ES2370816T3 - Secuencia de ácido nucléico y proteina así como polipeptidos que codifican manitol-deshidrogenasas o partes de los mismos así como su producción y uso en diagnostico y terapia. - Google Patents
Secuencia de ácido nucléico y proteina así como polipeptidos que codifican manitol-deshidrogenasas o partes de los mismos así como su producción y uso en diagnostico y terapia. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2370816T3 ES2370816T3 ES03714857T ES03714857T ES2370816T3 ES 2370816 T3 ES2370816 T3 ES 2370816T3 ES 03714857 T ES03714857 T ES 03714857T ES 03714857 T ES03714857 T ES 03714857T ES 2370816 T3 ES2370816 T3 ES 2370816T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- amino acid
- protein
- cladosporium
- herbarum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 title 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 47
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 18
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 10
- 108020000290 Mannitol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 57
- 241001149956 Cladosporium herbarum Species 0.000 claims description 46
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 claims description 24
- 241000222291 Passalora fulva Species 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 101710117857 NADP-dependent mannitol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 101710187165 Probable NADP-dependent mannitol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 101150047731 MTDH gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 4
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229940064394 cladosporium herbarum extract Drugs 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108050001408 Profilin Proteins 0.000 description 1
- 102000011195 Profilin Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000013569 fungal allergen Substances 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 108010007922 mannitol 2-dehydrogenase (NADP) Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01138—Mannitol 2-dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.138)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Vacuna para la desensibilización de pacientes frenta a una alergia por mohos, caracterizada porque contiene por lo menos un polipéptido con por lo menos un epítopo que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 1 o la Secuencia ID Nº 8 o una secuencia seleccionada de la Secuencia ID Nº 4, 5 y 6 o que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 11.
Description
Secuencia de ácido nucleico y proteína así como polipéptidos que codifican manitol-deshidrogenasas o partes de los mismos así como su producción y uso en diagnóstico y terapia
Las más distintas substancias causan en determinadas personas reacciones alérgicas. No son conocidas solo alergias frente a componentes de animales, como por ejemplo pelos de gato, sino también alergias frente a plantas o partes de plantas, como polen de flores. Pero también son conocidas alergias frente a microorganismos, como por ejemplo mohos.
Noeldner y col. [Physiological and Molecular Plant Pathology (1994) pág. 281-289] describen la purificación y caracterización de una manitol-deshidrogenasa del hongo patógeno para los tomates Cladosporium fulvum. Era objetivo de este trabajo aclarar manifiestamente el mecanismo a través del cual los hongos fitopatógenos obtienen y utilizan el carbono de sus células huésped.
Hult y col [Auch. Microbiol. 128 (1980) pág. 253-255] describe la distribución del NADPH que genera el ciclo del manitol bajo distintas especies de hongos. Aquí se trata de un trabajo de investigación básica.
De este estado de la técnica no se desprende indicación alguna anterior por la que los polipétidos reivindicados puedan jugar un papel esencial en enfermedades alérgicas.
Es objeto de la presente invención una vacuna para la desensibilización de pacientes frente a una alergia por mohos así como el uso del alérgeno principal del moho Cladosporium herbarum en diagnóstico y terapia. En el marco de la presente invención se ha establecido que en el caso de este alérgeno principal sorprendentemente se trata de una manitoldeshidrogenasa (MtDH). Otro objeto de la presente invención se refiere a un alérgeno principal de Alternaria alternata.
Se da a conocer un polipéptido que presenta al menos 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 1. La secuencia de aminoácidos está representada en la Fig. 1 al igual que la correspondiente secuencia del ADN. La invención se refiere también a los polipéptidos con las Sec. ID Nº 4, 5 y 6.
Se da a conocer además la secuencia completa de un polipéptido que codifica una manitol-deshidrogenasa. La Sec. ID Nº 7 representa la secuencia del ácido nucleico y la Sec. ID Nº 8 la secuencia de aminoácidos de este. Las secuencias están representadas en la Figura 3.
Además se da a conocer un polipéptido que presenta al menos 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 11. La secuencia de aminoácidos está representada en la Fig. 4., esta representa un alérgeno principal que se aisló de Alternaria alternata.
La secuencia de aminoácidos del alérgeno principal de Alternaria alternata, que se trata de la manitol-deshidrogenasa, está reproducida en la Fig. 5 en código de letras únicas junto con la secuencia de ADN (Secuencia ID Nº 12) que la codifica así como las secuencias de nucleótidos flanqueantes en el extremo 5’ y el 3’.
Un polipéptido presenta al menos un epítopo. Por un epítopo se entiende una zona a la que pueden unirse anticuerpos. Fundamentalmente hay epítopos lineales. En este caso los aminoácidos que forman el epítopo se encuentran unos al lado de otros. Sin embargo son más frecuentes los llamados epítopos conformacionales. Estos se forman por el plegado del polipéptido. De este modo, aminoácidos que no están próximos en la secuencia, debido al plegamiento tridimensional del polipéptido, pueden aproximarse espacialmente y unirse a esta estructura superficial un anticuerpo.
Preferiblemente los epítopos son específicos para un moho. Básicamente pueden producirse anticuerpos contra casi todas las secuencias de aminoácidos usando técnicas adecuadas, por ejemplo usando adyuvantes. Los polipéptidos conforme a la invención juegan sin embargo en el diagnóstico y terapia un papel fundamental. Por consiguiente los polipéptidos presentan preferiblemente epítopos específicos, siendo los epítopos específicos para un moho. Frecuentemente las proteínas o polipéptidos que proceden de un determinado organismo presentan similitudes con una proteína o polipéptido correspondiente que procede de un organismo emparentado. Por consiguiente es posible que anticuerpos que estén dirigidos contra un epítopo de un moho determinado, reaccionen también con un epítopo correspondiente de un moho emparentado.
Cuanto más específico es un epítopo, tanto menos reaccionan anticuerpos dirigidos contra él con un epítopo de un polipéptido homólogo de un organismo emparentado. Los polipéptidos presentan por consiguiente preferiblemente aquellos epítopos que son específicos para un moho. Con especial preferencia los polipéptidos presentan aquellos epítopos que son específicos para un moho del género Cladosporium. Con muy especial preferencia los polipéptidos presentan un epítopo que es específico para Cladosporium herbarum. Los anticuerpos que están dirigidos contra un epítopo de este tipo no reaccionan con otros polipéptidos.
En el marco de la presente invención se ha encontrado que el polipéptido con la secuencia de aminoácidos ID Nº 1 codifica una manitol-deshidrogenasa. Son objeto de la presente invención vacunas con partes de esta secuencia de aminoácidos con al menos 11 aminoácidos. Los polipéptidos conforme a la invención presentan preferiblemente por lo menos 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia con la Secuencia ID Nº.
Preferiblemente son polipéptidos tales que presenten por lo menos 50 aminoácidos consecutivos, y con muy especial preferencia polipéptidos tales que presenten por lo menos 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 1.
La invención se refiere también a una vacuna con pelipéptido de extremo N con la secuencia PGQQATKHESLLDQLS (Sec ID Nº 4) así como dos polipéptidos de extremo C terminal con la secuencia LDTGLSDFWK (Sec ID Nº 5) y MGRDGLAKEL (Sec ID Nº 6).
Es también objeto de la invención una vacuna con un polipéptido con la Secuencia ID Nº 8, así como partes de este polipéptido, que contienen un epítopo. Las partes de la Secuencia ID Nº 8 presentan por lo menos 11, preferiblemente por lo menos 20, todavía más preferiblemente por lo menos 50 y con muy especial preferencia por lo menos 100, aminoácidos consecutivos de la secuencia con la Secuencia ID Nº 8.
Otro objeto de la presente invención se refiere a una vacuna con un polipéptido con la Secuencia ID Nº 11 así como partes de este polipéptido que contienen un epítopo. Tales epítopos son específicos para Alternaria, más precisamente para Alternaria alternata. Las partes de la Secuencia ID Nº 11 presentan por lo menos 11, preferiblemente por lo menos 20, todavía más preferiblemente por lo menos 50 y con muy especial preferencia por lo menos 100, aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 11.
Preferiblemente estos polipéptidos presentan por lo menos un epítopo. Es posible, por ejemplo, detectar mediante determinaciones de hidrofilia/hidrofobia qué partes del polipéptido son especialmente adecuadas para reacciones inmunológicas. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante programas informáticos adecuados.
Como alternativa a esto es también posible producir, usando el llamado método Pepscan, fragmentos de la secuencia y hacer ensayos con ellos por reacción con sueros de pacientes alérgicos si los fragmentos cortos contienen epítopos procedentes. Además, debe aclararse si a este respecto se trata de epítopos que son específicos para un moho, en especial para un moho del género Cladosporium y/o Alternaria y en especial para Cladosporium herbarum y/o Alternaria alternata. Para la determinación se utilizan series de sueros adecuados.
El Cladosporium es un género de hongos que pertenece a los mohos. Las especies de Cladosporium son muy frecuentes y se encuentran preferiblemente en zonas pantanosas, en bosques y en jardines, pues crecen bien sobre plantas putrefactas o sobre follaje. Además, se encuentran en invernaderos y en frigoríficos mal limpiados. También crece el Cladosporium sobre productos textiles, p.ej. tejidos de lino. El Cladosporium puede desencadenar reacciones alérgicas, como p.ej. rinitis fluida, tos, estornudos, urticaria o asma (alergia a los mohos).
La Alternaria es un género de hongos que también pertenece a los hongos. Las especies de Alternaria se encuentran preferiblemente en zonas pantanosas, en bosques y en jardines, pues crecen bien sobre plantas putrefactas o sobre follaje. En el ámbito doméstico se encuentran sobre todo en la harina, frutas y verduras. Pero también crecen sobre productos textiles, p.ej. tejidos de lino. La Alternaria puede desencadenar reacciones alérgicas, como p.ej. rinitis fluida, tos, estornudos, urticaria o asma (alergia a los mohos).
Con el descubrimiento de la secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico es posible, utilizando técnicas recombinantes, producir recombinantemente fragmentos más cortos de la secuencia completa en bacterias, por ejemplo en E. coli o en organismos superiores, por ejemplo células de insectos, levaduras o células eucarióticas. Precisamente también pueden prepararse bien polipéptidos cortos químicamente por síntesis en fase sólida.
La vacuna conforme a la invención puede utilizarse para la desensibilización de pacientes frente a una alergia a mohos. En la desensibilización, pacientes que padecen de una alergia se ponen en contacto con una pequeña cantidad de un antígeno, con lo que deben formarse anticuerpos IgE neutralizantes. Mediante estos anticuerpos neutralizantes se unen los antígenos con los que el paciente ha estado en contacto. De este modo se evita la unión antígeno-anticuerpo de anticuerpos de tipo IgE que desencadenan reacciones alérgicas. Los polipéptidos conforme a la invención pueden utilizarse por consiguiente para la preparación de una vacuna. Para ello pueden incorporarse los polipéptidos producidos recombinantemente o también químicamente en una formulación de vacuna adecuada. La formulación de vacuna puede contener además de los polipéptidos también aditivos y coadyuvantes de formulación habituales, como también adyuvantes (sensibilizantes).
Es otro objeto de la presente invención el uso de un polipéptido para una detección diagnóstica de una enfermedad. En una enfermedad semejante se trata habitualmente de una alergia. Los polipéptidos se utilizan en un sistema de detección diagnóstico adecuado. A este respecto puede tratarse también de un radioinmunoensayo (RIA), o preferiblemente también de un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, enzimoinmunoensayo). La configuración habitual de un ensayo diagnóstico semejante es conocida.
Se dan a conocer también nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la Secuencia ID Nº 2. La secuencia de nucleótidos con la Secuencia ID Nº 2 está representada igualmente en la Figura 1. Se trata a este respecto de una parte del gen para la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium herbarum conforme a la invención.
Se describen además polinucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la Secuencia ID Nº 7 así como partes de esta secuencia de nucleótidos. Mediante esta secuencia de nucleótidos o partes de la misma puede producirse un polipéptido deseado recombinante en células huésped adecuadas.
Se dan a conocer polinucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la Secuencia ID Nº 12. Se trata a este respecto de una secuencia de nucleótidos que codifica la manitol-deshidrogenasa de Alternaria alternata así como secuencias de nucleótidos que están directamente adyacentes a la zona codificante. También se describen partes de esta secuencia de nucleótidos.
Un polinucleótido presenta por lo menos ocho, preferiblemente por lo menos 12, todavía más preferiblemente por lo menos 20 y lo más preferiblemente por lo menos 50, nucleótidos consecutivos. Para algunos campos de aplicación los nucleótidos deben ser más largos, en este caso los polinucleótidos presentan por lo menos 100 nucleótidos consecutivos seleccionados de la Secuencia ID Nº 2, ID Nº 7 o Secuencia ID Nº 12.
Los polinucleótidos pueden servir para la detección de una manitol-deshidrogenasa. Preferiblemente a este respecto se detecta la presencia de un gen codificante de esta manitol-deshidrogenasa de Cladosporium herbarum y/o Alternaria alternata. En el caso de este procedimiento se trata de métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos. Para ello se considera por ejemplo la NASBA (nucleic acid sequence based amplification, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico) o más preferiblemente la reacción en cadena con polimerasa (PCR).
Como se dan a conocer las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium herbarum y/o Alternaria alternata, es posible seleccionar para la amplificación aquellas secuencias de ácidos nucleicos que presenten una elevada homología e incluso identidad. Puede esperarse que al usar tal cebador altamente específico se realice una amplificación también de otras manitol-deshidrogenasas de organismos emparentados, ya que una elevada homología en las secuencias de aminoácidos habla de una fuerte conservación en una región génica semejante.
Para el diagnóstico con ácidos nucleicos es por consiguiente preferible utilizar entonces aquellas regiones que estén fuertemente conservadas si el antígeno debe aislarse no solo de especies de Cladosporium y/o Alternaria sino también de otras especies de mohos.
Las regiones que presentan una pequeña homología entre sí son por consiguiente mejor adecuadas para el diagnóstico fino, o sea para la diferenciación tanto entre especies de Alternaria como también de Cladosporium, como también para la diferenciación fina dentro de Cladosporios o Alternarias. En la Fig. 6 están representadas las regiones codificantes de Cladosporium herbarum y Alternaria alternata. Las secuencias de nucleótidos idénticas están respaldadas en negro e indican regiones conservadas.
Mediante un procedimiento semejante puede detectarse la presencia del moho Cladosporium herbarum y/o Alternaria alternata. Tales aplicaciones no son solo de interés en el diagnóstico médico, sino también en otros campos, por ejemplo de la higiene y de la investigación de alimentos. Debe tenerse en cuenta aquí que el Cladosporium herbarum también puede desarrollarse a temperaturas relativamente bajas de hasta aproximadamente +6ºC, y por consiguiente puede representar en sectores de la tecnología alimentaria una contaminación indeseada. Para la supervisión de alimentos y su control de calidad la detección también de pequeñas cantidades de Cladosporium herbarum puede jugar un papel esencial.
En otro aspecto se da a conocer un procedimiento para la producción de un polipéptido. En primer lugar, usando los polinucleótidos y usando la reacción en cadena con la polimerasa puede amplificarse un gen de un moho, preferiblemente de Cladosporium herbarum o Alternaria alternata. Este polinucleótido puede incorporarse entonces en un vector adecuado con el que se transforma una célula huésped. Los vectores adecuados se multiplican en la célula huésped y de este modo se expresan los polipéptidos. En el caso de las células huésped puede tratarse de células huésped habituales. Se consideran a este respecto células huésped bacterianas como Escherichia coli o Bacillus subtilus o levaduras como por ejemplo Sacharomyces cerevisae o Picha pastoris.
En el marco de la presente invención se ensayaron inmunotransferencias de IgE de extracto bruto de Cladosporium herbarum con 62 sueros de pacientes. De este modo se mostró una proteína inmunoreactiva de peso molecular 29 kD, que fue reconocida por el 61% de los sueros de pacientes. Los pacientes se preseleccionaron con el ensayo de piel o sangre (RAST) y reaccionaron positivamente al extracto de Cladosporium herbarum. Ningún otro alérgeno del extracto de Cladosporium herbarum reaccionó con un porcentaje tan grande de sueros de pacientes. Se parte por consiguiente de que esta proteína es el alérgeno principal del Cladosporium herbarum.
Las proteínas inmunorreactivas dadas a conocer en el marco de la presente invención no representan alérgenos importantes solo para la diagnosis, sino también para la terapia de alérgeno contra mohos, en especial especies de Cladosporium y Alternaria. Dado el caso estos alérgenos junto con otros alérgenos, por ejemplo el Alt a 1 [Unger A. y col. (1999), Clinical testing of recombinant allergens of the mold Alternaria alternata, Int. Arch. Allergy Immunol. 118, 220-221] y enolasas [Simon-Nobbe B. y col. (2000), IgE binding epitopes of enolases, a class of highly conserved fungal allergens, I. Allergy Clin. Immunol. 106, 887-895] se utilizan tanto en diagnóstico como también en terapia.
En la separación bidimensional por electroenfoque isoléctrico y SDS-PAGE se presentó esta proteína de Cladosporium herbarum como una mancha de 29 kD y con el punto isoeléctrico a pH = 5,8.
La proteína se purificó hasta homogeneidad por un procedimiento convencional (Ejemplo 1). El rendimiento fue de 1 mg. La proteína purificada homogénea se ensayó entonces por inmunotransferencia de IgE con una mezcla de seis pacientes y fue fuertemente positiva (Ejemplo 2).
La proteína purificada hasta homogeneidad se secuenció por degradación N-terminal de Edman automatizada y se determinaron las secuencias peptídicas internas tras degradación con CNBr. Las secuencias peptídicas N-terminales e internas tras digestión con tripsina se determinaron por degradación de Edman de aproximadamente 50 !g de proteína, que se obtuvieron por recorte de una mancha de la electroforesis bidimensional.
La Tabla 1 muestra una lista de todas las secuencias peptídicas determinadas. Se ha utilizado el “código de letra única”. Los aminoácidos respaldados en negro en la Tabla 1 pudieron encontrarse en la secuencia de la manitoldeshidrogenasa de Cladosporium fulvum.
Tabla 1
a) Material de partida: Extracto bruto separado mediante SDS-gel
bidimensional
b) Procedimiento de análisis: Secuenciación de Edman
a) Material de partida: Proteína nativa purificada b) Procedimiento de análisis: Secuenciación de Edman
Péptido 1
a) Material de partida: Extracto bruto separado mediante SDS-gel bidimensional b) Procedimiento de análisis: EM/EM c) Observación: solapa con la secuencia N-terminal
Péptido 2
a) Material de partida: Extracto bruto separado mediante SDS-gel bidimensional b) Digestión con tripsina c) Procedimiento de análisis: Secuenciación
a) Material de partida: Extracto bruto separado mediante SDS-gel bidimensional b) Digestión con tripsina
c) Procedimiento de análisis: EM/EM
Péptido 3
a) Material de partida: Extracto bruto separado mediante SDS-gel bidimensional b) Digestión con tripsina c) Procedimiento de análisis: Secuenciación
a) Material de partida: Extracto bruto separado mediante SDS-gel bidimensional b) Digestión con tripsina c) Procedimiento de análisis: EM/EM
5 Péptido 5
a) Material de partida:Proteína nativa purificada b) Digestión con CNBr c) Procedimiento de análisis: Secuenciación
Las secuencias peptídicas se compararon por búsqueda de homologías asistida por ordenador con todas las
10 secuencias de proteínas registradas en los bancos de datos (Swiss-prot, Genbank entre otros). Todos los péptidos mostraron homología con la familia de las manitol-deshidrogenasas. La manitol-deshidrogenasa con la que los péptidos presenta la máxima similitud de secuencia es la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium fulvum. Una purificación de la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium fulvum está descrita en Noeldner y col., Physiological and Molecular Plant Pathology (1994) págs. 281-289. La posición de estos péptidos en la secuencia pueden verse en
15 el “alineamiento” (Tabla 2).
Tabla 2
Número de registro: AAK67 (Sec ID Nº 3) Longitud de la secuencia codificante: 267 aminoácidos (AA) 15 801 pares de bases (pb)
PM: 28,6 kD pI: 6,33
En la Tabla 2 se muestra la disposición de los polipéptidos con las Sec ID Nº 4, 5 y 6 mediante la homología con C. fulvum.
Basándose en estos resultados se probó la actividad enzimática de la proteína purificada hasta homogeneidad. Los experimentos proporcionan que el alérgeno principal de Cladosporium herbarum altamente purificado es realmente una manitol-deshidrogenasa que cataliza la siguiente reacción metabólica: Fructosa + NADPH + H+ • Manitol + NADP+. Además se ha encontrado que el NADH no es activo como co-substrato y que tampoco la fructosa-6-fosfato es activa. La fructosa-6-fosfato actúa en la reacción como inhibidor. El método de la determinación de la actividad se describe en el Ejemplo 3.
Se utilizan ahora la secuencia peptídica N-terminal y una interna de la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium herbarum para mediante retrotraducción diseñar el cebador de PCR. La elección del cebador está resumida en la Tabla 3.
Tabla 3
· derivado de la secuencia N-terminal de la manitol-deshidrogenasa (MtDH) de C. herbarum (véase Sec. ID Nº 2)
· oligosecuencia: 5’ CA(A/G) CA(A/G) GC(I/C) AC(I/C) AA(A/G) CA(C/T) GA 3’
Oligo 2:
· derivado del péptido 4 de la MtDH de C. herbarum
· oligosecuencia: 5’ AC(A/G) AA(A/G) TC(A/G) CT(I/C) CC(A/G) GT(A/G) TC 3’
Los cebadores son mezclas de oligonucleótidos sintéticos. (A/G)... significa que en este sitio se encuentra tanto adenina como también guanina en los oligonucleótidos. Igualmente en (C/T) y (I/C), en donde I representa la base inosina.
Con estos cebadores mostrados en la Tabla 3 se llevó a cabo una reacción de PCR con ADN de un banco de ADNc de Cladosporium herbarum construido por los inventores (Achatz G y col., 1995, Mol. Immunol., 32, 213-27). El resultado fue una banda de 636 pb. Esta se secuenció por secuenciación automática de ADN conforme a Sanger (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-7) usando el cebador de PCR como cebador de secuenciación. De este modo se determinó la Sec. ID Nº 2. La secuencia de proteína derivada de esta secuencia de ADN (Sec ID Nº 1) es idéntica en hasta el 87% con la secuencia de proteína de la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium fulvum. Si se considera también la substitución por aminoácidos químicamente emparentados (p.ej. I -V, isoleucina -valina etc.), entonces este valor se eleva al 92%. Bajo la hipótesis plausible que la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium herbarum al igual que la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium fulvum presente una longitud total de 267 aminoácidos, se determina por secuenciación de péptidos por un lado y por secuenciación de ADN por otro ya un 65% de la secuencia de aminoácidos del alérgeno principal (manitol-deshidrogenasa) de Cladosporium herbarum. La secuencia completa conocida hasta ahora de esta proteína y su alineamiento con la secuencia homóloga de Cladosporium fulvum está representada en la Figura 2.
Ejemplo 1
Purificación de proteínas
1. Precipitación con sulfato amónico:
Mediante una concentración de sulfato amónico del 50% puede conseguirse un fraccionamiento previo, en el que la manitol-deshidrogenasa (MtDH) permanece en el sobrenadante.
Al extracto se le añadió Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. Las proteasas se inhibieron completamente con 1 tableta de Roche Complete por cada 100 ml de extracto y EDTA 2 mM.
La precipitación se realizó por adición de sulfato amónico sólido, molido y se llevó a cabo en dos pasos, primeramente 0-30%, a continuación 30-50%. La precipitación se equilibró durante al menos 45 min antes de centrífugar el extracto a 12.000 g. El sobrenadante se filtró y se purificó adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).
2. HIC (Fenilsefarosa): El sobrenadante de la precipitación con sulfato amónico se ajustó con acetato sódico a pH 6,5. La columna (8 ml Source 15 PHE, PHARMACIA) se equilibró con sulfato amónico 1,2 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM y se cargó con la muestra a un caudal de 1 ml/min. Tras lavar la columna con 20 ml de tampón se eluyó con un gradiente de 40 ml desde sulfato amónico 1,2 mM hasta sulfato amónico 0,6 M.
Las fracciones de manitol-deshidrogenasa (MtDH) se reunieron y se prepararon para el intercambiador aniónico. El volumen se concentró mediante los tubos de centrífuga Centricon (Millipore); intercambio de tampón frente a Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 usando columnas de desalinización PD-10 (AMERSHAM-PHARMACIA).
3. Intercambiador aniónico (Q-Sefarosa):
La columna (8 ml Source 15 PHE, PHARMACIA) se equilibró con Tris-HCl 15 mM, pH 7,5. Se eluyó con un gradiente de NaCl de 0-300 mM con 100 ml.
Ejemplo 2
Inmunotransferencia de la MtDH nativa purificada tras separación en SDS-gel
Se separó MtDH nativa purificada en un SDS-gel reductor (Laemmli UK, Nature, 1970; 27:680-5) por el peso molecular. A continuación, la proteína se transfirió en una transferencia Western (Towbin H y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979; 76: 4350-4) a una membrana de PVDF. Tras la saturación de los sitios de unión libres (30 min en tampón de bloqueo: fosfato de Na 50 mM, pH 7,5, 0,5% de Tween 20, 0,5% de BSA, 0,05% de NaN3) se realizó la incubación de la membrana con suero de paciente (diluido 1:10 en tampón de bloqueo). Entonces se lavó la membrana (3x10 min con tampón de bloqueo) para la eliminación de anticuerpos unidos inespecíficamente. La detección de Ac-IgE unidos específicamente se realizó usando un anticuerpo IgE de conejo anti-humano marcado con 125I. Tras exposición de la membrana a una película de rayos X pudo leerse el resultado.
Resultados:
1) La MtDH nativa purificada reacciona específicamente con los anticuerpos IgE de alérgicos a C. herbarum. Muestra una banda prominente reactiva a IgE a 29 kD.
2) El mismo resultado, es decir una banda prominente reactiva a IgE a 29 kD, se obtiene si se separa un extracto completo de C. herbarun en SDS-gel y a continuación se incuba en inmunotransferencia con suero de paciente.
Ejemplo 3
Inmunotransferencia de la MtDH nativa purificada tras separación bidimensional
Se separó MtDH nativa purificada en condiciones desnaturalizantes en un electroenfoque isoeléctrico (O’Farrel PH,
J. Biol. Chem., 1975; 250: 4007-21) conforme a la carga neta (punto isoeléctrico) de la proteína. A continuación de esto la proteína así separada se sometió a una electroforesis en SDS-gel (Laemmli UK, Nature, 1970; 27:680-5), con lo que adicionalmente se realizó una separación por el peso molecular. La proteína se transfirió en una transferencia Western (Towbin H y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979; 76: 4350-4) a una membrana de PVDF. Tras la saturación de los sitios de unión libres (30 min en tampón de bloqueo: fosfato de Na 50 mM, pH 7,5, 0,5% de Tween 20, 0,5% de BSA, 0,05% de NaN3) se realizó la incubación de la membrana con suero de paciente (diluido 1:10 en tampón de bloqueo). A continuación se lavó la membrana (3x10 min con tampón de bloqueo) para la eliminación de anticuerpos unidos inespecíficamente. La detección de Ac-IgE unidos específicamente se realizó usando un anticuerpo IgE de conejo anti-humano marcado con 125I. Tras exposición de la membrana a una película de rayos X pudieron apreciarse los siguientes resultados.
Resultados:
1) La MtDH nativa purificada reacciona específicamente con los anticuerpos IgE de alérgicos a C. herbarum. Se observa una mancha prominente reactiva a IgE a un peso molecular de 29 kD y un punto isoeléctrico de 5,8.
2) El mismo resultado, es decir una mancha prominente reactiva a IgE a un peso molecular de 29 kD y un punto isoeléctrico de 5,8, se obtiene si se separa un extracto completo de C. herbarun en gel bidimensional y a continuación se incuba en inmunotransferencia con suero de paciente. Adicionalmente se encuentra en el extracto completo una proteína reactiva frente a IgE con un peso molecular de 29 kD y un punto isoeléctrico de 5,6. Esta proteína podría representar una isoforma de la MtDH.
Ejemplo 4
Para justificar los resultados conforme a la invención se llevó a cabo una determinación de la actividad enzimática con la proteína nativa purificada convencional. La medición de la absorción de NADPH se realizó a 340 nm en un fotómetro.
Mezcla de reacción (1 ml):
5 Tris-HCl 50 mM, pH 7,5
NADPH o NADH 0,25 mM
D-Fructosa o fructosa-6-fosfato (0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 M)
Hasta 1 ml, de H2O
Inicio de la reacción con 0,5 !l de MtDM
10 Resultados:
Reacción con fructosa y NADPH
Ninguna reacción con fructosa-6-fosfato y NADH
Ejemplo 5
Secuencia de la manitol-deshidrogenasa (MtDH)
15 La secuencia completa de la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium herbarum se determinó como se describe a continuación.
Para sintetizar mezclas de cebadores para la PCR se utilizaron las secuencias peptídicas obtenidas por degradación de Edman de la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium purificada hasta homogeneidad. La PCR produjo una banda de 636 nt, que por un lado se secuenció y por otro lado se utilizó como sonda de hibridación para el cribado
20 de nuestro banco de ADNc. Se aisló un clon completo de manitol-deshidrogenasa (MtDH) de Cladosporium herbarum y se secuenció. La secuencia completa se muestra en la Fig. 3 y es idéntica en el 84% con la secuencia publicada de la MtDH de C. fulvum.
La Tabla 4 muestra el alineamiento de secuencias de las dos manitol-deshidrogenasas de Cladosporium herbarum y Cladosporium fulvum, estando representados solamente los aminoácidos distintos.
Tabla 4: Comparación de las secuencias de aminoácidos de las MtDH de C. herbarum y C. fulvum:
Lo respaldado en negro significa secuencia de aminoácidos idéntica, lo respaldado en gris son aminoácidos similares y los aminoácidos distintos están representados sin respaldo.
La secuencia de C. fulvum está reproducida como Sec ID Nº 9 y la secuencia de aminoácidos de C. herbarum como Sec ID Nº 10.
En la Tabla 4 puede verse que regiones del polipéptido son adecuadas eventualmente para la detección o para una vacuna para Cladosporium. A este respecto se trata de regiones que no presentan ninguna diferencia.
En las regiones que presentan fuertes diferencias debe partirse de que las reacciones inmunológicas suceden de manera distinta, por consiguiente tales regiones pueden contener epítopos altamente específicos.
En la determinación de la secuencia reproducida en la Fig. 3, se estableció que se presentaban pequeñas diferencias en la secuencia de nucleótidos en comparación con las secuencias parciales aisladas inicialmente. Esto puede atribuirse a distintas secuencias que se encontraban en el banco de genes. Sin embargo estas diferencias no cambian en la presente invención. Son objeto de la invención las distintas secuencias dadas a conocer, pues se parte de que a este respecto se trata de variantes del gen.
Ejemplo 6
Expresión de E, coli y reactividad con suero de paciente
El marco de lectura abierto de la MtDH se clonó en los siguientes vectores de expresión:
a) vector pHis-paralelo 2 (XhoI/BamHI) (ref: P. Sheffield, S. Garrard, y Z. Derewenda (1999). Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “paralell” expression vectors. Protein Expr Purif 15, 34)
b) vector pMW172 (NdeI/EcoRI) (ref: M. Susani, P. Jertschin, C. Dolecek, W. R. Sperr, P. Valent, C. Ebner, D. Kraft, R. Valenta y O. Scheiner (1995). High level expression of birch pollen profilin (Bet v 2) en Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant allergen (Biochem Biophys Res Commun 215, 250).
Los plásmidos se transformaron a continuación en la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3). Para la subsiguiente inducción se inocularon sendos 5 ml de LBamp con 50 !l de un cultivo de una noche estacionario de los dos clones y se sacudió a 37ºC hasta que se alcanzó una DO600 de 0,8 (aprox. 4 h). La inducción de la expresión de la proteína se realizó con IPTG 0,8 mM. Tras una incubación de 4 horas a 37ºC en un incubador de sacudidas las suspensiones de
E. coli se centrifugaron durante 15 min a 4000 rpm. Los sedimentos bacterianos se resuspendieron a continuación en 1 ml de PBS 1x y se separaron sendos 6 !l de los sedimentos bacterianos disueltos mediante SDS-PAGE y a continuación se tiñeron con Coomasssie BBR250. De este modo se obtuvieron los siguientes resultados: Las células de E. coli transformadas con los plásmidos de expresión e inducidas con IPTG, pero no las células de E. coli sin plásmido, muestran una banda de proteína intensa al peso molecular respectivamente esperado, concretamente 30 kD, o aproximadamente 33 kD (peso molecular aparente).
Con los polipéptidos separados usando un gel se llevó a cabo una inmunotransferencia de IgE. Se utilizó suero de un alérgico positivo a Cladosporium. La detección de los anticuerpos IgE unidos se realizó con el anticuerpo IgE de conejo anti-humano marcado con 125I (RAST). Las dos proteínas extrañas sobreexpresadas en E. coli reaccionan fuertemente con la IgE del paciente, pero no las propias proteínas de E. coli.
Ejemplo 7
Determinación de la frecuencia de la reacción frente a MtDH usando 30 sueros de alérgicos positivos a Cladosporium
El ensayo descrito en el Ejemplo 6 se repitió, pero utilizándose 30 sueros distintos positivos a Cladosporium no preseleccionados de alérgicos. El control mostró una inmunorreactividad muy débil del extracto de E. coli con el segundo anticuerpo (RAST). Esto es presumiblemente atribuible a un artefacto. Otros controles fueron como se esperaba negativos.
De 30 pacientes 20 mostraron una banda positiva a IgE a 30 kD que era más intensa que la banda débil en el ensayo de control. Por tanto se apreció la MtDH de aproximadamente dos tercios de los alérgicos positivos a Cladosporium. Este hallazgo es importante, porque mediante este ensayo se muestra que puede utilizarse MtDH de Cladosporium herbarum recombinante como agente de diagnóstico y terapéutico para una gran parte de los pacientes.
Ejemplo 8
Para la clonación de la manitol-deshidrogenasa de Alternaria alternata se utilizó un banco de ADNc en lambda-ZAP (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Este banco de clones de ADNc se preparó usando ARNm aislado de Alternaria alternata.
Como se ha descrito anteriormente, el banco de ADNc se cribó con una sonda de ADN y de este modo se aislaron primeramente 24 clones primarios. De estos clones 5 se secuenciaron completamente. En la región codificante las 5 secuencias eran idénticas. La traducción de la secuencia de nucleótidos a una secuencia de aminoácidos y la comparación con la secuencia de aminoácidos de la manitol-deshidrogenasa de Cladosporium herbarum mostró que el marco de lectura estaba completo. La secuencia presentó una identidad del 74% con la secuencia de Cladosporium herbarum.
Ejemplo 9
El marco de lectura abierto del clon que codifica la manitol-deshidrogenasa de Alternaria alternata se reclonó ahora en el vector de expresión pHis-paralelo 2 [P. Sheffield y col. (1999), Overcoming expresión and purification problems of RhoGDI using a familly of “paralell” expression vectors. Protein Exp. Purif. 15, 34] usando los sitios de restricción Bam H I (N-terminal) y Xho I (C-terminnal). En una expresión en E. coli BL21 y subsiguiente análisis de los productos génicos usando una electroforesis en gel SDS-PAGE y tinción con azul Coomasie resultó una banda de proteína fuertemente expresada a un peso molecular de aproximadamente 30 kD. Esto corresponde aproximadamente al peso molecular teórico a esperar.
Ejemplo 10
Para purificar la proteína recombinante producida y provista en el extremo C de un fragmento poli-HIS se escogió el siguiente procedimiento:
Las células de E. coli con el vector de expresión que expresa la proteína extraña, la manitol-deshidrogenasa de Alternaria alternata, en primer lugar se lisaron de modo habitual. A este respecto se determinó que la proteína recombinante producida se presentaba en forma insoluble. Los cuerpos de inclusión formados por la sobreexpresión de la proteína extraña se solubilizaron primeramente en un tampón con urea 6 molar y a continuación se purificaron por cromatografía de afinidad a través de una columna de quelato de níquel. La aplicación de la manitol-deshidrogenasa recombinante producida se realizó en tampón urea 6 M. Para la elución se utilizó tampón de imidazol. Las fracciones que contenían proteína se purificaron a continuación adicionalmente mediante una electroforesis en gel SDS-PAGE preparativa y se analizaron y así se mostró que el alérgeno ya se había purificado prácticamente en su totalidad hasta homogeneidad. Con una tinción con Coomasie-BB-R se vio tan solo una banda con un peso molecular de aproximadamente 30 kD.
Ejemplo 11
La proteína producida conforme al ejemplo 10 se separó por electroforesis en gel y se ensayó en una inmunotransferencia de IgE con 28 sueros de pacientes. Los 28 sueros procedían todos de pacientes que habían reaccionado positivamente con el extracto bruto de Alternaria alternata y que también se habían pre-ensayado tanto en el test cutáneo como también en el RAST. En 9 de los sueros de pacientes sometidos a ensayo era visible una banda intensa en la inmunotransferencia. Esto corresponde a aproximadamente el 32% de los pacientes sensibilizados con Alternaria alternata.
PROTOCOLO DE SECUENCIAS
<110> Biomay Produktions-und Handels-Gesellschaft m.b.H
<120> Polipéptido que codifica una manitol-deshidrogenasa, su producción y su uso en diagnóstico y terapia
<130> Cla h 1
<140>
<141>
<150> 102 14 082.0
<151> 28-03-2002
<150> 102 33 676.8
<151> 24-07-2002
<160> 12
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1
<211> 173
<212> PRT
<213> Cladosporium herbarum
<400>
<210> 2
<211> 519
<212> ADN
<213> Cladosporium herbarum
<400> 2
<210> 3
<211> 266
<212> PRT
- <213>
- Cladosporium fulvum 15 <400> 3
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Cladosporium herbarum
<400> 4
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Cladosporium herbarum
<400> 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Cladosporium herbarum
<400> 6
<210> 7
<211> 918
<212> PRT
<213> Cladosporium herbarum
<400> 7
<210> 8
<211> 267
<212> PRT
<213> Cladosporium herbarum
<400> 8
<210> 9
<211> 266
<212> PRT
- <213>
- Cladosporium fulvum 10 <400> 9
<210> 10
<211> 267
<212> PRT
<213> Cladosporium herbarum
<400> 10
<210> 11
<211> 266
<212> PRT
<213> Alternaria alternata
<400> 11 <210> 12
<211> 1026
<212> ADN
<213> Alternaria alternata
<400> 12
Claims (4)
- REIVINDICACIONES1. Vacuna para la desensibilización de pacientes frenta a una alergia por mohos, caracterizada porque contiene por lo menos un polipéptido con por lo menos un epítopo que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 1 o la Secuencia ID Nº 8 o una secuencia seleccionada de la5 Secuencia ID Nº 4, 5 y 6 o que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 11.
- 2. Uso de un polipéptido con por lo menos un epítopo que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 1 o la Secuencia ID Nº 8 o una secuencia seleccionada de la Secuencia ID Nº 4, 5 y 6 o que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con10 la Secuencia ID Nº 11 para la fabricación de una vacuna contra una alergia por mohos.
- 3. Uso de un polipéptido que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 1 o la Secuencia ID Nº 8 o una secuencia seleccionada de la Secuencia ID Nº 4, 5 y 6 o que presenta por lo menos 11 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos con la Secuencia ID Nº 11 para la detección diagnóstica de una enfermedad, concretamente de una alergia.15 4. Uso conforme a la reivindicación 3, caracterizado porque la enfermedad es una alergia contra mohos.Figura 1Figura 2Alineamiento de las NADP-MtDH de C. fulvum y C. herbarum sobre la base de los datos de ADN y proteínas presentesAlineamiento de las secuencias de aminoácidos derivadas de las manitol-deshidrogenasas de Cladosporium herbarum y Cladosporium fulvum.
-
- -
- ... significa que en ese sitio la secuencia de aminoácidos de C. herbarum todavía debe secuenciarse.
Fig. 3: Secuencia completa de nucleótidos y de proteína de la MtDH de Cladosporium herbarumFig. 4: MtdH de Alternaria alternata (Sec. ID Nº 11)MtDH de Alternaria alternataFig. 5: Secuencia de ADN (Sec. ID Nº 12) de la manitol-deshidrogenasa de Alternaria alternata Fig. 6: Comparación de la secuencia de ADN de C. herbarum y A. alternata
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10214082 | 2002-03-28 | ||
| DE10214082A DE10214082A1 (de) | 2002-03-28 | 2002-03-28 | Polypeptid kodierend für eine Mannit-Dehydrogenase, dessen Herstellung und Verwendung in Diagnostik und Therapie |
| DE10233676 | 2002-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2370816T3 true ES2370816T3 (es) | 2011-12-23 |
Family
ID=27816056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03714857T Expired - Lifetime ES2370816T3 (es) | 2002-03-28 | 2003-03-19 | Secuencia de ácido nucléico y proteina así como polipeptidos que codifican manitol-deshidrogenasas o partes de los mismos así como su producción y uso en diagnostico y terapia. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10214082A1 (es) |
| ES (1) | ES2370816T3 (es) |
-
2002
- 2002-03-28 DE DE10214082A patent/DE10214082A1/de not_active Ceased
-
2003
- 2003-03-19 ES ES03714857T patent/ES2370816T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE10214082A1 (de) | 2003-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hoffmann-Sommergruber et al. | High-level expression and purification of the major birch pollen allergen, Bet v 1 | |
| ES2559317T3 (es) | Péptidos antigénicos de Neisseria | |
| CN109313181B (zh) | 蛋变态反应的抗原 | |
| Kaiser et al. | Characterization of Actin and Poly-L-proline Binding Sites ofAcanthamoebaProfilin with Monoclonal Antibodies and by Mutagenesis | |
| Sidoli et al. | Cloning, expression, and immunological characterization of recombinant Lolium perenne allergen Lol p II. | |
| CHOW et al. | Identification and expression of an allergen Asp f 13 from Aspergillus fumigatus and epitope mapping using human IgE antibodies and rabbit polyclonal antibodies | |
| US20150210742A1 (en) | Novel allergen from ragweed pollen and uses thereof | |
| Cadot et al. | Cloning and expression of the cyclophilin Bet v 7, and analysis of immunological cross-reactivity among the cyclophilin A family | |
| KR100465382B1 (ko) | 말라세지아에서 유래된 항원성 단백질 | |
| US6869787B2 (en) | Ricin vaccine and methods of making and using thereof | |
| JP3758671B2 (ja) | 組み換えクラドスポリウムヘルバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｈｅｒｂａｒｕｍ）アレルゲン | |
| JP5542685B2 (ja) | 新規な小麦アレルゲン | |
| CN103724414B (zh) | 一种SjHSP90重组蛋白及其在血吸虫病诊断及疗效考核中的应用 | |
| ES2238487T3 (es) | Variantes de la proteina alergica phl p1 de phleum pratense. | |
| CN109734792A (zh) | 人cntn1抗原、人cntn1抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CN109810184A (zh) | 人nf155抗原、人nf155抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CA2480682C (en) | Nucleic acid sequence and protein, and polypeptides encoding mannitol dehydrogenases or parts thereof, and their preparation and use in diagnostics and therapy | |
| Wong et al. | Location and reduction of icarapin antigenicity by site specific coupling to polyethylene glycol | |
| KR20100135762A (ko) | 브라키스피라의 신규 서열, 그의 면역원성 조성물, 제조 방법 및 용도 | |
| JP4401288B2 (ja) | ヨモギ花粉由来のアレルゲン | |
| JP4232423B2 (ja) | 新規ユビキチン特異プロテアーゼ | |
| ES2384231T3 (es) | Proteínas híbridas de pincipales alérgenos de Parietaria judaica y usos de las mismas | |
| CN106604929B (zh) | 新型过敏原 | |
| ES2370281T3 (es) | Confórmeros de adhesinas bacterianas. | |
| KR20160015072A (ko) | 벼검은줄오갈병 바이러스의 외피단백질의 일부를 항원으로 인식하는 항혈청 및 이를 이용한 벼검은줄오갈병의 진단방법 |