ES2369359T3 - Métodos para prevenir la gluconoilación de proteínas. - Google Patents

Abstract

Un método para prevenir la gluconoilación de polipéptidos expresados en una cepa B de E.coli, que comprende introducir DNA en la E.coli, donde el DNA codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 95% respecto al SEQ ID NO:8.

Description

Metodos para prevenir la gluconoilacion de proteinas

CAMPO DE LA INVENCION

Esta invencion esta en el campo de la ingenieria bioquimica. Mas particularmente, esta invencion se refiere a procedimientos de fermentacion para producir polipeptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Escherichia coli (" E. coli") es un hospedante usado habitualmente para expresar proteinas para propositos de investigacion, diagnostico, terapeuticos e industriales. Los sistemas de expresion modernos pueden lograr altos niveles de una amplia variedad de proteinas (Baneyx, Current Opinion in Biotechnology 10:411-421 (1999)). Sin embargo, la calidad de la proteina expresada con frecuencia es tan importante o mas importante que la cantidad. Las proteinas expresadas en E. coli se pueden formar como agregados insolubles, o pueden tener aminoacidos mal incorporados (Bogosian, et al., Journal of Biological Chemistry 264:531-539 (1989)), o retener la metionina N-terminal (Chaudhuri, et al., Journal of Molecular Biology 285:1179-1194 (1999); Vassileva-Atanassova, et al., Journal of Biotechnology 69:6367 (1999); Yamashita, et al., Protein Expression & Purification 16:47 -52 (1999)). Ademas, se pueden producir modificaciones postraduccionales indeseadas tales como oxidacion (Berti, et al, Protein Expression & Purification 11:111-118 (1997); Konz, et al., Biotechnology Progress 14:393-409 (1998)) o α-N-6-fosfogluconoilacion (Geoghegan, et al., Anal. Biochem. 267:169-184 (1999); Kim et al., Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 57:759-762 (2001); Yan, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 262:793-800 (1999) "Yan et al. I"; Yan, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 259:271-282 (1999) "Yan et al. II"). Estas modificaciones pueden afectar adversamente a la actividad, estabilidad, estructura o inmunogenicidad de la proteina expresada, reduciendo en gran medida la utilidad de E. coli como hospedante para expresar polipeptidos.

Se ha descrito la alfa(α)-N-6-fosfogluconoilacion de varias proteinas recombinantes fusionadas con marcadores de afinidad de hexahistidina ("marcadores hexa-His") (Geoghegan, et al.; Kim, et al.; Yan et al. I; Yan et al. II). En estos estudios, se encontro que un derivado de acido gluconico se unia al extremo de la proteina recombinante. Todas estas proteinas se expresaron en cepas B de E. coli, usando vectores basados en pET (Novagen). Donde se indicaba, se uso medio LB. El aducto se detecto como una masa adicional asociada con el polipeptido de 258 Daltons ("Da"), que representaba la adicion de la 6-fosfogluconolactona (6-PGL), o de 178 Da, que representaba la presencia de gluconolactona sin el fosfato. Se supuso que la fosfogluconoilacion se producia en el grupo α-amino N-terminal por reaccion con la 6-PGL endogena, un producto intermedio del ciclo de las pentosas fosfato. Se propuso que el aducto de +178 Da era el resultado de la actividad enzimatica actuando en el aducto de +258 Da para eliminar el fosfato. Se mostro que la formacion del aducto era especifica para la secuencia de aminoacidos en el extremo N adyacente al marcador de His. Las secuencias polipeptidicas GXXHHHH, donde XX es SS, SA, AS, o AA, eran las mas propensas a la α-N-6-fosfogluconoilacion, mientras que SHHHHHH era menos propensa, y PHHHHHH y PFHHHHHH no se modificaban en absoluto (Geoghegan, et al.). No se detectaron modificaciones de otros grupos amino en ninguna otra parte de la proteina en experimentos in vivo o in vitro que usaron niveles altos de gluconolactona anadida. (Geoghegan, et al.)

Se ha mostrado que la fosfogluconoilacion N-terminal inhibe la cristalizacion de proteinas (Kim, et al.), pero se sabe relativamente poco mas sobre su efecto en la funcion, estabilidad o inmunogenicidad de la proteina. Se espera que la 6-PGL, que es un potente electrofilo, pueda estar implicada en reacciones de glicacion in vivo (Rakitzis and Papandreou, Chemico-Biological lnteractions 113:205-216 (1998)). La glicacion de proteinas se ha estudiado ampliamente y se sabe que juega un papel fundamental en el envejecimiento y estados patologicos relacionados con complicaciones diabeticas (Baynes and Monnier, The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition. Alan R. Liss, New York (1989)). Se ha mostrado que la delta-gluconolactona anadida de forma exogena, produce glicacion de la hemoglobina, que puede ser un factor en las complicaciones vasculares de la diabetes (Lindsay, et al., Clinica Chimica Acta 263:239247 (1997)). Ademas, la glicacion de la alanina-aminotransferasa en el grupo epsilon-amino de la Lys 313 reduce notablemente su actividad catalitica (Beranek, et al., Molecular & Cellular Biochemistry 218:35-39 (2001)).

Se ha mostrado que la 6-fosfogluconolactonasa ("pgl") es una enzima esencial de la ruta de las pentosas fosfato, especificamente en la hidrolisis de PGL a acido 6-fosfogluconico. (Miclet, et al., J. Biol. Chem. 276:34840-34846 (2001)). Se ha identificado el gen que codifica esta enzima en seres humanos (Collard, et al., FEBS Letters 459:223226 (1999)), Pseudomonas aeruginosa (Hager, et al., Journal of Bacteriology 182:3934-3941 (2000)), y Trypanosoma brucei y Plasmodium falciparum (Miclet, et al.). Aunque se ha observado la actividad de la pgl desde hace tiempo en E. coli (Kupor and Fraenkel, Journal of Bacteriology 100:1296-1301 (1969) "Kupor I" and Kupor and Fraenkel, Journal of Biological Chemistry 247:1904-1910 (1972) "Kupor II"), no se ha identificado la secuencia genica responsable de la codificacion de una enzima con esta actividad (Cordwell, S. J. Arch. Microbiol. 172:269-279 (1999)). Se ha sugerido que ademas de permitir el flujo metabolico por el ciclo de las pentosas fosfato, la actividad de la pgl dentro de la celula previene la acumulacion de 6-PGL y las consiguientes reacciones perjudiciales con nucleofilos intracelulares (Miclet, et al.). Las observaciones descritas de fosfogluconoilacion de proteinas en el extremo N, apoyan la hipotesis de que la 6-PGL producida en la ruta puede modificar proteinas, pero no se han descrito pruebas de que la modulacion de la actividad de la pgl pueda afectar a los niveles de proteina modificada.

Ademas, la cepa de Escherichia coli BL21(DE3) es un hospedante usado habitualmente para expresar proteinas con propositos de investigacion, diagnostico, terapeuticos e industriales, Studier, F.W., and Moffatt, B.A., J. Mol. Biol. 1986 May 5; 189(1):113-130. Esta cepa es comercialmente atractiva porque alcanza niveles muy altos de expresion de proteina recombinante mediante acoplamiento de la expresion de una copia cromosomica de la RNA-polimerasa de T7 y el uso de un promotor de RNA-polimerasa de T7 basado en plasmido en la proteina recombinante de interes. De acuerdo con esto, puesto que la RNA-polimerasa de T7 es una RNA-polimerasa extremadamente selectiva y activa, la transcripcion de la proteina recombinante se acumula con niveles muy altos, con frecuencia incluso hasta el punto de que disminuyen los transcritos de la celula hospedante.

Desafortunadamente, la cepa BL21(DE3) libera muy lentamente, aunque detectable, particulas de fago lambda infeccioso, del orden de 10-20 unidades formadoras de placa/ml (UFP), Stewart Shuman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 89:3489-3493. Segun parece, se introdujo el gen de la RNA-polimerasa de T7 en el cromosoma de la celula hospedante BL21 mediante transduccion con el fago lambda defectuoso DE3 que llevaba el gen de la RNA-polimerasa de T7 insertado en el gen int de lambda, Studier, F.W., and Moffatt, B.A., J. Mol. Biol. 1986; 189(1):113-130. El profago defectuoso resultante no puede replicarse normalmente debido a la interrupcion del gen int. La escision cromosomica del profago DE3 es un requisito para la replicacion del profago antes del empaquetamiento y liberacion de particulas de fago infeccioso, y depende de la recombinacion de la escision homologa que es dirigida por el producto del gen int. Como se describe en la presente memoria, niveles muy bajos de particulas de fago liberadas son debidos a sucesos de escision del profago aleatorios independientes de int. Aunque la liberacion de niveles muy bajos de particulas de fago infeccioso puede ser aceptable en algunos laboratorios de investigacion, cualquier liberacion de fago infeccioso es totalmente inaceptable en el marco de instalaciones de fabricacion biofarmaceuticas, tanto debido a consideraciones de seguridad para el paciente como a que la liberacion de agentes infecciosos puede poner en riesgo otros procedimientos de fabricacion basados en E. coli.

Es muy necesario un metodo para expresar o sobreexpresar polipeptidos en un microorganismo, tal como E. coli, con una menor incidencia de fosfogluconoilacion durante la fermentacion. Ademas, seria muy conveniente la creacion de una celula hospedante BL21(DE3) totalmente libre de fagos, para fabricar proteinas recombinantes terapeuticas en el formato de E. coli.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente descripcion proporciona metodos para prevenir la gluconoilacion de polipeptidos expresados por microorganismos, mediante crecimiento del microorganismo en medio de cultivo rico.

La presente descripcion tambien proporciona metodos para prevenir la gluconoilacion de polipeptidos expresados por microorganismos, que incluyen introducir (por ejemplo, transformar, infectar o transfectar) DNA que codifica un polipeptido que demuestra actividad de pgl en el microorganismo. Este polipeptido puede ser una enzima fosfogluconolactonasa. En otro aspecto, la enzima fosfogluconolactonasa puede tener una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% respecto a la enzima fosfogluconolactonasa producida por Pseudomonas, incluyendo, pero sin limitar, P. aeruginosa.

La presente descripcion tambien proporciona microorganismos capaces de prevenir la gluconoilacion de proteinas. En una realizacion, un microorganismo puede contener DNA que codifica un polipeptido que demuestra actividad de pgl.

La presente descripcion tambien proporciona un polinucleotido aislado que tiene una identidad de al menos 90% respecto al polinucleotido expuesto en el SEQ ID NO:7.

La presente descripcion tambien proporciona un microorganismo sin expresion detectable de fago lambda infeccioso.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra un mapa de enzimas de restriccion del vector pECO-1-pgl-2-13.

La Figura 2 muestra una secuencia polinucleotida para el vector pECO-1-pgl-2-13. (SEQ IDNO:9).

La Figura 3 muestra un mapa de enzimas de restriccion del vector pET28ProlL18Casp5.

La Figura 4 muestra una secuencia polinucleotida para el vector pET28ProlL18Casp5. (SEQ ID NO:13)

La Figura 5 muestra un mapa de enzimas de restriccion del vector pET28prolL18Casp5+pgl.

La Figura 6 muestra una secuencia polinucleotida para el vector pET28prolL18Casp5+pgl (SEQ ID NO:14).

La Figura 7 muestra una secuencia polinucleotida, SEQ ID NO:7.

La Figura 8 muestra una secuencia polipeptidica, SEQ ID NO:8.

Glosario "Celula(s) hospedante(s)" es una celula, incluyendo pero sin limitar, una celula bacteriana o celula de un microorganismo, en la que se ha introducido (por ejemplo, transformado, infectado o transfectado) o se puede introducir (por ejemplo, transformar, infectar o transfectar) una secuencia polinucleotida aislada.

"Transformado" como se conoce en la tecnica, es la modificacion directa del genoma o episoma de un organismo mediante la introduccion de DNA o RNA externo, o cualquier otra introduccion estable de DNA o RNA externo.

"Transfectado" como se conoce en la tecnica, es la introduccion de DNA o RNA externo en un microorganismo, incluyendo, pero sin limitar, DNA o RNA recombinante.

"Identidad", como se conoce en la tecnica, es una relacion entre dos o mas secuencias polipeptidicas o dos o mas secuencias polinucleotidas, segun el caso, determinada comparando las secuencias. En la tecnica, "identidad" tambien significa el grado de conexion entre las secuencias polipeptidicas o polinucleotidas, segun el caso, determinado por la correspondencia entre las hebras de dichas secuencias. La "Identidad" se puede calcular facilmente por metodos conocidos, incluyendo, pero sin limitar, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)). Los metodos para determinar la identidad estan disenados para dar la mayor correspondencia entre las secuencias ensayadas. Ademas, los metodos para determinar la identidad estan codificados en programas de ordenador disponibles por el publico. Entre los metodos de los programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias se incluyen, pero no se limita, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol.

215: 403-410 (1990)). El programa BLAST X esta disponible por el publico en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Tambien se puede usar el conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la identidad.

Entre los parametros para comparar secuencias polipeptidicas se incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparacion: BLOSSUM62 de Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992).

Penalizacion por hueco: 12

Penalizacion por longitud del hueco: 4

Un programa util con estos parametros esta disponible por el publico como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parametros mencionados son los parametros por defecto para comparaciones de peptidos (junto con la no penalizacion por huecos terminales).

Entre los parametros para comparar polinucleotidos se incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparacion: correspondencias = +10, no correspondencias = 0

Penalizacion por hueco: 50

Penalizacion por longitud del hueco: 3

Disponible como: El programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parametros por defecto para las comparaciones de acidos nucleicos.

A continuacion se proporciona un significado preferido para "identidad" para polinucleotidos y polipeptidos, segun el caso, en (1) y (2).

(1) Las realizaciones de polinucleotidos incluyen ademas un polinucleotido aislado que comprende una secuencia polinucleotida que tiene una identidad de al menos 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% respecto a la secuencia de referencia del SEQ ID NO:7, en el que dicha secuencia polinucleotida puede ser identica a la secuencia de referencia del SEQ ID NO:7, o puede incluir hasta un cierto numero entero de alteraciones de nucleotidos comparado con la secuencia de referencia, en el que dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consta de al menos una supresion, sustitucion, incluyendo transicion o transversion, o insercion de nucleotido, y en el que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleotidos de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleotidos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos en la secuencia de referencia, y en el que dicho numero de alteraciones de nucleotidos se determina multiplicando el numero total de nucleotidos en el SEQ ID NO:7 por el numero entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100, y despues restando este producto a dicho numero total de nucleotidos en el SEQ ID NO:7, o:

nn��� n-�X� n�•�y)

en el que nn es el numero de alteraciones de nucleotidos, Xn es el numero total de nucleotidos en el SEQ ID NO:7, y es 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, o 1,00 para 100%, y • es el simbolo del operador de multiplicacion, y en el que cualquier producto no entero de Xn e y se redondea por defecto al numero entero mas cercano antes de restarlo a Xn . Las alteraciones de una secuencia polinucleotida que codifica un polipeptido pueden crear mutaciones sin sentido, sustitutivas, o con desplazamiento del marco de lectura en esta secuencia codificante, y por lo tanto pueden alterar el polipeptido codificado por el polinucleotido despues de dichas alteraciones.

(2) Las realizaciones de polipeptidos incluyen ademas un polipeptido aislado que comprende un polipeptido que tiene una identidad de al menos 70, 80, 85, 90, 95, 97 o 100% respecto a una secuencia polipeptidica de referencia, en el que dicha secuencia polipeptidica puede ser identica a la secuencia de referencia, o puede incluir hasta un cierto numero entero de alteraciones de aminoacidos comparado con la secuencia de referencia, en el que dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consta de al menos una supresion, sustitucion, incluyendo sustitucion conservativa y no conservativa, o insercion de aminoacido, y en el que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia polipeptidica de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoacidos en la secuencia de referencia, o en uno o mas grupos contiguos en la secuencia de referencia, y en el que dicho numero de alteraciones de aminoacidos se determina multiplicando el numero total de aminoacidos por el numero entero que define el porcentaje de identidad dividido entre 100 y despues restando este producto a dicho numero total de aminoacidos, o:

na��� a-�X� a�•�y)

en el que na es el numero de alteraciones de aminoacidos, Xa es el numero total de aminoacidos en la secuencia, y es 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, o 1,00 para 100%, y • es el simbolo del operador de multiplicacion, y en el que cualquier producto no entero de Xa e y se redondea por defecto al numero entero mas cercano antes de restarlo a Xa .

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si se encuentra en la naturaleza, se ha cambiado o sacado de su entorno natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleotido o polipeptido presente de forma natural en un organismo vivo no esta "aislado", pero este mismo polinucleotido o polipeptido separado de los materiales con los que coexiste en su estado natural, esta "aislado", incluyendo, pero sin limitar, cuando dicho polinucleotido o polipeptido se vuelve a introducir en una celula.

"Polinucleotido(s)" en general se refiere a cualquier polirribonucleotido o polidesoxirrubonucleotido, que puede ser RNA

o DNA no modificado o RNA o DNA modificado. "Polinucleotido(s)" incluye, sin limitacion, DNA mono y bicatenario, DNA que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias o regiones mono, bi y tricatenarias, RNA mono y bicatenario, y RNA que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moleculas hibridas que comprenden DNA y RNA que pueden ser regiones monocatenarias o, mas tipicamente, bicatenarias o tricatenarias, o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Ademas, "polinucleotido" tal como se usa en la presente memoria se refiere a regiones tricatenarias que comprenden RNA o DNA, o tanto RNA como DNA. Las hebras en dichas regiones pueden ser de la misma molecula o de diferentes moleculas. Las regiones pueden incluir toda la region de una o mas de las moleculas, pero mas tipicamente implican solo una region de algunas de las moleculas. Una de las moleculas de una region helicoidal triple es con frecuencia un oligonucleotido. Tal como se usa en la presente memoria, el termino "polinucleotido(s)" tambien incluye DNA o RNA como se han descrito antes, que comprenden una o mas bases modificadas. Por lo tanto, los DNA

o RNA con cadenas principales modificadas por estabilidad o por otras razones son "polinucleotido(s)" tal como se entiende este termino en la presente memoria. Ademas, los DNA o RNA que comprenden bases poco comunes, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, solo por nombrar dos ejemplos, son polinucleotidos tal como se usa el termino en la presente memoria. Se observara que se han hecho una gran variedad de modificaciones al DNA y RNA que sirven para propositos muy utiles para los expertos en la tecnica. El termino "polinucleotido(s)" tal como se usa en la presente memoria, abarca dichas formas de polinucleotidos quimica, enzimatica o metabolicamente modificadas, asi como las formas quimicas de DNA y RNA caracteristicas de virus y celulas, incluyendo, por ejemplo, celulas sencillas y complejas. "Polinucleotido(s)" tambien abarca polinucleotidos cortos, denominados con frecuencia oligonucleotido(s).

"Polipeptido(s)" se refiere a cualquier peptido o proteina que comprende dos o mas aminoacidos unidos entre si por enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados. "Polipeptido(s)" se refiere tanto a cadenas cortas, normalmente denominadas peptidos, oligopeptidos y oligomeros, como a cadenas mas largas denominadas en general proteinas. Los polipeptidos pueden comprender aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos codificados por genes. Los "polipeptido(s)" incluyen los modificados por procedimientos naturales, tales como modificaciones en el procesamiento y otras postraduccionales, pero tambien por tecnicas de modificacion quimica. Dichas modificaciones estan descritas en los textos basicos y en monografias mas detalladas, asi como en una voluminosa bibliografia de investigacion, y son conocidas por los expertos en la tecnica. Se apreciara que puede haber el mismo tipo de modificacion con el mismo grado o distinto grado en varios sitios en un polipeptido dado. Tambien, un polipeptido dado puede comprender muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones se pueden producir en cualquier sitio en un polipeptido, incluyendo la cadena principal peptidica, las cadenas laterales de los aminoacidos, y los extremos amino o carboxilo. Entre las modificaciones se incluyen, por ejemplo, acetilacion, acilacion, ADP-ribosilacion, amidacion, union covalente de flavina, union covalente de un resto hemo, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un lipido o derivado de lipido, union covalente de fosfatidilinositol, reticulacion, ciclacion, formacion de enlace disulfuro, desmetilacion, formacion de reticulaciones covalentes, formacion de cisteina, formacion de piroglutamato, formilacion, gamma-carboxilacion, formacion de anclaje de GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, procesamiento proteolitico, fosforilacion, prenilacion, racemizacion, glicosilacion, union de lipido, sulfatacion, gammacarboxilacion de los restos de acido glutamico, hidroxilacion y ADP-ribosilacion, selenoilacion, sulfatacion, adicion de aminoacidos a proteinas mediada por RNA de transferencia, tales como arginilacion y ubiquitinacion. Vease por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993), y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 112 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990), y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Los polipeptidos pueden ser ramificados o ciclicos, con o sin ramificaciones. Los polipeptidos ciclicos, ramificados y circulares ramificados pueden ser resultado de procesos postraduccionales naturales, y se pueden hacer tambien por metodos completamente sinteticos.

"Sistema(s) de expresion recombinante" se refiere a sistemas de expresion o sus partes, o polinucleotidos, introducidos

o transformados en una celula hospedante o lisato de celula hospedante, para producir polinucleotidos y polipeptidos.

"Variante(s)" tal como se usa el termino en la presente memoria, es un polinucleotido o polipeptido que difiere de un polinucleotido o polipeptido de referencia respectivamente, pero que retiene las propiedades esenciales. Una variante tipica de un polinucleotido difiere en la secuencia de nucleotidos de otro polinucleotido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleotidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoacidos de un polipeptido codificado por el polinucleotido de referencia. Los cambios de nucleotidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones de aminoacidos, proteinas de fusion y truncamientos en el polipeptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute a continuacion. Una variante tipica de un polipeptido difiere en la secuencia de aminoacidos de otro polipeptido de referencia. En general, las diferencias estan limitadas, de modo que las secuencias del polipeptido de referencia y de la variante son muy similares en su totalidad, y en muchas regiones identicas. Una variante y un polipeptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoacidos en una o mas sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinacion. Un resto de aminoacido sustituido o insertado puede ser uno codificado o no por el codigo genetico. La presente descripcion tambien incluye variantes de cada uno de los polipeptidos, es decir, polipeptidos que varian de las referencias por sustituciones de aminoacidos conservativas, por las cuales un resto es sustituido por otro con caracteristicas similares. Dichas sustituciones tipicas son entre Al, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr, entre los restos acidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos basicos Lys y Arg; o restos aromaticos Phe y Tyr. Son particularmente preferidas las variantes en las que varios, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 o 1 aminoacidos son sustituidos, suprimidos o anadidos en cualquier combinacion. Una variante de un polinucleotido o polipeptido puede ser una natural tal como una variante alelica, o puede ser una variante que no se sabe que sea natural. Las variantes de polinucleotidos y polipeptidos que no son naturales se pueden hacer por tecnicas de mutagenesis, por sintesis directa y por otros metodos recombinantes conocidos por los expertos en la tecnica.

"Microorganismo(s)" significa un (i) procariota, incluyendo, pero sin limitar, un miembro del genero Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Haemophilus, Actinomycetes, Streptomycetes, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Fancisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobacter, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Listeria, Calymmatobacterium, Brucella, Bacillus, Clostridium, Treponema, Escherichia, Salmonella, Kleibsiella, Vibrio, Proteus, Errinia, Borrelia, Leptospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, Aeromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia y Mycoplasma, e incluyendo ademas pero sin limitar, un miembro de la especie o grupo, Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, Streptococcus del Grupo C, Streptococcus del Grupo D, Streptococcus del Grupo G, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diptheriae, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Actinomyctes israelii, Listeria monocytogenes, Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainiluenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella, Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcessens, Serratia liiuefaciens, Vibrio cholera, Shigella dysenterii, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Franscisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rickettsii y Chlamydia trachomitis, (ii) un arqueon, incluyendo, pero sin limitar, Archaebacter, y (iii) un eucariota unicelular o filamentoso, incluyendo, pero sin limitar, un protozoo, un hongo, un miembro del genero Saccharomyces, Kluveromyces, o Candida, y un miembro de la especie Saccharomyces ceriviseae, Kluveromyces lactis, o Candida albicans.

"Bacteria(s)(no)" significa un (i) procariota, incluyendo, pero sin limitar, un miembro del genero Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Haemophilus, Actinomycetes, Streptomycetes, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Fancisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobacter, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Listeria, Calymmatobacterium, Brucella, Bacillus, Clostridium, Treponema, Escherichia, Salmonella, Kleibsiella, Vibrio, Proteus, Errinia, Borrelia, Leptospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, Aeromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia y Mycoplasma, e incluyendo ademas, pero sin limitar, un miembro de la especie o grupo, Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, Streptococcus del Grupo C, Streptococcus del Grupo D, Streptococcus del Grupo G, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diptheriae, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Actinomyctes israelii, Listeria monocytogenes, Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella, Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcessens, Serratia liiuefaciens, Vibrio cholera, Shigella dysenterii, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa, Franscisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rickettsii yChlamydia trachomitis, y (ii) un arqueon, incluyendo, pero sin limitar, Archaebacter.

Tal como se usa en la presente memoria, "polipeptido(s) heterologo(s)" se refiere a un polipeptido no sintetizado naturalmente por una celula o microorganismo hospedante transformado de interes, e introducido en la celula o microorganismo hospedante por DNA recombinante. Por ejemplo, E. coli puede actuar como un microorganismo hospedante para la expresion de interleuquina, la cual no se produce en una E. coli no transformada. Los polipeptidos heterologos pueden incluir polipeptidos que se han modificado para facilitar el aislamiento.

Tal como se usa en la presente memoria, "marcador de afinidad" se refiere a cualquier resto asociado con una molecula que puede dar a dicha molecula una afinidad selectiva por otra sustancia o molecula. Por ejemplo, se puede usar un marcador de afinidad para facilitar la purificacion de una molecula proporcionando a la molecula una afinidad selectiva por un material de empaquetamiento de columna. Un ejemplo no limitante de un marcador de afinidad es un marcador de His.

Tal como se usa en la presente memoria, "marcador de His" se refiere a una repeticion de aminoacidos histidina, y puede incluir otros aminoacidos codificados en un polipeptido por tecnicas de ingenieria. Tipicamente, un marcador de His contiene al menos seis repeticiones de histidina ("hexa"), y esta situado cerca del extremo N del polipeptido. Los marcadores de His se pueden usar para facilitar la purificacion de polipeptidos heterologos en columnas con Ni.

Tal como se usa en la presente memoria, "medio minimo" se refiere al medio de crecimiento celular que comprende ingredientes quimicamente definidos que incluyen, pero no se limitan, tampones tales como tampon de fosfato, sales tales como sulfato magnesico, cloruro calcico, cloruro sodico, o sulfato de manganeso, minerales tales como hierro, cinc, cobre, cobalto, o molibdeno, una fuente de carbono tal como glucosa o glicerol, y una fuente de nitrogeno tal como sulfato o nitrato amonico. Un ejemplo es el medio M9 (Kim, YS, JH Seo and HY Cha, Enzyme and Microbial Technology 33 (2003):460-465.)

Tal como se usa en la presente memoria, "medio rico" se refiere al medio de crecimiento celular que comprende ingredientes no definidos y que incluyen, pero no se limitan, componentes adicionales tales como tampones (por ejemplo tampon de fosfato), sales (por ejemplo sulfato magnesico, cloruro calcico, cloruro sodico o sulfato de manganeso), y una fuente de carbono que puede ser glucosa o glicerol, por ejemplo. La fuente de nitrogeno puede estar compuesta por un hidrolisato de proteina tal como extracto de levadura, hidrolisato de carne, o hidrolisato de soja. La fuente de nitrogeno se puede proporcionar en una concentracion capaz de mantener el crecimiento celular, con una relacion de fuente de nitrogeno complejo (en gramos por litro) a densidad celular maxima (en unidades de DO) de 1:1 o mayor. Entre los ejemplos de medio rico se incluyen, pero no se limitan, Superbroth (Atlas RM, Handbook of Microbiological Mesdia; Parks LC Ed.; CRC Press: Boca Raton FL, pp. 281, 523, 529, 859), caldo de Teriffic (Alpha Biosciences, Baltimore, MD EE.UU.), Caldo Turbo (Athena Enzyme Systems, Baltimore, MD EE.UU.), o caldo Hyper (Athena Enzyme Systems, Baltimore, MD EE.UU.).

Tal como se usa en la presente memoria, "gluconoilacion" se refiere a la union de un derivado de acido gluconico a una proteina. La gluconoilacion puede incluir, pero no se limita, la formacion de aducto de 6-fosfogluconolactona (6-PGL), acetilacion, formilacion, desformilacion, gluconolactonacion, o derivatizacion con acido gluconico.

Tal como se usa en la presente memoria, "rendimiento de la concentracion" se refiere a la concentracion de un producto (por ejemplo, polipeptido expresado heterologamente) en solucion (por ejemplo, caldo de cultivo, o mezcla de lisis celular o tampon) y normalmente se expresa como mg/l o g/l. Un aumento del rendimiento de la concentracion se puede referir a un aumento absoluto o relativo de la concentracion de un producto producido en dos conjuntos definidos de condiciones.

Tal como se usa en la presente memoria, "actividad de pgl" se refiere a cualquier actividad de una 6fosfogluconolactonasa ("pgl"). Dicha actividad puede incluir hidrolisis de 6-PGL a acido 6-fosfogluconico. La actividad de pgl significativa se puede definir como actividad de hidrolisis de al menos 0,2 UI/min/g.

Tal como se usa en la presente memoria, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridacion rigurosas" significan que la hibridacion se producira solo si hay una identidad de al menos 70% y preferiblemente al menos 80%, pero especialmente preferiblemente al menos 95% entre las secuencias. Un ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas es incubacion toda la noche a 42°C en una solucion que comprende: formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisodico 15 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), 5x solucion de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y DNA de esperma de salmon fraccionado y desnaturalizado 20 microgramos/ml, seguido de lavado de los filtros en 0,1xSSC aproximadamente a 65°C. Las condiciones de hibridacion y lavado son conocidas y ejemplificadas por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente en su capitulo 11.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Las tensiones celulares que provienen del crecimiento en medio minimo, altas densidades celulares, y alto nivel de expresion de polipeptido heterologo, entre otras tensiones, pueden contribuir a la gluconoilacion del polipeptido heterologo. Por lo tanto, aliviar uno o mas de estos factores de tension puede afectar al nivel de gluconoilacion de la proteina expresada en el microorganismo, que a su vez puede afectar a la pureza y rendimiento de la concentracion de un polipeptido deseado. Algunas cepas de E. coli pueden tener niveles mayores de actividad de pgl que otras (aunque no se ha identificado el gen responsable de esta actividad en E. coli. Cordwell, S.J. 1999. Arch. Microbiol. 172:269279). Ademas, la gluconoilacion de polipeptidos puede afectar a la cristalizacion y determinacion estructural de estos polipeptidos.

La presente descripcion, proporciona metodos para prevenir la gluconoilacion de un polipeptido expresado en un microorganismo, que comprenden hacer crecer dicho microorganismo en un medio de cultivo rico. En otro aspecto, el microorganismo no demuestra actividad de 6-fosfogluconolactonasa significativa cuando se hace crecer en medio minimo. El microorganismo puede ser una cepa de E. coli. En otro aspecto de la invencion, una E. coli es una cepa B. En otro aspecto, un medio de cultivo rico comprende una fuente de nitrogeno complejo. Un medio de cultivo rico puede mantener el crecimiento celular en una relacion de concentracion de fuente de nitrogeno complejo a densidad celular

1:1. Una fuente de nitrogeno complejo puede comprender triptona, peptona, o extracto de levadura. En otro aspecto, un medio de cultivo es Superbroth. El medio Superbroth puede estar doblemente concentrado. En otro aspecto, se transfecta un microorganismo con una molecula de DNA recombinante que codifica un polipeptido heterologo.

En otra realizacion, se proporcionan metodos para prevenir la gluconoilacion de un polipeptido expresado en E. coli, que comprenden fermentar una variedad de la cepa K de E. coli para expresar el polipeptido. En otro aspecto, una cepa K demuestra actividad de fosfogluconolactonasa al menos aproximadamente 100 veces mayor comparada con la cepa B hecha crecer sustancialmente en las mismas condiciones. En otro aspecto, una cepa K es K-12.

En otra realizacion, se proporcionan metodos para prevenir la gluconoilacion de polipeptidos expresados en un microorganismo, que comprenden introducir DNA en el microorganismo, en el que el DNA codifica un polipeptido que demuestra actividad de 6-fosfogluconolactonasa. En otro aspecto, un microorganismo es E. coli. Un DNA comprende DNA que codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa. En otro aspecto, un DNA que codifica una enzima 6fosfogluconolactonasa tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% respecto a un DNA que codifica la 6-fosfogluconolactonasa de una Pseudomonas, que puede ser P. aeruginosa. En otro aspecto, un DNA que codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% respecto al SEQ ID NO:7. En otro aspecto, una enzima 6fosfogluconolactonasa tiene una secuencia de aminoacidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% respecto al SEQ ID NO:8. Un DNA que codifica una enzima 6fosfogluconolactonasa comprende la secuencia expuesta en el SEQ ID NO:7. El DNA puede ser DNA recombinante, y/o se puede transformar en un DNA genomico de un microorganismo.

En otra realizacion, se proporciona un microorganismo que puede prevenir la gluconoilacion de polipeptidos. Un microorganismo comprende DNA que codifica un polipeptido que demuestra actividad de 6-fosfogluconolactonasa. Un microorganismo comprende DNA que codifica 6-fosfogluconolactonasa. En otro aspecto, un DNA que codifica 6fosfogluconolactonasa tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% respecto al DNA que codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa de una Pseudomonas y en el que el microorganismo no es Pseudomonas. En otro aspecto de la invencion, un DNA que codifica 6-fosfogluconolactonasa es de P. aeruginosa. En otro aspecto, un microorganismo es una cepa de E. coli. En otro aspecto, un microorganismo es una cepa de E. coli, en el que se incorpora un DNA que codifica la 6-fosfogluconolactonasa en el genoma del microorganismo.

En otra realizacion, se proporciona un polinucleotido aislado que comprende un polinucleotido que tiene una identidad de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% respecto al polinucleotido expuesto en el SEQ ID NO:7. En otro aspecto, un polinucleotido aislado comprende un polinucleotido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% respecto a un polinucleotido que codifica un polipeptido que comprende aminoacidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% respecto al SEQ ID NO:8. En otro aspecto, un DNA codifica una proteina que demuestra actividad de 6-fosfogluconolactonasa. En otro aspecto, se expone una secuencia de DNA en el SEQ ID NO:7. En otro aspecto de la invencion, una secuencia de DNA es homologa a un DNA que codifica la 6-fosfogluconolactonasa de P. aeruginosa. En otro aspecto, un polinucleotido aislado comprende ademas un polinucleotido que codifica una interleuquina-18 humana, o sus variantes.

En otra realizacion, se proporcionan metodos para mejorar la formacion de cristal del polipeptido, que comprenden expresar dicho polipeptido por un metodo de la invencion, con el fin de reducir la gluconoilacion del polipeptido.

En otra realizacion, se proporcionan metodos para mejorar la eficacia del crecimiento y expresion de un polipeptido en un microorganismo. En un aspecto, un polipeptido demuestra un mayor rendimiento de la concentracion en la etapa de fermentacion comparado con el polipeptido gluconoilado.

En otra realizacion, se proporcionan metodos para producir una interleuquina humana, que comprenden coexpresar dicha interleuquina humana en un microorganismo con una enzima que tiene actividad de 6-fosfogluconolactonasa ("pgl"). En un aspecto, una interleuquina humana es una proteina IL-18, o sus variantes. En un aspecto, un microorganismo es E. coli. En un aspecto, la pgl es codificada por un polinucleotido que es transformado o transfectado en E. coli, incluyendo, pero sin limitar, ser transformado en el genoma o episoma.

En otra realizacion, se proporcionan metodos para producir una interleuquina humana, que comprenden expresar la interleuquina humana en un microorganismo que se hace crecer en un medio de cultivo rico. En un aspecto, una interleuquina humana es una proteina IL-18, o una de sus variantes. En otro aspecto, el microorganismo es E. coli. En un aspecto, un medio de cultivo rico comprende peptona de fitona. En un aspecto, un medio de cultivo rico comprende extracto de levadura Bacto.

En otra realizacion, se proporciona un microorganismo sin expresion detectable de fago lambda infeccioso. En un aspecto, se suprime o altera la proteina estructural de la capside del fago lambda, gpE, en un microorganismo. La supresion o alteracion de una proteina se puede lograr de varias formas no limitantes. Se puede eliminar parcial o completamente de un microorganismo un gen que codifica una proteina. Un gen que codifica una proteina se puede modificar geneticamente mediante tecnicas no limitantes tales como mutacion puntual o mutacion aleatoria. Una proteina se puede escindir o modificar quimica o enzimaticamente para alterar su estructura o funcion. Se puede alterar

o suprimir la expresion de un gen regulador promotor para eliminar o reducir la expresion del gen. Se pueden regular las condiciones de la solucion o temperatura para afectar a la estructura o funcion de la proteina. En un aspecto, un microorganismo es una E. coli. En otro aspecto un microorganismo comprende un gen de RNA-polimerasa de T7.

Los siguientes ejemplos ilustran diferentes aspectos de la invencion. Estos ejemplos no limitan el alcance de esta invencion que se define por las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo�1

Se creo una cepa mejorada de la cepa BL21(DE3) de E. coli que no tiene expresion detectable de fago lambda infeccioso, por supresion de la expresion de una proteina estructural principal de la capside del fago lambda, gpE. Esta cepa se uso en los Ejemplos presentados en la presente memoria.

Se amplifico por PCR un fragmento interno de 413 pares de bases de la region que codifica gpE usando la pareja de cebadores:

y DNA cromosomico de BL21(DE3) como molde. El fragmento resultante:

producto de la amplificacion por PCR, se clono TA y se verifico la secuencia usando tecnicas patron. Despues, se introdujo una copia funcional de un gen de resistencia al cloranfenicol en el sitio de EcoRV situado en el centro y mostrado en negrita en la secuencia de gpE clonada. Despues la construccion del fragmento de gpE interrumpido con cloranfenicol se uso como un vector konock-out de recombinacion homologa lineal para la supresion de la expresion

genetica del gen de gpE de lambda (DE3) que reside en la cepa hospedante BL21(DE3) de E. coli. El vector knock-out se introdujo en la celula hospedante exactamente como describen Kirill A. Datsenko y Barry Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2000; 97:6640-6645, excepto que se uso el vector descrito en la presente memoria. Se identificaron preliminarmente los knock-outs para gpE putativos por la capacidad de crecimiento en presencia de cloranfenicol 6 μg/ml, y posteriormente se confirmaron por analisis por PCR. Se deposito uno de dichos knock-outs para gpE de BL21(DE3), con la designacion en GSK ECC-023.

Se ensayo en ECC-023 la presencia de particulas de fago infeccioso en un ensayo de placa muy sensible. Como se muestra en la Tabla 1, el BL21(DE3) padre, expresaba cantidades apenas detectables de fago cuando no se inducia a hacerlo, aproximadamente 20 ufp, pero aproximadamente tres ordenes de magnitud mas cuando se inducia por la respuesta SOS al dano genetico (irradiacion UV). Sin embargo, el derivado knock-out para gpE, ECC-023, no producia ninguna prueba de fago infeccioso, incluso cuando se trato de inducir la respuesta SOS. Los datos muestran que el derivado de BL21(DE3), ECC-023, no produce ninguna particula de fago infeccioso detectable, y de acuerdo con esto es una cepa de celula hospedante adecuada para la fabricacion biofarmaceutica.

Tabla�1:�Producci6n�de�particulas�de�fago�infeccioso�de�E. coli.

UFP/ml

No inducido

Inducido por SOS

BL21(DE3)

21 10.000

ECC-023

0 0

Ejemplo�2

Este ejemplo muestra que cultivar celulas en un medio rico puede prevenir la formacion de un aducto de 6-PGL de proteinas marcadas con His, comparado con el medio minimo.

Se hizo crecer E. coli BL21(DE3) transformada con el plasmido pET28FabZSa, que codifica el gen para Hexa-His-FabZ, en MCJK (medio minimo) o MCJKLB (medio rico) a 37°C, hasta que se alcanzo una DO600 de 1,0. En la Taba 2 se describen las composiciones de los medios para MCJK y MCJKLB.

Tabla�2:�Composiciones de�los�medios�para�producir�HeXa-His-FabZ

Componente

MCJK MCJKLB

K2HPO4

56 mM 56 mM

(NH4)2SO4

38 mM 38 mM

MgSO4

5 mM 5 mM

CaCI2

1 mM 1 mM

Metales en trazas*

1 ml/l 1 ml/l

Glucosa

10 g/l 10 g/l

Extracto de levadura

nada 5 g/l

Triptona Bacto

nada 10 g/l

*Metales en trazas: FeCI2 161 mM, Na2MoO4 2,7 mM, ZnSO4 1,4 mM, MnCI2 2,5 mM, CuSO4 3,2 mM, CoCI2 3,4 mM, y H3BO33,2 mM

Se anadio isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido ("IPTG") con una concentracion final 1 mM, y las celulas se mantuvieron a 37°C durante cuatro horas hasta la recoleccion. Las celulas se recogieron por centrifugacion a 16.000 x g durante 10 min y se lisaron por agitacion suave en Tris 10 mM, pH 8,0, Na2EDTA 1 mM, lisozima 10 μg/ml y Benzonasa 25 U/ml (Sigma). Se separaron los restos celulares por centrifugacion a 16.000 x g durante 10 minutos, y la proteina recombinante se purifico del extracto soluble con resina Ni-NTA en modo discontinuo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Qiagen Inc., Valencia, CA). Se analizo en las proteinas heterologas la presencia de modificacion con gluconolactona por analisis de LC/MS.

El polipeptido heterologo MGSSH4 con marcador de His se gluconoila en un nivel de 34% de la proteina recombinante total cuando el cultivo se lleva a cabo en medio minimo (MCJK) como se muestra en la Tabla 3. Cuando el medio se complementa o se hace rico con extracto de levadura y triptona, la proteina gluconoilada no es detectable, como se

muestra tambien en la Tabla 3. Por lo tanto, el uso de un medio mas rico puede prevenir la formacion del aducto de 6-PGL.

Tabla 3: Efecto de medio minimo frente a rico en la gluconoilaci6n de una proteina marcada con His eXpresada en E. coli

Vector

EXtremo�N Inserto %�Modificado Hospedante Medio Comentarios

pET28FabZSa

MGSSH6 FabZ 34% BL21(DE3) MCJK medio minimo

pET28FabZSa

MGSSH6 FabZ No detectable BL21(DE3) MCJKLB medio rico

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que un resto de lisina interno de una quimioquina CXC recombinante (tambien conocida como Gro-beta-T) puede ser gluconoilado cuando se expresa en E. coli. Las secuencias del cDNA y de aminoacidos de Grobeta-T humano se proporcionan en la solicitud de patente Internacional, Publicacion n° WO 92/00327 (9 de Enero, 1992), asi como en la patente de EE.UU. n° 6.042.821 ypatente de EE.UU. n° 6.413.510.

La acumulacion de proteina heterologa durante la produccion de una quimioquina CXC (Gro-beta-T) se siguio de forma rutinaria usando un ensayo de fase inversa de alta produccion, cuantitativo. Esta separacion se conecto con un espectrometro de masas de tiempo de vuelo, de electropulverizacion ("ESI-TOF") y de alto rendimiento, para proporcionar un medio para seguir rutinariamente la formacion de las variantes relacionadas con el producto.

Cuando se expreso en el hospedante E. coli BL21(DE3), solo se observaron dos modificaciones del producto. La deconvolucion de los espectros de masas caracterizo las variantes que presentaban desplazamientos de masa de +178 Da y +258 Da comparadas con el producto nativo a 7.542 Da.

El producto obtenido de estas fermentaciones se paso por un procedimiento de purificacion. Las muestras durante el procedimiento se caracterizaron usando un ensayo de fase inversa de alta resolucion que puede resolver variantes minoritarias del producto. El analisis por cromatografia liquida-espectroscopia de masas ("LCMS") confirmo que las nuevas variantes del producto presentaban desplazamientos de masa de +258 Da (tiempo de retencion ∼14,8 min) y +178 Da (tiempo de retencion ∼15,2 min).

La bibliografia publicada indicaba que estos desplazamientos de masa de +178 Da y +258 Da se habian observado previamente en proteinas expresadas con marcadores de hexa-His, y que resultaban de la adicion de 6-PGL o gluconolactona al resto N-terminal. La quimioquina CXC (Gro-beta-T) no se expreso usando un marcador de hexa-His. Ademas, la molecula no presenta ninguna region rica en histidina. Para confirmar que las especies estaban relacionadas con el producto, se aislo cada variante y se sometio a secuenciacion N-terminal. La secuenciacion confirmo la secuencia correcta del producto y aseguro que no habia marcador de hexa-His.

Las variantes se sometieron a digestion con tripsina y cartografia del peptido. La comparacion con los mapas de peptidos generados usando el producto patron, puso de manifiesto dos nuevos picos en el mapa de tripsina, eluyendo el primer pico a 45,8 min (m/z 1094) y eluyendo el segundo pico a 46,5 min (m/z 1174). Los nuevos peptidos se aislaron y sometieron a secuenciacion N-terminal que indico que ambos tenian la misma secuencia (NIQSVKVK (SEQ ID NO:4)). La homologia de la secuencia y la presencia de una diferencia de masa de 80 Da sugeria que las especies diferian solo en la presencia de fosforilacion.

Se llevo a cabo espectrometria de masas LCMS del pico con m/z 1174. El experimento de MS/MS confirmo que el pico tiene una secuencia de NIQSVKVK (SEQ ID NO:4). Ademas, los iones fragmento de la serie y empezando por y3 e incluyendo y3, y4, y5 e y6 mostraron un aumento de masa de 258 Da. Sin embargo, el ion y2 no mostro el aumento de masa de 258 Da. Estos datos indicaban que la modificacion estaba en la lisina (n° 23 en la secuencia) con aumento de masa de 258 Da.

Para confirmar que la modificacion observada se debia a la gluconoilacion del producto, se desarrollaron reacciones in vitro que usaban L-glucono-1,5-lactona o acido galactonico reactivo. Los trabajos previos habian mostrado que estas especies podian inducir la adicion de especies gluconoilo al marcador hexa-His [Geohegan, et al.].

La quimioquina CXC (Gro-beta-T) purificada se intercambio con tampon en un tampon de TRIS a pH 8,0. Se anadieron L-glucono-1,5-lactona o acido galactonico en una concentracion 450 mM, y las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante veinte minutos. Ambas lactonas indujeron la misma modificacion de +178 Da de la quimioquina CXC observada durante la expresion en E. coli.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la gluconoilacion de los restos de lisina internos de una interleuquina humana recombinante (IL-18 humana) expresada en E. coli.

Se uso HPLC de fase inversa de alta resolucion acoplada con espectrometria de masas ESI-TOF, para cribar los aductos de 6-PGL de un producto de interleuquina. El analisis de la interleuquina expresada en la cepa B dio una especie relacionada con el producto que presentaba una diferencia de masa de +178 Da. Puesto que la proteina se expreso sin un marcador de hexa-His, era probable que la modificacion se produjera en un resto de lisina interno, como

5 se habia observado con la quimioquina CXC (vease el Ejemplo 3).

El analisis por HPLC de fase inversa de alta resolucion de la molecula de Interleuquina permitio la identificacion de multiples especies del producto que presentaban desplazamientos de masa de +178 Da a RT de 21,0, 22,0, 23,0 minutos y una especie minoritaria adicional que presentaba un desplazamiento de +258 Da (RT ∼27,5 minutos).

La modificacion in vitro de la interleuquina tambien se evaluo con L-glucono-1,5-lactona a pH 8,0, como se ha descrito

10 en el ejemplo previo. Esta reaccion otra vez dio las mismas modificaciones de +178 Da observadas cuando se expresaba la interleuquina en la cepa B de E. coli.

Ejemplo 5

Este ejemplo muestra que cultivar celulas en medio rico previene la gluconoilacion o formacion de aducto de PGL de los restos de lisina internos de una proteina recombinante. En este estudio se compararon tres procedimientos de

15 fermentacion discontinua alimentada. La diferencia entre los experimentos de fermentacion era el medio discontinuo y las composiciones de la alimentacion usadas durante la fase de produccion. Se uso un medio rico en el Procedimiento I de fermentacion, mientras que los lotes segundo y tercero (Procedimientos II y III) se llevaron a cabo con un medio minimo. Se uso glicerol como medio de alimentacion en el Procedimiento I y II, mientras que se uso glucosa en el Procedimiento III.

20 El procedimiento de fermentacion para producir una interleuquina recombinante en E. coli se llevo a cabo en un modo discontinuo alimentado en un fermentador de 15 litros. La fermentacion se inicio como un procedimiento discontinuo. Se preparo el inoculo mediante transferencia aseptica de 0,5 ml de un cultivo madre en glicerol a 1000 ml de medio PYE en un matraz de 2,8 litros, como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4. Composici6n del medio de siembra para la eXpansi6n del in6culo en los fermentadores

Articulo

Concentraci6n del medio discontinuo

Extracto de levadura

5 g/l

Peptona de fitona

10 g/l

Cloruro sodico

10 g/l

Dextrosa

10 g/l

Sulfato de kanamicina

50 mg/l

25 El cultivo se hizo crecer toda la noche a 27,5°C en un agitador rotatorio. Despues el cultivo del matraz agitado se transfirio a un fermentador que contenia 5 litros de medio discontinuo. El medio de produccion consta de sales, aminoacidos, y sulfato de kanamicina. Adicionalmente, el medio rico se complementa con altas concentraciones de extracto de levadura y peptona de fitona, como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5: Composici6n del medio de la etapa de producci6n para comparar medio rico frente a minimo

Concentraci6n de medio discontinuo

Articulo

Procedimiento I Procedimiento II Procedimiento III

Extracto de levadura

48 g/l 5,8 g/l 5,8 g/l

Peptona fitona

24 g/l 1,6 g/l 1,6 g/l

(NH4)2SO4

nada 5 g/l 5 g/l

NaCI

nada 1.3 g/l 1,3 g/l

Dextrosa

nada nada 33,5 g/l

Glicerol

26 g/l 26 g/l nada

K2HPO4

15,3 g/l 6 g/l 6 g/l

KH2PO4

1,7 g/l 3 g/l 3 g/l

Metales en trazas*

1 ml/l 1 ml/l 1 ml/l

MgSO4

5 mM 5 mM 5 mM

CaCI2

1 mM 1 nM 1 nM

Sulfato de kanamicina

30 mg/l 30 mg/l 30 mg/l

*Solucion de metales en trazas: FeCl2.6H2O, 37,8 g/l; Na2MoO4.H2O, 0,7 g/l; ZnSO4.7H2O, 0,4 g/l; MnCI2.4H2O, 0,5 g/l; CuSO4.5H2O, 0,8 g/l; CoCI2.6H2O, 0,8 g/l; H3BO3, 0,2 g/l.

El pH de cada medio se mantuvo a aproximadamente 7,3 usando hidroxido amonico. La temperatura se controlo a aproximadamente 27,5°C. El medio de alimentacion, glicerol o dextrosa se esterilizaron por separado y se conectaron asepticamente a un fermentador usando tubo de goma de silicona.

El suministro de medio de alimentacion se inicio cuando se redujo la cantidad del lote inicial en el cultivo. Un electrodo de oxigeno polarografico seguia la presion de oxigeno disuelto en el fermentador. La velocidad de alimentacion de carbono se controlo en un modo de cascada para mantener constante la presion de oxigeno disuelto alrededor de 20%. La aireacion se mantuvo a 10 l ptn/min y la presion a una sobrepresion de 0,49 kg/cm2 de. Se uso una velocidad de agitacion de 800 rpm desde el principio hasta el final del experimento de fermentacion. A una DO550 de aproximadamente 40 unidades, se inyectaron 100 ml de IPTG 1 mM en el cultivo para inducir la expresion genica recombinante.

El analisis por HPLC de fase inversa de las muestras recogidas 24 horas despues de la adicion de IPTG indicaban la reduccion del nivel de gluconolactona en el producto. La ausencia de aducto de 6-PGL en el Procedimiento I, y su presencia en el Procedimiento II y III, indica que el uso de medio rico, y la fuente de carbono sin glicerol, eran responsables de la eliminacion del aducto de 6-PGL. La Tabla 6 resume los resultados del analisis.

Tabla 6. Analisis del aducto de fosfogluconolactona en tres procedimientos de fermentaci6n para producir una interleuquina recombinante.

Procedimiento nO

Aducto de fosfogluconolactona en interleuquina humana XIL-18)

Procedimiento I

Ausente

Procedimiento II

Presente

Procedimiento III

Presente

Ejemplo 6

Este ejemplo muestra que la cepa K-12 de E. coli tiene actividad de pgl 100 veces mayor que la cepa B.

Se midio la actividad de 6-fosfogluconolactonasa en extractos de dos cepas diferentes con BL12(DE3) como madre, ECC005 y ECO680, y otras dos cepas originadas de un genotipo de K-12, ECO706 y ATG3995.

Para cultivar las cepas, en matraces de agitacion de 2 litros que contenian 1 litro de medio PYE + glucosa al 1% y kanamicina 50 μg/ml, se inocularon 0,4 ml de suspension celular de viales congelados. La incubacion fue a 30°C con una agitacion de 220 rpm durante 6 o 7,5 horas. Se tomaron muestras en los puntos de tiempo indicados para medir la densidad optica a 550 nm, y se recogieron sedimentos para medir la actividad de pgl. A continuacion se presentan detalles del ensayo in vitro para medir la actividad de pgl.

La actividad de pgl se ensayo por fluorometria, a 340 nm y 25°C, en extractos sin celulas. Los extractos sin celulas se prepararon como se ha descrito previamente (Maitra and Lobo, Journal of Biological Chemistry 246: 475-488 (1971)); esencialmente con los mismos tampones de resuspension, HEPES 50 mM pH 7,3 que contenia EDTA 5 mM y βmercaptoetanol 5 mM, pero las celulas se rompieron por sonicacion (5 ciclos de 20 s).

La pgl se ensayo usando un metodo previamente publicado (Sinha and Maitra Journal of General Microbiology, 1992;

138: 1865-1873) con algunas modificaciones. El ensayo consistia en una preincubacion de 1 ml de mezcla que contenia glucosa-6-fosfato 50 μM, NADP+ 0,5 mM, y una unidad de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa en tampon de MES 100 mM, pH 6,5, que contenia KCl 25 mM y MgCl2 10 mM. Una vez que la reaccion alcanzo la meseta, se siguio por adicion de 2 unidades de 6-fosfogluconato-deshidrogenasa, que dio como resultado un lento aumento de la absorbancia debido a la hidrolisis espontanea de la 6-PGL formada durante la etapa de preincubacion. Cuando se anaden los extractos sin celulas, cualquier aumento significativo de la fluorescencia se debe a la actividad de fosfogluconolactonasa. Todas las actividades de pgl se calcularon en el intervalo lineal del aumento de absorbancia despues de la adicion de extracto sin celulas.

La actividad enzimatica se calculo restando la tasa de hidrolisis espontanea de la 6-PGL. Las actividades enzimaticas se expresaron en mmoles de NADPH por minuto y por mg de proteina total. La proteina total se determino por el ensayo de proteinas con acido bicinconinico (BCA) (Pierce, Illinois, EE.UU.).

En las cepas basadas parentalmente en el genotipo de K-12, se ha detectado aumento de actividad de 100 veces mas que en las cepas B.

La Tabla 7 resume los resultados de los ensayos enzimaticos en las dos familias de cepas.

Tabla 7: Actividad de fosfogluconolactonasa medida en cepas K-12 y B de E. coli.

CEPAS "K"

Cultivo Actividad Hidrolisis esp.

Cepa

Tiempo (h) (mmoles de NADH/ min/mg de proteina) (mmoles/min/mg de proteina)

ATCC 10798

5,5 1,061 0,0011

6,5

2,899 0,0012

7,5

2,584 0,0012

K-12 que expresa una interleuquina humana (IL-18)

7,5 3,539 0,0011

CEPAS "B"

Cultivo Actividad Hidrolisis esp.

Cepa

Tiempo (h) (mmoles de NADH/ min/mg de proteina) (mmoles/min/mg de proteina)

ATCC 47092

5,5 0,028 0,0012

BL21(DE3) que expresa una interleuquina humana (IL-18)

5,5 0,032 0,0012

6,5

0,019 0,0011

7,5

0,032 0,0012

10 Ejemplo 7

Este ejemplo muestra que la expresion de un polipeptido heterologo, una quimioquina CXC (conocida tambien como Gro-beta-T) en la cepa BL21 de E. coli da como resultado el aducto de 6-PGL, mientras que la expresion del mismo polipeptido en una cepa K-12 previene la gluconoilacion de las lisinas internas.

Se llevaron a cabo diez experimentos de fermentacion usando cuatro cepas diferentes de E. coli construidas para la

15 expresion recombinante de una quimioquina CXC. Este ejemplo demuestra el efecto de la familia del hospedante frente al sistema promotor en la presencia de formacion de aducto de 6-PGL de la proteina recombinante usando dos sistemas de expresion con cada familia celular del hospedante. La Tabla 8 describe las cepas que se usaron.

Tabla 8: Familia del hospedante y sistemas promotores usados para eXpresar una quimioquina CXC en E. coli

Cepa nO

Familia del hospedante Sistema promotor

1

BL21 (DE3) polimerasa de T7

2

K-12(DE3) polimerasa de T7

3

BL21 (DE3) Lambda pL

4

K-12 Lambda pL

20 La fermentacion para producir la quimioquina CXC (Gro-beta-T) en E. coli se llevo a cabo en un modo discontinuo alimentado en un fermentador de 15 litros. La fermentacion se inicio como un procedimiento discontinuo. El inoculo se preparo por transferencia aseptica de 0,75 ml de un cultivo madre en glicerol a 100 ml de medio PYE a un matraz con tampon de 500 ml. El cultivo se hizo crecer durante 7 horas a 32,0°C en un agitador rotatorio. Despues el cultivo del matraz agitado se mezclo con 1,0 litro de medio PYE y se transfirio a un fermentador que contenia 8,0 litros de medio discontinuo. El medio de produccion constaba de sales y carbenicilina o sulfato de kanamicina dependiendo del promotor. Las formulaciones de los medios para la expansion de la semilla se proporcionan en la Tabla 9, y la formulacion del medio para la produccion de la quimioquina CXC en E. coli se proporciona en la Tabla 10.

Tabla 9: Formulaci6n del medio para la eXpansi6n de la semilla.

Componente

Concentraci6n

Extracto de levadura

5 g/l

Peptona de fitona

10 g/l

Cloruro sodico

10 g/l

Dextrosa

10 g/l

Sulfato de kanamicina

50 mg/l

Tabla 10: Formulaci6n del medio para producir quimioquina CXC en E. coli

Componente

Concentraci6n

Sulfato amonico

5 g/l

Fosfato potasico, dibasico

6 g/l

Fosfato potasico, monobasico

3 g/l

Cloruro sodico

1,3 g/l

Dextrosa

18 g/l

Sulfato magnesico

4,8 g/l

Biotina

1 mg/l

Metales en trazas*

10 ml/l

Sulfato de kanamicina

50 mg/l

o

Carbenicilina

25 mg/l

*Solucion de metales en trazas: FeCl2.6H2O, 3,78 g/l; Na2MoO4.H2O, 0,7 g/l; ZnSO4.7H2O, 0,4 g/l; MnCl2.4H2O, 0,5 g/l; CuSO4.5H2O, 0,8 g/l; CoCl2.6H2O, 0,8 g/l; H3BO3, 0,2 g/l.

El pH de cada medio se mantuvo aproximadamente a 7,0 usando hidroxido amonico. La temperatura se controlo a

10 aproximadamente 32,0°C y se aumento a aproximadamente 37,5°C en la induccion. El medio de alimentacion y la dextrosa se esterilizaron por separado y se conectaron asepticamente a un fermentador usando un tubo de goma de silicona.

El suministro de medio de alimentacion se inicio cuando se redujo la cantidad del lote inicial en el cultivo. Un electrodo de oxigeno polarografico seguia la presion de oxigeno disuelto en el fermentador. La velocidad de alimentacion de 15 carbono se controlo en un modo de cascada para mantener constante la presion de oxigeno disuelto alrededor de 25%. La aireacion se mantuvo a 10 l ptn/min y la presion a una sobrepresion de aproximadamente 0,49 kg/cm2. Se uso una velocidad de agitacion de aproximadamente 400 rpm al principio y se aumento segun fuera necesario para mantener una presion de oxigeno disuelto de aproximadamente 25%. A una DO550 de aproximadamente 14 unidades, se inyectaron 100 ml de IPTG 1,0 mM en el cultivo, o la temperatura se aumento a 37,5°C para inducir la expresion

20 genica recombinante.

Ninguno de los experimentos de fermentacion usando una familia de hospedante K-12 tenia formacion de aducto de 6-PGL detectable en el polipeptido expresado de modo recombinante, mientras que los experimentos usando la cepa B junto con el promotor de T7 presentaban todos la presencia de formacion de aducto de 6-PGL detectable en el polipeptido expresado de modo recombinante. Los tres experimentos usando la cepa B y el promotor de pL no tenian formacion de aducto detectable. Estos datos demuestran que la expresion de una proteina recombinante en una cepa de hospedante que tiene actividad de pgl, por ejemplo, K-12, puede prevenir la formacion de aducto de 6-PGL en proteinas recombinantes que son susceptibles a esta modificacion, vease el Ejemplo 3. En la Tabla 11 se presenta la presencia de formacion de aducto de 6-PGL en la quimioquina CXC expresada en las cepas B y K-12 de E. coli para cada fermentacion.

Tabla 11: Presencia de aducto de 6-PGL en quimioquina CXC eXpresada por el promotor de T7 o pL en cepas B y K12 de E. coli.

Genotipo de la cepa

Promotor EXperimento nO Aducto de gluconolactona 5 h despuss de inducci6n [% de pico del producto]

B

T7 1 21,7

2

5,8

3

4,2

Media

10,6

K-12

T7 1 0

2

0

Media

0

B

pL 1 0

2

0

3

0

Media

0

K-12

pL 1 0

2

0

Media

0

Ejemplo�8

Este ejemplo muestra que la expresion de un polipeptido heterologo, interleuquina humana (IL-18), en la cepa BL21 de

10 E. coli da como resultado la formacion de aducto de 6-PGL, mientras que la expresion del mismo polipeptido en una cepa K-12 prevendra la 6-fosfogluconoilacion de las lisinas internas.

Se construyeron cepas BL21(DE3) y K-12 de E. coli para expresar una interleuquina humana (IL-18). Los cultivos se hicieron crecer en medio minimo como se describe en el Ejemplo. El seguimiento de la modificacion del producto con 6-PGL se llevo a cabo en diferentes puntos de tiempo a lo largo del cultivo, usando metodos descritos en el Ejemplo.

15 Los resultados se expresan como proporciones de las areas de los picos del producto sin modificar a producto modificado. Los numeros mayores indican una menor proporcion de producto gluconoilado. Es evidente que el grado de gluconoilacion en la cepa BL21 (DE3) es significativamente mayor que en la cepa K-12. La fosfogluconoilacion de una interleuquina humana (IL-18) expresada en las cepas B y K-12 de E. coli se resume en la Tabla 12.

Tabla 12: Fosfogluconoilaci6n de una interleuquina humana eXpresada en las cepas B y K-12 de E. coli.

Cepa de E. coli

Tiempo�despuss de inducci6n Xh) Proporci6n de areas de producto no modificado a producto modificado

K-12

16 58,4

18

44,5

20

N/d

22

29,3

24

30,0

BL21 (DE3)

22 8,3

24

7,7

N/d = producto modificado no detectable

Ejemplo�9

Este ejemplo ilustra que la sobreexpresion de pgl heterologa en celulas hospedantes de E. coli conduce a una mayor conversion metabolica de la 6-PGL en su producto 6-fosfogluconato, reduciendo asi el deposito de 6-PGL disponible para la formacion de aducto. Se clono un gen de pgl de P. aeruginosa y se introdujo por ingenieria en un sistema de vector de expresion inducible basado en plasmido que es compatible con plasmidos basados en el origen de replicacion colE1, de modo que se pueden mantener dos plasmidos diferentes en la misma celula hospedante. El nivel de expresion inducible de pgl de P. aeruginosa se puede regular a voluntad, de una forma independiente de las rutas metabolicas endogenas de E. coli e independiente de la expresion inducible de la proteina recombinante de interes. De acuerdo con esto, la expresion de pgl recombinante se puede regular de modo que se disminuya el deposito de 6-PGL por debajo del nivel requerido para la formacion de aducto, pero no en un grado en el que los recursos de la celula hospedante esten sustancialmente afectados. Por lo tanto, el nivel de la proteina recombinante deseada se puede regular por separado para dar niveles de expresion muy altos.

Clonacion de pgl de P. aeruginosa

Se clono la pgl de P. aeruginosa como sigue. Se obtuvo P. aeruginosa del American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852-1776): Pseudomonas aeruginosa, cepa ATCC 27853. Los cebadores para la amplificacion por PCR 5' y 3' se designaron y sintetizaron para dirigir la amplificacion por PCR del gen de pgl entero, incluyendo la region justo corriente arriba del codon de iniciacion ATG. Las secuencias de los cebadores para la amplificacion homosentido y antisentido son:

respectivamente. Las secuencias en negrita indican sitios XhoI introducidos en el gen para permitir las posteriores etapas de clonacion.

Adicionalmente, se encontro que el gen de P. aeruginosa era muy rico en GC y no se amplificaria por PCR en las condiciones normales de amplificacion. Se encontro que la amplificacion por PCR requiere el uso de condiciones de amplificacion por PCR que estan optimizadas para moldes ricos en GC, especificamente Advantage-GC cDNA Polymerase Mix (cat. 8419-1; BD Biosciences Clontech: Palo Alto, CA; EE.UU.). La correspondiente secuencia de DNA de pgl (SEQ ID NO:7) que codifica el polipeptido de SEQ ID NO:8 se amplifico por PCR a partir de celulas completas de

P. aeruginosa despues de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, seguido de 68°C durante 1,5 minutos. Despues la amplificacion se completo por una sola incubacion a 68°C durante 3 minutos. El producto de la PCR se aislo por electroforesis en gel de agarosa y cromatografia en columna en un kit de extraccion en gel QIAquick (cat. 28704, Qiagen: Valencia, CA; EE.UU.). El DNA de pgl purificado en gel y amplificado, se eluyo en agua y se clono inmediatamente en el vector de clonacion pCR2.1 usando un kit TOPO TA Cloning® (cat. K4550-40, Invitrogen: Carlsbad, CA; EE.UU.) y se transformo en E. coli quimicamente competente One Shot® TOP10 (cat. C4040-06, Invitrogen: Carlsbad, CA; EE.UU.). En las colonias ampr resultantes se seleccionaron los insertos por digestion con EcoRI y se llevo a cabo electroforesis de los productos. Los insertos con secuencia verificada se liberaron del vector de clonacion por digestion con XhoI y se purificaron usando el kit de extraccion en gel QIAquick. El DNA del vector de expresion pECO-1 (BioCat 73552, GlaxoSmithKline: King of Prussia, PA; EE.UU.) se corto con Sall y se trato con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP) (cat M0290S, New England Biolabs: Beverly, MA; EE.UU.), y despues se purifico usando el kit de extraccion en gel QIAquick. Los insertos digeridos con XhoI y el pECO-1 tratado con Sall, se ligaron usando DNA-ligasa de T4 esencialmente como describia el fabricante (cat. M0202S; New England Biolabs: Beverly, MA; EE.UU.). Dos microlitros (2 μl) de la reaccion de ligazon se transformaron en celulas de E. coli quimicamente competentes One Shot® TOP10 como describia el fabricante (cat. C4040-06; Invitrogen: Carlsbad, CA; EE.UU.). Las colonias se cribaron segun la presencia de insertos de pgl en la orientacion correcta por PCR. Se selecciono el clon pECO-1pglcl2-13 para estudio posterior como se expone a continuacion.

La construccion resultante se basa en la cadena principal del plasmido pACYC184, y comprende los siguientes elementos funcionales geneticos: (1) p15A ori, que permite el mantenimiento del episoma plasmidico en la misma celula hospedante que los plasmidos heterologos con el elemento ori de tipo colE1; (2) marcador seleccionable de cloranfenicolr; (3) un promotor inducible de tetraciclina corriente arriba de un sitio de clonacion multiple; (4) gen de la pgl

de P. aeruginosa de longitud completa.

La construccion final, pECO-1pglcl2-13, se transformo como se ha descrito antes en celulas BL21 (DE3) que expresan una interleuquina humana, para el estudio posterior. La secuencia de DNA de pECO-1pglcl2-13 se presenta como el SEQ ID NO:9 y el mapa de restriccion de pECO-1pglcl2-13 se presenta en la Figura 1.

Los cultivos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 3. El analisis del aducto de 6-PGL se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 4. La actividad de fosfogluconolactonasa se midio como se describe en el Ejemplo 6. Entre las cepas adicionales que expresan la interleuquina humana (IL-18) examinadas en el estudio, se incluye BL21 (DE3) sin pECO-1pglcl2-13 y K-12. Las cepas con el plasmido de pgl se examinaron con y sin adicion de anhidrotetraciclina 20 ng/ml. Se expone un resumen de la presencia o ausencia de formacion del aducto de 6-PGL en celulas que expresan pgl en la Tabla 13 mostrada a continuacion.

Tabla 13: Impacto de la eXpresi6n de pgl en la fosfogluconoilaci6n de una interleuquina humana

Cepa

Actividad maXima de pgl �I�min�g de PCS Formaci6n de aducto de 6-PGL en la interleuquina humana XIL18)

BL21 (DE3)

0,002 Presente

BL21 (DE3) pECO-1pglcl2-13, sin tet

0,56 � 0,13 Ausente

BL21 (DE3) pECO-1pglcl2-13, tet inducido

0,64 +0,11 Ausente

K-12

0,96 �0,14 Ausente

PCS = peso de celula seca

Este ejemplo ha demostrado que la coexpresion de fosfogluconolactonasa de Pseudomonas con la interleuquina humana (IL-18) previene satisfactoriamente la formacion del aducto de 6-PGL en la cepa B de E. coli.

Ejemplo�10

La interleuquina-18 humana (IL-18) es una citoquina inmunomoduladora que se esta desarrollando como un agente anticancerigeno para tratar carcinomas de celulas renales y melanomas malignos. Se presentan descripciones de la IL18 humana y murina en las siguientes patentes de EE.UU.: Patente de EE.UU. n° 6.582.689, Patente de EE.UU. n° 5.914.253, Patente de EE.UU. n° 5.879.942, Patente de EE.UU. n° 5.912.324, Patente de EE.UU. n° 5.914.253, Patente de EE.UU. n° 6.060.283, Patente de EE.UU. n° 6.087.116, y Patente de EE.UU. n° 6.214.584. Se cree que la IL-18 estimula el sistema inmunitario, promueve la muerte de celulas tumorales inducida por Fas y la inmunidad mediada por celula. La secuencia polipeptidica de la IL-18 (SEQ ID NO:10) se puede producir en BL21 (DE3) de E. coli. Se puede expresar a partir de la secuencia polinucleotida para pro-IL-18 (SEQ ID NO:11), que despues es procesada a IL-18 madura por una enzima de procesamiento, Caspasa 5, coexpresada en la misma celula.

Se clono la 6-fosfonoglucolactonasa de bacterias Gram-negativas, Pseudomonas aeruginosa, en una cepa BL21 (DE3). La produccion de IL-18 en esta cepa produce IL-18 sin formacion de aducto detectable que da como resultado un aumento directo del rendimiento del producto deseado. Ademas, la correccion de la deficiencia de pgl tambien ha dado como resultado un aumento �10% de la productividad especifica. Por lo tanto, el efecto combinado de la calidad del producto y las mejoras de la productividad especifica mediante el uso de esta cepa de produccion modificada se ha traducido en un aumento �25% del rendimiento de la concentracion en la etapa de fermentacion. Se espera que la eliminacion de la formacion de aducto tendra un impacto positivo directo en el procedimiento de purificacion y aumentara mas el rendimiento global del procedimiento.

Ejemplo�11

La gluconoilacion de la IL-18 se siguio por analisis por HPLC de la IL-18 producida en celulas BL21 (DE3) con y sin coexpresion de pgl. La formacion de aducto se detecto como un hombro del pico que eluia aproximadamente dos minutos despues de la IL-18 purificada. Cuando se expreso la IL-18 en y se purifico de la cepa BL21DE3 de E. coli (pgl negativo), el area del pico principal (es decir, el area del pico de la IL-18 que no tenia formacion de aducto gluconoilo detectable) para la IL-18 era aproximadamente 56%. Mientras que la expresion y purificacion de IL-18 en celulas BL21 (DE3) (pgl positivo) produjo un area del pico principal de aproximadamente 88%, y no mostro formacion de aducto basandose en el ensayo por HPLC de alta resolucion.

Ejemplo�12

Se crearon dos vectores que comprendian polinucleotidos que codifican pro-Il-18 (SEQ ID NO:11), y Caspasa 5 (SEQ ID NO:12). Ambos eran vectores pET en los que se indujo la produccion de polipeptido usando un promotor de T7. Un vector tambien comprendia un polinucleotido que codifica pgl de P. aeruginosa (SEQ ID NO:7) que se indujo con el mismo promotor que para pro-IL-18. La secuencia entera del vector pET que comprende pro-IL-18 y Caspasa 5 se presenta en el SEQ ID NO:13. Se presenta un mapa de restriccion de este vector en la Figura 2. La secuencia entera

5 del vector pET que comprende pro-IL-18, Caspasa 5 y pgl se presenta en el SEQ ID NO:14. Se presenta un mapa de restriccion de este vector en 3. Cuando se expreso la IL-18 en celulas BL21 (DE3) de E. coli usando estos vectores, la cantidad de IL-18 recuperable mejoro mucho cuando el polipeptido se coexpreso con pgl, comparado con la expresion de IL-18 sin pgl. La cantidad de IL-18 recuperable obtenida de cada vector de expresion en celulas BL21 (DE3) de E. coli se presenta en la Tabla 14.

10 Tabla 14: Concentraci6n maXima de IL-18 producida en cepa "B" de E. coli con y sin coeXpresi6n de pgl LISTAD� DE SEC�ENCIAS

Cepa�

gen pgl Concentraci6n maXima Xg�l)

RBB057

No 4,32 (+/-0,4)

RBB059

Si 6,78 (+/-0,1)

*Ambas cepas son cepa B de E. coli

�110� GARDNER, Alan R. SWEITZER, Thomas D. TAYLOR, Alexander H.

5 PATEL, Pramatesh

�120� M�TODOS PARA PREVENIR LA GLUCONOILACION DE PROTE�NAS

�130� PU60116

�140� Pendiente de asignar �141� 04-03-2004

10 �150� 60/451,686 �151� 2003-03-04

�160� 14

�170� FastSEQ para version de Windows 4.0

�210� 1

15 �211� 24 �212� DNA �213� ESCHERIACHIA COLI

�400� 1 agctggccat tgctcaggtc gaag

20 �210� 2 �211� 25 �212� DNA �213� ESCHERICHIA COLI

�400� 2 25 gtactgtccg gaatacacga cgatg

�210� 3 �211� 413 �212� DNA �213� ESCHERICHIA COLI

30 �400� 3

�210� 4 �211� 8 �212� PRT

35 �213� HOMO SAPIENS

�400� 4

�210� 5 �211� 29 �212� DNA �213� Pseudomonas aeruginosa

�400� 5 ggcctcgagc tcggtggccc tggtggccc

5 �210� 6 �211� 31 �212� DNA �213� Pseudomonas aeruginosa

�400� 6 10 gccctcgagt ccgccactca ggggtaccaa t

�210� 7 �211� 732 �212� DNA �213� Pseudomonas aeruginosa

15 �400� 7

�210� 8 �211� 243 �212� PRT

20 �213� Pseudomonas aeruginosa

�400� 8 �210� 9 �211� 3416 �212� DNA �213� Secuencia artificial �223� Comprende expresion de PECO-1 y Pseudomonas aeruginosa

�400� 9

�400� 10

�210� 11 �211� 582 �212� DNA

10 �213� HOMO SAPIENS

�400� 11

�212� DNA

�213� HOMO SAPIENS �400� 12

�400� 13

�400� 14

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para prevenir la gluconoilacion de polipeptidos expresados en una cepa B de E.coli, que comprende introducir DNA en la E.coli, donde el DNA codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa que tiene una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de al menos 95% respecto al SEQ ID NO:8.

   5 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que dichos polipeptidos comprenden una interleuquina humana.

2. 3.

   Un metodo para producir una interleuquina humana que comprende expresar conjuntamente dicha interleuquina humana en una cepa B de E.coli con un DNA que codifica una enzima 6-fosfogluconolactonasa que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:8.

3. 4.

   Un metodo segun la reivindicacion 2 o reivindicacion 3, en el que la interleuquina humana es IL-18.

   10 5. Un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el DNA que codifica la enzima 6fosfogluconolactonasa tiene una identidad de secuencia de al menos 95% con respecto a SEQ ID NO:7.

4. 6. Un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el DNA que codifica la enzima 6fosfogluconolactonasa comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO:7.
5. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el DNA se transforma en el DNA genomico 15 de la E.coli.

6. 8.

   El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa B de E.coli es BL21.

7. 9.

   El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipeptido es un polipeptido expresado heterologamente.

   Figura 1

   Figura 2 Figura 3

   Figura 4 Figura 5

   Figura 6 Figura 7

   Figura 8