ES2369945A1 - Procedimiento de obtención de una composición que contiene factores de crecimiento a partir de un compuesto sanguíneo, y composición obtenible por dicho procedimiento. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de obtención de una composición que contiene factores de crecimiento, que comprende las fases de tratar térmicamente un compuesto sanguíneo que contiene factores de crecimiento para aumentar su temperatura de manera que se elimine el complemento y se reduzcan las inmunoglobulinas presentes en el mismo, de liofilizar el compuesto para conseguir una composición final seca de fácil transporte, manipulación y conservación que facilita los tratamientos periódicos o crónicos con compuestos sanguíneos. Se ha comprobado que, una vez re-suspendida la composición final seca, se obtiene una composición nuevamente húmeda que conserva intactas sus propiedades biológicas.
Description
Procedimiento de obtención de una composición
que contiene factores de crecimiento a partir de un compuesto
sanguíneo, y composición obtenible por dicho procedimiento.
La invención se refiere a un procedimiento de
obtención de una composición que contiene factores de crecimiento,
con la presencia o no de componentes celulares hemáticos (plaquetas,
eritrocitos y glóbulos blancos), a partir de un compuesto sanguíneo,
y a la composición que contiene factores de crecimiento obtenible
por medio de dicho procedimiento.
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En el estado de la técnica es conocida de forma
muy extensa la preparación de compuestos sanguíneos que contienen
factores de crecimiento, obtenidos a partir de la sangre de un
paciente. Dichos compuestos sanguíneos con o factores de crecimiento
han demostrado ofrecer propiedades biológicas muy importantes,
especialmente relacionadas con el desencadenamiento y favorecimiento
de la regeneración de tejidos, la disminución del dolor en cierto
tipo de dolencias y enfermedades, y otras múltiples utilidades.
A modo de ejemplo, la solicitud de patente
WO0044314A1, a favor del propio solicitante, se refiere a un método
de preparación de un gel de plasma sanguíneo autólogo, rico en
factores de crecimiento, a partir de la propia sangre del paciente,
procedimiento que ha sido actualizado en la más reciente solicitud
de patente WO2010130851A2, también a favor del propio solicitante.
Ambos procedimientos comparten pasos comunes como son el
centrifugado de la sangre del paciente, la separación de plasma rico
en plaquetas y la adición de cloruro de calcio al plasma rico en
plaquetas para producir la activación del plasma (la liberación de
factores de crecimiento por parte de las plaquetas contenidas en el
plasma) y para producir la coagulación del mismo hasta que el plasma
adquiere una consistencia similar a un gel.
También se conoce, por medio de la patente
ES2221770B2 un procedimiento de preparación de otro compuesto
sanguíneo rico en factores de crecimiento y con propiedades
biológicas muy beneficiosas, en este caso en forma líquida.
Concretamente, se trata de un sobrenadante de un plasma sanguíneo
rico en factores de crecimiento, obtenido a partir de la fase
líquida sobrenadante que aparece tras provocar la coagulación y una
posterior retracción de dicho plasma rico en factores de
crecimiento. En esta patente se describen además diversos usos del
sobrenadante, entre los cuales destaca su uso (favorecido por su
consistencia líquida) como colirio para el tratamiento de
enfermedades o dolencias oculares.
Un gel de plasma que contenga en factores de
crecimiento, un sobrenadante o, en general, cualquier compuesto
sanguíneo autólogo preparado según métodos conocidos en el estado
del arte, independientemente de la aplicación para la cual vaya a
utilizarse, presenta el inconveniente de que necesita ser aplicado
de forma inmediata para no perder sus propiedades biológicas. Esta
necesidad es especialmente crítica si el compuesto sanguíneo
contiene factores de crecimiento liberados. Así, los compuestos
sanguíneos no están preparados para aguantar a temperatura ambiente
largos periodos de tiempo y se recomienda su aplicación inmediata
(en el caso de un sobrenadante, en no más de ocho horas desde su
preparación) para evitar la degradación y desnaturalización de las
proteínas y factores de crecimiento o la posible contaminación
bacteriana del producto.
La inmediatez de uso de los compuestos
sanguíneos autólogos no ha sido limitante hasta la fecha ya que las
aplicaciones para las cuales han sido utilizados (regeneración de
tejidos, cultivo de células, aplicaciones agudas o incluso semanales
o quincenales, etc.) han sido compatibles con dicha inmediatez. Sin
embargo, en la actualidad están surgiendo posibles nuevas
aplicaciones de los compuestos sanguíneos autólogos que contienen
factores de crecimiento, que exigen infiltraciones o aplicaciones
continuas del compuesto, con un intervalo entre dosificaciones
relativamente breve. Los compuestos sanguíneos autólogos (gel,
sobrenadante, etc.) tal como son conocidos en la actualidad,
exigirían que para estas nuevas aplicaciones se estuviera extrayendo
sangre continuamente al paciente, repercutiendo muy negativamente en
la calidad de vida del mismo y en la factibilidad de tratamientos a
largo plazo para patologías crónicas o degenerativas.
Ejemplos de patologías crónicas o degenerativas
que podrían ser tratadas con un compuesto sanguíneo que contiene
factores de crecimiento, pero que actualmente no lo son debido a la
inmediatez de uso de los compuestos sanguíneos y a la imposibilidad
de su conservación, son múltiples: patologías oculares, patologías
del sistema nervioso central, patologías articulares degenerativas y
en conjunto todas aquellas enfermedades o patologías que requieran
la administración crónica o repetida del compuesto sanguíneo que
contiene factores de crecimiento.
Entre las patologías enumeradas se encuentran,
particularmente pero no solamente, las siguientes: el lupus
eritematoso sistémico, que es una enfermedad autoinmune crónica que
afecta al tejido conjuntivo y que se caracteriza por que produce una
inflamación y un daño de tejidos mediados por el sistema
inmunitario, específicamente debidos a la unión de anticuerpos a las
células del organismo y al depósito de complejos
antígeno-anticuerpo; el síndrome Sjögren, que es una
enfermedad autoinmune sistémica que se caracteriza por afectar
principalmente a las glándulas exocrinas y que conduce a la
aparición de sequedad; la dermatomiositis, que es una enfermedad del
tejido conectivo caracterizada por la inflamación de los músculos y
de la piel; la artritis reumatoide, la cual se trata de una
enfermedad sistémica autoinmune caracterizada por provocar
inflamación crónica, principalmente de las articulaciones, y que
produce destrucción progresiva con distintos grados de deformidad e
incapacidad funcional. Actualmente existen estudios que apuntan a
que una composición sanguínea autóloga que contenga factores de
crecimiento podría intervenir de forma muy satisfactoria en frenar
todas estas patologías si pudiera ser aplicado de forma regular en
el paciente.
La presente invención tiene como objetivo
diseñar un procedimiento de obtención de una composición que
contenga factores de crecimiento a partir de un compuesto sanguíneo
que contiene factores de crecimiento, que permita obtener una
composición capaz de ser conservada durante largos periodos de
tiempo y transportada de manera sencilla, de forma que la
composición resulte apta para ser aplicada no de forma inmediata
sino en el momento que se desee o estime necesario. De esta manera,
el procedimiento según la invención permitirá obtener una
composición que podrá ser utilizada en planteamientos terapéuticos
crónicos, de forma periódica, todo ello sin requerir constantes
extracciones de sangre del paciente y por lo tanto mejorando la
calidad de vida del mismo.
Es también objetivo de la presente invención que
la composición obtenida mediante el procedimiento de la invención
conserve intactas sus propiedades biológicas.
Es también objetivo de la presente invención que
la composición obtenida mediante el procedimiento de la invención
conserve unas propiedades biológicas mejoradas, especialmente
indicadas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
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Es objeto de la invención un procedimiento de
obtención de una composición que contiene factores de crecimiento,
con la presencia o no de componentes celulares hemáticos (plaquetas,
eritrocitos y glóbulos blancos), que comprende varias fases.
En primer lugar, el procedimiento comprende la
fase de disponer de un compuesto sanguíneo que contiene factores de
crecimiento, liberados o no. El compuesto sanguíneo puede ser de muy
diversos tipos: un gel de plasma rico en factores de crecimiento
obtenido según la técnica de WO0044314A1, WO2010130851A2 u otra
técnica aplicable; un sobrenadante obtenido como el componente
líquido que aparece tras producir la coagulación y posterior
retracción de un plasma sanguíneo, pudiendo dicho sobrenadante haber
sido obtenido por ejemplo según la técnica detallada en la patente
ES2221770B2; un suero sanguíneo; o, en general, cualquier compuesto
sanguíneo que contenga factores de crecimiento. El compuesto
sanguíneo puede contener o no componentes celulares hemáticos
(plaquetas, eritrocitos y glóbulos blancos).
Posteriormente, el procedimiento según la
invención comprende el paso de aplicar un tratamiento térmico al
compuesto sanguíneo, durante el cual se aumenta la temperatura del
mismo. El tratamiento térmico permite eliminar el complemento y
reducir la presencia de algunas de las inmunoglobulinas más
frecuentes en el compuesto sanguíneo que juegan un papel crítico en
reacciones cruzadas desde un punto de vista inmunológico. Dicha
eliminación o reducción considerable del complemento presente en el
compuesto sanguíneo constituye una importantísima ventaja para la
aplicabilidad del mismo a enfermedades del sistema inmune.
Adicionalmente, el procedimiento según la
invención comprende una fase en la que se liofiliza el compuesto
sanguíneo para conseguir una composición final prácticamente carente
de humedad.
De acuerdo con la invención, los pasos de
aplicar un tratamiento térmico al compuesto sanguíneo y de
liofilizar el compuesto sanguíneo se realizan en orden indistinto,
es decir, pueden realizarse en cualquier orden.
Adicionalmente, el procedimiento según la
invención puede comprender el paso de filtrar el compuesto
sanguíneo. Dicho paso se realiza antes de la liofilización (no
necesariamente inmediatamente antes, ya que en caso de aplicarse el
tratamiento térmico antes de efectuar la liofilización, el filtrado
se realiza antes del tratamiento térmico).
El procedimiento de obtención de una composición
a partir de un compuesto sanguíneo autólogo permite conseguir una
composición final seca que presenta múltiples ventajas sobre el
compuesto sanguíneo húmedo convencional. Una ventaja importante es
que una composición seca es evidentemente más fácil de manejar y
transportar que un compuesto húmedo (líquido, con consistencia de
gel más o menos viscoso o con otra consistencia). Asimismo, al no
contener agua, la composición seca puede mantenerse a temperatura
ambiente e incluso conservarse de forma ilimitada, constituyendo un
producto de larga estabilidad (gracias a lo cual puede aplazarse su
uso y no ha de ser utilizado necesariamente de forma inmediata, una
vez preparado). Adicionalmente, al no contener agua, la composición
seca no tiene riesgo de sufrir contaminaciones. Otra ventaja de la
composición seca es que puede recuperar rápidamente su estado
original; para ello basta con re-suspender la misma
en cualquier solvente isotónico que se emplee rutinariamente (por
ejemplo agua), proceso que puede efectuarse in situ.
Una ventaja adicional de la composición seca
según la invención es que, tal como se ha comprobado, una vez
re-suspendida dicha composición para recuperar un
estado húmedo y poder ser administrada, la composición
re-suspendida conserva las propiedades biológicas
que caracterizaban al compuesto sanguíneo húmedo antes de realizar
el procedimiento según la invención. Es decir, la composición
re-suspendida sigue conservando una concentración
análoga de factores de crecimiento con actividad biológica; además,
los efectos inducidos por la composición seca una vez
re-suspendida en la proliferación celular, la
migración y quimiotaxis celular y en la síntesis auto y paracrina de
factores de crecimiento son idénticos a los del compuesto sanguíneo
húmedo. Esta conservación de propiedades biológicas se consigue
gracias, entre otros motivos, a la adecuada temperatura a que es
sometido el producto durante la ejecución del procedimiento según la
invención. Por otra parte, debido a la baja temperatura utilizada en
las diferentes fases del procedimiento, la pérdida de constituyentes
volátiles comprendidos en el compuesto sanguíneo que pudiera
producirse durante la ejecución del procedimiento es mínima. Las
bajas temperaturas también permiten mantener un riesgo muy bajo de
contaminación microbiana y que la preparación no sufra alteraciones
desde un punto de vista enzimático (es ventajoso que las
preparaciones que contienen enzimas, como es el caso del compuesto
sanguíneo de la presente invención, se mantengan tratadas a bajas
temperaturas para que no se vean dañadas).
Otro efecto extremadamente beneficioso de la
invención es que la composición seca y, por lo tanto, la composición
final re-suspendida son composiciones libres o con
una presencia reducida de complemento, lo cual convierte la
composición final re-suspendida en una composición
particularmente óptima para tratar algunas enfermedades de
naturaleza autoinmune.
Todo lo anterior permite que la composición seca
pueda ser utilizada para tratamientos no inmediatos, por ejemplo
para tratar de forma regular patologías crónicas y, particularmente,
patologías crónicas de naturaleza autoinmune. Así, si la composición
seca obtenida según la invención se almacena por ejemplo en dosis,
el tratamiento crónico con la misma se convierte en un proceso muy
sencillo: el paciente crónico puede llevar su dosis (por ejemplo en
un envase) a cualquier lugar sin complicaciones ni temores; cuando
desea administrarse la dosis, basta con que humedezca
(re-suspenda) la misma y, una vez recuperada la
consistencia húmeda original (líquida u otra), efectúe la aplicación
de la forma aplicable.
Todas estas particularidades y ventajas
asociadas a la composición obtenida mediante el procedimiento según
la invención pueden resumirse en: una estabilidad óptima, una
especial indicación para algunas patologías de naturaleza
autoinmune; una solubilidad fácil, rápida y completa; una
conservación ilimitada; una buena protección contra las influencias
externas nocivas y una rápida disponibilidad de uso.
Es asimismo objeto de la invención una
composición que contiene factores de crecimiento, comprendiendo o no
componentes celulares hemáticos, obtenible por medio del
procedimiento según la invención. Dicha composición presenta todas
las ventajas descritas con anterioridad.
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Los detalles de la invención se aprecian en las
figuras que se acompañan, no pretendiendo éstas ser limitativas del
alcance de la invención:
- La Figura 1 muestra una gráfica del número de
keratocitos por centímetro cuadrado en tres córneas tratadas con
sobrenadante de plasma líquido convencional, no sometido a
tratamiento térmico, y con sobrenadante tratado térmicamente según
la invención.
- La Figura 2 muestra una gráfica de los niveles
de PDGF-AB en los sobrenadantes de tres donantes,
antes y después de ser tratados térmicamente según la invención.
- La Figura 3 muestra los niveles del factor D
del complemento en los sobrenadantes de tres donantes, antes y
después de realizar sobre dichos sobrenadantes un tratamiento
térmico de acuerdo con la invención.
- La Figura 4 muestra una gráfica del número de
fibroblastos por centímetro cuadrado en tres córneas tratadas con
sobrenadante de plasma líquido convencional, no sometido a
tratamiento térmico, y con sobrenadante tratado térmicamente según
la invención.
- La Figura 5 muestra una gráfica de la
concentración de factores de crecimiento PDGF-AB y
TGF-\beta1 en un sobrenadante sin liofilizar y en
un sobrenadante liofilizado según la invención.
- La Figura 6 muestra una gráfica de la
concentración de factores de crecimiento VEGF y EGF en un
sobrenadante sin liofilizar y en un sobrenadante liofilizado según
la invención.
- La Figura 7 muestra una gráfica de la cantidad
de fibroblastos conjuntivales contenida por centímetro cuadrado en
tres sobrenadantes líquidos, antes y después de realizar un filtrado
de los sobrenadantes.
- La Figura 8 muestra una gráfica de la
concentración de factores de crecimiento
TGF-\beta1 en sobrenadante filtrado y sin
filtrar.
- La Figura 9 muestra una gráfica de la
concentración de factores de crecimiento IGF-I en
sobrenadante filtrado y sin filtrar.
- La Figura 10 muestra una gráfica del número de
células primarias procedentes de keratocitos corneales humanos (HCK)
tras 72 horas de tratamiento con un sobrenadante de plasma rico en
factores de crecimiento (PRGF) convencional y con un sobrenadante de
plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) filtrado, tratado
térmicamente y liofilizado según la invención.
- La Figura 11 muestra una gráfica del número de
células primarias procedentes de fibroblastos conjuntivales humanos
corneales humanos (HCF) tras 72 horas de tratamiento con un
sobrenadante de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)
convencional y con un sobrenadante de plasma rico en factores de
crecimiento (PRGF) filtrado, tratado térmicamente y liofilizado
según la invención, el cual posteriormente ha sido
re-suspendido.
- La Figura 12 muestra una gráfica de la
concentración de células en un cultivo de células primarias de
keratocitos corneales humanos (HCK) realizado en un sobrenadante de
plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) convencional y en un
sobrenadante de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)
filtrado, tratado térmicamente y liofilizado según la invención, el
cual posteriormente ha sido re-suspendido.
- La Figura 13 muestra una gráfica de la
concentración de células en un cultivo de células primarias de
fibroblastos conjuntivales humanos (HCF) realizado en un
sobrenadante de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)
convencional y en un sobrenadante de plasma rico en factores de
crecimiento (PRGF) filtrado, tratado térmicamente y liofilizado
según la invención, el cual posteriormente ha sido
re-suspendido.
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Es objeto de la invención un procedimiento de
obtención de una composición que contiene factores de crecimiento,
con la presencia o no de componentes celulares hemáticos (plaquetas,
eritrocitos y glóbulos blancos), que comprende las siguientes
fases:
- a)
- Disponer de un compuesto sanguíneo que contiene factores de crecimiento, liberados o no, preparado según cualquier procedimiento de preparación aplicable. Un ejemplo de compuesto sanguíneo con factores de crecimiento liberados es aquel en el que, utilizando el agente que fuere (cloruro cálcico, trombina, sales de calcio, otros agentes que contengan iones divalente o combinaciones de los mismos, o cualquier otro sistema que active la coagulación), se ha liberado el contenido de factores de crecimiento de las plaquetas y se ha activado la cascada de coagulación, logrando un producto rico en proteínas y factores de crecimiento tanto plasmáticos como plaquetarios. El compuesto sanguíneo puede ser de muy diversos tipos: un gel de plasma rico en factores de crecimiento obtenido según la técnica de WO0044314A1, WO2010130851A2 u otra técnica aplicable; un sobrenadante obtenido como el componente líquido que aparece tras producir la coagulación y posterior retracción de un plasma sanguíneo, pudiendo dicho sobrenadante haber sido obtenido por ejemplo según la técnica detallada en la patente ES2221770B2; un suero sanguíneo; o, en general, cualquier compuesto sanguíneo que contenga factores de crecimiento en cualquier cantidad y que haya sido obtenido por cualquier procedimiento. El compuesto sanguíneo puede contener o no componentes celulares hemáticos (plaquetas, eritrocitos y glóbulos blancos).
- b)
- Aplicar un tratamiento térmico al compuesto sanguíneo, de manera que se consigue eliminar el complemento y reducir la presencia de algunas de las inmunoglobulinas más frecuentes del compuesto sanguíneo que juegan un papel crítico en reacciones cruzadas desde un punto de vista inraunológico. Dicha eliminación o reducción considerable del complemento presente en el compuesto sanguíneo constituye una importantísima ventaja para la aplicabilidad del mismo a enfermedades del sistema inmune. Así, se sabe que la presencia del sistema de complemento de un compuesto sanguíneo pudiera ser perjudicial ya que está implicado en la sobre-estimulación del sistema inmune y en muchos casos en la propia sintomatología de la enfermedad que se pretende tratar con el compuesto sanguíneo. El complemento del plasma está relacionado con diversas alteraciones tales como posibles reacciones adversas de enfermedades autoinmunes (Lupus eritematoso, artritis, etc.) mediadas por complemento (vía clásica del complemento) o reacciones adversas derivadas de enfermedades inflamatorias crónicas mediadas por complemento. Además, parte de los factores del complemento potencian la inflamación y la fagocitosis y actúan produciendo la lisis de células y microorganismos. Por su parte, las inmunoglobulinas (Ig) y más concretamente la IgG es la más presente en el compuesto sanguíneo y entre sus principales funciones biológicas destacan la fijación del complemento, la unión a receptores para Fe en células fagocíticas al opsonizar partículas durante la fogocitosis y la unión a receptores en células NK durante la citotoxicidad mediada por anticuerpos. Por lo tanto, la eliminación o reducción considerable del complemento presente en el compuesto sanguíneo constituye una importantísima ventaja para la aplicabilidad del mismo a enfermedades del sistema inmune. Gracias al tratamiento térmico se puede lograr, entonces, una composición final adaptada a las necesidades de pacientes con problemas del sistema inmune. Además, se ha comprobado que el tratamiento térmico no altera la presencia de factores de crecimiento y proteínas en el compuesto sanguíneo ni modifica o reduce la funcionalidad y potencialidad del mismo. Por su parte, la reducción total o parcial de las inmuglobulinas resulta importante en pacientes con enfermedades auto-inmunes ya que diferentes IgG participan en algunos de los procesos agudos de rechazo y por lo tanto reducir su presencia en la formulación ayuda a tratar distintos tejidos en estos pacientes sin riesgos de rechazo o reacción inmune aguda alguna.
- c)
- Liofilizar el compuesto sanguíneo, para eliminar casi en su totalidad el contenido en agua del mismo y permitir que el compuesto sanguíneo pase a un estado de no humedad que permite su conservación durante largos periodos de tiempo.
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La liofilización preferentemente se realiza sin
la adición de coadyuvantes (azúcares tales como la trehalosa,
componentes químicos, etc.). Los coadyuvantes son necesarios para
liofilizar muchas sustancias, pero se ha comprobado que el compuesto
sanguíneo consigue liofilizarse correctamente sin ellos y que
realizando la liofilización sin añadir ningún coadyuvante se
consigue una composición seca final (y por lo tanto una composición
re-suspendida para aplicar al paciente) más
biocompatible. Por ejemplo, algunos estudios realizados han
demostrado que algunos coadyuvantes como la trehalosa actúan
negativamente sobre la proliferación celular.
El procedimiento presenta la particularidad,
además, de que en principio los pasos de aplicar un tratamiento
térmico al compuesto sanguíneo y de liofilizar el compuesto
sanguíneo se pueden realizar en orden indistinto. Sin embargo, se
considera preferente el orden según el cual el paso de aplicar un
tratamiento térmico al compuesto sanguíneo se realiza antes del paso
de liofilizar el compuesto sanguíneo. Este orden preferente obedece
a que el producto, al ser tratado térmicamente con anterioridad,
contendrá todas las propiedades y potencialidad que se pretenden con
este proceso (reducción del complemento e IgG) antes de ser
liofilizado. Hay que tener en cuenta que la liofilización se realiza
con el ánimo de mejorar la conservación y mantenimiento del
preparado por lo tanto es preferente que constituya la etapa final y
no la inicial. Por lo tanto, en resumen, primero se pretende
optimizar el producto y posteriormente desarrollar su proceso de
conservación y mantenimiento.
El tratamiento térmico puede ser cualquier
tratamiento que permita elevar convenientemente la temperatura del
compuesto sanguíneo, siendo preferente que se someta al compuesto
sanguíneo a una temperatura superior a 37ºC durante un tiempo igual
o superior a 1 minuto (por ejemplo introduciendo el compuesto
sanguíneo en un baño de agua a esta temperatura y durante este
tiempo). Dado que la temperatura de 37ºC es la temperatura corporal
y la temperatura a la cual el complemento y las inmunoglobulinas
ejercen su máxima actividad biológica, es preferente de acuerdo con
la invención calentar el compuesto sanguíneo a una temperatura
superior a dichos 37ºC para conseguir eliminar alguno de los citados
componentes.
De forma especialmente ventajosa, el compuesto
sanguíneo se somete a una temperatura de entre 50 y 60ºC
(preferentemente a 56ºC), ya que a esa temperatura se consigue
optimizar la degradación de componentes del complemento y maximizar
la protección de las proteínas y factores de crecimiento que
componen el producto. Así, se ha comprobado que temperaturas
inferiores a este rango no garantizan que durante la incubación se
elimine del compuesto sanguíneo el complemento. Por otro lado,
incubar con temperaturas superiores a 60-65ºC
produciría la desnaturalización de los factores de crecimiento y de
las proteínas contenidas en el compuesto sanguíneo. Además,
preferentemente se somete el compuesto sanguíneo a dicha temperatura
durante entre 20 y 70 minutos (preferentemente entre 30 y 60
minutos) ya que a esos tiempos nuevamente se consigue optimizar la
degradación de componentes del complemento y maximizar la protección
de las proteínas y factores de crecimiento que componen el
producto.
producto.
La fase de liofilización comprende
preferentemente los pasos de:
- -
- congelar el compuesto sanguíneo a una temperatura menor de 0ºC durante igual o superior a 1 minuto;
- -
- realizar un secado primario del compuesto sanguíneo a a una temperatura menor o igual a 0ºC y a alto vacío, durante un tiempo igual o superior a 1 minuto, de manera que la mayor parte del agua libre contenida en el compuesto sanguíneo pasa a vapor;
- -
- opcionalmente, realizar un secado secundario del compuesto sanguíneo a una temperatura mayor o igual a 0ºC y a alto vacío, durante un tiempo igual o superior a 1 minuto, de manera que permite finalmente eliminar las ultimas trazas de vapor de agua, evaporando el agua no congelada contenida en el compuesto sanguíneo hasta conseguir una humedad final de menos del 1%;
- -
- opcionalmente, realizar un secado terciario del compuesto a una temperatura mayor o igual a 0ºC y a alto vacío, durante un tiempo igual o superior a 1 minuto, de manera que se elimine la humedad residual que haya quedado en el producto mediante evaporación y reducir su contenido de humedad, lo que mejorará la estabilidad del producto final.
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De forma especialmente ventajosa, el compuesto
sanguíneo se congela a una temperatura de entre -60 y -40ºC
(preferentemente a -50ºC) durante un tiempo superior a 1 hora
(preferentemente un tiempo superior a 2 horas) ya que fuera de este
rango, especialmente si las temperaturas de congelación son
inferiores, aumenta el riesgo de que el compuesto sanguíneo pierda
sus propiedades biológicas como consecuencia de la congelación.
Además, es conveniente congelar durante el tiempo mínimo de 1 hora
para asegurar que el compuesto sanguíneo se congela de forma
homogénea (la homogeneidad garantiza la estabilidad de la
liofilización y que no se alteren las propiedades biológicas
del
producto).
producto).
A su vez, el secado primario se realiza de forma
especialmente ventajosa a entre -60 y -40ºC y entre 0,05 y 0,15 mBar
(preferentemente a -50ºC y 0,1 mBar). La utilización de rangos bajos
de temperatura se realiza para asegurar que el producto está
totalmente congelado durante el proceso de sublimación, así como
para preservar las propiedades físicas, químicas, y biológicas del
producto inicial, evitando la posible desnaturalización de proteínas
del producto liofilizado. La duración concreta del proceso depende
de la cantidad de producto a liofilizar y ha sido establecida para
asegurar la total sublimación del hielo necesaria para un adecuado
secado.
En cuanto al secado secundario, éste se realiza
de manera especialmente ventajosa a entre +15 y +25ºC y entre 0,05 y
0,15 mBar (preferentemente a +20ºC y 0,1 mBar) ya que estas
condiciones permiten eliminar la humedad residual que haya quedado
en el producto mediante evaporación y reducir su contenido de
humedad por debajo del 1% con objeto de mejorar la estabilidad del
producto final.
Finalmente, el secado terciario se realiza de
manera especialmente ventajosa a entre +15 y +25ºC y vacío total
(preferentemente a +20ºC y vacío total), logrando eliminar
finalmente toda humedad, lo que proporcionará las óptimas
características de estabilidad y uniformidad del producto final.
El procedimiento según la invención puede
comprender, además, el paso adicional de filtrar el compuesto
sanguíneo para eliminar o evitar la aparición de componentes de alto
peso molecular, agregados plaquetarios o restos de fibrina que
pudieran alterar la uniformidad del congelado y la estabilidad del
liofilizado, lo que repercutiría también negativamente en la
re-suspensión de la composición seca (téngase en
cuenta que la velocidad de disolución de un liofilizado es
inversamente proporcional al tamaño de las partículas que lo
constituyen y que partículas gruesas comprendidas en la composición
seca podrían producir que la disolución de la composición seca fuera
más lenta o simplemente nula). En caso de realizarse, dicho paso
adicional de filtrar el compuesto sanguíneo se ejecuta antes de la
liofilización, aunque no necesariamente inmediatamente antes. El
paso de filtrar el compuesto sanguíneo podrá no ser necesario, por
ejemplo, cuando se disponga al comienzo del procedimiento de un
compuesto sanguíneo ya
filtrado.
filtrado.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe un ejemplo de
procedimiento de preparación de una composición final
re-suspendida a partir de una composición seca
obtenida a su vez según el procedimiento de la invención y a partir
de un sobrenadante de plasma rico en factores de crecimiento.
En primer lugar, se prepara un plasma rico en
factores de crecimiento a partir de sangre extraída de un paciente,
centrifugando en primer lugar la misma para separar la sangre en
diferentes fracciones, como es conocido en el estado de la técnica.
Entonces, se extrae la fracción de plasma mediante un dispositivo
PTD (por sus siglas en inglés "Plasma Transfer Device") a un
tubo de fraccionamiento de 9 ml y se procede a activar el plasma; la
activación se realiza estimando el volumen de plasma contenido en el
tubo de fraccionamiento y añadiendo posteriormente 50 \mul de
PRGF® Activator por cada mililitro de plasma. La activación del
plasma equivale a la liberación de factores de crecimiento por parte
de las plaquetas contenidas en el plasma.
En segundo lugar, se obtiene el sobrenadante a
partir del plasma rico en factores de crecimiento. Para ello, el
plasma rico en factores de crecimiento, ya activado, se incuba en
bloque de calor a 37ºC entre 1 hora y hora y media hasta la completa
retracción del coágulo de fibrina. Posteriormente, el tubo de
fraccionamiento se centrifuga a 1000 g durante 10 minutos con dos
finalidades principales: precipitar el coágulo de fibrina formado, y
extraer lo máximo posible el volumen de sobrenadante que podría
quedar retenido en el interior del coágulo. Entonces, los tubos
centrifugados se introducen en una cabina de flujo laminar, donde
pueden ser abiertos para mantener la completa esterilidad de la
muestra. Con una jeringuilla de 10 ml a la que se ha acoplado una
aguja intramuscular roma, se recoge todo el sobrenadante liberado.
Posteriormente, se retira la aguja roma de la jeringuilla y se
acopla un filtro de PVDF de 0,22 \mum, y se procede a la
filtración del sobrenadante. Durante el proceso de filtración, la
jeringa con el filtro se conecta a los dispensadores multidosis,
administrando 1 ml de sobrenadante filtrado por dispositivo.
Finalmente, los dispositivos se cierran herméticamente.
A continuación se ejecuta el procedimiento según
la invención, para obtener una composición final seca a partir del
sobrenadante líquido filtrado. Así, los dispositivos multidosis, con
el sobrenadante filtrado en su interior, son tratados térmicamente,
introduciéndose en un baño de agua precalentado previamente a 56ºC y
durante entre 30 a 60 minutos. Tras este periodo, se introducen
inmediatamente en un liofilizador previamente enfriado a -50ºC para
proceder a su congelación donde se mantendrán en un rango de tiempo
de entre 2 y 8 horas según el volumen de sobrenadante hasta que las
muestras se encuentren congeladas de forma homogénea.
Posteriormente, se realiza un secado primario a -50ºC y 0,1 mBar
durante como máximo 24 h. Seguidamente, se realiza un secado
secundario a +20ºC y 0,1 mBar durante máximo 6 h y finalmente se
realiza un secado terciario a +20ºC y vacío total durante como
máximo 12 h. El producto resultante es un polvo uniforme y homogéneo
que aparece ligeramente compactado y que se puede
re-suspender (es decir, diluir volviendo a su
consistencia de sobrenadante) tras contacto con una solución acuosa
de manera rápida y sencilla.
La composición final seca debe ser
re-suspendida para poder ser aplicada. Para ello, el
médico o el paciente toma una dosis de composición final seca y la
sumerge en un volumen determinado de agua destilada estéril dentro
de un contenedor, agitando posteriormente el contenedor hasta
conseguir la completa disolución la composición seca y la obtención
de una composición final nuevamente húmeda o líquida que conserva
las propiedades biológicas del sobrenadante húmedo inicial, previo
al tratamiento térmico y la liofilización. Dicha composición final
puede entonces ser directamente aplicada al paciente, por ejemplo
como colirio en los ojos.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen los resultados de
tres estudios experimentales realizados sobre el procedimiento y la
composición según la invención, efectuado y obtenida respectivamente
a partir de un sobrenadante de plasma sanguíneo rico en factores de
crecimiento. Se detallan asimismo las conclusiones técnicas
alcanzadas a partir de dichos resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado, el tratamiento térmico
realizado por la presente invención a temperaturas adecuadas permite
conservar las propiedades biológicas del sobrenadante, es decir, que
la composición seca final presente sustancialmente las mismas
propiedades que el sobrenadante líquido inicial.
Pues bien, tras realizarse una experimentación
sobre córnea, se ha comprobado que el proceso de tratamiento térmico
(baño de agua a 56ºC durante 30 minutos) no afecta a su efecto
biológico sobre la proliferación de fibroblastos de córnea y
conjuntiva ni de células epiteliales corneales. La multiplicación de
dichas células en cultivo in vitro es similar en el caso del
sobrenadante no tratado térmicamente. Así, en la Figura 1, que
muestra el número keratocitos por centímetro cuadrado en tres
córneas tratadas con sobrenadante de plasma líquido convencional, no
sometido a tratamiento térmico, y con sobrenadante tratado
térmicamente según la invención, se puede observar que la
proliferación de fibroblastos de córnea (keratocitos) es
prácticamente la misma en respuesta al sobrenadante de plasma
líquido convencional, no sometido a tratamiento térmico que al
sobrenadante tratado térmicamente según la invención. Lo mismo
ocurre en el caso de los fibroblastos conjuntivales y las células
epiteliales corneales estudiadas.
También se han analizado los niveles de factores
de crecimiento presentes en los sobrenadantes líquidos
convencionales y en sobrenadantes tratados térmicamente según la
invención. Se ha comprobado que, en el caso de factores plaquetarios
como el PDGF-AB o el TGF-\beta1,
el tratamiento térmico no afecta a sus niveles medidos en el
sobrenadante final. Por otra parte, se ha comprobado que factores de
crecimiento plasmáticos analizados como el IGF-I no
varían su concentración por efecto de la temperatura mientras que
otros agentes como las inmunoglobulinas G y M (IgG e IgM) presentan
un 9% y un 13% de disminución respectivamente en sus valores.
También se ha comprobado que el factor D del complemento desaparece
totalmente cuando el sobrenadante es sometido a tratamiento técnico.
Se pueden observar ejemplos de estos resultados en las siguientes
figuras. Así, la Figura 2 muestra los niveles de
PDGF-AB en los sobrenadantes de tres donantes, antes
y después de realizar sobre dichos sobrenadantes un tratamiento
térmico de acuerdo con la invención. Como puede observarse, dichos
niveles se mantienen prácticamente constantes (en el primer
sobrenadante descienden ligeramente, en el segundo se mantienen
constantes y en el tercero aumentan ligeramente). Por otro lado, la
Figura 3 muestra los niveles del factor D del complemento en los
sobrenadantes de tres donantes, antes y después de realizar sobre
dichos sobrenadantes un tratamiento térmico de acuerdo con la
invención. Como puede observarse, en los sobrenadantes líquidos
iniciales existe una presencia de factor D mientras que en los
sobrenadantes tratados térmicamente no se detecta presencia alguna
del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado en esta descripción, el
proceso de liofilización realizado por la presente invención permite
conservar las propiedades biológicas del sobrenadante, es decir, que
la composición seca final presente sustancialmente las mismas
propiedades que el sobrenadante líquido inicial.
Durante la experimentación, se ha analizado el
efecto del proceso de liofilización del sobrenadante de plasma sobre
la proliferación de fibroblastos conjuntivales y keratocitos. Los
resultados del análisis muestran que dicho tratamiento no afecta al
crecimiento de dichos tipos celulares en ninguno de los tres
sobrenadantes (de respectivos tres donantes) estudiados. Por
ejemplo, en la Figura 4, que muestra el número de fibroblastos por
centímetro cuadrado en tres córneas tratadas con sobrenadante de
plasma líquido convencional, no sometido a tratamiento térmico, y
con sobrenadante tratado térmicamente según la invención, se observa
que la presencia de fibroblastos se mantiene relativamente constante
(en el primer sobrenadante descienden ligeramente, en el segundo
aumentan ligeramente y en el tercero descienden ligeramente).
También se han analizado los niveles de factores
de crecimiento presentes en los sobrenadantes líquidos
convencionales y en sobrenadantes liofilizados según la invención.
Se ha comprobado que los niveles de factores de crecimiento
analizados no varían tras el proceso de liofilización, tanto el caso
de los factores plaquetarios como TGF-\beta1,
PDGF-AB, VEGF y EGF como en caso de factores
plasmáticos como IGF-1 o factor D del complemento. A
modo de ejemplo, la Figura 5 muestra la concentración de factores de
crecimiento PDGF-AB y TGF-\beta1
en un sobrenadante sin liofilizar y sin tratar térmicamente y en un
sobrenadante liofilizado y tratado térmicamente según la invención;
en ella se observa cómo la concentración de los primeros aumenta
ligeramente, mientras que la concentración de los segundos disminuye
ligeramente, siendo la concentración de ambos en el producto final
(sobrenadante liofilizado) en cualquier caso elevada. En la Figura 6
se muestran, análogamente, la concentración de factores de
crecimiento VEGF y EGF en un sobrenadante sin liofilizar y sin
tratar térmicamente y en un sobrenadante liofilizado y tratado
térmicamente según la invención; en ella se observa cómo la
concentración de ambos disminuye ligeramente, aunque se mantiene en
valores elevados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha estudiado también si la filtración del
sobrenadante pudiera conllevar algún efecto biológico indeseado en
el mismo, o si por el contrario no afecta a sus propiedades
biológicas.
Pues bien, los resultados obtenidos de los
estudios in vitro muestran que el proceso de filtración del
sobrenadante no modifica el efecto biológico que ejerce sobre la
proliferación de células fíbroblásticas y epiteliales de córnea y
conjuntiva (fibroblastos conjuntivales, keratocitos y epiteliales
corneales).
Por ejemplo, la Figura 7 muestra la cantidad de
fibroblastos conjuntivales contenida por centímetro cuadrado en tres
sobrenadantes líquidos, antes y después de realizar un filtrado de
los sobrenadantes. Como puede observarse, la proliferación de
fibroblastos conjuntivales en el sobrenadante filtrado es similar a
la proliferación en el sobrenadante no filtrado.
Por su parte, los niveles de factores de
crecimiento medidos en los sobrenadantes filtrados y no filtrados
son muy similares para los tres sobrenadantes analizados
(provenientes, como en todos los casos, de tres donantes
diferentes). La Figura 8 muestra las concentraciones del factor de
crecimiento TGF-\beta1 en los sobrenadantes
filtrados y sin filtrar, pudiendo comprobarse que dichas
concentraciones no varían de forma importante por el hecho de
filtrarse los sobrenadantes. Este hecho no se produce solamente en
el caso de los factores de crecimiento contenidos en los gránulos
alfa de las plaquetas (por ejemplo TGF-\beta1,
PDGF-AB, VEGF, EGF o TSP-1), sino
que también se produce en el caso de factores de crecimiento
presentes en el plasma como IGF-I (factor de
crecimiento derivado de insulina tipo I) o la endostatina. La Figura
9 muestra, en este sentido, la concentración de factor de
crecimiento IGF-I en el sobrenadante de tres
donantes, antes y después de realizar un filtrado. Como puede
observarse, el nivel de IGF-I se mantiene
prácticamente constante en los tres casos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 10 muestra una gráfica de la
proliferación de células primarias procedentes de keratocitos
corneales humanos (HCK) tras 72 horas de tratamiento con un
sobrenadante de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)
convencional y con un sobrenadante de plasma rico en factores de
crecimiento (PRGF) filtrado, tratado térmicamente y liofilizado
según la invención, el cual posteriormente ha sido
re-suspendido. Como puede observarse, el número de
células primarias es ligeramente mayor en el caso del sobrenadante
obtenido según el procedimiento de la presente invención.
La Figura 11 muestra una gráfica de la
proliferación de células primarias procedentes de fibroblastos
conjuntivales humanos corneales humanos (HCF) tras 72 horas de
tratamiento con un sobrenadante de plasma rico en factores de
crecimiento (PRGF) convencional y con un sobrenadante de plasma rico
en factores de crecimiento (PRGF) filtrado, tratado térmicamente y
liofilizado según la invención, el cual posteriormente ha sido
re-suspendido. Al igual que en la gráfica anterior,
el número de células primarias es ligeramente mayor en el caso del
sobrenadante obtenido según el procedimiento de la presente
invención.
La Figura 12 muestra el efecto de la aplicación
de un sobrenadante de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)
convencional y de un sobrenadante de plasma rico en factores de
crecimiento (PRGF) filtrado, tratado térmicamente y liofilizado
según la invención, el cual posteriormente ha sido
re-suspendido, sobre la migración del cultivo de
células primarias de keratocitos corneales humanos (HCK). Como puede
observarse, el número de células primarias es sólo ligeramente mayor
en el caso de utilizarse como medio de cultivo un sobrenadante
convencional.
La Figura 13 muestra el efecto de la aplicación
de un sobrenadante de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)
convencional y de un sobrenadante de plasma rico en factores de
crecimiento (PRGF) filtrado, tratado térmicamente y liofilizado
según la invención, el cual posteriormente ha sido
re-suspendido, sobre la migración del cultivo de
células primarias de fibroblastos conjuntivales humanos (HCF) tras
realizar una incubación de células durante 24 horas. El
comportamiento en ambos casos es, como puede comprobarse, muy
similar, aunque es ligeramente mejor en el caso del sobrenadante
obtenido según la invención.
\newpage
En resumen, tras analizarse todas las gráficas
con resultados experimentales, puede concluirse que el
comportamiento y las propiedades la composición final
re-suspendida son muy similares (con ligeras
variaciones irrelevantes) a los del sobrenadante de aplicación
inmediata convencional. Por lo tanto, se puede concluir que el hecho
de filtrar, tratar térmicamente y liofilizar un sobrenadante húmedo
para obtener un producto seco re-suspendible no
afecta a las propiedades del producto y, por otra parte, proporciona
las numerosas ventajas enumeradas en el presente documento.
Claims (20)
1. Procedimiento de obtención de una composición
que contiene factores de crecimiento, que comprende las fases
de:
- a)
- disponer de un compuesto sanguíneo que contiene factores de crecimiento, liberados o sin liberar,
- b)
- aplicar un tratamiento térmico al compuesto sanguíneo, en el cual el compuesto sanguíneo se somete a una temperatura entre 50 y 60ºC durante un tiempo entre 20 y 70 minutos,
- c)
- liofilizar el compuesto sanguíneo,
donde los pasos de aplicar un tratamiento
térmico al compuesto sanguíneo y de liofilizar el compuesto
sanguíneo se realizan en orden indistinto.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, que
se caracteriza por que la liofilización del compuesto
sanguíneo se realiza sin la adición de coadyuvantes.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, que
se caracteriza por que el paso de aplicar un tratamiento
térmico al compuesto sanguíneo se realiza antes del paso de
liofilizar el compuesto sanguíneo.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, que
se caracteriza por que: el compuesto sanguíneo se somete a
una temperatura de 56ºC durante un tiempo entre 30 y 60 minutos.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, que
se caracteriza por que el paso de liofilizar comprende los
pasos de:
- -
- congelar el compuesto sanguíneo a una temperatura menor que 0ºC durante un tiempo igual o superior a 1 minuto,
- -
- realizar un secado primario del compuesto sanguíneo a una temperatura menor o igual a 0ºC y a alto vacío, durante un tiempo igual o superior a 1 minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, que
se caracteriza por que:
- -
- la congelación del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura entre -60 y -40ºC durante un tiempo superior a 1 hora,
- -
- el secado primario del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura entre -60 y -40ºC y a una presión entre 0,05 y 0,15 mBar.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento, según la reivindicación 6, que
se caracteriza por que:
- -
- la congelación del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura de -50ºC durante un tiempo superior a 2 horas,
- -
- el secado primario del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura de -50ºC y a una presión de 0,1 mBar.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento, según la reivindicación 5, que
se caracteriza por que el paso de liofilizar comprende el
paso adicional de:
- -
- realizar un secado secundario del compuesto sanguíneo a una temperatura mayor o igual a 0ºC y a alto vacío, durante un tiempo igual o superior a 1 minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, que
se caracteriza por que:
- -
- el secado secundario del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura entre +15 y +25ºC y a una presión entre 0,05 y 0,15 mBar.
\newpage
10. Procedimiento, según la reivindicación 9,
que se caracteriza por que:
- -
- el secado secundario del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura de +20ºC y a una presión de 0,1 mBar.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento, según la reivindicación 8,
que se caracteriza por que comprende el paso adicional
de:
- -
- realizar un secado terciario del compuesto sanguíneo a una temperatura mayor o igual a 0ºC y a alto vacío, durante un tiempo igual o superior a 1 minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento, según la reivindicación 11,
que se caracteriza por que:
- -
- el secado terciario del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura entre +15 y +25ºC y en vacío total.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento, según la reivindicación 12,
que se caracteriza por que:
- -
- el secado terciario del compuesto sanguíneo se realiza a una temperatura de +20ºC y en vacío total.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Procedimiento, según la reivindicación 1,
que se caracteriza por que comprende el paso adicional de
filtrar el compuesto sanguíneo, el cual se realiza antes de la
liofilización.
15. Procedimiento, según la reivindicación 1,
que se caracteriza por que el compuesto sanguíneo que
contiene factores de crecimiento es un sobrenadante de plasma
sanguíneo.
16. Procedimiento, según la reivindicación 1,
que se caracteriza por que el compuesto sanguíneo que
contiene factores de crecimiento es un gel de plasma sanguíneo.
17. Procedimiento, según la reivindicación 1,
que se caracteriza por que el compuesto sanguíneo que
contiene factores de crecimiento es un suero sanguíneo.
18. Procedimiento, según la reivindicación 1,
que se caracteriza por que el compuesto sanguíneo no
comprende ningún componente celular hemático.
19. Procedimiento, según la reivindicación 1,
que se caracteriza por que el compuesto sanguíneo comprende
algún componente celular hemático.
20. Composición que contiene factores de
crecimiento, obtenible según el procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19.
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