ES2371015T3 - Tratamiento de imágenes, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo capaz de unir selectivamente al polipéptido humano ECSM4, en el que dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural que comprende una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de la Figura 4 o Figura 5, para uso como un medicamento..

Description

La presente invención se refiere a un gen cuya expresión es selectiva para el endotelio y al uso de anticuerpos que se unen al producto de este gen para uso como un medicamento.

El endotelio desempeña un papel esencial en muchos procesos fisiológicos y patológicos y se sabe que se trata de un sitio de transcripción excepcionalmente activo. Aproximadamente 1000 genes diferentes se expresan en una célula endotelial. En contraste, se encontró que los glóbulos rojos expresan 8, las plaquetas 22 y el músculo liso 127 genes diferentes (Adams et al, 1995). Algunos genes endoteliales específicos conocidos atraen mucha atención tanto por parte de la investigación básica, como por parte de la comfracción clínica. Por ejemplo, las tirosina quinasas específicas endoteliales Tie, TIE2/TEK, KDR y flt1 desempeñan papeles cruciales en la regulación de la integridad vascular, los procesos inflamatorios mediados por el endotelio y en la angiogénesis (Sato et al, 1993, Sato et al, 1995, Fong et al, 1995, Shalaby et al, 1995, Alello et al, 1995). Se reconoce ampliamente a la angiogénesis en la actualidad como un proceso que limita el crecimiento de tumores sólidos. También se encuentra involucrado en la formación de las placas de ateroesclerosis y restenosis. Por último, el endotelio desempeña un papel esencial en el complejo y dinámico sistema que regula la coagulación y la hemostasis.

De los muchos genes diferentes que se expresan en una célula endotelial, no todos son completamente selectivos de las células endoteliales, de modo que los genes y sus productos, y las moléculas que se unen a ellos por lo general no resultan útiles para las imágenes, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. Por tanto, existe aún la necesidad de encontrar moléculas específicas o selectivas de las células endoteliales.

En este documento reportamos la identificación de dos genes endoteliales altamente selectivos a los que hemos llamado: molécula 1 específica de células endoteliales (ECSM1) y glorieta mágica (molécula 4 específica de células endoteliales; ECSM4), aunque la presente invención se relaciona, únicamente, con ECSM4 humano. El término ECSM4 se emplea para indicar, como lo dejará claro el contexto, el ADNc y los polipéptidos codificados por el gen. ECSM4 es sorprendentemente específico en su perfil de expresión celular, y muestra una selectividad por las células endoteliales que es similar a la de el marcador aceptado actualmente en la técnica como el mejor marcador de células endoteliales (Factor von Willibrand). Obviamente, un grado tan elevado de especificidad por las células endoteliales es tan inédito como inesperado.

El clon de ADNc de la glorieta mágica humana (ECSM4), con una ORF de más de 417 aa (Número de Acceso de GenBank AK000805) y descrito en WO 99/46281 como una secuencia de 3716 nucleótidos se identificó mediante búsquedas de BLAST contra el contig 111518. Esta secuencia es rica en prolinas y presenta varias regiones de baja complejidad aminoacídica. La búsqueda de BLAST contra PRODOM (base de datos de familias de proteínas en HGMP, UK) identificó una región de 120 pb con homología con el dominio citoplasmático conservado de la familia de receptores de transmembrana involucrados en la guía repulsiva del axón (familia de proteínas ROBO1 DUTT1, E=4e-07). La homología se extendió a 468 aa (E=1,3e-09) cuando se llevó a cabo un análisis más riguroso empleando ssearch (Smith y Waterman, 1981), pero la región de similitud seguía contenida aun en el dominio citoplasmático. La familia ROBO1 DUTT1 incluye el homólogo 1 de la glorieta humana (ROBO1), el gen de ratón DUTT1 y el gen de rata ROBO1 (Kidd et al, 1998, Brose et al, 1999). Debido a esta región de homología llamamos al gen representado por Hs. 111518 “glorieta mágica” (ECSM4). Además el BLAST SBASE (base de datos de dominios de proteínas en HGMP) sugirió una región de similitud con el dominio largo del precursor de la molécula intracelular de adhesión de células neurales (E=2e-11). Debe resaltarse que el verdadero producto proteico de la glorieta mágica es probablemente más largo que los 417 aa codificados por el clon AK000805, dado que aparentemente la ORF no tiene un límite upstream (sentido hacia arriba), y la comparación de tamaño con la glorieta humana 1 (1651 aa) sugiere que se trata de una proteína mucho mayor. Esto está confirmado por la Figura 3, que muestra que el producto de traducción del gen ECSM4 de humanos tiene alrededor de 118 kDa. Sin embargo, ECSM4 es más pequeña que otros miembros de la familia de las glorietas, con los que comparte sólo dos de los cinco dominios Ig y dos de los tres dominios de tipo fibronectina en la región extracelular. La probable región intracelular rica en prolina que es homóloga a las de las glorietas que se piensa que se unan a c-abl. La Figura 12 muestra la secuencia aminoacídica completa de la ECSM4 humana (1105 aa), y la secuencia del homólogo de ratón se muestra en la Figura 13. En WO 99/11293 y WO 99/53051 se presentan secuencias nucleotídicas codificantes, que muestran alrededor de 99% de identidad con la secuencia nucleotídica de ECSM4 dada en la Figura 12.

En EP 1 074 617, WO 00/53756, WO 99/46281, WO 01/23523 y WO 99/11293 se presentan otras secuencias que muestran homología con la secuencia polipéptidica o nucleotídica de ECSM4. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones revela que estas secuencias se expresen de manera selectiva en el endotelio vascular, ni sugieren tampoco que puedan ser expresadas de esa forma.

Recientemente se han descubierto asociaciones interesantes entre los genes de la diferenciación neuronal y los de las células endoteliales. Por ejemplo, se identificó un receptor neuronal para el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) neuropilin 1 (Soker et al, 1998). La creencia tradicional era que VEGF era un factor de crecimiento exclusivo del endotelio. Procesos similares a la guía de los axones neuronales se implican ahora en la guía de la migración de las células endoteliales durante la angiogénesis y el crecimiento de los capilares. Por tanto, los ligandos efrinB y los receptores de EphB están involucrados en la demarcación de los dominios arterial y venoso (Adams et al, 1999). Es posible que la glorieta mágica (ECSM4) sea un homólogo específico del endotelio de la glorieta humana 1 involucrada en la guía repulsiva de las células endoteliales, presumiblemente con un ligando diferente, dado que la similtud está confinada a la región citoplasmática, o sea, efectora y se sabe que los receptores de guía poseen una arquitectura altamente modular (Barshaw y Goodman, 1999).

Sin embargo, hasta el momento no ha habido ninguna mención a la existencia de una contraparte endotelial, ni a que el patrón de expresión del gen de la glorieta mágica (ECSM4) se encuentre restringido a las células endoteliales, en especial a las células endoteliales angiogénicas, ni a ninguna función del polipéptido codificado por dicho gen.

Debe señalarse que un resultado sorprendente de nuestro análisis de RT-PCR, descrito en el Ejemplo 1 fue que ECSM4 aparentemente muestra una especificidad para el endotelio (Fig. 1) comparable con el marcador endotelial clásico factor de von Willebrand (vWF). La expresión de genes conocidos específicos del endotelio usualmente no se encuentra 100% restringida a la célula endotelial. Los datos presentados en este documento muestran el muy inesperado hallazgo de que ECSM4 no se expresa a niveles detectables (al menos mediante el empleo de los métodos descritos en los ejemplos) en tipos celulares distintos de las células endoteliales, dado que la selectividad de los marcadores conocidos de las células endoteliales es inferior al 100%. El análisis de protección con ribonucleasa confirmó y extendió esta observación (Figura 14a). Se observó que la expresión de ECSM4 se restringía al endotelio (tres aislamientos diferentes) y se encontraba ausente de los fibroblastos, las células de carcinoma y las neuronas. KDR y FLT1 se expresan en el tracto reproductivo masculino y femenino: en las células espermatogénicas (Obermair et al, 1999), trofoblastos y en la decidua (Clark et al, 1996). Se ha mostrado que KDR define a las células tronco hematopoiéticas (Ziegler et al, 1999). FLT1 también se encuentra presente en monocitos. Además de las células endoteliales vWF tiene una fuerte presencia en megacariocitos (Sporn et al, 1985, Nichols et al, 1985) y, por consecuencia, está presente en las plaquetas. Del mismo modo, la multimerina se encuentra presente tanto en las células endoteliales (Hayward et al, 1993), como en las plaquetas (Hayward et al, 1998).

Hablando de manera general, las células endotelilaes y las células hematopoiéticas descienden de los mismos precursores embrionarios: los hemangioblastos, y estos dos linajes celulares comparten muchos marcadores celulares (para una revisión ver Suda et al, 2000). Por tanto, el hallazgo de que ECSM4 no se expresa en células que no sean las del endotelio vascular es muy sorprendente.

La determinación de los genes cuya expresión es selectiva para el endotelio vascular permite un direccionamiento selectivo hacia estas células y, por tanto, la entrega específica de moléculas para la imaginología, el diagnóstico, el pronóstico, el tratamiento, la prevención y la evaluación de terapias para las enfermedades asociadas al crecimiento vascular normal o aberrante.

WO 99/426281 revela la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos secretados y transmembranosos, y nuevos ácidos nucleicos que codifican esos polipéptidos.

En el término “polipéptido humano ECSM4” incluimos un polipéptido cuya secuencia comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos dada en la Figura 4 o 5 o 12 o cuya secuencia está codificada por la secuencia nucleótida dada en la Figura 4 entre nucleótidos 1 y 1395 o entre nucleótidos 2 y 948 de la Figura 5 o entre nucleótidos 71 y 3442 de la Figura 12. Preferiblemente, el polipéptido ECSM4 es uno cuya secuencia aminiacídica comprende la secuencia dada en Figura 4 o Figura

12.

En el término “polipéptido humano ECSM4” incluimos un polipéptido representado por SEC ID Nº 18085 de EP1074617, SEC ID Nº 211 de bien WO 00/53756 o WO 99/46281, SEC ID Nº 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523, o SEC ID Nº 86 de WO 99/11293, o el polipéptido representado por SEC ID Nº 18084 o 5096 de EP1074617, SEC ID Nº 210 de bien WO 00/53756 o WO 99/46281, SEC ID Nº 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523, o SEC ID Nº 86 de WO 99/11293

En el término “polipéptido A ECSM4” incluimos también cualquier polipéptido que ocurra de manera natural y que contiene una porción de 50 residuos de aminoácidos consecutivos, o variantes naturales del mismo, con la secuencia polipéptidica dada en las Figuras 4, 5 ó 12. Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido humano.

Un primer aspecto de la invención provee un anticuerpo capaz de ligar selectivamente al polipéptido humano ECSM4, en el que dicho polipéptido humano ECSM4 es un polipéptido que ocurre de manera natural y que comprende una porción de 50 residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia polipéptidica de la Figura 4 o la Figura 5 para uso como un medicamento.

El anticuerpo puede ligar selectivamente un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica situada entre los residuos 1 y 467 de la secuencia polipeptídica de la Figura 12.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.

Realizaciones de las características de este aspecto de la invención son como se describe adelante en más detalle.

Un segundo aspecto de la invención provee un compuesto que comprende (I) un anticuerpo como se define en el primer aspecto de la invención, y (II) una fracción adicional, para uso como un medicamento.

De preferencia el anticuerpo y la fracción adicional se encuentran unidos de manera covalente.

De preferencia, un anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 es uno que se une de manera selectiva a un polipéptido con la secuencia GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE o ERATQEPSEHGP, o una secuencia localizada en la porción extracelular de ECSM4. Como se describe en más detalle más adelante, estas secuencias representan secuencias aminoacídicas que solo se encuentran en el ECSM4 humano y que no se encuentran en la secuencia polipéptidica de ECSM4 de ratón.

De preferencia, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 es el que se une a un polipéptido cuya secuencia aminoacídica contiene la secuencia dada en cualquiera de las Figuras 4, 5 ó 12 pero no se une al polipéptido representado por ninguna de las SEC. ID. No 18085 de EP 1 074 617, SEC ID No 211 de WO 00/53756 o W099146281, SEC ID Nos 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523, o SEC ID No 86 de WO 99/11293, o codificado por ninguna de las secuencias nucleotídicas representadas por la SEC. ID No 18084 o 5096 de EP 1 074 617, SEC ID No 210 de WO 00 53756 o WO 99/46281, o SEC ID Nos 22, 23, 96 o 98 de WO 01/23523 y SEC ID No 31 de WO 99/11293.

En el término “anticuerpo” incluimos no solo moléculas de inmunoglobulina completas, sino también fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab’)2, Fv y otros fragmentos de las mismas que mantienen el sitio de unión al antígeno. De manera similar, el término “anticuerpo” incluye derivados modificados genéticamente de anticuerpos, tales como moléculas Fv de cadena simple (scFv) y dominios de anticuerpos (dAbs). El término incluye también moléculas de tipo anticuerpo que pueden producirse mediante técnicas de phage-display u otras técnicas de selección aleatoria de moléculas que se unen a ECSM4.

Los dominios variable pesado (VH) y variable ligero (VL) de los anticuerpos están involucrados en el reconocimiento del antígeno, un hecho que fue reconocido por primera vez por experimentos tempranos de digestión mediante proteasas. Una confirmación posterior se obtuvo mediante la “humanización” de anticuerpos de roedores. Los dominios variables de los roedores pueden fusionarse a los dominios constantes de origen humano, de manera que el anticuerpo resultante mantiene la especificidad antigénica del anticuerpo de roedor original (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855).

Esa especificidad antigénica la confieren dominios variables, y es independiente de los dominios constantes es conocido a partir de experimentos que involucran la expresión en bacterias de fragmentos de anticuerpos, todos conteniendo uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen a las moléculas de tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); las moléculas de tipo Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de simple cadena (ScFv) en las que los dominios VH y VL correspondientes se encuentran unidos por medio de un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y los anticuerpos de un único dominio (dAbs), que contienen dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Una revisión general de las técnicas involucradas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que mantienen sus sitios de unión específicos puede encontrarse en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Por “moléculas ScFv” entendemos moléculas en las que los dominios VH y VL correspondientes se encuentran unidos por medio de un oligopéptido flexible.

Las ventajas del empleo de fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos son de varios niveles. El tamaño menor de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacológicas mejoradas, tales como una mejor penetración al sitio blanco. Se eliminan las funciones efectoras de los anticuerpos enteros, tales como la unión al complemento. Los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse y secretarse en E. coli permitiendo, de ese modo, la fácil producción de grandes cantidades de dichos fragmentos.

Los anticuerpos enteros y los fragmentos F(ab’)2 son “bivalentes”. Por “bivalentes” entendemos que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab’)2 tienen dos sitios de combinación con el antígeno. Por el contrario, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, al poseer un único sitio de combinación al antígeno.

Aunque el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, se prefiere utilizar un anticuerpo monoclonal. En algunas circunstancias, en particular si el anticuerpo va a ser administrado de manera repetida a un paciente humano, se prefiere que el anticuerpo monoclonal sea un anticuerpo monoclonal humano o un anticuerpo monoclonal humanizado.

Anticuerpos monoclonales adecuados, que son reactivos como tales pueden prepararse mediante el empleo de técnicas conocidas, por ejemplo, las presentadas en "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982). Pueden producirse anticuerpos policlonales que sean poliespecíficos o monoespecíficos. Se prefiere que sean monoespecíficos.

Los anticuerpos quiméricos se discuten en Neuberger et al (1998, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799).

Anticuerpos no humanos preparados de manera adecuada pueden “humanizarse” por métodos conocidos, por ejemplo, mediante la inserción de las regiones CDR de anticuerpos de ratón en el marco de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos en el sentido de que poseen la secuencia aminoacídica de anticuerpos humanos anti ECMS4, pero pueden prepararse empleando métodos conocidos en la técnica que no requieren la inmunización de humanos. Por ejemplo, están disponibles ratones trangénicos que contienen, en esencia, genes de inmunoglobulinas humanos (see Vaughan et al (1998) Nature Biotechnol. 16, 535-539).

La fracción adicional puede ser cualquier fracción que confiera al compuesto una propiedad útil con respecto al tratamiento o la imagen o el diagnóstico de enfermedades u otros padecimientos o estados que involucren una formación indeseable de nueva vasculatura. Tales enfermedades u otros padecimientos o estados se describen a continuación con mayor detalle. En particular, la fracción adicional es alguna que resulta útil en la eliminación o imaginología de nueva vasculatura asociada con el crecimiento de un tumor. De preferencia, la fracción adicional es alguna que es capaz de matar las células endoteliales a las que se dirige el compuesto.

En una realización preferida de la invención, la fracción adicional es citotóxica de manera directa o indirecta. En particular, la fracción adicional es, de preferencia, tóxica de manera directa o indirecta sobre células de la nueva vasculatura o células que se hallan en la vecindad cercana de, y asociadas a la nueva vasculatura.

En el término “directamente citotóxica” incluimos el sentido de que la fracción es alguna que resulta, por sí misma, citotóxica. En el término “indirectamente citotóxica” incluimos el sentido de que al fracción es alguna que, aunque no es en sí misma citotóxica, puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, a través de su acción sobre alguna otra molécula o mediante otra acción sobre la misma.

En una realización, la fracción citotóxica es un agente citotóxico quimioterapéutico. Son bien conocidos en la técnica los agentes citotóxicos quimioterapéuticos.

Los agentes citotóxicos quimioterapéuticos, tales como los agentes anticancerígenos incluyen: agentes alquilantes incluidos los derivados del nitrógeno, como la mecloroetamina (NH2), la ciclofosfamida, la ifosfamida, el melfalan (L-sarcolisina) y el clorambucil; las etilenaminas y metilenaminas, tales como la hexametilmelamina, el tioepta; los alquilsulfonatos, tales como el busulfan; las nitrosureas, tales como la camustina (BCNU), la lomustina (CCNU), la semustina (metil-CCNU) y la estreptozocina (estreptozocina); y los triazenos, tales como la decarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazol-carboxamida); los antimetabolitos, incluyendo los análogos del ácido fólico, tales como el metotrexato (ametopterina); los análogos de la pirimidina, tales como el fluorouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU), la floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) y la citarabina (arabinósido de citosina); y los análogos de purinas e inhibidores relacionados, tales como la mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), la tioguanina (6-tioguanina; TG) y la pentostatina (2’-desoxicoformicina). Los productos naturales incluyendo los alcaloides vinca, tales como la vinblastina (VLB) y la vincristina; las epipodofilotoxinas, tales como el etopósido y el tenipósido; los antibióticos, tales como la dactinomicina (actinomicina D), la daunorrubicina (daunomicina; rubidomicina), doxorrubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C); enzimas, tales como la L-asparaginasa; y modificadores de la respuesta biológica, tales como alfenomas de interferón. Agentes variados, incluyendo los complejos de coordinación de platino, tales como el cisplatin (cis-DDP) y el carboplatin; la antracenediona, tal como la mitoxantrona y la antraciclina; ureas sustituidas, tales como la hidroxiurea; derivados de la metil hidracina, tales como la procarbacina (N-metilhidracina, MIH); y supresores adrenocorticales, tales como el mitotano (o,p’-DDD) y la aminoglutetimida; el taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas de hormonas, tales como la flutamida y el tamoxifeno. Varios de estos agentes han sido unidos con anterioridad a anticuerpos y otros agentes de liberación dirigida a blancos, de manera que compuestos de la invención que incluyan dichos agentes pueden prepararse con facilidad por parte de personas versadas en la técnica. Por ejemplo, puede emplearse la conjugación por carbodiimida (Bauminger & Wilchek (1980) Methods Enzymol. 70, 151-159) para conjugar una gama de agentes, incluyendo la doxorrubicina, a anticuerpos o péptidos.

Las carbodiimidas incluyen un grupo de compuestos que poseen la fórmula general R-N=C=N-R’, donde R y R’ pueden ser alifáticos o aromáticos, y se emplean para la síntesis de enlaces peptídicos. El procedimiento preparativo es simple, relativamente rápido y puede llevarse a cabo bajo condiciones suaves. Los compuestos de tipo carbodiimida atacan a los grupos carboxílicos para convertirlos en sitios reactivos para los grupos amino libres.

La carbodiimida soluble en agua, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) es particularmente útil para la conjugación de una fracción funcional a una fracción de unión y puede usarse para conjugar doxorrubicina a péptidos que aparecen en tumores. La conjugación de la doxorrubicina y una fracción de unión requiere la presencia de un grupo amino, que es proporcionado por la doxorrubicina, y un grupo carboxilo, que es proporcionado por la fracción de unión, tal como un anticuerpo

o un péptido.

Además del uso de las carbodiimidas para la formación directa de enlaces peptídicos, la EDC puede emplearse también para preparar ésteres activos, tales como éster N-hidroxisuccinimida (NHS). El éster NHS, que se une solo a grupos amino, puede emplearse a su vez para inducir la formación de un enlace amida con el único grupo amino de la doxorrubicina. Se emplea con frecuencia el uso combinado de EDC y NHS para la conjugación, con el objetivo de incrementar el rendimiento en la formación del conjugado (Bauminger & Wilchek, supra, 1980).

También se pueden emplear otros métodos para conjugar una fracción funcional a un anticuerpo. Por ejemplo, puede emplearse la oxidación con peryodato de sodio, seguida por alquilación reductiva de reactivos apropiados, así como el entrecruzamiento con glutaraldehído. Sin embargo, se reconoce que, cualquiera sea el método de producción de un conjugado de la invención que se seleccione, debe tomarse la determinación de que el anticuerpo mantenga su capacidad de direccionamiento y que la fracción funcional mantenga su función relevante.

En otra realización, la fracción citotóxica es un péptido citotóxico o una fracción polipeptídica, en la que incluimos cualquier fracción que conduzca a la muerte celular. Se conocen bien en la técnica péptidos citotóxicos y fracciónes polipeptídicas e incluyen, por ejemplo, la ricina y la abrina, la exotoxina de Pseudomonas, el factor tisular, y similares. También se conocen en la técnica métodos para unirlos a los anticuerpos. El uso de ricina como agente citotóxico se describe en Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8996-9000; y el uso de factor tisular, que conduce a la coagulación localizada de la sangre y al infarto del tumor se ha descrito en Ran et al (1998) Cancer Res. 58, 4646-4653 and Huang et al (1997) Science 275, 547-550. Tsai et al (1995) Dis. Colon Rectum 38, 1067-1074 describe la cadena A de la abrina, conjugada con un anticuerpo monoclonal. Otras proteínas inactivadotas de ribosomas se describen como agentes citotóxicos en WO 96/06641. La exotoxina de Pseudomonas puede usarse también como fracción polipeptídica citotóxica (ver, por ejemplo, Aiello et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461)

Algunas citoquinas, tales como TNFa e IL-2, pueden también ser útiles como agentes citotóxicos.

Algunos átomos radiactivos pueden también ser citotóxicos si se les suministra en dosis suficientes. Por tanto, la fracción citotóxica puede incluir un átomo radiactivo que, al usarse, libere una cantidad suficiente de radiactividad al sitio blanco, comopar ser citotóxico. Átomos radiactivos adecuados incluyen el fósforo 32, el yodo 125, yodo 131, indio 111, renio 186, renio 188

o ytrio 90, o cualquier otro isótopo que emita suficiente energía para destruir las células, organelos o ácidos nucleico vecinos. De preferencia, los isótopos y la densidad de los átomos radiactivos en el compuesto de la invención son tales que una dosis de más de 4000 cGy (de preferencia al menos 6000, 8000 ó 10000 cGy) se suministre al sitio blanco, de preferencia, a las células en el sitio blanco y sus organelos, en particular, el núcleo.

El átomo radiactivo puede unirse al anticuerpo de maneras conocidas. Por ejemplo, se puede unir EDTA u otro agente quelante a la fracción de unión y usarse para unir 111In o 90Y. Los residuos de tirosina pueden marcarse con 125I o 131I.

La fracción citotóxica puede ser un polipéptido indirectamente citotóxico adecuado. En una realización preferida, el polipéptido indirectamente citotóxico es un polipéptido que posee actividad enzimática y puede convertir una prodroga relativamente no tóxica en una droga citotóxica. Cuando la fracción direccionadora es un anticuerpo, este tipo de sistema se denomina con frecuencia ADEPT (Terapia de enzima direccionada por anticuerpo sobre prodroga). El sistema requiere que la fracción direccionadora localice la porción enzimática al sitio deseado del cuerpo del paciente (o sea, el sitio que expresa ECSM4, tal como la nueva vasculación asociada con un tumor) y luego de permitir cierto tiempo para que la enzima se localice en el sitio, administrar una prodroga que es el sustrato de la enzima, el producto final de cuya catálisis es un compuesto citotóxico. El objeto de esta estrategia es maximizar la concentración de droga en el sitio deseado y minimizar la concentración de droga en tejidos normales (ver Senter, P.D. et al (1988) "Antitumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846; Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531-2; y Bagshawe,

K.D. et al (1988) "A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites" Br. J. Cancer. 58, 700-703.)

La enzima y la prodroga del sistema que emplea una enzima direccionada a ECSM4 como se describe aquí puede ser cualquiera de las propuestas anteriormente. La sustancia citotóxica puede ser cualquier droga anticancerígeno existente, tal como un agente alquilante; un agente que se intercala en el ADN; un agente que inhibe cualquier enzima clave, tal como la dihidrofolato reductasa, la timidina sintetasa, la ribonucleótido reductasa, la nucleósido quinasa o la topoisomerasa; o un agente que provoca la muerte celular mediante su interacción con cualquier otro constituyente celular. El etopósido es un ejemplo de un inhibidor de la topoisomerasa.

Sistemas de prodrogas reportados incluyen: una prodroga de gas de fenol activada por una �-glucuronidasa de E. coli (Wang et al, 1992 and Roffler et al, 1991); una prodroga de doxorrubicina activada por una �-glucuronidasa humana (Bosslet et al, 1994); otras prodrogas de doxorrubicina activadas por a-galactosidasa de semilla de café (Azoulay et al, 1995); las prodrogas de daunorrubicina activadas por a-D-galactosidasa de semilla de café (Gesson et al, 1994); una prodroga de 5-fluorouridina activada por una �-D-galactosidasa (Abraham et al, 1994); y prodrogas de metotrexato (p.e. metotrexato-alanina) activadas por carboxipeptidasa A (Kuefner et al, 1990, Vitols et al, 1992 and Vitols et al, 1995). Estas y otras se incluyen en la siguiente tabla.

Enzima

Prodroga

Carboxipeptidasa G2 Fosfatasa alcalina

Derivados de mostazas de ácido L-glutámico y ácido benzoico, mostazas de anilina, mostazas de fenol y mostazas de feniléndiamina; derivados fluorados de estas Etopósido fosfato Mitomicina fosfato

Beta-glucuronidasa

Glucurónido de mostaza de p-Hidroxianilina Glucurónido de Epirrubicina

Penicilina V amidasa

Adriamicin-N fenoxiacetilo

Penicilina G amidasa

N-(4’-hidroxifenil acetil) palitoxina Doxorrubicina y melfalán

Beta lactamasa Beta glucosidasa

p-feniléndiamina cefalosporina de mostaza de nitrógeno; derivados de doxorrubicina; cefalosporina derivada de vinblastina, mostaza de cefalosporina; derivado de taxol Ácido cianofenilmetil-beta-D-gluco-piranosidurónico

Nitrorreductasa

5-(Azaridina-1-ilo-)-2,4-dinitrobenzamida

Citosín deaminasa

5-Fluorocitosina

Carboxipeptidasa A

Metotrexato-alanina

(Esta tabla está adaptada de Bagshawe (1995) Drug Dev. Res. 34, 220-230, de donde pueden obtenerse referencias completas para estos diferentes sistemas; el derivado de taxol se describe en M.L. et al (1995) Chemistry & Biology 2, 223).

Las enzimas adecuadas para formar parte de la porción enzimática incluyen: exopeptidasas, tales como carboxipeptidasas G,

5 G1, y G2 (para las mostazas de prodrogas glutamiladas), carboxipeptidasas A y B (para prodrogas basadas en MTX) y aminopeptidasas (para prodrogas de 2-a-aminoacil MTC); endopeptidasas, tales como, p.e., trombolisina (para prodrogas de trombina); hidrolasas, tales como fosfatasas (p.e., fosfatasa alcalina) o sulfatasas (p.e., aril sulfatasas) (para prodrogas fosforiladas o sulfatadas); amidasas, tales como amidasas de penicilina y arilacil amidasa; lactamasas, tales como

�-lactamasas; glicosidasas, como �-glucuronidasa (para antraciclinas �-glucuronómido), a-galactosidasa (para amigdalina) y

10 �-galactosidasa (para antraciclina �-galactosa); deaminasas, tales como citosina deaminasa (para 5FC); quinasas, tales como uroquinasa y timidina quinasa (para ganciclovir); reductasas, tales como nitrorreductasa (para CB1954 y análogos), azorreductasa (para mostazas de azobenceno) y DT-diaforasa (para CB1954); oxidasas, tales como glucosa oxidasa (para glucosa), xantina oxidasa (para xantina) y lactoperoxidasa; DL-racemasas, anticuerps catalíticos y ciclodextrinas.

La prodroga es relativamente no tóxica, en comparación con la droga citotóxica. Por lo regular, tiene menos de 10% de la

15 toxicidad, de preferencia, menos de 1% de la toxicidad, según el resultado de la medida en una prueba adecuada de citotoxicidad in vitro.

Es probable que la fracción capaz de convertir una prodroga en una droga citotóxica sea activa en aislamiento del resto del compuesto, pero solo es necesario que sea activa cuando (a) se encuentra en combinación con el resto del compuesto y (b) el compuesto está unido a, adyacente a, o internalizado en las células blanco.

20 Cuando la otra fracción es un polipéptido, el anticuerpo y la otra fracción pueden estar unidas entre sí mediante cualquiera de los medios convencionales de entrecruzamiento de polipéptidos, tales como los que se describen de manera general en O’Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108. Por ejemplo, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 puede estar enriquecido con grupos tiol y la otra fracción puede reaccionar con un agente bifuncional capaz de reaccionar con dichos grupos tiol, por ejemplo, el éster de ácido iodoacético de la N-hidrosuccinimida (NHIA) o N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SP-DP). Los enlaces amida y tioéster, por ejemplo, conseguidos mediante éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida son, por lo general, más estables in vivo que los puentes disulfuro.

De manera alternativa, el compuesto puede producirse como un compuesto de fusión, mediante técnicas de ADN recombinante, en las cuales, un segmento de ADN contiene las regiones respectivas que codifican para el anticuerpo y la otra fracción, ya sea adyacentes una de otra, o separadas por una región que codifica para un polipéptido de unión que no destruye las propiedades del compuesto. Concebiblemente, las dos porciones del compuesto pueden sobrelaparse total o parcialemente.

El ADN, a continuación, se expresa en un huésped adecuado para producir un polipéptido que contiene el compuesto de la invención.

La fracción citotóxica puede ser un radiosensibilizador. Los radiosensibilizadores incluyen las fluoropirimidinas, los análogos de timidina, la hidroxiurea, la gencitabina, la fludarabina, la nicotinamida, las pirimidinas halogenadas, la 3-aminobenzamida, la 3-aminobenzodiamida, el etanixadol, el pimonidazol y el misonidazol (ver, por ejemplo, McGinn et al (1996) J. Natl. Cancer Inst. 88, 1193-11203; Shewach & Lawrence (1996) Invest. New Drugs 14, 257-263; Horsman (1995) Acta Oncol. 34, 571-587; Shenoy & Singh (1992) Clin. Invest. 10, .533-551; Mitchell et al (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56, 827-836; Iliakis & Kurtzman (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 1235-1241; Brown (1989) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16, 987-993; Brown (1985) Cancer 55, 2222-2228).

También, la entrega de genes a las células puede radiosensibilizarlas, por ejemplo, la insernción del gen de p53 o la ciclina D (Lang et al (1998) J. Neurosurg. 89, 125-132; Coco Martin et al (1999) Cancer Res. 59, 1134-1140).

La fracción adicional puede ser una que se convierta en citotóxica, o libere una fracción citotóxica, bajo irradiación. Por ejemplo, el isótopo de boro 10, cuando se le irradia adecuadamente, libera partículas a que son citotóxicas (ver, por ejemplo, US 4.348. 376 a Goldenberg; Primus et al (1996) Bioconjug. Chem. 7, 532-535).

De manera similar, la fracción citotóxica puede ser una que sea útil en la terapia fotodinámica, tal como la fotofrina (ver, por ejemplo, Dougherty et al (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90, 889-905).

La otra fracción puede contener una molécula de ácido nucleico que sea directa o indirectamente citotóxica. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede ser un oligonucleótido antisentido que, al ser localizado en el sitio blanco sea capaz de penetrar a las células y provocarles la muerte. El oligonucleótido, por tanto, puede ser uno de los que evita la expresión de un gen esencial, o uno que conduzca a un cambio en la expresión génica que provoque apoptosis.

Ejemplos de oligonucleótidos adecuados incluyen los dirigidos a bcl-2 (Ziegler et al (1997) J. Natl. Cancer Inst. 89, 1027-1036), y ADN polimerasa a y topoisomerase IIa (Lee et al (1996) Anticancer Res. 16, 1805-1811.

Los ácidos nucleicos de péptidos pueden resultar útiles en lugar de los ácidos nucleicos convencionales (ver Knudsen & Nielsen (1997) Anticancer Drugs 8, 113-118).

En otra realización, el anticuerpo puede estar contenido en un vehículo de entrega, para la entrega del ácido nucleico al blanco. El vehículo de entrega puede ser cualquier vehículo de entrega apropiado. Puede, por ejemplo, ser un liposoma que contenga ácido nucleico, o puede ser un virus o una partícula similar a un virus que sea capaz de entregar un ácido nucleico. En estos casos, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 está presente, por lo regular, en la superficie del vehículo de entrega. Por ejemplo, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4, tal como un fragmento adecuado de anticuerpo, puede estar presente en la superficie externa de un liposoma y el ácido nucleico a ser entregado puede estar presente en el interior del liposoma. Como otro ejemplo, un vector viral, tal como un vector retroviral o adenoviral, se construye, de manera que el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 se encuentra unido a o se localiza en, la superficie de la partícula, lo que permite que la partícula viral sea direccionada al sitio deseado. También se conocen sistemas de entrega direccionada como los sistemas de adenovirus modificados, descritos en WO 94/10323 en los que, por lo regular, el ADN es portado por la partícula adenoviral o de tipo adenoviral. Michael et al (1995) Gene Therapy 2, 660-668 describen una modificación de los adenovirus para añadir una fracción selectiva de células a una fibra proteica. También se encuentran disponibles retrovirus diseccionados para el uso en la invención; por ejemplo, secuencias que confieren afinidades de unión específicas pueden construirse dentro de genes env virales preexistentes (ver Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199 para una revisión de este y otros vectores diseccionados para la terapia génica).

Inmunoliposomas (liposomas direccionados por anticuerpos) que contienen un anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 pueden emplearse. Para la preparación de inmunoliposomas MPB-PE (N-[4-(p-maleimidofenill) butiril]-fosfatidiletanolamina) se sintetiza de acuerdo con el método de Martin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288. MBP-PE se incorpora a las bicapas liposomales para permitir una unión covalente del anticuerpo anti-ECSM4, o un fragmento del mismo, a la superficie liposomal. El liposoma se carga de modo conveniente con el ADN u otra construcción genética, seguida por la extrusión secuencial a través de filtros de membranas de policarbonato con tamaños de poro de 0.6 !m y 0.2 !m bajo presiones de nitrógeno de hasta 0.8 MPa. Después de la extrusión, la construcción de ADN atrapada se separa de la construcción de ADn libre por ultracentrifugación a 80 000 x g durante 45 minutos. Los liposomas MBP-PE acabados de preparar en tampón desoxigenado se mezclan con el anticuerpo recién preparado (o un fragmento del mismo) y se llevan a cabo las reacciones de acoplamiento en una atmósfera de nitrógeno a 4º C bajo rotación constante durante toda la noche. Los inmunoliposomas se separan de los anticuerpos no conjugados por ultracentrifugación a 80 000 x g durante 45 min. Los inmunoliposomas pueden inyectarse por vía intraperitoneal o directamente en el tumor.

El ácido nucleico entregado al sitio blanco puede ser cualquier ADN que conduzca, de manera directa o indirecta, a la citotoxicidad. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar para una ribozima que sea citotóxica para la célula, o puede codificar para una enzima que sea capaz de convertir un prodroga esencialmente no tóxica en una droga citotóxica (este último sistema a veces recibe el nombre de GDEPT: Terapia enzimática de Prodroga dirigida por gen).

Las ribozimas que pueden estar codificadas en el ácido nucleico a ser entregado al blanco se describen en Cech and Herschlag "Site-specific cleavage of single stranded DNA" US 5.180.818; Altman et al "Cleavage of targeted RNA by RNAse P" US 5.168.053, Cantin et al "Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA" US 5.149.796; Cech et al "RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods", US 5.116.742; Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endonucleases and methods", US 5.093.246; and Been et al "RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods; cleaves single-stranded RNA at specific site by transesterification", US 4.987.071. Blancos adecuados para las ribozimas incluyen factores de transcripción, tales como c-fos y c-myc, y bcl-2. Durai et al (1997) Anticancer Res. 17, 3307-3312 describen una ribozima cabeza de martillo contra bcl-2.

EP 0 415 731 describe el sistema GDEPT. Consideraciones similares en cuanto a la selección de la enzima y la prodroga se aplican al sistema GDEPT del mismo modo que al sistema ADEPT descrito anteriormente.

El ácido nucleico entregado al sitio blanco puede codificar para un polipéptido directamente citotóxico.

De manera alternativa, la otra porción puede incluir un polipéptido o un polinucleótido que codifique para un polipéptido que no sea directa ni indirectamente citotóxico, pero que sí sea de beneficio terapéutico. Ejemplos de tales polipéptidos incluyen citoquinas anti-proliferativas o antiinflamatorias que pueden ser beneficiosas para la ateroesclerosis, y los inmunomoduladores

o factores antiproliferativos que influyen sobre la coagulación de la sangre pueden ser beneficiosos para el tratamiento del cáncer.

La otra fracción puede resultar un inhibidor útil de la angiogénesis, tal como los péptidos angiostatina o endostatina. La otra fracción puede también resultar una enzima útil que convierte un polipéptido precursor a angiostatina o endostatina. Las metaloproteasas matriciales humanas tales como la elastasa de macrófagos, la gelatinasa y la estromolisina convierten el plasminñogeno a angiostatina (Cornelius et al (1998) J. Immunol. 161, 6845-6852). El plasminógeno es un precursor de la angiostatina.

En otra realización de la invención, la otra fracción es una fracción fácilmente detectable.

En el término “fracción fácilmente detectable” incluimos el sentido de que la fracción es una que, cuando se localiza en el sitio blanco luego de la administración del compuesto a un paciente, puede ser detectada, por lo regular, de manera no invasiva desde el exterior del organismo y puede detectarse el sitio blanco. Por tanto, los compuestos son útiles para la imaginología y el diagnóstico.

Por lo regular, la fracción fácilmente detectable es, o comprende, un átomo readiactivo que es útil en la imaginología. Átomos radiactivos adecuados incluyen el tecnecio 99, o el yodo 123 para estudios cintigráficos. Otras fracciónes fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, las marcas de espín para la imaginología de resonancia mágnetica (MRI), tales como yodo 123 nuevamente, yodo 131, indio 111, flúor 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro. Obviamente, el compuesto debe tener una cantidad suficiente del isótopo atómico apropiado para que la molécula pueda detectarse con facilidad.

La marca radiactiva o de otro tipo puede ser incorporada al compuesto por medios conocidos. Por ejemplo, el anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4 puede ser biosintetizado o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos, empleando los precursores aminoacídicos apropiados, lo que incluye, por ejemplo, el flúor 19 en lugar del hidrógeno. Las marcas tales como 99Tc, 123I, 186Rh, 188Rh, e 111In pueden, por ejemplo, unirse mediante un residuo de cisteína a la fracción de unión. El Itrio 90 puede unirse mediante un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker er al (1978) Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 49-57) puede emplearse para incorporar yodo 123. La referencia ("Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", J-F Chatal, CRC Press, 1989) describe otros métodos en detalle.

En otra realización preferida de la invención, la otra fracción es capaz de unirse de manera selectiva a una fracción directa o indirectamente citotóxica o a una fracción fácilmente detectable. Por tanto, en esta realización, la otra fracción puede ser cualquier fracción que se una a otro compuesto o componente que sea citotóxico o fácilmente detectable.

La otra fracción puede, por tanto, ser un anticuerpo que se una de manera selectiva a otro compuesto o componente, o puede ser alguna otra fracción de unión, tal como la estreptavidina, o la biotina, o similares. Los ejemplos siguientes ilustran los tipos de moléculas que se encuentran incluidos; se puede deducir fácilmente la utilidad de otras moléculas a partir de las explicaciones que se brindan en este documento.

Un anticuerpo biespecífico, en el que un sitio de unión incluye la fracción que se une de manera selectiva a ECSM4 humano y el segundo sitio de unión incluye una fracción que se une, por ejemplo, a una enzima que es capaz de convertir una prodroga sustancialmente no tóxica en una droga citotóxica.

Un compuesto, tal como un anticuerpo que se une de manera selectiva a ECSM4, al cual se ha unido biotina, avidina o estreptavidina, que han sido marcadas con una sonda fácilmente detectable puede emplearse de conjunto con el anticuerpo marcado con biotina en un sistema de imaginología de dos etapas, en el que el anticuerpo marcado se localiza primero en el sitio blanco en el paciente, y luego, la avidina o estreptavidina marcadas se administran al paciente. Los sistemas de anticuerpos biespecíficos y de biotina/estreptavidina (avidina) están revisados en Rosebrough (1996) Q J Nucl. Med. 40,234-251.

En una realización preferida de la invención, el anticuerpo que se une selectivamente a ECSM4 humano y la otra fracción son polipéptidos que se encuentran fusionados.

Los compuestos del segundo aspecto de la invención son útiles para el tratamiento, la imaginología o el diagnóstico de enfermedades, en particular, enfermedades en las que puede formarse nueva vasculatura indeseable, como se describe más adelante en más detalle.

Se aprecia que una molécula de ácido nucleico puede codificar un compuesto del segundo aspecto de la invención en el que el anticuerpo y la fracción adicional son polipéptidos que están fusionados.

Métodos de enlazar polinucleótidos se describen adelante en mayor detalle.

El anticuerpo o el compuesto para uso según la invención puede formularse como una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el compuesto y un portador farmacéuticamente aceptable.

En el término “farmacéuticamente aceptable” se incluye que la formulación sea estéril y libre de pirógenos. En la técnica farmacéutica se conocen bien portadores farmacéuticamente aceptables.

Los portadores deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con el anticuerpo o compuestos de la invención y no deletéreos para los receptores del mismo. Por lo regular, los portadores serán agua o solución salina estéril y libre de pirógenos; sin embargo, pueden emplearse otros portadores aceptables.

Por lo regular, las composiciones o formulaciones farmacéuticas son para la administración parenteral, más particularmente, para la administración intravenosa.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones estériles de inyección, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con respecto a la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden contener agentes de suspensión y agentes que las tornan más densas.

Un compuesto según el segundo aspecto de la invención en el que la fracción adicional es una fracción fácilmente detectable son útiles puede usarse en un método de imaginología del endotelio vascular en el cuerpo de un individuo por administración al individuo de una cantidad eficaz de dicho compuesto.. Por lo regular, el endotelio vascular está relacionado con la angiogénesis.

La imaginología del endotelio vascular de un individuo, por lo regular, incluye la detección de la localización del compuesto en dicho individuo.

La detección del compuesto o el anticuerpo puede llevarse a cabo empleando métodos bien conocidos en la técnica de imaginología y diagnóstico clínico. El método específico que se requiera dependerá del tipo de marca detectable unida al compuesto o anticuerpo. Por ejemplo, los átomos radiactivos pueden detectarse empleando autorradiografía o, en algunos casos, mediante imaginología de resonancia magnética (MRI), como se describió con anterioridad.

La imaginología del endotelio vascular en el cuerpo resulta útil porque puede proporcionar información acerca de la salud del organismo. Resulta de particular utilidad cuando el endotelio vascular está enfermo, o se encuentra en proliferación debido a un crecimiento canceroso. La imaginología del cáncer en un paciente es especialmente útil, porque puede emplearse para determinar el tamaño de un tumor y si el mismo está respondiendo a tratamiento. Dado que las enfermedades metastáticas involucran la formación de nuevos vasos sanguíneos, el método resulta útil en la evaluación de si ha ocurrido una metástasis.

El endotelio vascular puede ser neovasculatura, tal como la que se produce en el cáncer.

Un compuesto según el segundo aspecto de la invención en el que la fracción adicional es una fracción fácilmente detectable puede usarse en un método para el diagnóstico o el pronóstico, en un individuo, de una dolencia que involucra al endotelio vascular, mediante administración al individuo de una cantidad eficaz de dicho compuesto..

La dolencia puede ser una que incluya el crecimiento aberrante o excesivo del endotelio vascular, tal como el cáncer, aterosclerosis, restenosis, retinopatía diabética, artritis, soriasis, endometriosis, menorragia, los hemangiomas, y las malformaciones venosas.

El método puede ser uno que sea una ayuda para el diagnóstico.

El diagnóstico o el apoyo al diagnóstico de una dolencia que incluye el endotelio vascular en un individuo, por lo regular, incluye la detección de la localización del compuesto en el individuo. De preferencia el endotelio es en nueva vasculatura, o sea, vasculatura angiogénica.

La función de ECSM4 puede no ser la promoción de la proliferación de las células del endotelio vascular. Por lo tanto, el nivel de expresión de los polipéptidos ECSM4 en una célula endotelial puede no ser informativo con respecto de la salud del endotelio vascular. Sin embargo, la localización de la expresión de los polipéptidos ECSM4 puede resultar informativa, ya que representan el crecimiento de los vasos sanguíneos. La proliferación celular anormal, tal como el cáncer puede diagnosticarse mediante la detección de nueva vasculatura.

Un compuesto según el segundo aspecto de la invención en el que la fracción adicional es una fracción citotóxica o terapéutica puede usarse en un método para tratamiento de un individuo en necesidad de tratamiento, mediante administración al individuo de una cantidad eficaz de dicho compuesto.

El paciente que requiere el tratamiento puede tener una enfermedad proliferativa o una dolencia que involucra al endotelio vascular.

Una cantidad de enfermedades y dolencias involucra la formación no deseada de nueva vasculatura. La formación de nueva vasculatura está asociada con el cáncer, la soriasis, la aterosclerosis, la menorragia, la artritis (tanto inflamatoria como reumatoidea), la degeneración macular, la enfermedad de Pager, la retinopatía y sus complicaciones vasculares (incluyendo las proliferativas y de prematuridad, y diabéticas), las proliferaciones vasculares benignas y las fibrosis.

Por cáncer se incluye el sarcoma de Kaposi, la leucemia, el linfoma, el mieloma, los carcinomas sólidos (tanto primarios como secundarios (metástasis), los tumores vasculares, incluyendo el hemangioma (tanto capilar como juvenil (infantil)), la hemangiomatosis y el hemagioblastoma.

Así, el compuesto del segundo aspecto de la invención puede usarse en un método de tratar un paciente que tiene una enfermedad en la que la angiogénesis contribuye a la patología.

Por lo regular, la enfermedad se asocia con la formación de nueva vasculatura indeseada y el tratamiento reduce la misma en una cantidad apropiada.

Los tumores que pueden tratarse por los métodos de la invención incluyen cualesquiera tumores asociados con la producción de nuevos vasos sanguíneos.

El término “tumor” debe entenderse como referido a todas las formas de crecimiento celular neoplásico, incluyendo los tumores de pulmón, de hígado, de células sanguíneas, de piel, de páncreas, de estómago, de colon, de próstata, de útero, de mamas, de glándulas linfáticas y de vejiga. Los tumores sólidos son especialmente apropiados. Sin embargo, actualmente también se estima que los cánceres de la sangre, incluyendo las leucemias y los linfomas también involucran la formación de nuevos vasos sanguíneos y pueden tratarse por medio de los métodos de la invención.

Normalmente para uso en los métodos de tratamiento antes mencionados, la otra fracción es una que destruye o desacelera, o revierte el crecimiento de la nueva vasculatura.

Se apreciará con facilidad que, en dependencia del compuesto particular empleado en la imaginología, el diagnóstico o el tratamiento, el momento de la administración puede variar, así como la cantidad de otros componentes empleados en los sistemas terapéuticos aquí descritos.

Por ejemplo, en el caso en el que el compuesto del segundo aspecto de la invención comprenda una fracción fácilmente detectable o una fracción directamente citotóxica, puede suceder que solo el compuesto, en una formulación adecuada, sea para la administración al paciente, Por supuesto, al paciente se le pueden administrar otros agentes, tales como agentes inmunosupresores y similares.

Con respecto a los compuestos que se encuentran marcados de manera detectable, la imaginología tiene lugar una vez que el compuesto ha localizado el sitio blanco.

Sin embargo, si el compuesto es tal que requiere otro componente para ser útil para el tratamiento, la imaginología y el diagnóstico, el compuesto puede administrarse y permitírsele que localice el sitio blanco y, con posterioridad, administrar el otro componente pasado un lapso de tiempo adecuado.

Por ejemplo, con respecto a los sistemas de tipo ADEPT y GDEPT antes mencionados, el compuesto fracción de unión-fracción enzimática se administra y se localiza en el sitio blanco. Una vez que esto está hecho, se administra la prodroga.

Algo similar sucede, por ejemplo, con respecto a los compuestos en los cuales la otra fracción contenida en el compuesto es tal que se une a otro componente, el compuesto puede administrarse primero y permitírsele que se localice en el sitio blanco y, a continuación, administrar el otro componente.

Por tanto, en una realización, se administra al paciente un anticuerpo anti ECSM4 marcado con biotina y, luego de un período de tiempo adecuado, se administra estreptavidina marcada de manera detectable. Una vez que la estreptavidina se haya localizado en los sitios en los que se ha localizado el anticuerpo (o sea, los sitios blanco), tiene lugar la imaginología. Se cree que los compuestos del segundo aspecto de la invención en los que la otra fracción es una fracción fácilmente detectable, pueden resultar útiles para la determinación del estado angiogénico de los tumores u otros estados de enfermedad en los que la angiogénesis contribuye a la patología. Esto puede ser un factor importante que influya en la naturaleza y el desenlace de la terapia futura.

Un compuesto seún el segundo aspecto de la invención en el que la fracción adicional es una marca fácilmente detectable puede usarse en la fabricación de un agente de diagnóstico o pronóstico para una condición que implica al endotelio vascular.

Un compuesto seún el segundo aspecto de la invención en el que la fracción adicional es una fracción citotóxica o terapéutica puede usarse en la fabricación de un agente de diagnóstico o pronóstico para una condición que implica al endotelio vascular.

Las condiciones que implican el endotelio vascular se describen más adelante.

“Fragmentos” del polipéptido ECSM4 humano incluyen polipéptidos que comprenden al menos cinco aminoácidos consecutivos del polipéptido ECSM4. Preferiblemente, un fragmento del polipéptido comprende una secuencia aminoacídica que es útil como un péptido para producir un anticuerpo que es específico para el polipéptido ECSM4 humano. Normalmente, los fragmentos tienen al menos 8 aminoácidos, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 12 o 15 o 20 o 30

o 40 o 50 aminoácidos consecutivos del polipéptido ECSM4 o ECSM1. Preferiblemente, fragmentos del polipéptido ECSM4 comprenden pero no consisten de cualquiera de las secuencias aminoacídicas representadas por las SEC. ID. No 18085 de EP 1 074 617, SEC ID No 211 de WO 00/53756 o W099146281, SEC ID Nos 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523,

o SEC ID No 86 de WO 99/11293, o cualquiera de las secuencias aminoacídicas codificadas por la SEC. ID No 18084 o 5096 de EP 1 074 617, SEC ID No 210 de WO 00 53756 o WO 99/46281, o SEC ID Nos 22, 23, 96 o 98 de WO 01/23523 y SEC ID No 31 de WO 99/11293.

Normalmente, los fragmentos de polipéptido ECSM4 son unos que tienen porciones de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 4 o Figura 12.

El fragmento del polipéptido ECSM4 puede ser un fragmento que tiene la secuencia LSQSPGAVPQALVAWRA, DSVLTPEEVALCLEL, TYGYISVPTA, KGGVLLCPPRPCLTPT, WLADTW, WLADTWRSTRGSRD, SPPTTYGYIS, GSLANGWGSASEDNAASRASLVSSSDGSFLAD o FARALAVAVD, o tiene una secuencia de al menos 5 u 8 o 10 residuos de cualquiera de estas secuencias. Estos péptidos corresponden a aminoácidos 165-181, 274-288, 311-320, 336-351, 8-13, 8-21, 307-316, 355-387, y 390-399 respectivamente del polipéptido ECSM4 humano mostrado en Figura 4. Los péptidos WLADTW, WLADTWRSTRGSRD, SPPTTYGYIS, GSLANGWGSASEDNAASRASLVSSSDGSFLAD y FARALAVAVD representan regiones conservadas entre los homólogos de ratón y humano del polipéptido ECSM4, y entre el polipéptido ECSM4 y la proteína dutt1 de ratón. Los péptidos LSQSPGAVPQALVAWRA, DSVLTPEEVALCLEL, TYGYISVPTA y KGGVLLCPPRPCLTPT pueden ser útiles para promover anticuerpos.

Los péptidos preferidos son péptidos de al menos 5 u 8 o 10 o 12 o 15 o 20 residuos aminoácidos consecutivos de estas secuencias conservadas.

El fragmento del polipéptido ECSM4 puede ser un fragmento que tiene la secuencia GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE y ERATQEPSEHGP. Estos péptidos corresponden a regiones del polipéptido ECSM4 humano (localizadas en los residuos 4-16, 91-109, 227-236,288-300 y 444-455, respectivamente en la Figura 12) que no son, o solo lo son pobremente, conservadas en el homólogo de ratón (ver Figura 14). Como se describirá más adelante, tales péptidos pueden resultar particularmente útiles para activar anticuerpos contra el polipéptido ECSM4 humano.

De acuerdo con el programa de predicción de dominios de transmembrana llamado PRED-TMR (disponible en el sitio de Internet http://www.biophys.biol.uoa.gr) y un alineamiento de la secuencia aminoacídica con la proteína humana Robo1 (cuya región de transmembrana se conoce), los residuos 1-467, como muestra la Figura 12 tienen posibilidades de ser extracelulares, y además de ser extracelulares y estar expuestos, pueden incluir el sitio de unión para el ligando natural. Por lo tanto, fragmentos de ECSM4 que contengan o consistan en una secuencia del dominio extracelular de los residuos 1-467 de la Figura 12, pueden representar fragmento útiles para activar anticuerpos selectivos para células que expresen ECSM4 en su superficie y que pueden también resultar útiles en la modulación de la actividad del polipéptido ECSM4.

Por tanto, los fragmentos preferidos del polipéptido ECSM4 son aquellos fragmentos de la secuencia polipeptídica de la Figura 12 que comprenden, al menos 1, 3, ó 5 residuos aminoacídicos que no están conservados cuando se compara con el ECSM4 de ratón (como se muestra en la Figura 13). Con mayor preferencia, al menos 7, 9, 11, ó 13 residuos aminoacídicos en el fragmento no están conservados entre el ECSM4 humano y el ECSM4 de ratón, y con mayor preferencia aún, al menos 15, 17, 19, ó 21 residuos del fragmento no están conservados entre el ECSM4 humano y el ECSM4 de ratón. La secuencia de tales fragmentos puede determinarse a partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas humana y de ratón que se muestran en la Figura 14.

Una “variante” del polipéptido ECSM4 incluye variantes naturales, incluyendo variaciones alélicas y formas mutantes que ocurren en la naturaleza, y variantes con inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservativas o no conservativas, cuyos cambios no alteran de manera significativa la actividad de dicho polipéptido. En el caso del polipéptido ECSM4, como un homólogo endotelial específico de la glorieta 1 humana, puede muy bien estar involucrado en la guía repulsiva de la célula endotelial.

Por “sustitución conservativa” se entienden combinaciones tales como Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; and Phe, Tyr.

En “sustitución no conservativa” incluimos otras sustituciones, tales como aquellas en que el residuo sustituido mimetiza una modificación particular del residuo remplazado, por ejemplo una tirosina o serina fosforiladas pueden ser remplazadas por un aspartato o un glutamato, merced a la similitud de la cadena lateral del aspartato o el glutamato con un residuo fosforilado (en este caso, portan carga negativa a pH neutro).

Otras sustituciones no conservativas que se encuentran incluidas dentro del término “variantes” son mutaciones puntuales que alteran uno, a veces dos y, por lo regular no más de tres aminoácidos.

Variantes del polipéptido ECSM4 humano incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia con al menos 65% de identidad con la secuencia aminoacídica dada en la Figura 4, o la Figura 12, preferentemente al menos 70% u 80% u 85% o 90% de identidad con dicha secuencia, y con mayor preferencia al menos 95%, o 98% de identidad con dicha secuencia aminoacídica.

El porcentaje de identidad puede determinarse empleando, por ejemplo, el programa LALIGN (Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357) disponible en el sitio de Expasy (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN form.html) empleando como parámetros la opción de alineamiento global, la matriz de puntuación BLOSUM62, -14 como penalización para la apertura de hendiduras, -4 como penalización para la extensión de hendiduras.

Un aspecto adicional de la invención provee un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un compuesto según el segundo aspecto de la invención en el que el anticuerpo y la fracción adicional son polipéptidos que están fusionados, para uso como un medicamento.

Por “vector de expresión” queremos significar uno que es capaz, en un huésped apropiado, de expresar un polipéptido codificado por el polinucleótido.

Tales vectores pueden ser útiles en medicina. Vectores de expresión que comprenden un polinucleótido que codifica un compuesto según el segundo aspecto de la invención en el que el anticuerpo y la fracción adicional son polipéptidos que están fusionados, que son adecuados para uso en terapia génica están dentro del alcance de la invención. Por ello, en una realización preferida, el vector es uno que es adecuado para uso en terapia génica.

El ADN (o en el caso de vectores retrovirales, APN) que codifican el polipéptido pueden unirse a una amplia variedad de otras secuencias de ADN para introducción en un huésped apropiado. El ADN compañero dependerá de la naturaleza del huésped, la forma de introducción del ADN en el huésped, y si se desea mantenimiento o integración episomal.

Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, tal como un plásmido en orientación correcta y correcto marco de lectura para expresión. Si es necesario, el ADN puede estar vinculado a las apropiadas secuencias nucleotídicas de control regulatorio transcripcional y transnacional reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles son generalmente disponibles en el vector de expresión. Luego el vector se introduce en el huésped mediante técnicas estándar.

De preferencia, un anticuerpo que se une selectivamente a ECSM4 es uno que se une a un polipéptido cuya secuencia aminoacídica contiene la secuencia dada en cualesquiera de las Figuras 4, 5 ó 12, pero no se une al polipéptido representado por ninguno de los ID. SEC No. 18085 de EP 1 074 617, ID. SEC. No 211, ya sea de WO 00/53756 o WO99/46281, ID. SEC. Nos 24-27, 29, 30, 33, 34, 38 o 39 de WO 01/23523, o ID. SEC. No 86 de WO 99/11293, o codificado por ninguna de las secuencias nucleotídicas representadas por el ID. SEC No 18084 o 5096 de EP 1 074 617, ID. SEC. No 210 de WO 00/53756

o WO 99/46281, o ID. SEC. Nos 22, 23, 96 o 98 de WO 01/23523 e ID. SEC. No 31 de WO 99/11293.

En el término “unir selectivamente” incluimos anticuerpos que se unen al menos con diez veces más fuerza a ECSM4 que a otro polipéptido; de preferencia al menos 50 veces con más fuerza y, con mayor preferencia, al menos con 100 veces más fuerza. Tales anticuerpos pueden fabricarse por métodos bien conocidos en la técnica, empleando la información relacionada con las diferencias en las secuencias aminoacídicas de ECSM4 y otro polipéptido que no sea ECSM4.

Los anticuerpos que se unen de manera selectiva a ECSM4 pueden modular también la función del polipéptido ECSM4. Los anticuerpos que mimetizan el efecto de la unión del verdadero ligando mediante la estimulación o la activación de ECSM4, o que se unen y de ese modo evitan la unión subsiguiente y la activación o estimulación de ECSM4 por el ligando verdadero, y tales anticuerpos moduladores de la función están incluidos en el alcance de la invención. Se apreciará que los anticuerpos que modulan la función son útiles como un instrumento de investigación, por ejemplo, en el estudio de los efectos de la estimulación o activación de ECSM4, o procesos posteriores desencadenados por dicha estimulación. Dichos anticuerpos son útiles en la medicina, por ejemplo, en la modulación de la angiogénesis en pacientes. Específicamente, la modulación de la angiogénesis por la administración de dichos anticuerpos puede resultar útil para el tratamiento de una enfermedad en un paciente en el que la modulación de la angiogénesis resulte beneficiosa, como el cáncer.

Los siguientes péptidos pueden resultar útiles como inmunógenos en la generación de anticuerpos, tales como suero policlonal de conejo: LSQSPGAVPQALVAWRA, DSVLTPEEVALCLEL, TYGYISVPTA and KGGVLLCPPRPCLTPT.

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención se une de manera selectiva a una secuencia aminoacídica de secuencia GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE o ERATQEPSEHGP. Estas secuencias representan secuencias aminoacídicas que no son idénticas entre las secuencias polipéptidicas de ECSM4 de humano y ratón. Por lo general, los polipéptidos ECSM4 de humano y ratón muestran un alto grado de identidad, lo que hace que la producción de anticuerpos de ratón contra el ECSM4 humano sea particularmente difícil, debido a la falta de inmunogenicidad de gran parte de la secuencia de ECSM4 humana en ratón. Las secuencias aminoacídicas que están ausentes del ECSM4 de ratón tienen más probabilidad de ser inmunogénicas en un ratón que las secuencias que están presentes en el ECSM4 de ratón (un alineamiento entre las secuencias aminoacídicas del ECSM4 humano y de ratón se encuentra en la Figura 14). Por tanto, los fragmentos polipeptídicos que contienen secuencias únicas al ECSM4 humano como se describió con anterioridad son más útiles que los polipéptidos ECSM4 cuyas secuencias se encuentran tanto en humanos como en ratones, para la producción de anticuerpos que se unen de manera selectiva al polipéptido ECSM4 humano.

Los anticuerpos generados como resultado del uso de secuencias aminoacídicas que se localizan en la porción extracelular del polipéptido ECSM4 tienen probabilidad de ser útiles como moléculas blanco del tejido endotelial. Por tanto, es particularmente preferido que el anticuerpo de la invención se levante contra y, de preferencia, se una de manera selectiva a, una secuencia aminoacídica que es única del polipéptido ECSM4 humano, cuya secuencia se localiza hacia el extremo N-terminal del polipéptido, y se encuentra en la porción extracelular, localizada entre los residuos 1 y 467 de la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 12.

Aunque las secuencias aminoacídicas que son únicas del ECSM4 humano pueden emplearse para producir anticuerpos policlonales, se prefiere emplearlas para producir anticuerpos monoclonales.

Los péptidos en los que uno ó más de los residuos aminoacídicos se encuentran químicamente modificados, antes o después de la síntesis del péptido, pueden emplearse, siempre que la función del péptido, o sea, la producción de anticuerpos específicos in vivo, permanezca sustancialmente inalterada. Tales modificaciones incluyen la formación de sales con ácidos o bases, especialmente ácidos o bases orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables, la formación de ésteres o amidas a partir de un grupo carboxilo terminal, y la unión de grupos protectores a los aminoácidos, tales como N-t-butoxicarbonilo. Tales modificaciones pueden proteger al péptido del metabolismo in vivo. Los péptidos pueden estar presentes como copias simples o múltiples, por ejemplo, repeticiones en tándem. Estas repeticiones en tándem o múltiples pueden ser en sí mismas lo suficientemente antigénicas para obviar el empleo de portadores. Puede resultar ventajoso que el péptido se sintetice como un lazo, con los extremos N-terminal y C-terminal unidos, o añadir uno o más residuos de Cys a un extremo, para incrementar la antigenicidad, y/o para permitir la formación de enlaces disulfuro. Si el péptido se encuentra unido de manera covalente a un portador, de preferencia, un polipéptido, entonces el arreglo es de preferencia, tal que el péptido de la invención forma un lazo.

De acuerdo a las teorías inmunológicas en boga, una función portadora debe estar presente en cualquier formulación inmunogénica con el objetivo de estimular al, o aumentar la estimulación del, sistema inmune. Se piensa que el mejor portador contiene (o forma, de conjunto con el antígeno) un epítope de célula T. Los péptidos pueden estar asociados, por ejemplo, mediante entrecruzamiento, con un portador separado, tal como albúminas de suero, mioglobinas, toxoides bacterianos y hemocianina. Más recientemente, los portadores desarrollados que inducen la ayuda T en la respuesta inmune incluyen el antígeno del núcleo de la hepatitis B (también llamado proteína de la nucleocápside), epítopes de células T presumibles, tales como Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, -galactosidasa y el péptido 163-171 de la interleuquina-1. El último compuesto puede verse como portador o como adyuvante, o ambos. De manera alternativa, varias copias del mismo o diferentes péptidos de la invención pueden entrecruzarse, en esta situación no existe un portador separado como tal, sino que la función portadora puede ser proporcionada por dicho entrecruzamiento. Agentes de entrecruzamiento adecuados incluyen los listados como tal en los catálogos de Sigma y Pierce, por ejemplo, el glutaraldehído, la carbodiimida y el succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, cuyo último agente explota el grupo SH del residuo de cisteína en el C-terminal (si está presente).

Si el péptido se prepara por la expresión de una secuencia de un nucleótido adecuado en un huésped adecuado, entonces puede ser ventajoso expresar el péptido como un producto de fusión con una secuencia peptídica que actúa como un portadro. El sistema de Kabigen “ECOSOC” es un ejemplo de tal reordenamiento.

Los péptidos pueden sintetizarse por el método Fmoc-poliamida de síntesis de péptidos en fase sólida, como está descrito en Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433, y las referencias de dicho trabajo. La protección temporal del grupo N-amino se logra por el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La ruptura repetitiva de este grupo protector altamente lábil ante bases se efectúa empleando 20% de piperidina en N,N-dimetilformamida. Las funciones de las cadenas laterales pueden protegerse como sus éteres butílicos (en el caso de serina, treonina y tirosina), butil ésteres (en el caso del ácido glutámico y el ácido aspártico), derivado de butiloxicarbonilo (en el caso de lisina e histidina), derivado tritilo (en el caso de cisteína) y derivado de 4-metoxi-2,3,6-trimetil-bencenosulfonilo (en el caso de arginina). En el caso en que la glutamina o la asparagina son los residuos C-terminal, se hace uso del grupo 4,4’-dimetoxibenzidrilo para la protección de las funcionalidades de las cadenas laterales amido. El soporte de fase sólida se basa en un polímero de polidimetil archilamida, constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida (monómero del esqueleto), bisacrioiletilén diamino (entrecruzador) y el éster metílico de acriloilsarcosina (agente funcionalizador). El agente unido escindible de péptido a resina empleado es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético lábil al ácido. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en la forma de sus derivados de anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la asparagina y la glutamina, que se añaden empleando un procedimiento de acoplamiento reverso mediado por N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se monitorean empleando procedimientos de prueba de ninhidrina, ácido trinitrobeceno sulfónico o isotina. Al completar la síntesis, se separan los péptidos del soporte de resina con la remoción concomitante de los grupos protectores de las cadenas laterales, mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95%, conteniendo una mezcla limpiadora al 50%. Los limpiadores comúnmente empleados son etanoditiol, fenol, anisol y agua, de los cuales la elección concreta depende de los aminoácidos que compongan el péptido que se está sintetizando. El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación al vacío, con la trituración subsiguiente con dietiléter que rinde el péptido crudo. Los limpiadores presentes se eliminan por un procedimiento simple de extracción que, mediante la liofilización de la fase acuosa, rinde el péptido crudo, libre de limpiadores. Los reactivos para la síntesis peptídica están generalmente disponibles a partir de Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK. La purificación puede llenarse a cabo mediante cualquiera de, o una combinación de, técnicas tales como la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de intercambio iónico y (especialmente) la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa. Se puede llevar a cabo el análisis de los péptidos empleando cromatografía de capa fina, cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa, análisis de aminoácidos después de al hidrólisis ácida y por medio de análisis de espectrometría de masas por bombardeo rápido de átomos (FAB).

Pueden activarse los anticuerpos en un animal mediante la inmunización con un péptido adecuado. Los péptidos adecuados se describen en el presente documento. De manera alternativa, con la tecnología actual, resulta posible fabricar anticuerpos como se definen en el presente documento sin necesidad de emplear animales. Dichas técnicas incluyen, por ejemplo, la tecnología de muestra de anticuerpos en fagos, como se conoce bien en la técnica. Los péptidos adecuados, como se describen en el presente documento, pueden emplearse para seleccionar los anticuerpos producidos de esta manera.

Se podrá apreciar que, con los avances en las tecnologías de anticuerpos puede no resultar necesario inmunizar un animal para producir un anticuerpo. Los sistemas sintéticos, tales como las bibliotecas de muestras de fagos, pueden emplearse. El empleo de estos sistemas se incluye en los métodos de la invención y los productos de dichos sistemas son “anticuerpos” para los propósitos de la invención.

Se reconocerá que los anticuerpos que reconocen a ECSM4 y variantes o fragmentos del mismo son reactivos de investigación y agentes terapéuticos útiles, en particular cuando se preparan como un compuesto de la invención como se describió con anterioridad. Adecuadamente, los anticuerpos de la invención son marcables para su detección, por ejemplo, puede marcárseles de modo que puedan ser detectados de modo directo o indirecto. Convenientemente, los anticuerpos se marcan con una fracción radiactiva o una fracción coloreada, o una fracción fluorescente, o pueden unirse a una enzima. Por lo regular, la enzima es una que puede convertir un sustrato no coloreado (o no fluorescente) en un producto coloreado (o fluorescente). El anticuerpo puede estar marcado con biotina (o estreptavidina) y detectarse luego de modo indirecto usando estreptavidina (o biotina) que haya sido marcada con una fracción radiactiva o una fracción coloreada, o una fracción fluorescente, o similares,

o pueden encontrarse unidas a cualquier enzima del tipo descrito antes. Normalmente, los fragmentos tienen al menos 8 aminoácidos consecutivos, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 12 o 15 o 20 o 30 o 40 o 50 aminoácidos consecutivos del polipéptido de ECSM4 o ECSM1.

Los métodos para la detección de la presencia de fragmentos de péptidos derivados de polipéptidos mayores se conocen en la técnica.

El anticuerpo que liga selectivamente a ECSM4 del primer aspecto de la invención puede usarse en un método de modular la angiogénesis en un individuo.

Preferiblemente, el anticuerpo es uno que modula la actividad o función, sea directa o indirectamente, del polipéptido ECSM4 del individuo.

Los anticuerpos preferidos son los que se describieron con más detalles con anterioridad.

La producción de anticuerpos que modulan la función de un polipéptido expuesto en la superficie celular es conocida en la técnica y se discutió con más detalles con anterioridad. Dichos anticuerpos pueden modular la función mediante la imitación de la función del ligando natural y la estimulación del polipéptido para la actividad o función, o puede modular la función del polipéptido mediante la eliminación de la estimulación del polipéptido por el ligando mediante la obstrucción estérica del sitio de unión del ligando, evitando, de ese modo la unión del ligando natural.

La invención se describirá ahora en más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos y Figuras

Figura 1.

Verificación experimental por PCR con transcripción reversa. Los candidatos a genes endoteliales específicos predichos mediante la combinación de la búsqueda por UniGene/EST y análisis diferencial xProfiler SAGE (Tabla 8) se ensayaron en busca de expresión en tres cultivos celulares endoteliales y nueve no endoteliales. Los cultivos endoteliales fueron los siguientes: HMVEC (células del endotelio microvascular humano), cultivo confluente de HUVEC (células del endotelio venoso umbilical humano) y cultivo proliferativo de HUVEC. Los cultivos no endoteliales fueron los siguientes: células del estroma endometrial normal (NES) cultivadas en normoxia y células del NES cultivadas en hipoxia, líneas celulares de carcinoma mamario MDA 453 y MDA 468, HeLa, fibroblastos FEK4 cultivados en normoxia y fibroblastos FEK4 cultivados en hipoxia, y SW480, HCT116, dos líneas celulares de epitelio colorrectal. ECSM1 mostró especificidad endotelial completa, mientras que la glorieta mágica/ECSM4 mostró una marcada preferencia por la expresión en el endotelio. Resulta interesante que aparentemente estos dos genes nuevos presentan mayor especificidad endotelial que el gen marcador específico del tejido endotelial: el factor de von Willebrand.

Figura 2.

Secuencia de contig generada con Phrap para ECSM1 y la secuencia aminoacídica del producto de su traducción. Los ESTs empleados para generar este contig se muestran en la Tabla 10.

Figura 3.

Transcripción/traducción in vitro de ECSM4. El ADNc que codifica para el ECSM4 de tamaño completo se clonó en un vector plasmídico pBluescript. Los plásmidos circular y digerido por Hindi se sometieron a transcripción/traducción in vitro empleando un sistema TNT T7 Quick de transcripción/traducción in vitro acoplado (Promega Corporation) que incorpora Metionina marcada con 35S según las instrucciones del fabricante. Los productos de reacción se resolvieron mediante SDS PAGE y se visualizaron por medio de una autorradiografía. El plásmido de luciferasa se empleó como control positivo de la reacción. Los números de la izquierda indican la posición de los marcadores de peso molecular, como referencia. El tamaño de la banda que denota ECSM4 es consistente con el peso molecular calculado del polipéptido de 118 kDa.

Figura 4.

ADNc y traducción computacional de GenBank AK000805 (ECSM4 humano/glorieta mágica).

Figura 5.

Secuencia de contig generada mediante Phrap de ECSM4 humano (glorieta mágica) ESTs y traducción del polipéptido codificado. La secuencia de ADN se muestra en la orientación en que estaría el ADNc, que es opuesta a aquella en la que se generó originalmente. Los ESTs empleados para generar el contig se muestran en la Tabla 11. El inicio de la traducción en esta secuencia se encuentra en la posición 2 de la secuencia del contig, y el fin de la traducción está en la posición 948.

Figura 6.

Un alineamiento del No. De Acceso AK000805 de GenBank (“sec. mágica”) y Phrap (“hs. 111518”) generó las secuencias de ácidos nucleicos del ECSM4 humano que se presentan en la Figura 4 y la Figura 5.

Figura 7.

Secuencia nucleotídica y secuencia aminoacídica del contig ECSM4 de ratón.

Figura 8.

Un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la proteína Robo1 de ratón (“T30805”) y la ECSM4 humana (“pep. mágico”).

Figura 9.

Un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la proteína Robo1 de ratón (“T30805”) y ECSM4 de ratón (“pep. mágico de ratón”).

Figura 10.

Un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de las proteínas ECSM4 de humano (“pep. mágico”) y ratón (“pep. mágico de ratón”). Los residuos en negrita indican secuencias bien conservadas. La secuencia de la proteína de ratón se muestra encima y la secuencia humana se muestra debajo.

Figura 11.

Expresión de la glorieta mágica in vitro. (a) Análisis de protección de ribonucleasa. Encima, dos sondas para regiones diferentes (nucleótidos 1 a 355 y 3333 a 3679) de la glorieta mágica se emplearon en el análisis (mostrado a la izquierda y a la derecha). El ensayo de protección de ARNasa se llevó a cabo con el ARN pequeño nuclear U6 como control (mostrado debajo) (Maxwell et al (1999) Nature 399: 271). Líneas celulares humanas y aislamientos primarios: MRC-5, línea celular de fibroblastos, MCF-7, línea celular de carcinoma mamario. Neuro, SY-SH-5Y línea celular de neuroblastoma, HUVEC, aislamiento de endotelio venoso umbilical, HDMEC, aislamiento de endotelio microvascular dérmico y HMME2, línea celular de endotelio microvascular mamario. N, normoxia, H, hipoxia, P, proliferación, (b) Análisis de Western de lisados celulares. Una banda a aproximadamente 110 kD corresponde a MR y fue más fuerte en células expuestas a hipoxia durante 18 h. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. La inmunotinción se llevó a cabo como se describe en Brown et al (2000) Cancer Res. 60: 6298. Se levantó anti suero policlonal en conejo contra los siguientes péptidos unidos a la hemocianina: aminoácidos 165-181 (LSQSPGAVPQALVAWRA) y 274-288 (DSVLTPEEVALCLEL) (anti-suero 1) o péptidos 311-320 (TYGYISVPTA) y 336-351 (KGGVLLCPPRPCLTPT) (anti-suero 2). Ambos anti sueros dieron resultados idénticos. Para los análsis de western, el anti suero fue purificado mediante afinidad en una columna “HP Hi-Trap activada por NHS” (Amersham) a la cual se unieron péptidos empleados para activar el anti suero 1.

Figura 12.

ADNc de ECSM4 humano de longitud completa y secuencia de la proteína codificada.

Figura 13.

ADNc de ECSM4 de ratón (MuMR sec.) de longitud completa y secuencia de la proteína codificada.

Figura 14.

Alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la ECSM4 humana (encima) y de ratón (debajo).

Figura 15.

Alineamiento de las secuencias de ADNc de ECSM4 de humano (“HuMR. sec”; encima) y ECSM4 de ratón (“MuMR. sec”; debajo).

Figura 16.

Análisis de hibridización in situ de tejido placentario humano usando ECSM4 como sonda. Una vista de campo brillante con aumento de 10x de una sección fina de tejido placentario. La flecha indica un gran vaso sanguíneo.

Figura 17.

Análisis de hibridización in situ de tejido placentario humano usando ECSM4 como sonda. Una ampliación mayor de la vista de campo brillante de la sección fina de tejido placentario mostrada en la Figura 16, centrada en el vaso sanguíneo. La flecha apunta a células endoteliales alrededor del lumen del vaso.

Figura 18.

Análisis de hibridización in situ de tejido placentario humano usando ECSM4 como sonda. Una ampliación mayor de la vista de campo brillante de la sección fina de tejido placentario mostrada en la Figura 16, centrada en el vaso sanguíneo y mostrada aquí en campo oscuro. La flecha muestra tinción positiva de las células endoteliales alrededor del lumen del vaso.

Figura 19.

Análisis de hibridización in situ de tejido metastático colorrectal y de hígado, empleando ECSM4 como sonda. Una vista de campo brillante de una sección de tejido metastático colorrectal y de hígado ampliada con objetivos de (A) 10x y (B) 20x. El área marcada por la frontera (circulando * A) muestra el tejido hepático normal. La flecha en (B) muestra uno de los vasos sanguíneos dentro del tejido del tumor metastático.

Figura 20.

Análisis de hibridización in situ de tejido metastático colorrectal y de hígado, empleando ECSM4 como sonda. Esta es una vista de campo oscuro de una sección de tejido metastático colorrectal y de hígado ampliado con objetivos de (A) 10x y (B) 20x. El área marcada por la frontera (circulando *) muestra el tejido hepático normal. La flecha en (B) muestra uno de los vasos sanguíneos dentro del tejido del tumor metastático correspondiente al vaso mostrado en la Figura 19B. La expresión de ECSM4 está restringida a las células endoteliales de los vasos sanguíneos del tumor. Nótese que existe poca expresión en el tejido circundante normal (*).

Figura 21.

Western Blot empleando el anticuerpo MGO-5 de ratón como anticuerpo primario. Las diluciones de los péptidos derivados de ECSM4, MR 165, MR 311, MR 366 y el polipéptido control Albúmina de Suero Bovino (BSA) se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y se puntearon en una membrana de Immobilon P. Se empleó una sonda de anticuerpo MGO-5 para la gota y se visualizó empleando anticuerpo anti conejo unido a fosfatasa alcalina.

Figura 22.

Inmunotinción de una sección de placenta congelada. Una sección fina congelada de placenta humana se analizó mediante inmunohistoquímica sin ningún anticuerpo primario (control negativo) y se visualizó empleando un anticuerpo anti conejo acoplado a fosfatasa alcalina. Se observa poca tinción de fondo.

Figura 23.

Inmunotinción de una sección de placenta congelada. Una sección fina congelada de placenta humana se analizó mediante inmunohistoquímica empleando un anticuerpo primario que reconoce el Factor de von Willibrand (control positivo), y se visualizó empleando un anticuerpo secundario anti conejo unido a fosfatasa alcalina. Las flechas muestran altos niveles de expresión de vWF, restringidos a las células del endotelio vascular.

Figura 24.

Inmunotinción de una sección de placenta congelada. Una sección fina congelada de placenta humana se analizó mediante inmunohistoquímica empleando MGO-5 (un anticuerpo policlonal de conejo levantado contra el péptido MR 165) como anticuerpo primario, y se visualizó empleando un anticuerpo secundario anti conejo unido a una fosfatasa alcalina. Las flechas muestran altos niveles de expresión de ECSM4 que están restringidos a las células del endotelio vascular. Nótese que el tejido circundante muestra poca tinción. La comparación don las Figuras 22 y 23 muestra que la expresión de ECSM4 está colocalizada con la de vWF, un conocido marcador de las células del endotelio vascular.

Figura 25.

Análisis inmunohistoquímico de células HUVEC: Factor de von Willibrand (vWF). Las células HUVEC se inmovilizaron y analizaron por inmunohistoquímica empleando un anticuerpo que reconoce el Factor de von Willibrand (un marcador de células endoteliales) como anticuerpo primario y se visualizaron empleando un anticuerpo anto conejo unido a fosfatasa alcalina. Las flechas muestran la expresión de vWF en un subconjunto de células HUVEC.

Figura 26.

Análisis inmunohistoquímico de células HUVEC empleando el anticuerpo MGO-7. Las células HUVEC se inmovilizaron y analizaron por inmunohistoquímica empleando el anticuerpo MGO-7 (un anticuerpo policlonal de ratón levantado contra los péptidos MR 311 y MR 336) como anticuerpo primario, y se visualizaron empleando un anticuerpo anti conejo unido a fosfatasa alcalina. Las flechas muestran la expresión de ECSM4 en un subconjunto de las células HUVEC. Nótese que la tinción está localizada, principalmente, en la superficie celular.

Figura 27. Expresión de la glorieta mágica in vivo.

(A)

Expresión de MR detectada por hibridización in situ en una arteriola placentaria (a) y vénula (b) (izquierda, campo brillante y derecha, campo oscuro). (c) Tinción inmunohistoquímica de la glorieta mágica en una arteriola placentaria. Izquierda, control del factor de von Willibrand y derecha, glorieta mágica. (B) Expresión de MR en endotelio de tumor. Ganglioglioma (a) x20 y (b) x50. Izquierda, campo brillante; derecha, campo oscuro. Las flechas resaltan un vaso que corre diagonalmente a través de la sección con un eritrocito dentro. Las células endoteliales son fuertemente positivas para la expresión de MR. El carcinoma papilar de vejiga (c) x20 y (d) x50. El núcleo vascular de la papila del tumor se muestra fuertemente positivo, en particular las células endoteliales “planas” indicadas por las flechas. Se generó una sonda antisentido de glorieta mágica empleando la polimerasa T3 a partir del clon IMAGE EST 1912098 (GenBank acc. AI278949). El plásmido se linealizó con EcoRI con anterioridad a la síntesis de la sonda. El análisis in situ se llevó a cabo entonces como se describe en Poulsom et al (1998) Eur.

J.

Histochemistry 42: 121-132.

Ejemplo 1.

Clonaje in silico de nuevos genes específicos para el endotelio

Describimos el uso de dos estrategias independientes para el análisis de expresión diferencial combinado con la verificación experimental para la identificación de genes específicos o que se expresen de manera preferencial en el endotelio vascular.

La primera estrategia estuvo basada en el análisis de la expresión en grupos de EST en el índice de genes UniGene humano (Schuler et al, 1997). Se realizaron búsquedas recurrentes con hendiduras utilizando el BLAST (Altschul et al, 1997) con un muy alto rigor contra fragmentos expresados de secuencia (ESTs) divididos en dos grupos. Estos dos grupos incluyeron bibliotecas de células endoteliales y no endoteliales derivadas de dbEST (Boguski et al, 1995). La segunda estrategia empleó una segunda herramienta de minería de datos: SAGEmap xProfiler. XProfiler es una herramienta en línea disponible gratuitamente, que forma parte del proyecto de anatomía del genoma del cáncer del NCBI (CGAP) (Strausberg et al, 1997, Cole et al, 1995). Aunque estas dos estrategias por sí solas produjeron un número desalentador de falsos positivos, cuando ambas se combinaron, las predicciones fueron excepcionalmente confiables y se identificaron dos nuevos candidatos de genes endoteliales específicos. Los ADNcs de longitud completa se han identificado en bases de datos de secuencia. Otro gen (conjunto EST) corresponde a una secuencia parcial de ADNc de un proyecto fr secuenciación de ADNc a gran escala y contiene una región de similaridad al dominio intracelular del homóloge 1 de la glorieta humana (ROBO1).

Pesquisaje de índice de genes UniGene/EST

Se extrajo un grupo de secuencias endoteliales y un grupo de secuencias no endoteliales utilizando el sistema de recuperación de secuencias (SRS) versión 5 a partir de dbEST. El grupo endotelial consistió en 11117 ESTs de nueve bibliotecas endoteliales humanas (Tabla 1). El grupo no endotelial incluyó 173137 ESTs de 108 bibliotecas de líneas celulares humanas y de tumores microdisectados (Tabla 2). Los ESTs se extrajeron de la versión de abril del 2000 de dbEST. Ficheros múltiples FASTA se convirtieron en una base de datos BLAST que permitiera búsquedas utilizando el programa pressdb. La tabla 3 muestra es estado de expresión de cinco genes específicos de células endoteliales conocidos en estos dos grupos.

Subsecuentemente, se buscó la secuencia representativa más larga en cada conjunto UniGene (UniGene Build #111 mayo del 2000, fichero múltiple FASTA hs.sec.uniq) utilizando un BLAST con muy alto rigor contra estos dos grupos. Si no se encontraron coincidencias para estas secuencias representativas, se usó el resto de las secuencias que pertenecía al conjunto (UniGene fichero múltiple-FASTA hs.sec) como secuencias de búsqueda del BLAST. Finalmente, se seleccionaron los conjuntos sin coincidencias en el grupo no endotelial y al menos una coincidencia en el grupo endotelial.

La optimización del valor E del BLAST fue crucial para el éxito de las búsquedas a nivel de identidad del BLAST. Un valor E demasiado alto hubiera producido parálogos de genes. Por otra parte, un valor E muy bajo (de alto rigor) hubiera producido muchos falsos negativos, por ejemplo, no se hubieran informado verdaderos positivos debido a errores de secuenciación en los datos de EST: Los ESTs son secuencias de un solo pase de secuenciación, hecho a gran escala y bajo costo y tienen una alta tasa de errores (Aaronson et al, 1996). En este trabajo, se utilizó un valor E de 10e-20 en las búsquedas contra el grupo de EST no endoteliales y un valor E de 10e-30 de más alto rigor en las búsquedas contra el grupo endotelial, más pequeño. Estos valores se consideraron óptimos después de una serie de búsquedas del BLAST de prueba.

Análisis diferencial de los datos SAGE y SAGEmap xProfiler

La segunda estrategia de minería de datos que se utilizó para la identificación de genes endoteliales específicos o preferentemente endoteliales nuevos fue la sustracción de la biblioteca SAGE basada en la web (SAGEmap xProfiler: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/sagexpsetup.cgi). Se compararon dos bibliotecas SAGE endoteliales (SAGE_Duke_HMVEC y SAGE_Duke_HMVEC+VEGF con un total de 110790 secuencias) a veinticuatro bibliotecas de líneas celulares no endoteliales, (la lista completa en la tabla 4, un total de 733461 secuencias). La tabla 5 muestra el estado de expresión de cinco genes endoteliales específicos conocidos: el factor von Willebrand (vWF), dos receptores del factor de crecimiento vascular endotelial: tirosina quinasa de tipo fins 1 (flt1) y receptor de dominio quinasa inserto (KDR), receptor tirosina quinasa de tipo tie (TIE1) y receptor tirosina quinasa de tipo tek (TIE2/TEK), en estos dos conjuntos SAGE.

Los datos combinados proporcionan predicciones altamente certeras

Se seleccionaron veinte genes conocidos en la búsqueda de UniGen/EST (Tabla 6). Estos genes no mostraban coincidencias en el conjunto no endotelial, y al menos una coincidencia en el conjunto endotelial. La lista contenía al menos cuatro genes específicos del endotelio: TIE1, TIE2/TEK, LYVE1, y multimerina, indicando aproximadamente 20% de exactitud de la predicción. Otros genes de la lista, aunque se encontraban, con certeza, expresados preferencialmente en las células endoteliales, podían no ser específicos del endotelio. Para aumentar la exactitud de la predicción decidimos combinar búsquedas de UniGen/EST con el análisis xPrifiler SAGE. La salida del xProfiler consistía en una lista de genes con diez veces más número de fragementos en el endotelio que en el conjunto no endotelial, ordenados de acuerdo con la certeza de la predicción. Se aplicó a esta lista un umbral de 90% de certeza. La Tabla 7 muestra de qué modo se combinaron los datos provenientes de las dos estrategias: Las búsquedas de nivel de identidad en el BLAST se llevaron a cabo con los ARNm (genes conocidos) o los contigo calculados mediante el Phrap (los grupos de EST que representaban genes nuevos) para investigar de qué modo estos genes se encontraban representados en los conjuntos endotelial y no endotelial. La verificación experimental que se llevó a cabo a continuación, mediante RT-PCR (Figura 1) demostró que la estrategia combinada tuvo un 100% de certeza, o sea, los genes en la lista de xProfiler que no poseían coincidencias en el conjunto de EST no endotelial y al menos una coincidencia en el conjunto endotelial era realmente específica del endotelio.

DISCUSIÓN

Ha habido varios informes de análisis computacionales de transcriptosomas de tejidos. Por lo general, se construye un perfil de expresión, sobre la base del número de fragmentos asignados a un gen o clase de genes dados (Bernstein et al, 1996, Welle et al, 1999, Bortoluzzi et al, 2000). Se puede llevar a cabo un intento de identificar transcritos tejido específicos. Por ejemplo, Vasmatzis et al, (1997) describe tres genes nuevos que se expresan de modo exclusivo en la próstata mediante sustracción in silico de bibliotecas de la colección dbEST. También se pueden emplear bibliotecas de ADNc fabricadas con ese propósito. Se han identificado 10 candidatos de genes específicos de granulocitos por medio de análisis extensivo de secuencia de bibliotecas de ADNc obtenidas a partir de granulocitos y muestras de otros 11 tejidos, específicamente, una línea celular de hepatocitos, hígado fetal, hígado infantil, hígado adulto, grasa subcutánea, grasa visceral, pulmón, mucosa del colon, queratinocitos, córnea y retina (Itoh et al, 1998).

Un análisis similar a la estrategia basada en dbEST, seguida por Vasmatzis et al, se complica por el hecho de que las células endoteliales están presentes en todos los tejidos del organismo y los EST endoteliales contaminan todas las bibliotecas de tejidos. Para validar esto, empleamos tres genes específicos del endotelio bien conocidos: KDR, FLT1, y TIE-2 como interrogación para las búsquedas de BLAST contra dbEST. Los transcritos estaban presentes en una amplia gama de tejidos con múltiples coincidencias en tejidos muy vascularizados (p.e., placenta, retina), tejidos embrionarios (hígado, bazo) o infantiles (cerebro). Además, encontramos que la sustracción simple de las bibliotecas de EST endoteliales contra todas las otras bibliotecas de dbEST no fue capaz de identificar ningún gen específico (datos no mostrados).

Se emplearon dos tipos de datos de expresión muy diferentes en nuestros esfuerzos de minería de datos. La búsqueda de UniGen/EST se basó en las bibliotecas de fragmentos de secuencia expresadas a partir de dbEST. Existen 9 bibliotecas de endotelio humano en la versión actual de dbEST, con un número total de EST relativamente pequeño: 11117. Algunos genes endoteliales específicos bien conocidos no están representados en este conjunto de datos (tabla 3). Esta limitación aumentó nuestras preocupaciones de que genes con bajos niveles de expresión serían obviados en nuestro análisis. Por tanto, utilizamos otro tipo de datos de expresión computables: bibliotecas CGAP SAGE. Los fragmentos SAGE son a veces llamados pequeños ESTs (usualmente 10-11 pb de longitud). Su principal ventaja es que pueden ser localizados dentro del ADNc de manera inequívoca: ellos están inmediatamente adyacentes al sitio de restricción 3’ NlaIII. Aunque hay solo dos bibliotecas CGAP SAGE endoteliales disponibles hasta el momento, estas contienen un total impresionante de ~111000 fragmentos – un conjunto de datos aproximadamente 10 veces mayor que las ~11117 secuencias en el conjunto de EST endoteliales. La estrategia combinada demostró ser muy exacta (tabla 8, figura 1) cuando se verificó por RT-PCR.

Reportamos aquí la identificación de dos nuevos genes endoteliales altamente específicos: molécula específica de célula endotelial 1 (ECSM1 – entrada UniGene Hs.13957) y glorieta mágica (entrada UniGene Hs.111518). Para un resumen abarcador de los datos disponibles de estos genes ver la tabla 8.

Nuestra estrategia combinada de minería de datos en conjunto con la verificación experimental es una herramienta de genómica funcional poderosa. Este tipo de análisis puede ser aplicado a muchos tipos celulares no solo a células endoteliales. El reto de identificar la función de los genes descubiertos perdura, pero las herramientas bioinformáticas como la genómica estructural, o las búsquedas por homología y de motivos pueden ofrecer conocimientos que pueden ser verificados experimentalmente.

En resumen, esta estrategia de pesquisaje ha permitido la identificación de nuevos genes específicos de células endoteliales y de genes conocidos cuya expresión no se conocía que fuera específica de células endoteliales. Esta identificación permite aumentar nuestro conocimiento de la biología de la célula endotelial y, además, proporciona nuevos blancos farmacéuticos para la imaginología, diagnóstico y tratamiento de dolencias médicas relacionadas con el endotelio.

MÉTODOS

Programas de PERL

Se generaron un número de programas en PERL para facilitar la recuperación de secuencias a gran escala, los envíos de búsquedas del BLAST, y el análisis automático de la salida del BLAST.

Recuperación de secuencias de bases de datos

Para la preparación de este informe se utilizaron ficheros UniGene almacenados localmente (Build #111, versión de mayo de 2000). Se puede acceder al sitio web UniGene en la URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/, y se pueden descargar los ficheros UniGene del repositorio ftp: ftp://ncbi.nlm.nih.gov/repository/unigene/. Las secuencias representativas del subconjunto de humano de UniGene (el EST más largo dentro del conjunto) se almacenan en el fichero Hs.sec.uniq, mientras que todos los ESTs que pertenecen al conjunto se almacenan en un archivo separado llamado Hs.sec.

Las secuencias se extrajeron de la base de datos dbEST, a la que se accedió localmente en el centro HGMP utilizando el comando getz del sistema de recuperación de ficheros (SRS versión 5). Esto se realizó repetidamente utilizando un programa de PERL para todas las bibliotecas en los subgrupos endoteliales y no endoteliales, y las secuencias se integraron en dos ficheros FASTA múltiples.

Criterio de selección para las bibliotecas EST no endoteliales

La selección de 108 bibliotecas dbEST no endoteliales fue fundamentalmente manual. Inicialmente, se realizó una búsqueda en la lista de todas las bibliotecas dbEST disponibles (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/libs_byorg.html) utilizando la palabra clave “células” y la frase “línea celular”. Aunque esta búsqueda identificó la mayor cantidad de bibliotecas, fue necesario añadir palabras clave adicionales para que la lista estuviese completa: “melanocito”, “macrófago”, “HeLa”, “fibroblasto”. En algunos casos, se consultó la descripción detallada de la biblioteca para confirmar que la biblioteca se había obtenido a partir de un cultivo primario o una línea celular. También añadimos cierto número de bibliotecas de tumor microdisectado de CGAP. Para ello se empleó el navegador de bibliotecas (disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CGAP/hTGI/lbrow/cgaplb.cgi) para buscar la palabra “microdisectado”.

Pesquisaje del índice de genes UniGen

El índice de transcritos de gen UniGen se pesquisó contra la división EST de GenBank, dbEST. Tanto UniGen como dbEST fueron desarrollados por el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI). UniGen es una colección de grupos de EST que corresponden a probables genes únicos. Actualmente consta de cuatro conjuntos de datos: humano, ratón, rata y pez cebra. El conjunto de datos humanos está compuesto, aproximadamente, por 90 000 grupos (UniGene Build #111 May 2000). Por medio de búsquedas de identidad muy rigurosas mediante BLAST, intentamos identificar los genes de UniGen que poseen transcritos en el endotelio y que no poseen transcritos en las bibliotecas de dbEST de células no endoteliales. En el curso del proyecto se empleó como implementación del BLAST el blast2 de la Universidad de Washington, que es una versión del BLAST que admite la introducción de hendiduras. El valor-E se fijó en 10e-20 en las búsquedas contra el conjunto de EST no endoteliales y en 10e-30 en las búsquedas contra el conjunto endotelial de menor tamaño.

Aunque UniGen no proporciona secuencias consenso de sus grupos, se identifica la secuencia de mayor longitud dentro del grupo. Por tanto, esta secuencia de mayor longitud, representativa (fichero multi FASTA Hs.sec.uniq) se empleó para la búsqueda de BLAST empleando condiciones muy rigurosas contra los conjuntos de EST endoteliales y no endoteliales. Si dicha secuencia representativa no encontró ninguna coincidencia, el resto de las secuencias del grupo (fichero multi FASTA UniGen Hs.sec) se utilizó a continuación para la búsqueda del BLAST. Por último, los grupos sin coincidencias en el conjunto no endotelial y con al menos una coincidencia en el conjunto endotelial se seleccionaron empleando programas de PERL que analizaban el texto de las salidas del BLAST.

Sustracción xProfiler SAGE

xProfiler permite a un usuario en línea llevar a cabo una comparación diferencial de cualquier combinación de cuarenta y siete análisis seriados de bibliotecas de expresión génica (SAGE) con un total de aproximadamente 2 300 000 fragmentos de SAGE empleando un algoritmo estadístico dedicado (Chen et al, 1998). Puede accederse a xProfiler en http://www.ncbi.n1m.nih.gov/SAGE/sagexpsetup.cgi. SAGE es una tecnología de expresión cuantitativa en la que los genes se identifican, por lo general, por un fragmento de secuencia de 10 ú 11 pb adyacente al sitio de restricción de NIaIII más cercano al extremo 3’ del ADNc (Velculescu et al, 1995).

Las dos bibliotecas disponibles de células endoteliales (SAGE_Duke_HMVEC y SAGE_Duke_HMVEC+VEGF) definieron el conjunto A y 24 bibliotecas no endoteliales (ver Tabla 4 para una lista) definieron el conjunto B. La estrategia se verificó mediante la verificación del estado de expresión de los cinco genes específicos del endotelio que sirvieron como referencia en los dos conjuntos SAGE (Tabla 5) empleando un mapeo de Gen a Fragmento (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/SAGEcid.cgi). A continuación, se empleó el xProfiler para seleccionar los genes con expresión diferencial entre los conjuntos A y B. La salida del xProfiler consistió en una lista de genes con una diferencia de diez veces en el número de fragmentos encontrados en el conjunto endotelial con respecto al conjunto no endotelial, ordenados de acuerdo con la certeza de la predicción. Se aplicó un umbral de 90% de certeza a esta lista.

La otra herramienta de análisis de expresión diferencial en línea de CGAP, la Muestra Diferencial Digital (DDD) se basa en los datos de expresión de EST (información de biblioteca fuente) en lugar de emplear los fragmentos de SAGE. Intentamos emplear esta herramienta de modo similar al mapeo de SAGE xProfiler, pero no hemos logrado obtener resultados útiles. Cinco de las nueve bibliotecas endoteliales y sesenta y cuatro de ciento ocho bibliotecas no endoteliales empleadas en nuestra estrategia orientada a BLAST estaban disponibles para análisis en línea empleando DDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CGAP/info/ddd.cgi). Cuando se llevó a cabo dicho análisis los quince genes con mayor puntuación fueron los siguientes: anexina A2, actina gamma 1, proteína ribosomal grande P0, inhibidor del activador de plasminógeno tipo I, timosina beta 4, peptidiloprolil isomerasa A, proteína ribosomal L13a, receptor de laminina 1 (proteína ribosomal SA), factor 1 alfa 1 de elongación de la traducción en eucariontes, vimentina, polipéptido pesado de ferritina, proteína ribosomal L3, proteína ribosomal S18, proteína ribosomal L19, proteína tumoral1 controlada traduccionalmente. Esta lista era bastante sorprendente; no incluía ninguno de los genes específicos del endotelio bien conocidos, no presentaba ningún sobrelapamiento con los resultados de SAGE (Tabla 8), y contenía muchos genes que, en la literatura están reportados como ubicuos en su expresión (proteínas ribosomales, actina, vimetina, ferritina). Una ventaja importante de nuestra búsqueda de UniGen/EST es que, en lugar de basarse en datos de las bibliotecas fuente y algoritmos falibles de agrupamiento de los EST en realidad lleva a cabo comparaciones de identidad mediante el BLAST, en la búsqueda de transcritos que correspondan a un gen.

Minería de datos en los grupos de UniGen

Para acceder rápidamente a la información acerca de las entradas de UniGen (p.e., referencias a la literatura, sitios de STS, homólogos, referencias a la función) se emplean de manera rutinaria recursos en línea: las interfaces de UniGene y LocusLink del NCBI y la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man.

Los EST en los grupos de UniGen no se ensamblan en contigo, de manera que antes de los análisis de secuencia se crearon contigo empleando el ensamblador phrap (para documentación acerca de phrap ver http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.does/phrap.html).

Para el análisis del contig genómico AC005795 (44 399 pb) que contenía ECSM1, se empleó la interfaz NIX de Internet para análisis de múltiples aplicaciones en grandes secuencias de nucleótidos desconocidas. Para mayor información con respecto a NIX ver http://www.hgmp.mrc.ac.uk/NIX/. El alineamiento de ECSM1 contra AC005795 se obtuvo empleando la interfaz del NCBI a la Interfaz del Genoma Humano: el Visor del Mapa NCBI. Para más información sobre el Visor del Mapa del NCBI ver http://www.ncbi.nmi.nih.gov/genome/guide/.

Para buscar posibles dominios de transmembrana y secuencias señal en secuencias de nucleótidos traducidas se emplearon tres aplicaciones basadas en Internet: DAS http://www.biokemi.su.se/~server/DAS/ (Cserzo et al, 1997), TopPred2 http://www.biokemi.su.se/-server/toppred2/ (Heijne 1992), y SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ (Nielsen et al, 1997).

Programas de PERL

Se generó una cantidad de programas de PERL para facilitar la recuperación a gran escala de secuencias, el envío de los BLAST y el análisis automático de la salida de los BLAST.

Verificación experimental

Para verificar experimentalmente la especificidad de la expresión empleamos la reversotranscripción acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Se extrajo el ARN de tres líneas celulares endoteliales y siete no endoteliales, cultivadas in vitro. Los cultivos endoteliales fueron los siguientes: HMVEC (células de endotelio microvascular humano), HUVEC (células de endotelio venoso umbilical) cultivo confluente y cultivo proliferativo de HUVEC. Los cultivos no endoteliales fueron los siguientes: células estromales endometriales normales (NES) cultivadas en normoxia y NES cultivadas en hipoxia, líneas celulares de carcinoma mamario MDA 453 y MDA 468, HeLa, fibroblastos FEK4 cultivados en normoxia y fibroblastos FEK4 cultivados en hipoxia, y SW480, HCT116: dos líneas celulares de epitelio colorrectal.

Si estaba disponible un sitio de secuencia fragmentada (STS) se emplearon cebadores de PCR de dbSTS y se siguieron las condiciones de ciclo de PCR sugeridas en la entrada de dbSTS. De lo contrario, se diseñaron cebadores empleando el programa Primer3. Los cebadores se listan en la Tabla 9.

Medios de cultivo de tejidos, extracción de ARN y síntesis de ADNc

Se cultivaron las líneas celulares in vitro, de acuerdo con los protocolos estándar de cultivo de tejidos. En particular, se suplementó el medio de las células endoteliales con ECGS (suplemento de crecimiento de células endoteliales, Sigma), y heparina (Sigma) para estimular el crecimiento. Se extrajo el ARN total empleando el Minikit RNeasy (Qiagen) y se sintetizó el ADNc empleando el paquete de síntesis de la primera hebra Reverse-IT (ABgene).

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Tabla 1 Nueve bibliotecas de endotelio humano de dbEST

Endotelio aórtico humano, 20 secuencias, cultivo in vitro

Células endoteliales humanas, 346 secuencias, aislamiento primario

Célula endotelial humana (Y. Mitsui), 3 secuencias, cultivo in vitro

Célula endotelial 937223 de Stratagene, 7171 secuencias, aislamiento primario

Células endoteliales de la aorta, 1245 secuencias, aislamiento primario

Células endoteliales de la aorta tratadas con TNF, 1908 secuencias, aislamiento primario

Células endoteliales de vena umbilical I, 9 secuencias

Biblioteca de ADNc HDMEC, 11 secuencias, cultivo in vitro

Células endoteliales de vena umbilical II, 404 secuencias

Tabla 2. Bibliotecas dbEST no endoteliales.

1. Células T activadas I

2. Células T activadas II

3. Células T activadas III

4 Células T activadas IV

5. Células T activadas IX

6. Células T activadas V

7. Células T activadas VI

8. Células T activadas VII

9. Células T activadas VIII

10. Células T activadas X

11. Células T activadas XI

12. Células T activadas XII

13. Células T activadas. XX

14. Línea celular CAMA1Ee I

15. Línea celular CAMA1Ee II

16. Células CCRF-CEM tratadas con ciclohexamida I

17. Biblioteca CdnA de línea celular B activada 3D5

18. Biblioteca de ADNc HeLa cromosoma 7

19. Línea celular de carcinoma de colon (Caco-2) I

20. Línea celular de carcinoma de colon (Caco-2) II

21. Línea celular de carcinoma de colon (HCC)

22. Línea celular de carcinoma de colon (HCC) II

23. Línea celular HCC (metástasis en hígado de ratón)

24. Línea celular HCC (metástasis en hígado de ratón) II

25. ADNc HeLa (T.Noma)

26. SRIG HeLa (genes inducidos por retinoides sintéticos)

27. Macrófagos derivados de monocitos de Homo sapiens

28. Células HSC172 I

29. Células HSC172 II

30. Línea celular de carcinoma gástrico humano 23132

31. Línea celular de cáncer de mama humana Bcap37

32. Subclon de línea celular humana A431

33. Línea celular humana AGZY-83a

34. Línea celular humana PCI-O6A

35. Línea celular humana PCI-O6B

36. Línea celular humana SK-N-MC

37. Línea celular humana TF-1 (D.L.Ma)

38. Células exocervicales humanas (CGLee)

39. Línea celular de fibrosarcoma humano HT1080

40. Línea celular de fibrosarcoma humano HT1080-6TGc5

41. Línea celular de cáncer gástrico humano SGC-7901

42. Línea celular TF-1 humana privada de GM-CSF (Liu,Hongtao)

43. HeLa humana (Y.Wang)

44. Células de HeLa humana (M.Lovett)

45. ARNm de línea celular humana Jurkat (Thiele, K.)

46. Células humanas eritroleucémicas K5 62

47. Línea celular de cáncer de pulmón humano A549.A549

48. Línea celular de carcinoma nasofaríngeo humano HNE1

49. Células de neuroblastoma SK-ER3 humano (M.Garnier)

50. Melanocitos humanos de recién nacido (T.Vogt)

51. Línea celular de cáncer de páncreas humano Patu 8988t

52. ARNm de melanocitos primarios humanos (I.M.Eisenbarth)

53. Línea celular promielocítica humana HL60 (S.Herblot)

54. Línea celular de retina humana ARPE-19

55. Línea celular de glándula salival humana HSG

56. Leucocitos humanos

57. Células T Jurkat T I

58. Células T Jurkat T II

59. Células T Jurkat T III

60. Células T Jurkat T V

61. Células T Jurkat T VI

62. Línea celular de hígado HepG2

63. Células LNCAP I

64. Macrófago I

65. Macrófago II

66. Macrófago, sustraído (CdNA total)

67. Línea celular MCF7

68. Células B Namalwa I

69. Células B Namalwa II

70. NCI_CGAP_Br4

71. NCI_CGAP_Br5

72. NCI_CGAP_CLL1

73. NCI_CGAP_GCB0

74. NCI_CGAP_GCB1

75. NCI_CGAP_HN1

76. NCI_CGAP_HN3

77. NCI_CGAP_HN4

78. NCI_CGAP_HSC1

79 NCI_CGAP_Li1

80. NCI_CGA.P_Li2

81. NCI_CGAP_Ov5

82. NCI_CGAP_Ov6

83. NCI_CGAP_Pr1

84. NCI_CGAP_Pr10

85. NCI_CGAP_Pr11 1

86. NCI_CG.AP_Pr16

87. NCI_CGAP_Pr18

88. NCI_CGAP_Pr2

89. NCI_CGAP_Pr20

90. NCI_CGAP_Pr24

91. NCI_CGAP_Pr25

92. NCI_CGAP_Pr3

93. NCI_CGAP_Pr4

94. NCI_CGAP_Pr4.1

95. NCI_CGAP_Pr5

96. NCI_CGAP_Pr6

97. NCI_CGAP_Pr7

98. NCI_CGAP_Pr8

99. NCI_CGAP_Pr9

100. Células óseas trabecular normales humanas

101. Células Raji tratadas con ciclohexamida I

102. Línea celular de epitelio pigmentado retinal 0041

103. Células HeLa tratadas con retinoide

104. Melanocito Soares 2NbHM

105. Fibroblastos senescentes Soares Nb HSF

106. Células HeLa Stratagene s3 937216

107. Células Supt

108. Línea celular de rhabdomiosarcoma T, de adulto humano

Tabla 3. Cinco genes que se conoce que son genes endoteliales específicos en el grupo de dbEST.

El número de ESTs en el grupo endotelial es relativamente pequeño (~11,117) y no todos los genes endoteliales conocidos se encuentran representados.

Gen endotelial específico conocido

Coincidencias enendotelial el grupo no Coincidencias en el grupo endotelial

factor von Willebrand (vWF)

1 27

receptor flt1 VEGF

- -

receptor KDR VEGF

1 --

tirosina quinasa TIE1

-- 5

tirosina quinasa TIE2/TEK

-- 2

Tabla 4. Veinticuatro bibliotecas SAGE-CGAP de células no endoteliales.

SÍMBOLO

DESCRIPCIÓN

SAGE_HCT116

Colon, línea celular derivada de carcinoma colorectal

SAGE_Caco_2

Colon, línea celular de carcinoma colorectal

SAGE_Duke_H392

Cerebro, línea celular de glioblastoma multiforme de Duke

SAGE_SW837

Colon, línea celular de cáncer

SAGE_RKO

Colon, línea celular de cáncer

SAGE_NHA(5ta)

Cerebro, células de astrositos normales humanos cultivadas en el pase 5

SAGE_ES2-1

Línea celular ES-2 de células Clear de carcinoma ovárico, pobremente diferenciada

SAGE_OVCA432-2

Ovario, línea celular de carcinoma OVCA432

SAGE_OV1063-3

Ovario, línea celular de carcinoma OV1063

SAGE_Duke_mhh-1

Cerebro, línea celular de medulloblastoma negativo para c-myc mhh-1

SAGE_Duke_H341

Cerebro, línea celular de medulloblastoma positivo para c-myc, H341

SAGE_HOSE_4

Ovario, epitelio de superficie normal

SAGE_OVP-5

Ovario, líneas celulares de cáncer muestreadas

SAGE_LNCaP

Próstata, línea celular. Dependiente de

andrógenos.

SAGE_HMEC-B41

Cultivo celular de células epiteliales mamarias humanas normales HMEC-B41

SAGE_MDA453

Línea celular de carcinoma de mama humano MDA-MB-453

SAGE_SKBR3

Línea celular ATCC SK-BR-3. Adenocarcinoma mamario humano

SAGE_A27 80-9

Ovario, línea celular de cáncer ovárico A2780

SAGE_Duke_H247_normal

Cerebro, línea celular de glioblastoma multiforme H247

AGE_Duke_H247_Hipoxia

Cerebro, línea celular de glioblastoma multiforme de Duke, H247, crecida en condiciones de 1,5% de oxígeno

SAGE_Duke_post_crisis_fibroblastos

Piel, línea celular de fibroblastos sobrevivientes postcrisis

SAGE_Duke_premsis_ fibroblastos

Piel, clones de fibroblastos humanos transformados con antígenos T

SAGE_A

Próstata, línea celular de cáncer. Inducida con andrógeno sintético

SAGE_IOSE29-11

Ovario, línea celular de epitelio de superficie

Tabla 5. Cinco genes endoteliales específicos conocidos en los grupos CGAP SAGE.

TIE1 y TIE2/TEK tienen múltiples coincidencias en el grupo no endotelial (la mayoría en líneas celulares normales o de carcinoma de origen ovárico). vWF es el más específico endotelial con 80 coincidencias en el grupo endotelial y solo una coincidencia en el grupo no endotelial.

Gen endotelial específico conocido

Fragmento en la líbrería SAGE no endotelial Fragmento en la líbrería SAGE endotelial

factor von Willebrand (vWF)

1 (línea celular de carcinoma) 80

receptor flt1 VEGF

- -

receptor KDR VEGF

1 (línea celular de epitelio de superficie ovárica IOSE29) 6

tirosina quinasa TIE1

17 (líneas celulares de tumores ováricos y de epitelios ováricos normales) 27

tirosina quinasa TIE2/TEK

4 (líneas celulares de carcinoma ovárico y de glioblastoma multiforme) 2

Tabla 6.

Resultados del pesquisaje UniGene/EST. Se seleccionaron veinte genes conocidos en el pesquisaje UniGene/EST (sin coincidencias en el grupo no endotelial y como mínimo una coincidencia en el grupo endotelial). Al menos cuatro de estos genes se conoce que son genes endoteliales específicos: TIE1, TIE2/TEK, LYVE1 y multimerina, lo que indica ~ 20 % de exactitud de la predicción. Otros genes, aunque ciertamente se expresan de modo preferencial en las células endoteliales, pueden no ser genes endoteliales específicos.

Descripción

ID de UniGene Coincidencias en Endothelio

Receptor tirosina quinasa endotelial TIE1

Hs.78824 5

Fosfolipasa A2 citosólica; Relacionada con el metabolismo de eicosanoides

Hs.211587 3

Deshidrogenasa de alfa cetoácidos de cadena ramificada

Hs.1265 2

Proteína quinasa dependiente de CGMP, clonada de ADNc de aorta cDNA, altamente expresada en tejidos muy vascularizados como aorta, corazón, y útero (Tamura et al, 1996)

Hs.2689 2

Receptor 1 – LYVE1 de hialuronano del endotelio de vasos linfáticos

Hs.17917 2

Proteína de interacción TRAP: vía de señalización de TNF

Hs.21254 2

Multimerina: una gran proteína específica del endotelio; se une al factor V de plaquetas, también se encuentra en plaquetas (Hayward et al, 1996)

Hs.32934 2

Diubiquitina (un miembro de la familia de la ubicuitina); reportado en células dendríticas y linfocitos B; involicrado en procesamiento de antígenos; esta es la primera evidencia de que también se encuentra presente en las células endoteliales (Bates et al, 1997)

Hs.44532 2

Proteína de la familia de la beta-transducina; también homóloga del gen notchless de D. melanogaster: una nueva proteína que contiene repecticiones de tipo WD40, que modula la actividad de señalización de Notch

Hs.85570 2

Tirosina quinasa endotelial de receptor con actividad de señalización Notch

Hs.89640 2

Proteína X asociada a BCL2 (BAX)

Hs.159428 2

ARNm de sepiapterina reductasa

Hs.160100 2

Receptor beta de ácido retinoinco (RARB)

Hs.171495 2

Receptor de ST2: un homólogo de receptor de interleuquina 1

Hs.66 1

Proteína quinasa 8 activada por mitógeno (MAPK8)

Hs.859 1

Gen ERG relacionado con el oncogen ETS

Hs.45514 1

PP35 similar a yhdg de E. coli y nifR3 de R. capsulatus

Hs.97627 1

Proteoglicano receptor de la matriz; fuertemente expresado en retina y vena del cordón umbilical (Felbor et al, 1998)

Hs.129882 1

Gen de la metilmalonato semialdejído deshidrogenasa

Hs.170608 1

Secuencia retroviral relacionada con HTLV-1

Hs.247963 1

Tabla 7.

El análisis diferencial de xProfiler se combinó con datos obtenidos del pesquisaje UniGen/EST, logrando un 100% de certeza de predicción. La salida de xProfiler lista genes con 10 veces más fragmentos en el conjunto endotelial que en el conjunto no endotelial de las bibliotecas SAGE-CGAP. Las coincidencias que corresponden a estos genes en los conjuntos de EST endoteliales y no endoteliales se identificaron mediante búsquedas de niveles de identidad, mediante BLAST para encontrar ARNm (genes conocidos) o secuencias de contig ensambladas mediante phrap (grupos de EST que representan nuevos genes). Los genes se ordenan de acuerdo con el número de coincidencias en el conjunto de EST no endotelial. Los genes endoteliales específicos conocidos y predichos nuevos se encuentran en negrita

ID de UniGen

Descripción del gen Certeza de predicción de xProfiler Coincidencias en el conjunto de EST endoteliales Coincidencias en el conjunto de EST no endoteliales

Hs.13957

ESTs-ECSMI 97% 4 0

Hs.111518

glorieta mágica, homología distante con la glorieta humana 1 100% 4 0

Hs.268107

multimerina 92% 5 0

Hs.155106

Proteína 2 modificadora de la actividad del receptor de tipo receptor de 97% 0 0

calcitonina

Hs.233955

ESTs 96% 0 0

Hs.26530

Respuesta al empobrecimiento de suero (proteína de unión a fosfatidilserina) 94% 3 1

Hs.83213

Proteína 4 de unión a ácido graso 100% 3 1

Hs.110802

Factor de von Willebrand 100% 25 1

Hs.76206

Caderina 5, VE-caderina (endotelio vascular) 100% 4 1

Hs.2271

Endotelina 1 98% 9 2

Hs.119129

Colágeno, tipo IV, alfa 1 100% 4 6

Hs.78146

Molécula de adhesión celular de plaquetas/células endoteliales (antígeno CD31) 99% 18 5

Hs.76224

Proteína 1 de matriz extracelular de tipo fibulina, que contiene EGF 100% 37 9

Hs.75511

Factor de crecimiento de tejido conectivo 100% 34 48

Tabla 8. Resumen de la información disponible sobre la glorieta mágica Tabla 9.

ID de

ADNc de ORF de Segmentos de Información de Descripción

grupo

tamaño mayor transmembran mapeo

de

completo tamaño a, péptido

UniGen

señal Contexto

y

genómico

tamaño

Clones genómicos

ECS

Hs.1395 103 aa Vecino

M1

7 confirmado genómico: tropomiosina

1100 pb

con 5’ RACE dbSTS G26129 y G28043 Cromosoma 19 Mapa génico 98: Marcador SGC33470.

Marcador stSG3414, Intervalo D19S425-D19S4 18 AC005945, AC005795 (identidad parcial)

Glori

Hs. ADNc parcial 417 aa Un dominio de Vecino Región de homología de

eta

111518 FLJ20798 transmembran genómico: 486aa con la porción

mági

fis, clon a predicho por proteína 1 citoplasmática de la

ca

TopPred2 y integral de glorieta,

DAS.

transmembrana

2067 pb

ADSU02031 (acc. Ningún péptido señal (ITM1) dbSTS G14646 y de la familia de la

AK000805)

detectado en la G14937 proteína de guia

ORF

axónica: humano

disponible de

ROBO1, rata ROBO1 y

417 aa

ratón dutt1 (E=1,3e-09)

(PSeñal)

1496 pb

sin embargo es muy probable que el verdadero producto proteico sea mayor Cromosoma 11, Mapa génico 98: Marcador SHGC-11739, Intervalo D11S1353-D11S 93 La ORF no tiene ningún límite aparente upstream (sentido hacia arriba). Esto, de conjunto con la comparación de tamaño con ROBO1 (1651 aa)

sugiere que la

verdadera proteína tiene

gran probabilidad de ser

mucho mayor

Posibles sitios de poliA

alternativos: el clon de

ADNc proveniente de

tejido adiposo parece

estar poliadenilado en

una posición diferente a

la secuencia

proveniente del contig

de UniGen

Lista de cebadores empleados en las reacciones de RT-PCR. Se emplearon los cebadores de dbSTS si una entrada de UniGen contenía un sitio de secuencia fragmentada (STS). De lo contrario, se diseñaron cebadores empleando el programa Primer3.

Gen

Cebadores (Secuencia o Acceso de GenBank para el STS)

ECSM1 Hs.13957

G26129

Glorieta mágica Hs.111518

G14937

Actividad modificadora 2 de receptor de tipo receptor de calcitonina

G26129

Hs.233955

G21261

Proteína 4 de unión a ácido graso

5’-TGC AGC TTC CTT CTC ACC TT-3’ 5’-TCA CAT CCC CAT TCA CAC TG-3’

Factor de von Willebrand

5’-TGT ACC ATG AGG TTC TCA ATG C-3’ 5’-TTA TTG TGG GCT CAG AAG GG-3’

Proteína de respuesta al empobrecimiento de suero

G21528

Colágeno tipo IV, alfa 1

G07125

Proteína 1 de matriz extracelular de tipo fibulina, que contiene EGF

G06992

Factor de crecimiento de tejido conectivo

5’-CAA ATG CTT CCA GGT GAA AAA-3’ 5’-CGT TCA AAG CAT GAA ATG GA-3’

Tabla 10.

Los ESTs que pertenecen a la secuencia del contig de ECSM1 son los siguientes:

Secuencias de EST (30) AI540508, clon de ADNc IMAGE:2209821, Útero, lectura 3’, 2,1kb AI870175, clon de ADNc IMAGE:2.424998, Útero, lectura 3’, 1,7kb AI978643, clon de ADNc IMAGE:2491824, Útero, lectura 3’, 1,3kb AI473856, clon de ADNc IMAGE:2044374, Nodo linfático, lectura 3’ AI037900, clon de ADNc IMAGE:1657707, Embrión, lectura 3’, 1,2kb AI417620, clon de ADNc IMAGE:2115082, lectura 3’, 1,0kb AA147817, clon de ADNc IMAGE:590062, lectura 3’ AA968592, clon de ADNc IMAGE:1578323, lectura 3’, 0,7kb AW474729, clon de ADNc IMAGE:2853635, Útero, lectura 3’ R02352, clon de ADNc IMAGE:124282, lectura 3’, 0,7kb R01889, clon de ADNc IMAGE:124485, lectura 5’, 0,7kb AA446606, clon de ADNc IMAGE:783693, Embrión, lectura 3’ R02456, clon de ADNc IMAGE:124282, lectura 5’, 0,7kb T72705, clon de ADNc IMAGE:108686, lectura 5’, 0,7kb R01890, clon de ADNc IMAGE:124485, lectura 3’, 0,7kb AA147925, clon de ADNc IMAGE:590014, lectura 5’ AI131471; clon de ADNc IMAGE:1709098, Corazón, lectura 3’, 0,6kb AA733177, clon ADNc 399421, Corazón, lectura 3’ AI039489, clon de ADNc IMAGE: 1658903, Embrión, lectura 3’, 0,6kb AI128585, clon de ADNc IMAGE:1691245, Corazón, lectura 3’, 0,6kb AI540506, clon de ADNc IMAGE:2209817, Útero, lectura 3’, 0,6kb AA894832, cDNAcloneIlVIAGE:1502815, Riñón, lectura 3’, 0,5kb AW057578, clon de ADNc IMAGE:2553014, Muestreado, lectura 3’, 0,3kb AA729975, clon de ADNc IMAGE: 1257976, Célula Germinal, 0,3kb AI131016, clon de ADNc IMAGE:1706622, Corazón, lectura 3’, 0,2kb AA147965, clon de ADNc IMAGE:590062, lectura 5’ AA446735, clon de ADNc IMAGE:783693, Embrión, lectura 5’ AA147867, clon de ADNc IMAGE:590014, lectura 3’ AI497866, clon de ADNc IMAGE:2125892, Muestreada, lectura 3’ T72636, clon de ADNc IMAGE:108686, lectura 3’, 0,7kb

Tabla 11.

ESTs dentro de la secuencia de la glorieta mágica:

Secuencias de EST en la glorieta mágica (55): AI803963, clon de ADNc IMAGE:2069520, lectura 3’, 0.9kb W88669, clon de ADNc IMAGE: 417844, lectura 3’, 0.7kb AI184863, clon de ADNc IMAGE:1565500, Muestreada, lectura 3’, 0.6kb AA011319, clon de ADNc IMAGE:359779, Corazón, lectura 3’, 0.6kb AA302765, cDNAcloneATCC: 194652, Tejido adiposo, lectura 3’ AI278949, clon de ADNc IMAGE:1912098, Colon, lectura 3’, 0.7kb AI265775, clon de ADNc IMAGE:2006542, Ovario, lectura 3’ AA746200, clon de ADNc IMAGE:1324396, Riñón, 0.5kb N78762, clon de ADNc IMAGE:301290, Pulmón, lectura 3’ AI352263, clon de ADNc IMAGE:1940638, Embrión, lectura 3’, 0.6kb AA630260, clon de ADNc IMAGE:854855, Pulmón, lectura 3’, 0.5kb C20950, clon de ADNc (sin nombre), lectura 3’ W88875, clon de ADNc IMAGE:417844, lectura 5’, 0.7kb AA156022, clon de ADNc IMAGE:590120, lectura 3’ N93972, clon de ADNc:309369, Pulmón, lectura 3’, 1.7kb AI217602, clon de ADNc IMAGE: 1732380, Corazón, lectura 3’, 0.5kb

AW294276, clon de ADNc IMAGE:2726’347, lectura 3’ AA010931, clon de ADNc IMAGE:359779, Corazón, lectura 5’, 0.6kb AA3 03 624, cDNAcloneATCC:115215, Aorta, lectura 5’ AI366745, clon de ADNc IMAGE:1935056, lectura 3’, 0.5kb AA327257, cDNAcloneATCC:127927, Colon, lectura 5’ C06489, cDNAclonehbc5849, Páncreas BE218677, clon de ADNc IMAGE:3176164, Pulmón, lectura 3’ AA335675, cDNAcloneATCC:137498, Testículos, lectura 5’ R84975, clon de ADNc IMAGE:180552, Cerebro, lectura 3’, 2.1kb AI926445, clon de ADNc IMAGE:2459442, Estómago, lectura 3’, 1.9kb H61208, clon de ADNc IMAGE:236318, Ovario, lectura 3’, 1.9kb AA335358, clon de ADNc ATCC:137019, Testículos, lectura 5’ AI129190, clon de ADNc IMAGE:1509564, Muestreada, lectura 3’, 0.8kb T59188, clon de ADNc IMAGE:74634, Bazo, lectura 5’, 0.8kb T59150, clon de ADNc IMAGE:74634, Bazo, lectura 3’, 0.8kb R53174, clon de ADNc IMAGE:154350, Mama, lectura 5’, 0.8kb AA156150, clon de ADNc IMAGE:590120, lectura 5’ AA302509, clon de ADNcATCC:114727, Aorta, lectura 5’ R99429, clon de ADNc IMAGE:201985, lectura 5’, 2.4kb AI813787, clon de ADNc IMAGE:2421627, Páncreas, lectura 3’, 1.2kb H62113, clon de ADNc IMAGE:236316, Ovario, lectura 5’, 1.0kb R16422, clon de ADNc IMAGE:129313, lectura 5’, 0.7kb T48993 clon de ADNc IMAGE:70531, Placenta, lectura 5’, 0.6kb T05694, clon de ADNc HFBDF13, Cerebro R84531, clon de ADNc IMAGE:180104, Cerebro, lectura 5’, 2.2kb AI903080, clon ADNc (sin nombre), mama AI903083, clon de ADNc(sin nombre), mama AA302764, clon de ADNcATCC:194652, Tejido adiposo, lectura 5’ AA341407, clon de ADNcATCC:143064, Riñón, lectura 5’ W16503, clon de ADNc IMAGE:301194, Pulmón, lectura 5’ AW801246, clon de ADNc(sin nombre), útero AW959183, clon de ADNc(sin nombre) R85924, clon de ADNc IMAGE:180104, Cerebro, lectura 3’, 2.2kb

AA358843, clon de ADNcATCC:162953, Pulmón, lectura 5’ BE161769, clon de ADNc(sin nombre), cabeza-cuello W40341, clon de ADNc IMAGE:309369, Pulmón, lectura 5’, 1.7kb AA876225, clon de ADNc IMAGE:1257188, Célula Germinal, lectura 3’ R99441, clon de ADNc IMAGE:202009, lectura 5’, 2.3kb W76132, clon de ADNc IMAGE:344982, Corazón, lectura 5’, 1.4kb,

Tabla 12. 110 ESTs en el grupo de la glorieta mágica de ratón (Mm.27782)

AI427548, clon de ADNc IMAGE:521115, Músculo, lectura 3’ AV022394, clon de ADNc1190026N09, lectura 3’ BB219221, clon de ADNcA530053H04, lectura 3’ AI604803, clon de ADNc IMAGE:388336, Embrión, lectura 3’ AI504730, clon de ADNc IMAGE:964027, Glándula Mamaria, lectura 3’ AI430395, clon de ADNc IMAGE:388336, Embrión, lectura 5’ AI181963, clon de ADNc IMAGE:1451626, Hígado, lectura 3’ AV020471, clon de ADNc1190017N14, lectura 3’ BB219225, clon de ADNcA530053H12, lectura 3’ BB224304, clon de ADNcA530086A21, lectura 3’ BB527740, clon de ADNcD930042M18, lectura 3’ W66614, clon de ADNc IMAGE: 388336, Embrión, lectura 5’ BB097630, clon de ADNc9430060E21, lectura 3’ AI152731, clon de ADNc IMAGE:1478154, Útero, lectura 5’ AW742708, clon de ADNc IMAGE:2780289, oído interno,170 muestreada, lectura 3’ BB118169, clon de ADNc9530064M17, lectura 3’ AI839154, clon de ADNcUI-M-AO0-ach-e-11-0-UI, lectura 3’ BB206388, clon de ADNcA430075J10, lectura 3’ BB381670, clon de ADNcC230015E01, lectura 3’ BB 199721, clon de ADNcA430017A19, lectura 3’ AI593217, clon de ADNc IMAGE:1177959; Glándula mamaria, lectura 3’ BB219411, clon de ADNcA530054L01, lectura 3’ BB220744, clon de ADNcA530061M19, lectura 3’ BB220944, clon de ADNcA530062022, lectura 3’

BB390078, clon de ADNcC230066L23, lectura 3’ BB220730, clon de ADNcA530061L13, lectura 3’ AI615527, clon de ADNc IMAGE:964027, Glándula mamaria, lectura 5’ A1882477, clon de ADNc IMAGE:1396822, Glándula mamaria, lectura 5’ AV025281, clon de ADNc1200012D01, lectura 3’ BB470462, clon de ADNcD230033L23, lectura 3’ BB247620, clon de ADNcA730020G03, lectura 3’ BB555377, clon de ADNcE330019B13, lectura 3’ BB512960, clon de ADNcD730043I21 BB400157, clon de ADNcC330017F17, lectura 3’ BB320465, clon de ADNcB230385O10, lectura 3’ BB105670, clon de ADNc9430096H10, lectura 3’ BB441462, clon de ADNcD030027B11, lectura 3’ BB137530, clon de ADNc9830142007, lectura 3’ AA553155, clon de ADNc IMAGE:964027, Glándula mamaria, lectura 5’ BB319763, clon de ADNcB230382G07, lectura 3’ BB451051, clon de ADNcD130007I05, lectura 3’ BB504672, clon de ADNcD630049J11, lectura 3’ AI429453, clon de ADNc IMAGE:569122, Embrión, lectura 3’ BB190585, clon de ADNcA330062J23, lectura 3’ BB257082, clon de ADNcA730076M18, lectura 3’ BB386699, clon de ADNcC230047P06,lectura 3’ BB295814, clon de ADNcB130042A09, lectura 3’ BB450972, clon de ADNcD130007A22, lectura 3’ AA718562, clon de ADNc IMAGE:1177959, Glándula mamaria, lectura 5’ BB223775, clon de ADNcA530083K18, lectura 3’ AV020555, clon de ADNc1190018G05, lectura 3’ BB226083, clon de ADNcA530095K11, lectura 3’ BB482105, clon de ADNcD430007019, lectura 3’ BB381671, clon de ADNcC230015E02, lectura 3’ BB383758, clon de ADNcC230030C02, lectura 3’ BB257519, clon de ADNcA730080D13, lectura 3’ BB265667, clon de ADNcA830021117, lectura 3’

BB254777, clon de ADNcA730063K20, lectura 3’ AV240775, clon de ADNc4732443F15, lectura 3’ BB315010, clon de ADNcB230352H04, lectura 3’ BB390074, clon de ADNcC230066L16, lectura 3’ BB517605, clon de ADNcD830025B17,lectura 3’ BB484410, clon de ADNcD430025H01, lectura 3’ BB357583, clon de ADNcC030022J01, lectura 3’ AV225639, clon de ADNc3830431D12, lectura 3’ BB554921, clon de ADNcE330016A12, lectura 3’ BB161650, clon de ADNcA130061H21, lectura 3’ BB106720, clon de ADNc9530002M22, lectura 3’ BB535465, clon de ADNcE030043P14, lectura 3’ BB357738, clon de ADNcC030024B10, lectura 3’ AV285588, clon de ADNc5031411M12 BB188339, clon de ADNcA330048H22, lectura 3’ AV337749, clon de ADNc6430404F19, lectura 3’ BB065281, clon de ADNc8030443H10, lectura 3’ BB148059, clon de ADNc9930104N19, lectura 3’ AV252251, clon de ADNc4833438P20,lectura 3’ BB184506, clon de ADNcA330012J24, lectura 3’ BB522445, clon de ADNcD930007M08, lectura 3’ BB520366, clon de ADNcD830041K23, lectura 3’ AV127290, clon de ADNc2700047J01, lectura 3’ BB248651, clon de ADNcA730027F04, lectura 3’ BB008452, clon de ADNc4732482M24, lectura 3’ BB550719, clon de ADNcE230024C07, lectura 3’ BB182033, clon de ADNcA230095N14, lectura 3’ BB480258, clon de ADNcD33004SD17, lectura 3’ BB004855, clon de ADNc4732463E03, lectura 3’ AV379748, clon de ADNc9230013A19, lectura 3’ BB552137, clon de ADNcE230035B12,lectura 3’ BB288263, clon de ADNc IMAGE:3490042, Mama; lectura 5’ BB215681, clon de ADNcA530026M11, lectura 3’

BB251356, clon de ADNcA730046B16, lectura 3’ BB503441, clon de ADNcD630043F10, lectura 3’ BB500571, clon de ADNcD630029E03, lectura 3’ BB199833, clon de ADNcA430017K13, lectura 3’ BB533549, clon de ADNcE030030K03, lectura 3’ BB098399, clon de ADNc9430063L18, lectura 3’ BB213310, clon de ADNcA530009E09, lectura 3’ BB240699, clon de ADNcA630083B 14, lectura 3’ BB217106, clon de ADNcA530040N24,lectura 3’ BB057432, clon de ADNc7120459H22, lectura 3’ BB214645, clon de ADNcA530021N22, lectura 3’ BB218254, cDNAcloncA530048K12, lectura 3’ BB319841, clon de ADNcB230382006, lectura 3’ BB459759, clon de ADNcD130063G22, lectura 3’ BB485618, clon de ADNcD430032M09, lectura 3’ BB517699, clon de ADNcD830025118, lectura 3’ BB53 5595, clon de ADNcE030044M09, lectura 3’ BBS36291, clon de ADNcE030049D17, lectura 3’ BB552689, clon de ADNcE330001A16, lectura 3’ BB552709, clon de ADNcE33C001C16, lectura 3’

Ejemplo 2.

La expresión de ECSM4 está restringida a las células endoteliales.

La hibridización in situ (ISH) de tejidos normal y tumoral mostró que la expresión de ECSM4 se encuentra restringida a células

5 del endotelio vascular en los vasos angiogénicos de los adultos únicamente. El análisis de tejidos normales mostró que la expresión de ECSM4 se detecta en placenta humana y tejido fetal de cordón umbilical de 10,8 semanas de edad menstrual. Como se muestra en la Figura 16, la expresión de ECSM4 es altamente específica para las células del endotelio vascular de los vasos sanguíneos de la placenta. Además, la expresión estaba ausente a través de una gran cantidad de otros tejidos normales que se analizaron, incluyendo el hígado adulto, el cerebro y los grandes vasos, la próstata, el colon, el intestino

10 delgado, el corazón, el ojo (coroide y esclerótica), el ovario, el estómago, las mamas, y la vejiga fetal, los testículos, los riñones (15,8 semanas) y el corazón fetal, los riñones, la glándula adrenal, el intestino (11,3 semanas), cerebro fetal (10,6 semanas) y ojo fetal (16,5 semanas) (datos no mostrados).

El análisis de ISH de las biopsias de metástasis de hígado y tejido colorrectal mostró que la expresión de ECSM4 se encontraba restringida a las células del endotelio vascular de los vasos tumorales únicamente (Figura 17 y 18). No se detectó

15 expresión en el tejido circundante normal. Además, la expresión incrementada en la vecindad de los tejidos necróticos (Figura 18, el tejido necrótico se indica por medio de la señal brillante marcada *) es indicativa y consistente con la inducción de la expresión de ECSM4 por hipoxia. Como tal, ECSM4 puede ser un nuevo gen regulado por hipoxia.

El patrón de expresión altamente restringido de ECSM4 en los vasos angiogénicos en los tejidos normal y tumoral en los adultos es completamente consistente con el patrón de expresión selectivo a las células endoteliales por medio del análisis in

20 silico descrito en el Ejemplo 1.

Métodos

Se obtuvieron bloques de tumores y tejidos embebidos en paraffin y fijados con formalina, de los archivos del grupo de Patologías Mamarias del Imperial Cancer Research Fund del Hospital Guys, Londres, Reino Unido. Se preparó una ribosonda antisentido para el ADNc ECSM4 para la localización específica del ARNm del ECSM4 por hibridización in situ. Los métodos para el pretratamiento, hibridización, lavado y enjuagues de las láminas en Ilford K5 para autoradiografía han sido descritos previamente (Poulsom, R., Longcroft, J. M., Jeffrey, R. E., Rogers, L., y Steel, J. H. (1998) Eur. J. Histochem. 42, 121-132). Las películas se expusieron de 7 a 15 días antes del revelado en Kodak D19 y la tinción opuesta con Giemsa. Se examinaron las secciones bajo las condiciones de campo oscuro de luz reflejada o convencionales (Olympus BH2 con epi-iluminación) bajo un objetivo de x5, x10 o x20 que permitió ver los granos de platas autorradiográficos individuales como objetos brillantes en un fondo oscuro.

Ejemplo 3.

El polipéptido ECSM4 se detecta solo en células endoteliales.

Se generaron anticuerpos capaces de unir selectivamente el polipéptido ECSM4 y se utilizaron en inmunohistoquímica para demostrar la presencia del polipéptido ECSM4 en un grupo de tipos celulares (figuras 21 a la 26). Las muestras de tejido se prepararon a través de tecnicas estándares en las técnicas de inmunohistoquímica.

Generación de anticuerpos que reconocen al ECSM4.

Se fusionaron los péptidos MR 165, MR 311 y MR 336 a hemocianina Keyhole Limpet (KLH) antes de la inmunización de conejos para la producción de anticuerpos policlonales. El anticuerpo MGO-5 se derivó de conejos inmunizados con el péptido MR 165, mientras que el MGO-7 se derivó de conejos inmunizados con una mezcla de MR 311 y MR 336. La secuencia de los péptidos utilizados para generar los anticuerpos policlonales se muestra debajo, con la referencia dentro de la secuencia de aminoácidos del ECSM4 humano de longitud completa, como se muestra en la figura 12.

MR 165 = LSQSPGAVPQALVAWRA (681-697)

MR 274 = DSVLTPEEVALCLEL (790-804)

MR 311 = TYGYISVPTA (827-836)

MR 336 = KGGVLLCPPRPCLTPT (852-867)

Ejemplo 4.

Se utilizó la secuencia de EST de la glorieta mágica identificada en la búsqueda bioinformática de transcritos endoteliales específicos para aislar un ADNc de 3800 pares de bases de longitud a partir de una biblioteca de ADNc de corazón humano. Una búsqueda utilizando cebadores específicos del gen mostró que el mismo estaba presente en bibliotecas de corazón, cerebro fetal y adulto, hígado, pulmón, riñón, músculo, placenta e intestino delgado, pero ausente en leucocitos de sangr periférica, bazo y testículos. La mayor expresión estuvo en la biblioteca de placenta. La comparación de la secuencia de la glorieta mágica a la de la glorieta reveló una proteína de transmembrana con homología en toda la secuencia de la proteína pero ausencia de algunos dominios extracelulares. Así, MR tiene dos dominios inmunoglobulina y dos dominios fibronectina en la porción extracelular comparada con cinco dominios inmunoglobulina y dos fibronectina en la porción extracelular de las glorietas neuronales específicas. Se identificó un dominio transmembrana a través de (i) la utilización de un programa de predicción de transmembrana PRED-TMR y (ii) la utilización de un alineamiento entre las secuencias de la MR humana y del péptido ROBO1 humano. Ambos métodos identificaron los mismos residuos correspondientes a la región de transmembrana de la MR humana, los aminoácidos 468-490. Por lo tanto, los aa 1-467 son extracelulares y los aa 491-1007 son intracelulares. El dominio intracelular contiene una región rica en prolina putative que es homóloga a aquellas en la glorieta que se piensa que se acoplan a c-abl (Bashaw et al (2000) Cell 101: 703-715).

Se mapeó el sitio de secuencia fragmentada (STS) del SHGC-11739 humano (GenBank acc. G14646) en el ARNm de la glorieta mágica en una búsqueda dbSTS del BLAST. Este STS se localizó en el cromosoma 11 en el mapa físico de Stanford G3 (región 5647.00 cR10000 LOD 1.09 bin 129). Sin embargo, falta gran cantidad de la secuencia y no se conoce la estructura genómica. La búsqueda en la base de datos RIKEN identificó la glorieta mágica murina. El peso molecular predicho del núcleo peptídico de la MR humana fue de 107457 kDa. Esto se confirmó por la traducción in vitro (figura 3).

Ejemplo 5.

La expresión es detectable en los tumores

Se empleó la hibridización in situ para caracterizar la expresión de ECSM4 in vivo. Se encontró que la expresión de ECSM4 es muy restringida (Tabla 13), con una señal que no es detectable en muchos tejidos, incluyendo el tejido neuronal. Por el contrario, se detectó un fuerte expresión en placenta y en una gama de tumores, incluyendo los de cerebro, vejiga y metástasis del cáncer de colon en hígado (Figura 27). La expresión dentro de los tumores estuvo restringida a la vasculatura tumoral. La tinción inmunohistoquímica de la placenta confirmó la expresión endotelial específica de la proteína.

5 Una búsqueda de ECSM4 en bibliotecas de CGAP SAGE la detectó únicamente en bibliotecas endoteliales y de tumores (Tabla 14). Esto fue consistente con los resultados de la hibridización in situ en adultos, que mostró que la expresión estaba restringida a vasos tumorales (metástasis de cáncer de colon en hígado, ganglioglioma y carcinomas de vejiga y pulmón).

Tabla 13 Expresión de la glorieta mágica en tejido humano in vivo.

Expresión detectada Placenta y tejido fetal de cordón umbilical (10,8 semanas de edad menstrual)

10 Vasos en métastasis en hígado de tumor colorrectal, ganglioglioma, vejiga y carcinoma mamrio. Expresión no detectada Hígado de adulto, cerebro y vasos de gran calibre, próstata, solon, intestino delgado, corazón, coroide y esclerótica del ojo,

ovario, estómago, mama

Tabla 14 Bibliotecas de CGAP SAGE en las que se encontró la glorieta mágica sobre la base del mapeo de fragmentos 15 a genes

Biblioteca

Fragmentos/millón de fragmentos

HDMEC

171

HDMEC + VEGF

224

Meduloblastoma

102

Glioblastoma multiforme

85

Ovario, adenocarcinoma seroso

59

Glioblastoma multiforme, muestredao

48

HMDEC, células endoteliales microvasculares dérmicas humanas; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular

Ejemplo 6

Inducción de ECSM4 en células endoteliales hipóxicas

20 El RT-PCR inicial detectó la expresión de ECSM4 en líneas celulares endoteliales, pero no en otras líneas celulares, tales como fibroblastos (endometrio normal y FEK4), carcinoma de colon (SW480 y HCT116), carcinoma mamario (MDA453 y MDA468) y células HeLa. El análisis de protección a ribonucleasa confirmó y extendió este resultado (Figura 11a). Se vio que la expresión de ECSM4 está restringida al endotelio (tres aislamientos diferentes) y ausente en los fibroblastos, las células de carcinoma y neuronas. La inducción de ECSM4 en hipoxia en células endoteliales (pero no en células no endoteliales) se

25 observó cuando se analizó la expresión de ECSM4 usando dos sondas de protección de ARNasa diferentes. La expresión era, como promedio 5,5 y 2,6 veces superior en hipoxia para HUVEC y HDMEC respectivamente. El análisis de Western identificó una banda débil de 110 kD en las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMEC), pero que se encontraba ausente de los tipos celulares no endoteliales (Figura 11b). La banda era más intensa cuando las células HDMEC se exponían a 18 h de hipoxia, en consistencia con la hipótesis de que ECSM4 es un gen regulado mediante hipoxia.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo capaz de unir selectivamente al polipéptido humano ECSM4, en el que dicho ECSM4 humano es un polipéptido que existe de manera natural que comprende una porción de 50 residuos aminoacídicos consecutivos de la secuencia polipeptídica de la Figura 4 o Figura 5, para uso como un medicamento..

2. 2.

   Un anticuerpo según la Reivindicación 1, que liga selectivamente un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica situada entre los residuos 1 y 467 de la secuencia polipeptídica de la Figura 12.

3. 3.

   Un anticuerpo según la Reivindicación 1 ó 2 que liga selectivamente cualquiera de las secuencias aminoacídicas GGDSLLGGRGSL, LLQPPARGHAHDGQALSTDL, EPQDYTEPVE, TAPGGQGAPWAEE, o ERATQEEPSEHGP,.

4. 4.

   Un anticuerpo según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo monoclonal.

5. 5.

   Un compuesto que comprende (i) un anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y (ii) una fracción adicional, para uso como un medicamento.

6. 6.

   Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional es una fracción fácilmente detectable..

7. 7.

   Un compuesto según la Reivindicación 6 en el que la fracción fácilmente detectable comprende un átomo radiactivo.

8. 8.

   Un compuesto según la Reivindicación 7 en el que el átomo radioactivo es tecnecio-99m o yodo-123.

9. 9.

   Un compuesto según la Reivindicación 6 en el que la fracción fácilmente detectable comprende una cantidad adecuada de uno cualquiera de yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

10. 10.

    Un compuesto según la Reivindicación según la Reivindicación 5, en el que la fracción adicional es una fracción directa

    o indirectamente citotóxica.

11. 11.

    Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es un agente quimoterapéutico directamente citotóxico.

12. 12.

    Un compuesto según la Reivindicación 11, en el que la fracción citotóxica incluye un átomo radioactivo.

13. 13.

    Un compuesto según la Reivindicación 12 en el que el átomo radioactivo es uno cualquiera entre fósforo-32, yodo-125, yodo-131, indio-111, renio-186, renio-188 o itrio-90.

14. 14.

    Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es un polipéptido directamente citotóxico.

15. 15.

    Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es una fracción que es capaz de convertir un profármaco relativamente no tóxico en un fármaco citotóxico.

16. 16.

    Un compuesto según la Reivindicación 10 en el que la fracción citotóxica es un radiosensibilizador.

17. 17.

    Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional comprende una molécula de ácido nucleico.

18. 18.

    Un compuesto según la Reivindicación 17 en el que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico directamente citotóxica.

19. 19.

    Un compuesto según la Reivindicación 17 en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido directa o indirectamente citotóxico.

20. 20.

    Un compuesto según la Reivindicación 17 en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido terapéutico.

21. 21.

    Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional liga selectivamente a una fracción directa o indirectamente citotóxica.

22. 22.

    Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que la fracción adicional liga selectivamente a una fracción fácilmente detectable.

23. 23.

    Un compuesto según la Reivindicación 5 en el que el anticuerpo y la fracción adicional son polipéptidos que están fusionados.

24. 24.

    Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un compuesto según la reivindicación 23, para uso como un medicamento.

    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

    Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido.

    Documentos de patentes citados en la descripción

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