ES2368556T3

ES2368556T3 - Proteína implicada en la restauración de la fertilidad a partir de la esterilidad masculina citoplasmática y gen que la codifica.

Info

Publication number: ES2368556T3
Application number: ES02720587T
Authority: ES
Inventors: Jun Imamura; Hideya Fujimoto; Ritsuko Yanagidate; Nobuya Koizuka; Takako Sakai; Takahiko Hayakawa
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2011-11-18
Anticipated expiration: 2022-04-24

Abstract

ADN aislado que codifica una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en una planta que presenta esterilidad masculina citoplasmática, seleccionado de entre el grupo constituido por: (1) un ADN aislado que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3; (2) un ADN aislado que presenta una homología 90% o superior con respecto a una secuencia de ADN que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3; (3) un ADN aislado que presenta una homología de 90% con la secuencia de ADN de SEC ID nº:2.

Description

Proteína implicada en la restauración de la fertilidad a partir de la esterilidad masculina citoplasmática y gen que la codifica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un gen implicado en la restauración de la fertilidad en caso de esterilidad masculina citoplasmática. Más específicamente, la presente invención se refiere al gen implicado en la reversión de la característica de esterilidad masculina citoplasmática (en adelante, abreviada a veces como emc), que se utiliza para el desarrollo de una variedad de cultivo de un híbrido de primera generación filial (en adelante, abreviado como F1), así como a un vector y a un transformante que contienen dicho gen.

Antecedentes de la técnica

En cuanto a cultivos tales como cultivos de cereales y hortalizas, las variedades F1 se están desarrollando activamente con características tales como: 1) un carácter genético agrícola excelentemente mejorado por heterosis, 2) una calidad homogénea de las cosechas, y 3) protección del derecho de obtentor sobre la base de la segregación de caracteres genéticos en la siguiente generación. De hecho, las variedades F1 de muchos de los principales cultivos se han pasado a utilizar en la práctica.

Un procedimiento para la producción de semillas de una variedad F1 resulta ejemplificado por un sistema de producción de semillas emc/Rf que comprende una línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática (emc) y una línea restauradora de la fertilidad (en adelante, abreviada a veces como Rf) en una variedad que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Por ejemplo, el procedimiento ha sido desarrollado para cereales tales como arroz, sorgo y maíz, y para una oleaginosa tal como el girasol. Estos métodos han sido desarrollados utilizando una técnica de reproducción o fusión celular.

Para las brasicáceas, está muy extendido el sistema de producción de semillas F1 mediante la aplicación de autoincompatibilidad. Sin embargo, para la colza que muestra una autoincompatibilidad inestable, el sistema para la producción de semillas F1 requiere la utilización de la línea emc y la línea Rf.

Por el contrario, en los últimos años se ha llevado a cabo un estudio para la utilización de una línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática derivada de rábano Kosena (Kosena emc) y una línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática derivada de rábano Ogura (Ogura emc) para la colza. Ambos genes emc están codificados en un genoma de la mitocondria, que es un orgánulo citoplasmático, y sus secuencias de nucleótidos son conocidas. Sin embargo, no se ha llevado a cabo ningún estudio de biología molecular utilizando rábano y, por lo tanto, apenas se conocen los marcadores necesarios para el aislamiento de los genes. En consecuencia, el aislamiento del gen a partir de un núcleo resulta complicado. Por lo tanto, la introducción del gen Rf sólo se ha logrado para la colza mediante la aplicación de cruces intergenéricos o enfoques de fusión celular a una línea de rábano, en la cual se ha restaurado la fertilidad.

Además, para el gen Rf, 1 o más genes restauradores están presentes de acuerdo con cada línea emc de diferentes especies de plantas. Para el rábano, la presencia del gen Rf1 y del gen Rf2 es necesaria para la restauración de la fertilidad. Además, es conocido que el gen Rf1 reduce notablemente la acumulación de proteína ORF125 (M. Iwabuchi et al, Plant Mol. Biol., 39: 183-188, 1999) en la mitocondria, conocida como proteína asociada a la emc del rábano (Jpn. J. Breeding 47 (volumen independiente 1): p. 186. 1997 y Jpn. J. Breeding 48 (volumen independiente 1): p. 197. 1998.)

En la colza, también se ha puesto de manifiesto por análisis genético que el gen Rf1 de rábano introducido por cruces intergenéricos o fusión celular reduce la acumulación de las proteínas ORF125 u ORF138 (M. Grelon y otros, Mol. Gen. Genet. 243: 540-547), conocidas como proteínas asociadas a la emc, y que la reducción de la acumulación de dichas proteínas ORF125 u ORF138 coincide perfectamente con el fenómeno de la restauración de la fertilidad (N. Koizuka y otros, Theor. Appl. Genet. 100: 949-955. 2000). La restauración de la fertilidad de la línea masculina estéril de colza requiere la reducción de la acumulación de las proteínas ORF125 u ORF138. Para ello, el gen Rf1 es un gen importante.

Sin embargo, en relación con una secuencia de nucleótidos de los genes Rf, sólo se ha identificado y aislado el gen Rf2, que es un gen restaurador de un citoplasma T del maíz emc. Pero no se ha dado a conocer ninguna secuencia de nucleótidos de genes Rf de otras especies vegetales.

Descripción de la invención

Se ha puesto de manifiesto que la línea restauradora de la colza en la que se ha introducido un gen Rf1 derivado de rábano Ogura por hibridación intergenérica o fusión celular, y la variedad F1 creada mediante la utilización de la línea como línea parental con polen, muestra un contenido más elevado de glucosinolatos (en adelante abreviados como GSL) con respecto al valor habitual, lo que supone un problema práctico. Esto puede ser debido a que el gen derivado de rábano que participa en la biosíntesis de los GSL está presente alrededor del gen Rf1, estableciéndose un estrecho enlace genético y, en consecuencia, el contenido de GSL de la línea restauradora de la colza (línea Rf) aumenta. Es conocido que los GSL están presentes en los desechos de colza y que, cuando se administran a un animal como alimento, afectan a la glándula tiroides. En consecuencia, el contenido de GSL de una semilla de colza en una etapa de reproducción está limitado a 18 µmol/g o menor en Norteamérica y a 20 µmol/g o menor en Europa.

Por otra parte, en los últimos años se ha desarrollado activamente una planta a la que se ha añadido una función tal como tolerancia a herbicidas mediante recombinación génica. Para la creación eficiente de estas plantas, la presencia únicamente de la línea restauradora de la colza producida por reproducción o fusión celular es insuficiente, de manera que se desea el aislamiento del gen Rf, particularmente del gen Rf1 derivado de rábano.

Por lo tanto, uno de los problemas que pretende resolver la presente invención consiste en aislar genes Rf, particularmente el gen Rf1 derivado de rábano, y determinar su estructura. Otro problema que pretende resolver la presente invención consiste en proporcionar unos medios para establecer la línea restauradora de la colza utilizando el gen Rf aislado.

Como resultado del estudio exhaustivo llevado a cabo a fin de solucionar los problemas anteriores, se ha conseguido la clonación de genes Rf1 derivados de la colza y el rábano, solucionando de este modo dichos problemas.

Así, la presente invención da a conocer una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC ID nº: 3. Además, se describe una proteína que tiene 14 o más motivos de repetición de pentatricopéptidos (en adelante, abreviado a veces como PPR), en la que un grupo de dichos motivos se divide en 3 o más bloques, presentando cada uno de los bloques individuales, como mínimo, 2 o más motivos PPR, y presentando el bloque del extremo carboxilo (C-terminal) 4 motivos PPR.

También se describe:

la proteína en la que el número de motivos PPR está comprendido entre 14 y 16;

la proteína en la que el grupo de motivos PPR se divide en 3 bloques y cada bloque tiene 5, 7 y 4 motivos PPR empezando desde el extremo amino (N-terminal);

la proteína en la que el cuarto aminoácido situado en un segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal) es un aminoácido distinto de serina, treonina y cisteína;

la proteína en la que el cuarto aminoácido situado en un segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal) es cualquiera de entre asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico o histidina; y

la proteína que tiene además una secuencia de péptido señal para translocar a una mitocondria en el extremo terminal o tiene una secuencia de -LysAspGluLeu-en el extremo carboxilo.

Además, se describe una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, lo que provoca un cambio en la movilidad electroforética de un producto de transcripción después de ponerse en contacto con el producto de transcripción de un gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática.

Además, se describe una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 26;

una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 27;

una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 28, y

una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, la cual tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 29.

Se describe también cualquiera de las siguientes proteínas:

(1): una proteína que presenta una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 17, o una secuencia correspondiente a los aminoácidos 82º a 690º de la secuencia de

aminoácidos SEC ID nº: 19; o

(2): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos en la que 1 o varios aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, la secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 17, o la secuencia correspondiente a los aminoácidos 82º a 690º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 19, y está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

Se describe también cualquiera de las siguientes proteínas:

(1): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 17 o SEC ID nº: 19; o

(2): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos en la que 1 o varios aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, SEC ID nº: 17, o SEC ID nº: 19, y está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

Preferentemente, en la presente invención, el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática tiene un gen de esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o rábano Ogura o un homólogo de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un ADN que codifica la proteína según la presente invención, descrita anteriormente.

También se describe:

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 22;

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 23;

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 24; y

un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 25.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer:

(1): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2. También se describe un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18; o

(2): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o

(3): un ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, y SEC ID nº: 18 en condiciones estrictas y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

Se describe también cualquiera de los siguientes ADN:

(1): un ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o

(2): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o

(3): un ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

(1): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1. También se describe un ADN que presenta

una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o

(2): un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o

(3): un ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer: Preferentemente, en la presente invención, el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática tiene un gen de esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o rábano Ogura o un homólogo de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un vector que contiene ADN según la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un transformante que presenta ADN según la presente invención o un vector según la presente invención. Preferentemente, dicho transformante es una planta transformada.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un procedimiento para la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática en el que se utiliza ADN según la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un transformante con un gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática, en el que se introduce una longitud parcial o total de ADN según la presente invención con un promotor de tipo inducción a una célula que presenta ADN según la presente invención, de tal modo que el transformante puede regular la expresión del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática.

Otro aspecto de la presente invención da a conocer un procedimiento para mantener la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática utilizando el transformante descrito anteriormente.

Además, se describe un procedimiento para la detección de un gen involucrado en la reversión de la esterilidad masculina citoplásmica, en el que se utiliza un cebador oligonucleótido con entre 15 y 50 unidades libremente diseñado a partir del ADN según la presente invención o una sonda con por lo menos 15 oligonucleótidos que consiste en la totalidad o una parte del ADN anterior según la presente invención, y en el que se confirma que la cantidad de la secuencia de nucleótidos amplificada por el cebador o la cantidad de la secuencia de nucleótidos detectada por la sonda en el organismo de muestra de interés es de 1 gen o más en 1 genoma.

Se describe además un ADN promotor que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 5091º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 1º a 811º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un mapa genético del marcador Rf.

La figura 2 representa una vista esquemática de la estructura de un clon lambda CHI portador de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1.

La figura 3 representa un resultado de la detección de un ADN introducido en un transformante mediante el método PCR:

Carril 1: vector de control; Carril 2: colza transformada; Carril 3: colza con esterilidad masculina citoplasmática,

a: 3186 pb a 3753 pb, longitud: 568 pb,

b: 4869 pb a 5112 pb, longitud: 244 pb,

c: 7766 pb a 8250 pb, longitud: 485 pb.

La figura 4 representa el resultado del análisis transferencia Western de la reducción de la acumulación de ORF125, que es una proteína emc, en el transformante:

Carril 1: colza con esterilidad masculina citoplasmática -1-15 µg;

Carril 2: colza con fertilidad restaurada 15 µg;

Carril 3: colza con esterilidad masculina citoplasmática -2-15 µg; Carriles 4 a 7: colza con esterilidad masculina citoplasmática -2 -, Serie de dilución: 15/2 µg, 15/4 µg, 15/8 µgy 15/16 µg;

Carril 8: colza transformada 15 µg.

La figura 5 representa el resultado de la observación microscópica de granos de polen extraídos de una planta florecida de colza transformada.

La figura 6 representa la secuencia de nucleótidos de pSTV125-5’ #LA6 y pSTV125-5’ #LA12.

Mejor modo de poner en práctica la invención

Las formas de realización de la presente invención se describen con mayor detalle a continuación.

(1) Formas de realización de la proteína según la presente invención

La proteína según la presente invención se refiere a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3.

En la presente memoria, el motivo PPR es el motivo “repetición de pentatricopéptidos”. Dicho motivo PPR es una estructura de una nueva proteína descubierta en el transcurso de un proyecto de genoma de Arabidopsis. El motivo básico de la misma consiste en que una secuencia de 35 aminoácidos degenerados se repite en tándem en una estructura primaria de la proteína. El motivo PPR tiene la secuencia representada por: terminal amino (terminal N)”VTYNTLISGYCKNGKLEEALELFEEMKEKGIKPDV”-terminal carboxilo (terminal C) como secuencia consenso de aminoácidos. Este motivo es el propuesto por Small y Peeters (referencia: Trends Biochem. Sci. 2000, 25 46-47). En el año de publicación de la referencia, se registraron aproximadamente 200 genes que pueden presentar este motivo en el genoma de Arabidopsis en un banco de genes tal como GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/index.html). En la actualidad, la posibilidad de la presencia de esta estructura en una determinada proteína se puede determinar fácilmente mediante un programa alojado en la base de datos Protein Families Database of Alignments and HMNs (en adelante abreviada como Pfam; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml), ubicada en el Sanger Institute del Reino Unido.

Hasta ahora, existen los ejemplos siguientes de proteínas con el motivo PPR cuya función se conoce: 1) PET309 de levadura y CYA-5 de Neurospora crassa, que son proteínas que se translocan a la mitocondria, interactúan con el ARNm coxI, que es un gen mitocondrial que regula la expresión de coxI en un estadio de procesamiento posttranscripcional o traducción (Manthey y McEwen, EMBO. J. 1995, 14, 4031, Coffin y otros, Curr Genet 1997, 32, 273-280); y 2) CRP1 de maíz, que es una proteína con motivo PPR que se transloca a la mitocondria y es esencial para la traducción de los genes petA y petD, dos genes de cloroplasto esenciales para una etapa de procesamiento de ARNm de petD (Fisk y otros, EMBO. J., 1999, 18, 2621-2630). En consecuencia, las proteínas que presentan el motivo del PPR pueden contribuir muy probablemente de algún modo a la regulación de la traducción.

En el contexto de la presente invención, se ha aislado un gen involucrado en la restauración de la fertilidad de un individuo de rábano Kosena que presenta esterilidad masculina citoplasmática y han descubierto que la proteína codificada por el mismo tiene 14 o más motivos de repeticiones de pentatricopéptidos (en adelante, abreviados como PPR), el grupo de motivos PPR se divide en 3 o más bloques, presentando cada uno de los bloques individuales, como mínimo, 2 o más motivos PPR, y presentando el bloque situado en la posición más cercana al extremo carboxilo (C-terminal) 4 motivos PPR.

La proteína mencionada anteriormente involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática es preferentemente una en la que el número de motivos PPR esta comprendido entre 14 y 16, y más preferentemente en la que el grupo de motivos PPR se divide en 3 bloques y cada bloque tiene 5, 7 y 4 motivos PPR empezando desde un extremo amino (N-terminal).

Específicamente, la proteína comprende:

(1): Complejo PPR nº 1: complejo PPR en el que los motivos PPR primero a quinto desde el extremo N-terminal comprenden 175 residuos consecutivos;

(2): Complejo PPR nº 2: complejo PPR en el que los motivos PPR sexto a 12º del extremo N-terminal comprenden 245 residuos consecutivos;

(3): Complejo PPR nº 3: complejo PPR en el que los motivos PPR 13º a 16º del extremo N-terminal comprenden 140 residuos consecutivos;

Más preferentemente, el cuarto aminoácido, que está presente en el segundo motivo PPR del extremo amino (Nterminal), es un aminoácido distinto de serina, treonina o cisteína. Más preferentemente, el cuarto aminoácido, que está presente en el segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal), es cualquiera de entre asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico o histidina. De forma particularmente preferente, el cuarto aminoácido, que está presente en el segundo motivo PPR desde el extremo amino (N-terminal), es asparagina.

Es conocido que, normalmente, el gen restaurador de la fertilidad está presente en un genoma nuclear y el gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática está presente en la mitocondria. En consecuencia, la proteína anterior involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática tiene además una secuencia de péptido señal para la translocación a la mitocondria en el extremo amino o tiene una secuencia Lys-Asp-Glu-Leu en el extremo carboxilo.

Entre los ejemplos de secuencia de péptido señal en el extremo N para la translocación a la mitocondria se encuentran las confirmadas por un programa de predicción “TargetP” (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) o el programa de predicción “Psort” (http://psort.nibb.ac.jp/) basado en un algoritmo de O. Emanuelsson (J. Mol. Biol. 300, 1005-1016, 2000). Entre los ejemplos del péptido señal se encuentra el péptido señal (MetAlaPheArgGlnThrLeuSerIleArgSerArgLeuPheAlaArgArgAsnGlnProValTyrHisIleIleProArgGluSerAspHisGluArgAs p) del gen AtOXA1 de Arabidopsis thaliana (W. Sakamoto y otros, Plant Cell Physiol., 41: 1157-1163.) Entre estos péptidos, un ejemplo de secuencia de aminoácidos preferente es la secuencia representada por los aminoácidos 1º a 79º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, y de forma particularmente preferente la secuencia correspondiente a los aminoácidos 1º a 34º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3.

La proteína según la presente invención, que está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, está enlazada al producto de transcripción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática con el fin de provocar una inhibición de la traducción de dicho gen, alcanzándose la restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

Entre los ejemplos del producto de transcripción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática se encuentra el producto de transcripción (ARNm) de cada gen de orf125, que es una proteína que causa esterilidad masculina citoplasmática en rábano Kosena, u orf138, que es la proteína que causa esterilidad masculina citoplasmática en rábano Ogura. Entre los ejemplos preferidos se encuentra la región 5’-UTR (Bonhomme y otros; Mol. Gen. Genet., 235: 340-348, 1992) del gen.

Entre los ejemplos de los procedimientos empleados para confirmar el enlazamiento con el producto de transcripción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática se encuentra un procedimiento en el que se añade la proteína según la presente invención al ARNm de ORF125 u ORF138, que se transcribió artificialmente in vitro, seguido de electroforesis en el llamado método de cambio en la movilidad electroforética. En la práctica, la operación se puede llevar a cabo en las condiciones aplicadas comúnmente en el método de cambio en la movilidad electroforética.

Otro método consiste en que un gen fusionado de ORF125 u ORF138 y un gen reportero detectable, tal como ßgalactosidasa o luciferasa, se expresan en Escherichia coli o similar, se añade la proteína según la presente invención y se observa la presencia o ausencia de inhibición de la expresión.

Específicamente, el gen restaurador de la fertilidad que presenta la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº: 2 se integra en un vector para la expresión en una Escherichia coli, y un vector en el que la región 5’-UTR y una región de codificación de 25 aminoácidos de orf125 están fusionados al gen lacZ se integran en la Escherichia coli. Estos vectores se someten a expresión de inducción, la expresión del gen lacZ se suprime sólo cuando el vector de expresión en el que se ha integrado el gen restaurador de la fertilidad integrada está presente, y como consecuencia las colonias azules de Escherichia coli se vuelven blancas en presencia de X-Gal. Tal como se ha descrito anteriormente, se puede confirmar que, mediante la utilización de un gen que codifica la proteína según la presente solicitud y llevando a cabo la confirmación mencionada anteriormente, la proteína según la presente invención tiene una función de restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, provocando la inhibición de la traducción del gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática.

También se describe el hecho de que los ejemplos de las proteínas implicadas en la restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática incluyen proteínas con una secuencia de aminoácidos que presenta una homología del 70% o superior, preferentemente del 80% o superior, más preferentemente del 90%

: o superior, y todavía más preferentemente 92% o superior, todavía más preferentemente 95% o superior, particularmente del 97% o superior, con respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 26 a 29, que es la secuencia de consenso. La secuencia de consenso se ejemplifica con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 26, preferentemente con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 27 o 28, y de forma particularmente preferente con la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 29.

Otros ejemplos descritos de las proteínas mencionadas anteriormente incluyen:

(1): una proteína que presenta una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, una secuencia correspondiente a los aminoácidos 80º a 687º de la secuencia de

aminoácidos SEC ID nº: 17, o la secuencia correspondiente a los aminoácidos 82º a 690º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 19; o

Un ejemplo de la proteína que presenta una secuencia para la translocación a la mitocondria es:

(1): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3.

La proteína según la presente invención es la proteína que puede estar involucrada en la restauración de la fertilidad en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Más específicamente, cuando la planta transformante (línea Rf) en la que se ha introducido el ADN que codifica la proteína según la presente invención se cruza con un individuo de la línea de esterilidad masculina citoplasmática (línea emc), se pueden obtener semillas F1 en las que se ha restaurado la fertilidad. Entre los ejemplos preferidos del anterior individuo de la línea emc se encuentra la planta en la que se ha introducido el gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o rábano Ogura.

La proteína según la presente invención se puede aislar por cribado mediante el método de cambio en la movilidad electroforética tal como se ha descrito anteriormente, y se puede aislar o sintetizar utilizando ADN según la presente invención, que se describe más adelante. El procedimiento para la obtención de la proteína según la presente invención se describe a continuación.

(2): Formas de realización de ADN según la presente invención

El ADN según la presente invención se refiere a ADN de:

(i): ADN que codifica la proteína según la presente invención descrito anteriormente; o (v) (1) ADN que tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1. Se describe además un

(ii): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos cualquiera de entre SEC ID nº: 22 a SEC ID nº: 25;

(iii) ADN de entre cualquiera de los siguientes;

(1): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18; o

(2): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16, o SEC ID nº: 18, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o

(iv): ADN de cualquiera de entre los siguientes:

(1): ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o

(2): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o

(3): ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 8553º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o una secuencia correspondiente a los nucleótidos 812º a 3002º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

(v): ADN de entre cualquiera de los siguientes;

(1): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15; o

(2): ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; o

(3): ADN que se hibrida con un ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 15 en condiciones estrictas, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

En la presente memoria, el ADN según la presente invención también se puede designar gen según la presente invención.

La secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 es una secuencia genómica de nucleótidos de ADN de 8553 nucleótidos, la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2 es una secuencia de codificación obtenida a partir de SEC ID nº: 1, y la secuencia SEC ID nº: 3 es una secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2.

La secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 15 es una secuencia genómica de nucleótidos de ADN de 3306 bases, la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 16 es una secuencia de codificación obtenida a partir de SEC ID nº: 15 y la secuencia SEC ID nº: 17 es una secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 16.

La expresión “la secuencia de nucleótidos en la que 1 o diversos nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido” en la presente memoria se refiere a la secuencia de nucleótidos en la que cierto número de nucleótidos, por ejemplo entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 15, más preferentemente entre 1 y 10, y aún más preferentemente entre 1 y 5, se han eliminado, añadido y/o sustituido.

La expresión “la secuencia de aminoácidos en la que 1 o diversos aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido” en la presente memoria se refiere a la secuencia de aminoácidos en la que cierto número de aminoácidos, por ejemplo entre 1 y 20, preferentemente entre 1 y 15, más preferentemente entre 1 y 10, y aún más preferentemente entre 1 y 5, se han eliminado, añadido y/o sustituido.

La expresión “ADN que se hibrida en condiciones estrictas” se refiere a la secuencia de nucleótidos de ADN que se obtiene utilizando el ADN como una sonda por el método de hibridación de colonias, el método de hibridación de placa o el método de hibridación de transferencia Southern. Un ejemplo de un ADN de este tipo es aquel que se puede identificar mediante la utilización de un filtro preparado mediante la fijación de ADN o un fragmento de ADN derivados de una colonia o una placa y mediante la realización de una hibridación a 65ºC en presencia de NaCl 0,7 a 1,0 M, seguido por el lavado del filtro utilizando solución 0,1 a 2 x SSC (1 x SSC está compuesta por cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM) a 65ºC.

La hibridación se puede llevar a cabo según el método descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (en adelante abreviado como “Molecular Cloning 2ª ed”).

Un ejemplo del ADN que se hibrida en condiciones estrictas es el ADN que tiene un cierto grado, o superior, de homología con la secuencia de nucleótidos del ADN utilizado como sonda. La expresión “un cierto grado, o superior, de homología” utilizada en el presente documento es, por ejemplo, el 70% o superior, preferentemente el 80% o superior, más preferentemente el 90% o superior, aún más preferentemente el 93% o superior, de forma particularmente preferentemente el 95% o superior y todavía más preferentemente 97% o superior. El ADN que tiene un cierto grado o superior de homología utilizado en el presente documento incluye un polinucleótido que muestra una homología tal como se ha descrito anteriormente y un polinucleótido con una hebra complementaria del mismo.

El ADN según la presente invención es ADN que puede participar en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Más específicamente, cuando la planta transformante (línea Rf) en la que se ha introducido el ADN según la presente invención se cruza con un individuo de la línea de esterilidad masculina citoplasmática (línea emc), se pueden obtener semillas F1 en las que se ha restaurado la fertilidad. Entre los ejemplos preferidos de la línea emc mencionada anteriormente se encuentran un individuo en el que se ha introducido el gen responsable de la esterilidad masculina citoplasmática de rábano Kosena y/o de rábano Ogura.

(3) Método de obtención de ADN según la presente invención

El procedimiento para obtener ADN según la presente invención no está particularmente limitado. Sobre la base de la información de las secuencias de nucleótidos SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2, dadas a conocer en la presente memoria, y de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 o el motivo PPR obtenido sobre la base de la información de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 y la secuencia de aminoácidos obtenida mediante la combinación de una secuencia de tránsito mitocondrial, se puede aislar o sintetizar ADN según la presente invención mediante la aplicación de una técnica común de reproducción y una técnica común de ingeniería genética conocidas por los expertos en la materia.

Concretamente, se puede obtener ADN según la presente invención de un origen vegetal apropiado en el que se expresa el gen según la presente invención, en concreto una planta Raphanus que incluye una variedad y una especie relacionada de rábano, u otras plantas en las que se introduce el ADN genómico que contiene el gen restaurador a partir de estas plantas mediante técnicas de cruce o fusión celular, más concretamente, plantas Raphanus tales como rábano Kosena, rábano Ogura, rábano Yuanhong o variedades derivadas de los mismos y especies relacionadas con dichas variedades de rábano o plantas Brassica en las que se introduce el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática de estas especies de plantas y variedades a partir de estas plantas mediante técnicas de cruce o fusión celular. El gen según la presente invención se puede aislar y obtener, por ejemplo, aislando marcadores de ADN que se sitúan alrededor de un gen Rf, preparando un mapa genómico que indica la relación entre las distancias genéticas de estos marcadores de ADN y el gen Rf y aplicando el método de clonación posicional (también llamado rastreo cromosómico) de una región Rf a la vez que se empieza por el mapa genómico.

Esta técnica se inicia encontrando un marcador de ADN apropiado en un ADN genómico y preparando el mapa genómico mediante la medición de la distancia genética del gen Rf y los marcadores de ADN. Para los marcadores de ADN, que por lo general tienen unos 100 pb de longitud, el genoma derivado de un padre se deben distinguir del genoma derivado de una madre. El marcador de ADN debe localizar un cromosoma igual que el del gen y los marcadores cuyo modo de herencia es casi igual al del gen debido a una pequeña distancia con respecto al mismo, es decir, resulta más deseable un marcador con una relación genética muy estrecha.

Como método para aislar el marcador de ADN, hasta el momento se ha utilizado frecuentemente el método RFLP. Sin embargo, recientemente se han utilizado métodos simples y ventajosos, tales como el método RAPD y el método AFLP (polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados), que utilizan PCR (Nucleic Acids Research, 1995, Vol. 23, nº 21: 4407-4414). Particularmente, el método AFLP es un medio eficaz para la obtención del marcador que presenta una relación genética estrecha. Como material para la medición de la distancia genética con respecto al marcador, habitualmente se utiliza una población F2 obtenida por autopolinización de una generación F1 producida por cruce de un individuo homocigótico recesivo que no presenta el gen Rf1 con un individuo homocigótico dominante que presenta genes Rf1 homocigóticos, y una población BC1 obtenida por cruce de la generación F1 con la planta homocigótica recesiva, que es la progenitora de la misma, que carece del gen de interés.

Como individuo homocigótico recesivo descrito anteriormente, se pueden utilizar plantas de Raphanus que incluyen la variedad y la especie relacionada con el rábano de la línea de esterilidad masculina citoplasmática, más concretamente rábano Kosena y rábano Ogura de la línea de esterilidad masculina citoplasmática, o plantas Brassica en las que se ha introducido la esterilidad masculina citoplasmática derivada del rábano Kosena (Kosena emc) y la esterilidad masculina citoplasmática derivada del rábano Ogura (Ogura emc), y más concretamente se puede utilizar colza emc.

Como planta homocigótica dominante descrita anteriormente, se pueden utilizar plantas Raphanus que incluyen la variedad y la especie relacionada de rábano de la línea Rf, más concretamente plantas Brassica en las que se ha introducido mediante técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la fertilidad masculina citoplasmática de las plantas Raphanus, incluidos el rábano Kosena, el rábano Ogura, el rábano Yuanhong o variedades y especies relacionadas de estas variedades de rábano, que son la línea de esterilidad masculina citoplasmática, y más específicamente se puede utilizar colza Rf.

Para el análisis de la población F2 obtenida por autopolinización de la generación F1 obtenida mediante el cruce de estos progenitores y la población BC1 obtenida mediante el cruce de la generación F1 con la planta homocigótica recesiva, habitualmente se utilizan deseablemente 100 individuos o más, y más preferentemente 1.000 individuos o más. El número de individuos utilizados es el mayor posible para aumentar la exactitud del mapa genómico y reducir la distancia física del marcador de ADN con respecto a un gen de interés. De modo parecido, en el gen Rf se puede obtener el marcador de ADN que tiene una distancia física más corta.

Como material para la medición de la distancia genética del marcador de ADN con respecto al gen Rf, por ejemplo, se puede utilizar una población F2 de unos miles de individuos que se obtiene mediante la autopolinización de la generación F1 de rábano producida mediante el cruce de rábano Kosena (Raphanus sativus cv. Kosena) de la línea emc con rábano Yuanhong (Raphanus sativus cv. Yuanhong) de la línea Rf según el método descrito en N. Koizuka y otros (Teor. Appl. Genet. 100: 949-955, 2000). El análisis de estas poblaciones permite el aislamiento de los marcadores de ADN con un enlace en una forma que intercala el gen Rf y situados en una posición con una distancia de alrededor de 0,2 cM desde ambos lados. Mediante este paso se puede preparar el mapa genómico, tal como se muestra en la figura 1, que muestra la distancia genética del marcador con respecto al gen Rf.

Después de la preparación del mapa genómico, el ADN genómico que corresponde a su posición se debe clonar para combinar entre los marcadores de ADN que intercalan el gen objetivo. Normalmente, la distancia física entre los marcadores de ADN y el gen objetivo es grande y, por lo tanto, la combinación de una serie de clones que presentan fragmentos de ADN genómico permite cubrir una región que abarca desde el marcador de ADN hasta el gen objetivo. Un paso para combinar estos marcadores de ADN mediante la utilización del clon que presenta fragmentos de ADN genómico es la preparación de un cóntigo. Para el gen Rf, el cóntigo se puede preparar de modo similar mediante la combinación de estos marcadores de ADN, que se encuentran en la posición más cercana al gen Rf, utilizando una serie de clones con fragmentos de ADN genómico, de tal modo que se cubre la región del gen Rf.

Se puede obtener una colección de clones con fragmentos de ADN genómico mediante la preparación de una biblioteca genómica. Normalmente, se utilizan diferentes tipos de vectores según la longitud del ADN genómico que se puede clonar. Los ejemplos incluyen los construidos utilizando un vector fago lambda, que puede clonar un fragmento con una longitud de hasta 20 kb, un vector cósmido, que puede clonar un fragmento con una longitud relativamente grande (hasta 40 kb), un vector BAC (cromosoma artificial bacteriano), que puede clonar un fragmento con una longitud más grande (100 kb o más).

En cualquier biblioteca, es importante que el valor obtenido multiplicando un número de poblaciones de la biblioteca por una longitud promedio del fragmento clonado dé un valor correspondiente a de 4 a 5 veces la longitud completa (tamaño genómico) del genoma suministrado a la biblioteca. El tamaño genómico del rábano puede ser de aproximadamente 500 Mbp y, por lo tanto, en caso de utilizar el vector fago lambda con una longitud promedio de 20 kb, el número de la población se vuelve entre 1,0 x 105 y 1,25 x 105 y, en caso de utilizar la biblioteca de cósmidos con una longitud promedio de 40 kb, el número de la población se vuelve entre 5,0 x 104 y 6,25 x 104. Se cree que el tamaño genómico de la colza es de aproximadamente 1.000 Mbp y, por lo tanto, en caso de utilizar el vector fago lambda con una longitud promedio de 20 kb, el número de la población se vuelve entre 2,0 x 105 y 2,5 x 105 y, en caso de utilizar la biblioteca de cósmidos con una longitud promedio de 40 kb, el número de la población se vuelve entre 1,0 x 105 y 1,25 x 105.

Para el ADN genómico suministrado a la biblioteca, el ADN genómico se puede extraer de un organismo vivo que contiene el gen objetivo mediante un método convencional. Para el gen Rf, se puede utilizar la planta Raphanus, incluyendo la variedad y la especie relacionada con el rábano de la línea Rf, más concretamente plantas Brassica en las que se ha introducido por técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la fertilidad masculina citoplasmática de las plantas Raphanus, incluyendo rábano Kosena, rábano Ogura, rábano Yuanhong o variedades y especies relacionadas con estas variedades de rábano, que son la línea de esterilidad masculina citoplasmática, más específicamente, la colza Rf. En general, puede resultar más preferente extraer el ADN genómico de la misma planta de línea Rf que la planta progenitora utilizada para la preparación de la población F2 y la población BC1 a fin de preparar la biblioteca genómica. El ADN genómico se puede preparar de acuerdo con un método convencional, tal como el método CTAB (Murray, M. G. y Thompson, W.F. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4321).

Para la preparación del cóntigo, primero se aísla el clon que tiene el marcador de ADN situado a ambos lados del gen Rf. El aislamiento se lleva a cabo a partir de la biblioteca genómica por el procedimiento convencional que utiliza un método de hibridación en placa para una biblioteca de fagos lambda y un método de hibridación de colonias para una biblioteca de cósmidos y una biblioteca de BAC. A continuación, utilizando una región terminal del clon aislado como un índice, se prepara un cóntigo aislando el clon situado en una posición adyacente al clon. Después de la preparación, la secuencia de nucleótidos del cóntigo se determina mediante el método convencional.

Desde el desarrollo del proyecto del genoma en los últimos años, se ha puesto a punto una técnica para prever la existencia de un gen funcional basándose en la secuencia de nucleótidos del ADN genómico. Un programa de identificación de genes llamado “Genscan” puede identificar el gen con una considerable probabilidad. Además, un programa de búsqueda de homologías llamado “BLAST” puede identificar la similitud con otros genes y proteínas. Mediante la utilización de estos programas analíticos se lleva a cabo la identificación y el aislamiento del gen objetivo. De modo similar, para el gen Rf se puede aislar e identificar la secuencia de ADN genómico del cóntigo utilizando un software analítico similar. Dicho análisis revela una región promotora en una secuencia de nucleótidos de ADN genómico, una región génica estructural que contiene un intrón y una región de terminación. Además, con respecto al gen estructural que contiene el intrón, se indican claramente el gen en una forma que se traduce en una proteína de la que se ha excluido el intrón y la secuencia de aminoácidos que corresponde al gen. De este modo, se puede identificar el gen Rf en el cóntigo con una probabilidad considerable.

Además, sobre la base de la secuencia génica identificada mediante los programas analíticos descritos anteriormente, la forma concreta de expresión in vivo del genoma objetivo se puede confirmar mediante la purificación de un ARNm y el aislamiento del ADN complementario (ADNc) correspondiente. Se confirma convenientemente un sitio de inicio de la transcripción mediante un análisis que aplica el sencillo método de 5’-RACE, que utiliza PCR, y, de forma más fiable, el método de extensión del cebador y el método de mapeo de SI.

Los métodos mencionados anteriormente se han descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 y similares.

Un ejemplo de los genes según la presente invención que se aislaron a partir de la secuencia de nucleótidos identificada por las técnicas descritas anteriormente es el ADN de SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16 y SEC ID nº: 18. De este modo, sobre la base de la secuencia de ADN se puede aislar fácilmente el ADNc de otro origen vegetal mediante una técnica de ingeniería genética convencional.

En concreto, el ADNc correspondiente al gen según la presente invención se puede obtener a partir del origen vegetal apropiado en el que se expresa el gen según la presente invención, en concreto, la planta Raphanus que incluye la variedad y la especie relacionada con el rábano u otras plantas, en la que se ha introducido a partir de dichas plantas mediante técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la esterilidad masculina citoplasmática, y más concretamente las plantas Raphanus como rábano Kosena, rábano Ogura y rábano Yuanhong, o variedades y especies relacionadas de dichas variedades de rábano o plantas del género Brassica, en las que se ha introducido mediante técnicas de cruce o fusión celular el ADN genómico que contiene el gen restaurador de la fertilidad masculina citoplasmática, mediante la preparación de una biblioteca de ADNc según el método convencional y la selección de un clon adecuado de la biblioteca utilizando el fragmento adecuado de ADN específico para el gen según la presente invención como sonda, o utilizando un anticuerpo contra un producto de traducción del gen según la presente invención.

En el procedimiento descrito anteriormente, algunos ejemplos del origen del ADNc son varias células y tejidos que expresan el gen según la presente invención y una célula cultivada derivada de los mismos. La separación del ARN total, la separación y purificación del ARNm y la obtención y clonación del ADNc a partir de estas células y tejidos se puede llevar a cabo según el método convencional.

El método para la detección del gen según la presente invención a partir de la biblioteca de ADNc no está particularmente limitado y puede seguir el método convencional.

Como sonda utilizada en la presente invención, se puede utilizar de forma general el ADN sintetizado químicamente a partir de la información sobre la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención, y se pueden utilizar preferentemente el gen según la presente invención y el fragmento del mismo ya obtenido. Además, también se pueden utilizar como sonda para detección un cebador sentido y un cebador antisentido diseñados a partir de la información de la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención.

Una secuencia de nucleótidos del cebador sentido y el cebador antisentido utilizados como sonda es una secuencia de nucleótidos parcial que corresponde al ADN que codifica la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, que tiene, como mínimo, de 15 a 50 nucleótidos consecutivos y preferentemente de 20 a 30 nucleótidos consecutivos. Alternativamente, se puede utilizar como sonda un clon positivo que tiene la secuencia tal como se ha descrito anteriormente.

La obtención del gen según la presente invención se puede llevar a cabo combinando técnicas convencionales utilizadas para el aislamiento del gen, tales como la técnica de amplificación de ADN y ARN por el método PCR y el método RACE, representado por el método 5’-RACE.

El cebador utilizado para la aplicación del método PCR se puede diseñar adecuadamente basándose en la información de la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención dado a conocer por la presente invención, y se puede sintetizar por el método convencional. El aislamiento y la purificación de los fragmentos de ADN y ARN amplificados se pueden llevar a cabo por el método convencional, tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede utilizar electroforesis en gel.

En cuanto al gen o los diversos fragmentos de ADN según la presente invención obtenidos mediante los procedimientos descritos anteriormente, la secuencia de nucleótidos de los mismos se puede determinar según el método convencional.

Utilizando una parte o toda la secuencia de nucleótidos del gen según la presente invención obtenido mediante dicho procedimiento, se puede detectar característicamente la presencia del gen según la presente invención y la aparición de expresión del mismo en un individuo o en diversos tejidos.

Tal como se ha descrito anteriormente, un ejemplo del gen según la presente invención es un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3, aunque no se limita al mismo. Los homólogos de dicho gen entran dentro del ámbito de la presente invención.

La expresión “los homólogos del gen” se refiere a una serie de genes relacionados que presentan una homología de secuencia con el gen (o un producto génico del mismo) según la presente invención y se reconocen como una familia de genes basándose en la similitud de un rasgo estructural, tal como se ha descrito anteriormente, y de una función biológica del mismo, tal como se ha descrito anteriormente. Se incluye un alelo de dichos genes.

Por ejemplo, el gen según la presente invención no se limita al gen que presenta la secuencia de nucleótidos específica de SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2, sino que puede presentar una secuencia de nucleótidos seleccionada combinando opcionalmente un codón correspondiente a un residuo aminoácido individual representado por SEC ID nº: 3. La selección del codón se puede llevar a cabo según el método convencional y, por ejemplo, se puede tener en cuenta la frecuencia de uso de un codón en un huésped.

Además, tal como se ha descrito anteriormente, el gen según la presente invención incluye ADN que se hibrida con el ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o con una parte del mismo en condiciones estrictas. Un ADN de este tipo es un ADN que tiene un cierto grado o superior de homología con ADN que tiene la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o una parte del mismo.

Los ADN descritos anteriormente con un cierto grado de homología o superior se refieren a polinucleótidos y polinucleótidos de cadena complementaria de los mismos que presentan, como mínimo, un 70% de grado de homología, preferentemente por lo menos 90% de grado de homología, más preferentemente, como mínimo, un 95% de grado de homología, y todavía más preferentemente por lo menos 97% de grado de homología, con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o una parte de los mismos, o la secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de aminoácidos SEC ID nº: 3 o una parte de la misma.

Más específicamente, se puede poner como ejemplo el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se hibrida con el ADN que presenta una secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o una parte de la misma en condiciones estrictas de 0,2 x SSC que contiene un 0,1% de SDS a 50ºC o 1 x SSC que contiene un 0,1% de SDS a 60ºC.

Entre los ADN según la presente invención, particularmente los siguientes se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia, tales como síntesis química, técnicas de ingeniería genética y mutagénesis:

El ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 15, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática;

El ADN que presenta una secuencia de nucleótidos en la que 1 o varios nucleótidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 2, SEC ID nº: 16 o SEC ID nº: 18, y está involucrado en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática; y

El ADN que codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos en la que 1 o varios aminoácidos se han eliminado, añadido y/o sustituido en la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 y está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Por ejemplo, utilizando ADN con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 o parte de las mismas se puede obtener un gen mutado, introduciéndose la mutación en dichos ADN.

Como procedimiento para la obtención de un gen mutante, se pueden utilizar los procedimientos conocidos como de mutante aleatorio, mutante con diana, un método que utiliza un gen sintético (Sin Idensi Kougaku Handbook, Zikken Igaku Sppl., Youdosya, 1996).

Específicamente, se pueden utilizar procedimientos que consisten en poner en contacto el ADN con la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 ó 2, o parte de las mismas, con un fármaco mutágeno, un procedimiento para irradiar rayos ultravioleta en el ADN, una técnica de ingeniería genética, etc. El procedimiento de mutagénesis dirigida a un sitio, que es una técnica de ingeniería genética, es una técnica útil, ya que puede introducir una mutación específica en un sitio específico y se puede llevar a cabo según el método descrito en Molecular Cloning, 2ª edición.

(4) Vector que contiene ADN según la presente invención

El ADN según la presente invención se puede utilizar como vector recombinante mediante su introducción en un vector apropiado. El tipo de vector puede ser un vector de expresión o un vector de no expresión y se puede seleccionar de acuerdo con los fines.

Un vector de clonación preferido es el que puede presentar replicación autónoma en una cepa K12 de Escherichia coli y se puede utilizar un vector fago o un vector plasmídico. El vector para la expresión en Escherichia coli se puede utilizar como vector de clonación. Específicamente, algunos ejemplos son ZAP Express (Strata Gene, Strategies, 5, 58 (1992),) pBluescrlpt II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), Lambda ZAP II (Strata Gene), λ gt10, λ gt11 (ADN Cloning, A Practical APPRoach, 1, 49 (1985)), λ TriplEx (Clonetec), λ ExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 (Mo1. Gen. Biol., 3, 280 (1983)), pMW218 (Wako Pure Chemicals), pUC118 (Takara), pEG400 (J. Bac., 172, 2392 (1990)), y pQE-30 (QIAGEN).

El vector de expresión se puede seleccionar teniendo en cuenta la combinación con el huésped, y preferentemente se utiliza un vector capaz de replicación autónoma en la célula huésped o de integración en un cromosoma y que contiene un promotor en una posición que permite la transcripción del gen según la presente invención.

Cuando se utiliza una bacteria como célula huésped, resulta preferente que el vector de expresión para la expresión del ADN sea capaz de experimentar replicación autónoma en la célula bacteriana y también que sea un vector recombinante compuesto por el promotor, una secuencia de unión a los ribosomas, el ADN anterior y una secuencia de terminación de transcripción. También puede estar incluido un gen para regular el promotor.

Algunos ejemplos de vectores de expresión para bacterias son pBTrP2, pBTac1, pBTac2 (todos ellos comercializados por Boeringer Manheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYP10 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 58-110600), pKYP200 (Agrc. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), PLSA1 (Agrc. Biol. Chem., 53, 277 (1989) ), pGEL1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)), pBluescriptII SK+, pBluescriptII SK(-) (Stratagene), pTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERMBP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US nº 4.686.191, US nº 4.939.094, US nº 5.160.735), pSupex, pUB110, pTP5; pC194, pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)), pSTV28 (Takara), pSTV29 (Takara), pUC118 (Takara), pPA1 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 63-233798), pEG400 (J. Bacteriol., 172, 2392 (1990) ), y pQE-30 (QIAGEN). Algunos ejemplos de promotores para bacterias son promotores derivados de Escherichia coli y fagos, tales como el promotor trp (P trp), el promotor lac (P lac), el promotor PL, el promotor PR y el promotor PSE, así como el promotor SP01, el promotor SP02 y el promotor penP.

Algunos ejemplos de vector de expresión para levadura son YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp5O (ATCC37419), pHS19 y pHS15. Algunos ejemplos de promotor para levadura son el promotor PHO5, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH, el promotor gal1, el promotor gal10, el promotor de las proteínas de choque térmico y promotores tales como el promotor MF-α1 y el promotor CUP1.

Algunos ejemplos de vector de expresión para una célula animal son pcDNAI, pcDM8 (comercializados por Funakoshi), pAGE107 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (1990)), pAS3-3 (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 2-227075), pCDM8 (Nature, 329, 840, (1987)), pcDNAI/AmP (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), y pAGE210. Algunos ejemplos de promotores para célula animal son el gen temprano inmediato (IE o “immediate early”) de citomegalovirus (CMV humano), un promotor temprano de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de metalotioneínas, un promotor de choque térmico y un promotor SRα.

Algunos ejemplos de vector de expresión para una célula vegetal son pIG121-Hm (Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)), pBI121 (EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)), pLAN411 y pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290). Cuando se introduce en una planta un fragmento largo de ADN, de 10 kb o superior, resulta deseable utilizar un vector mejorado a fin de permitir una fijación estable y la introducción de ADN de cadena larga. Por ejemplo, pBIBAC2 (Gene 200 (1997) 107-116), pYLTAC7 (PNAS 96 (1999) 6535-6540) y pBIGRZ2 (Bioscience and Industry 55 (1997) 37-39).

Un ejemplo de promotor para célula vegetal es el promotor 35S del virus mosaico de la coliflor (Mol. Gen. Genet. (1990) 220, 389-392). A continuación se describe con mayor detalle la transformación de la planta.

(5) Transformante que presenta ADN según la presente invención

El transformante que presenta ADN según la presente invención se puede preparar mediante la introducción del vector recombinante mencionado anteriormente (preferentemente el vector de expresión) en un huésped.

Son ejemplos específicos de la célula huésped de bacterias los microorganismos pertenecientes a Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Scenedesmun, Streptomyces, Synnecoccus y Zymomonas. Un ejemplo del procedimiento para introducir el vector recombinante en el huésped bacteriano es un procedimiento que utiliza un ion de calcio y un método de protoplastos.

Algunos ejemplos específicos de huésped de levadura son Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans y Schwanniomyces alluvius.

El procedimiento para introducir el vector recombinante en el huésped de levadura puede ser cualquier método para introducir el ADN en la levadura, y algunos ejemplos son el método de electroporación, el método de esferoplastos y el método de acetato de litio.

Un ejemplo del huésped para la célula animal son las células Namalva, las células COS1, las células COS7 y las células CHO.

Como método para introducir el vector recombinante en la célula animal, se puede utilizar cualquier método capaz de introducir ADN en células animales. Por ejemplo, se pueden utilizar el método de electroporación, el método del fosfato de calcio y el método de lipofección.

El transformante que utiliza la célula vegetal se describe más adelante.

(5) Método de obtención de la proteína según la presente invención

El método para la obtención de la proteína según la presente invención no está particularmente limitado. Sobre la base de la información obtenida mediante la combinación de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, dada a conocer en la presente memoria, o la secuencia de tránsito a las mitocondrias obtenida sobre la base de la información de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3, la proteína según la presente invención se puede aislar, expresar o sintetizar mediante la aplicación de la técnica general de ingeniería genética conocida por los expertos en la materia.

Por ejemplo, la proteína según la presente invención se puede expresar mediante el aislamiento o la síntesis de ADN que codifica una proteína según la presente invención e introduciéndola en la célula.

La proteína según la presente invención se puede obtener, por ejemplo, mediante el cultivo de un transformante que presenta un gen según la presente invención, la producción y acumulación de la proteína según la presente invención en dicho cultivo y la recolección de la proteína del mismo.

El método para el cultivo de un transformante que presenta un gen según la presente invención se puede llevar a cabo según un método convencional utilizado para el cultivo del huésped.

Cuando el transformante según la presente invención es un microorganismo procariota, tal como Escherichia coli,o eucariota, tal como una levadura, un medio de cultivo para el cultivo de estos microorganismos puede ser un medio natural o sintético, siempre que dichos medios de cultivo contengan una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas que puedan ser utilizadas por los microorganismos y siempre que se pueda llevar a cabo un cultivo eficiente del transformante. El cultivo se lleva a cabo preferentemente en condiciones aeróbicas, tal como un cultivo con agitación o un cultivo sumergido aireado y agitado; la temperatura de cultivo está comprendida normalmente entre 15 y 40ºC, y la duración del mismo está comprendida normalmente entre 16 horas y 7 días. Durante el cultivo, el pH se mantiene entre 3,0 y 9,0. El ajuste del pH se lleva a cabo utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una solución alcalina, urea, carbonato de calcio, amonio o similares. Además, si es necesario, durante el cultivo se puede añadir al medio un antibiótico como la ampicilina o la tetraciclina.

Como medio de cultivo para el cultivo del transformante obtenido utilizando la célula animal como célula huésped, se utiliza medio RPM11640, un medio de uso habitual (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), medio MEM de Eagle (Science, 122, 501 (1952)), medio DMEM (Virology, 8, 396 (1959)), medio 199 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) o el medio preparado mediante la adición de suero bovino fetal a cualquiera de estos medios. Habitualmente, el cultivo se lleva a cabo a un pH comprendido entre 6 y 8, una temperatura comprendida entre 30 y 40ºC y CO2 al 5% de 1 a 7 días. Además, si es necesario durante el cultivo, se puede añadir un antibiótico como la kanamicina o la penicilina al medio de cultivo.

Como medio de cultivo para el transformante obtenido utilizando la célula vegetal como célula huésped, se utiliza cualquier medio tal como medio MS, medio R2P y otros, que son comúnmente utilizados junto con especies vegetales. El cultivo se lleva a cabo durante de 1 a 21 días a un pH comprendido entre 6 y 8 y una temperatura comprendida entre 15 y 35ºC. Si es necesario durante el cultivo, se puede añadir un antibiótico, como la kanamicina

o la higromicina, al medio de cultivo.

Con el fin de aislar y purificar la proteína según la presente invención, que está involucrada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática a partir de un producto de cultivo del transformante, se pueden utilizar métodos habituales de aislamiento y purificación.

Por ejemplo, cuando la proteína según la presente invención se expresa intracelularmente en estado de disolución, tras la finalización del cultivo, las células se recogen por centrifugación, se suspenden en una solución tampón acuosa y, a continuación, se rompen mediante un equipo de ultrasonidos, un equipo de émbolo, un homogeneizador Manton Gaulin o un triturador Dyno Mill a fin de obtener una solución de extracto sin células. A partir del sobrenadante obtenido por centrifugación de la solución de extracto sin células, se puede obtener un producto de muestra purificado utilizando un método convencional de aislamiento y purificación de proteínas, tal como un método de extracción por disolvente, un método de precipitación por adición de sal utilizando sulfato de amonio y similares, un método de desalinización, un método de precipitación utilizando un disolvente orgánico, un método de cromatografía por intercambio aniónico utilizando una resina como dietilaminoetilo (DEAE) Sepharose o DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Corp), un método de cromatografía por intercambio catiónico utilizando S-Sepharosa FF (Pharmacia), un método de cromatografía hidrofóbica utilizando una resina como Butyl Sepharose o Phenyl Sepharose, un método de filtración en gel con utilización de un tamiz molecular, un método de cromatografía de afinidad, un método de cromatofocalización y un método de electroforesis, tal como isoelectroenfoque, de forma independiente o en combinación.

Cuando la proteína se expresa intracelularmente formando una materia insoluble, la misma se recoge a partir de una fracción del precipitado que se obtiene mediante la recolección, destrucción y centrifugación de las células de manera similar por un método convencional. A continuación, la materia insoluble de la proteína se solubiliza mediante un agente de desnaturalización de proteínas. Una solución de la proteína disuelta se diluye o se dializa con una solución que carece del agente de desnaturalización de proteínas o lo contiene en una concentración tan baja que la desnaturalización de las proteínas no se produce, con el fin de construir una estructura normal estereoscópica de la proteína. A continuación, se puede obtener un producto de muestra purificado mediante los mismos métodos de aislamiento y purificación descritos anteriormente.

Cuando la proteína según la presente invención o un derivado de la misma, tal como la molécula modificada con azúcar, se secreta extracelularmente, la proteína o derivado, tal como la molécula con adición de una cadena de azúcar, se puede recoger en el sobrenadante del cultivo. La fracción solubilizada se obtiene por tratamiento del producto de cultivo por medio de técnicas tales como centrifugación, tal como se ha descrito anteriormente, y el producto de muestra purificado se puede obtener a partir de la fracción disuelta mediante los métodos de aislamiento y purificación descritos anteriormente.

La proteína según la presente invención también se puede preparar por un método de síntesis química, tal como el método Fmoc (fluorenilmetoxicarbonilo) o el método t-Boc (t-butiloxicarbonilo). Además, la síntesis se puede realizar utilizando un sintetizador de péptidos disponible en el mercado a través de Souwa Boueki (Advanced Chem Tech, USA), Perkin Elmer Japan (Perkin Elmer, USA), Amersham Pharmacia Biotech (Amersham Pharmacia Biotech), Aroca (Protein Technology Instrument, USA), Kurabou (Synthecell-Vega, USA), Japan PerSeptive Ltd. (PerSeptive, USA) y Shimadzu Corporation.

(7) Transformante de la planta que presenta ADN según la presente invención

La secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 es la secuencia de nucleótidos en una forma en la que la secuencia de nucleótidos del genoma original de la planta se ha extraído. Dicha secuencia de nucleótidos contiene un promotor y un terminador necesarios para la expresión de genes en una forma operativa. En cuanto al vector que se debe introducir, la clonación del gen se puede realizar en un vector de clonación convencional, tal como el cósmido pWE15 (STRATAGANE), mediante un método de introducción directa. Cuando se utiliza Agrobacterium, la clonación se puede realizar en un vector de transformación de plantas convencional, tal como el vector pB1121 (Clontech).

Se pueden introducir en la célula vegetal el ADN de la secuencia de nucleótidos de la que se han extraído parte de los intrones de esta secuencia (genómica), el ADN de la secuencia de nucleótidos de la que se han extraído casi todos los intrones, el ADN de la SEC ID nº: 2 o de los nucleótidos 238º a 2064º de la misma, o el ADN que codifica una proteína de SEC ID nº: 3 o una región correspondiente a los residuos 80º a 687º de la misma.

El ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 3754º a 5091º de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 es el promotor que tiene la capacidad de transcribir un ARNm en una antera y se utiliza preferentemente para la reversión de la esterilidad masculina.

Además, las regiones promotora y terminadora se pueden reemplazar por un promotor y un terminador que funcionen en una célula vegetal conocida.

Cuando se introduce en la célula vegetal el ADN anterior de SEC ID nº: 2 o los nucleótidos 238º a 2064º de la misma, o el ADN que codifica una proteína de SEC ID nº: 3 o una región correspondiente a los residuos 80º a 687º de la misma, el promotor y el terminador son necesarios además de dicho ADN. Un ejemplo de vector de expresión de uso común es el pB1121 (Clonetech). En dicho vector, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se utiliza como promotor y el terminador de la enzima nopalina sintasa, que está presente en el plásmido Ti de A. tumefaciens, se utiliza como terminador. Como promotor necesario para la expresión, no sólo se puede utilizar el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor descrito anteriormente, sino también el promotor rbcS ampliamente presente en las plantas. Más preferentemente, se utilizan un promotor tal como TA29, que se expresa en el período de desarrollo del polen, y más preferentemente promotores auténticos situados más arriba de los genes. Como terminador, no sólo se puede utilizar el terminador de la enzima nopalina sintasa descrito anteriormente, sino también el terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor. Más preferentemente, se utiliza un terminador auténtico situado más abajo del gen.

Cuando el ADN anterior de SEC ID nº: 2 o los nucleótidos 238º a 2064º de la misma, o el ADN que codifica una proteína de SEC ID nº: 3 o una región correspondiente a los residuos 80º a 687º de la misma se utilizan a fin de restaurar la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, es necesaria además de estas secuencias una secuencia de tránsito mitocondrial.

Como secuencia de tránsito mitocondrial, se utiliza un ADN correspondiente a los nucleótidos 1º a 237º de la SEC ID nº: 2 o un ADN que codifica los aminoácidos 1º a 79º de la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3.

En los siguientes ejemplos, se han preparado los vectores para la transformación de plantas a fin de introducir el ADN (SEC ID nº: 1) del gen Rf que contiene intrones contenidos en regiones desde el promotor auténtico presente en el genoma hasta el terminador y la planta en una forma auténtica. Tras la escisión de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 del clon que compone una parte del cóntigo por una enzima de restricción, la secuencia se subclonó en un vector de clonación apropiado. A continuación, el fragmento subclonado se introdujo en los vectores pKM424 y pBIGRZ2 para la transformación de la planta a fin de obtener el vector que puede introducir el fragmento en la planta. Este vector se introdujo en Agrobacterium para la transformación de la planta. Mediante la infección de la planta con Agrobacterium que contiene dicho vector, el fragmento de ADN se integra en el genoma de la planta.

Algunos ejemplos de plantas a las que se puede aplicar el gen según la presente invención son oleaginosas tales como colza, girasol, soja y palma, cereales tales como arroz, maíz y trigo, plantas de floración tales como el tabaco y la petunia, y diversas hortalizas tales como tomate, brócoli, col, col china y zanahoria.

Entre las mismas, resultan preferentes las plantas Brassica, tales como la colza, la col, la col china y el brócoli, y el tomate. La colza, la col, la col china y el brócoli son particularmente preferentes, y la colza es la más preferente.

En la presente memoria, algunos ejemplos de fuente de la planta para transformación son una semilla, un germen, un brote, un callo, una célula cultivada y un cuerpo de planta. Por ejemplo, el germen o un protoplasto en el caso de la colza; la plántula, el callo o la célula cultivada en el caso de la soja; la plántula en el caso del girasol; el callo o la célula cultivada en el caso de la palma; la plántula, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso del arroz; la plántula, el brote, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso del maíz; la plántula, el callo o la célula cultivada en el caso del trigo; la plántula, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso de la col y el brócoli; la plántula, el callo, la célula cultivada o el protoplasto en el caso de la zanahoria. Las partes preferentes se seleccionan adecuadamente en función de la planta, tal como acostumbran a hacer los expertos en la materia.

La transformación de la planta se puede llevar a cabo por vías convencionales. Por ejemplo, existe el método en el que se introduce el vector en la planta mediante la infección de una célula de la misma con Agrobacterium después de introducir el vector en una célula de Agrobacterium; y el método en el que el vector se introduce directamente en la célula utilizando, por ejemplo, el método de electroporación, el método de DEAE-dextrano, el método del fosfato de calcio, el método del polietilenglicol y el método de la pistola de partículas.

Por ejemplo, el método preferido para la introducción de un gen en la colza se ejemplifica con el método descrito a continuación.

Un hipocótilo de una forma de colza asépticamente germinada en el medio MS que contiene un azúcar, tal como sacarosa, como fuente de carbono, se precultiva en dicho medio MS que contiene ácido 2,4-diclorofenoxiacético y sacarosa. La Agrobacterium cultivada en medio YEB se recoge por centrifugación y se suspende de nuevo en el medio MS que contiene sacarosa. El hipocótilo de colza descrito anteriormente se añade a esta suspensión seguido de agitación. A continuación, el hipocótilo extraído se devuelve al medio de precultivo original para el cocultivo durante 3 días, seguido de la transferencia a un medio de selección que contiene hormonas vegetales tales como zeatina y bencilaminopurina, y carbenicilina y kanamicina para la selección. Se obtiene un individuo regenerado mediante el cultivo de los brotes verdes regenerados obtenidos en un medio de cultivo de crecimiento que contiene opcionalmente una hormona vegetal, tal como bencilaminopurina, y a continuación en un medio de cultivo de enraizamiento que contiene opcionalmente hormonas vegetales, tal como ácido naftalenacético y bencilaminopurina. Mediante el cruce de este individuo con el individuo de la línea emc se pueden obtener híbridos F1 en los que se ha restaurado la fertilidad.

La introducción de ADN según la presente invención en la planta se puede permitir la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática.

Para la planta regenerada descrita anteriormente, la expresión se puede confirmar mediante el cruce con colza de la línea emc y examinando la fertilidad de la descendencia. Cuando la transformación se lleva a cabo utilizando una planta de colza que presenta la característica de emc en forma de material, la fertilidad del polen se puede examinar transfiriendo el transformante (individuo regenerado), que ha producido una raíz de la manera descrita anteriormente, a un suelo que contiene un fertilizante convencional para floración. Este procedimiento resulta preferente teniendo en cuenta la facilidad de manejo y el aspecto temporal.

En el transformante anterior, cuando la transformación se lleva a cabo tal como se ha descrito anteriormente utilizando la célula o el tejido, preferentemente el hipocótilo, un cotiledón, una hoja, el polen, la célula cultivada, el callo y el protoplasto de la planta de colza que presenta esterilidad masculina citoplasmática como fuente de células, la planta en la que se ha restaurado la fertilidad del polen se puede obtener mediante la transferencia de la planta (individuo regenerado) producida por el método anterior a una tierra que contiene el fertilizante convencional para floración.

El cuerpo de la planta en cuyo núcleo se ha integrado el ADN se puede obtener mediante la introducción del ADN según la presente invención en la célula emc por el método de introducción de genes descrito anteriormente utilizando la célula emc, seleccionando la célula en cuyo núcleo está integrado el ADN utilizando como índice un marcador de selección de tolerancia frente a un antibiótico, tal como kanamicina, o de tolerancia a un herbicida, y cultivando a continuación la célula en el medio de cultivo de crecimiento o el medio de cultivo de enraizamiento, tal como se ha descrito anteriormente. En este cuerpo de planta, la fertilidad se ha restaurado frente al carácter de esterilidad masculina.

Para detectar el gen implicado en la restauración de la fertilidad, el método aplicable consiste en utilizar un cebador oligonucleótido con entre 15 y 50 unidades libremente diseñado a partir del ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sonda con al menos 15 unidades que consiste en la totalidad o una parte del ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y se confirma que la cantidad de la secuencia de nucleótidos amplificada por el cebador o la cantidad de la secuencia de nucleótidos detectada por la sonda en el organismo de muestra de interés es de 1 gen o más en 1 genoma.

Un ejemplo de técnica específica para la confirmación es el método PCR y el método de hibridación de Southern, de entre los cuales resulta preferente el método PCR. Estas técnicas se pueden llevar a cabo de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 (en adelante abreviado Molecular Cloning 2ª ed.).

Para confirmar que se encuentra 1 gen o más en 1 genoma mediante el método PCR, es necesario que, como técnica simplificada, se puede observar un mismo grado de amplificación mediante el uso de un mismo número de copias del ADN como plantilla. Más exactamente, en la misma muestra biológica de una misma cantidad, la cantidad de dicho gen amplificado conocido se compara con la cantidad de la secuencia de nucleótidos amplificada mediante el uso del cebador mediante la aplicación del método PCR cuantitativo utilizando un cebador opcional para amplificar un gen conocido como estándar interno en el que hay 1 gen en 1 genoma. En el método de hibridación de Southern, el ADN de la planta de la línea restauradora de la fertilidad en el que 1 gen está presente en 1 genoma se compara con el ADN de la planta de muestra objetivo en una cantidad idéntica y a continuación se comprueba que las cantidades de los ADN detectados son idénticas o superiores.

Un ejemplo de cebador utilizado en el método PCR es el oligonucleótido de 15 a 50 unidades idéntico o complementario a la secuencia de ADN de SEC ID nº: 1, o SEC ID nº: 2.

Un ejemplo de la sonda utilizada en el método de hibridación de Southern es una región total de una doble hebra de ADN idéntica a la secuencia de ADN de SEC ID nº: 1 o SEC ID nº: 2, o una parte de, como mínimo, 15 unidades o más de la misma, o la región total de un ADN de hebra sencilla o una hebra complementaria de la misma, o una parte de al menos 15 unidades o más de la misma. Además, se puede utilizar un ADN que tiene un cierto grado de homología o más con respecto a la secuencia de nucleótidos del ADN que se utiliza como sonda, tal como se ha mencionado anteriormente. El “cierto grado de homología o más” utilizado en el presente documento es, por ejemplo, el 70% o superior, preferentemente el 80% o superior, más preferentemente el 90% o superior, aún más preferentemente el 93% o superior, particularmente preferentemente 95% o superior y todavía más preferentemente 97% o superior. El ADN que tiene dicho cierto grado de homología o más incluye el polinucleótido que presenta homología descrito anteriormente y el polinucleótido de la hebra complementaria del mismo.

El método para la detección del gen tal como se ha descrito anteriormente se puede aplicar como medio no sólo de confirmación de la integración del ADN en el transformante, sino también de la confirmación de la presencia del gen Rf en el individuo en el que se pretende llevar a cabo la introducción del gen Rf por cruce. Al utilizar este método, la presencia del gen Rf se puede confirmar antes de la floración cuando el gen Rf se introduce en el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática. Cuando el gen Rf se introduce en la planta que presenta un citoplasma común, la fertilidad del individuo de la siguiente generación obtenida mediante el cruce del polen en una etapa de floración con el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática debe ser confirmada, pero la presencia del gen Rf se puede confirmar antes de esta etapa utilizando el presente método. Dicho método se conoce generalmente como uso de un ADN marcador o reproducción de ADN marcador. El gen Rf se puede utilizar como ADN marcador del gen Rf (marcador Rf). El marcador Rf, tal como se ha descrito anteriormente, es importante para la reproducción de una variedad de planta comercial utilizando un recombinante en el que se ha introducido el ADN y una planta no recombinante en la que se ha introducido el gen Rf por cruce como planta madre.

Se puede confirmar si el ADN introducido funciona como gen Rf mediante la confirmación de la restauración de la fertilidad del transformante tal como se ha mencionado anteriormente, y también por el método que se presenta a continuación.

Tal como se ha descrito anteriormente, el gen Rf restaura la fertilidad del cuerpo de la planta reduciendo la cantidad de proteína ORF125 u ORF138, que es la proteína asociada a emc, la cual se acumula en las mitocondrias. En consecuencia, al confirmar la reducción de la cantidad de proteína ORF125 u ORF138 acumulada en las mitocondrias del transformante, se puede confirmar que el gen introducido es el gen Rf.

El método para confirmar la reducción de la cantidad de proteína ORF125 u ORF138 acumulada en las mitocondrias es, por ejemplo, un método por el que se confirma que la cantidad de señal de hibridación de un anticuerpo contra la proteína derivada de un genoma mitocondrial utilizado como estándar interno, tal como anti-F1-F0-ATPasa (en adelante abreviado ATPA) descrito en N. Koizuka y otros, Theor. Appl. Genet., 100: 949-955, 2000, es igual entre el individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática y el transformante en el que se ha introducido el ADN en la planta con fertilidad restaurada o el individuo con esterilidad masculina citoplasmática, cuando la proteína ORF125 u ORF138 se detectan por el método transferencia Western según la condición descrita en la presente memoria, y que la cantidad acumulada en el transformante producido introduciendo el ADN en la planta con la fertilidad restaurada o el individuo con esterilidad masculina citoplasmática se ha reducido en más del 50%, preferentemente en el 60% o más, más preferentemente en el 80% o más, en comparación con la cantidad de proteína ORF125 u ORF138 acumulada en el individuo con esterilidad masculina citoplasmática.

En la práctica, en un capullo de la planta de rábano con esterilidad masculina citoplasmática que tiene ORF125, cuando se introduce el gen Rf restaurador de la fertilidad, la cantidad de proteína ORF125 acumulada se reduce notablemente, lo que lleva a una detección prácticamente nula. En la colza, en un capullo de la planta con la fertilidad restaurada en la que se ha introducido el gen restaurador de la fertilidad en colza con esterilidad masculina citoplasmática que tiene la proteína ORF125 mediante cruce, se ha observado que la cantidad de proteína ORF125 acumulada se reduce en un 80% o más. En el ejemplo, en el capullo de la colza transformante en la que se ha introducido el gen en el individuo con esterilidad masculina citoplasmática, se ha observado que la cantidad de proteína ORF125 acumulada se reduce en un 80% o más.

El anticuerpo contra la proteína ORF125 y ORF138 del método descrito anteriormente se puede obtener mediante la siguiente técnica convencional. Estas proteínas se inoculan en un animal como antígeno para obtener un antisuero, y el anticuerpo inmunoglobulina G se puede purificar utilizando una columna de afinidad que tiene fijada proteína A. El antígeno se puede obtener mediante la purificación de la proteína a partir del individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática y que la expresa, y de la célula cultivada por un método convencional. Además, el antígeno también se obtiene por combinación de los genes de ORF125 y ORF138 con el vector de expresión para expresarlo en Escherichia coli y levadura, seguido de purificación de un modo parecido. Además, el péptido obtenido por síntesis química de la longitud entera o una parte de la misma de la proteína ORF125 y ORF138 se puede utilizar como antígeno. El anticuerpo contra el ATPA también se puede obtener mediante una técnica similar.

Además, mediante la introducción de una parte o la totalidad del gen según la presente invención en la célula que tiene un citoplasma con emc y/o el ADN según la presente invención junto con el promotor de inducción, la expresión de la emc se puede regular de forma específica y temporal y, de este modo, se puede alcanzar un nuevo sistema de producción de semillas híbridas que no necesitan una línea masculina que mantenga la esterilidad (mantenedora) y/o la línea restauradora (línea Rf) necesaria para la producción de semillas híbridas.

Es decir, normalmente la colza de la línea emc es estéril y, por lo tanto, la propagación y mantenimiento de la línea emc requiere la línea mantenedora en la que la emc y el Rf no están involucrados. Por lo tanto, hasta ahora, la producción de una semilla híbrida requería plantas de 3 líneas, concretamente, la línea Rf, la línea emc y la línea mantenedora. Sin embargo, debido a que el gen Rf ha sido aislado e identificado por la presente invención, aplicar el método para llevar a cabo la inducción del promotor mediante una sustancia química en la producción de híbridos con el fin de regular la expresión del gen restaurador permite la construcción de la línea emc con capacidad de propagación y mantenimiento incluso sin la línea mantenedora.

Específicamente, la longitud entera o una parte de la misma del gen según la presente invención se integra en un vector que presenta el promotor inducido desde el exterior, por ejemplo, el promotor sensible a fármacos, en una dirección antisentido o sentido, o es un vector construido para inducir el silenciamiento génico con el promotor inducible. A continuación, la célula que presenta el citoplasma emc y el ADN según la presente invención, o que tiene únicamente el citoplasma emc, se transforma utilizando el vector.

La célula que presenta el citoplasma emc y/o el ADN según la presente invención puede ser no sólo la célula obtenida mediante la transformación de una célula que tiene el citoplasma emc con el ADN según la presente invención por el método descrito anteriormente, sino también la célula obtenida mediante el cruce de la línea emc con la línea Rf.

El promotor inducible descrito anteriormente se conoce, por ejemplo, a partir de la publicación de patente japonesa abierta a inspección pública 6-46697, y el método para la preparación del vector y la transformación tiene un ejemplo en las técnicas similares a las descritas anteriormente.

Normalmente, el promotor no se induce en el transformante, que es la célula obtenida por el método descrito anteriormente, tiene citoplasma emc y tiene o no ADN según la presente invención, y en el que una parte o la totalidad del ADN según la presente invención se integra junto con el promotor de inducción. Por lo tanto, la planta que lleva el vector diseñado para la regulación al alza del gen descrito anteriormente muestra fertilidad cuando se aplica la inducción, o la planta que lleva el vector diseñado para la regulación a la baja del gen muestra fertilidad causada por la inhibición de la expresión del gen Rf endógeno, y el mantenimiento de la línea se puede llevar a cabo por autopolinización. En la producción del híbrido, la sustancia química que tiene capacidad de inducir el promotor actúa sobre la planta que lleva un vector que puede regular a la baja el gen Rf endógeno y, por lo tanto, se inhibe la expresión del gen Rf. De este modo, la planta adquiere esterilidad masculina y, por lo tanto, se puede utilizar como línea emc en la producción de la semilla híbrida. Además, cuando la línea emc que tiene tanto el gen Rf endógeno y el constructo de regulación a la baja, la línea Rf necesaria hasta ahora para la producción de semillas híbridas pasa a ser innecesaria. En consecuencia, todas las variedades o líneas de colza sin el gen Rf se pueden utilizar como donantes de polen (padre). Así, además de ser innecesaria la línea mantenedora, la línea Rf se vuelve igualmente innecesaria y se pueden reducir considerablemente los costes de producción.

La aplicación de estos métodos permite la propagación y mantenimiento por autopolinización, incluso en la línea emc. En consecuencia, aunque hasta el momento son necesarias 3 líneas para la producción de la semilla híbrida, es posible que la línea mantenedora se vuelva innecesaria y se puedan reducir considerablemente los costes de producción.

A continuación se describen con mayor detalle los ejemplos de la presente invención no limitativos del alcance de la presente invención en ningún sentido.

Ejemplos

Ejemplo 1: Aislamiento de un marcador de ADN relacionado con el gen restaurador de la fertilidad masculina citoplasmática y preparación del mapa genómico

Para el aislamiento del gen restaurador de la fertilidad (gen Rf), es necesario en primer lugar aislar el marcador de ADN situado alrededor del gen Rf y preparar el mapa genómico que muestra una relación entre las distancias genéticas de este marcador de ADN y el gen Rf. Como punto de partida, se llevó a cabo la clonación posicional de una región Rf.

Como método para aislar el marcador de ADN, se llevó a cabo un método AFLP utilizando el AFLP Analysis System I AFLP Starter Kit de GIBCO BRL para el método AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados) (Nucleic Acids Research, 1995, vol. 23, nº 21: 4407-4414). Como material utilizado para medir la distancia genética desde el marcador, se utilizó una población F2 de aproximadamente 2.100 individuos obtenida por autopolinización de ocho individuos de la generación F1 de rábano producida mediante el cruce de un individuo ((KC2/KA1)-1) de Raphanus sativus cv. Kosena de la línea emc con un individuo (Yuan10-3) de Raphanus sativus cv. Yuanhong según el método descrito en N. Koizuka y otros, Theor. Appl. Genet., 100: 949-955 2000. Como resultado, se aislaron, en una forma que intercalaba el gen Rf, 5 marcadores enlazados en una posición con una distancia genética comprendida entre 0,2 y 0,3 cM desde cada lado del gen. La figura 1 muestra el mapa genómico que pone de manifiesto la distancia genética de cada marcador de ADN y del gen Rf.

Ejemplo 2: Preparación del cóntigo y análisis del gen Rf sobre la base del mapa genómico

Tras la elaboración del mapa genómico, es necesario que el ADN genómico correspondiente a la posición esté clonado y los marcadores de ADN que intercalan el gen Rf estén enlazados. Dado que los marcadores de ADN están lejos del gen Rf, mediante la combinación de una serie de clones con el fragmento de ADN genómico se preparó el cóntigo de la región del gen Rf que cubre los marcadores de ADN.

Un grupo de clones que presentan el fragmento de ADN genómico se denomina biblioteca genómica. Se prepararon dos tipos de biblioteca. Como dador de ADN, el ADN genómico se preparó a partir de rábano Yuanhong, que es el mismo que el progenitor de la línea restauradora para la preparación de la población F2 mediante el método CTAB (Murray, M. G. y Thompson, W. F. (1980) Nucleic Acids Res., 8, 4321) según una técnica convencional. Para la biblioteca, se preparó una biblioteca de fagos lambda con una longitud promedio de 20 kb y una población de 1,5 x 105 individuos utilizando un vector λ DASH II (Stratagene) como vector lambda. Como vector cósmido, se preparó una biblioteca de cósmidos con una longitud promedio de 40 kb y una población de 5,5 x 104 individuos utilizando el vector PNEB::-TNC (EPICENTRE TECHNOLOGIES).

En la preparación del cóntigo, en primer lugar se aisló un clon lambda de la biblioteca de fagos lambda preparada del modo descrito anteriormente utilizando el marcador de ADN situado a ambos lados del gen Rf como índice mediante la técnica de hibridación en placa. Se aisló un clon cósmido de la biblioteca de cósmidos utilizando la técnica de hibridación de colonias para completar el cóntigo que cubre los marcadores de ADN de ambos lados, tal como se muestra en la figura 1. Para los clones de cósmidos NIT7/2 y TO3-2, que forman una parte del cóntigo, la secuencia de nucleótidos se determinó por un método convencional.

A continuación, la secuencia de nucleótidos de los clones de cósmidos NIT7/2 y TO3-2 que componen una parte del cóntigo se analizó mediante “Genscan” (Mitsubishi Space Software) considerando un parámetro para Arabidopsis thaliana, cuya secuencia de ADN genómico es parecida a la del rábano y cuya secuencia genómica total ha sido determinada recientemente. De resultas de ello, se descubrieron la región promotora que parecía expresar el gen Rf, la región génica estructural que contiene el intrón y la región de terminación. Además, se obtuvieron el gen que tiene una forma susceptible de ser traducida a la proteína de la que se han eliminado los intrones y la secuencia de aminoácidos del mismo.

Ejemplo 3: Subclonación de la región de ADN genómico

El fragmento HpaI-SwaI (8546 pb) del ADN que presenta una secuencia correspondiente a los nucleótidos 1º a 8553º de SEC ID nº: 1, que contiene suficientes regiones desde el promotor hasta el terminador detectadas por “Genscan”, se separó del vector mediante electroforesis en gel utilizando agarosa (FMC) para la recolección de los fragmentos. El gel que contenía el fragmento de ADN se digirió con GELase (Epicentre Technologies) para recoger el ADN. A continuación, se obtuvieron fragmentos clonados mediante la división del fragmento obtenido utilizando una enzima de restricción, BamHI. Estos fragmentos de ADN se subclonaron en vector pGEM-T Easy (Promega) a fin de obtener cds6BT/pGEM-T Easy. Los detalles se facilitan a continuación.

Se añadieron 1 µg de ADN cósmido NIT7/2 y 10 unidades de enzima de restricción HpaI (Takara) a 100 µl de solución tampón 1xK con enzimas de restricción (Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, KCl 100 mM) y se incubó a 37ºC durante 1 hora.

Tras la incubación, se añadieron 10 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 250 µl de etanol y se agitó, seguido de enfriamiento a -80ºC durante 5 minutos, y a continuación la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la mezcla se centrifugó a

15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó con un secador de centrifugación en vacío durante 5 minutos. Se añadieron 89 µl de agua esterilizada al precipitado de ADN recogido a fin de disolver el ADN.

A la solución de ADN disuelto se le añadieron 10 µl de solución tampón 10xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 500 mM (pH 7,5), MgCl2 100 mM, ditiotreitol 10 mM, NaCl 1.000 mM), 1 µl de enzima de restricción SwaI 10 unidades/µl (Takara) y la mezcla se incubó a 25°C durante 1 hora. Se añadieron 11 µl de 10x solución tampón de carga (1% de SDS, 50% de glicetrol, 0,05% de azul de bromofenol).

Se mezclaron 1,2 g de agarosa de punto de fusión bajo, agarosa SeaPlaque GTG (FMC) y 150 ml de solución tampón TAE 1x (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM), la mezcla se calentó a 100ºC para fundir la agarosa y se enfrió a 45ºC con agitación. Se colocó un peine de 30 mm de ancho x 1 mm de espesor en una bandeja de gel de 14 x 15 cm y el gel enfriado se vertió para la coagulación. El ADN al que se había añadido un colorante de carga se vertió en el peine de gel y se sometió a electroforesis en TAE 1x a un voltaje de 30 V/30 cm durante 18 horas.

El gel de electroforesis se transfirió a 0,5 µg/ml de bromuro de etidio/solución TAE 1x para la tinción durante 30 minutos. El gel se colocó en un transiluminador en el que se irradiaron rayos ultravioleta con una longitud de onda de 365 nm y un fragmento de interés de 8546 pb se cortó con un cuchillo esterilizado. A continuación, el gel se cortó a fin de obtener fragmentos cuadrados de aproximadamente 1 mm y se transfirió a microtubos de 2 ml previamente pesado, y se determinó el peso del gel.

Se añadió 1 µl de tampón 50x GELase (Bis-Tris 2M (pH 6,0), NaCl 2M) por 50 mg de peso de gel. El tubo que contenía el gel se incubó en un bloque calefactor seco a 68ºC, la solución se agitó dándole de vez en cuando la vuelta y se incubó durante 10 minutos para fundir completamente el gel. El tubo se pasó al bloque calefactor seco a 45ºC, la solución se agitó dándole de vez en cuando la vuelta y se incubó durante 5 minutos. Se añadió a este tubo 1 unidad de GELase (Epicentre Technologies) por 200 mg de peso del gel, la solución se agitó dándole de vez en cuando la vuelta y se incubó durante 30 minutos en el bloque calefactor seco a 45ºC.

Se añadió 1/3 de volumen de acetato de amonio 10 M (pH 7,0) por 1 volumen del gel y la solución se agitó y se centrifugó a 15.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo microtubo de 2 ml y se añadieron 2 volúmenes de etanol. El tubo se agitó y centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la solución se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó en un secador de centrifugación en vacío durante 5 minutos. Se añadieron 20 µl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) al precipitado y la solución se disolvió por completo para recoger el ADN.

A 20 µl de la solución de ADN recogida se le añadieron 10 µl de solución tampón 10xK con enzimas de restricción (Tris-HCl 200 mM (pH 8,5), MgCl2 100 mM, ditiotreitol 10 mM, KCl 1.000 mM), 68 µl de dH20, 2 µl de enzima de restricción BamHI 10 unidades/µl (Takara), y la mezcla se incubó a 30ºC durante 1 hora. Tras la incubación, se añadieron 10 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 250 µl de etanol y la mezcla se agitó y enfrió a -80ºC durante 5 minutos, y a continuación se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron de nuevo cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó durante 5 minutos utilizando un secador de centrifugación en vacío. Se añadieron 20 µl de agua esterilizada al precipitado de ADN recogido a fin de disolverlo. Se añadieron y mezclaron 55 µl de agua esterilizada, 10 µl de 10x solución tampón de PCR (Tris-HCl 100 mM (pH 8,3), KCl 500 mM), 6 µl de MgCl2 25 mM, 8 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de 5 unidades/µl de Taq ADN polimerasa (Takara), y a continuación la mezcla se incubó a 72ºC durante 30 minutos para añadir dATP en la posición 3’ terminal.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) y se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos.Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la mezcla se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se añadieron 20 µl de la solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM), se retiró la unidad de filtración y se invirtió la dirección para fijar el nuevo microtubo. La solución se centrifugó a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos para recoger el ADN en la unidad de filtro.

Se mezclaron 1 µl de vector pGEM-T Easy (Promega) 50 ng/µly6 µl de solución I del kit ADN Ligation Kit Ver.2 (Takara) con 5 µl del ADN purificado obtenido por el método anterior, y a continuación se incubó la mezcla a 16ºC durante 30 minutos.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) junto con 100 µl de agua esterilizada y a continuación se centrifugó la solución a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la mezcla se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se retiró la unidad de filtro y se invirtió la dirección para fijar el nuevo microtubo.

El ADN de la unidad de filtro se recogió por centrifugación a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos.

El ADN recogido en el tubo se enfrió poniéndolo en hielo. Se introdujeron en el tubo 30 µl de Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) para la electroporación y se mezclaron suavemente. Las células de Escherichia coli mezcladas con ADN se transfirieron a una cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,25 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 37ºC. La Escherichia coli se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 37ºC durante 1 hora. La Escherichia coli cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 100 µg/ml de ampicilina (Wako Pure Chemicals Ltd.), 20 µg/ml de X-Gal (Takara) y 1 mM de IPTG (Takara), y se cultivó durante 18 horas o más a 37ºC.

Una colonia blanca aparecida en un medio de cultivo de agar se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron 100 µg/ml de ampicilina. El ADN plásmido se extrajo de células cultivadas de Escherichia coli por el método convencional. Se confirmó que un fragmento de interés se clonó en el ADN plásmido por escisión con enzima de restricción EcoRI (Takara), y así se obtuvo cds6BT/pGEM-T Easy.

Se cultivó Escherichia coli DH10B individual portadora del cds6BT/pGEM-T Easy obtenido por el método anterior a 37ºC durante 18 horas en 100 ml de medio de cultivo LB al que se añadieron 100 µg/ml de ampicilina. La purificación se llevó a cabo por el método alcalino con SDS utilizando el equipo Qiagen Midi Kit (QIAGEN).

Ejemplo 4-1: Preparación del vector para la transformación de plantas (1)

El cds6BT/pGEM-T Easy se dividió con la enzima de restricción EcoRI y se separó del vector mediante electroforesis en gel utilizando agarosa para la recolección de los fragmentos. El fragmento de ADN obtenido se clonó en el sitio EcoRI del vector para la transformación de plantas pKM424 (un vector en el que se añadieron un fragmento del promotor CaMV35S: gen GUS: un terminador NOS al pKM424, es el vector pLAN421 (Plant Cell Reports 10 (1991) 286-290)) a fin de preparar el vector para la transformación de plantas cds6BT/pKM424. Los detalles se facilitan a continuación.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM) se le añadió 1 µg de ADN cds6BT/pGEM-T Easy y 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora.

Posteriormente, el fragmento EcoRI que contenía cds6BT se separó y se recogió de cds6BT/pGEM-T Easy por el mismo método que para recoger el fragmento HpaI-SwaI anterior.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM) se añadió 1 µg del vector para la transformación de plantas pKM424 y 10 unidades de enzima de restricción EcoRI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. Tras la incubación, se añadieron 100 µl de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y 1 unidad de fosfatasa alcalina bacteriana (Takara) y se mezcló. A continuación, se llevó a cabo una desfosforilación mediante la incubación a 50ºC durante 1 hora.

Se añadieron 200 µl de fenol-cloroformo saturado de solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM) y la mezcla se agitó vigorosamente. Se llevó a cabo una centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos y a continuación se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Se repitió la misma operación para eliminar la proteína. Se añadieron 20 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 500 µl de etanol y la mezcla se agitó y enfrió a -80ºC durante 5 minutos, seguido de centrifugación a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó durante 5 minutos utilizando un secador de centrifugación en vacío. Se añadieron 100 µl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) al precipitado a fin de disolverlo completamente para obtener una concentración de 10 ng/µl.

Se mezclaron 10 µl de fragmento EcoRI purificado, 1 µl de vector pKM424 desfosforilado y 11 µl de solución I del kit ADN Ligation Kit Ver. 2 (Takara), y a continuación la mezcla se incubó a 16ºC durante 30 minutos.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) junto con 100 µl de agua esterilizada y se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la solución se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se retiró la unidad de filtro y se fijó a un nuevo microtubo en dirección invertida.

La centrifugación se llevó a cabo a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos para recoger el ADN en la unidad de filtro.

El ADN recogido en el tubo se puso en hielo a fin de enfriarlo. Se introdujeron en el tubo 30 µl de Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) para la electroporación y se mezclaron suavemente. La Escherichia coli mezclada con ADN se transfirió a una cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,25 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 37ºC. La Escherichia coli se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 37ºC durante 1 hora. La Escherichia coli cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 50 µg/ml de espectinomicina (Sigma) y se cultivó durante 18 horas o más a 37ºC.

La colonia que apareció en el medio de agar se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron 50 µg/ml de espectinomicina. El ADN plásmido se extrajo de la Escherichia coli cultivada por un método convencional. Se confirmó que la región situada desde el sitio BamHI al sitio HpaI se clonó en el ADN plásmido por escisión con enzima de restricción HindIII (Takara). El plásmido se denominó cds6BT/pKM424.

Se cultivó a 37ºC durante 18 horas Escherichia coli DH10B portadora de cds6BT/pKM424 en 250 ml de medio LB al que se añadieron 50 µg/ml de espectinomicina. Se llevó a cabo una purificación por el método SDS alcalino utilizando el kit Qiagen Midi Kit (Qiagen Corp).

Ejemplo 4-2: Preparación del vector para la transformación de plantas (2)

Se dividió el clon lambda CHI (véase la figura 2, fragmento clonado con una longitud de aproximadamente 17 kb) suficientemente portador de la secuencia de nucleótidos SEC ID nº: 1 con una enzima de restricción NotI (Takara), que se encuentra en el sitio de clonación múltiple, y a continuación se separó del vector mediante electroforesis en gel de agarosa a fin de recoger el fragmento, que se clonó en el sitio NotI del vector pBIGRZ2 (Bioscience and Industry, 55 (1997), 37-39) para la transformación de plantas a fin de preparar el vector CHI/pBIGRZ2 para la transformación de plantas. Los detalles se facilitan a continuación.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM, 0,01% de BSA y 0,01% de Triton X-100) se le añadieron 1 µg del ADN de clon lambda CHI y 10 unidades de enzima de restricción NotI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. El fragmento NotI del clon lambda CHI se separó y se recogió por el mismo método aplicado para la recolección del fragmento HpaI-SwaI, tal como se ha descrito anteriormente.

A 100 µl de solución tampón 1xH con enzimas de restricción (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 100 mM, 0,01% de BSA y 0,01% de Triton X-1) se le añadieron 1 mg del vector pBIGRZ2 para la transformación de plantas y 10 unidades de enzima de restricción NotI (Takara), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. Tras la incubación, se añadieron y mezclaron 100 µl de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y 1 unidad de fosfatasa alcalina bacteriana (Takara), y la mezcla se incubó a 50ºC durante 1 hora para la desfosforilación.

Se añadieron 200 µl de fenol/cloroformo saturado con solución tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) y a continuación se agitó la mezcla vigorosamente. Tras una centrifugación a 15.000 rpm durante 5 minutos, se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Se repitió la misma operación para eliminar la proteína. Se añadieron 20 µl de acetato de sodio 3M (pH 5,6) y 500 µl de etanol y la mezcla se agitó y enfrió a -80ºC durante 5 minutos, seguido de centrifugación a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se añadió cuidadosamente 1 ml de etanol al 70%, y la solución se centrifugó a 15.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se secó durante 5 minutos utilizando un secador de centrifugación en vacío. Se añadieron 100 µl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM) al precipitado a fin de disolverlo completamente para obtener una concentración de 10 ng/µl.

Se mezclaron 10 µl de fragmento NotI purificado, 1 µl de vector pBIGRZ2 desfosforilado y 11 µl de solución I del kit ADN Ligation Kit Ver.2 (Takara), y la mezcla se incubó a 16ºC durante 30 minutos.

La solución de reacción anterior se transfirió a una unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-50 (Millipore) junto con 100 µl de agua esterilizada y se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se descartó el agua, se añadieron de nuevo 100 µl de agua esterilizada y la mezcla se centrifugó a 5.000 rpm y 4ºC durante 20 minutos. Se retiró la unidad de filtro y se invirtió la dirección para fijar el nuevo microtubo. La solución se centrifugó a 3.000 rpm y 4ºC durante 5 minutos para recoger el ADN en la unidad de filtro.

El ADN recogido en el tubo se puso en hielo a fin de enfriarlo. Se introdujeron en el tubo 30 µl de Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) para la electroporación y se mezclaron suavemente. La Escherichia coli mezclada con el ADN se transfirió a la cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,25 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 37ºC. La Escherichia coli se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 37ºC durante 1 hora. La Escherichia coli cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 25 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals) y se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más.

La colonia que apareció en el medio de agar se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron 25 µg/ml de kanamicina. El ADN plásmido se extrajo de la Escherichia coli cultivada por el método convencional. Se confirmó por escisión con enzima de restricción HindIII (Takara) que un fragmento de interés se clonó en el ADN plásmido. El plásmido se denominó CHI/pBIGRZ2.

Se cultivó a 37ºC durante 18 horas Escherichia coli DH10B portadora de CHI/pBIGRZ2 en 250 ml de medio LB al que se añadieron 25 µg/ml de kanamicina. Se llevó a cabo una purificación por el método SDS alcalino utilizando el kit Qiagen Midi Kit (Qiagen).

Ejemplo 5: Transferencia del vector para la transformación de planta a Agrobacterium

Se preparó una célula competente de Agrobacterium y se transfirieron respectivamente el vector cds6BT/pKM424 y el vector CHI/pBIGRZ2 obtenidos en los ejemplos 4-1 y 4-2 al Agrobacterium EHA101 para la transformación de plantas. Los detalles se indican a continuación.

La célula competente para la electroporación de Agrobacterium EHA101 se preparó por el método siguiente. Se diseminó Agrobacterium EHA101 en medio LB agar al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals) y 25 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals), y se cultivaron a 28ºC durante 24 horas o más para obtener una única colonia. Se introdujeron 20 ml de medio LB al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina y 25 µg/ml de cloranfenicol en un tubo de centrífuga de 50 ml, se inoculó la colonia de aproximadamente 1 mm de diámetro y se sometió a cultivo con agitación a 28ºC durante 40 horas. Después de 40 horas, se abrió y cerró una vez la tapa del tubo de centrífuga y el cultivo se prosiguió del mismo modo durante 4 horas. La solución de cultivo se centrifugó a 1.500 x g y 4ºC para recoger las células. Una vez descartado el sobrenadante, se añadieron al tubo 40 ml de glicerol al 10% enfriado con hielo y esterilizado, seguido de resuspensión de las células y centrifugación a

1.500 x g a 4ºC para la recolección de las células. Esta operación se repitió dos veces. Se añadieron 500 µl de glicerol al 10% esterilizado y enfriado con hielo a las células obtenidas para la resuspensión. Se dispusieron 100 µl de las células en cada uno de los microtubos esterilizados y se congelaron con nitrógeno líquido, y a continuación se guardaron a -80ºC en un congelador.

Se disolvieron en hielo células competentes de Agrobacterium EHA101 para la electroporación. Se introdujeron 40 µl de células electrocompetentes en tubos de 1,5 ml previamente enfriados y se añadieron 100 ng de ADN plásmido de cualquiera de los vectores cds6BT/pKM424 o CHI/pBIGRZ2, y se mezcló suavemente.

La Agrobacterium mezclada con el ADN se transfirió a la cubeta (USA Scientific Plastics) previamente enfriada en hielo para la electroporación (la distancia entre electrodos era de 1 mm). Se llevó a cabo la electroporación en un equipo Electro Cell Manipulator 600 (BTX) en condiciones de 1,44 kv, 129 0 y 50 µF, y a continuación se añadieron inmediatamente a la cubeta 500 µl de medio de cultivo SOC (Gibco BRL) calentado a 30ºC. La Agrobacterium se transfirió a un tubo de cultivo de 10 ml y se sometió a cultivo con agitación a 30ºC durante 1 hora.

En cuanto a la Agrobacterium a la que se transfirió el vector cds6BT/pKM424, la Agrobacterium cultivada se extendió en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar) al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals), 25 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals), 50 µg/ml de espectinomicina (Sigma) y 2,5 µg/ml de tetraciclina (Sigma), y se cultivó a 28ºC durante 24 horas o más.

En cuanto a la Agrobacterium a la que se transfirió el vector CHI/pBIGRZ2, la Agrobacterium cultivada se extendió en medio LB agar al que se añadieron 50 µg/ml de kanamicina (Wako Pure Chemicals), 25 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals) y 30 µg/ml de higromicina (Sigma), y se cultivó a 28ºC durante 24 horas o más.

La colonia que apareció en el medio de agar se cultivó a 30ºC durante 24 horas o más en 2 ml de medio LB al que se añadieron los antibióticos anteriores correspondientes a cada vector. El ADN plásmido se extrajo de la Agrobacterium cultivada por un método convencional. Se confirmó por escisión con enzima de restricción HindIII (Takara) que el vector cds6BT/pKM424 o el vector CHI/pBIGRZ2 se transfirieron a la Agrobacterium. La solución de cultivo cultivada durante 24 horas que contenía el clon confirmado se mezcló con una cantidad idéntica de glicerol esterilizado al 80% y se guardó a -80ºC. Este clon se utilizó para la transformación de la planta de colza.

Ejemplo 6: Preparación del transformante de colza

La transformación de la colza se llevó a cabo de la siguiente manera. Se sometieron semillas de colza emc (SW18) con el gen asociado a la emc orf125 derivado de rábano a un tratamiento de esterilización con una solución de hipoclorito al 10% para germinarlas en medio MS (T. Murashige y F. Skoog, Physiol. Plant. 15: 485, 1962), que no contiene ninguna hormona. Sólo se cortó un hipocótilo de una plántula de 7 a 14 días tras la germinación; se cortó y se dividió en una longitud de 3 a 5 mm y se precultivó en medio MS (Sigma; M5519) que contenía sacarosa (3%), 2,4-D (1 mg/l) y agarosa (0,4%) (Sigma; tipo I) a 23ºC durante un periodo de 12 a 16 horas. Entonces se llevó a cabo un cocultivo junto con una línea celular BY-2 derivada del tabaco para cultivo nodriza.

La Agrobacterium que contenía CHI/pBIGRZ2 se cultivó a 28ºC durante 8 a 48 horas hasta aproximadamente OD600 = 1,0. Las células de Agrobacterium se suspendieron en un medio MS líquido sin hormonas. El hipocótilo cortado se mezcló con esta solución de Agrobacterium y se sometió a cocultivo durante aproximadamente 20 minutos. Tras el cocultivo, el hipocótilo, del que se extrajo la Agrobacterium con un papel de filtro, se cultivó, por ejemplo, en medio MS básico que contenía vitamina B5 (Sigma; M0404), sacarosa (3%) y 2,4-D (1 mg/l) durante 2 días para la infección. Tras la infección, el cotiledón se transfirió al medio desprovisto de bacterias obtenido mediante la adición del antibiótico carbenicilina (Pfizer: zeopen o GIBCO-BRL: sales disódicas de carbenicilina) en una concentración de 500 mg/l en el medio MS básico que contenía vitamina B5, sacarosa (3%) y 2,4-D (1 mg/l), a fin de eliminar la Agrobacterium.

Transcurrido un período de 5 días a 1 semana en el medio desprovisto de bacterias, el hipocótilo se cultivó en medio MS básico que contenía vitamina B5, sacarosa (1%), bencilaminopurina (3 mg/l), carbenicilina (500 mg/l), así como nitrato de plata (5 mg/l) y kanamicina para la selección (de 5 a 30 mg/l) (Nakalai Tesque; sulfato de kanamicina) de 14 a 21 días. En este momento puede aparecer un callo verde, que se debe transferir inmediatamente mediante inoculación en el medio del siguiente paso.

Un ejemplo del medio del siguiente paso es el medio de selección, por ejemplo, medio MS básico (Sigma; M5519), sacarosa (1%), bencilaminopurina (3 mg/l), zeatina (1 mg/l), carbenicilina (500 mg/l) y kanamicina (de 5 a 30 mg/l). El hipocótilo que forma el callo desde un punto de corte se transfirió a este medio de cultivo y se cultivó a 23ºC durante 3 semanas. A continuación, dicha transferencia se repitió de 3 a 5 veces cada 3 semanas hasta la aparición del callo verde.

El callo verde se cortó del hipocótilo en el momento en que hacía aparición y se transfirió al medio con la misma composición. A continuación, cuando sólo la parte verde se cortó y se subcultivó, se formó un brote adventicio con una probabilidad comprendida entre un 1 y un 30%. Posteriormente, dicho brote adventicio se transfirió al medio B5 básico (Sigma; G5893) al que se añadieron sacarosa (3%) y bencilaminopurina (1mg/l), y se sometió a subcultivo seguido de enraizamiento en el medio MS (Sigma; M5519) que contenía sacarosa (3%), ácido nafténico (0,1 mg/l) y bencilaminopurina (0,01 mg/l).

Ejemplo 7: Análisis del transformante (detección del ADN transferido)

Se extrajo una hoja de un individuo del transformante obtenido en el ejemplo 6 que formó un brote y se aisló el ADN utilizando el kit de aislamiento de ADN de Qiagen (DNAeasy Plant Mini).

En 3 sitios (sitios a, b y c) del ADN se detectó el fragmento transferido por el método PCR (el resultado se muestra en la figura 3). El sitio a es una secuencia de 568 pb correspondiente a los nucleótidos 3186º a 3753º de la secuencia SEC ID nº: 1, y como cebador directo se utilizó “5’-GAAGCAAAAAAGAAAACGAGCAGAG-3’” (SEC ID nº: 4) y como cebador inverso se utilizó “5’-CCAAAAATCCGAAATCCGAATAGAC-3’” (SEC ID nº: 5). El sitio b es una secuencia de 244 pb correspondiente a los nucleótidos 4869º a 5112º de la secuencia SEC ID nº: 1, y como cebador directo se utilizó “5’-CTCGGCTCTGGGTTTAGTGA-3’” (SEC ID nº: 6) y como cebador inverso se utilizó “5’-TCCACAAACCCTAGCCAACA-3’” (SEC ID nº: 7). El sitio c es una secuencia de 485 pb correspondiente a los nucleótidos 7766º a 8250º de la secuencia SEC ID nº: 1, y como cebador directo se utilizó “5’-GCTTATGCTTCTCTGGTTCGCCTC-3’” (SEC ID nº: 8) y como cebador inverso se utilizó “5’-CTCAGTTTTCGTCACCTTACACAATGC-3’” (SEC ID nº: 9).

A 1 µl de la solución de ADN transformante (50 ng/µl) se añadieron 12,1 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón de PCR 10 x (Tris-HCl 100 mM (pH 8, 3), KCl 500 mM), 1,2 µl de MgCl2 25 mM, 1,6 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución de cebador directo 10 µM para cada sitio, 1 µl de solución de cebador inverso 10 µM para cada sitio, 0,1 µl de 5 unidades/µl de rTaq ADN polimerasa (Takara), seguido de mezclado. A continuación, el ADN se amplificó repitiendo 35 veces un ciclo de 94ºC durante 40 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Se utilizó UNOII (Biometra) como termociclador. Tras la compleción de la reacción, el producto amplificado se detectó por electroforesis en gel con NuSieve 3:1 agarosa (FMC) al 4%/solución tampón TBE 1 x (tris-borato 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM) (véase la figura 3).

Como conclusión, se puso de manifiesto que el sitio a no se transfirió a esta colza transformada. Se puso de manifiesto que, en los otros dos sitios (sitios b y c), se observó un producto de amplificación con el mismo tamaño que el de un control positivo y, por lo tanto, el ADN se integró en la colza transformada.

Ejemplo 8: Análisis del transformante (detección de la acumulación reducida de la proteína ORF125 asociada a emc)

Se extrajo un capullo de la misma planta que la del ejemplo 7 y se analizó por transferencia Western la acumulación reducida de la proteína ORF125 asociada a emc. El resultado se muestra en la figura 4.

(1) Extracción de la proteína de la planta transformada

Se llevaron a cabo la extracción de proteínas y el transferencia Western según el método de N. Koizuka y otros, (Theor. Appl. Genet. (2000) 100: 949-955).

En concreto, 1 capullo (1 mm de longitud) de la colza transformada obtenida y 100 µl de la solución tampón enfriada con hielo (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), SDS al 2% (p/v)) para la extracción de proteínas se introdujeron en un mortero enfriado con hielo y se trituraron con una mano de mortero. Esta solución se transfirió a un microtubo de centrifugación y se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Tras la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un nuevo microtubo de centrifugación y se calentó a 100ºC durante 5 minutos. La centrifugación se llevó a cabo de nuevo a 15.000 rpm y 4ºC durante 15 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo microtubo de centrifugación a fin de preparar una solución de proteína solubilizada en SDS. La concentración de la solución de proteína solubilizada en SDS se midió por el método de Bradford utilizando un kit de cuantificación de proteínas (Biorad). Simultáneamente a esta operación, la solución de proteína solubilizada en SDS se extrajo de manera similar a partir de los capullos de colza de la línea con esterilidad masculina citoplasmática y colza de la línea restauradora de la esterilidad, y se midieron las concentraciones.

(2): Separación de la proteína por SDS-PAGE y transferencia a una membrana de PVDF: transferencia Western

Con un gel de poliacrilamida-SDS al 10% de 7 x 10 cm, se colocaron 15 µg de la proteína solubilizada en SDS en 1 carril para la separación por electroforesis. Además, para la comparación de las acumulaciones de proteína ORF125 se colocaron series diluidas de colza de la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática en el gel y se separaron. Se llevó a cabo una electroforesis a 10 mA durante 1 hora y 15 mA durante 1 hora. Tras la electroforesis, la proteína contenida en el gel de poliacrilamida se transfirió a la membrana de PVDF (Millipore) utilizando un equipo de electrotransferencia en sistema semiseco (Nippon Electrophoresis) a 100 mA durante una hora.

(3): Detección de la proteína utilizando un anticuerpo: transferencia Western

Las membranas de PVDF a las que se transfirió la proteína se cortaron en mitades y se transfirieron a 10 ml de una solución de bloqueo (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,05%, leche descremada al 5%) y se bloquearon mediante agitación durante una hora. Se detectó ATPA en la membrana superior de PVDF como control de una proteína mitocondrial y se detectó ORF125, que es la proteína implicada en la esterilidad masculina citoplasmática, en la membrana inferior de PVDF. La membrana de PVDF se transfirió a 10 ml de una solución de reacción de anticuerpo primario (se añadieron 100 µl de un anticuerpo monoclonal ATPA para la detección de ATPA a 10 ml de la solución de bloqueo y se añadieron 2 µl de antisuero de conejo anti-ORF125 para la detección de ORF125 (M. Iwabuchi y otros, Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188)), y se agitó durante 18 horas. La membrana de PVDF se transfirió a 100 ml de TTBS (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,05%) y se agitó durante 10 minutos. Esta operación se repitió 3 veces a fin de lavar la solución de anticuerpo primario en exceso. La membrana de PVDF se transfirió a 10 ml de una solución de reacción de anticuerpo secundario (a 10 ml de la solución de bloqueo se añadieron 10 µl de anti-IgG de ratón obtenido en cabra marcado con peroxidasa (Amersham) para la detección de ATPA y 10 µl de anti-IgG de conejo obtenido en cabra marcado con fosfatasa alcalina (Bio-rad) para la detección de ORF125, respectivamente (M. Iwabuchi y otros, Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188)), y ambas soluciones se agitaron durante una hora. La membrana de PVDF se transfirió a 100 ml de TTBS (Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,05%) y se agitó durante 10 minutos. Esta operación se repitió tres veces a fin de lavar la solución de anticuerpo secundario en exceso. Se utilizó un sistema de quimioluminiscencia “ECL+” (Amersham) para la peroxidasa a fin de detectar ATPA, y la exposición se llevó a cabo durante 5 segundos para la detección. Para la detección de ORF125, se utilizó BCIP/NBT (MOSS Inc.), que es un sustrato colorante para fosfatasa alcalina, y la tinción y la detección se llevaron a cabo durante 5 minutos.

Como conclusión, se puso de manifiesto que las acumulaciones de ATPA, que es el control, prácticamente no cambian en el capullo de la colza con esterilidad masculina citoplasmática de 2 líneas, en la colza con fertilidad restaurada y en el capullo de la colza transformante obtenida introduciendo ADN en la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática, pero la acumulación de proteína ORF125 se redujo significativamente en la colza transformante. El alcance de esta reducción es idéntico al de la línea con fertilidad restaurada obtenida mediante la transferencia de un gen restaurador de la fertilidad a la línea que presenta esterilidad masculina citoplasmática mediante cruce (figura 4 e Iwabuchi M. y otros, Plant Molecular Biology (1999) 39: 183-188). Se puso de manifiesto que el grado de reducción de la acumulación de la proteína ORF125 fue de 1/8 a 1/16 en la colza con fertilidad restaurada y de aproximadamente 1/8 en la colza transformante por comparación con las series diluidas. Tal como se ha descrito anteriormente, la restauración de la fertilidad en la colza está fuertemente relacionada con la reducción de la acumulación de la proteína ORF125, y los dos hechos indican lo mismo. Por lo tanto, se demostró que la secuencia de ADN tiene la función de reducir la acumulación de proteína ORF125 en la mitocondria y es una secuencia de ADN genómico portadora del gen restaurador de la fertilidad.

Además, los granos de polen se extrajeron de la planta en floración y se observaron al microscopio. Como conclusión, se confirmó que se producía un polen normal (figura 5).

Ejemplo 9: Aislamiento de ADNc.

El aislamiento del ADNc se llevó a cabo seleccionando la planta F2 que tiene genes Rf1 homocigóticos y muestra fertilidad del polen como donante de ARN de la población F2 utilizado para la elaboración del mapa genético, purificando el ARNm del capullo y utilizando a continuación el método 5’-RACE o 3’-RACE tras la síntesis del ADNc.

(Purificación de ARNm)

Se extrajo el ARN total del capullo de la planta F2 que tiene genes Rf1 homocigóticos y muestra fertilidad del polen aplicando el método del tiocianato de guanidinio como método convencional mediante el uso del kit RNeasy (Qiagen). Se purificó el ARN poliA+ del ARN total utilizando el “kit de purificación de ARNm” (Amersham Pharmacia) con una columna de celulosa Origo (dT) y se utilizó como ARNm.

(Aislamiento de ADNc por 5’-RACE y 3’-RACE)

El ADNc se aisló con 1 µg de ARNm purificado utilizando el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, basado en los métodos 5’-RACE y 3’-RACE. Como cebadores específicos de gen, se utilizó 5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3’ (SEC ID nº: 10) para el 5’RACE y 5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3’ (SEC ID nº: 11) para el 3’-RACE. Después de determinarse la secuencia de nucleótidos del clon obtenido, se obtuvo la secuencia del ADNc (SEC ID nº: 2).

Ejemplo 10: Conversión de ADNc en secuencia de aminoácidos y análisis de la misma

(1): La conversión de ADNc en la secuencia de aminoácidos se realizó utilizando un código genético convencional y el software de análisis de genes “Genetyx-SV” (Software Development K.K.), lo que permite obtener la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3. El motivo PPR se analizó mediante un programa registrado en la base de datos Protein Families Database of Alignments and HMNs (en adelante abreviada Pfam; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml). Como resultado del análisis, se puso de manifiesto que el producto traducido del gen restaurador de la fertilidad de SEC ID nº: 1 fue la proteína que tenía 16 motivos PPR. El motivo PPR tenía 3 complejos PPR. Los 3 complejos eran:

(1): complejo PPR nº 1: complejo PPR comprendido por 175 residuos consecutivos de los motivos PPR primero a quinto desde el extremo N-terminal;

(2): complejo PPR nº 2: complejo PPR compuesto por 245 residuos consecutivos de los motivos PPR sexto a 12º desde el extremo N-terminal; y

(3): complejo PPR nº 3: complejo PPR compuesto por 140 residuos consecutivos de los motivos PPR 13º a 16º desde el extremo N-terminal;

Ejemplo 11: Análisis de la proteína según la presente invención

Se investigó si la traducción se inhibía o no en Escherichia coli uniéndola al producto de transcripción (ARNm) del gen de la proteína ORF125, lo que provoca esterilidad masculina citoplasmática en Kosena.

El gen restaurador de la fertilidad de SEC ID nº: 2 se introdujo en el sitio BamHI-SphI del vector de expresión pQE80L (Qiagen) de Escherichia coli para construir el vector de expresión que añade seis residuos de histidina (6 x His) al extremo N-terminal (pQEB1/cds6). El ADN se amplificó utilizando el cebador: CGGGATCCGCTCACAATT (SEC ID nº: 12) para introducir el sitio BamHI y el cebador M13 Primer RV (Takara) y utilizando el vector pSTV29 (Takara) como plantilla. Para la amplificación del ADN, se utilizó el kit Takara LA PCR Kit (Takara). El ADN amplificado se

dividió mediante las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (Takara), y a continuación se purificó utilizando Suprec02 (Takara). A fin de sintetizar un fragmento de ADN con los sitios BamHI y EcoRI en ambos extremos del sitio 5’-UTR del gen orf125 y 25 aminoácidos de orf125, se llevó a cabo un PCR según el método de Fujimoto (Plant PCR Experiment Protocol: Practice of ADN synthesis, pág. 84-87 (Syuuzyunsya)) utilizando 2 cebadores. Los 2 cebadores utilizados fueron:

y

El ADN amplificado se dividió mediante las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (Takara) y se purificó utilizando Suprec-02 (Takara). El ADN purificado se ligó con el kit Takara Ligation Kit (Takara). Con ello se transformó la Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) y se cultivó a 37ºC durante 18 horas o más en medio LB agar (1% de bactotriptona, 0,5% de extracto de bactolevadura, 1% de NaCl, 1,5% de bacto-agar, IPTG 0,1 mM, X-Gal 20 µg/ml) al que se añadieron 50 µg/ml de cloranfenicol (Sigma). Se extrajo un plásmido de una colonia de color azul pálido por un método convencional y se determinó la secuencia de nucleótidos. De este modo, se construyó un vector (pSTV125-5’#LA6) en el que 174 pb (nucleótidos 7º al 180º de la secuencia de nucleótidos de la figura 6) que contienen la región 5’-UTR del gen orf125 y 25 aminoácidos de orf125 se introdujeron entre el sitio EcoRI y un punto de inicio de transcripción del gen lacZ. Además, simultáneamente, se obtuvo el vector que tiene el fragmento (nucleótidos 7º al 193º de la secuencia de nucleótidos de la figura 6) en el que se producen varias mutaciones en la parte correspondiente a los 174 pb (pSTV125-5’#LA12).

Los vectores pSTV125-5’#LA6 y #LA12 se transfirieron a Escherichia coli DH10B (Gibco BRL) y las células se cultivaron en el medio de agar obtenido mediante la adición de 50 µg/ml de cloranfenicol (Wako Pure Chemicals), 200 µM de IPTG (Wako Pure Chemicals) y 40 µg/ml de X-Gal (Takara) a medio LB, a 37ºC durante una noche a fin de hacer crecer la colonia, lo que dio lugar a una colonia de color azul pálido. De este modo se confirmó que el gen LacZ transferido se expresaba en la Escherichia coli a la que se había transferido cada vector.

Además, a fin de transferir el vector pSTV125-5’ anterior y el vector pQEB1/cds6 a la Escherichia coli, que es la misma que la descrita anteriormente, cuando las células se cultivaron con el medio al que se añadieron 50 µg/ml de ampicilina, en el caso del cocultivo con pSTV125-5’#LA6 la colonia se volvió blanca. Sin embargo, en caso de cocultivo con pSTV125-5’#LA12 con una mutación en un sitio de fragmento de transferencia, la colonia se volvió azul pálido y el grado de azulamiento fue el mismo que en el caso del #LA12 solo. Se examinó si a la Escherichia coli le faltaba alguno de estos vectores transferidos mediante la extracción de los vectores por un método convencional tras el cultivo de cada colonia.

A partir de los resultados anteriores, se entiende que la proteína expresada en Escherichia coli por el vector pQEB1/cds6 se convirtió en la colonia blanca a través de la supresión de la expresión del gen LacZ como resultado de la unión con el ARNm de pSTV125-5’#LA6. En el caso de cocultivo con pSTV125-5’#LA12, se entiende que la mutación se produce en el sitio de fragmento de transferencia y por lo tanto la proteína derivada de pQEB1/cds6 no se puede unir a ARNm y, en consecuencia, el gen LacZ se expresa y provoca el color azul.

En consecuencia, se supone que la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 3 afecta al ARNm de orf125, más específicamente al producto de transcripción de una región código de como mínimo la región orf125-5’UTR y 25 residuos aminoácidos de ORF125 con el fin de suprimir la expresión de la proteína ORF125.

Se supone que el producto de traducción del gen según la presente invención, después de translocarse a la mitocondria, se une al gen de esterilidad masculina en la mitocondria e inhibe la traducción, lo que provoca la reducción de la acumulación de la proteína causante de la esterilidad masculina citoplasmática y, de este modo, se revierte dicha esterilidad masculina citoplasmática en fertilidad.

Ejemplo 12: Aislamiento del gen restaurador de la fertilidad de colza Kosena

La secuencia genómica del gen restaurador de la fertilidad se obtuvo a partir de la línea de colza (en adelante, colza Kosena) obtenida mediante la transferencia del gen restaurador de la fertilidad de rábano Kosena por fusión celular aplicando el método PCR. El ADN se extrajo de 0,1 g de una hoja de colza Kosena utilizando un kit de aislamiento de ADN (DNeasy plant mini) de Qiagen. Para amplificar el ADN, el 5’-ACATAAAAATCACTAGATACTTGACATGGAGGC-3’ (SEC ID nº: 30), que es la secuencia de nucleótidos de 1027 pb a 1059 pb de SEC ID nº: 1, se diseñó como cebador directo, y el 5’-AAGAGGAGGAAGATGGCATCACAGC-3’ (SEC ID nº: 31), que es la secuencia de nucleótidos de 7675 pb a 7651 pb de SEC ID nº: 1, se diseñó como cebador inverso.

A 10 µl de solución de ADN de colza Kosena (50 ng/µl) se le añadieron 49 µl de agua esterilizada, 10 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 10 µl de MgCl2 25 mM, 16 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 2 µl de solución de cebador directo 10 µM, 2 µl de solución de cebador inverso 10 µMy1 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 20 segundos y 68ºC durante 15 minutos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). Tras completar la reacción, se purificaron aproximadamente 6 kb del producto amplificado con la unidad de ultrafiltración con membrana Microcon-PCR (Millipore). La secuencia de nucleótidos de 3306 pb de los nucleótidos 4280º a 7585º de SEC ID nº: 1 se determinó por un método convencional utilizando el producto purificado como plantilla (SEC ID nº: 15). Mediante la comparación de la secuencia genómica de nucleótidos obtenida a partir de colza Kosena con la secuencia obtenida a partir de rábano Yuanhong, se encontraron sustituciones de nucleótidos en el ADN en 7 pb de entre 3306 pb, y se reveló que presentan un alto grado de homología.

Además, la secuencia de ADNc del gen restaurador de la fertilidad de la colza Kosena en la parte 3’ se obtuvo por RT-PCR y se confirmó que los intrones estaban unidos del mismo modo que en el rábano Yuanhong. A partir del brote de colza Kosena, se extrajo el ARN total por el método AGPC (tiocianato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo) (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 a 166), que es un método convencional. A partir de 1 µg de ARN total, se sintetizó el ADNc utilizando RNAsaH-transcriptasa inversa SUPERSCRIPT II (Invitrogen). Se utilizó 5’-TGGAGTAAAGAGGAACTAAAAAGGGC3’ (SEC ID nº: 32) como cebador directo específico de la parte 3’ del gen restaurador de la fertilidad y 5’-CAGACAATAGACGCATAAAAGGC-3’ (SEC ID nº: 33) como cebador inverso específico de la parte 3’ del gen restaurador de la fertilidad. El ADN se amplificó mediante la adición y mezclado de 14,9 µl de agua esterilizada, 2,5 µl de solución tampón de PCR 10 x (Takara), 1,5 µl de MgCl2 25 mM, 2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1,5 µl de solución 10 µM de cebador directo, 1,5 µl de solución 10 µM de cebador inverso y 0,1 µl de 5 unidades/µl de Takara Taq (Takara) a 1 µl de solución de ADNc de colza Kosena y la repetición 35 veces de un ciclo de 94ºC durante 40 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). A 3 µl del producto amplificado se añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. La secuencia de nucleótidos del clon obtenido se determinó por un método convencional y se confirmó que los intrones del ADNc de la colza Kosena estaban unidos del mismo modo que en el rábano Yuanhong. Así, se puso de manifiesto que las sustituciones de bases de 7 pb encontradas en la comparación de las secuencias genómicas estaban presentes en 5444 pb a 5814 pb de SEC ID nº: 1 y no afectaron al empalme.

A partir de los resultados anteriores, se puso de manifiesto que el gen restaurador de la fertilidad de la colza Kosena se expresa de modo parecido a como lo hace en el rábano Yuanhong. La secuencia de ADNc que codifica únicamente la región de traducción se muestra en la SEC ID nº: 16. La secuencia de aminoácidos (SEC ID nº: 17) se obtuvo a partir de esta secuencia de ADNc.

Ejemplo 13: Aislamiento de la secuencia parcial del gen restaurador de la fertilidad de un rábano silvestre, Raphanus raphanistrum (en adelante, R. raphanistrum)

Se aisló una secuencia parcial del gen restaurador de la fertilidad de R. raphanistrum a partir de un ADNc.

(Purificación de ARNm)

Se extrajo el ARN total del capullo de R. raphanistrum por el método AGPC (tiocianato de guanidinio ácido-fenolcloroformo) (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 a 166), que es un método convencional. Se purificó ARN poliA+ del ARN total utilizando el “kit de purificación de ARNm” (Amersham Pharmacia) con una columna de celulosa Origo (dT) y se utilizó como ARNm.

(Aislamiento de la secuencia parcial de ADNc)

El ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARNm purificado utilizando el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” (Clontech).

Se utilizó 5’-GATTCCTTTCTCTTGCATTTCAG-3’ (SEC ID nº: 34) como cebador directo específico del gen restaurador de la fertilidad y 5’-ATCTCGTCCTTTACCTTCTGTGG-3’ (SEC ID nº: 35) como cebador inverso específico del gen restaurador de la fertilidad.

A 1 µl de solución de ADNc de R. raphanistrum se le añadieron 14,4 µl de agua esterilizada, 2,5 µl de solución tampón Pyrobest PCR 10 x (Takara), 2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 2,5 µl de solución de cebador directo 10 µM, 2,5 µl de solución de cebador inverso 10 µM y 0,1 µl de 5 unidades/µl de Pyrobest ADN polimerasa (Takara), seguido de mezclado, y el ADN se amplificó repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). Se añadieron y mezclaron 0,1 µl de 5 unidades/µl de Takara Taq (Takara) a la solución de ADN amplificado. A continuación, se añadió el nucleótido adenina al terminal 3’ del ADN mediante incubación a 72ºC durante 10 minutos. A 3 µl del producto amplificado se añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante una hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. La secuencia de nucleótidos del clon obtenido se determinó por un método convencional y se obtuvo la secuencia parcial de ADNc (SEC ID nº: 20). Además, se obtuvo la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº: 21) a partir de la secuencia de ADNc.

Ejemplo 14: Aislamiento del gen restaurador de la fertilidad de colza Ogura

La secuencia de ADNc del gen restaurador de la fertilidad se aisló a partir de la línea de colza obtenida mediante la transferencia del gen restaurador de la fertilidad de rábano Ogura por cruce (en adelante, colza Ogura) aplicando el método 5’RACE y el método 3’RACE.

(Purificación de ARNm)

Se extrajo el ARN total de los capullos de colza Ogura por el método AGPC (tiocianato de guanidinio ácido-fenolcloroformo) (Syuuzyunsya, Cell Engineering Separate volume: Biotechnology Experiment Illustrated, (2) Fundamentals of gene analysis: 161 a 166), que es un método convencional. Se purificó ARN poliA+ utilizando el “kit de purificación de ARNm” (Amersham Pharmacia Corp.) con una columna de celulosa Origo (dT) y se utilizó como ARNm.

(Aislamiento de la secuencia parcial de ADNc)

El ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARNm purificado utilizando el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” (Clontech). 5’-GATCCATGCATTTGTCAAGG-3’ (SEC ID nº: 36) se utilizó como cebador directo específico del gen restaurador de la fertilidad y CATTTGTGTAGCCTCATCTAGG-3’ (SEC ID nº: 37) como cebador inverso específico del gen restaurador de la fertilidad.

A 1 µl de solución de ADNc de colza Ogura se le añadieron 14,4 µl de agua esterilizada, 2,5 µl de solución tampón Pyrobest PCR 10 x (Takara), 2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 2,5 µl de solución de cebador directo 10 µM, 2,5 µl de solución de primer inverso 10 µM y 0,1 µl de 5 unidades/µl de Pyrobest ADN polimerasa (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra). Se añadieron y mezclaron 0,1 µl de 5 unidades/µl de Takara Taq a la solución de ADN amplificado y a continuación se añadió el nucleótido adenina al terminal 3’ del ADN mediante incubación a 72ºC durante 10 minutos. A 3 µl del producto amplificado se añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. La secuencia de nucleótidos del clon obtenido se determinó por un método convencional y se obtuvieron cuatro secuencias parciales de ADNc. Sobre la base de la información de las cuatro secuencias parciales obtenidas, se diseñaron cebadores en cuatro partes comunes para 5’RACE y 3’RACE, y se aisló cada ADNc.

(Aislamiento de ADNc por 5’RACE y 3’RACE)

Se aisló ADNc del modo descrito anteriormente y llevando a cabo 5’RACE 3’RACE con el kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE” (Clontech). Como cebadores específicos de gen, se utilizaron

y

para 5’RACE, y para 3’-RACE.

En 5’RACE, el PCR se llevó a cabo dos veces para obtener ADN. A 2 µl de solución de ADNc de colza Ogura diluida 250 veces se le añadieron 8,6 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 2 µl de MgCl2 25 mM, 3,2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución 10 µM de cebador de SEC ID nº: 9907F, 1 µl de solución 10 µM de cebador adaptador (kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, Clontech) y 0,2 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 70ºC durante 3 minutos, y 25 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 3 minutos. La solución de ADN obtenida se diluyó 100 veces y a 2 µl de la misma se añadieron 8,6 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 2 µl de MgCl2 25 mM, 3,2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución 10 µM de cebador de SEC ID nº: 5’ ogu-1, 1 µl de solución 10 µM de cebador adaptador (kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, Clontech) y 0,2 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 5 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 70ºC durante 3 minutos, y 25 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 3 minutos. El termociclador utilizado fue UNOII (Biometra).

En 3’RACE, a 2 µl de solución de ADNc de colza Ogura diluida 50 veces se añadieron 8,6 µl de agua esterilizada, 2 µl de solución tampón LA PCR 10 x (Takara), 2 µl de MgCl2 25 mM, 3,2 µl de mezcla dNTP 2,5 mM, 1 µl de solución 10 µM de cebador de SEC ID nº: 3’ ogu-1, 1 µl de solución 10 µM de cebador adaptador (kit “Marathon RACE system 5’RACE 3’RACE”, Clontech) y 0,2 µl de 5 unidades/µl de Takara LA Taq (Takara), seguido de mezclado. El ADN se amplificó repitiendo 35 veces un ciclo de 98ºC durante 5 segundos, 63ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos.

A 3 µl del producto amplificado se le añadió 1 µl de vector pGEM-Teasy (Promega), 5 µl de solución tampón de ligadura 2 x (Promega) y 1 µl de T4 ADN ligasa (Promega), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora a fin de ligar el vector. La Escherichia coli DH5 α (Gibco BRL) se transformó con este vector a fin de obtener un clon. Se determinó la secuencia de nucleótidos del clon obtenido y a continuación se obtuvieron la secuencia 5’RACE y la secuencia 3’RACE correspondientes a las anteriores 4 secuencias parciales de ADNc. La secuencia de ADNc de longitud completa se obtuvo por combinación de cada secuencia. Entre estas, la secuencia que tiene la mayor homología con la secuencia de ADNc de rábano Yuanhong se identificó como el gen restaurador de la fertilidad de la colza Kosena (SEC ID nº: 18). Además, se obtuvo la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº: 19) a partir de la secuencia de ADNc.

Ejemplo 15: Análisis del gen restaurador de la fertilidad

Para los genes individuales restauradores de la fertilidad obtenidos por el método anterior, se llevaron a cabo análisis utilizando el software de análisis de genes “Mac Vector 6.5” (Oxford Molecular Ltd. ) para la homología de la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos, y utilizando la Protein Families Database of Alignments and HMNs disponible a través de Sanger Institute, Reino Unido, para el análisis de motivos.

Todos los genes Rf derivados de rábano Yuanhong, colza Kosena y colza Ogura según la presente invención tienen 16 motivos PPR, y estos grupos de motivos PPR se dividen en 3 bloques de 5, 7 y 4 motivos desde el extremo amino, y el cuarto aminoácido situado en el segundo motivo PPR desde el extremo amino es asparagina. El fragmento parcial derivado de Raphanus raphanistrum también se analizó mediante su aplicación a la parte correspondiente (94º a 264º de la SEC ID nº: 26) de la secuencia anterior, y se puso de manifiesto que tenía una parte correspondiente a los motivos PPR primero a sexto desde el extremo amino, y los grupos de motivos PPR y el cuarto aminoácido situado en el segundo motivo PPR desde el extremo amino también mostró las características descritas anteriormente.

Además, entre los 3 genes restauradores de la fertilidad obtenidos a partir de rábano Yuanhong, colza Kosena y colza Ogura, y la proteína (SEC ID nº: 26) y el gen que la codifica (SEC ID nº: 27) según la presente invención, que se obtuvieron de resultas del análisis de la secuencia parcial del gen restaurador de la fertilidad de R. raphanistrum, el rábano Yuanhong muestra una homología muy alta con la colza Kosena. Es decir, las secuencias de aminoácidos muestran un grado elevado de homología del 99,6% (sólo 3 aminoácidos son diferentes) y las secuencias de nucleótidos muestran un grado elevado de homología del 99,7%. En consecuencia, la proteína que presenta una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 29 y el gen (SEC ID nº: 25) que la codifica son particularmente preferentes.

Por otro lado, la comparación de la colza Ogura con el rábano Yuanhong y de la colza Ogura con la colza Kosena puso de manifiesto un alto grado de homología. Cada homología en la secuencia de aminoácidos mostró un 92,0% en la comparación de la colza Ogura con el rábano Yuanhong y un 91,6% en la comparación de la colza Ogura con la colza Kosena. La comparación de la secuencia de nucleótidos puso de manifiesto aproximadamente un 95% en ambos casos. Estos valores son menores que los existentes entre el rábano Yuanhong y la colza Kosena.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, se aisló el gen Rf, particularmente el gen Rf1 derivado de rábano, y se determinó la estructura del mismo. Según la presente invención, se da a conocer un medio para establecer una línea 5 restauradora de la fertilidad en la colza utilizando el gen Rf aislado.

Listado de secuencias

<110> Mitsubishi Chemical Corporation 10

<120> Proteína implicada en la restauración de la fertilidad en caso de esterilidad masculina citoplasmática y gen que la codifica

<130> EP21009EP 15

<140> EP 02 720 587.1

<141> 2002-04-24

<150> JP2001128008 20 <151> 2001-04-25

<150> JP2001202082

<151> 2001-07-03 25 <150> JP2002020083

<151> 2002-01-29

<160> 39 30 <170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 8553

<212> ADN 35 <213> Raphanus sativus

<400> 1

<210> 2

<211> 2064

<212> ADN

<213> Raphanus sativus

<400> 2

<210> 3 15 <211> 687

<212> PRT

<213> Raphanus sativus

<400> 3 20

<210> 4

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 4

gaagcaaaaa agaaaacgag cagag

<210> 5

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 5

ccaaaaatcc gaaatccgaa tagac: 25

<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 6

ctcggctctg ggtttagtga: 20

<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 7

tccacaaacc ctagccaaca: 20

<210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 8

gcttatgctt ctctggttcg cctc: 24

<210> 9 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 9

ctcagttttc gtcaccttac acaatgc: 27

<210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 10

gattcctttc tcttgcattt cag: 23

<210> 11 <211> 23 <212 ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 11

atctcgtcct ttaccttctg tgg: 23

<210> 12 <211> 18 <212 > ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 12

cgggatccgc tcacaatt: 18

<210> 13 <211> 100 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 13

<210> 14

<211> 100

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 14

<210> 15

<211> 3306

<212> ADN

<213> Raphanus sativus

<400> 15

<210> 16

<211> 2064

<212> ADN

<213> Raphanus sativus

<400> 16

<210> 17

<211> 688

<212> PRT

<213> Raphanus sativus

<400> 17

5 10: <210> 18 <211> 2073 <212> ADN <213> Raphanus sativus.

41

<400> 18

5

<210> 19

<211> 691

<212> PRT

<213> Raphanus sativus

10

<400> 19

<210> 20

<211> 516

<212> ADN

<213> Raphanus raphanistrum

<400> 20

<210> 21

<211> 171

<212>: PRT 15 <213> Raphanus raphanistrum

<400> 21

<210> 22

<211> 2073

<212>: ADN 25 <213> Raphanus

<400> 22

<210> 24

<211> 2064

<212> ADN

<213> Raphanus

<400> 24

<210> 25

<211> 2064

<212>: ADN 15 <213> Raphanus.

5

<210> 23

<211> 2073

<212> ADN

<213> Raphanus

10

<400> 23

<400> 25

<210> 26

<211> 690

<212> PRT

<213> Raphanus

<220>

<221> Xaa

<222> 16

<223> Glu o Val

<221> Xaa

<222> 36

<223> Arg o ninguno

<221> Xaa

<222> 37

<223> Asp o ninguno

<221> Xaa

<222> 95

<223> Glu o Lys

<221> Xaa

<222> 99

<223> leu o Val

<221> Xaa

<222> 104

<223> Tyr o His

<221> Xaa

<222> 105

<223> Gln o Lys

<221> Xaa

<222> 109

<223> Arg o Met

<221> Xaa

<222> 110

<223> Lys o Arg

<221> Xaa

<222> 111

<223> Gln o Arg

<221> Xaa

<222> 113

<223> Arg o Pro

<221> Xaa

<222> 116

<223> Ile, Ala o Val

<221> Xaa

<222> 142

<223> Leu o Ile <221> Xaa

<222> 152

<223> Val o Ala

<221> Xaa

<222> 155

<223> Thr o Asn

<221> Xaa

<222> 163

<223> Val, o Leu

<221> Xaa

<222> 164

<223> Glu o Asp

<221> Xaa

<222> 165

<223> Asp, Asn o Lys

<221> Xaa

<222> 167

<223> Val o Gly

<221> Xaa

<222> 172

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 173

<223> Leu o Phe

<221> Xaa

<222> 186

<223> Val o Ile

<221> Xaa

<222> 187

<223> Val o Ile

<221> Xaa

<222> 198

<223> Arg o Tyr

<221> Xaa

<222> 202

<223> Ile o Val

<221> Xaa

<222> 213

<223> Met o Leu

<221> Xaa

<222> 220

<223> Thr o Asp

<221> Xaa

<222> 234

<223> Lys o Met

<221> Xaa

<222> 250

<223> Val o Leu

<221> Xaa <222> 254

<223> Ile o Lys

<221> Xaa

<222> 276

<223> Ala o Ser

<221> Xaa

<222> 297

<223> Ser o Cys

<221> Xaa

<222> 300

<223> Val o Asn

<221> Xaa

<222> 309

<223> Ser o Ile

<221> Xaa

<222> 389

<223> Ala o Pro

<221> Xaa

<222> 396

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 397

<223> Leu o Val

<221> Xaa

<222> 398

<223> Ile o Phe

<221> Xaa

<222> 408

<223> Cys o Arg

<221> Xaa

<222> 426

<223> Thr o Ala

<221> Xaa

<222> 431

<223> Asp o Asn

<221> Xaa

<222> 433

<223> Thr o Val

<221> Xaa

<222> 443

<223> Tyr o Cys

<221> Xaa

<222> 444

<223> Leu o Gln

<221> Xaa

<222> 449

<223> Asn o Thr

<221> Xaa

<222> 456

<223> Gln o His

<221> Xaa

<222> 463

<223> Leu o Val

<221> Xaa

<222> 466

<223> Asp o Asn

<221> Xaa

<222> 467

<223> Ile o Val

<221> Xaa

<222> 471

<223> Asp o Ser

<221> Xaa

<222> 487

<223> Leu o Trp

<221> Xaa

<222> 489

<223> Met o Leu

<221> Xaa

<222> 498

<223> Lys o Met

<221> Xaa

<222> 537

<223> Glu o Lys

<221> Xaa

<222> 591

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 618

<223> Ala o Thr

<221> Xaa

<222> 626

<223> Cys o Arg

<221> Xaa

<222> 630

<223> Lys o Asn

<221> Xaa

<222> 652

<223> Asp o Gly

<221> Xaa

<222> 653

<223> Thr o Ile

<221> Xaa

<222> 658

<223> Asn o Ser

<221> Xaa

<222> 672

<223> Ala o Thr

<221> Xaa <222> 678

<223> Lys o Glu

<221> Xaa

<222> 683

<223> Met o Val

<221> Xaa

<222> 684

<223> Asp o Gly

<221> Xaa

<222> 685

<223> Leu o Tyr

<221> Xaa

<222> 686

<223> Ser o Gln

<221> Xaa

<222> 687

<223> Phe o Leu

<221> Xaa

<222> 688

<223> Gly o Glu

<221> Xaa

<222> 689

<223> Gly o Asp

<221> Xaa

<222> 690

<223> Glu o ninguno

<400> 26

<210> 27

<211> 690

<212> PRT

<213> Raphanus

<220>

<221> Xaa

<222> 16

<223> Glu o Val

<221> Xaa

<222> 36

<223> Arg o ninguno

<221> Xaa

<223>: 37

<223>: Asp o ninguno

<221> Xaa

<222> 95

<223> Glu o Lys,

<221> Xaa

<222> 99

<223> Leu o Val

<221> Xaa

<222> 104

<223> Tyr o His

<221> Xaa

<222> 105

<223> Gln o Lys

<221> Xaa

<222> 109

<223> Arg o Met

<221> Xaa

<222> 110

<223> Lys o Arg

<221> Xaa

<222> 111

<223> Gln o Arg

<221> Xaa

<222> 113

<223> Arg o Pro <221> Xaa

<222> 116

<223> Ile o Ala

<221> Xaa

<222> 142

<223> Leu o Ile

<221> Xaa

<222> 165

<223> Asp o Asn

<221> Xaa

<222> 167

<223> Val o Gly

<221> Xaa

<222> 172

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 173

<223> Leu o Phe

<221> Xaa

<222> 276

<223> Ala o Ser

<221> Xaa

<222> 297

<223> Ser o Cys

<221> Xaa

<222> 300

<223> Val o Asn

<221> Xaa

<222> 309

<223> Ser o Ile

<221> Xaa

<222> 389

<223> Ala o Pro

<221> Xaa

<222> 396

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 397

<223> Leu o Val

<221> Xaa

<222> 398

<223> Ile o Phe

<221> Xaa

<222> 408

<223> Cys o Arg

<221> Xaa

<222> 426

<223> Thr o Ala

<221> Xaa

<222> 431

<223> Asp o Asn

<221> Xaa

<222> 433

<223> Thr o Val

<221> Xaa

<222> 443

<223> Tyr o Cys

<221> Xaa

<222> 444

<223> Leu o Gln

<221> Xaa

<222> 449

<223> Asn o Thr

<221> Xaa

<222> 456

<223> Gln o His

<221> Xaa

<222> 463

<223> Leu o Val

<221> Xaa

<222> 466

<223> Asp o Asn

<221> Xaa

<222> 467

<223> Ile o Val

<221> Xaa

<222> 471

<223> Asp o Ser

<221> Xaa

<222> 487

<223> Leu o Trp

<221> Xaa

<222> 489

<223> Met o Leu

<221> Xaa

<222> 498

<223> Lys o Met

<221> Xaa

<222> 537

<223> Glu o Lys

<221> Xaa

<222> 591

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 618

<223> Ala o Thr

<221> Xaa

<222> 626

<223> Cys o Arg

<221> Xaa

<222> 630

<223> Lys o Asn

<221> Xaa

<222> 652

<223> Asp o Gly

<221> Xaa

<222> 653

<223> Thr o Ile

<221> Xaa

<222> 658

<223> Asn o Ser

<221> Xaa

<222> 672

<223> Ala o Thr

<221> Xaa

<222> 678

<223> Lys o Glu

<221> Xaa

<222> 683

<223> Met o Val

<221> Xaa

<222> 684

<223> Asp o Gly

<221> Xaa

<222> 685

<223> Leu o Tyr

<221> Xaa

<222> 686

<223> Ser o Gln

<221> Xaa

<222> 687

<223> Phe o Leu

<221> Xaa

<222> 688

<223> Gly o Glu

<221> Xaa

<222> 689

<223> Gly o Asp

<221> Xaa

<222> 690

<223> Glu o ninguno

<400> 27

<210> 28

<211> 687

<212> PRT

<213> Raphanus sativus

<210> 28

<211> 687

<212> PRT

<213> Raphanus

<220>

<221> Xaa

<222> 111

<223> Arg o Pro

<221> Xaa

<222>: 114

<222>: Ile o Val

<221> Xaa

<222> 140

<223> Leu o Ile

<221> Xaa

<222> 150

<223> Val o Ala

<221> Xaa

<222> 153

<223> Thr o Asn

<221> Xaa <222> 161

<223> Val o Leu

<221> Xaa

<222> 162

<223> Glu o Asp

<221> Xaa

<222> 163

<223> Asp o Lys

<221> Xaa

<222> 170

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 171

<223> Leu o Phe

<221> Xaa

<222> 184

<223> Val o Ile

<221> Xaa

<222> 185

<223> Val o Ile

<221> Xaa

<222> 196

<223> Arg o Tyr

<221> Xaa

<222> 200

<223> Ile o Val

<221> Xaa

<222> 211

<223> Met o Leu

<221> Xaa

<222> 218

<223> Thr o Asp

<221> Xaa

<222> 232

<223> Lys o Met

<221> Xaa

<222> 248

<223> Val o Leu

<221> Xaa

<222> 252

<223> Ile o Lys

<400> 28

<212> PRT

<213> Raphanus sativus

<220> 10 <221> Xaa

<222> 140

<223> Leu o Ile

<221> Xaa 15 <222> 170

<223> Asn o Asp

<221> Xaa

<222> 171 20 <223> Leu o Phe

<400> 29

<210> 30 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 30

acataaaaat cactagatac ttgacatgga ggc: 33

<210> 31 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 31

aagaggagga agatggcatc acagc: 25

<210> 32 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 32

tggagtaaag aggaactaaa aagggc: 26

<210> 33

<211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 33

cagacaatag acgcataaaa ggc: 23

<210> 34 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 34

gattcctttc tcttgcattt cag: 23

<210> 35 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 35

atctcgtcct ttaccttctg tgg: 23

<210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 36

gatccatgca tttgtcaagg: 20

<210> 37 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 37

catttgtgta gcctcatcta gg: 22

<210> 38 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

<400> 38

5 10: gtccggagag cagcccttgg tag <210> 39 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético 23

15: <400> 39 tcatcgtata attcttcagc ctc 23

Claims

REIVINDICACIONES

1. ADN aislado que codifica una proteína implicada en la restauración de la fertilidad en una planta que presenta esterilidad masculina citoplasmática, seleccionado de entre el grupo constituido por:

(1)

un ADN aislado que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3;

(2)

un ADN aislado que presenta una homología 90% o superior con respecto a una secuencia de ADN que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 3;

(3)

un ADN aislado que presenta una homología de 90% con la secuencia de ADN de SEC ID nº: 2.
2.

ADN aislado según la reivindicación 1 que presenta una homología de 95% con la secuencia de ADN de SEC ID nº: 2.
3.

ADN aislado según la reivindicación 2, que es SEC ID nº: 2.
4.

ADN aislado de SEC ID nº: 1.
5.

Proteína implicada en la restauración de la fertilidad en un individuo que presenta esterilidad masculina citoplasmática, que está codificada por un ADN según una de las reivindicaciones 1 a 3.
6.

Proteína según la reivindicación 4, que presenta la SEC ID nº: 3.
7.

Vector que contiene el ADN aislado según una de las reivindicaciones 1 a 4.
8.

Planta transformante o células de la misma transformada con el ADN aislado según una de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector según la reivindicación 7.
9.

Planta transformante o células de la misma según la reivindicación 8, que es una planta Brassica.
10.

Utilización de un ADN aislado según una de las reivindicaciones 1 a 4 para la restauración de la fertilidad en la planta que presenta esterilidad masculina citoplasmática.