de control de expresión útiles, incluyen, por ejemplo, una repetición terminal larga (abreviadamente LTR por la expresión long terminal repeat) viral, tal como LTR del virus de la leucemia de múridos Moloney, los promotores tempranos y tardíos de SV40, promotor temprano e inmediato de adenovirus o citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión está dirigida por la RNA-polimerasa de T7, las regiones promotoras y

operadoras principales del fago λ, las regiones de control para la proteína de cubierta fd, el promotor para 3fosfoglicerato-quinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promo

de levaduras, el promotor poliédrico del sistema de baculovirus y otras se-
ן tores de los factores de apareamiento

cuencias que se sabe que controlan la expresión of genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y sus diversas combinaciones. Debe entenderse que el diseño de vector de expresión puede depender de factores tales, como la elección de la célula hospedante que se ha de transformar y/o el tipo de proteína deseada que se ha de expresar.

Además se deben considerar también el número de copias del vector, la capacidad de controlar el número de copias y la expresión de cualesquiera otras proteínas codificadas por el vector, tal como marcadores de antibióticos.

Los genes Dicer o Argonaut recombinantes pueden ser producidos ligando un ácido nucleico que codifica un polipéptido Dicer o Argonaut en un vector adecuado para la expresión células procarióticas, células eucarióticas o ambas. Los vectores de expresión para la producción de formas recombinantes de los polipéptidos Dicer o Argonaut objeto incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, vectores adecuados para la expresión de un polipéptido Dicer o Argonaut incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de ppB-Tac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procarióticas, tal como E. coli.

Para la expresión de proteínas de recombinantes en levadura existen cierto número de vectores. Por ejemplo, YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 y YRP17 son vehículos de clonación y expresión útiles en la introducción de construcciones genéticas en S. cerevisiae (véase por ejemplo, Broach et al., (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, p. 83). Estos vectores pueden replicarse en E. coli debido a la presencia del origen de pBR322, y en S. cerevisiae debido al determinante de replicación del plásmido de 2 micrómetros de levadura. Además se pueden usar marcadores de resistencia a fármacos, tales cómos ampicilina. En una realización ilustrativa, se produce recombinantemente un polipéptido Dicer o Argonaut utilizando un vector de expresión generado por sub-clonación de la secuencia codificadora de un gen Dicer o Argonaut.

Los vectores de expresión de mamíferos preferidos contienen tanto secuencias procarióticas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucarióticas que se expresan en células eucarióticas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2- dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión en mamíferos adecuados para la transfección de células eucarióticas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y la selección de resistencia a fármacos tanto en células procarióticas y eucarióticas. Alternativamente, se pueden usar derivados de virus, tales como el papilomavirus bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucarióticas. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y la transformación de organismos hospedantes son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticas, así como métodos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17.

La presente invención puede proporcionar una construcción de "activación de genes" que, por recombinación homóloga con un DNA genómico, altera las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen Dicer o Argonaut endógeno. Por ejemplo, la construcción de activación de genes puede reemplazar al promotor endógeno de un gen Dicer

: o Argonaut con un promotor heterólogo, por ejemplo, una que causa la expresión constitutiva del gen Dicer o Argonaut o que causa la expresión inducible del gen en condiciones diferentes del modelo de expresión normal de Dicer

: o Argonaut. Están disponibles una variedad de formatos diferentes de construcciones de activación de genes. Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO93/09222, WO95/31560, WO96/294411, WO951 31560 y WO94/12650 de Transkariotic Therapies, Inc.

En realizaciones preferidas, la secuencia de nucleótidos usada como construcción de activación de genes puede estar constituida por: (1) DNA de alguna porción del gen Dicer o Argonaut endógeno (secuencia de exones, secuencia de intrones, secuencias de promotor, etc.) que dirigen la recombinación y (2) secuencia(s) reguladora(s) transcripcional(es) heteróloga(s) que ha(n) de estar enlazadas operativamente a la secuencia codificadora para el gen Dicer o Argonaut genómico por recombinación de la construcción de activación de genes. Para uso en generar cultivos de células productoras de Dicer o Argonaut la construcción puede incluir además un gen informador para detectar la presencia de la construcción con genes desactivados en la célula.

La construcción de activación de genes se inserta en una célula, y se integra con el DNA genómico de la célula en una posición tal que proporciona secuencias reguladoras heterólogas en asociación operativa con el gen Dicer o Argonaut natural. Dicha inserción ocurre por recombinación homóloga, es decir, las regiones de recombinación de la construcción de activación que son homólogas a la secuencia del gen Dicer o Argonaut endógeno se hibridan con el DNA genómico y se recombinan con las secuencias genómicas de modo que la construcción es incorporada en la posición correspondiente del DNA genómico.

Los términos "región de recombinación" o "secuencia diana" se refieren a un segmento (es decir, una porción) de una construcción de activación de genes que tienen una secuencia que es sustancialmente idéntica a, o sustancial-mente complementaria, a una secuencia de genes genómica, por ejemplo, incluyendo las secuencias flanqueantes 5' del gen genómico, y puede facilitar la recombinación homóloga entre la secuencia y la construcción del gen diana.

Tal como se usa en la presente memoria el término "región de reemplazo" se refiere a una porción de una construcción de activación que llega a quedar integrada en la localización cromosómica endógena después de la recombinación homóloga entre una región de recombinación y una secuencia genómica.

Las secuencias reguladoras heterólogas, por ejemplo las que son proporcionadas en la región de reemplazo pueden incluir una o más de una variedad de elementos, incluyendo: promotores (tales como promotores constitutivos o inducibles), potenciadores, elementos reguladores negativos, regiones de control de locus, sitios de unión a factores de transcripción o sus combinaciones.

Los promotores/potenciadores que se pueden usar para controlar la expresión del gen diana in vivo incluyen, pero sin limitación: el promotor/potenciador de citomegalovirus (CMV) (Karasuyama et al., (1989) J. Exp. Med. 169: 13), el promotor de la β-actina humana (Gunning et al., (1987) PNAS 84: 4831-4835), el promotor inducible de glucocorticoides presente en la repetición terminal larga (LTR) del virus del tumor mamario de ratón (abreviadamente MMTV, por la expresión inglesa mouse mammary tumor virus) (Klessig et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4: 1354-1362), las secuencias de repetición terminales largas del virus de la leucemia de múridos Moloney (MuLV LTR) (Weiss et al., (1985) RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), el promotor de la región temprana o tardía del SV40 (Bernoist et al., (1981) Nature 290: 304-310; Templeton et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4: 817; y Sprague et al., (1983) J. Virol. 45: 773), el promotor contenido la repetición terminal larga en 3' del virus del sarcoma de Rous (abreviadamente RSV = Rous Sarcoma Virus) (Yamamoto et al., (1980) Cell 22: 787-797), el promotor/potenciador de la timidina-quinasa del virus herpes simplex (HSV) (Wagner et al., (1981) PNAS 82: 3567-71), y el promotor LAT del virus herpes simple (Wolfe et al., (1992) Nature Genetics 1: 379-384).

En todavía otras realizaciones, la región de reemplazo simplemente deleciona un elemento de control transcripcional negativo del gen natural, por ejemplo, para activar la expresión, o suprime un elemento de control positivo, por ejemplo, para inhibir la expresión del gen diana.

B. Célula/Organismo

La célula con el gen diana puede proceder de cualquier mamífero o estar contenida en dicho animal. La construcción de dsRNA puede ser sintetizada in vivo o in vitro. La RNA-polimerasa endógena de la célula puede mediar la transcripción in vivo o la RNA-polimerasa clonada puede ser usada para la transcripción in vivo o in vitro. Para generar transcritos bicatenarios de un transgén in vivo, se puede usar una región reguladora para transcribir la cadena (o cadenas) de RNA. Además, el dsRNA puede ser generado transcribiendo una cadena de RNA que forme una horquilla, produciendo así un dsRNA.

La manipulación genética ha llegado a ser posible en organismos que no son modelos genéticos clásicos. Los programas de cría y cribado pueden ser acelerados por la capacidad de analizar rápidamente las consecuencias de una interrupción de genes dianas. Las interrupciones de genes se pueden usar para descubrir la función del gen diana, para producir modelos de enfermedades en las cuales están implicados los genes dianas en causar o impedir un estado patológico y en producir organismos con propiedades económicas mejoradas.

La célula con el gen diana puede proceder de una animal o estar contenida en dicho animal.

Ejemplos de mamíferos incluyen ganado, cabra, cerdo, oveja, roedores, hámster, ratón, rata, primate y humano.

La célula que tiene el gen diana puede proceder de células de líneas celulares germinales o somáticas no humanas, células pluripotentes, en fase de división o sin división, parenquimales o de epitelio, inmortalizadas o transformadas

o similares. La célula puede ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos de células que están diferenciadas incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endoteliales, neuronas, glia, células de la sangre, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos y células de las glándulas endocrina o exocrinas.

C. Genes dianas

El gen diana puede ser un gen derivado de la célula, un gen endógeno, un transgén, o un gen de un agente patógeno que está presente en la célula después de su infección. Dependiendo del gen diana particular y la dosis de materia de RNA bicatenario administrada, el método puede proporcionar una pérdida parcial o completa de función para el gen diana. Las dosis inferiores del material inyectado y los tiempos más largos después de la administración del dsRNA pueden dar como resultado la inhibición en una fracción más pequeña de células. La cuantificación de la expresión de genes en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición al nivel de acumulación de mRNA diana o traducción de la proteína diana.

"Inhibición de la expresión de genes" se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel del producto proteínico y/o mRNA de un gen diana. "Especificidad" se refiere a la capacidad de inhibir el gen diana sin efectos manifiestos sobre otros genes de la célula. Las consecuencias de la inhibición se pueden confirmar por examen de propiedades exteriores de la célula u organismo (como se presenta más adelante en los ejemplos) o por técnicas bioquímicas tales como hibridación en solución de RNA, protección de nucleasas, hibridación Northern, transcripción inversa, monitorización de la expresión de genes con una micromatriz, unión a anticuerpos, ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos y análisis de células activadas por fluorescencia (FACS). Para la inhibición mediada por RNA en una línea celular u organismo completo, la expresión de genes se analiza convenientemente mediante el uso de un gen informador o de resistencia a fármacos cuyo producto proteínico se analiza fácilmente. Dichos genes informadores incluyen acetohidroxiácido-sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucoronidasa (GUS), cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), proteína fluorescente verde (GFP), peroxidasa de rábano silvestre (HRP), luciferasa (Luc), nopalina-sintasa (NOS), octopina-sintasa (OCS) y sus derivados. Están disponibles múltiples marcadores seleccionables que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina.

Dependiendo del análisis la determinación de la cantidad de la expresión de genes permite determinar un grado de inhibición que es mayor que 10%, 33%, 50%, 90%, 95% o 99% en comparación con una célula no tratada de acuerdo con la presente invención. Las dosis inferiores del material inyectado y los tiempos más largos después de la administración de dsRNA pueden dar como resultado la inhibición en una fracción más pequeña de células (por ejemplo, al menos 10%, 20%, 50%, 75%, 90%, o 95% de las células que actúan como diana). La cuantificación de la expresión de genes en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición al nivel de acumulación de mRNA diana o traducción de proteína diana. Como ejemplo, la eficiencia de inhibición puede ser determinada evaluando la cantidad del producto génico en la célula: el mRNA puede ser detectado con una sonda de hibridación que tenga una secuencia de nucleótidos fuera de la región usada para el RNA bicatenario inhibidor o el polipéptido traducido puede ser detectado con un anticuerpo producido contra la secuencia del polipéptido de esa región.

Como se ha descrito antes la presente invención no está limitada a ningún tipo de gen diana o secuencia de nucleótidos. Pero con fines ilustrativos se enumeran las siguientes clases de genes dianas posibles: genes del desarrollo (por ejemplo, moléculas de adherencia, inhibidores de ciclina-quinasa, miembros de la familia Writ, miembros de la familia Pax, miembros de la familia de hélices Winged, miembros de la familia Hox, citoquinas/linfoquinas y sus receptores, factores de crecimiento/diferenciación y sus receptores, neurotransmisores y sus receptores); oncogenes (por ejemplo, ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSI, ETS1, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIM 1, PML, RET, SRC, TALI, TCL3, y YES); genes supresores de tumores (por ejemplo, APC, BRCA 1, BRCA2, MADH4, MCC, NF 1, NF2, RB 1, TP53, y WTI); y enzimas (por ejemplo, ACC-sintasas y oxidasas, ACP-desaturasas e hidroxilasas, ADPglucosa-fosforilasas, ATPasas, alcohol-deshidrogenasas, amilasas, amiloglucosidasas, catalasas, celulasas, calco-na-sintasas, quitinasas, ciclooxigenasas, descarboxilasas, dextrinasas, DNA- y RNA-polimerasas, galactosidasas, glucanasas, glucosa-oxidasas, almidón-sintasas unidas a gránulos, GTPasas, helicasas, hemicelulasas, inte grasas, inulinasas, invertasas, isomerasas, quinasas, lactasas, lipasas, lipoxigenasas, lisozimas, nopalina-sintasas, octopinasintasas, pectin-esterasas, peroxidasas, fosfatasas, fosfolipasas, fosforilasas, fitasas, sintasas reguladoras del crecimiento de plantas, poligalacturonasas, proteinasas y peptidasas, pulanasas, recombinasas, transcriptasas inversas, RUBISCOs, topoisomerasas y xilanasas).

D. Construcciones de dsRNA

La construcción de dsRNA puede comprender una o más cadenas de ribonucleótido polimerizado. Puede incluir modificaciones en la cadena principal de azúcar-fosfato o en el nucleósido. Por ejemplo, los enlaces fosfodiéster del RNA natural pueden ser modificados para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre. Las modificaciones en la estructura del RNA pueden ser adaptadas para permitir una inhibición genética específica al mismo tiempo que eviten una respuesta de pánico general en algunos organismos que es generada por el dsRNA. Análogamente, las bases pueden ser modificadas para bloquear la actividad de la adenosina-desaminasa. La construcción de dsRNA puede ser producida enzimáticamente o por síntesis orgánica parcial/total, y cualquier ribonucleótido modificado puede ser introducido por síntesis orgánica o enzimática in vitro.

La construcción de dsRNA puede ser introducida directamente en la célula (es decir, intracelularmente); o ser introducida extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducida por vial oral o puede ser introducida bañando un organismo en una solución que contenga el RNA. Los métodos para la introducción oral incluyen el mezclamiento directo del RNA con el alimento del organismo, así como enfoques de ingeniería en los cuales una especie que se usa como alimento es manipulada por ingeniería genética para expresar un RNA y luego se alimenta al organismo afectado. Los métodos físicos de introducir ácidos nucleicos incluyen la inyección de una solución de RNA directamente en la célula o la inyección extracelular en el organismo.

La estructura bicatenaria se forma mediante una cadena de RNA monocatenario auto-complementaria. La formación de dúplex de RNA puede ser iniciada dentro o fuera de la célula. El RNA puede ser introducido en una cantidad que permite el suministro de al menos una copia por célula. Las dosis superiores (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500

o 1000 copias por célula) de material bicatenario puede proporcionar más inhibición eficaz; las dosis inferiores pueden ser útiles también para aplicaciones específicas. La inhibición es específica de secuencia porque las secuencias de nucleótidoss correspondientes a la región de la dúplex del RNA son la diana para la inhibición genética.

Las construcciones de dsRNA que contienen una secuencia de nucleótidos idéntica a una porción de la secuencia codificadora del gen diana son preferidas para la inhibición. También se ha encontrado que para la inhibición son eficaces secuencias de RNA con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales sencillas respecto a la secuencia diana (dsRNA similar al gen diana). Por tanto, la identidad de secuencia puede ser optimizada por algoritmos de comparación y alineamiento de secuencias conocidos en la técnica (véase Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, y las referencias citadas en dicho texto) y calcular la diferencia porcentual entre la secuencia de nucleótidoss mediante, por ejemplo, el algoritmo de Smith-Waterman tal como es implementado en el programa informático BESTFIT usando parámetros por defecto (por ejemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group). Se prefiere una identidad de secuencias mayor que 90% o incluso una identidad de secuencias de 100%, entre el RNA inhibidor y la porción del gen diana. Alternativamente, la región dúplex del RNA puede ser definida funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con una porción del transcrito del gen diana (por ejemplo, hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas; seguido por lavado). En ciertas realizaciones preferidas, la longitud el dsRNA tiene una longitud de al menos 20, 21 o 22 nucleótidos, por ejemplo, correspondiente al tamaño de los productos de RNA producidos por escisión dependiente de Dicer. En ciertas realizaciones, la construcción el dsRNA tiene al menos una longitud de al menos 25 bases.

No se requiere una identidad de secuencia del 100% entre el RNA y el gen diana para llevar a la práctica la presente invención. Por tanto la invención tiene la ventaja de ser capaz de tolerar variaciones de secuencias que pudieran ser esperadas debido a la mutación genética, polimorfismo por tensión o divergencia evolutiva.

La construcción de dsRNA puede ser sintetizada in vivo o in vitro. La RNA-polimerasa endógena de la célula puede mediar la transcripción in vivo, o se puede usar RNA-polimerasa clonada para la transcripción in vivo o in vitro. Para la transcripción a partir de un transgén in vivo o una construcción de expresión, se puede usar una región reguladora (por ejemplo, promotor, potenciador, silenciador, donadora y aceptora de empalme, de poliadenilación) para transcribir la cadena (o cadenas) de dsRNA. La inhibición puede ser dirigida por transcripción específica en un órgano, tejido o tipo de célula; estimulación de una condición ambiental (por ejemplo, infección, tensión, temperatura, inductores químicos); y/o transcripción manipulada por ingeniería en una etapa o edad del desarrollo. Las cadenas del RNA pueden estar o no estar poliadeniladas; las cadenas del RNA pueden o no ser capaces de ser traducidas en un polipéptido por el aparato traduccional de las células. La construcción de dsRNA puede ser sintetizada químicamente o enzimáticamente por reacciones manuales o automatizadas. La construcción de dsRNA puede ser sintetizada por una RNA-polimerasa celular o una RNA-polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, T3, T7, SP6). El uso y producción de una construcción de expresión son conocidos en la técnica (véase también WO 97/32016; Las patentes de EE.UU. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 y 5.804.693; y las referencias citadas en las mismas). Si es sintetizado químicamente o por síntesis enzimática in vitro el RNA puede ser purificado antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, el RNA puede ser purificado a partir de una mezcla por extracción con un disolvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o una de sus combinaciones. Alternativamente, la construcción de dsRNA se puede usar con o sin un mínimo de purificación para evitar pérdidas debidas al procesamiento de la muestra. La construcción de dsRNA puede ser secada para conservación o ser disuelta en una solución acuosa. La solución puede contener tampones o sales que promuevan la reasociación de cadenas y/o la estabilización de las cadenas de los dúplex.

Los métodos físicos de introducir los ácidos nucleicos incluyen inyección de una solución que contiene la construcción de dsRNA, bombardeo por partículas cubiertas por la construcción de dsRNA, impregnación de la célula u organismo en una solución del RNA o electroporación de membranas celulares en presencia de la construcción de dsRNA. Una construcción viral empaquetada en una partícula viral conseguiría tanto la introducción eficiente de una construcción de expresión en la célula como la transcripción de la construcción de dsRNA codificada por la construcción de expresión. Se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en células, tales como transporte de vehículo mediado por lípidos, transporte mediado por productos químicos, tales como fosfato de calcio y similares. Por tanto, la construcción de dsRNA puede ser introducida junto con componentes que realizan una o más de las actividades siguientes: potenciar la absorción de RNA por la célula, promover la reasociación de cadenas de las cadenas del dúplex, estabilizar las cadenas reasociadas o aumentar de otro modo la inhibición del gen diana.

E. Usos ilustrativos

Una utilidad de la presente invención es como método de identificar la función de los genes de un organismo, especialmente eucariotas superiores, que comprende el uso de RNA bicatenario para inhibir la actividad de un gen diana de función previamente desconocida. En lugar de un aislamiento laborioso, y que necesita mucho tiempo, de mutantes por cribado genético tradicional, la genómica funcional podría prever determinar la función de los genes no caracterizados empleando la invención para reducir la cantidad y/o alterar la temporización de la actividad del gen diana. La invención podría usarse en determinar dianas potenciales para productos farmacéuticos, comprendiendo los eventos normales y patológicos asociados con el desarrollo, determinando las vías de señalización responsables del desarrollo posnatal/envejecimiento y similares. La velocidad aumentada de adquirir información de secuencias de nucleótidos a partir de fuentes genómicas y de genes expresados, incluyendo secuencias totales para genomas de mamíferos, puede ser acoplada con la invención para determinar la función de los genes en una célula o en un organismo completo. La preferencia de diferentes organismos de usar codones particulares, la búsqueda de bases de datos de secuencias para productos génicos relacionados, la correlación del mapa de enlace de rasgos genéticos con el mapa físico del cual se derivan las secuencias de nucleótidos, y los métodos de inteligencia artificial pueden ser usados para definir supuestos marcos de lectura abiertos de secuencias de nucleótidos adquiridas en tales proyectos de secuenciación.

Un simple ensayo podría ser inhibir la expresión de genes de acuerdo con la secuencia parcial disponible de una etiqueta de secuencia expresada (abreviadamente EST por la expresión inglesa expressed sequence tag). Las alteraciones funcionales en el crecimiento, desarrollo, metabolismo, resistencia a enfermedades u otros procesos biológicos serían indicativos de la función normal del producto del gen de la EST.

La facilidad con la cual la construcción de dsRNA puede ser introducida en una célula/organismo intacto que contiene el gen diana permite que la presente invención sea usada en cribados de alta producción (abreviadamente HTS por la expresión inglesa high throughput screening). Por ejemplo, los RNA dúplex pueden ser producidos por una reacción de amplificación usando cebadores que flanquean los insertos de cualquier genoteca derivada de la célula u organismo diana. Los insertos pueden proceder de DNA o mRNA genómico (por ejemplo, cDNA y cRNA). Los clones individuales de la genoteca pueden ser replicados y luego aislados reacciones separadas, pero preferiblemente la genoteca se mantiene en recipientes de reacción individuales (por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos) para minimizar el número de etapas requerido para llevar a la práctica la invención y permitir la automatización del proceso.

En un área ilustrativa, la presente invención puede proporcionar una genoteca dispuesta en matrices de construcciones de RNAi. La matriz puede estar en la forma de soluciones, tales como placas multi-pocillo, o puede estar "impresa" en sustratos sólidos sobre los cuales pueden crecer las células. Para ilustración, las soluciones que contienen RNA dúplex que son capaces de inhibir los diferentes genes expresados pueden ser colocadas en pocillos individuales posicionados en una placa de microtitulación en forma de una matriz ordenada, y las células/los organismos intactos de cada pocillo pueden ser analizados en lo que respecta a los cambios o modificaciones de su comportamiento o desarrollo debido a la inhibición de la actividad del gen diana.

En un área o campo de aplicación, el método objeto usa una genoteca dispuesta en matrices de construcciones de RNAi para cribar combinaciones de RNAi que son letales para las células hospedantes. La letalidad sintética es un principio fundamental de la genética experimental. Una letalidad sintética describe las propiedades de dos mutaciones que, individualmente, son toleradas por el organismo, pero que, en combinación, son letales. Las matrices objeto se pueden usar para identificar las mutaciones de pérdida de función que son letales en combinación con alteraciones en otros genes, tales como oncogenes activados o mutaciones de pérdida de función para supresiones tumorales. Para conseguir esto, se pueden crear "matrices de fenotipos" usando células cultivadas. La expresión de cada con junto de genes, tales como el genoma de células hospedantes puede ser individual y sistemáticamente interrumpida usando interferencia de RNA. La combinación con alteraciones en oncogenes y las vías supresoras de tumores puede ser usada para identificar interacciones sintéticas letales que pueden identificar nuevas dianas terapéuticas.

En ciertas aplicaciones, las construcciones de RNAi pueden ser alimentadas directamente a, o inyectadas en, la célula/organismo que contiene el gen diana. Alternativamente, el RNA dúplex puede ser producido por transcripción in vivo o in vitro a partir de una construcción de expresión usada para producir la genoteca. La construcción puede ser replicada como clones individuales y transcrita de la genoteca para producir el RNA; cada clon puede ser alimentado, inyectado, o suministrado por otro método conocido en la técnica, a la célula/organismo que contiene el gen diana. La función del gen diana puede ser analizada a partir de los efectos que tiene sobre la célula/organismo cuando se inhibe la actividad del gen. Este cribado podría ser aplicable a pequeños objetos que podrían ser procesados en un número grande, por ejemplo, células de cultivos de tejidos procedentes de mamíferos, especialmente primates, y más preferiblemente seres humanos.

Si se determina una característica de un organismo para ser asociada genéticamente a un polimorfismo a través de análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (abreviadamente RFLP por la expresión inglesa Restriction Fragment Length Polymorphism) o análisis del locus de rasgo cuantitativo (abreviadamente QTL por la expresión inglesa Quantitative Trait Locus), la presente invención se puede usar para ganar conocimiento en lo que concierne a si el polimorfismo genético podría ser directamente responsable para la característica. Por ejemplo, puede ser amplificado un fragmento que define el polimorfismo genético o las secuencias en la vecindad de dicho polimorfismo para producir un RNA, el RNA dúplex puede ser introducido en el organismo o célula, y puede ser determinada una alteración en la característica si está correlacionada con la inhibición. Naturalmente, puede haber explicaciones triviales de los resultados negativos con este tipo de ensayo, por ejemplo: la inhibición del gen diana causa letalidad, la inhibición del gen diana puede no dar como resultado una alteración observable, el fragmento contiene secuencias de nucleótidos que no son capaces de inhibir el gen diana o la actividad del gen diana es redundante.

La presente invención puede ser útil en permitir la inhibición de genes esenciales. Dichos genes pueden ser requeridos para la viabilidad de la célula u organismo en unas etapas particulares del desarrollo o solamente en compartimento o tejidos celulares específicos. El equivalente funcional de las mutaciones condicionales se puede producir inhibiendo la actividad del gen diana cuando o donde no sea requerido para la viabilidad. La invención permite la adición de RNA en momentos específicos del desarrollo y en localizaciones del organismo sin introducir mutaciones permanentes en el genoma diana.

La presente invención puede ser útil en permitir la inhibición de genes que han sido difíciles de inhibir usando otros métodos debido a redundancia de genes. Puesto que los presentes métodos se pueden usar para administrar más de un dsRNA a una célula u organismo, se pueden administrar dsRNA idénticos o similares a más de un gen, en donde los genes tienen una función redundante durante el desarrollo normal.

Si un empalme alternativo produjo una familia de transcritos que fueran distinguidos por uso de exones característicos, la presente invención puede dirigir la inhibición a través de exones apropiados para inhibir específicamente o distinguir entre las funciones de miembros de la familia. Por ejemplo, un factor proteínico que contenía un dominio transmembranal alternativamente empalmado puede ser expresado tanto en las formas unidas a membranas como en las secretadas. En lugar de aislar una mutación sin sentido que termina la traducción antes del dominio transmembranal, las consecuencias funcionales de tener solo la hormona secretada puede ser determinada de acuerdo con la invención haciendo actuar como diana el exón que contiene el dominio transmembranal y con ello inhibir la expresión de la hormona unida a membrana. Es decir, el método objeto puede ser usado para la supresión seleccionada de variantes de empalme.

La presente invención se puede usar sola o como componente de un kit que tiene al menos uno de los reactivos necesarios para llevar a cabo la introducción in vitro o in vivo de RNA a muestras de ensayo o sujetos. Los componentes preferidos son el dsRNA y un vehículo que favorece o promueve la introducción del dsRNA. Dicho kit puede incluir también instrucciones para permitir a un usuario del kit poner en práctica la invención.

Alternativamente, un organismo puede ser manipulado por ingeniería genética para producir dsRNA que produce resultados beneficiosos comercialmente o medicamente, por ejemplo, resistencia a un agente patógeno o a sus efectos patógenos, crecimiento mejorado o nuevos modelos de desarrollo.

IV. Ejemplos

La invención, que ya ha sido descrita en términos generales, se entenderá más completamente con referencia a los ejemplos siguientes, que han de ser incluidos simplemente para fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, así como, cuando sea apropiado, para fines de sus fundamentos (particularmente en relación con vectores no integrantes) y no se pretende que dichos ejemplos limiten la invención.

Ejemplo 1: Una nucleasa dirigida por RNA media el silenciamiento de genes por RNAi

En un diverso grupo de organismos que incluye Caenorhabditis elegans, Drosophila, planaria, hydra, tripanosomas, hongos y plantas, la introducción de RNA bicatenarios inhibe la expresión de genes de una manera específica de las secuencias (Sharp (1999) Genes and Development 13: 139-141; Sánchez-Alvarado and Newmark (1999) PNAS 96: 5049-5054; Lohman et al., (1999) Developmental Biology 214: 211-214; Cogoni and Macino (1999) Nature 399: 166169; Waterhouse et al., (1998) PNAS 95: 13959-13964; Montgomery and Fire (1998) Trends Genet, 14: 225-228; Ngo et al., (1998) PNAS 95: 14687-14692). Estas respuestas, llamadas interferencia de RNA o silenciamiento transcripcional o postranscripcional de genes, pueden proporcionar defensa anti-viral, modular la transposición o regular la expresión de genes (Sharp (1999) Genes and Development 13: 139-141; Montgomery and Fire (1998) Trends Genet. 14: 225-228; Tabara et al., (1999) Cell 99: 123-132; Ketting et al., (1999) Cell 99: 133-141; Ratcliff et al., (1997) Science 276: 1559-1560). Los inventores hemos emprendido una método bioquímico para aclarar los mecanismos que subyacen en este fenómeno genético. Aquí mostramos que los fenotipos de ''pérdida de función'' pueden ser creados en células cultivadas de Drosophila por transfección RNA bicatenarios específicos. Esto coincide con una reducción marcada en el nivel de los RNA mensajeros celulares similares. Extractos de células transfectadas contenían una actividad de nucleasa que degrada específicamente transcritos exógenos homólogos a RNA bicatenarios transfectados. Esta enzima contiene un componente de RNA esencial. Después de purificación parcial, la nucleasa específica de secuencia se co-fracciona una especie de RNA de ~25 nucleótidos diferenciado que puede conferir especificidad a la enzima a través de la homología a los mRNA sustratos.

Aunque los RNA bicatenarios (dsRNAs) pueden provocar silenciamiento de genes en numerosos contextos biológicos incluyendo Drosophila (Kennerdell et al., (1998) Cell 95: 1017-1026; Misquitta and Paterson (1999) PNAS 96:1451-1456), los mecanismos que subyacen bajo este fenómeno han permanecido en su mayor parte desconocidos. Por tanto los inventores deseamos establecer un modelo bioquímicamente fácil de comprender en el cual puedan ser investigados dichos mecanismos.

La transfección transitoria de células S2 de Drosophila cultivadas con el vector de expresión lacZ dio como resultado actividad de β-galactosidasa que fue fácilmente detectable en un ensayo in situ (Fig. 1a). Esta actividad se redujo grandemente por co-transfección con un dsRNA correspondiente a los primeros 300 nucleótidos de la secuencia de lacZ, mientras que la co-transfección con un dsRNA (CD8) de control (Fig. 1a) o con RNA monocatenarios de orientación con sentido o antisentido (datos no mostrados) tenían poco o ningún efecto. Esto indicó que los dsRNAs podían interferir de un modo específico de secuencia con la expresión de genes en células cultivadas.

Para determinar si la interferencia de RNA (RNAi) se podía usar para dirigirla a los genes endógenos, transfectamos células S2 con un dsRNA correspondiente a los primeros 540 nucleótidos de ciclina E de Drosophila, un gen que es esencial para el progreso en la fase S del ciclo celular. Durante el crecimiento en fase logarítmica, las células no tratadas residen principalmente en la fase G2/M (Fig. 1b). La transfección con dsRNA de lacZ no tuvo efecto sobre la distribución en el ciclo celular, pero la transfección con dsRNA de ciclina E causó una detención del ciclo celular en la fase G1 (Fig. 1b). La capacidad del dsRNA de ciclina E de provocar esta respuesta era dependiente de la longitud. Los RNA bicatenarios de 540 y 400 nucleótidos fueron bastante eficaces, mientras que los dsRNAs de 200 y 300 nucleótidos fueron menos potentes. Los RNA bicatenarios de ciclina E de 50 o 100 nucleótidos fueron inertes en nuestro ensayo y la transfección con un RNA monocatenario de ciclina E virtualmente no tuvo efecto.

Un aspecto distintivo de la RNAi es una reducción en el nivel de los mRNA que son homólogos al dsRNA. Las células transfectadas con el dsRNA de ciclina E (población a granel) mostraron mRNA de ciclina E endógeno disminuido en comparación con células de control (Fig. 1c). Similarmente, la transfección de células con dsRNAs homólogos a fizzy, un componente del complejo promotor de la anafase (abreviadamente APC por la expresión anaphase promoting-complex) o la ciclina A, una ciclina que actúa en las fases S, G2 y M, causó también una reducción de sus mRNA similares (Fig.1c). La reducción modesta de los niveles de mRNA de fizzy en células transfectadas con dsRNA de ciclina A resultó probablemente de la detención en un punto del ciclo celular en el cual la transcripción de fizzy es baja (Wolf and Jackson (1998) Current Biology 8: R637-R639; Kramer et al., (1998) Current Biology 8: 12071210). Estos resultados indican que la RNAi puede ser generalmente un método aplicable para sondar la función de los genes es células de Drosophila cultivadas.

La disminución en los niveles de mRNA observada en la transfección de dsRNA específicos en células de Drosophila pudo ser explicada por los efectos en los niveles transcripcionales o postranscripcionales. Los datos de otros sistemas han indicado que algunos elementos de la respuesta al dsRNA pueden afectar al mRNA directamente (revisado en el trabajo de Sharp (1999) Genes and Development 13: 139-141; Montgomery and Fire (1998) Trends Genet. 14: 225-228). Por tanto buscábamos desarrollar un ensayo libre de células que reflejó, al menos in parte, la RNAi.

Células S2 fueron transfectadas con dsRNA correspondientes a ciclina E o lacZ. Los extractos celulares fueron incubados con mRNA sintéticos de lacZ o ciclina E. Los extractos preparados de células transfectadas con el dsRNA de ciclina E de 540 nucleótidos degradaron eficazmente el transcrito de ciclina E; sin embargo, el transcrito de lacZ fue estable en estos lisados (Fig. 2a). Inversamente, los lisados de células transfectadas con los dsRNA de lacZ degradaron los transcritos de lacZ pero dejaron intacto el mRNA de la ciclina E. Estos resultados indican que la RNAi suprime los mRNA dianas a través de la generación de una actividad de nucleasa específica de secuencia. Hemos denominado a esta enzima RISC (complejo de silenciamiento inducido por RNA, la abreviatura RISC corresponde a la expresión inglesa RNA-induced silencing complex). Aunque observamos ocasionalmente posibles compuestos intermedios en el proceso de degradación (véase la Fig. 2), la ausencia de productos finales de escisiones estables indica una exonucleasa (acoplada quizás a una endonucleasa). Sin embargo, es posible que la nucleasa de la RNAi haga un corte endonucleolítico inicial y que exonucleasas no específicas del extracto completen el proceso de la degradación (Shuttleworth and Colman (1988) EMBO J. 7: 427-434). Además, nuestra capacidad para crear un extracto que tenga como diana lacZ in vitro indica que para la respuesta a la RNAi no se requiere la presencia de un gen endógeno.

Para examinar los requisitos del sustrato para la actividad de nucleasa, específica de secuencia, inducida por dsRNA incubamos una variedad de transcritos derivados de ciclina E con un extracto procedente de células que habían sido transfectadas con el dsRNA de ciclina E de 540 nucleótidos (Fig. 2b, c). Igual que un requisito para de longitud fue observado para el dsRNA transfectado, la actividad nucleasa de la RNAi mostró una dependencia del tamaño del RNA sustrato. Tanto un transcrito de 600 nucleótidos que se extiende ligeramente más allá de de la región diana (Fig. 2b) como un transcrito de ~1 kilobase (kb) que contiene la secuencia codificadora completa (datos no mostrados) fueron completamente destruidos por el extracto. Sorprendentemente, los sustratos más cortos no fueron degradados tan eficientemente. La actividad reducida se observó contra un transcrito de 300 o uno de 220 nucleótidos, y en nuestro ensayo un transcrito de 100 nucleótidos fue resistente a la nucleasa. Esto no fue debido solamente a los efectos de posición porque los transcritos de 100 nucleótidos derivados de otras porciones del dsRNA transfectado se comportó similarmente (datos no mostrados). Como era de esperar, la actividad (o actividades) de nucleasa presente(s) en el extracto pudo reconocer también la cadena antisentido del mRNA de la ciclina E. De nuevo los sustratos que contenían una porción sustancial de la región diana fueron degradados eficientemente, mientras que los que contenían un tramo más corto de secuencia homóloga (~130 nucleótidos) fueron reconocidos de un modo no eficiente (Fig. 2c, as600). Para ambas cadenas con sentido y antisentido, no fueron degradados los transcritos que no tenían homología con el dsRNA transfectado (Fig. 2b, Eout; Fig. 2c, as300). Aunque no podemos excluir la posibilidad de que la especificidad de la nucleasa haya migrado más allá de la región diana, la resistencia de los transcritos que no contienen homología para el dsRNA es concordante con los datos de C. elegans. Los RNA bicatenarios homólogos a un cistrón situado hacia el extremo 5' tiene poco o ningún efecto sobre un cistrón enlazado en dirección hacia el extremo 3', a pesar del hecho de que los mRNA policistrónicos no procesados puede ser detectados fácilmente (Tabara et al., (1998) Science 282: 430-432; Bosher et al., (1999) Genetics 153: 1245-1256). Además, la nucleasa fue inactiva contra un dsRNA idéntico al usado para provocar la respuesta a la RNAi in vivo (Fig. 2b). En el sistema in vitro, no se requirió una caperuza (cap) en 5’ ni una cola de poli(A), puesto que tales transcritos fueron degradados tan eficientemente como los RNA no provistos de caperuza (uncapped) y no poliadenilados.

El silenciamiento de genes provocado por dsRNA es específico de secuencia. Un mecanismo plausible para determinar la especificidad sería la incorporación de secuencias guías de ácido nucleico en los complejos que consiguen el silenciamiento (Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286: 950-952). De acuerdo con esta idea, el pretratamiento de los extractos con una nucleasa dependiente de Ca2+ (nucleasa microcócica) suprime la capacidad de los extractos para degradar los mRNA similares (Fig. 3). La actividad no pudo ser rescatada por la adición de mRNA no específicos tales como RNA de transferencia de levadura. Aunque la nucleasa microcócica puede degradar tanto DNA como RNA, el tratamiento del extracto con DNAsa I no tuvo efecto (Fig. 3). La actividad de nucleasa específica de secuencia, sin embargo, requería proteína (datos no mostrados). Juntos, nuestros resultados apoyan la posibilidad de que la nucleasa de RNAi es una ribonucleoproteína, que requiere tanto RNA como componentes proteínicos. El fraccionamiento bioquímico (véase más adelante) es concordante con estos componentes que están asociados en el extracto en lugar de ser ensamblados en el mRNA diana después de su adición.

En plantas, el fenómeno de la co-supresión ha sido asociado con la existencia de RNA cortos (~25-nucleótidos) que corresponden al gen que está siendo silenciado (Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286: 950-952). Para abordar la posibilidad de que un RNA similar pudiera existir en Drosophila y guiar la nucleasa específica de secuencia en la elección del sustrato, purificamos parcialmente nuestra actividad a través de varias etapas de fraccionamiento. Los extractos en bruto contenían tanto actividad específica de secuencia como RNA abundantes, heterogéneos homólogos al dsRNA transfectado (Figuras 2 y 4a). La nucleasa de RNAi se fraccionó con ribosomas en una etapa de centrifugación a alta velocidad. La actividad podía ser extraída por tratamiento con alta concentración en sal, y los ribosomas pudieron ser separados por una etapa adicional de centrifugación. La cromatografía de nucleasa soluble en una columna de cambio aniónico dio como resultado un pico diferenciado de actividad (Fig. 4b, ciclina E). Este retuvo la especificidad puesto que fue inactiva contra un mRNA heterólogo (Fig. 4b, lacZ). Las fracciones activas también contenían una especie de RNA de 25 nucleótidos que es homólogo a la diana ciclina E (Fig. 4b, Northern). La banda observada en las transferencias Northern puede representar una familia de RNA diferenciados porque podía ser detectada con sondas específicas tanto para secuencias con sentido como antisentido de ciclina E como sondas derivadas de segmentos distintos de dsRNA (datos no mostrados). En el momento de escribir este texto, no podemos determinar si el RNA de 25 nucleótidos está presente en el complejo de nucleasa en una forma bicatenaria o monocatenaria.

La interferencia de RNA permite una defensa adaptativa contra dsRNA tanto exógenos como endógenos, proporcionando algo semejante a una respuesta inmunitaria por dsRNA. Nuestros datos y los de otros (Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286: 950-952), son concordantes con un modelo en el cual los dsRNA presentes en una célula se convierten a través de procesamiento o replicación en pequeños determinantes de especificidad de tamaño diferenciado de un modo análogo al procesamiento de antígenos. Nuestros resultados sugieren que el componente postranscripcional del silenciamiento de genes dependiente de dsRNA se consigue mediante una nucleasa específica de secuencia que incorpora estos pequeños RNA como guías que dirigen mensajes específicos basados en el reconocimiento de secuencias. El tamaño idéntico de supuestos determinantes de especificidad en plantas (Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286: 950-952) y animales predice una conservación de ambos mecanismos y los componentes del silenciamiento postranscripcional inducido por dsRNA en diversos organismos. En plantas, los dsRNA provocan no solamente el silenciamiento postranscripcional de genes sino también la remodelación de la cromatina y la represión transcripcional (Jones et al., (1998) EMBO J. 17: 6385-6393; Jones et al., (1999) Plant Cell 11:2291-2301). Ahora es crítico determinar si la conservación del mecanismo de silenciamiento de genes existe también al nivel transcripcional y si la remodelación de la cromatina puede ser dirigida de un modo específico de secuencia por estas mismas secuencias de guía derivadas de dsRNA.

Métodos:

Métodos de cultivo de células y RNA. Se cultivaron células S2 (Schneider (1972) J. Embryol Exp Morpho 27: 353365) a 27ºC en medios de insectos de Schneider al 90% (Sigma), suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10%. Las células fueron transfectadas con dsRNA y DNA de plásmido por co-precipitación con fosfato cálcico (DiNocera and Dawid (1983) PNAS 80: 7095-7098). Se obtuvieron idénticos resultados cuando las células fueron transfectadas usando reactivos lipídicos (por Ejemplo, Superfect, Qiagen). Para análisis por FACS, las células fueron transfectadas adicionalmente con un vector que dirige la expresión de una proteína de fusión formada por la fluorescente verde (GFP)-US9 (Kalejta et al., (1999) Exp. Cell Res. 248: 322-328). Estas células fueron fijadas en etanol al 90% enfriado con hielo y teñidas con yoduro de propidio a 25 µg/mL. La FACS se realizó en un citómetro de flujo Elite (Coulter). Para la transferencia Nothern, se aseguraron iguales cargas por transferencias sobre sondas con un DNA complementario de control (RP49). Para la producción de dsRNA, fueron generados moldes de transcripción por la reacción en cadena de la polimerasa de tal modo que contenían secuencias del promotor de T7 encada extremo del molde. El RNA se preparó usando el kit RiboMax (Promega). La confirmación de que los RNA eran bicatenarios vino de su completa sensibilidad a la RNasa II (un regalo de A. Nicholson). Los transcritos del RNA diana fueron sintetizados usando el kit Riboprobe (Promega) y fueron purificados en gel antes de su uso.

Preparación del extracto. Se cultivaron en placas células S2 en fase log en placas de cultivo de tejidos y transfectadas con 30 µg de dsRNA y 30 µg de DNA de plásmido vehículo. Setenta y dos horas después de la transfección, las células se cosecharon en PBS que contenía EGTA 5 mM, se lavaron dos veces en PBS y una vez en tampón hipotónico (HEPES 10 mM, pH 7,3, β-mercaptoetanol 6 mM). Las células se suspendieron en 0,7 volúmenes de células empaquetadas de tampón hipotónico que contenía inhibidores de proteasa Complete (Boehringer) y 0,5 unidades/ml de RNasina (Promega). Las células fueron rotas en un homogeneizador Dounce con una mano de mortero de tipo B, y los lisados se centrifugaron a 30.000g durante 20 minutos. Los líquidos sobrenadantes se usaron en un medio de ensayo in vitro que contenía HEPES 20 Mm, pH 7,3, KOAc 110 mM, Mg(OAc)2 1 mM, EGTA 3 mM, CaCl2 2 mM, DTT 1 mM. Típicamente, se usó un extracto de 5 µl en un medio de ensayo de 10 µl que contenía también 10.000 c.p.m. de mRNA sustrato sintético.

Fraccionamiento del extracto. Los extractos fueron centrifugados a 200.000g durante 3 horas y el sedimento resultante (que contenía ribosomas) se extrajo en concentrado hipotónico que contenía también MgCl2 1 mM y KOAc 300 mM. El material extraído se centrifugó a 100.000g durante 1 h y el líquido sobrenadante resultante se fraccionó en una columna Source 15Q (Pharmacia) usando un gradiente de KCl en tampón A (HEPES 20 mM pH 7,0, ditiotreitol 1 mM, MgCl2 1 mM). Las fracciones se analizaron respecto a actividad de nucleasa como se ha descrito antes. Para la transferencia Nothern, las fracciones fueron tratadas con proteinasa K/SDS, extraídas con fenol, y resueltas en geles de urea 8M en acrilamida al 15%. El RNA se sometió a electrotransferencia sobre Hybond N+ y se sondó con ribo-sondas específicas de cadenas derivadas mRNA de ciclina. La hibridación se llevó a cabo en NaPO4 500 mM, pH 7,0, formamida al 15%, SDS al 7%, BSA al 1 %. Las manchas de transferencias fueron lavadas en 1X SSC a 3745ºC.

Ejemplo 2: Papel de la ribonucleasa bidentada en la etapa de iniciación de la interferencia de RNA.

Métodos genéticos en gusanos, hongos y plantas han identificado un grupo de proteínas que son esenciales para el silenciamiento de genes inducido por RNA bicatenario. Entre estas proteínas están miembros de la familia ARGONAUTE (por ejemplo RDE1, QDE2) (Tabara et al., (1999) Cell 99: 123-132; Catalanotto et al., (2000) Nature 404: 245; Fagard et al., (2000) PNAS 97: 11650-11654), helicasas de la familia recQ (MUT-7, QDE3) (Ketting et al., (1999) Cell 99: 133-141; Cogoni and Macino. (1999) Science 286: 2342-2344) y RNA-polimerasas dependientes de RNA (por ejemplo EGO-1, QDE1, SGS2/SDE1) (Cogoni and Macino (1999) Nature 399: 166-169; Smardon et al., (2000) Current Biology 10: 169-178; Mourrain et al., (2000) Cell 101: 533-542; Dalmay et al., (2000) Cell 101: 543553). Aunque se han propuesto funciones potenciales, a ninguno de estos genes le ha sido asignado una función definitiva en el proceso de silenciamiento. Estudios bioquímicos han sugerido que los silenciamientos de genes postranscripcionales (abreviadamente PTGS por las expresión ingles Post-Transcriptional Gene Silencings) se consiguen por una nucleasa multicomponente que tiene como diana varios mRNA paras degradación (Hammond et al.,

(2000) Nature 404: 293-296; Zamore et al., (2000) Cell 101 25-33; Tuschl et al., (1999) Genes and Development 13: 3191-3197). Los inventores hemos mostrado que la especificidad de este complejo puede derivar de la incorporación de una pequeña secuencia guía que es homóloga al mRNA sustrato (Hammond et al., (2000) Nature 404: 293-296). Estos RNA de 22 nucleótidos fueron transgenes activamente silenciadores originalmente identificados en plantas (Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-952). Los RNA ha sido producidos durante la RNAi in vitro usando un extracto preparado a partir de embriones de Drosophila (Zamore et al., (2000) Cell 101, 25-33). Los supuestos RNA guía pueden ser producidos también en extractos de células S2 de Drosophila (Fig. 5a). Con el objeto de comprender el mecanismo del silenciamiento de genes postranscripcional, hemos emprendido tanto el fraccionamiento bioquímico como aproximaciones al gen candidato para identifica las enzimas que ejecutan cada etapa de la RNAi.

Nuestros estudios previos dan como resultado la purificación parcial de una nucleasa, RISC, que es un efector de la interferencia de RNA. Véase el Ejemplo 1. Esta enzima fue aislada de las células S2 de Drosophila en las cuales se había iniciado la RNAi in vivo por transfección con dsRNA. Primeramente buscamos determinar si la enzima RISC y la enzima que inicia la RNAi vía procesamiento del dsRNA en 22 meros tienen actividades distintas. La actividad de RISC pudo ser grandemente clarificada a partir de extractos por centrifugación a alta velocidad (100.000xg durante 60 minutos) en tanto que la actividad que produce 22 meros permanecía en el líquido sobrenadante (Fig. 5b, c). Este sencillo fraccionamiento indicó que las actividades de RISC y la generadora de 22 meros son separables y por tanto enzimas distintas. Sin embargo, parece probablemente que pudieran interaccionar en algún punto durante el proceso de silenciamiento.

Los miembros de la familia RNAsa III están entre las pocas nucleasas que muestran especificidad para el RNA bicatenario (Nicholson (1999) FEMS Microbiol Rev. 23: 371-390). El análisis de los genomas de Drosophila y C. elegans revela varios tipos de enzimas RNAsa III. Primeramente está la RNAsa III canónica que contiene un solo resto de firma de RNAsa III y un dominio de unión a RNA bicatenario [(abreviadamente dsRBD por la expresión inglesa RNA binding domain; por ejemplo RNC_CAEEL). En segundo lugar está una clase representada por Drosha (Filippov et al., (2000) Gene 245:213-221), una enzima de Drosophila que contiene dos restos de RNAsa III y un dsRBD (Ce-Drosha en C. elegans). Una tercera clase contiene dos firmas de RNAsa III y un dominio de helicasa amino terminal (por ejemplo Drosophila CG4792, CG6493, C. elegans K12H4.8),y estos habían sido previamente propuestos por Bass como nucleasas de RNAi candidatas (Bass (2000) Cell 101: 235-238). Los representantes de todas las tres clases fueron analizados en cuanto a su capacidad para producir RNA de ~22 nucleótidos a partir de sustratos de dsRNA.

La digestión parcial de dsRNA de ciclina E de 500 nucleótidos con RNAsa III bacteriana purificada produjo un frotis (extensión) de productos mientras que la digestión casi completan produjo un grupo homogéneo de diversos RNA de~ 11-17 nucleótidos (no mostrado). Para analizar las enzimas RNAsa III duales preparamos versiones con una cola o etiqueta del epítopo T7 de Drosha y CG4792. Estas fueron expresadas en células S2 transfectadas y aisladas por inmunoprecipitación usando conjugados anticuerpo-agarosa. El tratamiento del dsRNA con el inmunoprecipitado CG4792y proporcionó fragmentos de ~22 nucleótidos similares a los producidos en extractos de S2 o de embrión (Fig. 6a). Ni la actividad del extracto ni la actividad de los inmunoprecipitados dependía de la secuencia del sustrato de RNA puesto que los dsRNA procedían de varios genes fueron procesados equivalentemente (véase Supplement 1). Se obtuvieron resultados negativos con Drosha y con inmunoprecipitados de una helicasa DExH box (Homeless (Gillespie et al., (1995) Genes and Development 9:2495-2508); véase la Fig 6a ,b). La transferencia Western confirmó que se expresó cada una de las proteínas dianas y los similarmente inmunoprecipitados (véase Supplement 2). Por tanto, llegamos a la conclusión de que CG4792 puede realizar la etapa de iniciación de interferencia de RNA produciendo secuencias de guía de ~22 nucleótidos a partir de los dsRNA. Debido a su capacidad para digerir el dsRNA en pequeños RNA de tamaño uniforme, hemos denominado a esta enzima (Dicer). El mRNA de Dicer se expresa en embriones, en células S2, y en moscas adultas en concordancia con la presencia de la maquinaria de RNAi funcional (véase Supplement 3).

La posibilidad de que Dicer pudiera ser la nucleasa responsable de la producción de los RNA guía a partir de los dsRNA nos apremió a producir un antisuero dirigido contra el extremo carboxi de la proteína Dicer (Dicer-1, CG4792). Este antisuero pudo inmunoprecipitar una actividad de nucleasa desde extractos de embriones de Drosophila o de lisados de células S2 que produjeron diversos RNA de ~22 nucleótidos. Los RNA de los sustratos de dsRNA (Fig. 6C). Los supuestos RNA guía que son producidos por la enzima Dicer-1 co-migran precisamente con los 22 meros que se producen en el extracto y con los 22 meros que están asociados con la enzima RISC (Fig. 6D, F). Se había mostrado previamente que la enzima que produjo los RNA guía en extractos de embriones de Drosophila era dependiente de ATP (Zamore et al., (2000) Cell 101: 25-33). El empobrecimiento en este factor dio como resultado una tasa inferior en ~6 veces de la escisión por dsRNA y la producción de RNA con una movilidad ligeramente inferior. Fue de interés en hecho de que tanto los inmunoprecipitados de Dicer-1 como los extractos de células S2 requieren ATP para la producción de ~ 22 meros (Fig. 6D). No observamos la acumulación de productos de movilidad inferior en estos casos, aunque observamos habitualmente estos extractos de embriones empobrecidos en ATP. El requisito de esta nucleasa para ATP es propiedad bastante inusual. Proponemos la hipótesis de que este requisito podría indicar que la enzima puede actuar procesando el dsRNA, con el dominio de helicasa utilizando la energía de la hidrólisis del ATP tanto para desenrollar los RNA guía como para la translocalización a lo largo del sustrato.

La inducción eficiente de interferencia de RNA en C. elegans y en Drosophila tiene varios requisitos. Por ejemplo, el RNA de iniciación debe ser bicatenario, y debe tener una longitud de varios cientos de nucleótidos. Para determinar si estos requisitos son dictados por Dicer, caracterizamos la capacidad de los extractos y de la enzima inmunoprecipitada para digerir diversos sustratos d RNA. Dicer fue inactiva contra los RNA monocatenarios independientemente de su longitud (véase Supplement 4). La enzima podía digerir tanto dsRNA de 200 como de 500 nucleótidos, pero era significativamente menos activa con sustratos más cortos (véase Supplement 4). Los RNA bicatenarios tan cortos como de 35 nucleótidos podían ser cortados por la enzima, aunque muy ineficientemente (datos no mostrados). En contraste, la RNAsa III de E. coli pudo digerir hasta su completamiento los dsRNA de 35 o 22 nucleótidos (no mostrado). Esto sugiere que las preferencias para sustratos de la enzima Dicer puede contribuir a determinar, pero no totalmente, la dependencia del tamaño de la RNAi.

Para determinar si la enzima Dicer realmente desempeña una papel en la RNAi in vivo, buscamos disminuir la actividad de Dicer células S2 y analizamos el efecto sobre el silenciamiento de genes inducido por RNA. La transfección de células S2 con una mezcla de dsRNA homólogos a los dos genes Dicer de Drosophila (CG4792 y CG6493) dio como resultado un reducción de 6-7 veces de la actividad de Dicer en lisados de células enteras o en inmunoprecipitados de Dicer-1 (Fig. 7A, B). La transfección con un dsRNA control (caspasa 9 de múridos) no tuvo efecto. Se observaron resultados cualitativamente similares si Dicer fue examinada por transferencia Northern (no mostrada). El empobrecimiento de Dicer de este modo comprometió sustancialmente la capacidad de las células de silenciar subsiguientemente un transgén de GFP exógeno por RNAi (Fig. 7C). Estos resultados indican que Dicer está implicado en la RNAi in vivo. La falta de inhibición completa del silenciamiento podría resultar de una supresión completa de Dicer (que es por sí misma requerida por la RNAi) o podría indicar que in vivo, los RNA guía pueden ser producidos por más de un mecanismo (por ejemplo a través de la acción de RNA-polimerasas dependientes de RNA).

Nuestros resultados indican que el proceso de la interferencia de RNA puede ser dividido en la menos dos etapas distintas. De acuerdo con este modelo, la iniciación de PTGS podría ocurrir por procesamiento de un RNA bicatenario por Dicer en secuencias de guía de ~22 nucleótidos, aunque no podemos excluir formalmente la posibilidad que pueda participar en el proceso otra nucleasa asociada a Dicer. Estos RNA guía se incorporarían en un complejo de nucleasa distinto (RISC) que se dirige a los mRNA para degradación. Una implicación de este modelo es que las secuencias de guía se derivan por sí mismas directamente del dsRNA que desencadena la respuesta. De acuerdo con este modelo, hemos demostrado que dsRNA exógenos marcados con 32P que han sido introducidos en las células S2 por transfección se incorporan en la enzima RISC como 22 meros (Fig. 7E). Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que la RNA-polimerasa dependiente de RNA pudiera amplificar lo 22 meros una vez que han sido generados o proporcionar un método alternativo para producir los RNA guía.

La estructura de la enzima Dicer provoca especulación sobre el mecanismo mediante el cual la enzima podría producir fragmentos de tamaños diferenciados independientemente de la secuencia del dsRNA (véase Supplement 1, Fig. 8a). Se ha establecido que la RNAsa III bacteriana actúa sobre su sustrato como un dímero (Nicholson (1999) FEMS Microbiol Rev. 23: 371-390; Robertson et al., (1968) J. Biol. Chem. 243: 82-91; Dunn (1976) J. Biol. Chem.

251: 3807-3814). Similarmente, se puede requerir un dímero de enzimas Dicer para la escisión de los dsRNA en piezas de ~22 nucleótidos. Por consiguiente, de acuerdo con un modelo, el intervalo de escisión estaría determinado por la disposición física de los dos dominios de RNAsa III dentro de la enzima Dicer (Fig. 8a). Un modelo alternativo plausible exigiría que la escisión fuera dirigida a una sola posición por los dos dominios RIII en una sola proteína Dicer. El intervalo de 22 nucleótidos podría estar dictado por la interacción de enzimas Dicer vecinas o por translocalización a lo largo del mRNA sustrato. La presencia de un dominio de helicasa integral sugiere que los productos de escisión de Dicer pudieran ser 22 meros monocatenarios que se incorporan en la enzima RISC como tales.

Un aspecto notable de la familia Dicer es su conservación en el curso de la evolución. Se encuentras homólogos en

C. elegans (K12H4.8), Arabidopsis (por ejemplo, CARPEL FACTORY (Jacobson et al., (1999) Development 126: 5231-5243), T25K16.4, AC012328_1), mamíferos (Helicase-MOI (Matsuda et al., (2000) Biochim. Biophys. Acta 1490: 163-169) y S. pombe (YC9A_SCHPO) (Fig 8b, véase los Supplements 6,7 para comparaciones de secuencias). De hecho, el miembro de la familia humana Dicer es capaz de generar ~22 nucleótidos. Los RNA procedentes de dsRNA sustratos (Supplement 5) sugieren que estas proteínas estructuralmente similares pueden compartir todas funciones bioquímicas similares. Se ha demostrado que los dsRNA exógenos pueden afectar la función de los genes en embriones de ratón tempranos (Wianny et al., (2000) Nature Cell Biology 2: 70-75), y nuestros resultados sugieren que esta regulación pueda ser conseguida por una maquinaria de RNAi conservada en el curso de la evolución.

Además de los restos de RNAsa III y helicasa, las búsquedas en las bases de datos PFAM indican que cada miembro de la familia Dicer contiene también un dominio ZAP (Fig 8c) (Sonnhammer et al., (1997) Proteins 28: 405-420). Esta secuencia fue definida basada solamente en su conservación en la familia Zwille/ ARGONAUTE/Piwi que ha sido implicada en la RNAi por mutaciones en C. elegans (Rde-1) y Neurospora (Qde-2) (Tabara et al., (1999) Cell 99:123-132; Catalanotto et al, (2000) Nature 404: 245). Aunque la función de este dominio es desconocida, es intrigante que esta región de homología esté restringida a las dos familias de genes que participan en el silenciamiento dependiente de dsRNA. Tanto la familia ARGONAUTE como la Dicer han estado también implicadas en procesos biológicos comunes, a saber, la determinación del destino de las células madre. Un alelo hipomórfico de la carpel factory, un miembro de la familia Dicer en Arabidopsis, está caracterizado por una proliferación aumentada en los meristemos florales (Jacobsen et al., (1999) Development 126 5231-5243). Este fenotipo y cierto número de otras características también son compartidos por mutantes de Arabidopsis ARGONAUTE (agol-1) (Bohmert et al., (1998) EMBO J. 17: 170-180; C. Kidner and R. Martienensen, comunicación personal). Estos análisis genéticos empiezan a proporcionar evidencia de que la RNAi puede ser más que una respuesta defensiva a ciertos RNA inusuales, sino que puede desempeñar funciones importantes en la regulación de genes endógenos.

Con la identificación de Dicer como un catalizador para la etapa de iniciación de la RNAi, hemos comenzado a desentrañar las bases bioquímicas de este mecanismo inusual de la regulación de genes. Será de importancia crítica determinar si los miembros conservados de la familia de otros organismos, particularmente mamíferos desempeñan también un papel en la regulación de genes mediada por dsRNA.

Métodos:

Construcciones de plásmidos. Se obtuvo por PCR un cDNA de longitud completa que codifica Drosha a partir de EST secuenciada por el proyecto del genoma Berkeley Drosophila. El clon Homeless fue un obsequio de Gillespie and Berg (Universidad de Washington). La etiqueta del epítopo T7 se añadió al extremo amino de cada una por PCR, y los cDNA etiquetados fueron clonados en pRIP, un vector retroviral diseñado específicamente para la expresión en células de insectos (E. Bernstein, no publicado). En este vector, la expresión es activada por el promotor IE3 de Orgyia pseudotsugata (Invitrogen). Puesto que no estaba disponible cDNA para CG4792/Dicer, se amplificó un clon genómico de un bácmido (BACR23F10; obtenido del BACPAC Resource Center del Dept. of Human Genetics en The Roswell Park Cancer Institute). De nuevo, durante la amplificación, una etiqueta de epítopo T7 fue añadida al extremo amino de la secuencia codificadora. El gen Dicer humano se aisló a partir de una genoteca de cDNA preparada a partir de células HaCaT (GJH, no publicado). Una versión provista de etiquetas de T7de la secuencia codificadora completa se clonó en pCDNA3 (Invitrogen) para la expresión en células humanas (LinX-A).

Cultivo celular y preparación de extractos. Cultivo de células S2 y embriones. Se cultivaron células S2 a 27ºC en CO2 al 5% en medios para insectos de Schneider suplementado con suero bovino fetal al 10% inactivado por calor (Gemini) y solución de antibiótico-antimicótico (Gibco BRL). Las células fueron cosechadas para la preparación del extracto a 10x106 células/ml. Las células se lavaron con 1X en PBS y se volvieron a suspender en un tampón hipo-tónico (Hepes 10 mM, pH 7,0, MgCl2 2 mM, βME 6 mM) y se trataron en un homogeneizador Dounce. Los lisados celulares se centrifugaron a 20.000xg durante 20 minutos. Los extractos se conservaron a -80ºC. Embriones de Drosophila fueron criados en cajas de moscas por metodologías estándares y fueron recogidas cada 12 horas. Los embriones fueron descorionados en lejía chlorox al 50% y lavados exhaustivamente con agua destilada. Se añadió a los embriones tampón de lisis (Hepes 10 mM, KCl10 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 0,5 mM, β-glicerofosfato 10 mM, DTT1 mM, PMSF 0,2 mM) y los extractos se prepararon por homogeneización en un triturador de tejidos. Los lisados fueron centrifugados durante 72 horas a 200.000xg y se congelaron a -80ºC. Se mantuvieron en DMEM/FCS al 10% células LinX-A, un derivado altamente transfectable de células 293 humanas, (Lin Xie and GJH, no publicado).

Transfecciones y immunoprecipitaciones. Se transfectaron células S2 usando un método con fosfato de calcio esencialmente como se ha descrito previamente (Hammond et al., (2000) Nature 404: 293-296). Las tasas de transfección fueron ~90% como se monitorizó en controles que usan un ensayo de la β-galactosidasa in situ. Las células se transfectaron también por co-precipitación en fosfato cálcico. Para las immunoprecipitaciones, las células (~ 5x106 por IP) fueron transfectadas con varios clones y se lisaron tres días más tarde en tampón IP (KOAc 125 mM, MgOAc 1 mM, CaCl2 1 mM, EGTA 1, 5 mM, Hepes 20 mM pH 7, DTT 0,1 mM, NP- 40 al 1% más inhibidores de proteasa Complete (Roche)). Los lisados se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000xg y los líquidos sobrenadantes se añadieron a perlas de agarosa-anticuerpos T7 (Novagen). La unión al anticuerpo transcurrió 4 horas a 4ºC. Las perlas se centrifugaron y lavaron en tampón de lisis tres veces, y una vez en tampón de reacción. El antisuero Dicer se produjo en conejos usando un péptido conjugado con KLH correspondiente a los 8 aminoácidos C-terminales de Dicer-1 (CG4792) de Drosophila.

Reacciones de escisión. Preparación de RNA. Se generaron moldes que iban a ser transcritos en dsRNA por PCR con cebadores directos e inversos, conteniendo cada uno una secuencia del promotor T7. Los RNA se produjeron usando el kit Riboprobe (Promega) y se marcaron uniformemente durante la reacción de transcripción con 32P-UTP. Los RNA monocatenarios se purificaron en geles de agarosa al 1%. Escisión del dsRNA. Cinco microlitros de extractos de embrión o de células S2 se incubaron durante una hora a 30ºC con dsRNA en una mezcla de reacción que contenía Hepes 20 mM, pH 7,0, MgOAc 2 mM, DTT2 mM, ATP 1 mM y Superasin al 5% (Ambion). Los inmunoprecipitados se trataron similarmente excepto que un volumen mínimo de tampón de reacción (que incluye ATP y Superasin) y dsRNA se añadieron a las perlas que habían sido lavadas en el tampón de reacción (véase antes). Para el empobrecimiento en ATP, los extractos de embriones de Drosophila se incubaron durante 20 minutos a 30ºC con glucosa 2 mM y 0,375 U de hexoquinasa (Roche) antes de la adición de dsRNA.

Análisis Northern y Western. Se preparó RNA total a partir de embriones de Drosophila (0-12 horas), a partir moscas adultas, y de células S2 que usan Trizol (Lifetech). Se aisló el RNA mensajero mediante afinidad usando perlas magnéticas con oligo-dT (Dynal). Los RNA fueron sometidos a electroforesis en geles de formaldehído/agarosa desnaturalizados, sometidos a transferencia y sondados con DNA cebados aleatoriamente correspondientes a Dicer. Por análisis Western, las proteína con etiqueta de T7 fueron inmunoprecipitadas de lisados de células completas en tampón IP usando conjugados de anticuerpos anti-T7-agarosa. Las proteínas fueron liberadas de las perlas por ebullición en tampón de Laemmli y fueron separadas por electroforesis en SDS PAGE al 8%. Después de transferencia a nitrocelulosa, las proteínas fueron visualizadas usando un anticuerpo anti-T7 conjugado a HRP (Novagen) y detección quimioluminescente (Supersignal, Pierce).

RNAi de Dicer. Se transfectaron células S2 de Drosophila con un dsRNA correspondiente a caspasa 9 de ratón o con una mezcla de dos dsRNA correspondientes a Dicer-1 y Dicer-2 (CG4792 y CG6493) de Drosophila. Dos días después de la transfección inicial, las células se transfectaron otra vez con una mezcla que contenía un plásmido de expresión de GFP y dsRNA de luciferasa o dsRNA de GFP como se ha descrito previamente (Hammond et al., (2000) Nature 404: 293-296). Las células se analizaron respecto a su actividad de Dicer o por fluorescencia tres días después de la segunda transfección. La cuantificación de células fluorescentes fue hecha en un clasificador de células Coulter EPICS después de la fijación. Las transfecciones de control indicaron que la actividad de Dicer no se vio afectada por la introducción del dsRNA de caspasa 9.

Ejemplo 3: Un método simplificado para la creación de construcciones de forma de horquilla para interferencia de RNA.

En numerosos organismos modelos los RNA bicatenarios han demostrado causar una supresión eficaz y específica de la función de los genes (Bosher and Labouesse (2000) Nature Cell Biology 2: E31-E36). Esta respuesta, denominada interferencia de RNA o silenciamiento postranscripcional de genes, ha evolucionado llegando a ser una herramienta genética reversible altamente eficaz en C. elegans, Drosophila, plantas y otros numerosos sistemas. En estos casos los RNA bicatenarios puede ser introducidos por inyección, transfección o alimentación; sin embargo, en todos los casos, la respuesta es tanto transitoria como sistémica. Recientemente, la interferencia estable con la expresión de genes ha sido conseguida por la expresión de los RNA que forman estructuras de tipo corchete (snap-back) u horquilla (Fortier and Belote (2000) Genesis 26: 240-244; Kennerdell and Carthew (2000) Nature Biotechnology 18: 896-898; Lam and Thummel (2000) Current Biology 10: 957-963; Shi et al., (2000) RNA 6: 1069-1076; Smith et al., (2000) Nature 407: 319-320; Tavemarakis et al., (2000) Nature Genetics 24: 180-183). Esto tiene el potencial de que no solo permite el silenciamiento estable de la expresión de genes, sino que también se ha observado el silencia-miento inducible en tripanosomas y moscas Drosophila adultas (Fortier and Belote (2000) Genesis 26: 240-244; Lam and Thummel (2000) Current Biology 10: 957-963; Shi et al., (2000) RNA 6: 1069-1076). La utilidad de este método está algo impedida por las dificultades que surgen en la construcción de plásmidos bacterianos que contienen las repeticiones invertidas largas que son necesarias para provocar el silenciamiento. En un reciente informe, se indicó que se cribaron más de 1.000 supuestos clones para identificar la construcción deseada (Tavemarakis et al., (2000) Nature Genetics 24: 180-183).

La presencia de estructuras con forma de horquillas frecuentemente induce transposiciones o reordenamientos de plásmidos, debidos en parte a las proteínas sbc de E. coli que reconocen y escinden estructuras cruciformes de DNA (Connelly et al., (1996) Genes Cell 1: 285-291). Hemos desarrollado un método para la construcción de horquillas que no requiere la clonación de repeticiones invertidas, per se. En lugar de ello, el fragmento del gen que ha de ser silenciado se clona como una repetición directa, y la inversión se consigue por tratamiento con una recombinasa específica del sitio, bien in vitro (o potencialmente in vivo) (véase la Fig. 27). Tras la recombinación, la estructura de repetición es estable en una cepa bacteriana que carece de un sistema SBC intacto (DL759). Hemos utilizado con éxito esta estrategia para construir numerosas construcciones de horquillas de expresión que han sido usadas satisfactoriamente para provocar el silenciamiento de genes en células de Drosophila.

En los Ejemplos siguientes, usamos este método para expresar dsRNA largos en una variedad de tipos de células de mamíferos. Mostramos que dichos dsRNA largos median la RNAi en una variedad de tipos de células. Adicional-mente, puesto que el vector descrito en la Figura 27 contiene un marcador seleccionable, los dsRNA producidos de este modo pueden ser expresados establemente en células. Por consiguiente, este método permite no solo el examen de los efectos transitorios de la supresión del RNA en una célula, sino también los efectos de una supresión del RNA estable y prolongada.

Métodos:

Los plásmidos que expresan los RNA con forma de horquilla fueron construidos clonando los primeros 500 pares de bases de la región codificadora de GFP en el casete FLIP de pRIP-FLIP como repetición directa. El casete FLIP contiene dos sitios de clonación direccionales, el segundo de los cuales está flanqueado por los sitios Lox P. El gen de la zeocina, presente entre los sitios de clonación mantiene la selección y la estabilidad. Para crear una repetición invertida para la producción de horquillas, los clones de repetición directa fueron expuestos a Cre-recombinasa (Stratagene) in vitro y, después transformados en E. Coli DL759. Estas bacterias permiten la replicación de DNA que contiene estructuras cruciformes que tienden a formar repeticiones invertidas.

Ejemplo 4: Los dsRNA largos suprimen la expresión de genes en células de mamíferos

Experimento previos han demostrado que los dsRNA, producidos usando una variedad de métodos que incluyen la construcción de horquillas, puede suprimir la expresión de genes en células de Drosophila. Ahora demostramos que el dsRNA puede suprimir también la expresión de genes en células de mamíferos en cultivo. Adicionalmente, el poder de la RNAi como herramienta genética sería grandemente potenciado por la capacidad de manipular por ingeniería genética el silenciamiento estable de la expresión de genes. Por tanto emprendemos un esfuerzo para identificar células de mamíferos en las cuales pudieran usarse los dsRNA largos como desencadenadores de la RNAi con la esperanza de que estas mismas líneas celulares proporcionaran una plataforma sobre la cual desarrollar estrategias de silenciamiento estables. Demostramos que la supresión de RNA puede ser mediada expresando establemente una horquilla larga en una línea celular de mamíferos. La capacidad de manipular por ingeniería genética el silenciamiento estable de la expresión de genes es células de mamíferos cultivados, además de la capacidad de silenciar transitoriamente la expresión de genes, tiene muchas aplicaciones importantes.

A. RNAi en células P19 pluripotentes de múridos

Primero buscamos determinar si los agentes desencadenantes constituidos por dsRNA largos podían inducir silenciamientos específicos de secuencia en células de múridos cultivadas, tanto para desarrollar este método como una herramienta para sondar la función de los genes, como para permitir estudios mecanísticos del silenciamiento inducido por dsRNA para ser propagado en sistemas de mamíferos. Por tanto, intentamos extender los estudios previos en embriones de ratón (Wianny et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2: 70-75; Svoboda et al., 2000, Development 127: 41474156) buscando por mecanismos similares al de la RNAi en tipos de células embrionarias pluripotentes. Inspeccionamos cierto número de líneas celulares de origen embrionario en cuanto al grado de supresión generalizada de la expresión de genes ocurrida por introducción de dsRNA. Como ensayo, analizamos los efectos del dsRNA sobre la expresión de GFP tal como se mide in situ contando células fluorescentes. Como cabía esperar, tanto en células embrionarias de riñón humanas (293) como fibroblastos de embrión de ratón, la expresión de GFP fue virtualmente eliminada independiente de la secuencia del dsRNA co-transfectado. En algún teratocarcinoma pluripotente y líneas celulares de teratoma (por ejemplo, N- Teral, F9), la respuesta de PKR fue atenuada pero todavía evidente; sin embargo, en contraste, la transfección dsRNA no homólogos no tuvo efecto en la expresión de genes informadores (por ejemplo, GFP o luciferasa) en células madre embrionarias de ratón o en células embrionarias de carcinoma p19 (Fig. 28).

La transfección de células embrionarias de carcinoma p19 con GFP en presencia de dsRNA correspondiente similar a los primeros 500 nucleótidos de la secuencia codificadora de la GFP tuvo un efecto notablemente diferente. La expresión de GFP fue eliminada en la vasta mayoría de las células co-transfectadas (Fig. 28), lo que sugiere que estas células de múridos cultivadas podrían responder al dsRNA de un modo similar al que nosotros habíamos demostrado previamente en células S2 cultivadas de Drosophila (Hammond et al., 2000, Nature 404: 293-296).

Para cuantificar la extensión en la cual el dsRNA podría inducir el silenciamiento de genes específico de secuencia, usamos un ensayo informador dual de luciferasa similar al que había sido usado primeramente para demostrar la RNAi en extractos de embriones de Drosophila (Tuschl et al., 1999, Genes Dev. 13: 3191-3197). Células P19 EC fueron transfectadas con una mezcla de dos plásmidos que dirigen individualmente la expresión de luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla. Estos fueron co-transfectados sin dsRNA, con dsRNA que corresponde a los primeros ~500 nucleótidos de la luciferasa de luciérnaga o con dsRNA correspondiente a los primeros 500 nucleótidos de GFP como control. La co-transfección con dsRNA de GFP dio actividades de luciferasa que fueron similares a las del control sin dsRNA, tanto en la relación de actividad luciferasa de luciérnaga/Renilla como en los valores absolutos de ambas actividades. En contraste, en células que recibieron el dsRNA de luciferasa de luciérnaga, la relación de actividad de luciferasa de Renilla se redujo en hasta 30 veces (250 ng, Fig. 29B). Para comparación, llevamos a cabo un conjunto idéntico de experimentos in células S2 de Drosophila. Aunque se obtuvieron resultados cualitativamente similares la respuesta de silenciamiento fue más potente. A niveles equivalentes de dsRNA, las células S2 suprimieron la actividad de luciferasa de luciérnaga a virtualmente los niveles de fondo.

También se realizó el experimento complementario en el cual el dsRNA era homólogo al de luciferasa de Renilla. De nuevo, en este caso, la supresión de la expresión de la enzima Renilla fue ~10 veces (Fig. 29D). Por tanto, la respuesta al dsRNA en células P19 fue flexible, y la maquinaria de silenciamiento fue capaz de adaptarse a los dsRNA dirigidos contra cualquiera de los informadores que fueron ensayados.

Realizamos dos métodos para analizar si esta respuesta era específica de los dsRNA. El pre-tratamiento del agente desencadenante con RNasa III purificada, una ribonucleasa específica de dsRNA, antes de la transfección redujo grandemente su capacidad para provocar el silenciamiento. Además, la transfección de células con RNA monocatenarios antisentido dirigidos contra luciferasa de luciérnaga o luciferasa de Renilla tuvo poco o ningún efecto sobre la expresión de los informadores (Fig. 29C y 29D). Considerados juntos, estos resultados proporcionaron un fuerte indicación de que los RNA bicatenarios provocan una respuesta de silenciamiento potente y específica en células embrionarias de carcinoma p19. El silenciamiento eficiente podría ser provocado con concentraciones relativamente bajas de dsRNA (25 ng/ml de medios de cultivo; véase Fig. 29A). La respuesta fue dependiente de la concentración con una supresión máxima de ~20 veces la conseguida a una dosis de 1,5 µg/ml de medios de cultivo. El silencia-miento fue establecido rápidamente y fue evidente a las 9 horas postransfección (el punto de tiempo más pronto examinado). Además, la respuesta persistió sin cambios significativos en el grado de supresión durante hasta las 72 horas siguientes a una sola dosis de dsRNA.

La Figura 30 muestra además células P19 de tipo natural que han sido co-transfectadas con RFP o GFP (panel derecho). Adviértase la expresión robusta de RFP o GFP respectivamente y aproximadamente 42 horas postransfección. Nosotros aislamos clones de P19 que expresan establemente una horquilla de GFP de 500 nucleótidos. Dichos clones fueron transfectados luego con RFP o GFP, y la expresión de RFP o GFP se determinó por inspección visual de las células. El panel izquierdo demuestra que una horquilla de 500 nucleótidos suprime específica-mente la expresión de GFP en células P19.

B. RNAi en células madres embrionarias.

Para determinar si la presencia de una respuesta específica de secuencia al dsRNA fue una peculiaridad de las células P19 o si se extendía también a las células embrionarias normales de múridos, realizamos ensayos de silenciamiento similares en células madre embrionarias de ratón. La co-transfección de células madre embrionarias con dsRNAs no similares (por ejemplo, GFP), de nuevo, no tuvo un efecto acusado en los valores absolutos o en las relaciones de actividad de luciferasa de Renilla y luciérnaga (Fig. 31). Sin embargo, la transfección con dsRNA de luciferasa de luciérnaga o Renilla redujo de forma espectacular y específica la actividad de la enzima diana (Fig. 31).

Este resultado sugiere que la RNAi puede operar en múltiples tipos de células de múridos de origen embrionario, incluyendo células madre embrionarias normales. La capacidad de provocar silenciamiento en un tipo de célula que se usa normalmente para la generación de animales con mosaicos genéticos sugiere la posibilidad de analizar eventualmente los efectos biológicos del silenciamiento tanto en cultivo como en modelos de animales reconstituidos. Nuestra capacidad de manipular satisfactoriamente células ES vía RNAi permite el uso de la RNAi en la generación de ratones transgénicos y con genes desactivados (knock-out).

C. RNAi en células somáticas de múridos.

Las vías efectoras de la RNAi probablemente están presentes en células somáticas de mamíferos, basadas en la capacidad de los siRNA de inducir silenciamiento transitorio (Elbashir et al., 2001, Nature 411; 494-498). Además, hemos mostrado que el iniciador de las vías iniciadoras y efectoras de la RNAi existe claramente en células embrionarias que pueden cumplir o hacer valer el silenciamiento en respuesta a los dsRNA desencadenantes. Por lo tanto buscamos analizar si la maquinaria de la RNAi pudiera existir intacta en algunas líneas celulares somáticas.

La transfección de células HeLa con informadores de luciferasa en combinación dsRNA desencadenantes largos causó una supresión de actividad casi completa, independientemente de la secuencia de RNA. En una línea celular de mioblasto de múridos, C2C12, advertimos una mezcla de dos respuestas. Ciertos dsRNA homólogos a luciferasa de luciérnaga provocaron un efecto específico de secuencia, produciendo un grado de supresión que fue ligeramente más potente que el observado por transfección con siRNA de ~21 nucleótidos similar (Elbashir et al., 2001, Nature

411: 494-498) (véase la Fig. 32A). Sin embargo, con dsRNA desencadenantes largos, el efecto específico estaba superpuesto por una supresión generalizada de la expresión del gen informador que presumiblemente fue debida a la activación de PKR (Fig. 32B).

Numerosos virus de mamíferos han evolucionado para tener la capacidad de bloquear la PKR como una ayuda para una infección eficiente. Por ejemplo, los adenovirus expresan RNA de VA, que mimetizan los dsRNA con respecto a la unión pero no a la activación de la PKR (Clarke et al., 1995, RNA 1: 7-20). El virus vaccinia usa dos estrategias

para evadirse de la PKR. La primera es la expresión de E3L, que se une a los dsRNA y los enmascara (Kawagis Kobayashi et al., 2000, Virology 276: 424-434). La segunda es la expresión de K3L, que se une a la PKR y la inhibe

).supra (Kawagishi-Kobayashi et al., 2000,
ן vía su capacidad de mimetizar el sustrato natural de esta enzima, eIF2

La transfección de células C2C12 con un vector que dirige la expresión de K3L atenúa la represión generalizada de genes informadores en respuesta a los dsRNA. Sin embargo, esta proteína no tuvo efecto sobre la magnitud de la inhibición específica por RNAi (Fig. 32C).

La Figura 33 muestra además los resultados de un ensayo de co co-transfección transitoria realizado en células Hela, células CHO y células P19. Las líneas celulares fueron transfectadas cada una con plásmidos que expresan luciferasas de luciérnaga (Photinus pyralis) y de pensamiento de mar (Renilla reniformis). Las líneas celulares fueron transfectadas adicionalmente con 400 ng de dsRNA de 500 nucleótidos correspondientes a luciferasa de luciérnaga (dsLUC) o dsGFP. Los resultados demuestran que los dsRNA puede mediar específicamente la supresión en múltiples tipos de células de mamíferos.

Estos resultados plantean la posibilidad de que al menos en algunas líneas celulares y/o tipos de células, bloqueando respuestas no específicas a los dsRNA facilitarán el uso de dsRNA largos para el estudio de la función de los genes. Esto podría conseguirse a través del uso de inhibidores virales, como se describe en el presente texto, o a través del uso de células aisladas de animales que están modificados genéticamente para carecer de respuestas indeseables.

D. Supresión estable de la expresión de genes usando la RNAi.

Hasta la fecha, los dsRNA se han usado para inducir silenciamiento de genes específico de secuencia en células de mamíferos cultivadas o en embriones solo de un modo transitorio. Sin embargo, las aplicaciones más potentes de la manipulación genética se realizan con la creación de mutantes estables. La capacidad de inducir silenciamiento usando los dsRNA ofrece la oportunidad de trasladar a una célula de mamíferos el trabajo de organismos modelos, tales como Drosophila, plantas y C. elegans en donde el silenciamiento estable ha sido conseguido por la expresión impuesta de los RNA con forma de horquilla (Kennerdell et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 896-898; Smith et al.,

2000, Nature 407: 319-320; Tavemarakis et al., 2000, Nat. Genet. 24: 180-183).

Se transfectaron células madre (EC) embrionarias P19 con un vector de control o con un vector de expresión que dirige la expresión de un RNA con forma de horquilla de GFP de ~500 nucleótidos a partir de un promotor de RNApolimerasa II (citomegalovirus). Las colonias que proceden de células que tenían integrado establemente una construcción fueron seleccionadas y expandidas en líneas celulares clonales. Cala línea celular fue analizada respecto a RNAi persistente por co-transfección transitoria con una mezcla de dos genes informadores, dsRED para marcar las células transfectadas y GFP para analizar el silenciamiento estable.

La transfección de células EC P19 clonales que habían integrado establemente el vector de control produjeron igual número de células rojas y verdes, como era de esperar en ausencia de una respuesta de silenciamiento específica (Fig. 34B), mientras que las células que expresan el RNA con forma de horquilla de GFP dieron un resultado muy diferente. Estas células expresaron la proteína dsRED con una eficiencia comparable a la observada en células que contiene el vector de control. Sin embargo, las células fallaron en expresar la GFP informadora transfectada (Fig. 34B). Estos datos aportan una fuerte indicación de que la expresión continua de un dsRNA con forma de horquilla puede provocar un silenciamiento estable específico de secuencia de un gen diana.

En células S2 de Drosophila y de C. elegans, la RNAi es iniciada por la enzima Dicer, que procesa el dsRNAi en varios siRNA de ~22 nucleótidos (Bernstein et al., 2001, Nature 409: 363-366; Grishok et al., 2001, Cell 106: 23-34; Hutvagner et al., 2001, Science 293: 834-838; Ketting et al., 2001, Genes Dev. 15: 2654-2659; Knight et al., 2001, Science 293: 2269-2271). En ambas células S2 y de C. elegans experimentos que usan dsRNA para dirigirlo a Dicer suprimen la respuesta de silenciamiento por RNAi. Se analizó si Dicer desempeña un papel central en el silencia-miento de genes inducido por horquillas en células P19 transfectando células P19 transfectadas establemente con construcciones de horquilla de GFP con dsRNA de Dicer de ratón. El tratamiento con dsRNA de Dicer, pero sin dsRNA de control dio como resultado una des-represión de GFP (Fig. 34C).

E. El dsRNA induce silenciamiento postranscripcional.

Un aspecto clave de la RNAi es que ejerce su efecto en el nivel postranscripcional por destrucción de los mRNA dianas (Hammond et al., 2001, Nat. Rev. Genet. 2: 110-119). Para analizar si los dsRNA inducían silenciamiento en células de ratón vía un mecanismo postranscripcional, usamos un ensayo idéntico al usado inicialmente para caracterizar las respuestas del RNAi en extractos de embriones de Drosophila (Tuschl et al., 1999, Genes Dev. 13: 31913197). Preparamos lisados de células EC P19 que eran competentes para traducción in vitro de mRNA con caperuza (capped) correspondientes a luciferasa de Renilla y luciérnaga. La adición de dsRNA no específicos a estos extractos no tuvo un efecto sustancial sobre la cantidad absoluta de expresión de luciferasa o sobre la relación de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla (Fig. 35). En contraste, la adición de dsRNA homólogo a la luciferasa de luciérnaga indujo una supresión de actividad acusada y dependiente de la dosis. La adición de RNA correspondiente a solo la cadena antisentido del dsRNA tuvo poco efecto, comparable al dsRNA no específico de control, y el pre-tratamiento del dsRNA desencadenante del silenciamiento con RNasa III redujo grandemente su potencial para inducir el silenciamiento in vitro. Un segundo aspecto distintivo de la RNAi es la producción de pequeños siRNA de ~22 nucleótidos, que determinan la especificidad del silenciamiento. Encontramos que dichas especies de RNA fueron generadas a partir de dsRNA en extractos de células P19 (Fig. 34D, in vitro), indicativo de la presencia de una actividad Dicer de ratón. Estas especies fueron producidas también en células que expresa establemente RNA con forma de horquillas de GFP (Fig. 34D, in vivo). Consideradas juntas la naturaleza postranscripcional del silenciamiento inducido por dsRNA, la asociación del silenciamiento con la producción de siRNAs de ~ 22 nucleótidos, y la dependencia de esta respuesta de Dicer, un agente clave en la vía de la RNAi, sugieren fuertemente que el dsRNA suprime la expresión de genes en células de múridos vía un mecanismo de RNAi convencional.

F. El silenciamiento de genes mediado por RNAi es específico y requiere los dsRNA.

Realizamos experimentos para verificar que los efectos supresores observados en el sistema in vitro fueron específicos para RNA bicatenario. Explicado resumidamente, los experimentos fueron realizados de acuerdo con los métodos reseñados anteriormente. El dsRNA bicatenario (ds), el RNA monocatenario (ss) o el RNA antisentido (as) correspondientes a luciferasa de luciérnaga (abreviadamente FF por la expresión inglesa firefly) o de Renilla (Ren) luciferasa fue añadido a la reacción de traducción. Después de las reacciones realizadas 30ºC durante 1 hora, se realizaron ensayos de luciferasa duales usando un luminómetro modelo 3010 de Analytical Scientific Instruments.

La Figura 36 resume los resultados de estos experimentos que demuestran que la supresión de la expresión de genes observada en este ensayo in vitro es específica para dsRNA. Estos resultados refuerzan además la conclusión de que el dsRNA suprime la expresión de genes en un sistema in vitro de una manera concordante con el silenciamiento postranscripcional.

G. Las células de mamíferos impregnadas con dsRNA dan como resultado el silenciamiento de genes.

Estudios de silenciamiento postranscripcional en vertebrados han demostrado que la transfección o inyección de dsRNA no es necesaria para conseguir los efectos supresores. Por Ejemplo, la supresión por dsRNA en C. elegans puede ser observada impregnando los gusanos en dsRNA o alimentando los gusanos con bacterias que expresan el dsRNA de interés. Abordamos la cuestión de si la supresión por dsRNA en células de mamíferos podía ser observada sin transfección de dsRNA. Dicho resultado presentaría un potencial adicional para usar fácilmente la supresión por dsRNA en células de mamíferos, y podría permitir también el uso de dsRNA para suprimir la expresión de genes en tipos de células que han sido difíciles de transfectar (es decir, tipos de células con una baja eficiencia de transfección o tipos de células que han demostrado ser difíciles de transfectar en absoluto).

Se hicieron crecer células P 19 en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos hasta aproximadamente 60% de con-

MEM/ FBS al 10 %). A los cultivos se añadieron concentraciones variables de
ן fluencia en medios de crecimiento (

dsRNA de luciérnaga y las células se cultivaron durante 12 horas 12 en medios de crecimiento + dsRNA. Las células se transfectaron con plásmidos que expresan luciferasa de luciérnaga o de pensamiento de mar, como se ha descrito con detalle anteriormente. Los ensayos de luciferasa duales se realizaron 12 horas postransfección usando un luminómetro modelo 3010 de Analytical Scientific Instruments.

La Figura 37 resume estos resultados que demuestran que el dsRNA puede suprimir la expresión de genes en células de mamíferos sin transfección. Cultivar células en presencia de dsRNA dio como resultado una supresión dependiente de la dosis en la expresión del gen de luciferasa de luciérnaga.

Métodos:

Cultivo de células. Se cultivaron células embrionarias de carcinoma de ratón P19 (American Type Culture Collec

-MEM (GIBCO/BRL) suplementado con FBS al 10% inactivado por calor y solución de antibióti-
ן , CRL-1825) en tion

co /antimicótico al 1% (GIBCO/BRL). Las células madre embrionarias de ratón (J1, proporcionadas por S. Kim, Cold Spring Harbor Laboratory) fueron cultivadas en DMEM que contenía ESgro (Chemicon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cultivaron células de mioblasto de múridos C2C (obsequio de N. Tonks, Cold Spring Harbor Laboratory) en DMEM (GIBCO/BRL) suplementado con FBS al 10% inactivado por calor y solución de antibiótico /antimicótico al 1% (GIBCO/BRL).

Preparación de RNA. Para la producción de dsRNA se generaron moldes de transcripción por PCR; contenían secuencias del promotor T7 en cada extremo del molde (véase Hammond et al., 2000, Nature 404: 293-296). Los dsRNA se prepararon usando el kit RiboMax (Ambion, Austin, TX). Los transcritos de mRNA de luciferasa de luciérnaga y Renilla se sintetizaron usando el kit Riboprobe (Promega) y se purificaron en gel antes de su uso.

Ensayos de transfección y silenciamiento de genes. Se transfectaron células con las cantidades indicadas de dsRNA y DNA de plásmidos usando FuGENE6 (Roche Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fueron transfectadas al 50-70% de confluencia en placas de 12 pocillos que contenían 1 o 2 ml de medio por pocillo. Se llevaron a cabo ensayos de luciferasa duales (Promega) co-transfectando células con plásmidos que contienen luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor SV40 (pGL3-Control, Promega) y luciferasa de Renilla bajo el control de la región potenciadora/promotora de SV40 temprana (pSV40, Promega). Esos plásmidos se co-transfectaron usando una relación 1:1 o 10:1 de pGL3-control (250 ng/pocillo) a pRL-SV40. Ambas relaciones dieron resultados similares. Para algunos experimentos las células fueron transfectadas con vectores que dirigen la expresión de la proteína de fusión proteína fluorescente verde potenciada (EGFP)-US9 (Kalejta et al., 1999, Exp. Cell Res. 248: 322-328) o proteína fluorescente roja (RFP) (pDsRed N1, CLON TECH). La RNAi se realizó en células S2 como se ha descrito (Hammond et al., 2000, Nature 404: 293-296).

Se construyeron plásmidos que expresan horquillas de RNA (RNA con un bucle y tallo complementario) clonando las primeras 500 pb de la región codificadora EGFP (CLONTECH) en el casete FLIP de pRIP-FLIP como una unidad de repetición directa. El casete FLIP contiene dos sitios de clonación direccionales, el segundo de los cuales soporta los sitios de flanqueamiento LoxP (véase Fig. 35A). El gene de zeocina (Stratagene), presente entre los sitios de clonación, mantiene la selección y, por tanto, la estabilidad del casete FLIP. El casete FLIP que contiene repeticiones directas de EGFP fue subclonado en pcDNA3 (Invitrogen). Para crear una repetición invertida para la producción de la horquilla, los clones de repetición directa de EGFP fueron expuestos a Cre-recombinasa (Stratagene) in vitro y, después, transformados en Escherichia coli DL759 (Connelly et al., 1996, Genes Cell 1: 285-291). Estas bacterias permiten la replicación de DNA que contiene estructuras cruciformes, que tienden a formarse a partir de repeticiones invertidas. Los transformantes DL759 fueron cribados para seleccionar plásmidos que contienen repeticiones invertidas (~50%).

El silenciamiento de Dicer se consiguió usando un dsRNA que comprende el exón 25 del gen Dicer de ratón y correspondiente a los nucleótidos 5284-5552 del cDNA de Dicer humano.

Ensayos de traducción in vitro y de Dicer in vitro. Se cosecharon células que crecen logarítmicamente en PBS que contenía EGTA 5 mM lavado dos veces en PBS y una vez en tampón hipotónico (Hepes10 mM, pH 7,3 / βmercaptoetanol 6 mM). Las células se volvieron a suspender en 0,7 volúmenes de células empaquetadas de tampón hipotónico que contenía inhibidores de proteasa Complete (Roche Molecular Biochemicals) y 0,5 unidades/ml de RNasina (Promega). Las células se trituraron en un homogeneizador Dounce con un tipo de mano de mortero B, y los lisados se centrifugaron a 30.000 x g durante 20 minutos. Los líquidos sobrenadantes se usaron en un ensayo de traducción in vitro que contenía mRNA de luciferasa de luciérnaga y de Renilla con caperuza (capped) mm7G(5’)pppG o en ensayos de Dicer in vitro que contenían dsRNA marcado con 32P. Para la traducción in vitro los ensayos, se mezclaron 5 µl de extracto con 100 ng de mRNA de luciérnaga y de Renilla junto con 1 µg de dsRNA (o tampón)/DTT10 mM/espermidina 0,5 mM/Hepes 200 mM, MgOAc 3,3 mM/KOAc 800 mM /ATP 1 mM/ GTP 1 mM /4 unidades de Rnasina/215 µg de creatina-fosfatasa /1 µg de creatina-fosfatasa-quinasa /aminoácidos 1 mm (Promega). Las reacciones se llevaron a cabo durante 1 hora a 30ºC y se sofocaron añadiendo 1 x tampón de lisis pasivo (Promega). Los extractos fueron analizados luego para actividad de luciferasa. Los ensayos in vitro para la actividad de Dicer se realizaron como se ha descrito (Bernstein et al., 2001, Nature 409: 363-366).

Construcción de líneas silenciadoras estables. Placas de diez centímetros de células P 19 se transfectaron con 5 µg de plásmido de expresión de la horquilla de GFP y se seleccionaron los integrantes estables usando G-418 (300 mg/ml) durante 14 días. Los clones se seleccionaron y cribaron para silenciamiento de GFP.

Ejemplo 5: Composiciones y métodos para sintetizar siRNA

Los resultados previos han indicado que los RNA sintéticos (siRNA) cortos pueden inducir eficientemente la supresión de RNA. Puesto que los RNA cortos no activan la respuesta de PKR no específica, ofrecen un medio de silenciar eficientemente la expresión de genes en una gama de tipos de células. Sin embargo, el estado actual de la técnica con respecto a los siRNA tiene serias limitaciones. Primeramente, los siRNA se sintetizan actualmente químicamente con gran coste (aproximadamente 400$/siRNA). Dichos altos costes hacen a los siRNA impracticables para los laboratorios pequeños o para uso en esfuerzos de cribado a gran escala. Por consiguiente existe la necesidad de métodos para generar los siRNA a un coste reducido.

Los inventores proporcionamos composiciones y métodos para sintetizar los siRNA por polimerasa de T7. Este método permite una síntesis eficiente de los siRNA a un coste compatible con las reacciones de transcripción de RNA estándares (aproximadamente 16$/siRNA). Este coste grandemente reducido hace uso del siRNA un método razonable para los laboratorios pequeños, y facilitará también su uso en proyectos de cribado a gran escala.

La Figura 38 muestra el método para producir los siRNA usando polimerasa de T7. Dicho resumidamente, la polimerasa de T7 se usa para transcribir tanto un transcrito con sentido como con antisentido. Los transcritos se reasocian luego para proporcionar un siRNA. Los expertos en la técnica reconocerán que una cualquiera de las RNApolimerasas disponibles puede ser empleada sustituyendo a la polimerasa de T7 para poner en práctica la invención (es decir., T3, Sp6, etc.).

Este método es susceptible de generación de una sola especie de siRNA, así como para la generación de una geno-teca de siRNA. Dicha genoteca de siRNA puede ser usada en numerosos cribados de alta producción, incluyendo los cribados genotípicos basados en células y cribados basados en matrices.

Ejemplo 6: Generación de dsRNA con forma de horquillas cortas y supresión de la expresión de genes usando dichas horquillas cortas.

Puesto que la realización que los RNA cortos, con forma de horquilla codificados endógenamente podrían regular la expresión de genes vía elementos de la maquinaria de la RNAi, hemos buscado explotar este mecanismo biológico para la regulación de los genes dianas deseados. En la presente memoria mostramos que los RNA (shRNA) pueden inducir el silenciamiento de genes específico de secuencia en células de mamíferos. Como se hace normalmente con los siRNA, el silenciamiento puede ser provocado transfectando horquillas exógenamente sintetizadas en células. Sin embargo, el silenciamiento puede ser desencadenado también por expresión endógena de los shRNA. Esta observación abre la puerta a la producción de líneas celulares continuas en las cuales se usa la RNAi para suprimir establemente la expresión de genes en células de mamíferos. Además, métodos similares deben probar su eficacia en la creación de animales transgénicos y potencialmente en estrategias terapéuticas en las cuales la supresión de la función de los genes a largo plazo es esencial para producir el efecto deseado.

Diversos grupos (Grishok et al., 2001, Cell 106: 23-34; Ketting et al., 2001, Genes & Dev. 15: 2654-2659; Knight et al., 2001, Science 293: 2269-2271; Hutvagner et al., 2001, Science 293: 834-838) han mostrado que los agentes desencadenantes endógenos del silenciamiento de genes, específicamente RNA temporales cortos (abreviadamente stRNA por la expresión ingles small temporal RNA) let-7 y lin-4, funcionan al menos en parte a través de vías de la RNAi. Específicamente, estos RNA cortos están codificados por precursores de horquillas que son procesados por Dicer en las formas maduras de ~21 nucleótidos. Además, estudios genéticos en C. elegans han mostrado un requisito para las proteínas de la familia Argonaute en la función de los stRNA. Específicamente, alg-1 y alg-2, miembros de la subfamilia EIF2c, están implicados tanto en procesamiento de stRNA como en sus funciones efectoras en el desarrollo posterior (Grishok et al., 2001, supra). Nosotros hemos mostrado recientemente que un componente de RISC, la nucleasa efectora de la RNAi, es un miembro de la familia Argonaute, proponiendo un modelo en el cual los stRNA pueden funcionar a través de complejos similares a RISC, que regulan la traducción del mRNA en lugar de la estabilidad del mRNA (Hammond et al., 2001, Science 293: 1146-1150).

A. RNA con forma de horquillas cortas desencadenaron el silenciamiento de genes en células de Drosophila.

Deseamos analizar la posibilidad de que pudiéramos redirigir estos RNA cortos, con forma de horquilla, codificados endógenamente para regular genes de elección con el objetivo final de subvertir el sistema regulador para manipular la expresión de genes establemente en líneas de células de mamíferos y en animales transgénicos. Tanto si es desencadenada por los dsRNA largos como por los siRNA, la RNAi es generalmente más potente en la supresión de la expresión de genes en células S2 de Drosophila que en células de mamíferos. Por tanto elegimos este sistema modelo en el cual analizar la eficacia de los RNA con forma de horquillas cortas (shRNA) como inductores del silenciamiento de genes.

Ni los stRNA ni el grupo más amplio de los microRNA (miRNA) que han sido recientemente descubiertos forman estructuras de horquillas perfectas. Realmente, para cada uno de estos RNA se predice que contienen varios nucleótidos abultados (sobresalientes) dentro de sus estructuras de tallo bastante cortas (~30 nucleótidos). Debido a que la posición y carácter de estos nucleótidos abultados han sido conservados a través de la evolución y entre al menos un subconjunto de los miRNA, buscamos diseñar imitadores de miRNA redirigidos para conservar estos aspectos estructurales predichos. Solamente los miRNA let-7 y lin-4 tienen dianas de mRNA conocidas (Wightman et al., 1993, Cell 75: 855-862; Slack et al., 2000, Mol. Cell 5: 659-669). En ambos casos, aparear los sitios de unión dentro de los transcritos regulados es imperfecto, y en el caso de lin-4, la presencia del un nucleótido abultado es crítica para la supresión (Ha et al., 1996, Genes & Dev. 10: 3041-3050). Por lo tanto diseñamos shRNA que se aparean imperfectamente con los sustratos dianas. Un subconjunto de estos shRNA se representa en la Figura 39A.

Para permitir el análisis rápido de variantes de los shRNA y un comparación cuantitativa de la eficacia de la supresión elegimos usar un sistema informador de luciferasa dual, como se ha descrito previamente para los ensayos de RNAi tanto en extractos de Drosophila (Tuschl et al., 1999, Genes & Dev. 13: 3191-3197) como en células de mamíferos (Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 9742-9747; Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-498). La cotransfección de plásmidos informadores de luciferasa de luciérnaga y de Renilla con dsRNA largos o con siRNA homólogos al gen de la luciferasa de luciérnaga proporcionó una supresión de ~95% de luciferasa de luciérnaga sin efecto sobre la luciferasa de Renilla (Fig. 39B; datos no mostrados). La luciferasa de luciérnaga podía ser también específicamente silenciada por co-transfección con shRNA homólogos. Los inhibidores más potentes fueron los compuestos de estructuras de horquillas sencillas con homología completa con el sustrato. La introducción de pares de bases G-U dentro del tallo de la horquilla o dentro de la secuencia de reconocimiento del sustrato tuvo poco o ningún efecto (Fig. 39A y 39B; datos no mostrados).

Estos resultados muestran que los RNA de horquillas pequeñas pueden inducir silenciamiento de genes en células S2 de Drosophila con potencia similar a la de los siRNA (Fig. 39B). Sin embargo, en nuestra observación inicial de la interferencia de RNA en células S2 de Drosophila, advertimos una profunda dependencia de la eficiencia del silenciamiento de la longitud del dsRNA desencadenante (Hammond et al., 2000, Nature 404: 293-296). Realmente, los dsRNA de menos de ~200 nucleótidos silencian muy ineficientemente. El silenciamiento se inicia por una nucleasa de la familia de la RNasa III, Dicer, que procesa los dsRNA largos en siRNA de ~22 nucleótidos. De acuerdo con su potencia variable como iniciadores de silenciamiento, los dsRNA largos se procesan mucho más fácilmente que los RNA cortos por la enzima Dicer (Bernstein et al., 2001, Nature 409: 363-366). Por consiguiente analizamos si los shRNA fueron sustratos para la enzima Dicer.

Hemos advertido previamente que let-7 (Ketting et al., 2001, Genes & Dev. 15: 2654-2659) y otros miRNA (E. Bernstein, datos no publicados) son procesados por Dicer con una eficiencia inesperadamente alta en comparación con los dsRNA cortos que no tienen forma de horquilla. Similarmente, Dicer procesó eficientemente los shRNA que tienen como diana la luciferasa de luciérnaga, independientemente de si fueron diseñados para mimetizar un sustrato natural de Dicer (let-7) o si fueron simples estructuras con forma de horquilla (Fig. 39C). Esos datos sugieren los shRNA recombinantes pueden ser procesados por Dicer en siRNA y son concordantes con la idea de que estos agentes desencadenantes con forma de horquillas cortas silencian los genes por una vía de la RNAi.

B. Silenciamiento de genes activado por RNA cortos con forma de horquilla en células de mamíferos.

Las células de mamíferos contienen varios sistemas endógenos que fueron previstos para dificultar la aplicación de la RNAi. El principal entre estos es un proteína-quinasa activada por RNA (abreviadamente PKR), que efectúa una supresión general de la traducción vía fosforilación de EIF-2a (Williams 1997, Biochem. Soc. Trans. 25: 509-513; Gil et al., 2000, Apoptosis 5: 107-114). La activación de estas y otras vías sensibles al dsRNA, requiere generalmente dúplex que exceden de 30 pg en longitud, posiblemente para permitir la dimerización de la enzima sobre su activador alostérico (por ejemplo, Clarke et al., 1995, RNA 1: 7-20). Los RNA cortos que mimetizan los productos de Dicer, los siRNA, escapan presumiblemente de este límite y desencadenan un silenciamiento específico, en parte debido a su tamaño. Sin embargo, los RNA dúplex cortos que carecen de los aspectos de signatura de los siRNA pueden inducir eficientemente el silenciamiento en células S2, pero no en células de mamíferos (A.A. Caudy, datos no publicados). Los miRNA codificados endógenamente pueden escapar también de la vigilancia por la PKR debido a su tamaño, pero quizás también a causa de la discontinuidad de su estructura dúplex. Dado que los shRNA of <30 pb fueron inductores eficaces de la RNAi en células S2 de Drosophila, analizamos si estos RNA podían inducir también el silenciamiento específico de secuencias en células de mamíferos.

Se co-transfectaron células de riñón embrionarias humanas (HEK293T) con shRNA sintetizados químicamente y con una mezcla de plásmidos informadores de luciferasa de luciérnaga y de Renilla. Como habíamos observado en células S2, los shRNA fueron inductores eficaces del silenciamiento de genes. De nuevo una vez más, horquillas diseñadas para mimetizar let-7 fueron concordantemente menos eficaces que lo fueron los RNA con forma de horquilla sencillos, y la introducción de desapareamientos entre la cadena antisentido del shRNA y el mRNA diana suprimió el silenciamiento (Fig. 40A; datos no mostrados). Globalmente, los shRNA fueron agentes desencadenantes del silenciamiento algo menos potentes que lo fueron los siRNA. Mientras que los siRNA homólogos al de luciferasa de luciérnaga proporcionaron usualmente una supresión de la expresión de genes de ~90%-95%, los niveles de supresión conseguidos con los shRNA variaban de 80% a 90% por término medio. Como también observamos con los siRNA, el determinante más importante de la potencia del agente desencadenante del silenciamiento es su secuencia. Encontramos que aproximadamente 50% de tanto los siRNA como los shRNA son competentes para suprimir la expresión de genes. Sin embargo, ningún análisis de las estructuras predichas del mRNA diana ni ningún análisis estructuras alternativas en dúplex de siRNA u horquillas de shRNA ha demostrado un valor predictivo para elegir inhibidores eficaces de la expresión de genes.

Hemos adoptado como patrón, shRNA de dúplex que contienen 29 pb. Sin embargo, el tamaño de la hélice puede ser reducido hasta ~25 nucleótidos sin pérdida significativa de potencia. Los dúplex tan cortos como 22 pb pueden provocar todavía un silenciamiento detectable, pero lo hace menos eficientemente que lo hacen los dúplex largos. En ningún caso observamos una reducción en el informador de control interno (luciferasa de Renilla) lo que sería concordante con una inducción de respuestas al dsRNA no específicas.

La capacidad de los shRNA de inducir el silenciamiento de genes no estuvo confinada a las células 293T. También se obtuvieron resultados similares en una variedad de otras líneas celulares de mamíferos, incluyendo las células cancerosas humanas (HeLa), células epiteliales de monos transformadas (COS-1), fibroblastos de múridos (NIH 3T3), y fibroblastos humanos diploides (IMR90; Fig. 40; datos no mostrados).

C. Síntesis de inhibidores eficaces de la expresión de genes usando RNA-polimerasa de T7.

El uso de los siRNA para provocar el silenciamiento de genes está desarrollándose en una metodología estándar para investigar la función de los genes en células de mamíferos. Hasta la fecha, los siRNA han sido producidos exclusivamente por síntesis química (por ejemplo, Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 9742-9747; Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-498). Sin embargo, los costes asociados con este método son significativamente limitantes de su potencial utilidad como herramienta para investigar en paralelo las funciones de grandes números de genes. Los RNA con forma de horquillas cortas son procesados presumiblemente en siRNA activos in vivo por Dicer. Por tanto, estos pueden ser más tolerantes de estructuras terminales, tanto en lo que respecta a colgantes de nucleótidos como con respecto a extremos de fosfato. Por tanto analizamos si los shRNA podrían ser preparados por transcripción in vitro con RNA-polimerasa de T7.

Se prepararon por síntesis por DNA moldes de transcripción, que fueron predichos para generar siRNA y shRNA similares a los preparados por síntesis química de RNA (Fig. 41A, C). Estos fueron ensayados en cuanto a su eficacia tanto en células S2 (datos no mostrados) como en células 293 humanas (Fig. 41B, D). Globalmente, el comportamiento de la horquilla sintetizada por T7 o los siRNA igualaron estrechamente el comportamiento de la producida por síntesis química, tanto con respecto a la magnitud de la inhibición con respecto a la eficacia relativa de las secuencias diferentes. Debido a que la polimerasa de T7 prefiere iniciar en residuos de guanosina gemelos, sin embargo fue crítico considerar el contexto de iniciación cuando se diseñan siRNA transcritos in vitro (Fig. 41B). En contraste, los shRNA, que son procesados por Dicer (véase Fig. 39C), toleran la adición de estas bases en el extremo 5’ del transcrito.

Estudios en extractos de embriones de Drosophila indican que los siRNA poseen extremos 5’ fosforilados, concordantes con su producción por una nucleasa de la familia de la RNasa III. In vitro, este extremo 5’ es crítico para la inducción de RNAi por oligonucleótidos sintéticos de RNA (Elbashir et al., 2001, EMBO J. 20: 6877-6888; Nykanen et al., 2001, Cell 107: 309-321). Los siRNA químicamente sintetizados están no fosforilados y la adición enzimática de grupo fosfato en el extremo 5’ in vitro antes de la transfección no aumenta la potencia del efecto del silenciamiento (A.A. Caudy, datos no publicados). Esto sugiere que el requisito de extremos fosforilados es menos riguroso en células de mamíferos o que una quinasa fosforila eficientemente los siRNA in vivo. Los RNA sintetizados con RNApolimerasa de T7, sin embargo, poseen extremos 5’ trifosfato. Por tanto, exploramos la posibilidad de sintetizar siR-NA con polimerasa de T7 seguido por tratamiento in vitro con pirofosfatasa para modificar los extremos para asemejarse a los de los siRNA. Sorprendentemente, los siRNA monofosforilados (datos no mostrados) fueron tan potentes en inducir el silenciamiento de genes como los de productos de transcripción que llevan extremos trifosfatos (Fig. 41 B). Esto puede sugerir que el requisito de extremos monofosforilados sea menos exigente en células de mamíferos o que los siRNA se modifican in vivo para conseguir una estructura terminal apropiada.

Considerados juntos nuestros datos sugieren que tanto los dúplex de shRNA como los de siRNA pueden ser preparados por síntesis con RNA-polimerasa de T7 in vitro. Esto reduce significantemente el coste de RNAi en células de mamíferos y allana el camino para la aplicación de la RNAi a escala del genoma completo.

D. Transcripción de RNA cortos con forma de horquilla in vivo por RNA-polimerasa III.

Aunque los siRNA son una herramienta eficaz innegable para sondar la función de los genes en células de mamíferos, sus efectos supresores son por definición de duración limitada. La administración de los siRNA puede ser conseguida por un número de metodologías de transfección transitorias, y tanto la temporización de la supresión máxima como la recuperación de los niveles de proteínas pueden variar a medida que decae el silenciamiento tanto con el tipo de célula como con el gen diana. Por consiguiente, una limitación de los siRNA es el desarrollo de líneas celulares continuas en las cuales la expresión de una diana deseada esté establemente silenciada.

Los RNA con forma de horquillas, que consisten en estructuras dúplex largas, han sido demostrados como desencadenantes eficaces del silenciamiento estable de genes en plantas, in C. elegans, y en Drosophila (Kennerdell et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 896-898; Smith et al., 2000, Nature 407: 319-320; Tavernarakis et al., 2000, Nat. Genet. 24: 180-183). Recientemente hemos demostrado supresión estable de expresión de genes en células cultivadas de mamíferos por expresión continua de un RNA de horquilla larga (Paddison et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 1443-1448). Sin embargo, el alcance de este método estuvo limitado por la necesidad de expresar dichas horquillas solamente en células que carecen de una respuesta de PKR detectable. En principio los shRNA podrían sortear dichas limitaciones y proporcionar una herramienta para provocar supresión estable por RNA en células somáticas de mamíferos.

Para ensayar esta posibilidad, clonamos inicialmente secuencias que codifican un shRNA de luciferasa de luciérnaga en plásmidos de expresión basados en CMV. Esto fue predicho para generar un transcrito de RNA-polimerasa ll poliadenilado y provisto de caperuza (capped) en el cual la horquilla estaba extendida en ambos extremos 5' y 3’ por secuencias de vector y poli (A). Esta construcción fue completamente inerte en ensayos de silenciamiento en células 293T.

En el curso de nuestros estudios con shRNa sintetizados químicamente y por T7 D, advertimos que la presencia de extensiones monocatenarias significativas (en 5’ o 3’ del dúplex) reducía la eficacia de los shRNA. Por tanto exploramos el uso de estrategias alternativas de promotor en un esfuerzo para producir RNA con forma de horquillas más definidos. En particular, los promotores de RNA-polimerasa III tiene sitios de iniciación y terminación bien definidos y naturalmente producen una variedad especies de RNA cortas y estables. Aunque muchos promotores Pol III contienen elementos esenciales dentro de la región transcrita, limitando su utilidad para nuestros fines; los promotores de la clase III usan exclusivamente secuencias de promotores no transcritas. De estos, el promotor de snRNA U6 y el promotor RNA de H1 han sido bien estudiados (Lobo et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 2891-2899; Hannon et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 22796-22799; Chong et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 20727-20734).

Colocando un sitio de clonación conveniente inmediatamente detrás del promotor de snRNA U6, hemos construido pShh-1, un vector de expresión en el cual las horquillas cortas son aprovechadas para el silenciamiento de genes. En este vector cualquiera de las dos secuencias de shRNA derivadas de luciferasa de luciérnaga fueron clonadas a partir de oligonucleótidos sintéticos. Estos fueron co-transfectados con plásmidos de expresión de luciferasa de luciérnaga y de Renilla en células 293T. Uno de los dos shRNA codificados provocó el silenciamiento efectivo de luciferasa de luciérnaga sin alterar la expresión del control interno (Fig. 42C). El segundo shRNA codificado produjo también una represión detectable, aunque débil. En ambos casos, el silenciamiento fue dependiente de la inserción del shRNA en la orientación correcta con respecto al promotor (Fig. 42C; datos no mostrados). Aunque el shRNA propiamente dicho es simétrico bilateralmente, la inserción en la orientación incorrecta afectaría a la terminación de Pol III y se predice producir una horquilla con ambas extensiones monocatenarias en 5’ y 3’. Se obtuvieron resultados similares en cierto número de otras líneas celulares de mamíferos incluyendo HeLa, COS-1, NIH 3T3, y IMR90 (Fig. 42; datos no mostrados). Sin embargo, pShh1-Ff1 fue incapaz de efectuar la supresión del informador de luciferasa en células de Drosophila, en las cuales el promotor U6 humano es inactivo.

E. Se requiere Dicer para el silenciamiento de genes mediado por shRNA.

Como ensayo definitivo de si los shRNA codificados en plásmidos realizaron el silenciamiento de genes por la vía de la RNAi en mamíferos, determinamos la dependencia de la supresión en un componente esencial de la vía de la RNAi. Transfectamos pShh1- Ff1 junto con un siRNA homólogo a Dicer humana. La Figura 43 muestra que el tratamiento de células con siRNA de Dicer es capaz de deprimir completamente el silenciamiento inducido por pShh1Ff1. La adición de un siRNA no tratado no tuvo efecto en la magnitud de la supresión por pShh1-Ff1. Importante-mente, los siRNA de Dicer no tuvieron efecto sobre el silenciamiento inducido por siRNA de luciferasa de luciérnaga. Estos resultados son concordantes con los shRNA que operan por una vía de la RNAi similar a los provocados por stRNA y dsRNA largos. Además sugiere que el silenciamiento mediado por siRNA es menos sensible al empobrecimiento de la enzima Dicer.

F. Silenciamiento de genes mediado por shRNA estable de un gen endógeno.

La utilidad última de las horquillas cortas codificadas será la creación de mutantes estables que permitan el estudio de los fenotipos resultantes. Por tanto, ensayamos si podíamos crear un fenotipo celular a través de la supresión estable. La expresión de alelos activados del oncogén ras en fibroblastos embrionarios primarios de ratón (MEF) induce una detención del crecimiento estable que se asemeja, como fenotipo terminal, a la senescencia replicante (Serrano et al., 1997, Cell 88: 593-602). Las células cesan de dividirse y adoptan una morfología aplanada grande típica. La senescencia puede ser contrarrestada por mutaciones que inactivan la vía del supresor tumoral p53 (Serrano et al., 1997, supra). Como un ensayo de la capacidad de los shRNA codificados en vectores para suprimir establemente un gen celular endógeno generamos una horquilla que fue dirigida al gen p53 de ratón. Como se muestra en la Figura 44, los MEF transfectados con pBabeRasV12 fallaron en proliferar y mostrar una morfología de senescencia cuando se co-transfectaron con un vector de control vacío. Como se ha indicado previamente por Serrano et al., el estado terminalmente detenido se consigue en 100% de las células seleccionadas por fármaco en cultivo 8 días postransfección. Sin embargo, por co-transfección de una construcción de expresión de ras activada con pShh-p53, las células emergieron de una selección por fármaco que no solo falla en adoptar una morfología de senescencia, sino también en mantener la capacidad de proliferar durante un mínimo de varias semanas en cultivo (Fig. 44). Estos datos respaldan fuertemente que la expresión de construcciones de shRNA se puede usar para la creación de líneas continuas de células de mamíferos en las cuales los genes dianas seleccionados son suprimidos establemente.

G. La introducción simultánea de RNA con forma de horquillas múltiples no producen sinergia.

En un intento para comprender más los mecanismos mediante los cuales horquillas cortas suprimen la expresión de genes, examinamos los efectos de transfectar células con una mezcla de dos horquillas cortas diferentes correspondientes a luciferasa de luciérnaga. La Figura 45 resume los resultados de experimentos que sugieren que no hay efectos sinérgicos sobre la supresión de la expresión del gen de luciferasa de luciérnaga obtenida cuando las células se exponen a una mezcla de dichas horquillas cortas.

Métodos:

Cultivo de células. Se cultivaron células HEK 293T, HeLa, COS-1, MEF e IMR90 en DMEM (GIBCO BRL) suplementado suero de bovino fetal (FBS) al 10% inactivado por calor y solución de antibiótico/antimicótico al 1% (GIBCO BRL). Se cultivaron células NIH 3T3 en DMEM suplementado con suero de ternera al 10% inactivado con calor y solución de antibiótico/antimicótico al 1%.

Preparación de RNA. Se produjeron tanto shRNA como siRNA in vitro usando moldes de oligonucleótidos de DNA sintetizados químicamente (Sigma) y el kit Megashortscript de T7 (Ambion). Los moldes de transcripción fueron diseñados de tal modo que contenían secuencias del promotor de T7 en el extremo 5’. Los transcritos de shRNA sometidos a procesamiento por Dicer in vitro se sintetizaron usando un kit Riboprobe (Promega). Los RNA sintetizados químicamente se obtuvieron a partir de Dharmacon, Inc.

Ensayos de transfección y silenciamiento de genes. Se transfectaron células con las cantidades indicadas de de siRNA, shRNA y DNA de plásmidos usando métodos estándares de fosfato de calcio a 50%-70% de confluencia en placas de 6 pocillos. Se realizaron ensayos de luciferasa duales (Promega) co-transfectando células con plásmidos que contienen luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor SV40 (pGL3-Control, Promega) y luciferasa de Renilla bajo el control de la región potenciadora/promotora temprana de SV40 (pSV40, Promega). Los plásmidos fueron co-transfectados usando una relación 1:1 de pGL3-Control (250 ng/pocillo) a pRL-SV40. La RNAi en células S2 se realizó como se ha descrito previamente (Hammond et al., 2000, Nature 404: 293-296). Para un silenciamiento estable, se co-transfectaron MEF primarios (un obsequio de S. Lowe, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) usando Fugene 6 con pBabe-Ha-rasV12 y pShh-p53 (marcador de no resistencia), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La selección fue para la presencia del plásmido Ha-rasV12 activado, que lleva un marcador de resistencia a puromicina. El plásmido pShh-p53 estaba presente en exceso, como patrón en el experimento de cotransfección. Hemos generado ahora una versión del vector del promotor U6 (pSHAG-1) que es compatible con el sistema GATEWAY (Invitrogen), y este puede ser usado para transportar el casete de expresión del shRNA a una variedad de casetes receptores que llevan marcadores seleccionables enlazador por cis. Además, hemos validado la administración de shRNA usando vectores retrovirales. La información actualizada de plásmidos puede ser obtenida en http://www.cshl.org/public/science/hannon.html.

Plásmidos que expresan RNA con forma de horquillas. La región del promotor U6 a partir de -265 hasta +1 fue amplificada por PCR, añadiendo sitios 5’ KpnI y 3’ EcoRV para clonación en pB-S SK+. Un juego de oligonucleótidos enlazador/terminador que lleva la secuencia del terminador de U6 y los extremos enlazados de 5’ EcoRV y 3’ NotI fue clonado en la construcción del promotor, dando como resultado un casete U6 con un sitio EcoRV para la inserción de nuevas secuencias. Este vector ha sido denominado pShh1. Oligonucleótidos de DNA bicatenario con extremos romos que codifican shRNA con entre 19 y 29 bases de homología para la secuencia diana fueron ligados en el sitio EcoRV para producir construcciones de expresión. La secuencia de oligonucleótidos usada para la construcción Ff1 fue: TCCAATTCAGCGGGAGCCACCTGATGAAGCTTGATCGGGTGGCTCTCGCTGAGTTGGAATCCATTTTTTTT. Esta secuencia va precedida por la secuencia GGAT, que es suministrada por el vector, y contiene una extensión de más de cinco Ts como un terminador Pol III.

Ensayos Dicer in vitro. Los ensayos in vitro para la actividad de Dicer se realizaron como se ha descrito (Bernstein et al., 2001, Nature 409: 363-366).

Ejemplo 7: Función in vivo de las horquillas cortas codificadas

Un objeto de la presente invención es mejorar métodos para generar siRNA y horquillas cortas para uso en suprimir específicamente la expresión de genes. El ejemplo 6 demuestra que los siRNA y las horquillas cortas son altamente eficaces en suprimir específicamente la expresión de genes. Por consiguiente, sería ventajoso combinar la supresión eficiente de la expresión de genes conseguible usando horquillas cortas y siRNA con un método para codificar dicho RNA en u plásmido y expresarlo de modo transitorio o estable.

La Figura 46 demuestra que las horquillas cortas codificadas en un plásmido son eficaces en suprimir la expresión de genes in vivo. Se insertaron oligonucleótidos de DNA, que codifican horquillas de 29 nucleótidos correspondientes a luciferasa de luciérnaga, en un vector que contenía el promotor U6. Se examinaron tres construcciones independientes en cuanto a su capacidad de suprimir específicamente la expresión del gen de luciferasa de luciérnaga en células293T. siOligo1-2, siOligo1-6, y siOligo1-19 (construcción en la orientación correcta) cada una suprimió la expresión de genes tan eficazmente como la siRNA. Por el contrario siOligo1-10 (construcción en la orientación incorrecta) no suprimió la expresión de genes. Adicionalmente, una construcción independiente señalada como diana para una porción diferente del gen de la luciferasa de luciérnaga no suprimió eficazmente la expresión del gen en cualquier orientación (siOligo2-23, siOligo2-36).

Los resultados resumidos en la Figura 46 demuestran que la expresión transitoria de los siRNA y horquillas cortas codificadas en un plásmido pueden suprimir eficazmente la expresión de genes. Un experto en la técnica puede elegir entre una gama de vectores para expresar transitoria o establemente un siRNA u horquilla corta. En las Figuras 47-49 se presentan ejemplos no limitativos de vectores y estrategias para expresar establemente dsRNA cortos.

Ejemplo 8: Supresión por dsRNA en ausencia de una respuesta de PKR

Un impedimento potencial para el uso de la RNAi para suprimir la expresión de genes en algunos tipos de células es la respuesta no especifica de PKR que puede ser desencadenada por dsRNA largos. Numerosos virus de mamíferos han adquirido por evolución la capacidad de bloquear la PKR con el fin de ayudar a la infección de células hos

pedantes potenciales. Por ejemplo, los adenovirus expresan RNA que imitan a los dsRNA, pero no activan la respuesta de la PKR. El virus vaccinia usa dos estrategias para evadir la PKR: la expresión de E3L que se une y en

de la PKR.
ן mascara el dsRNA; la expresión de K3L imita al sustrato natural elF2

Nuestra comprensión de los mecanismos mediante los cuales los virus evitan la respuesta de la PKR nos permite diseñar métodos para evitar/sortear la respuesta de la PKR en tipos de células en los cuales podría ser ventajoso la supresión de la expresión de genes con dsRNA largos. Los método incluyen tratar las células con un agente que inhibe la apoptosis activada por RNA proteína-quinasa (PKR), tal como tratamiento con agentes que inhiben la expresión de PKR, causan su destrucción, y/o inhiben la actividad de la PKR. Por consiguiente, la supresión por RNAi de la expresión de genes en dichos tipos de células podría implicar primeramente inhibir la respuesta de PKR, y luego suministrar un dsRNA idéntico o similar a un gen diana.

A. En una línea celular de mioblastos de múridos, C2C12, advertimos que las células respondieron a dsRNA largos con una mezcla de respuestas específicas y no específicas (presumiblemente de PKR). Para atenuar la respuesta de PKR no específica mientras se mantiene la supresión robusta y específica debida a los dsRNA largos, las células C2C12 fueron transfectadas con un vector que dirige la expresión de K3L. Esta etapa adicional atenuó satisfacgtoriamente la respuesta de PKR, sin embargo la expresión de la proteína K3L no tuvo efecto sobre la magnitud de la inhibición específica.

B. Sin embargo, puesto que no había sido previamente demostrada la eficacia de dicho método de dos etapas, era posible anteriormente que la supresión por los dsRNA no sería posible en células con una respuesta de PKR. La Figura 50 resume los resultados que demuestran que dicho método de dos etapas es posible, y que la supresión mediada por dsRNA robusta y específica es posible en células que habían poseído anteriormente una respuesta de PKR robusta.

Expresado resumidamente, los ensayos de luciferasa dual fueron realizados como se ha descrito en detalle anteriormente. Los experimentos se llevaron a cabo usando PKR -/- MEF cosechados de embriones de ratón E13.5 PKR-/-. Los MEF tienen típicamente una respuesta de PKR robusta, y por tanto el tratamiento con dsRNA largos da como resultados una supresión no específica de expresión de genes y apoptosis. Sin embargo, en células PKR -/examinadas 12, 42, y 82 horas después de la transfección, la expresión de dsRNA de luciferasa de Renilla suprime específicamente la expresión de luciferasa de pensamiento de mar (Renilla reniformis). Esta supresión es estable en el tiempo.

Estos resultados demuestran que la respuesta de PKR no específica puede ser bloqueada sin afectar a la supresión de la expresión de genes mediada por dsRNA. Esto permite el uso de dsRNA largos para suprimir la expresión de genes en una gama diversa de tipos de células, incluyendo las que serían previamente intratables debido a las influencias desconcertantes de la respuesta de PKR no específica a los dsRNA largos.

Ejemplo 9: Supresión de la expresión de genes usando dsRNA que corresponde a secuencias no codificado-ras.

Los modelos actuales para los mecanismos por los que se efectúa la RNAi han sugerido que la construcción de dsRNA debe contener una secuencia codificadora correspondiente al gen de interés. Aunque hay pruebas que han demostrado que dicha secuencia codificadora no necesita tener un apareamiento perfecto con la secuencia endógena codificadora (es decir, puede ser similar), se ha mantenido ampliamente que la construcción de dsRNA debe corresponder a la secuencia codificadora. Nosotros presentamos pruebas que contradicen las enseñanzas de la técnica anterior, y demostramos que el dsRNA correspondiente a las regiones no codificadoras de un gen puede suprimir la función del gen in vivo. Estos resultados son significativos no sólo porque demuestran que el dsRNA idéntico o no similar a las secuencias no codificadoras (es decir, las secuencias de promotores, las secuencias de potenciadores o las secuencias intrónicas) pueden mediar la supresión, sino también porque demostramos la supresión in vivo de la expresión de genes que usan una tecnología de dsRNA en un modelo de ratón.

Generamos RNA bicatenario correspondiente a cuatro segmentos del promotor del gen de la tirosinasa de ratón. Tres de estos segmentos corresponden al promotor próximo y uno corresponde a un potenciador (Fig. 51). El gen de la tirosinasa codifica la enzima limitante de la velocidad implicada en la vía biosintética de la melanina (Bilodeau et al., (2001) Pigment Cell Research 14: 328-336). Por consiguiente, se espera que la supresión del gen de la tirosinasa inhiba la pigmentación.

El RNA bicatenario correspondiente a cada uno de los segmentos de promotores anteriores fue inyectado en los pronúcleos de huevos fertilizados. Los cachorros nacieron después de 19 días. En total 42/136 (31%) de los embriones llegaron a su madurez como animales. Este número está dentro del intervalo esperado para la transgénesis (3040%). Dos cachorros de 42 (5%) aparecieron totalmente sin pigmentar en el nacimiento, lo que es concordante con la supresión de la función de la tirosinasa.

Métodos:

dsRNA procedente de la región promotora no codificante del gen de la tirosinasa. Se amplificaron por PCR cuatro segmentos del promotor del gen de la tirosinasa usando cebadores que incorporaban promotores de la RNApolimerasa de T7 en los productos de PCR (mostrados en letra negrita - Fig. 51). Las secuencias de las regiones que flanquean el extremo 5’ del gen de la tirosinasa de ratón se obtuvieron de GenBank (número de acceso D00439 y X51743). La secuencia del potenciador de la tirosinasa, localizado aproximadamente 12 kb en dirección 5’ del sitio de comienzo de la transcripción, se obtuvo también de GenBank (número de acceso X76647).

Las secuencias de los cebadores usados fueron como sigue: adviértase que la secuencia del promotor de la RNApolimerasa de T7 se muestra en negrita.

(a) Potenciador de tirosinasa (~12 kb hacia el extremo 5’):

5’ TAATACGACTCACTATAGGGCAAGGTCATAGTTCCTGCCAGCTG 3’

5’ TAATACGACTCACTATAGGGCAGATATTTTCTTACCACCCACCC 3’

(b) -1404 a -1007:

5’ TAATACGACTCACTATAGGGTTAAGTTTAACAGGAGAAGCTGGA 3’

5’ TAATACGACTCACTATAGGGAAATCATTGCTTTCCTGATAATGC 3’

(c) -1003 a -506:

5’ TAATACGACTCACTATAGGGTAGATTTCCGCAGCCCCAGTGTTC 3’

5’ TAATACGACTCACTATAGGGGTTGCCTCTCATTTTTCCTTGATT 3’

(d) -505 a -85:

5’ TAATACGACTCACTATAGGGTATTTTAGACTGATTACTTTTATAA 3’

5’ TAATACGACTCACTATAGGGTCACATGTTTTGGCTAAGACCTAT 3’

Los productos de la PCR fueron purificados en gel a partir de geles de TAE al 1%-agarosa usando el kit de extracción de gel QiaExII (Qiagen). El RNA bicatenario se produjo a partir de estos moldes usando el kit T7Megashortscript (Ambion). Las enzimas y los nucleótidos no incorporados se eliminaron usando el kit de purificación por PCR Qiaquick MinElute. El RNA fue extraído por fenol/cloroformo dos veces, y se precipitó en etanol. Los sedimentos se volvieron a suspender en tampón de inyección ((Tris 10 mM (pH 7,5), EDTA 0,15 nM (pH 8,0)) a una concentración de 20 ng/ul y se hicieron correr en un gel de TAE al 1%-agarosa para confirmar la integridad.

Generación de ratones: Una mezcla igual de RNA bicatenario de cada uno de los dos conjuntos de promotores anteriores se inyectó en los pronúcleos de huevos fertilizados de ratones C57BL6J. Se realizaron un total de 136 inyecciones y se implantaron 34 embriones en cada una de 4 hembras seudopreñadas CD-1. Los cachorros nacieron después de 19 días. En total, 42/136 (31%) de los embriones llegaron a su madurez adulta. 2/42 cachorros (5%) nacieron totalmente sin pigmentar.

No está claro si la RNAi mediada por dsRNA idéntico o similar a la secuencia no codificadora funciona por el mismo mecanismo que el PTGS observado en presencia de dsRNA idéntico o similar a la secuencia codificadora. Sin embargo, si estos resultados revelan finalmente mecanismos similares o diferentes no disminuyen la tremenda utilidad de las composiciones y los métodos de la presente invención para suprimir la expresión de uno o más genes in vitro

o in vivo.

La presente invención demuestra que el dsRNA cuya longitud varía de 20 a 500 nucleótidos puede suprimir fácilmente la expresión de genes dianas tanto in vitro como o in vivo. Además, la presente invención demuestra que los dsRNA pueden ser generados usando una variedad de métodos incluyendo la formación de horquillas, y que estos dsRNA pueden ser expresados estable o transitoriamente. Finalmente, la presente invención demuestra que el dsRNA idéntico o similar a secuencias no codificadoras puede suprimir la expresión de genes dianas.

Ejemplo 10: Interferencia de RNA en ratones adultos

La interferencia de RNA es un mecanismo de supervivencia conservado en el curso de la evolución que responde al RNA bicatenario por silenciamiento específico de secuencia de genes homólogos. En este texto mostramos que la transexpresión de genes puede ser suprimida en ratones adultos por RNA de interferencia cortos sintéticos y por RNA cortos con forma de horquillas transcritos in vivo a partir de moldes de DNA. También mostramos el potencial terapéutico de esta técnica demostrando la selección como diana de una secuencia del virus de la hepatitis C por interferencia de RNA in vivo.

Los RNA de interferencia cortos (siRNA) mimetizan compuestos intermedios en la vía de interferencia por (RNAi) y pueden silenciar genes en células somáticas sin activar la supresión no específica por proteína-quinasa dependiente de RNA bicatenario (Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-498). Para investigar si los siRNA inhiben también la expresión de genes in vivo, usamos una modificación de los métodos de transfección hidrodinámica (Zhang et al., 1999, Hum. Gene Therapy 10: 1735-1737; Liu et al., 1999, Gene Therapy 6: 1258-1266; Chang et al., 2001, J. Virol.

75: 3469-3473) para administrar siRNA sin cubierta de proteína (naked) a hígados de ratones adultos. Un siRNA derivado de luciferasa de luciérnaga o siRNA no relacionado se co-inyectó con plásmidos de expresión de luciferasa (para la descripción de su construcción y secuencias, véase la Figura 52). Monitorizamos la expresión de luciferasa en animales vivos usando formación cuantitativa de imágenes del cuerpo completo (Contag, et al., 1997, Photochem. Photobiol. 66: 523-531) (véanse las Figuras 53a, 54a), y encontramos que era dependiente de la dosis del plásmido informador.

-1 antitripsina (hAAT) humano co-inyectado (Yant et
ן En cada experimento, las medidas en suero de plásmidode

al., 2000, Nature Genet. 25: 35-41) sirvió para normalizar la eficiencia de la transfección y monitorizar la inhibición traduccional no específica. Las concentraciones medias en suero de hAAT después de 74 horas fueron similares en todos los grupos.

Nuestros resultados indican que hubo inhibición, mediada por siRNA, de expresión de luciferasa expresión en ratones adultos (P < 0,0115) y que los siRNA no relacionados no tuvieron efecto (P < 0,864; Figuras 53a, 53b). En 11 experimentos independientes, los siRNA de luciferasa redujeron la expresión de luciferasa (como se deduce por la luz emitida) en un valor medio de 81% (± 2,2%). Estos hallazgos indican que la RNAi puede sub-regular la expresión de genes en ratones adultos.

A medida que la RNAi degrada los RNA del virus sincitial respiratorio en cultivo (Bitko et al., 2001, BMC Microbiol. 1: 34) investigamos si la RNAi podía ser dirigida contra un RNA patógeno humano expresado en un ratón, es decir el del virus de la hepatitis C (HCV). La infección por HCV (un virus de RNA que infecta a 1 de cada 40 personas de la población mundial) es la razón más común para el trasplante de hígado en Estados Unidos y Europa. Fusionamos la región NS5B (proteína no estructural 5B, región codificadora de la polimerasa viral) del virus con RNA luciferasa y monitorizamos la RNAi por co-transfección in vivo. Una siRNA que se dirige a la región NS5B redujo la expresión de luciferasa de la fusión proteína NS5B del HCV-luciferasa en 75 % (± 6,8 %; 6 animales por grupo). Este resultado sugiere que puede ser factible usar la RNAi como una terapia contra otros agentes patógenos humanos importantes.

Aunque nuestros resultados muestran que los siRNA son funcionales en ratones, sigue siendo un obstáculo su administración. A diferencia de los siRNAs, los RNA de horquillas cortas funcionales (shRNA) pueden ser expresados in vivo a partir de moldes de DNA usando promotores de RNA-polimerasa lll (Paddison et al., 2002, Genes Dev. 16:948-958; Tuschl 2002, Nature Biotechnol. 20:446-448); son tan eficaces como los siRNA en inducir la supresión de genes. La expresión de un RNA (p-Shh1-Ff1) similar inhibió la expresión de luciferasa en hasta 98 % (± 0,6 %), con una supresión media de 92,8 % (± 3,39 %) en tres experimentos independientes (véanse las Figuras 54a, 54b). Un vector de expresión de shRNA vacío no tuvo efecto; invertir la orientación del inserto de shRNA (pShh1-Ff1 rev) impide el silenciamiento de genes porque altera la terminación por la RNA-polimerasa lll y genera un shRNA estructurado inapropiadamente. Estos hallazgos indican que los shRNA codificados en plásmidos pueden inducir una respuesta de RNAi potente y específica en ratones adultos.

La RANi puede encontrar aplicación en genómica funcional o en identificar dianas para el diseñador de fármacos. Es un sistema más prometedor que el de los ratones con genes desactivados porque grupos de genes se pueden volver simultáneamente ineficaces sin necesidad de cruces que consumen mucho tiempo. La terapia de genes usualmente depende de la expresión ectópica de proteínas exógenas; sin embargo, la RNAi puede complementar finalmente este enfoque de la ganancia de función por genes relacionados con enfermedades por silenciamiento con construcciones de DNA que dirigen la expresión de los shRNA. Nuestro método de administración de RNAi podría ser adaptado para aprovecharse de vectores de transferencia de genes virales y no virales en un contexto clínico.

Ejemplo 11: Transmisión de líneas germinales de RNAi en ratones

Las moléculas de microRNA (miRNA) son moléculas de RNA no codificadoras pequeñas que se han encontrado en una colección diversa de eucariotas, incluyendo mamíferos. Los precursores de los miRNA comparten una estructura característica secundaria, formando RNA cortos con forma de horquillas. Estudios genéticos y bioquímicos han indicado que los miRNA se procesan a sus formas maduras por Dicer que es una nucleasa de la de las RNAsa lll y funcionan a través de interferencia mediada por RNA (RNAi) y vías relacionadas para regular la expresión de genes dianas (Hannon 2002, Nature 418: 244-251; Pasquinelli et al., 2002, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 18:495-513). Recientemente, nosotros y otros colegas hemos remodelado los miRNA para permitir la manipulación experimental de la expresión de genes en células de mamíferos y hemos denominado a estos desencadenadores sintéticos del silenciamiento ''RNA cortos con forma de horquillas'' (shRNA) (Paddison et al., 2002, Cancer Cell 2: 17-23). El silencia-miento por los shRNA requiere la maquinaria de la RNAi y está co-relacionado con la producción de RNA de interferencia cortos (siRNA), que son una firma o rúbrica de la RNAi.

La expresión de los shRNA puede producir un silenciamiento transitorio o estable, dependiendo de si el casete de expresión está integrado el genoma de la célula cultivada receptora (Paddison et al., 2002, Cancer Cell 2:17-23). Los vectores de expresión de los shRNA inducen también el silenciamiento de genes en ratones adultos tras la administración transitoria (Lewis et al., 2002, Nat. Genet. 32: 107-108; McCaffrey et al., 2002, Nature 418: 38-39). Sin embargo, para que los shRNA sean una herramienta genética viable en ratones, es esencial la manipulación estable de la expresión de genes. Hemann y colegas han demostrado que la supresión a largo plazo de la expresión de genes in vivo tras la administración retroviral de casetes de expresión de shRNA a células madre hematopoyéticas (Hemann et al., 2003, Nat. Genet. en prensa). En la invención buscamos analizar si los casetes de expresión de shRNA que fueron pasados a través de la línea germinal de ratón podrían hacer valer el silenciamiento heredable de genes.

Empezamos adoptando métodos de transgénesis estándares (Gordon et al., 1993, Methods Enzymol. 225: 747-771) usando shRNA dirigidos contra una variedad de dianas con fenotipos esperados, incluyendo los genes que codifican tirosinasa (albino), miosina VIIa (cubilete), Bmp-5 (orejas arrugadas), Hox a-10 (defectos límbicos), homogentisato1,2,-dioxigenasa (la orina se vuelve negra por exposición al aire), sin pelo (pérdida de pelo) y receptor 1 de melanocortina (amarillo). Tres construcciones por gen fueron linealizadas e inyectadas en pronúcleos para producir animales fundadores transgénicos. Aunque advertimos la presencia del transgen en algunos animales, virtualmente ninguno mostró un fenotipo definido o reproducible, lo que era de esperar para un alelo hipomórfico del gen diana.

Por tanto, decidimos adoptar otro método: verificando la presencia de shRNA y su actividad hacia un gen diana en células madre embrionarias (ES) cultivadas y luego nos preguntamos si aquellas células retenían la supresión en un animal quimérico in vivo. También planeamos analizar si dichas células podían pasar una construcción inductora de la RNAi a través de líneas germinales de ratón. Para estos estudios, elegimos examinar un nuevo gen, Neill, que se propone que tiene un papel en la reparación del DNA. Los daños por oxidación dan cuenta der 10.000 lesiones de DNA por célula por día en seres humanos y se piensa que contribuyen a la carcinogénesis, el envejecimiento y el daño de tejidos que sigue a la isquemia (Ames et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7915-7922; Jackson et al., 2001, Mutat. Res. 477: 7-21). El daño de DNA por oxidación incluye sitios que no son bases, roturas de cadenas, y al menos 20 bases oxidadas, muchos de los cuales son citotóxicos o pro-mutagénos (Dizdaroglu et al., 2002, Free Radic. Biol. Med. 32: 1102-1115). La DNA-N-glicosilasas inician la vía de reparación por escisión de bases, reconociendo bases específicas en el DNA y escindiendo el enlace azúcar-base para liberar la base dañada (David et al., 1998, Chem. Rev. 98: 1221-1262).

Los genes Neil son una nueva familia de genes recientemente descubierta de DNA-N-glicosilasas de mamíferos relacionada con la familia de proteínas Fpg/Nei de Escherichia coli (Hazra et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

99: 3523-3528; Bandaru et al., 2002, DNA Repair 1: 517-529). Neil1 reconoce y elimina del DNA un amplio espectro de pirimidinas oxidadas y purinas con el anillo abierto, incluyendo timina-glicol (Tg), 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidin (FapyG) y 4,6-diamino-5- formidopirimidina (FapyA). Tg, FapyG y FapyA están entre las bases oxidadas más prevalentes producidas por radiación ionizante (Dizdaroglu et al., 2002, Free Radic. Biol. Med. 32: 1102-1115) y puede bloquear DNA-polimerasas replicantes, lo cual a su vez puede producir la muerte de la célula (Asagoshi et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 14589-14597; Clark et al., 1989, Biochemistry 28: 775-779).

Las glicolasas Nth1 y Ogg1 cada una elimina subconjuntos de bases oxidadas del DNA que se solapan con sustratos de Neil1 (Nishimura 2002, Free Radic. Biol. Med. 32: 813-821; Asagoshi et al., 2000, Biochemistry 39: 1138911398; Dizdaroglu et al., 1999, Biochemistry 38: 243-246). Sin embargo, ratones con ninguna mutación en Nth1 (Ocampo et al., 2002, Mol. Cell. Biol. 22: 6111-6121; Takao et al., 2002, EMBO J. 21: 3486-3493) u Ogg1 (Klungland et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 13300-13305; Minowa et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 41564161) son viables, planteando la posibilidad de que la actividad de Neil 1 atenúe la pérdida de Nth1 o Ogg1. Recientemente, una actividad de Tg-DNA glicosilasa residual en ratones Nth1-/-ha sido identificada como Neil1 (Takao et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 42205-42213).

Construimos un vector de shRNA sencillo que se dirige a una secuencia próxima al extremo 5’ de la región codificadora de Neill. Este vector fue introducido en células madre embrionarias de ratón por electroporación, y los integrantes individuales estables se analizaron para la expresión de la proteína Neil 1 (véase el enlace de Internet: http: //www.cshl.edu/public/SCIENCE/hannon.html para métodos detallados). La mayoría de las líneas celulares mostró una reducción de -80% en la proteína Neil1, lo cual está correlacionado con un cambio similar en los niveles de

5 mRNA de Neill. Estas células mostraron un incremento de aproximadamente dos veces en su sensibilidad a la radiación ionizante, concordante con un papel o función para Neil1 en la reparación de DNA. Dos líneas celulares ES independientes se inyectaron en blastocistos BL/ 6, y se obtuvieron varias quimeras en un alto porcentaje. Estas quimeras fueron criadas con cruces entre ellas, y la transmisión de líneas germinales de la construcción de expresión de shRNA fue advertida en numerosas progenies F1 (13/27 para una línea y 12/26 para la otra).

10 Para determinar si el silenciamiento de Neill que ha sido observado en células ES fue transmitido fielmente examinamos el mRNA de Neill y los niveles de proteína. Ambos fueron reducidos aproximadamente en la misma extensión que se había observado en las células ES manipuladas (Figuras 55, 56). Concordante con haber ocurrido esto por la vía de la RNAi, detectamos la presencia de siRNA correspondientes a la secuencia de los shRNA en los animales F1 que llevan el vector de expresión de shRNA, pero no en los que carecen de dicho vector (Fig. 56b).

15 Los datos antes mencionados demuestran que los shRNA se pueden usar para crear líneas germinales de ratones transgénicos en las cuales la RNAi ha silenciado un gen diana. Estas observaciones abren la puerta a usar la RNAi como un complemento a las metodologías estándares de desactivación de genes y proporcionan un medio para determinar rápidamente las consecuencias de suprimir un gen de interés en un animal vivo. Acoplados con los promotores U6 dependientes de activador el uso de los shRNA proporcionará finalmente métodos para la supresión

20 específica de tejidos, inducible y reversible de la expresión de genes en ratones.

V. Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de deducir, usando simplemente experimentación, usual, muchas equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria. Se pretende que dichas equivalentes estén abarcadas por las reivindicaciones siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método introducir en la célula de mamífero in vitro, un vector de expresión que se integra cromosómicamente que comprende una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA se expresa en la célula de mamífero y comprende una región bicatenaria de una longitud de entre 20 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con los cual se atenúa la expresión del gen diana.
2.

El método de la reivindicación 1, en donde el shRNA se expresa establemente en la célula de mamífero.
3.

El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el vector de expresión comprende además una secuencia regula-dora de la transcripción unida operativamente a la secuencia que codifica el shRNA.
4.

El método de la reivindicación 1, en donde la región bicatenaria tiene una longitud de al menos 21 o 22 nucleótidos.
5.

El método de la reivindicación 1, en donde la región bicatenaria tiene una longitud de al menos 25 nucleótidos.
6.

El método de la reivindicación 1, en donde la región bicatenaria tiene una longitud de 29 nucleótidos.
7.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la expresión del gen diana es atenuada en al menos 10 veces con respecto a una célula no tratada o una célula tratada con una construcción de dsRNA que no corresponde al gen diana.
8.

Un vector de expresión que se integra cromosómicamente para uso en un método de atenuar la expresión de un gen diana en un célula de mamífero, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende una región bicatenaria que tiene una longitud de entre 20 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana.
9.

Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8, para atenuar la expresión de un gen diana en una célula de mamífero in vivo.
10.

Uso de un vector de expresión que se integra cromosómicamente para la fabricación de un medicamento para uso en terapia, comprendiendo el vector de expresión una secuencia que codifica un RNA corto con forma de horquilla (shRNA), en donde el shRNA comprende un región bicatenaria que tiene una longitud entre 20 y 29 pares de bases, comprendiendo la región bicatenaria una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una región codificadora del gen diana, con lo cual se atenúa la expresión del gen diana.