ES2370535T3

ES2370535T3 - Antagonista de poli-tlr.

Info

Publication number: ES2370535T3
Application number: ES07825710T
Authority: ES
Inventors: Indravadan Ambalal Modi; Bakulesh Mafatial Khamar
Original assignee: Cadila Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Cadila Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2006-11-23
Filing date: 2007-11-21
Publication date: 2011-12-19
Anticipated expiration: 2027-11-21
Also published as: GB2450580B; EA023046B1; ATE524972T1; JP2010510303A; EP2096914A2; GB2464231A; CA2670124A1; WO2008062288A8; WO2008062288A2; EP2096914A4; US20100062026A1; US8333978B2; CA2670124C; WO2008062288A3; JP5358450B2; EP2359837A1; AU2007323134A1; AP2009004881A0; EP2096914B1; ZA200903523B

Abstract

Mycobacteium w para su utilización en el tratamiento de la septicemia.

Description

Antagonista de poli-TLR

Campo de la invención

La presente invención proporciona Mycobacterium w para su utilización en el tratamiento de la septicemia.

Antecedentes de la invención

La presente invención proporciona antagonista de poli receptores tipo Toll (TLR). Los receptores de tipo Toll (TLR) son familias de proteínas. El sistema inmunitario innato reconoce patógenos e inicia una respuesta eficaz y apropiada mediante los TLR. Los TLR son parte de la superfamilia IL-IR/TLR mayor, que incluye las IL-IR, las IL 18R, y un grupo de receptores huérfanos. La familia está definida por la presencia de un dominio citoplásmico, con resistencia a IL-1 tipo Toll (TIR) que es responsable de mediar en la señalización aguas abajo. Hasta ahora, se han identificado 13 TLR; los TLR 1 a 9 son comunes para ratón y especie humana, mientras que TLR10 es sólo funcional en los seres humanos, y TLR 11, 12 y 13 sólo se han encontrado en ratones. A muchos de estos receptores pero no a todos se les ha asignado una función en la detección inicial de, y la respuesta a, moléculas asociadas a patógenos específicos (MAP).

En los macrófagos y neutrófilos, esto conduce a respuestas inmunitarias innatas, tales como la inflamación y la inducción de la actividad microbicida, mientras que la activación de los TLR expresados en los dendrocitos conduce a la iniciación de la inmunidad adaptativa mediante la inducción de IL-12 y moléculas co-estimuladoras.

Aunque los TLR son parte del sistema de protección del cuerpo, su sobreexpresión se asocia a una variedad de enfermedades. La septicemia es una de esas enfermedades. La incidencia de septicemia debida a infección en los Estados Unidos se ha estimado en aproximadamente 750.000 casos al año, con una tasa media de mortalidad de alrededor del 30% (Angus et al., Crit. Care Med . vol. 29, (2001), págs. 1303 a 1310). Endotoxina, o lipopolisacárido (LPS), que es un componente importante de la pared celular de bacterias gram-negativas, es el agente etiológico de la septicemia gram-negativa. La endotoxina provoca una respuesta inmunitaria innata, principalmente mediante el receptor 4 tipo Toll (TLR4) (Medzhitov et al., Nature vol. 388 (6640), (1997), págs. 394-397) en hospedadores infectados, mediante la cual el cuerpo es advertido de la infección bacteriana, lo que conduce a un ataque antimicrobiano por el sistema inmunitario del hospedador. Dicha respuesta inmunitaria suele ser beneficiosa para los hospedadores infectados, sin embargo, una respuesta inmunitaria abrumadora a la endotoxina puede ser patológica, lo que conduce al síndrome de respuesta inflamatoria generalizada (SIRS), insuficiencia orgánica, varias septicemias y, posiblemente, al choque séptico y la muerte. Los síntomas de estas enfermedades incluyen fiebre, inflamación generalizada, y las enfermedades más graves, tales como la coagulación intravascular diseminada (CID), hipotensión, insuficiencia renal aguda, síndrome de disnea respiratoria aguda (SDRA), la destrucción hepatocelular y la insuficiencia cardíaca.

Los receptores tipo Toll expresados por LPS incluyen TLR 2, 9, otros, además de TLR4. Mientras que la propia endotoxina es una molécula muy heterogénea, la expresión de muchas de las propiedades tóxicas de la endotoxina se atribuye a la fracción de lípido A hidrófobo muy conservado. Un fármaco eficaz que actúa como antagonista del TLR4, y que es un antagonista para esta estructura conservada del lípido A, se conoce como E5564 (también conocido como compuesto 1287, SGEA y Eriforán) (Mullarkey et al., J. Exp Pharmacol. Ther. 304 (3): 1193-1102, 2003). Este fármaco se describe como compuesto 1 en la Pat. de EE.UU. nº 5.681.824, WO/2004/071465 (Procedimientos y kits para su utilización en el diagnóstico y el tratamiento de la endotoxinemia) describe un procedimiento para determinar si un paciente podría beneficiarse o seguir beneficiándose del tratamiento con un antagonista receptor 4 tipo Toll (TLR4). También se sabe que la inhibición del receptor 4 tipo Toll con eritorán atenúa la isquemia de miocardio con lesión por reperfusión. Circulation 114 (Supl. 1), (2006), págs. 1270-4

Las demás enfermedades en las que se sobreexpresan uno o más TLR incluyen, pero no se limitan a las siguientes:

1.: Empeoramiento de infecciones virales latentes o activas (por ejemplo, la infección por VIH, citomegalovirus, herpes simple y virus de la gripe),

2.: Predisposición innata o adquirida a la infección pulmonar bacteriana,

3.: Insuficiencia cardíaca congestiva con edema pulmonar,

4.: Neumonía obstructiva crónica

5.: Mieloma múltiple

6.: Lupus eritematoso diseminado (LED)

7.: Lupus

8.: Colitis ulcerosa

9.: Enfermedad de Crohn

10.: Enfermedades autoinmunitarias

11.: Enfermedades reumáticas

5 12. Hepatitis crónica

13.: Paludismo (P. falciparum)

14.: Esclerosis múltiple

15.: Neuritis óptica

16. Encefalitis vírica (virus del Nilo occidental) 10 17. Candidiasis

18. Aterosclerosis

Algunos de estos trastornos son susceptibles a la terapia convencional, mientras que no existe un tratamiento definitivo para la mayoría de las enfermedades.

Terapias complementarias antibacterianas, antinflamatorias e inmunomoduladoras seleccionadas, investigadas en 15 pacientes con septicemia grave y choque séptico.

Tipo de terapia Objetivo (s) Agentes

Neutralización de toxinas Endotoxina Anticuerpos antiendotoxina, anticuerpos antimicrobianas lípido A, análogos de lipopolisacáridos, eliminación de lipopolisacáridos

Fármacos inmunomoduladores, Mediadores inflamatorios Corticosteroides en altas dosis, antinflamatorios e inespecíficos múltiples e inmunitarios corticosteroides en bajas dosis, pentoxifilina, inmunoglobulinas, interferón gamma

Inhibición de mediadores Citocinas pro-inflamatorias: Anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral, específicos Factor de necrosis tumoral receptores solubles del factor de necrosis tumoral, antagonista receptor de interleucinaInterleucina-1 1,

Componentes fosfolipídicos: Inhibidor de la fosfolipasa A2 Fosfolipasa A2 Ibuprofeno Ciclooxigenasa Dazoxibeno, cetoconazol Tromboxano Antagonistas del factor activador de plaquetas Factor activador de plaquetas Factor activador de plaquetas

Acetilhidrolasa

Radicales libres de oxígeno N-acetilcisteína, selenio

Óxido nítrico N-metil-L-arginina

Bradicinina Antagonista de la bradicinina

Corrección de la coagulopatía en Antitrombina III, inhibidor de la Proteína C activada cascada de coagulación ruta del factor tisular

A pesar de todas estas morbilidades asociadas a la septicemia no se ha reducido. Por lo tanto hay necesidad de proporcionar mejores opciones terapéuticas para estas enfermedades.

Mycobacterium w es una micobacteria no patógena, cultivable, atípica, con propiedades bioquímicas y características de crecimiento rápido parecidas a las que pertenecen al grupo Runyons clase IV de Mycobacterium. Se ha descubierto que comparte antígenos con Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis. Se ha observado que proporciona profilaxis contra la lepra en seres humanos convirtiendo individuos negativos a la lepromina en positividad a la lepromina. Se ha observado que proporciona profilaxis contra la tuberculosis en los animales. En la lepra se observa también que reduce la duración de la terapia de destrucción bacteriana, la depuración, así como el cuidado clínico cuando se utiliza junto con la multiterapia. La composición farmacéutica que contiene Mycobacterium W está aprobada para uso humano desde 1998 en la India.

Esto se ha descrito en varias patentes y publicaciones. Mycobacterium w destruida térmicamente está disponible como preparación comercial en la India. Contiene 0,5 x 10 9 células destruidas térmicamente de Mycobacterium w por 0,1 ml de composición farmacéutica.

Objeto de la invención

Es deseable reducir la actividad inducida por TLR utilizando Mycobacterium w o sus componentes.

Es deseable proporcionar actividad antagonista de poliTLR de mycobacterium o sus componentes cuando es inducida por agonistas sintéticos de TLR conocidos como CPG, ODN o de origen natural como lipopolisacáridos.

Es deseable proporcionar actividad de antagonistas de mycobacterium w y sus componentes a efectos de los ligandos de TLR, como lipopolisacáridos, E. coli, etc.

Otro objeto de la invención consiste en proporcionar utilidad de Mycobacterium w para su utilización en el tratamiento de la septicemia.

También se da a conocer Mycobacterium w o sus componentes en el tratamiento de enfermedades como el mieloma múltiple, el paludismo, la esclerosis múltiple, la neuritis óptica, la neumonía obstructiva crónica para mejorar la morbilidad y la mortalidad asociada a ellos.

Breve descripción de los dibujos

Figura. 1: Efecto de Mycobacterium w sobre TLR inducido por LPS

Figura. 2: Efecto de Mycobacterium w sobre el ligando poli TLR en TLR inducidas

Figura. 3: Efecto de Mycobacterium w sobre el ligando LPS en fiebre provocada (prueba d e pirógeno)

Figura. 4: Efecto de Mycobacterium w que contiene la composición de la septicemia provocada

por E. coli (intraperitoneal + alta dosis de antibiótico)

Figura. 5 Efecto de Mycobacterium w que contiene la composición de la septicemia inducida por E. coli (intraperitoneal + baja dosis de antibiótico)

Figura. 6 Efecto de Mycobacterium w que contiene la composición de la septicemia inducida por E. coli (vía intravenosa)

Descripción detallada de la invención

Las composiciones farmacéuticas que contienen Mycobacterium w y/o sus componentes se sabe que proporcionan respuesta Th1. También son conocidas por compartir antígenos con Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis. Encuentran utilidad en el tratamiento de la lepra para mejorar la destrucción de organismos y su eliminación del cuerpo dando como resultado una curación más rápida. Se ha encontrado útil como profilaxis contra la tuberculosis y también la lepra.

Sorprendentemente, se observa que también poseen propiedades únicas de reducción de la actividad de TLR. Su efecto inhibidor/antagonista es visto por lo menos agonista TLR 3, 4, 5, 6, 9. La reducción en la actividad de TLR se observa cuando las TLR se expresan a través de gran variedad de ligandos TLR in vitro así como in vivo. También se encuentra útil en el tratamiento de enfermedades provocadas por ligandos de TLR, como por ejemplo, lipopolisacáridos (citocinas y pyroxia). También se encuentra útil en el tratamiento de enfermedades en las que se sobreexpresan en varios receptores tipo Toll p. ej. en la septicemia, el mieloma múltiple, el paludismo, la esclerosis múltiple, neuritis óptica, neumonía obstructiva crónica, etc.

Por consiguiente, la invención proporciona Mycobacterium w para su utilización en el tratamiento de la septicemia.

La invención se ilustra por medio de los siguientes ejemplos, sin limitar el alcance de la invención.

I. De acuerdo con la invención, la composición de una composición farmacéutica, el método de preparación, características HPLC, su seguridad y tolerancia, los métodos de utilización y los resultados de los tratamientos se describen en los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la presente invención y el alcance de la presente invención no debe estar limitada por ellos.

Ejemplo 1

Las composiciones farmacéuticas: 5 A. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene:

Mycobacterium W., (destruidas térmicamente) 9 0,50 x 10 Cloruro de sodio IP 0,90% p/v Tween 80 0,1% p/v Tiomerosal IP 0,01% p/v (como conservante) Agua para inyectables IP c.s.p. 0,1 ml

B. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene:

Mycobacterium w., (destruidas térmicamente) 9 0,50 x 10 Cloruro de sodio IP 0,90% p/v Triton x 100 0,1% p/v Tiomerosal IP 0,01% p/v (como conservante) Agua para inyectables IP c.s.p. 0,1 ml

10 C. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene:

Mycobacterium w., (destruidas térmicamente) 9 0,50 x 10 Cloruro de sodio IP 0,90% p/v Tiomerosal IP 0,01% p/v (como conservante) Agua para inyectables IP c.s.p. 0,1 ml

D. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene:

Extracto de Mycobacterium w después del tratamiento con ultrasonidos de 1 × 10 Mycobacterium w Cloruro de sodio IP 0,90% p/v Tiomerosal IP 0,01% p/v (como conservante) Agua para inyectables IP c.s.p. 0,1 ml

E. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene: Extracto de metanol de 1 × 1010 de Mycobacterium w

Cloruro de sodio IP 0,90% p/v

Tiomerosal IP 0,01% p/v (como conservante) Agua para inyectables IP c.s.p. 0,1 ml

F. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene: Extracto de cloroformo 1 × 1010 de Mycobacterium w

Cloruro de sodio IP 0,90% p/v Tiomerosal IP 0,01% p/v (como conservante) Agua para inyectables IP c.s.p. 0,1 ml

5 G. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene: Extracto de acetona de 1 × 1010 de Mycobacterium w:

H. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene: 10 Extracto en etanol de 1 × 1010 de Mycobacterium w

I. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene: Extracto de Liticasa de 1 × 1010 de Mycobacterium w

J. Cada dosis de 0,1 ml de agente terapéutico contiene: 0,5 x 107 de Mycobacterium w (destruida térmicamente) Extracto de Mycobacterium w obtenido de 1 × 103 de Mycobacterium w por destrucción, extracción con disolventes o

20 extracción enzimática.

Cloruro de sodio IP 0,90% p/v

Thiomerosal IP 0,01% p/v (como conservante)

Agua para inyectables IP c.s.p. 0,1 ml

Ejemplo 2

Procedimiento de preparación de una composición farmacéutica:

A. Cultivo de Mycobacterium w.

i) Preparación del medio de cultivo.

Mycobacterium w se cultiva en medio sólido como medio de LJ o medio líquido como el medio Middlebrook o medio líquido de Sauton.

Para un mejor rendimiento se enriquece el medio Middlebrook. Puede enriquecerse preferentemente mediante adición de glucosa, bactotriptona y BSA. Se utilizan preferentemente en una proporción de 20:30:2. El medio de enriquecimiento se añade al medio Middlebrook. Se lleva a cabo preferentemente en proporción de 15:1 a 25:1 con mayor preferencia en proporción de 20:1.

ii) Operación en biorreactor

a) Preparación del recipiente:

Las partes en contacto internas del recipiente (juntas, sellos mecánicos, acanaladuras para anillo en o/empaque etc.) deben limpiarse de manera apropiada para evitar cualquier contaminación. Se llena el recipiente con NaOH 0,1 N y se deja como tal durante 24 horas para retirar los materiales pirógenos y otros contaminantes. El recipiente se limpia primero con agua acidulada, luego con agua corriente. Por último, se enjuaga el recipiente con agua destilada (3 veces) antes de preparar el medio.

b) Esterilización del biorreactor

El biorreactor que contiene 9 l de agua destilada se esteriliza con vapor recalentado (indirecto). Asimismo, el biorreactor se esteriliza una vez más con medio Middlebrook. Las demás botellas de adición, entrada/salida de los filtros de aire, etc. se esterilizan en autoclave (dos veces) a 121°C durante 15 minutos. Antes de su utilización, estos se secan a 50°C. en la estufa.

c) Parámetros del medio

i. Temperatura: 37 ± 0,5°C.

ii. pH: 6,7 a 6,8 inicialmente.

B. Recolección y concentración

Por lo general se realiza al final del 6º día después de cultivar en condiciones asépticas. La concentración de células (paletización) se hace por centrifugación.

C. Lavado de las células

La paleta así obtenida se lava un mínimo de tres veces con solución salina normal. Se pueden lavar con cualquier otro líquido que sea preferentemente isotónico.

D. Se agrega vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se añade a la paleta solución salina normal sin pirógenos. Puede utilizarse cualquier otro líquido isotónico sin pirógenos como vehículo farmacéutico. El vehículo se añade en cantidad para obtener la concentración deseada de sustancia activa en la forma final.

E. Adición de conservantes

Para mantener el producto exento de otras bacterias contaminantes para su periodo de conservación, se añade conservante. El conservante preferido es tiomesol que se utiliza en la concentración final de 0,01% p/v.

F. Esterilización terminal

La esterilización terminal se puede hacer por varios métodos físicos, como la aplicación de calor o radiación ionizante o filtración estéril.

El calor puede ser en forma de calor seco o calor húmedo. También puede ser en forma de ebullición o pasteurización. Las radiaciones ionizantes pueden ser rayos ultravioleta, gamma o microondas o cualquier otra forma de radiación ionizante. Es preferible esterilizar al autoclave el producto final. Esto se puede hacer antes o después de llenar en un envase final.

G. Control de Calidad

i. Se evalúa en el material la pureza y esterilidad.

ii. Se comprueba la solidez al ácido en los organismos después de la tinción de Gram.

iii. Prueba de inactivación: Ésta se hace cultivando el producto en medio LJ para descubrir cualquier organismo vivo.

iv. Poder patógeno y/o la contaminación con patógenos.

Los organismos cultivados se infectan a ratones Balb/c.

Ninguno de los ratones debe morir y todos deben permanecer sanos y con ganancia de peso. No debe haber ninguna lesión macroscópica o microscópica apreciada en el hígado, bazo, pulmón o cualquier otro órgano cuando se sacrifican los animales hasta 8 semanas después del tratamiento.

v. Ensayo bioquímico:

Se somete el organismo a los siguientes ensayos bioquímicos: a) Ureasa b) Hidrólisis con Tween 80 c) Ensayo de niacina d) Ensayo de reducción de nitratos

El organismo da resultados negativos en ureasa, hidrólisis con Tween 80 y ensayo de niacina. Es positivo por el ensayo de reducción de nitratos.

H. Preparación de los constituyentes de Mycobacterium w. Los constituyentes de Mycobacterium w se puede preparar para la invención por:

I. Rotura celular

II. Extracción con disolventes

III. Extracción enzimática.

La rotura celular se puede hacer por medio de ultrasonidos o la utilización de fraccionómetro de alta presión o mediante la aplicación del ingrediente de presión osmótica.

La extracción con disolvente se puede hacer con cualquier disolvente orgánico como cloroformo, etanol, metanol, acetona, fenol, alcohol isopropílico, ácido acético, urea, hexano, etc.

La extracción enzimática se puede hacer con enzimas que pueden digerir la pared celular/membranas. Por lo general son de naturaleza proteolítica. Las enzimas liticasa y pronasa son las enzimas preferidas. A los efectos de la invención pueden utilizarse los componentes celulares de Mycobacterium w solos en lugar de organismos de Mycobacterium w o pueden añadirse al producto que contiene Mycobacterium w.

Además los componentes celulares dan como resultado una mayor eficacia del producto.

En todos los ejemplos Mycobacterium w se utilizan tal como se describe en el ejemplo 1 c, que contiene 0,50 x 109 por 0,1 ml de Mycobacterium w destruida térmicamente.

II. Ejemplos que demuestran la reducción en TLR inducido utilizando composiciones farmacéuticas comprende Mw.

Ejemplo 1

La estimulación de TLR se prueba evaluando la activación de NF-K� en las células HEK293 que expresan un TLR dado. La actividad antagonista de la composición farmacéutica que contiene 0,5 x 109 células de Mycobacterium w destruida térmicamente en 0,1 ml de solución salina normal se prueba en TLR humanos: 2, 3, 4, 5, 7, 8 y 9. Ligandos de TLR utilizados en el estudio: hTLR2: HKLM (Listeria monocytogenes destruida térmicamente) a 2 x 107, 1 x 107, 2 x 106 y 1 x 106 células/ml hTLR3: Poli(I:C) a 20 y 10 ng/ml hTLR4: lípido por LPS de E. coli K12 a 2 y 1 ng/ml hTLR5: Flagelina de S. typhimurium a 20 y 10 ng/ml hTLR7: Loxoribina a 1 y 0,5 mM hTLR8: ssRNA40 a 5 y 3 1g/ml hTLR9: CpG ODN 2006, a 50 y 20 ng/ml

Procedimiento General

El indicador de fosfatasa alcalina secretada está bajo el control de un activador inducible por el factor de transcripción NF-KB.La estimulación de TLR en la detección se prueba evaluando la activación de NF-kB en las células HEK293 que expresan una TLR dada. Este gen indicador permite el seguimiento de la señalización a través de la TLR, basándose en la activación de NF-KB.En una placa de 96 pocillos (200 1l de volumen total) que contiene las células HEK293 adecuadas (25.000-50.000 células/pocillo), se añaden 201l de Mycobacterium w así como los ligandos de TLR a los pocillos. El medio añadido a los pocillos se diseña para la detección de la expresión de SEAP inducida por NF-KB.Después de una incubación de 16 a 20 horas para encontrar la actividad de NF-kB inducida por se lee la D.O. a 650 nm en un detector de absorbancia Beckman Coulter AD 340C.

Los resultados se presentan en forma de tabla como se menciona a continuación. Columna (A) demuestra actividad inducida por ligandos de TLR. Columna (B) demuestra una actividad inducida por ligando TLR en presencia de la composición que contiene Mycobacterium w (Mw). La última columna proporciona el % de antagonismo inducido por Mycobacterium w en relación con el ligando TLR solo.

REFERENCIA

REFERENCIA

TLR: POSITIVA (Ligando TLR) (A) POSITIVA+Mw (B) B/A% Antagonismo %

TLR3: 1,881 1,445 76,8% 23,2%

TLR4: 1,207 0,602 49,87% 50,13%

TLR5: 2,227 1,134 50,92% 49,08%

TLR7: 1,503 1,141 74,57% 25,43%

TLR8: 0,591 0,431 72,92% 27,08%

TLR9: 1,979 0,135 0,07% 99,93%

TLR2: 2,21 2,17 98,19% 1,81%

Los descubrimientos sugieren antagonismo de TLR cuando son estimuladas por un ligando TLR para TLR 3, 4, 5, 7, 8, 9. El antagonismo no se observa en TLR2 en este experimento.

Ejemplo 2

Se sacrificaron ratones de 8 a 10 semanas y se aislaron esplenocitos del bazo. Las células del bazo se cultivaron con diferentes concentraciones de LPS y la combinación de LPS con células Mycobacterium w destruidas térmicamente. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640.

Después de 48 horas las células se recogen y se comprueba la expresión de diferentes TLR. La expresión de TLR se comprueba ampliando el ARNm específico del lisado celular (kit Cell-cDNA II, Ambion) utilizando cebadores específicos de TLR (R & D systems).

Los productos ampliados se comprueban en gel de agarosa al 1,5% utilizando tinción de bromuro de etidio.

Se ha observado que la expresión de TLR 3, 4, 5, 6 y 9 se reduce cuando las células están expuestas a Mycobacterium w + LPS en comparación con LPS solo. No se aprecia ningún efecto sobre TLR1. (Figura 1). Así, la composición farmacéutica que contiene Mycobacterium w demuestra la actividad antagonista de inducción inducida por LPS de TLR 3, 4, 5, 6 y 9. No tiene ningún efecto sobre TLR1 inducida por liposoma.

Ejemplo 3

La administración de un ligando poliTLR a ratones da como resultado la expresión de TLR 1, 3, 5, 6, 9 en esplenocitos. Luego se recoge y se analiza 7 días después.

Esplenocitos que expresan TLR 1, 3, 5, 6, 9 cuando son estimulados in vitro durante 48 horas con 0,5 × 105 o más de Mycobacterium w destruida térmicamente, se traduce en ausencia de expresión de TLR 3, 5 y 6. (100% de reducción en la expresión de TLR 3, 5 y 6). Los resultados se demuestran en la figura 2.

Por lo tanto los ejemplos anteriores demuestran la reducción en las TLR inducida por la composición farmacéutica de la presente invención.

III. Ejemplos que demuestran actividad antagonista a efecto de ligandos TLR.

Ejemplo 1

Efecto sobre citocinas inducidas por LPS

Se sacrificaron ratones de 8 a 10 semanas y se aislaron esplenocitos del bazo. Se cultivaron los esplenocitos con diferentes concentraciones de LPS y la combinación de LPS con células de Mycobacterium w destruidas térmicamente. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640.

Se analizaron Superstant en citocinas como TNF-alfa e IFN-gamma.

Los estudios in vitro de Mycobacterium w cuando se utilizan junto con lipopolisacáridos (LPS) reducen FNT/Alfa inducido por LPS y también reducen la secreción de IFN gamma. La cantidad de inhibición observada es significativa y es tan buena como el nivel basal (inhibición completa).

Ejemplo 2

Efecto sobre la fiebre provocada por LPS

Se prepararon conejos para las pruebas de pirógenos y se controló la temperatura. Se administró a los conejos una inyección intravenosa de lisado de E. coli para simular la fiebre provocada por endotoxina/LPS. Dos horas más tarde se dividieron en grupo de referencia y grupo de tratamiento. El grupo de tratamiento recibió una inyección de 2 ml de

la composición farmacéutica que contenía 0,5 x 109 células de Mycobacterium w destruidas térmicamente por 0,1 ml. Los descubrimientos se han reproducido tres veces. Los animales en el grupo tratado mostraban una disminución de la temperatura, mientras que los animales de referencia seguían teniendo aumento de temperatura. El efecto continuado hasta el final del experimento está representado en la figura. 3.

Así, ejemplos anteriores demuestran efecto antagonista a efectos de los ligandos de TLR por la composición farmacéutica que comprende Mw.

IV Ejemplos que demuestran utilidad en enfermedades en las que los TLR son conocidos por sobreexpresarse

(A) Mejor supervivencia en septicemia provocada por E. coli en ratones:

La inyección de E. coli vivas a los ratones por vía parenteral produce septicemia con un 100% de mortalidad. Se evaluó la eficacia de las composiciones farmacéuticas que contienen 0,5 x 109 células de Mycobacterium w (Mw) destruidas térmicamente en este modelo de ratones.

Se administró la suspensión de E. coli a los animales seguida de Mycobacterium w por vía IV o ID en varias combinaciones con y sin dexametasona y amoxicilina. Se observa mayor aumento de supervivencia en los animales tratados con Mycobacterium w junto con los glucocorticoides y la amoxicilina.

Experimento 1 (intraperitoneal)

Se administró a los ratones 1 ml de E. coli vivas (20 D.O.) por vía intraperitoneal. Se trataron los ratones con diferentes combinaciones de terapias de amoxicilina (500 mg) y dexametasona (2,0 mg) (Fig. 2). En cada grupo había 10 animales. En el grupo de referencia todos los animales murieron en 48 horas (Grupo I). Con las intervenciones ha mejorado la supervivencia (Grupo II-VII). Se observó el 100% de supervivencia cuando se combinó dexametasona + amoxicilina con 0,1 ml de Mycobacterium w por vía intradérmica (Grupo IV). Esto fue seguido por los mismos fármacos, pero Mycobacterium w administrada por vía intravenosa (Grupo V). Los resultados se representan gráficamente en la figura. 2.

Experimento 2 (intraperitoneal)

En el segundo experimento la dosis de amoxicilina se redujo de 500 mg/kg a 70 mg/kg (Fig. 3). Una vez más los mejores resultados se observaron con el grupo II de Mycobacterium w administrado por vía intradérmica junto con esteroides y antibióticos seguido del grupo III por vía intravenosa. Los resultados se representan gráficamente en la figura. 3.

La comparación del experimento 1 y 2 pone de manifiesto que la cantidad de antibiótico es importante. Esto es clínicamente relevante dado que la septicemia se trata con dosis masivas de antibióticos y dosis no convencionales utilizadas para el tratamiento de otras infecciones.

Experimento 3 (vía intravenosa)

En el tercer experimento se provocó septicemia por vía intravenosa y los niveles de dexametasona se redujeron a 0,5 mg/kg desde 2 mg/kg. Los resultados sugieren que la combinación de esteroides + antibióticos

+ Mycobacterium w (grupo VII) proporciona una mejor supervivencia. Estos tres experimentos demostraron que la utilización de Mycobacterium w mejora la supervivencia en la septicemia. Los resultados se representan gráficamente en la figura 4.

(B) Modelo P. berghei de paludismo:

La desregulación del sistema inmunitario en el escenario del paludismo de P. Falciparum se sabe que provoca síndromes de pseudo-septicemia. En los animales infectados con una forma fulminante de paludismo ocasionada por la cepa ANKA de P. berghei se observa idéntica situación. En un trabajo preliminar realizado en IISc., Bangalore se observa que la administración de Mycobacterium w + Artether da como resultado el 70% de supervivencia frente al 0% en el grupo de referencia que recibió Artether o placebo sólo. Por lo tanto, Mycobacterium w tiene capacidad para invertir los síndromes pseudosepticémicos ocasionados en las infecciones de paludismo.

Así, los ejemplos anteriores (IV-A y IV-B) demuestran la utilidad de la composición farmacéutica que contiene Mw en las enfermedades en animales en los que se sobreexpresan los TLR.

(C) Septicemia en seres humanos

El principal producto ha demostrado su utilidad en el tratamiento de las enfermedades infecciosas crónicas. También se ha encontrado utilidad en la resolución de los granulomas resistentes a esteroides, derrame pleural, hidroneumotórax, neuritis óptica, etc.

También se ha evaluado en el tratamiento de la septicemia.

Ejemplo 1

Un paciente de 65 años de edad con mieloma refractario se observó que padecía septicemia y se le conectó al respirador durante 6 semanas. Estuvo tomando antibióticos superiores (penems), EPO, GM CSF transfusión diaria de plaquetas para tratamiento. A pesar de éstos, estaba teniendo un curso cuesta abajo con disminución progresiva del recuento de CD4. Se le administraron 0,2 ml de Mycobacterium w por vía intradérmica en dos dosis divididas en el deltoides. A las 48 horas se le retiró el respirador. No necesitó infusión de plaquetas.

Ejemplo 2

Un joven delicado con tuberculosis pulmonar avanzada desarrolló infección bacteriana de pulmón que conduce a septicemia. No estaba respondiendo a la terapia convencional. Se le administró IV 5 ml. de Mycobacterium w durante 5 días.

Esto dio como resultado la curación de la septicemia y la infección lo que condujo al alta hospitalaria. Se observó que era estable sin recaída 6 semanas después. Ambos ejemplos sugieren que Mycobacterium w es útil en el tratamiento de la septicemia en seres humanos.

(D): Neuritis óptica

A paciente de 56 años con neuritis óptica se observó que padecía insuficiencia visual residual después del tratamiento con 1 g diario de metil-prednisolona por vía intravenosa durante 3 días. La visión se mantuvo estable en 6/36 y 6/18, respectivamente, en el ojo derecho e izquierdo respectivamente. Se le administraron 5 ml de Mycobacterium w (preparado como para la invención) en 500 ml de solución salina normal en infusión una vez más por vía intravenosa. La mejora de la visión llegó a 6/12 y 6/9, respectivamente, en el ojo derecho e izquierdo 10 días después del inicio del tratamiento.

(E): Esclerosis múltiple

Una paciente de 28 años de edad tenía parálisis en ambas extremidades inferiores debido a (grado 0 de potencia)esclerosis múltiple. Ésta no respondió a la terapia durante 6 meses. Ella no recibió ninguna otra terapia durante el período.

Se le administraron 2 ml diarios de Mycobacterium w en 100 ml de solución salina normal por vía intravenosa durante tres días. Presentó signos de recuperación cuando se evaluó 15 días después con un grado II de potencia ambas extremidades inferiores.

(F) Neumonía obstructiva crónica

El uso de la composición farmacéutica que contiene Mycobacterium w en el tratamiento de la neumonía obstructiva crónica dio como resultado la disminución de las secreciones, la disminución de la cantidad de infección, la disminución del número de agravamientos que requieren hospitalizaciones según los ejemplos demuestra su efecto sobre el VEF1 y FEM.

Experimento 1

Se administró a pacientes con neumonía obstructiva crónica 0,1 ml de Mycobacterium w por vía intradérmica cada quince días durante 2 meses. Esto dio como resultado una mejoría en el volumen de expiración forzada en un segundo (FEV1) en más del 50% en 5 de los 9 pacientes mejoró en más del 25% en el resto. La mejoría en el flujo expiratorio máximo (FEM) también siguió el mismo patrón.

Experimento 2

A 16 pacientes con neumonía obstructiva crónica se les administraron 0,5 x 109 células de Mycobacterium w destruidas térmicamente por vía intramuscular después de ponerlas en suspensión en 1 ml de solución salina normal.

Después de una sola inyección se observó mejora en FEV1 en 13 de 16 pacientes al ser examinados después de la inyección el día 15 (más del 50% 7, más del 25% 6). Esta mejora alcanzó su máximo en 4 a 6 semanas. Del mismo modo la mejora del FEM se observó en 11 de 16 pacientes.

Experimento 3

En 6 pacientes con neumonía obstructiva crónica 0,5 x 109 células de Mycobacterium w destruidas térmicamente se administraron a la mucosa nasal en aerosol nasal (0,1 ml). La mejoría en el VEF1 en más del 25% se observó en 5 de 6 pacientes consiguiendo en 3 de ellos más del 50% de mejora.

La mejora de la FEM en más del 25% se observó en 4 de 6 pacientes consiguiendo en 2 de ellos alcanzar más del 50% de mejora.

Experimento 4

En diez pacientes con neumonía obstructiva crónica 0,5 x 109 células de Mycobacterium w destruidas térmicamente en suspensión en 3 ml de diluyente se administraron a los pulmones por nebulización como una única administración. Se observó mejoría en los 10 pacientes en el VEF1 (más del 25%).

El efecto parece persistir durante más de 6 semanas. La mejora del FEM fue más del 25% en 8 pacientes, logrando en 4 de ellos más del 50% de mejora.

(G) Mieloma múltiple

Una mujer de 70 años con mieloma se volvió resistente al tratamiento convencional y continuó avanzando la enfermedad. Tenía dolores óseos intensos. El dolor era tan intenso que era incapaz de caminar. Se le administró 0,1 ml de Mycobacterium w por vía intradérmica cada mes. Se logró que remitiera la enfermedad. Después de tres meses de terapia no tenía síntomas y podía caminar con soltura. Su hemoglobina mejoró de 5,5% gm a 7,5% gm.

Así, los ejemplos anteriores (IV-C a IV-G) demuestran efectos positivos de la composición farmacéutica de la presente invención en el tratamiento de las enfermedades en seres humanos en los que se sobreexpresan los TLR.

Los ejemplos (Ejemplo nº II-1 a III-3) ilustran, la actividad antagonista de poli-TLR de Mycobacterium o sus componentes cuando es inducido por agonistas TLR sintéticos conocidos como CPG, ODN o de origen natural como lipopolisacáridos. Los ejemplos (Ejemplo n º II-1 a 11-2) ilustran aún más la actividad de los antagonistas de Mycobacterium w y sus componentes a efectos de los ligandos de TLR, como lipopolisacárido, E -coli , etc. Los ejemplos (Ejemplo nº IV-a, IV-b ) ilustran aún más la utilidad de Mycobacterium w o sus componentes en el manejo de enfermedades en las que se sobreexpresan los TLR. Los ejemplos (Ejemplo nº IV-c, IV-d) ilustran más los efectos positivos de Mycobacterium w o sus componentes en el tratamiento de enfermedades como la septicemia, neuritis óptica, esclerosis múltiple, neumonía obstructiva crónica, mieloma múltiple.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1.

Mycobacteium w para su utilización en el tratamiento de la septicemia.
2.

Utilización de Mycobacteium w en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la septicemia.

I.

E. coli

II.

E. coli + Dexametasona (0,5 ml de 4 mg/ml)

III.

E. coli + Amoxicilina (500 mg/kg)

IV.

E. coli + Dexametasona + Amoxicilina + 0,1 ml de Mycobacterium w ID

V.

E. coli + Dexametasona + Amoxicilina + 0,1 ml de Mycobacterium w IV

VI.

E. coli + Dexametasona + 0,1 ml de Mycobacterium w ID

VII.

E. coli + Dexametasona + 0,1 ml de Mycobacterium w IV

I.

E. coli

II.

E. coli + Dexametasona (2,0 mg) + Amoxicilina (70 mg/kg) + 0,1 ml de Mycobacterium w ID

III.

E. coli + Dexametasona (2,0 mg) + Amoxicilina (70 mg/kg) + 0,1 ml de Mycobacterium w IV

IV.

E. coli + Amoxicilina (70 mg/kg) + 0,1 ml de Mycobacterium w ID

V.

E. coli + Amoxicilina (70 mg/kg) + 0,1 ml de Mycobacterium w IV

I. E. coli

II. E. coli + Dexasona (0,5 mg/kg)

III. E. coli + Dexasona (0,5 mg/kg) + 0,1 ml de Mycobacterium w ID

IV.

E. coli + Amoxicilina (70 mg/kg)

V.

E. coli + Dexasona (0,5 mg/kg) + Amoxicilina (70 mg/kg)

VI. E. coli + Dexasona (0,5 mg/kg) + Amoxicilina (70 mg/kg) + 0,1 ml de Mycobacterium w ID