ES2369695T3 - Métodos para incrementar la proliferación de células b. - Google Patents
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Abstract
Un método ex vivo para incrementar la proliferación de células B no tumorigénicas comprendiendo administrar una cantidad efectiva de PCDGF a dichas células donde la proliferación de dichas células es aumentada por encima del nivel basal de proliferación celular.
Description
Métodos para incrementar la proliferación de
células B.
Diversas publicaciones están mencionadas aquí.
Citas completas para estas publicaciones son proporcionadas
abajo.
abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
La proliferación y diferenciación de células en
organismos multicelulares es sujeto a procesos altamente regulados.
Una faceta típica de las células de cáncer es la ausencia de control
sobre el proceso; la proliferación y diferenciación se vuelven
desreguladas resultando en un crecimiento incontrolado. Importantes
esfuerzos de investigación han sido dirigidos hacia un mejor
entendimiento de esta diferencia entre células normales y de tumor.
Un área de foco de investigación es los factores de crecimiento y
más concretamente, la estimulación del crecimiento autocrino.
Los factores de crecimiento son polipéptidos que
llevan mensajes a las células acerca del crecimiento, la
diferenciación, la migración y la expresión de genes. Normalmente,
los factores de crecimiento son producidos en una célula y actúan en
otra célula para estimular la proliferación. Sin embargo, ciertas
células malignas, en cultivo, demuestran una mayor o absoluta
dependencia de un mecanismo de crecimiento autocrino. Las células
malignas que observan este comportamiento autocrino sortean la norma
de producción del factor de crecimiento por otras células y están
por consiguiente desreguladas en su crecimiento.
El desarrollo de las células B está compuesto de
dos fases: independiente de antígeno y dependiente de antígeno. La
fase independiente de antígeno del desarrollo de la célula B ocurre
en la médula ósea donde los progenitores de células B se distinguen
en células B inmaduras presentando IgM de superficie de célula. La
fase dependiente de antígeno de la diferenciación de células B
ocurre en la periferia secundaria de los órganos linfoides donde las
células B específicas de antígeno proliferan y se distinguen dentro
de células de plasma que segregan anticuerpos específicos tras la
activación.
Durante la fase independiente de antígeno del
desarrollo de las células B, el reajuste secuencial de segmentos
génicos de inmunoglobina genera un diverso repertorio de antígenos.
Las células pro-B, las primeras células de línea B
derivadas de progenitores de células B, están caracterizada por la
aparición de proteínas de la superficie celular del linaje de
primeras células B y por el reajuste de genes inmunoglobulina del
locus de cadena pesada. La etapa de células es seguida por la etapa
de célula pre-B la cuál está caracterizada por el
reajuste de los genes de cadena ligera de inmoglubina. El reajuste
exitoso de tanto las cadenas ligera y pesada lleva a la presencia de
molécula IgM intactas sobre la superficie de célula en la etapa
inmadura de la célula B.
Los células B inmaduras se someten a selección
para autotolerancia en una serie de puntos de seguridad provocados
por antígenos y la selección para la capacidad de sobrevivir en los
tejidos linfoides periféricos. Los células B que sobreviven a la
selección para autotolerancia y capacidad para sobrevivir en los
tejidos linfoides periféricos se diferencian además para hacer que
las células B maduras expresen IgD superficial además de IgM
superficial [Burrows, 1997]. Las células B maduras recirculan a
través de tejidos linfoides periféricos donde pueden encontrar
antígenos. Los células B activadas por antígenos pueden distinguirse
en células de plasma y segregar una enorme cantidad de anticuerpos
[Duchosal, 1997]. IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE. IgM es la primera
molécula inmunoglobulina que se sintetiza y se expresa.
La diferenciación y desarrollo de las células B
dependientes de antígeno comienzan con el enlace de antígenos en
células B. La activación de células B requiere dos señales; enlace
de antígenos a la inmunoglobulina de la superficie celular B e
interacción de las células B con células T auxiliares específicas de
antígeno. La inmoglobulina de superficie sirviendo como receptor de
antígeno de la célula B (RCB, receptor de células B) tiene un papel
importante en la activación de la célula B. Después de ligar el
antígeno, el RCB y el complejo de antígeno es interiorizado y la
proteína de antígeno se deteriora. El antígeno digerido vuelve a las
superficie celular B como péptidos ligados a moléculas de clase II
MHC [Parker, 1993].
Cuando las células B se desarrollan desde
células pro-B a células de plasma, expresan
proteínas superficiales de la célula distintas a la inmoglubina que
son marcadores útiles para las células de linaje B en diferentes
etapas del desarrollo. Una de las primeras proteínas identificables
expresadas sobre la superficie de las células de linaje B es CD45R
(también conocida como B220) [Osmond, 1998; Hardy, 2001]. CD45R, una
proteína tirosina fosfatasa que funciona en señalación de receptor
de célula B, es expresada por medio del desarrollo de la célula B a
partir de células pro-B hasta células de plasma
[Osmond, 1998; Hardy, 2001]. CD43 (el leucosialina de mucina) es
también expresada en la etapa de la célula pro B pero su expresión
se pierde a medida que las células pasan a células inmaduras B
[Hardy, 2001]. CD43 es una molécula multifuncional con funcionalidad
contradictoria inmediata [Ostberg, 1998]. Por ejemplo, CD43 puede
actuar como una molécula de adhesión que puede guiar interacciones
célula-célula de precursores de célula B con células
del estroma [Ostberg, 1998]. Sin embargo, CD43 tiene también
funciones de antiadhesión [Ostberg, 1998]. CD43 tiene un importante
papel en señalización de células e interacción citosqueletal
[Ostberg, 1998]. CD19 es otro marcador celular de superficie
expresado a partir de células pro-B a través de la
etapa de la célula de plasma [Hardy, 2001]. CD19 está involucrado en
la señalización del receptor de la célula B y reduce el umbral para
la estimulación del receptor del antígeno de las células B [LeBien,
1998]. Otras moléculas de superficie celular expresadas durante
distintas etapas del desarrollo de la célula B incluyen el antígeno
estable al calor HSA, CD10, CD20, CD22, CD38, y CD40 [Duchosal,
1997; Hardy, 2001].
El desarrollo de la célula B y la diferenciación
de la fase independiente del antígeno están fuertemente regulados
por el linaje y los factores de crecimiento específicos de la etapa
y las moléculas de adhesión celular. La interleucina 7
(IL-7), segregada por células del estroma, es un
factor esencial de crecimiento para el desarrollo inicial de la
célula B. IL-7 puede estimular la proliferación de
células pro y pre B [Duchosal, 1997]. Neutralizar el anticuerpo
anti-IL-7 puede inhibir la
proliferación inducida por IL-7 de células pro y pre
B [Duchosal, 1997]. La profilerización de la célula B dependiente de
IL-7 es potenciada por la insulina como factor de
crecimiento-1 y factor de célula madre, dos factores
de crecimiento del estroma [Duchosal, 1997]. Interferones
(IFNs)-\alpha/\beta, segregados por macrófagos
en médula ósea, pueden inhibir el crecimiento de células B inducidas
por IL-7 por apoptosis [Burrows, 1997]. El factor 1
derivado de células del estroma o el factor estimulante de
crecimiento de células pre B (SDF-1/PBSF),
producidas constitutivamente por células del estroma de médula ósea,
estimula la proliferación de células pro y pre B [Nagasawa, 1996].
Experimentos en vivo muestran que ratones carentes de
PBSF/SDF-1 murieron perinatalmente [Nagasawa, 1996].
IL-3 estimula la proliferación de células pre B por
medio de la interacción con el receptor IL-3 en
células B. [Duchosal, 1997]. IL-3 es una citoquina
derivada de célula T y junto con IL-6, puede
estimular células madre multipotenciales y progenitores de células B
[Kincade, 1989]. Neuroleucina, un homologo de isómero de forsato 6
de glucosa, tiene la capacidad de estimular el desarrollo de células
B [Kincade, 1989].
Existen diversos factores de crecimiento que
regulan negativamente el desarrollo de células B.
IL-1 inhibe la generación de células pre B a partir
de las primeras células pro B [Ryan, 1994]. Sin embargo,
IL-1 incrementa la generación de células B
secretoras de Ig en cultivo de médula espinal humana [Ryan, 1994].
TNF-\alpha y IL-4 inhiben colonias
de progenitor de linfoide humano [Ryan, 1994]. Las moléculas de
adhesión de células también son importantes para el desarrollo
temprano de células B. El factor de célula madre (FCM), presente en
la superficie celular de células del estroma, interactúa con el
receptor tirosina Kinasa de la superficie de la célula, kit, sobre
el precursor de la célula B y estimula el desarrollo temprano de la
célula B [Ashman, 1999]. FCM existe en ambas formas soluble o unido
a membrana o como resultado de empalme y división proteolítica
diferencial [Ashman, 1999]. La forma de unión de membrana de FCM
contribuye a su regulación del desarrollo temprano de células B
[Ashman, 1999]. Flk2/flt3 es un receptor de tirosina quinasa en la
misma familia que el c-kit del receptor del factor
de célula madre. El ligando flk2/flt3, que tiene homología con
FCM-1, es un potente coestimulador de células B
tempranas, además del IL-7 y FCM [Burrows, 1997]. La
ruptura del gen flk2/flt3 conduce a una deficiencia selectiva de
progenitores primitivos de células B [Burrows, 1997].
VLA-4 es una molécula de la
superficie celular de precursores de célula B que interactúa con el
ligando fibronectina de matriz extracelular sobre células del
estroma y macrófagos, y VCAM-1 sobre células
endoteliales y macrófagos [Duchosal, 1997]. VLA-4 se
expresa más en células pro B que en células pre B. Por lo tanto,
VLA-4 modula más efectivamente la proliferación de
células B que células B [Duchosal, 1997].
La interacción entre CD44 en precursores de
célula B y hialonurato en células del estroma también juega un
importante papel en el desarrollo de la célula B. Los anticuerpos a
CD44 inhiben el desarrollo in vivo de la célula B de ratón
[Duchosal, 1997]. Las hormonas pueden también regular la
linfopoyesis B, El estrógeno regula la generación de las células B
vía un efecto sobre células del estroma en el microambiente
lifopoyético [Burrows, 1997]. Ratones enanos deficientes en la
expresión de prolactina y hormona estimuladora del tiroides son
inmunodeficientes, debido a una deficiencia de célula T y un defecto
en el desarrollo de la célula B, lo que es corregible por la falta
de hormona de tiroides. [Burrows, 1997].
Las células cooperadoras T transmiten señales a
las células B por medio de un contacto directo de la célula B y la
célula cooperadora T. Este contacto directo es logrado por
interacción independiente de antígeno de la molécula accesoria,
ligandos de CD40 en la célula cooperadora T y CD40s en las células T
cooperadoras de la célula B [Parker, 1993], y por interacción
específica de antígeno del complejo péptido MHC de clase II sobre la
superficie celular B con receptor de célula T específico de antígeno
en células T cooperadoras. La activación de células B mediadas por
antígeno sucede en un modo independiente T de célula o un modo
dependiente de célula T. La activación de de células B independiente
de célula T puede suceder en respuesta a antígenos sin proteínas,
tales como un polisacárido. La capacidad de las células B para
responder inmediatamente a polisacáridos proporciona una rápida
respuesta a muchos importantes patógenos bacterianos [Vos, 2000]. La
activación de células B dependientes de células T tiene lugar en
respuesta a antígenos de proteínas o a antígenos sin proteínas
conjugados con moléculas portadoras de proteínas.
La activación de células B dependiente de
células T es el núcleo de inmunidad humoral. Las células T
cooperadoras activadas producen citoquinas solubles que pueden
estimular la proliferación de células B y la diferenciación
[marcador, 1993]. La primera citoquina soluble identificada fue
IL-4, también conocida como factor 1 estimulador de
célula B (BFE-1) o factor de crecimiento de célula B
(FCCB). IL-4 fue identificada originalmente como una
molécula capaz de estimular la síntesis de ADN de células B de ratón
estimuladas por anti-IgM [Howard, 1982]. El
IL-4 humano es una glucoproteina amino ácida 153 que
tiene un núcleo de proteína con una masa molecular de 15 KD.
IL-4 humano glucosilado puede tener una masa
molecular de 20KD [Yokota, 1986; Ohara, 1987]. IL-4
tiene múltiples efectos sobre las células B. Por ejemplo, el
IL-4 puede aumentar la proliferación de células B
estimulada con anticuerpos anti-IgM [Howard, 1982],
inducir la expresión de MHC clase II y CD23 [Conrad, 1987; Jansen,
1990], y regular la expresión de isotipos de inmoglobulina. Por
ejemplo, el IL-4 es capaz de inducir a las células B
a que produzcan IgE [Pene, 1988] e inducir el cambio de expresión de
células de producir IgM a IgG1 y/o IgE [Callard, 1991].
IL-4 también juega un papel en la regulación de las
células T, mastocitos, monocitos, hematopoyesis, fibroblastos
[Jansen, 1990].
La Interleucina (IL-2) es una
glucoproteina aminoacida 133 con un peso de molécula de 13 a 17.5 KD
de acuerdo a glucosilación viable [Robb, 1981].
IL-2, producida por células T, estimula la
proliferación de células B activadas [Gearing, 1985], promueve la
inducción de secreción de inmoglobulina y la síntesis de cadena J
por células B [Gearing, 1985; Blackman, 1986], y actúa para aumentar
los efectos inmunes mediados por células B activadas [Mingari,
1984].
La interleucina 6 (IL-6) es una
glucoproteina de 186 aminoácidos con un peso molecular de 19 a 30 KD
[May, 1989] que es producido a partir de muchos tipos de células
incluyendo monocitos, macrófagos, células del estroma, y células de
plasma [May, 1988; Frassanito, 2001]. IL-6 está bien
establecida como un factor de diferenciación de última etapa para la
transición de célula B a célula de plasma [Muraguchi, 1988].
IL-6 estimula células B activadas para producir IgM,
IgG, y IgA [Muraguchi, 1988]. IL-6 también aumenta
la respuesta de anticuerpo específico de antígeno para antígeno
in vitro y in vivo [Takatsuki, 1988]. Mientras la fase
dependiente de antígeno del desarrollo de célula T depende de la
producción de un factor autocrino, IL-2, un
correspondiente factor regulatorio autocrino para células B no se ha
identificado todavía.
PCDGF (factor de crecimiento derivado de célula
PC) es un factor de crecimiento autocrino altamente tumorigenico y
agente causante de una amplia variedad de tumores. Por ejemplo, los
niveles de PCDGF son elevados en células hematopoyéticas
tumorigénicas tales como leucemias de célula B, pero no pueden ser
detectados en células normales B. Como se describe en la Patente
U.S. 6,309,826, la sobreexpresión de PCDGF conduce al crecimiento
incontrolado de células de tumor y tumorigénesis incrementada. El
grado de sobreexpresión PCDGF se correlaciona directamente con el
grado de tumorigenicidad celular. El PCDGF sobreexpresante de
células no necesita señales externas para mantener el crecimiento
incontrolado de células. La pérdida de crecimiento regulado de
células, tal como una pérdida de respuesta a la insulina y/o
estrógeno, conduce a malignidad incrementada y crecimiento excesivo
no regulado de células. Sin embargo, no ha sido previamente mostrado
que PCDGF esté asociado con estimular el crecimiento de células B no
tumorigénicas (ejemplo, normal).
Mientras que PCDGF aumenta moderadamente el
crecimiento de células 3T3, PCDGF inhibe el crecimiento de otras
varias líneas celulares. Por ejemplo, PCDGF inhibe el crecimiento de
células epiteliales normales de pulmón de visión (CCL 64). Xia, X y
Serrero, G, Identification of cell surface binding sites for PC cell
derived growth factor, (epithelin/granulin precursor) on epithelial
cells and fibroblasts, Biochem. Biophys. Res. Commun. 245,
539-543,1998. PCDGF también inhibe el crecimiento de
células epiteliales timicas de rata y ratón normales (células BT1B y
TEASA3Al ) (Serrero, resultados sin publicar).
El PCDGF no tiene efecto en la proliferación de
varias líneas de células incluyendo células Hela y CHO (Serrero,
datos sin publicar), y células Cos-7 (Plowman, et
al, 1993; Serrero unpublished results; Plowman, G. D., Green, J. M.,
Neubauer, M. G., Buckley, S. D., McDonald, V. L., Todaro, G. J., and
Shoyab, M. (1992). The epithelin precursor encodes two proteins with
opposing activities).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona métodos ex
vivo para incrementar la proliferación de células B ex
vivo no tumorigénicas administrando PCDGF a células B. Hemos
descubierto que el PCDGF es un factor de crecimiento autocrino para
células B normales (por ejemplo, no-tumorigénicas).
De ahí, PCDGF puede ser usado para aumentar la proliferación de
células normales por ejemplo, para mejorar la eficiencia de cultivo
de células hematopoyéticas primarias. La eficiencia mejorada y el
crecimiento del cultivo de células B primarias es de gran valor en,
por ejemplo, estableciendo y mantenimiento de líneas de células (por
ejemplo.; líneas de células madre) para uso en investigación
biomédica.
La invención proporciona, en una realización, un
método ex vivo de incrementar la proliferación de células B
ex vivo no tumorigénicas administrando una cantidad efectiva
de PCDGF a células B en donde la proliferación de las células B es
aumentada en, preferentemente al menos dos veces. Otra realización
de la invención proporciona un método ex vivo de aumentar la
proliferizacion de células B ex vivo no tumorigénicas
administrando una cantidad efectiva de PCDGF a células B en donde la
proliferación de las células B es aumentada en al menos 3 veces.
Otras realizaciones de la invención proporcionan métodos para
estimular síntesis de ADN en células B no tumorigénicas
comprendiendo administrar PCDCF a células B en donde la síntesis de
ADN es aumentada al menos dos veces.
Realizaciones adicionales y ventajas de la
presente invención serán establecidas en parte en la descripción que
sigue, y en parte serán obvias desde la descripción, o pueden ser
aprendidas por la práctica de la invención. Los objetos y ventajas
de la invención se lograrán por medios de los instrumentos y
combinaciones señaladas particularmente en las reivindicaciones
adjuntas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La Fig. 1 muestra que niveles de mRNA de PCDGF
en células B de ratón normal son enormemente incrementados tras la
activación de las células desde el estado de reposo al estado
activado por la adición de LPS. El mRNA de PCDGF aumentó tan pronto
como 6 horas después de la adición de LPS (lipopolisacárido) como se
muestra por análisis Northern blot.
Las Figs. 2A y 2B muestra que la expresión de
proteína PCDGF es también radicalmente incrementada 48 horas después
de la adición de LPS como es mostrado por teñido inmunoflouroescente
que detecta la presencia de PCDGF. La Fig. 2A muestra teñido de
PCDGF en ausencia de LPS mientras que la Fig. 2B muestra teñido de
PCDGF 48 horas después de la adición de 10 ug/ml de LPS.
La Fig. 3 muestra que la proliferación de
células, como es indicada por la incorporación de timidina, aumenta
al menos 100 veces después de 48 horas de incubación con 10 ug/ml de
LPS.
La Fig. 4 muestra que la expresión aumentada de
PCDGF fue debida a la adición de LPS. El ensayo de reacción en
cadena de polimerasa transcirptasa-inversa
(RT-PCR) muestra que se detectó mRNA de PCDGF en
muestras estimuladas por LPS y no detectadas en el control o
muestras estimuladas por Con A.
La Fig. 5 muestra que la expresión incrementada
de proteína PCDGF fue debida a la adición de LPS ya que las
proteínas PCDGF fue únicamente detectada en la muestra estimulada
por LPS.
La Fig. 6 muestra que la proliferación de
linfocitos de bazo de ratón se activa tanto por LPS como por Con
A.
Las Figs. 7A-D muestran que las
células positivas de PCDGF proliferan por la estimulación de LPS.
Linfocitos de ratón estimulados con LPS fueron inmunoteñidos usando
anti PCDGF y anti-BrdU (anticuerpo análogo de
timidina). Las células que se tiñeron positivas para PCDGF también
se tiñeron positivas para anti-BrdU y
anti-B220 mostrando que las células PCDGF positivas
estimuladas con LPS estaban proliferando (es decir, incorporando
timidina). Se incubaron linfocitos de bazo de ratón sin LPS (7A y B)
o con 10 ug/ml LPS (7C y D) y se tiñeron con anticuerpo
B220-BrdU (7A y C) o anticuerpo
anti-PCDGF (7B y D).
Figs. 8A-F muestran que las
células positivas de PCDGF son linfocitos B. Los linfocitos de ratón
se tiñeron con un anticuerpo
anti-B220-FITC que está dirigido al
antígeno B220, un marcador común de células B. Las células que se
tiñeron positivas para PCDGF también se tiñeron positivas para B220.
Los linfocitos de bazo de ratón fueron incubados sin LPS
(8A-C) o con 10 ug/ml LPS (8D-F) y
manchados con anticuerpos B220-FITC (8A y D), DAPI
(8B y E) o anticuerpos anti-PCDGF (8C y F).
La Fig. 9 muestra que PCDGF estimula la
proliferación de células de bazo de ratón. 200 ng/ml de PCDGF, 10
ug/ml de anti-IgM, y la combinación de PCDGF y de
anti-IgM estimuló la proliferación de células B en
estado de reposo de ratón en 2.7, 3.7, y 4.6 veces respectivamente
después de un tratamiento de 72 horas.
PCDGF es un potente factor de crecimiento de
células cancerígenas y el agente tumorigenico para una amplia
variedad de tumores en pecho, ovario, pulmón, riñón, hígado,
hemopoyético y otros tejidos. Dado el papel destacado de PCDGF en
tumorigénesis, la investigación de PCDGF ha sido siempre dirigida
hasta ahora a inhibir y/o inactivar el PCDGF a fin de inhibir o
interferir con el crecimiento de la célula del tumor. Los
antagonistas de PCDGF, tales como los anticuerpos
anti-PCDGF, interfieren con la actividad biológica
del PCDGF (ejemplo, la actividad tumorigénica) ligando directamente
el PCDGF y evitando que el PCDGF transmita señales de crecimiento de
células a una célula objetivo (ejemplo, la célula de cáncer de
pecho). El PCDGF no ha sido usado previamente para aumentar la
proliferación celular en células B no tumorigénicas.
El inventor ha hallado sorprendentemente que el
PCDGF puede ser usado para aumentar la proliferación de células B no
tumorigénicas. El término "células B
no-tumorigénicas" se refiere a células B que no
exhiben el crecimiento, regulación, y/o actividad biológica de
crecimiento de célula tumorigénica (ejemplo, crecimiento
desregulado, capacidad de provocar tumores después de la inyección
dentro de un animal). El término "células B" se refiere a
células B de cualquier etapa de desarrollo (ejemplo, las células
madre B, las células progenitoras B, las células B diferenciadas,
las células de plasma) y de cualquier fuente incluyendo, pero no
limitado a sangre periférica, ganglios linfáticos, médula ósea,
sangre del cordón umbilical, o células de bazo.
A pesar de que el PCDGF no es detectado en
células B en estado de reposo normal (ejemplo, células estables no
sometidas a divisiones celulares o proliferación), el mRNA y niveles
de proteína de PCDGF son elevadas de forma importante cuando las
células B son cambiadas de un estado de reposo a uno activo. El LPS
(lipopolisacárido) es un compuesto complejo hallado en la pared de
la célula de bacterias gram-negativas. El LPS es un
conocido mitógeno para células B. Cuando los linfocitos de bazo de
ratón son activados con 10 ug/ml de LPS, la expresión de mRNA PCDGF
aumentó tan pronto como seis horas tras el tratamiento como se
muestra por análisis Northern-blot (Fig. 1). El mRNA
PCDGF es virtualmente indetectable en células normales antes de la
adición de LPS (ver columnas 1-5 de la Fig. 1). De
seis a cuarenta y ocho horas después del tratamiento con LPS, la
expresión de mRNA PCDGF creció espectacularmente (ver columnas de
6-9 de la Fig. 1).
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La activación de células B normales con LPS
también resulta en expresión de proteína PCDGF incrementada. El
teñido inmunofluorescente de linfocitos esplénicos de ratón con
anticuerpo PCDGF antihumano de conejo purificado 48 horas después de
la adición de 10 ug/ml LPS (Fig. 2B) o el control (Fig. 2A) muestra
el incremento espectacular en niveles de proteína PCDGF siguiendo
tratamiento con LPS. Niveles incrementados de mRNA PCDGF y proteína
se correlacionan con el incremento de proliferación de células (Fig.
3). La incorporación de timidina por linfocitos esplénicos de ratón
fue estimulada al menos 100 veces después de 48 horas de incubación
con 10 ug/ml de LPS.
Linfocitos esplénicos de ratón son una mezcla de
células B y T. Con el fin de determinar si la estimulación de LPS de
linfocitos esplénicos de ratón es específica de células B, Con A, un
activador de linfocito T, fue usado para activar linfocitos
esplénicos de ratón. Como se muestra en la Fig. 4, mRNA PCDGF fue
únicamente detectado en muestras estimuladas de LPS pero no en el
control o muestras estimuladas de Con A como se indica en un
experimento de reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa
inversa (RCPTI). El mRNA PCDGF transcrito se muestra en el LPS+,
columnas Con A- pero no en el LPS-, columnas Con A + entre 6 y 48
horas después de la adición de o bien LPS o Con A. Asimismo, los
niveles de proteína PCDGF son estimulados por LPS pero no por Con A
como se muestra por inmunoprecipitación seguida por análisis
Western-blot con anticuerpos
anti-PCDGF tras 24 horas de estimulación de
linfocitos esplénicos de ratón con o bien 10 ug/ml LPS (Fig. 5,
calle 2) o 2.5 ug/ml Con A (Fig. 5, calle 3). La proliferación de
linfocitos esplénicos de ratón es estimulada por o bien 10 ug/ml LPS
o 2.5 ug/ml Con A (Fig. 6). De este modo, niveles incrementados de
mRNA y proteína PCDGF en linfocitos activados esplénicos de ratón
resultan de la activación de células B.
Con el fin de determinar si los linfocitos
esplénicos de ratón positivos por PCDGF están proliferando células B
por la estimulación de LPS, fue llevado a cabo teñido
inmunofluorescente usando anticuerpos dirigidos a PCDGF, análogo de
timidina, y marcadores de células B. BrdU es un análogo de timidina
incorporado dentro del ADN durante la síntesis de ADN (un indicador
de proliferación de la célula). B220 es un antígeno, usado
comúnmente como marcador de célula B, que es expresado en linfocitos
B en todas las etapas desde pro-B a células B
maduras. Linfocitos esplénicos de ratón fueron incubados sin (Figs.
7A y 7B) o con (Figs. 7C y 7D) 10 ug/ml LPS y teñidos con
anticuerpos anti-BrdU (Figs. 7A y 7C) o anticuerpos
anti-PCDGF (Figs. 7B y 7D). Como se muestra en las
Figs. 7C y 7D, las células PCDGF y LPS positivas eran también BrdU
positivas mientras las células negativas LPS eran o bien PCDGF o
BrdU positivas. Así, las células positivas PCDGF eran células B
proliferantes mientras que células negativas PCDGF (ejemplo, células
desestimuladas) no estaban proliferando. Los linfocitos esplénicos
de ratón proliferantes eran células B como se muestra en las Figs.
8A-8F. Los linfocitos esplénicos de ratón estaban
desestimulados (8A-C) o estimulados
(8D-F) con 10 ug/ml de LPS. Las células fueron
teñidas con anticuerpo anti-8220 (8A y 8D), DAPI
(4,6-diamidino-2-phe-nilindola)
mancha nuclear (8B y 8E), o anticuerpos anti-PCDGF
(8C o 8F). Las células estimuladas eran positivas para el teñido de
células B (anti-B220) y el teñido de PCDGF
(anti-PCDGP) como se muestra en las Figuras 8D y 8F.
DAPI tiñe el núcleo de las células y por tanto muestra la población
de células entera.
PCDGF puede inducir a proliferar las células B
en estado de reposo. Como se muestra en la Fig. 9, linfocitos
esplénicos de ratón en estado de reposo fueron tratados con un
control (calle 1), 200 ng/ml PCDGF (calle 2), 10 ug/ml IgM (calle
3), o tanto 200 ng/ml de PCDGF y 10 ug/ml de IgM (calle 4). La
proliferación de células B fue estimulada después de 72 horas de
tratamiento por 0, 2.7, 3.7, y 4.6 veces respectivamente en columnas
1-4. PCDGF solo (Fig. 9, calle 3) o en combinación
con IgM (Fig. 9, calle 4) puede inducir a células B en estado de
reposo a proliferar.
Una realización del invento proporciona métodos
ex vivo de incrementar la proliferación de células B ex
vivo no tumorigénicas comprendiendo administrar una cantidad
efectiva de PCDGF a dichas células donde la proliferación de dichas
células es incrementada por al menos 2 veces. PCDGF puede también
ser coadministrada con otro factor de proliferación de células B
incluyendo, pero no limitado a, IgM. La coadministración de PCDGF y
otro mitógeno de célula B (ejemplo, IgM, LPS) pueden además
incrementar la proliferación de células B como se muestra en la Fig.
9. PCDGF y un estimulador de células co-B puede ser
administrado simultáneamente o secuencialmente a células B o
incorporado directamente dentro de los medios de línea celular
B.
Otra realización proporciona métodos ex
vivo de incrementar la síntesis de ADN en células B ex
vivo no tumorigénicas comprendiendo administrar una cantidad
efectiva de PCDGF a dichas células en donde la síntesis de DNA en
dichas células es incrementada por, preferentemente al menos 2
veces. Una realización adicional de la invención proporciona métodos
ex vivo de incrementar síntesis de ADN en células B ex
vivo no tumorigénicas comprendiendo administrar una cantidad
efectiva de PCDGF y otro factor estimulador de síntesis de ADN de
células B (ejemplo, IgM) a dichas células en donde la síntesis de
ADN en dichas células es incrementada por, por ejemplo, al menos 2 o
3 veces.
PCDGF puede estar proporcionado a las células
añadiendo PCDGF en un portador apropiado (ejemplo, buffer) al medio
de cultivo de célula en concentraciones típicamente yendo desde el
0.01 ng a alrededor de 100 mg/ml y preferentemente desde alrededor
de 10 ng a alrededor de 50 mg/ml. Las células B pueden también ser
transfectadas con ADN o RNA codificando PCDGF o fragmentos de PCDGF
activos los cuales retienen la capacidad de incrementar la
proliferación de células B no tumorigénicas o vectores conteniendo
tales como secuencias ADN o RNA. Células B transferidas puede ser
inducidas a crear PCDGF o fragmentos PCDGF activos usando la técnica
adecuada (ejemplo, el promotor inducible, y copias plásmidas
múltiples). En otra realización de la invención, las células B
pueden estar co-local izadas con células produciendo
PCDGF (ejemplo, células tumorigénicas incluyendo, pero no limitado a
células múltiples de mieloma, células transfectadas con PCDGF
codificando ácido nucleico). PCDGF segregado de células productoras
de PCDGF puede provocar proliferación de células B normales en
proximidad de las células productores de PCDGF.
También se han revelado métodos ex vivo
de células B proliferantes identificables en una población de
células homeopáticas comprendiendo, medir el nivel de PCDGF en
dichas células en donde las células PCDGF son células B
proliferantes. Como se muestra en la Fig. 8, las células positivas
PCDGF en una población de linfocitos esplénicos de ratón (incluyendo
ambas células B y células T) también tiñe positivo para células B
proliferantes. De este modo, el teñido positivo para PCDGF es
indicativo de la presencia de células B proliferantes en una
población de células homeopáticas. Las células B proliferantes
pueden ser aisladas de una población de células mezclada y usada
para establecer líneas celulares, formar hibridomas con células de
mieloma, o establecer el cariotipo.
Las células B, y otras células hematopoyéticas,
son generalmente conocidas por ser difíciles de mantener en cultivo
celular. PCDGF puede ser usado para establecer cultivo in
vitro de células B mamíferas de cualquier origen (ejemplo,
células madre, médula ósea, sangre del cordón umbilical, células
madre embrionarias). Otra realización de la invención proporciona
métodos ex vivo de incrementar la proliferación de células
ex vivo no tumorigénicas que responden a PCDGF (ejemplo,
células B mamíferas, células madre B mamíferas, células de médula
ósea mamífera y células que responden a PCDGF de sistemas
hematopoyéticos). Por ejemplo, PCDGF puede ser usado para estimular
la formación de células hibridomas las cuales están formadas de
células de bazo y células de mieloma múltiples fusionadas.
En realizaciones adicionales de la invención,
PCDGF puede ser usado para establecer y mantener líneas celulares B
inmortalizadas, expandir poblaciones de células B para
establecimiento del cariotipo, y para estimular la producción de
antígeno de células en estado de reposo. Las células B de cualquier
etapa del desarrollo de células B o cualquier origen pueden ser
activadas usando PCDGF y/o un estimulador de células
co-B, identificado usando anticuerpos
anti-PCDGF, y establecido en unas líneas celulares
in vitro. Líneas celulares B pueden ser inmortalizadas y/o
mantenidas en un estado activo y proliferante por la adición de
PCDGF a los medios de cultivos de células. PCDGF puede también ser
usado para activar células B activas en estado de reposo resultando
en la producción de anticuerpos. Por ejemplo, PCDGF puede ser usado
para estimular la formación de células hibridoma las cuales están
formadas de células de bazo y células demieloma múltiple
fusionadas.
Se entiende que la aplicación de las enseñanzas
de la presente invención a un problema o ambiente específico será
dentro de la capacidad de tener una habilidad normal en la técnica a
la luz de las enseñanzas aquí contenidas. La presente invención está
más ilustrada plenamente por los siguientes ejemplos no
limitadores.
\vskip1.000000\baselineskip
Investigamos la expresión de PCDGF por
activación por LPS, un mitógeno para células B normales de ratón.
Cuando linfocitos de bazo de ratón fueron activados por 10 Pg/ml de
LPS, la expresión de mRNA PCDGF aumentó espectacularmente tan pronto
como en 6 horas como es mostrado por análisis de
Northern-blot (Figura 1). Linfocitos de bazo de
ratón fueron cultivados en 1.2X10^{6} células/ml en RPMI 1640
conteniendo 10% de FBS. 10 Pg/ml de LPS fueron usados para activar
células B de ratón en estado de reposo. RNAs fueron aislados en 0,
6, 12, 24, y 48 horas. Análisis de Northern blot fueron llevados a
cabo para revisar la expresión de mRNA PCDGF. El panel superior
muestra la expresión de mRNA PCDGF. El panel inferior muestra de
teñido de 18S y 28S RNA EB para indicar carga igual para cada
calle.
La expresión de proteína de PCDGF fue también
espectacularmente incrementada tras 48 horas como se muestra por el
teñido inmunofluorescente (Figura 2). Linfocitos de bazo de ratón
fueron incubados en 1.2X10^{6} células/ml en RPMI 1640 conteniendo
10% de FBS durante 48 horas sin (A) o con (B) 10 Pg/ml de LPS. La
preparación de citospina de células fue fijada con 2% de
paraformaldehído en PBS, permeabilizado con 0.2% de Triton X 100 en
PBS, y teñido con anticuerpo de PCDGF antihumano de conejo
purificado y desarrollado con IgG F(ab')2 conjugado de de
cabra anticonejo Alexia 488. El teñido inmunofluorescente fue
observado y fotografiado usando un microscopio fluorescente Olympus
BX40 equipado con lámpara de mercurio de 100 W.
La incorporación de timidina alcanzó una
estimulación de 100 veces y cpm máxima después de 48 horas de
incubación con 10 \mug/ml de LPS (Figura 3). Linfocitos de bazo de
ratón fueron cultivados en 1.2x10^{6} células/ml con o sin LPS (10
\mug/ml) en un volumen final de medio 0.2 ml de RPMI 1640
conteniendo 10% de FBS en unas placas de 96 pocillos de base plana.
[3H] TdR (1 \muCi/pocillo) fue añadida al cultivo durante las
últimas 6 horas. La incorporación de timidina fue revisada en 24,
48, y 72 horas. El resultado está expresado como media \pm SD.
Esos datos indicaron que tras la activación de células B normales,
las expresiones de mRNA PCDGF y proteína fueron estimuladas
espectacularmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Linfocitos de bazo de ratón, las células que
usamos en nuestros experimentos, son una mezcla de células T y B de
ratón. Con el fin de controlar si el incremento de expresión de
PCDGF es específico a la activación de células B, usamos Con A, un
activador fuerte de linfocito T, para estimular células T de
linfocitos de bazo de ratón y medir la expresión de PCDGF. Como se
indica por RT-PCR (Figura 4), mRNA PCDGF fue
únicamente detectada en muestras estimuladas por LPS pero no en
control y muestras estimuladas por Con A de 6 a 48 horas. Linfocitos
de bazo de ratón fueron incubados en 1.2X10^{6} células/ml en RPMI
1640 conteniendo 10% de FBS con 10 \mug/ml de LPS, 2.5 \mug/ml
de ConA, o vehículo. RNAs fueron aisladas a 0, 6, 12, 24, y 48 horas
y RT-PCR fue llevado a cabo para revisar la
expresión de mRNA PCDGF (panel superior). El ratón
\beta-actin fue usado como un control interno para
indicar la carga igual de cada calle (panel inferior).
La expresión de la proteína PCDGF fue también
únicamente detectada en muestra estimulada por LPS (Figura 5).
Linfocitos de bazo de ratón fueron incubados en 1.2X10^{6}
células/ml en RPMI 1640 conteniendo 10% FBS con 10 \mug/ml LPS,
2.5 \mug/ml ConA, o vehículo durante 24 horas. Los medios de
cultivo conteniendo la misma cantidad de células vivas (6X10^{6}
células vivas) fueron usados para inmunoprecipitación seguida por
análisis de Western blot para comprobar la expresión de proteína de
PCDGF.
Los datos de incorporación de timidina muestran
que los linfocitos de bazo de ratón fueron activados por o bien LPS
o Con A (Figura 6). Los linfocitos de bazo de ratón fueron
cultivados en 1.2x10^{6} células/ml con 10 \mug/ml de LPS, 2.5
\mug/ml de ConA, o vehículo durante 48 horas en un volumen final
de medio 0.2 ml de RPMI 1640 conteniendo 10% de FBS en unas placas
de 96 pocillos de base plana. [3H] TdR (1 \muCi/pocillo) fue
añadido al cultivo durante las últimas 6 horas. Los resultados están
expresados como media \pm SD. Esos datos mostraron que el
incremento de expresión de PCDGF era específico a la activación de
células B.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de probar que las células positivas
PCDGF son células B proliferando por encima de estimulación LPS,
teñido inmunofluorescente fue llevado a cabo usando anticuerpos
anti-PCDGF, anticuerpos anti-BrdU, y
anticuerpos anti-B220. BrdU es un análogo de
timidina y es incorporado específicamente dentro de ADN durante la
síntesis de ADN. Teñido de los linfocitos de ratón con anticuerpo
fluoresceína de BrdU mostró que los linfocitos teñidos positivo para
PCDGF fueron positivos para BrdU indicando que las células que
expresaron PCDGF eran células proliferantes (Figura 7). El antígeno
B220 es expresado en linfocitos B en todas las etapas desde
pro-B a través de células B maduras. B220 es
comúnmente usado como un marcador de célula B. Teñido de los
linfocitos de ratón con anticuerpos B220-FITC mostró
que los linfocitos teñidos positivo para PCDGF eran positivos para
B220 indicando que las células que expresaron PCDGF era células B
(Figura 8). Linfocitos de bazo de ratón fueron incubados a
1.2X10^{6} células/ml en RPMI 1640 conteniendo 10% de FBS durante
48 horas sin (A, B, C) o con (D, E, F) 10 Pg/ml de LPS. Células
fueron fijadas con 2% de paraformaldehído en PBS, permeabilizado con
0.2% de Triton X 100 en PBS, y teñido con B220-FITC
(A y D), Dapi (B y E), o anticuerpo PCDGF antihumano de conejo
purificado seguido por el anticuerpo secundario IgG de anticonejo de
cabra con Texas rojo Texas red (C y F). Teñido inmunofluorescente
fue observado y fotografiado usando un microscopio por fluorescencia
Olympus BX40 equipado con una lámpara de mercurio 100 W.
\vskip1.000000\baselineskip
Es importante investigar si PCDGF sólo o con
otros mitógenos de células B puede estimular la proliferación de
células B en reposo. Usamos la incorporación de timidina para
determinar el efecto de PCDGF, anti IgM, o PCDGF sobre la
proliferación de células B en reposo de ratón. Como se muestra en la
Fig. 9, 10 \mug/ml anti-IgM, 200 ng/ml con 10
\mug/ml anti-IgM, estimuló la proliferación de
células B en reposo de ratón en 2.7, 3.7, y 4.6 veces, después de un
tratamiento de 71 horas. Los linfocitos de bazo de ratón se
incubaron en 5X10^{6} células/ml durante 72 horas con 200 ng/ml
PCDGF, 10 \mug/ml anti-IgM, o ambos en un volumen
final de medio 2 ml RPMI 1640 conteniendo 10% FBS in placas de 96
pocillos de fondo plano. [3H] TdR (1 PCi/ pocillo) se añadió al
cultivo durante las últimas 16horas. El resultado se expresa como
media \pm SD.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citadas por el
solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No
forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto
gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden
excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier
responsabilidad en este sentido.
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T-cell-stimulating activities.
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Claims (7)
1. Un método ex vivo para incrementar la
proliferación de células B no tumorigénicas comprendiendo
administrar una cantidad efectiva de PCDGF a dichas células donde la
proliferación de dichas células es aumentada por encima del nivel
basal de proliferación celular.
2. El método de la Reivindicación 1 donde dichas
células son de sangre periférica, ganglios linfáticos, médula
espinal, sangre de cordón umbilical o el bazo.
3. Los métodos de la Reivindicación 1 o 2, que
además comprenden administrar una cantidad efectiva de un mitógeno
de célula B donde la proliferación de células B es incrementada por
encima de el nivel basal de proliferación celular.
4. Un método ex vivo de estimular
síntesis de ADN en células B no tumorigénicas comprendiendo
administrar una cantidad efectiva de PCDGF a dichas células en donde
la síntesis de ADN es incrementada por encima del nivel basal de
síntesis de ADN celular.
5. El método de la Reivindicación 4, en donde
dichas células son de sangre periférica, ganglios linfáticos, médula
espinal, sangre de cordón umbilical o el bazo.
6. Los métodos de la Reivindicación 4 o 5, que
además comprenden administrar una cantidad efectiva de un mitógeno
de células B en donde la síntesis de ADN es incrementada por encima
del nivel basal de síntesis de ADN celular.
7. El método de la Reivindicación 1 donde dichas
células son un cultivo de células B primarias.
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