ES2371273T3 - Polímeros impresos molecularmente y uso de los mismos en dispositivos de diagnóstico. - Google Patents

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Abstract

Un adhesivo que comprende al menos un polímero reticulado impreso molecularmente.

Description

Polfmero impreso molecularmente y uso de los mismos en dispositivos de diagn6stico
ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCION
La presente invenci6n esta dirigida a polfmeros impresos molecularmente, y al uso de los mismos en dispositivos de diagn6stico para el analisis de moleculas diana.
El reconocimiento molecular es crftico para el funcionamiento de los sistemas biol6gicos. Los sistemas biol6gicos dependen del reconocimiento molecular para realizar funciones especfficas. Sistemas de reconocimiento molecular tales como interacciones enzima-sustrato, interacciones anticuerpo-antfgeno, replicaci6n del ADN y replicaci6n celular son ejemplos de sistemas biol6gicos dependientes de interacciones moleculares especfficas. Se usan biomoleculas tales como enzimas y anticuerpos en dispositivos de diagn6stico in vitro para detectar y cuantificar una molecula diana especffica que es indicativa de una enfermedad o funci6n biol6gica especffica. Por ejemplo, la enzima glucosa oxidasa se usa en tiras diagn6sticas de ensayo para cuantificar la concentraci6n de glucosa en fluidos biol6gicos tales como sangre, suero y fluido intersticial. La glucosa oxidasa reacciona especfficamente con la glucosa. Los diabeticos usan de manera rutinaria tiras de ensayo de glucosa para controlar el nivel de glucosa en su sangre.
Los polfmeros impresos molecularmente (MIPs, por sus siglas en ingles) son compuestos sinteticos creados con sitios receptores que se exhiben selectivamente a un compuesto diana. La sfntesis de un polfmero con la funcionalidad para reconocer una molecula diana especffica permite al polfmero capturar y concentrar la molecula diana. Alternativamente, se puede preparar un polfmero impreso molecularmente que contiene moleculas diana para liberar de manera controlable estas moleculas desde la red del polfmero.
Las aplicaciones para los polfmeros impresos molecularmente incluyen: adsorbentes cromatograficos, membranas, sensores y sistemas de administraci6n de farmacos. (Referencias: Molecular Imprinting at the edge of the Third Millenium, Sergey A. Piletsky et al., Trends in Biotechnology, vol 19(1), paginas 9-12, enero de 2001, y "Polymers and Gels as Molecular Recognition Agents", Nicholas A. Peppas y Yanbin Huang, Pharmaceutical Research, vol. 19(5), paginas 578-587, mayo de 2002; "Molecular Imprinting Science and Technology: A Survey of the Literature for the Years up to and including 2003", Alexander et al., Journal of Molecular Recognition, 2006, Vol. 19, pags. 106
180.
La sfntesis de polfmeros impresos molecularmente implica la polimerizaci6n y reticulaci6n de mon6meros funcionales en presencia de una molecula plantilla para capturar la impresi6n de la plantilla. Las moleculas plantilla pueden ser extrafdas del polfmero para crear sitios tridimensionales dentro de la matriz del polfmero con grupos funcionales que son complementarios a los de la molecula plantilla. (Referencia, "Molecular Imprinting: State of the Art and Perspectives", Jean Daniel Marty y Monique Mauzac, Advances in Polymer Science, vol. 172, paginas 1-35, 2005).
Las redes de polfmeros altamente reticulados son estructuras rfgidas que pueden exhibir una alta especificidad a la molecula diana. Esta alta especificidad hace a estos polfmeros rfgidos ideales para metodos analfticos y tecnicas de separaci6n que requieran un emparejamiento complementario exacto de grupos funcionales moleculares y la posici6n y orientaci6n de los grupos en una molecula diana. Por consiguiente, los polfmeros impresos molecularmente se pueden usar como relleno de columnas cromatograficas usadas para separar enanti6meros de mezclas racemicas.
Los MIPs rfgidos tienen la ventaja de ser altamente especfficos a una unica molecula diana. Tienen la desventaja de que es diffcil extraer la molecula plantilla de la red del polfmero altamente reticulado, debido a fuertes interacciones complementarias entre el polfmero y las moleculas diana. Ademas, la funcionalidad complementaria y los requerimientos de orientaci6n reducen la velocidad de reacci6n o el tiempo para que la molecula plantilla sea adsorbida en el sitio impreso. Reducir la densidad de reticulaci6n de un MIP reduce la especificidad de los sitios de captura. Sin embargo, la velocidad de captura de la plantilla es aumentada.
Muchas patentes y artfculos describen el uso de interacciones moleculares polfmero-biomolecula especfficas en biosensores. Per Bjork et al., en Biosensors & Bioelectronics 20 (2005), paginas 1764-1771, describe un biosensor basado en la interacci6n electrostatica y de enlace de hidr6geno entre politiofeno y oligonucle6tidos. La publicaci6n de patente de EE.UU. N° 2004/0053425 describe un ensayo en chip basado en el reconocimiento molecular entre un peptido o protefna y un anticuerpo monoclonal. Estas aplicaciones se basan en el reconocimiento molecular, en lugar de en un polfmero impreso molecularmente.
La patente de EE.UU. N° 6.638.498, de Green et al, describe MIPs para unirse a y retirar toxinas del tracto gastrointestinal.
Chin-Shiou Huang, en la patente de EE.UU. N° 6.680.210, muestra tecnicas para preparar polfmeros en los que se imprimen macromoleculas. Los MIPs se pueden usar para detectar y cuantificar la cantidad de cada macromolecula en una fuente biol6gica compleja.
La patente de EE.UU. N° 6.762.025, cedida a Molecular Machines, Inc., muestra el uso de oligonucle6tidos para el reconocimiento molecular.
La patente de EE.UU. N° 6.807.842 describe un sensor de reconocimiento molecular para detectar un analito usando una pelfcula de un polfmero semiconductor. La pelfcula de polfmero esta impresa con el analito y la resistencia de la pelfcula cambia cuando es expuesta al analito e interferentes.
La patente de EE.UU. N° 6.582.971, de Singh et al., describe un metodo para imprimir molecularmente polfmeros con biomoleculas grandes tales como protefnas. Usando polimerizaci6n bifasica, una biomolecula diana es impresa molecularmente en el polfmero en la interfaz entre una fase acuosa y una organica.
La patente de EE.UU. N° 6.461.873, de Catonia et al., describe un detector de cafefna que usa al menos dos polfmeros impresos molecularmente en una primera y segunda zonas en una tira de papel. El MIP en la primera zona retira sustancias que puedan interferir con el analisis de la cafefna. La segunda zona esta revestida con un MIP que adsorbe selectivamente cafefna y reactivos cromogenicos que proporcionan una cuantificaci6n colorimetrica de la cafefna.
COMPENDIO DE LA INVENCION
Un polfmero con sitios impresos molecularmente puede ser formulado en un adhesivo. El adhesivo impreso molecularmente se puede usar en dispositivos de diagn6stico in vitro para concentrar un analito diana en un area de detecci6n. Ademas, se puede usar un adhesivo impreso molecularmente para extraer o unirse a compuestos interferentes de fluidos donde contactan con el adhesivo, y retirar estos compuestos en un biosensor. Concentrando un analito en el area de detecci6n o retirando compuestos interferentes, la precisi6n, sensibilidad y nivel de detecci6n del dispositivo pueden ser mejorados.
Alternativamente, un adhesivo que se prepara usando un polfmero que ha sido sintetizado para ser impreso con una molecula especffica puede liberar de manera controlable la molecula diana segun se requiera. Por ejemplo, un adhesivo impreso con un tensioactivo puede retener el tensioactivo en la red del adhesivo y liberar despues el tensioactivo en un dispositivo de diagn6stico para reducir la tensi6n superficial de fluidos. Se pueden usar adhesivos impresos con tensioactivo en dispositivos de flujo lateral para reducir la tensi6n superficial de fluidos biol6gicos tales como sangre y esputo, para aumentar las velocidades de flujo y reducir el tiempo de respuesta del sensor.
Ademas, la presente invenci6n comprende un metodo para realizar un analisis de una muestra lfquida que contiene un componente a ser analizado en cuanto a identidad y/o cantidad, que comprende poner en contacto dicha muestra lfquida con un adhesivo comprendido de un polfmero reticulado que ha sido impreso con dicho componente, y realizar dicho analisis en base a la cantidad de dicho componente absorbida por dicho polfmero que ha sido previamente impreso con dicho componente.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Figura 1a es una vista cenital de un dispositivo de diagn6stico de flujo lateral;
La Figura 1b es un diagrama esquematico del dispositivo de diagn6stico de flujo lateral de la Figura 1a;
La Figura 2 representa un dispositivo microflufdico usado en analisis de muestras in vitro;
La Figura 3 es una vista lateral de un dispositivo de diagn6stico de flujo lateral de la presente invenci6n;
La Figura 4 es una vista cenital del dispositivo de diagn6stico de flujo lateral de la Figura 3;
La Figura 5 es una vista en despiece de una tira de ensayo diagn6stico de flujo lateral de la presente invenci6n;
La Figura 6 es una vista en despiece de otra realizaci6n de una tira de ensayo de flujo lateral de la presente invenci6n;
La Figura 7 es una vista en perspectiva de un dispositivo de diagn6stico microflufdico acorde con la presente invenci6n;
La Figura 8 es una vista en secci6n transversal del dispositivo de la Figura 7;
La Figura 9 es una vista en perspectiva de otra realizaci6n de un dispositivo microflufdico que tiene una porci6n espaciadora de adhesivo unida a una porci6n base;
La Figura 10 es una vista en secci6n transversal del dispositivo microflufdico de la Figura 9, en la que estan presentes ambas porciones base;
La Figura 11 es una vista en perspectiva de una microplaca sin una lamina de cobertura; y
La Figura 12 es una vista en perspectiva de la microplaca de la Figura 9 con una lamina de cobertura.
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La Figura 13 es una vista cenital de una microplaca de pocillos abiertos que tiene una multitud de orificios en la misma.
La Figura 14 es una vista en secci6n transversal de la microplaca de pocillos abiertos de la Figura 13.
La Figura 15 es una representaci6n grafica del efecto sobre determinada concentraci6n de glucosa usando un MIP impreso para acido urico y acido asc6rbico.
La Figura 16 es una representaci6n grafica del efecto sobre determinada concentraci6n de glucosa usando 5% en peso de MIPs impresos para acido urico y acido asc6rbico en la masa de un adhesivo sensible a la presi6n.
La Figura 17 es una representaci6n grafica del efecto sobre determinada concentraci6n de glucosa usando 5% en peso de MIPs impresos para acido urico y acido asc6rbico en la superficie de un adhesivo sensible a la presi6n.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCION
La presente invenci6n esta dirigida a adhesivos que contienen al menos un polfmero impreso molecularmente (MIP). Un polfmero impreso molecularmente es un polfmero reticulado creado con un sitio de reconocimiento molecular especffico. El sitio de reconocimiento molecular es complementario a la forma y funcionalidad de una molecula diana
o receptora.
La presente invenci6n se basa en el efecto combinado del uso de una molecula diana, mon6meros funcionales en el polfmero que son complementarios a la molecula diana, y el uso de un agente de reticulaci6n.
La molecula diana puede ser un analito, un compuesto interferente, o un compuesto a ser recogido. Ademas, el polfmero impreso molecularmente de la presente invenci6n se puede usar para permitir la liberaci6n qufmica de un componente impreso (tal como un compuesto antimicrobiano), o la administraci6n de farmacos por medio de programaci6n de velocidad (difusi6n), liberaci6n activada o liberaci6n regulada. El MIP se puede usar para recoger una molecula diana, o liberar una molecula diana.
Durante la formaci6n del MIP, se polimerizan y reticulan mon6meros funcionales en presencia de una molecula plantilla para producir una resina impresa molecularmente.
Ventajosamente, la resina polimerica puede estar comprendida de uno o mas de los siguientes mon6meros funcionales: acido acrflico, acido metacrflico, acido trifluorometacrflico, acido 4-vinilbenzoico, acido itac6nico, 1vinilimidazol, 2-vinilpiridina, 4-vinilpiridina, 4(5)-vinilimidazol, acido 4-vinilbencil-iminodiacetico, y acido 2-acrilamido2-metil-1-propanosulf6nico. Esta lista de mon6meros funcionales no pretende ser exhaustiva, y se pueden emplear otros mon6meros funcionales que se juzguen apropiados. La selecci6n de mon6meros funcionales adecuados esta bien dentro de la experiencia de la persona habituada de manera rutinaria a la tecnica.
Otros mon6meros ejemplares que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, metacrilato de hidroxiletilo, 1vinilimidazol, acido vinilacetico, acrilamida y acrilamida de diacetona.
Tambien se emplea un agente de reticulaci6n a fin de controlar la morfologfa de la matriz del polfmero, estabilizar el sitio de uni6n y proporcionar estabilidad mecanica, y esta presente, de manera general, en una cantidad de entre 2590% en peso, basado en el peso total de los reaccionantes usados para formar el polfmero.
Los agentes de reticulaci6n ejemplares incluyen, pero no se limitan a 4-divinilbenceno, N,N'-metilen-bisacrilamida, N,N'-fenilen-bisacrilamida, 2,6-bisacrilamidopiridina, dimetacrilato de etilenglicol, poli(dimetacrilato de etilenglicol), y trimetacrilato de trimetilolpropano.
Tales mon6meros se pueden emplear para dar polfmeros tales como poli(metacrilato de hidroxietilo), poli(acido acrflico), poli(acido metacrflico), polipirrol, copolfmeros de acido vinilacetico, acrilamida y alilbenceno; poli(4-vinilpiridina); poliestireno-co-acrilamida; copolfmero de acrilamida y 4-vinilpiridina.
Los reaccionantes polimericos y el agente de reticulaci6n se pueden combinar entre si en presencia de un disolvente
o por6geno. El disolvente o por6geno reune a todos los reaccionantes durante la polimerizaci6n, es responsable de crear poros en el polfmero (polfmeros de tipo gel que pueden ser amorfos o vftreos), partfculas macroporosas o de microgeles. Los disolventes tfpicos incluyen, pero no se limitan a, acetonitrilo o agua.
Tambien se pueden emplear iniciadores basados en disolvente o basados en agua para mejorar la polimerizaci6n de los reaccionantes. Un iniciador basado en disolvente adecuado es el azobis-isobutironitrilo, y un iniciador basado en agua es el acido 2,2'-azobis-cianovalerico.
La resina se usa para formular un adhesivo que puede ser revestido sobre diversas pelfculas de soporte. La molecula plantilla puede ser retenida en la resina, dejando que la molecula plantilla sea liberada del adhesivo de manera controlable. Alternativamente, la molecula plantilla puede ser extrafda de la resina antes de la formulaci6n en un adhesivo.
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Los adhesivos pueden ser formulados para contener multiples polfmeros impresos molecularmente. Se puede preparar un adhesivo que contenga multiples MIPs para extraer diferentes moleculas plantilla (p. ej. interferentes) de un fluido segun contacten los interferentes presentes en el fluido con la superficie del adhesivo.
Las composiciones MIP de la presente invenci6n se pueden usar de diversas maneras diferentes. La composici6n MIP, una vez formada, puede ser molida hasta el tamafo de un polvo. El polvo MIP puede ser mezclado despues en una composici6n adhesiva para formar un adhesivo que tiene uniformemente disperso en el mismo el componente MIP. El polvo MIP tambien se puede aplicar a la superficie de una capa adhesiva, mezclar en una disoluci6n adhesiva bien en forma de s6lido o bien en la forma de una mezcla solvatada de disolvente/s6lidos, suspender en una disoluci6n (disuelto o no), y revestir por colado o pulverizaci6n sobre una superficie adhesiva.
Se pueden mezclar diferentes composiciones MIP en presencia de un disolvente adecuado, y despues colar o formar de otro modo hasta obtener un s6lido. Despues, el s6lido puede ser molido hasta un tamafo de partfcula adecuado. El polfmero tambien puede ser polimerizado en presencia de dos o mas moleculas.
Alternativamente, suponiendo que el polfmero impreso resultante sea suficientemente blando para servir como un adhesivo sensible a la presi6n, el polfmero impreso molecularmente puede constituir por sf mismo la capa adhesiva.
La identidad del componente adhesivo con el que se puede mezclar el MIP no es crftica. Se pueden emplear diversos adhesivos, tales como adhesivos sellables por calor y adhesivos sensibles a la presi6n, la identidad de los cuales es conocida por aquellos con experiencia habitual en la tecnica.
Por ejemplo, se pueden usar diversos adhesivos, que incluyen, pero no se limitan a, eteres polivinflicos, adhesivos acrflicos, poli-alfa-olefinas y adhesivos de silicona, asf como mezclas de los mismos. A modo de ejemplo, los adhesivos sensibles a la presi6n de eter polivinflico comprenden generalmente mezclas de eter vinilmetflico, eter viniletflico o eter vinilisobutflico, u homopolfmeros de eteres vinflicos y acrilatos. Los adhesivos sensibles a la presi6n acrflicos pueden comprender, por ejemplo un componente de ester alquflico C3-12 y un componente polar tal como acido (met)acrflico, N-vinilpirrolidona, etc. Tales adhesivos pueden ser hechos pegajosos. Los adhesivos de polialfaolefinas pueden comprender un polfmero de poli(alqueno) C3-18 opcionalmente reticulado, que es bien pegajoso por sf mismo o bien puede incluir un agente de pegajosidad. Los adhesivos sensibles a la presi6n de silicona comprenden un polfmero o goma constituyente y una resina pegajosa.
Mas especfficamente, el adhesivo sensible a la presi6n acrflico esta comprendido preferiblemente de un polfmero formado a partir del producto de reacci6n de al menos un acrilato A y un mon6mero B diferente del mon6mero A.
El al menos un mon6mero A comprende preferiblemente un ester de acido (met)acrflico monomerico de un alcohol no terciario, donde la parte del alcohol tiene de 1 a 30 atomos de carbono. Los mon6meros A ejemplares incluyen, pero no se limitan a, esteres de acido acrflico o acido metacrflico con alcoholes no terciarios tales como 1-butanol, 1pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 2-metil-1-butanol, 1-metil-1-pentanol, 2-metil-1-pentanol, 3-metil-1-pentanol, 2-etil1-butanol, 3,5,5-trimetil-1-hexanol, 3-heptanol, 2-octanol, 1-decanol, 1-dodecanol, etc. Tales mon6meros son bien conocidos por los expertos en la tecnica. El al menos un componente monomerico A (si esta presente mas que un mon6mero A) exhibira preferiblemente un numero medio de atomos de carbono en la parte del alcohol de los esteres de acidos acrflicos o (met)acrflicos totales de entre 3 y 16.
Se pueden incorporar en el polfmero uno o mas mon6meros B polimerizables diferentes del mon6mero A, mon6mero(s) B que es (son) copolimerizable(s) con el mon6mero A. Tal(es) mon6mero(s) B adicional(es) puede(n) ser hidr6filo(s) o bien hidr6fobo(s).
Los mon6meros B opcionales ejemplares incluyen mon6meros vinflicos que tienen al menos un atomo de nitr6geno. Tales mon6meros (cada uno de los cuales exhibe una Tg de >20°C) incluyen, pero no se limitan a, acrilamidas Nmono-sustituidas, tales como acrilamida, metacrilamida, N-metilacrilamida, N-etilacrilamida, N-metilolacrilamida, Nhidroxietilacrilamida y acrilamida de diacetona; acrilamidas N,N-disustituidas, tales como N,N-dimetilacrilamida, N,Ndietilacrilamida,N -etil-N-aminoetilacrilamida, N-etil-N-hidroxietilacrilamida, N,N-dimetilolacrilamida, y N,N-dihidroxietilacrilamida, etc.
Otros mon6meros B opcionales pueden incluir, por ejemplo, diversos mon6meros vinflicos tales como acido (met)acrflico, acido itac6nico, acido crot6nico, (met)acrilato de metoxietilo, (met)acrilato de etoxietilo, (met)acrilato de glicerol, metacrilato de hidroxietilo, metacrilato de hidroxipropilo, acrilato de beta-carboxietilo, vinilpirrolidona, vinilcaprolactama y acrilato de caprolactama. Se puede emplear uno o mas mon6meros B.
Tales adhesivos sensibles a la presi6n son bien conocidos por un experto habitual en la tecnica, y pueden ser seleccionados facilmente por tales personas para el uso en la presente invenci6n.
Ventajosamente, tales MIPs se pueden usar en dispositivos de diagn6stico tales como dispositivos de flujo lateral u otros tipos de dispositivos de diagn6stico como los representados en las Figuras discutidas mas adelante. Se ha encontrado que los interferentes presentes de manera natural en un fluido que contacta con el dispositivo de diagn6stico pueden interferir con la obtenci6n de un resultado diagn6stico exacto. Por ejemplo, como se discute mas adelante, la presencia del interferente acido urico y/o acido asc6rbico en la sangre interfiere con la obtenci6n de una determinaci6n exacta de la cantidad de glucosa presente en la sangre. Mediante el uso de un MIP que ha sido impreso con acido urico y/o acido asc6rbico, el acido urico y/o acido asc6rbico pueden ser retirados del fluido durante la diagnosis, mejorando asf la exactitud de la determinaci6n de glucosa en el fluido. La misma ventaja existe con respecto a otros interferentes que puedan estar presentes.
La molecula diana debe ser no reactiva bajo las condiciones de polimerizaci6n empleadas para formar el polfmero impreso. Una relaci6n de pesos tfpica de mon6mero/molecula diana es 4:1, aunque la cantidad de molecula diana que se emplea no es crftica para la practica de la invenci6n reivindicada.
Un metodo para preparar un polfmero impreso molecularmente con sitios de reconocimiento de la glucosa es descrito por Hasoo Seong et al en el Journal Biomaterial Science Polymer Education, Vol. 13(6), paginas 637-649 (2002).
Se sintetiz6 un polfmero impreso con glucosa usando mon6meros funcionales usados actualmente para preparar adhesivos sensibles a la presi6n. Los Ejemplos 1-7 describen diversas formulaciones y condiciones usadas para preparar MIPs impresos con glucosa, asf como sistemas de control. El reticulador y la concentraci6n del reticulador se seleccionaron para controlar la rigidez del sitio receptor de glucosa.
La presente invenci6n se describe ademas en relaci6n con los siguientes Ejemplos, que se deben ver como meramente ilustrativos de la invenci6n y no limitantes por naturaleza.
El Ejemplo 1 es una formulaci6n polimerica convencional que se prepara sin la presencia de un agente de glucosa, y se hace como composici6n de control.
Ejemplo 1
13% de s6lidos, disolvente DMSO
acido vinilacetico
4,89% en peso
acrilamida
4,03%
alilbenceno
6,71%
diacrilato de 1,4-butanodiol
84,37%
Los reaccionantes anteriores se mezclan con 1% en peso de los mon6meros con el iniciador 2,2'-azobis(2,4-dimetilpentanonitrilo), y se polimerizan durante 4 horas a 60°C en una atm6sfera de nitr6geno.
El Ejemplo 2 contiene los mismos componentes de polfmero que la formulaci6n del Ejemplo 1, pero tambien incluye un componente de D-glucosa.
Ejemplo 2
13% de s6lidos, disolvente DMSO
acido vinilacetico 5,34% en peso
acrilamida 4,41%
alilbenceno 7,33%
D-glucosa 11,18%
diacrilato de 1,4-butanodiol 71,74%
Los reaccionantes anteriores se mezclan con 1% en peso de los mon6meros con el iniciador 2,2'-azobis(2,4-dimetilpentanonitrilo), y se polimerizan durante 4 horas a 60°C en una atm6sfera de nitr6geno.
Tras completarse la polimerizaci6n, el polfmero de los Ejemplos 1 y 2 se sec6 para retirar el disolvente y despues se moli6 hasta un polvo fino.
El polvo polimerico del Ejemplo 2 se lav6 con agua para retirar cualquier resto de glucosa. Despues del lavado con agua, se volvieron a secar los polfmeros. Para determinar la capacidad de los sitios impresos para extraer y concentrar D-glucosa, el polfmero fue expuesto a una disoluci6n acuosa que contenfa 10% de glucosa. Se us6 un analisis termogravimetrico usando un Universal V2.6D de TA Instruments para medir el cambio en la estabilidad termica del polfmero causado por la adsorci6n de glucosa por el polfmero. Midiendo el cambio en la temperatura de descomposici6n del polfmero con o sin glucosa, se encontr6 que el 70% de los sitios te6ricos se formaron durante la polimerizaci6n, y el 50% de estos sitios permanecieron viables para la captaci6n de glucosa despues de la retirada de la glucosa.
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El Ejemplo 3 es otra formulaci6n polimerica convencional que se prepara sin la presencia de un agente de glucosa, y se hace como composici6n de control.
Ejemplo 3
13% de s6lidos, disolvente DMSO
acido vinilacetico
4,89% en peso
acrilamida
4,03%
alilbenceno
6,71%
N,N-metilen-bis-acrilamida
84,37%
Los reaccionantes anteriores se mezclan con 1% en peso de los mon6meros con el iniciador 2,2'-azobis(2,4-dimetilpentanonitrilo), y se polimerizan durante 4 horas a 60°C en una atm6sfera de nitr6geno.
El Ejemplo 4 contiene los mismos componentes de polfmero que la formulaci6n del Ejemplo 3, pero tambien incluye un componente de D-glucosa.
Ejemplo 4
13% de s6lidos, disolvente DMSO
acido vinilacetico 5,34% en peso
acrilamida 4,41%
alilbenceno 7,33%
D-glucosa 11,18%
N,N-metilen-bis-acrilamida 71,74%
Los reaccionantes anteriores se mezclan con 1% en peso de los mon6meros con el iniciador 2,2'-azobis(2,4-dimetilpentanonitrilo), y se polimerizan durante 4 horas a 60°C en una atm6sfera de nitr6geno.
Como se apunt6 anteriormente, el polfmero sintetizado en el Ejemplo 3 no contiene sitios impresos con glucosa, y se usa como control. El Ejemplo 4 es un polfmero similar. Sin embargo, la polimerizaci6n y reticulaci6n se produce en presencia de glucosa como molecula plantilla.
No se pudo usar un analisis termogravimetrico para los Ejemplos 3 y 4, dado que el cambio en la descomposici6n del polfmero fue similar a la glucosa. Para medir la impresi6n de la glucosa en el Ejemplo 4, se obtuvo de WAKO Chemicals USA, Inc. un kit de glucosa Glucose G2 Autokit. Este kit emplea un metodo enzimatico que usa mutarotasa y glucosa oxidasa para generar per6xido de hidr6geno durante la oxidaci6n de la glucosa. Despues, el per6xido de hidr6geno induce la condensaci6n oxidativa entre fenol y 4-aminoantipirina en presencia de peroxidasa para crear un color rojo. Midiendo la absorbancia del color rojo, la concentraci6n de glucosa puede ser determinada.
Se sigui6 un procedimiento de lavado y secado similar al de los Ejemplos 1 y 2. Los polfmeros de los Ejemplos 3 y 4 fueron expuestos a una disoluci6n acuosa de glucosa al 10%, despues se lavaron y se recogi6 una muestra de los extractos acuosos del control y de los polfmeros impresos. Las muestras acuosas se prepararon siguiendo las instrucciones del kit de glucosa, y la absorbancia se ensay6 en un espectrofot6metro Lambda 9000 UV/VIS/NIR de Perkin Elmer. Usando un patr6n de concentraci6n conocida incluido en el kit, se determin6 la concentraci6n de glucosa en las muestras acuosas. Este valor fue relacionado con los sitios de glucosa impresos te6ricos en los polfmeros. Se calcul6 que se formaron el 80% de los sitios te6ricos durante la polimerizaci6n para el Ejemplo 4, y el 70% de estos sitios permanecieron viables para la captaci6n despues de la retirada de la glucosa.
Los Ejemplos 2 y 4 forman polfmeros de rfgidos a blandos que se formularon en un adhesivo y se revistieron sobre un soporte de poliester. La pelfcula adhesiva se us6 en un dispositivo de flujo lateral para soportar una membrana de nitrocelulosa bajo un area de detecci6n. El area de detecci6n en la membrana de nitrocelulosa habfa sido tratada con reactivos colorimetricos que responden a la glucosa. Se hizo pasar una gota de una disoluci6n acuosa de glucosa al 1% a traves de la membrana, y el color en el area de detecci6n respondi6 en 2 segundos. Se construy6 un dispositivo de flujo lateral similar sin el adhesivo MIP usando los controles de los Ejemplos 1 y 3, y los reactivos colorimetricos en el area de detecci6n no respondieron hasta 10 segundos.
El Ejemplo 5 tambien contiene los mismos componentes de polfmero que la formulaci6n del Ejemplo 2, pero tambien incluye un componente de acido urico en lugar de un componente de D-glucosa. El acido urico es un conocido interferente en las determinaciones de glucosa, como se discuti6 anteriormente.
Ejemplo 5
13% de s6lidos, disolvente DMSO
acido vinilacetico
5,34% en peso
acrilamida
4,41%
alilbenceno
7,33%
acido urico
11,18%
N,N-metilen-bis-acrilamida
71,74%
Los reaccionantes anteriores se mezclan con 1% en peso de los mon6meros con el iniciador 2,2'-azobis(2,4-dimetilpentanonitrilo), y se polimerizan durante 4 horas a 60°C en una atm6sfera de nitr6geno.
El Ejemplo 5 muestra un polfmero MIP impreso para acido urico por retirada de acido urico del polfmero resultante por un exhaustivo lavado con agua. Se ha reportado que el acido urico interfiere con la respuesta de las tiras de ensayo de glucosa en sangre. El MIP de acido urico se formul6 en un adhesivo, y la cinta adhesiva se us6 como cubierta sobre el canal para sangre de una tira de ensayo de glucosa en sangre Accu-Chek Comfort Curve fabricada por Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN. Una disoluci6n de ensayo que contenfa 130 mg/decalitro de glucosa y 8 mg/decalitro de acido urico se dej6 absorber a traves del canal de sangre.
Se obtuvieron mediciones de glucosa mas exactas cuando el canal fue cerrado por el adhesivo impreso con acido urico en comparaci6n con una tira de ensayo de control que no contenfa el adhesivo MIP.
Se sabe tambien que otros compuestos, tales como el acetaminofeno y el acido asc6rbico, interfieren con el analisis de la glucosa en sangre. Otras moleculas que pueden ser impresas incluyen, pero no se limitan a, cafefna, melatonina, morfina u otros farmacos de adicci6n, etc. Se pueden preparar MIPs similares al Ejemplo 5 usando estos compuestos interferentes como moleculas plantilla. Por ejemplo, se pueden preparar polfmeros individuales para cada interferente de la misma manera que la apuntada anteriormente. Alternativamente, se puede sintetizar un polfmero con sitios impresos para multiples compuestos interferentes incorporando diferentes interferentes en un unico lote de reacci6n.
El Ejemplo 6 contiene otra formulaci6n polimerica adhesiva sensible a la presi6n convencional, fotocurable y exenta de disolventes, para el uso como control.
Ejemplo 6
acrilato de 2-etilhexilo 56,15% en peso acrilato de n-butilo 14,99 acetato de vinilo 19,98 acido acrflico 5,61 poli(diacrilato de etilenglicol) 2,50 2-hidroxi-2-metil-1-fenil-1-propanona 0,77
Los reaccionantes anteriores se mezclan con 1% en peso de los mon6meros con el iniciador 2,2'-azobis(2,4-dimetil
pentanonitrilo), y se polimerizan durante 4 horas a 60°C en una atm6sfera de nitr6geno. El Ejemplo 7 contiene los mismos componentes de polfmero que la formulaci6n del Ejemplo 6, pero tambien incluye un componente de tensioactivo -es decir, Aerosol OT, un tensioactivo ani6nico, obtenido de Cytec Industries.
Ejemplo 7
acrilato de 2-etilhexilo 55,74% en peso acrilato de n-butilo 14,88
acetato de vinilo 19,83 acido acrflico 5,57 poli(diacrilato de etilenglicol) 2,48 2-hidroxi-2-metil-1-fenil-1-propanona 0,76
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Aerosol OT 0,74
Despues de un fotocurado por radicales libres, el Ejemplo 7 produce un adhesivo sensible a la presi6n hidr6filo. La molecula de tensioactivo se usa como plantilla para crear sitios impresos dentro de la matriz del adhesivo. Las moleculas de tensioactivo pueden ser liberadas del adhesivo de manera controlable durante el uso para reducir la tensi6n superficial de los fluidos que contactan con el adhesivo. Dado que las moleculas del tensioactivo estan atrapadas dentro de la matriz del polfmero, son menos labiles y el adhesivo retiene sus propiedades hidr6filas incluso despues de enjuagar el adhesivo bajo el chorro del agua del grifo.
Se prepar6 una cinta adhesiva sensible a la presi6n revistiendo el polfmero impreso del Ejemplo 7 sobre una pelfcula de poliester de 3 mil de grosor. La cinta impresa con tensioactivo se us6 como cubierta para encerrar canales flufdicos moldeados en un sustrato de polietileno. El agua fluy6 a traves de los canales, mientras que una construcci6n similar preparada usando una cinta adhesiva sensible a la presi6n hecha usando el polfmero de control del Ejemplo 6 no lo hizo. El flujo de agua a traves de los canales se pudo repetir multiples veces, ilustrando la retenci6n del tensioactivo en el polfmero adhesivo impreso.
Los polfmeros impresos molecularmente de la presente invenci6n se pueden usar con ventaja con dispositivos de diagn6stico tales como los descritos en la Publicaci6n PCT WO 02/085185. Tales dispositivos incluyen dispositivos de flujo lateral, dispositivos de diagn6stico in vitro microflufdicos, y dispositivos de diagn6stico in vitro comprendidos de una microplaca que tiene una placa base que tiene dispuestos en la misma una multitud de microorificios o cavidades, y al menos una cubierta colocada en relaci6n de sellado para dichos microorificios o cavidades.
La Publicaci6n PCT WO 02/085185 muestra la combinaci6n de un tensioactivo con una composici6n polimerica a fin de dar un polfmero hidr6filo. Sin embargo, la publicaci6n apuntada meramente muestra la mezcla del tensioactivo con un polfmero solvatado. Esto es, en contraste, mezclar el tensioactivo con la mezcla de mon6meros que son despues polimerizados y reticulados en presencia del tensioactivo para formar un polfmero impreso.
Los dispositivos de flujo lateral como los mostrados en las Figuras 1A y 1B tienen tfpicamente un area de entrada de muestras para recibir el fluido biol6gico. El area u orificio de entrada de muestras puede estar pr6ximo a una capa conjugada que contiene los reactivos especfficos para el metodo de ensayo analftico. Segun fluye el especimen de muestra desde el area de entrada a traves de un area de reactivos, se producen reacciones qufmicas especfficas o una formaci6n de complejos. El producto de reacci6n o complejo continua fluyendo hasta un area de detecci6n, donde el analito es medido. Los fluidos del especimen pueden continuar fluyendo y ser recogidos en una capa absorbente. El tiempo requerido para determinar la concentraci6n de un analito especffico es dependiente de la velocidad de flujo del fluido y la velocidad de reacci6n entre el analito y un reactivo de ensayo especffico.
Se usan tfpicamente soportes adhesivos en la construcci6n de dispositivos de flujo lateral para soportar los diversos componentes del dispositivo, incluyendo la capa conjugada, una membrana microporosa con reactivos especfficos y una capa absorbente como se muestra en las Figuras 1A y 1B. La capa adhesiva puede ser bien sensible a la presi6n o bien sellable por calor, y puede estar presente en una pelfcula de soporte tal como una pelfcula de poliester. La velocidad de flujo del fluido de muestra es controlada tfpicamente por el flujo capilar a traves de la membrana microporosa.
La presente invenci6n se puede emplear con ventaja en diversos dispositivos de diagn6stico in vitro, tanto del tipo de flujo lateral como de flujo capilar, con dispositivos del tipo de flujo lateral de las Figuras 3-8. En una realizaci6n de un dispositivo de flujo lateral de la presente invenci6n como el representado en la Figura 6, el dispositivo comprende una cubierta 1 de la carcasa, medios 3 (orificios) en la cubierta de la carcasa para introducir una muestra a ser ensayada en el dispositivo, medios 5 (capa absorbente) para la recogida de fluidos, y una tira 7 de soporte que tiene separados por un espacio un primer y segundo extremos. Los medios para la recogida de fluidos de muestra estan adheridos al soporte en un primer extremo de la tira de soporte, los medios para introducir la muestra estan adheridos al soporte en el segundo extremo de la tira de soporte. Una membrana 9 microporosa o porosa esta colocada opcionalmente entre el primer y segundo extremos para proporcionar una vfa para el recorrido de la muestra entre el primer y segundo extremos, asf como para proporcionar una matriz para cualquier material reactivo que pueda estar presente para el contacto con la muestra fluida, tiempo durante el cual la muestra contacta con el reactivo con el que se debe producir la reacci6n o contacto.
Ventajosamente, de acuerdo con la presente invenci6n, la tira de soporte entre el primer y segundo extremos puede ser una pelfcula de polfmero impreso molecularmente, que puede ser adhesiva por naturaleza. La tira 7 de soporte puede ser, p.ej., sellable por calor o exhibir propiedades adhesivas sensibles a la presi6n. Si la tira 7 de soporte exhibe propiedades adhesivas sensibles a la presi6n, y esta impresa molecularmente con un tensioactivo, el caracter hidr6filo del material sirve para evitar reducir la eficacia de cualquier membrana 9 unida a la tira de soporte en el caso de que se produzca una migraci6n del adhesivo hacia la membrana.
A modo de ventaja adicional, si la tira de soporte esta impresa con un tensioactivo, puede ser posible evitar el uso de la membrana 9, por el contrario confiar unicamente en el caracter hidr6filo de la propia tira de soporte para absorber la muestra desde el punto de introducci6n de muestras hasta el punto de recogida de muestras. En tal realizaci6n, el reactivo con el que la muestra debe contactar o reaccionar se aplicara bien directamente a la tira de soporte para el
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contacto con la muestra, o bien sera presentado a la superficie de la tira de soporte desde un reservorio unido a la tira de soporte de una manera convencional.
El orificio 11 se puede emplear para proporcionar acceso para otro material tal como un tamp6n a ser aplicado a la capa 13 absorbente. La muestra, una vez afadida al orificio 3, contacta con la capa 15 absorbente. El montaje de la tira de soporte y los componentes unidos asociados puede estar posicionado dentro de una porci6n 17 de fondo de la carcasa. La cubierta 1 de la carcasa incluye un orificio 20 de visi6n para ver el resultado visual de la reacci6n entre la muestra y el reactivo presente en el dispositivo.
Las Figuras 3 y 4 representan una tira de ensayo de flujo lateral acorde con la presente invenci6n. La tira de ensayo incluye una capa 19 absorbente de muestras, una membrana 21 y una capa 23 de recogida de muestras. La tira 25 de soporte incluye una superficie 27 que puede ser sellable por calor o sensible a la presi6n por naturaleza de acuerdo con la presente invenci6n, y que puede ser un MIP. Las areas 29 en la membrana 21 contienen reactivos para la reacci6n con la muestra. Alternativamente, la membrana puede ser omitida y su funci6n servida por una superficie hidr6fila de la tira 25 de soporte si esta impresa con un tensioactivo. En tal realizaci6n, las areas 29 pueden aun contener reactivos para la reacci6n con la muestra de ensayo, y las areas 29 de la tira de soporte tambien se pueden hacer mas hidr6fobas (o menos hidr6filas) que la superficie restante de la tira de soporte. La presencia de tales areas servira para reducir la velocidad de paso de la muestra a traves de la tira de soporte para maximizar el tiempo de contacto con los reactivos en las areas 29.
Otra realizaci6n del dispositivo de la presente invenci6n se representa en la Figura 5. El dispositivo de la Figura 5 incluye las cubiertas 31, 33 para los extremos respectivos del dispositivo, que incluyen la capa 37 de muestras y la capa 35 de recogida, habiendo zonas 41 de ensayo intermedias entre los extremos del dispositivo sobre la tira 39 de soporte que tiene una superficie 43 impresa. Como se discuti6 anteriormente, las zonas 41 de ensayo pueden estar posicionadas en partes de la tira de soporte que han sido hechas menos hidr6filas (o mas hidr6fobas) que la parte restante de la tira de soporte, o que pueden ser por el contrario impresas con un componente deseado.
Se pueden emprender con ventaja diversas modificaciones en tal realizaci6n. Como se discuti6 anteriormente, se pueden proveer areas selectivas de caracter superficial hidr6filo/hidr6fobo sobre la superficie del material de soporte mediante impresi6n molecular para modificar las caracterfsticas de flujo de la muestra fluida, bien dirigiendo la muestra longitudinalmente a lo largo de la tira de soporte hacia el punto de recogida de fluidos, o bien causando que la muestra fluida contacte con areas hidr6filas/hidr6fobas adyacentes para reducir la velocidad de flujo de la muestra fluida a lo largo de la tira de soporte. En tal caso, por ejemplo, el reactivo puede estar situado en la parte hidr6foba, donde la absorci6n de la muestra fluida serfa mas lenta para permitir un tiempo de contacto mas largo entre la muestra fluida y el reactivo. En los terminos de esta discusi6n, el termino hidr6foba no pretende significar que la parte del soporte serfa enteramente hidr6foba, sino que tambien podrfa significar que ese area es mas hidr6foba que la parte hidr6fila adyacente de la tira de soporte (es decir, ambas partes tendrfan diversos grados de hidrofilicidad, de tal modo que la absorci6n de la muestra fluida serfa aun estimulada a viajar desde la entrada de muestras hasta el area de recogida de muestras).
Por consiguiente, en el contexto de las Figuras 3-6, la superficie de la pelfcula de soporte (p.ej., una pelfcula de poliester como en la Figura 1) se podrfa hacer hidr6fila por impresi6n molecular como se discuti6 anteriormente, y ser empleada como una capa sellable por calor para la uni6n a la capa absorbente y la capa de muestra/capa conjugada. Opcionalmente, tambien se podrfa unir una membrana a la tira de soporte hidr6fila sellable por calor. Alternativamente, el uso de la membrana puede ser evitado y los reactivos ser aplicados directamente a la superficie hidr6fila de la tira de soporte, y causar que la muestra y el reactivo se absorban directamente a traves de la superficie de la tira de soporte hacia la capa absorbente. Alternativamente, la capa de soporte puede estar impresa molecularmente con otros tipos de moleculas, como se discuti6 anteriormente.
Como se discuti6 anteriormente, en una realizaci6n donde la tira de soporte comprende una capa adhesiva sensible a la presi6n hidr6fila, la membrana aun se puede usar con ventaja debido al caracter hidr6filo del adhesivo, sin temor a una disminuci6n de la capacidad de la membrana para funcionar debido a la migraci6n del adhesivo. Sin embargo, es posible aun evitar el uso de la membrana, sirviendo la capa adhesiva hidr6fila como medio de transporte para la muestra desde la capa de muestras hasta la capa absorbente. Cualesquiera reactivos que se deseen poner en contacto con la muestra se pueden aplicar directamente a la superficie de la capa adhesiva hidr6fila. El caracter adhesivo de la tira de soporte tambien se puede emplear con ventaja para unir las respectivas capas de muestra/conjugada/absorbente a la tira de soporte. Esto facilita la fabricaci6n del dispositivo. Tal dispositivo estarfa contenido tfpicamente en una carcasa adecuada que incluye, de manera general, una ventana de visi6n para determinar la extensi6n de la reacci6n de la muestra y el reactivo (p.ej., determinar la extensi6n de la reacci6n debida a la formaci6n de color o la intensidad del color formado).
En el contexto de un dispositivo de diagn6stico microflufdico que emplea transporte capilar de la muestra fluida durante el procedimiento de analisis, tales dispositivos incluyen tfpicamente canales microflufdicos moldeados en un sustrato polimerico adecuado (veanse las Figuras 7 y 16). Dispositivos microflufdicos se refiere, de manera general, a un dispositivo que tiene uno o mas canales, pasajes, camaras o conductos de fluido que tienen al menos una dimensi6n en secci6n transversal interna (anchura o profundidad) de entre 0,1 um y 500 mm, dentro de la cual una muestra fluida pasa desde un orificio de entrada hasta una zona de detecci6n.
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El dispositivo de diagn6stico microflufdico esta comprendido, de manera general, de una porci6n base sustancialmente plana que tiene uno o mas canales, pasajes, camaras o conductos microflufdicos en la misma. Diversos materiales pueden comprender la porci6n base, incluyendo materiales polimericos tales como poli(metacrilato de metilo), policarbonato, politetrafluoroetileno, poli(cloruro de vinilo), poli(dimetilsiloxano), polisulfona, y sustratos basados en sflice tales como vidrio, cuarzo, silicona y polisilicona, asf como otros materiales de sustrato empleados convencionalmente.
Tales sustratos se fabrican por medios convencionales, tales como moldeo por inyecci6n, repujado o estampado, etc. Los pasajes o canales microflufdicos pueden ser fabricados en la porci6n base por tecnicas de microfabricaci6n convencionales bien conocidas por los expertos en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, fotolitograffa, grabado qufmico humedo, ablaci6n por laser, tecnicas de abrasi6n por aire, moldeo por inyecci6n, repujado y otras tecnicas. El material de la base se selecciona en base a la compatibilidad con el metodo de fabricaci6n deseado, asf como la compatibilidad con la exposici6n prevista a materiales y condiciones, que incluyen extremos de pH, temperatura, concentraci6n salina, y la aplicaci6n de campos electricos. El material de la base tambien se puede seleccionar para propiedades opcionales, que incluyen transparencia y caracterfsticas espectrales.
Una superficie de cierre o cubierta esta situada sobre la parte superior del sustrato base para encerrar o sellar de otro modo los pasajes o canales microflufdicos. En el contexto de la presente invenci6n, los canales o pasajes estan cubiertos con un sustrato acorde con la presente invenci6n, la superficie del cual esta impresa molecularmente, que cubre los pasajes o canales en el sustrato base. Se puede usar una cubierta impresa con tensioactivo para mejorar el flujo del lfquido a traves de los pasajes y canales microflufdicos.
Tales dispositivos incluyen tfpicamente medios detectores 6pticos posicionados adyacentes a una ventana de detector, por lo cual el detector detecta la presencia o ausencia de una caracterfstica 6ptica desde dentro del pasaje
o canal microflufdico que resulta del flujo de la muestra lfquida a traves del pasaje o canal. El detector 6ptico puede comprender cualquiera de diversos medios detectores, tales como sistemas de detecci6n fluorescente, colorimetrico
o de vfdeo, que incluyen una fuente de luz de excitaci6n (laser o LED), etc. Se pueden emplear diversas marcas 6pticamente detectables para proporcionar una caracterfstica 6pticamente detectable, tales como marcas coloreadas, marcas de coloides, marcas fluorescentes, caracterfsticas espectrales y marcas quimioluminiscentes.
Como se discuti6 anteriormente, una alternativa a tener que asegurar de otro modo que los canales poseen suficiente hidrofilicidad para causar que la muestra fluida viaje a lo largo del tubo capilar, es que la parte superior del canal este cubierta con un material hidr6filo que ha sido impreso molecularmente con un tensioactivo de acuerdo con la presente invenci6n. Esto es, se puede aplicar una pelfcula polimerica sellable por calor que tiene caracterfsticas superficiales hidr6filas sobre la cavidad abierta del canal, tanto para cerrar el canal como para proporcionar el caracter hidr6filo necesario, de tal modo que se causara que la muestra fluida humedezca el canal. Como alternativa, la pelfcula polimerica puede incluir un revestimiento adhesivo sensible a la presi6n que es tambien de caracter hidr6filo para proporcionar la hidrofilicidad necesaria para causar que la muestra fluida humedezca el canal estando impresa molecularmente con un tensioactivo. El uso de tales materiales en la construcci6n del dispositivo de diagn6stico microflufdico tambien sirve para simplificar la fabricaci6n del dispositivo. En el contexto de la presente invenci6n, la superficie frontal entera de la capa de cobertura no necesita ser hidr6fila; en lugar de eso, s6lo se requiere que sea hidr6fila la porci6n de la capa de cobertura que sirve para cerrar los canales o pasajes microflufdicos. Por supuesto, como es el caso con los dispositivos de flujo lateral, ciertas partes de la capa de cobertura que cierran los canales o pasajes microflufdicos pueden ser hechas menos hidr6filas que otras partes para modificar la velocidad de flujo de la muestra fluida.
Un dispositivo microflufdico tfpico que ha sido preparado de acuerdo con la presente invenci6n se representa en las Figuras 7 y 8. El dispositivo de la Figura 7 incluye la porci6n 45 base, el hueco 47 en la parte superior de la base 45, canales 49 microflufdicos abiertos, reservorios 51 de fluido y ventana 53 de visi6n. En el dispositivo de la Figura 7, los canales 49 microflufdicos estan sin cubrir, a fin de representar el interior del dispositivo. En la vista en secci6n transversal del dispositivo de la Figura 16 (en la Figura 8), la porci6n 45 base incluye un canal 49 microflufdico que se muestra estando cerrado por la porci6n 55 de cobertura. La porci6n 55 de cobertura incluye una superficie 57 frontal impresa molecularmente, por lo cual la muestra fluida que entra en el canal 49 microflufdico contactara con la superficie frontal y causara que la muestra sea transportada a lo largo de la longitud del canal. La superficie 57 frontal de la cubierta 55 puede ser hecha hidr6fila de acuerdo con la presente invenci6n, tal como por la presencia de un adhesivo sensible a la presi6n hidr6filo, haciendo a la superficie de la propia cubierta hidr6fila por impresi6n molecular. Por ejemplo, la cubierta 55 puede ser sellada por calor o unida de manera adhesiva a la parte interior de la base 45.
A modo de una realizaci6n alternativa representada en las Figuras 9 y 10, el dispositivo de diagn6stico in vitro microflufdico puede estar comprendido de capas 69, 75 base opuestas, separadas por una capa 71 espaciadora adhesiva. Aunque s6lo se muestra una unica capa base en la Figura 9 para representar los canales 73 de fluido, se muestran ambas bases en la Figura 10. La capa 71 espaciadora puede tener canales 73 de fluido provistos en la misma, dentro de los cuales un fluido a ser ensayado pasa desde un reservorio hasta un punto de recogida. Al menos una parte de las superficies de las capas 69, 75 base y la capa espaciadora que definen los lfmites de los canales de fluido pueden ser impresas molecularmente.
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La capa 71 espaciadora es preferiblemente una capa adhesiva que esta unida a las capas base opuestas, bien como resultado de propiedades adhesivas sensibles a la presi6n de la capa espaciadora o bien como resultado de ser sellada por calor a cada una de las capas base. Si es sensible a la presi6n, la capa espaciadora se puede usar en la forma de una pelfcula de transferencia o como una construcci6n de doble cara. Como se discuti6 anteriormente, si las capas base no son de caracter hidr6filo, la capa espaciadora puede poseer el caracter hidr6filo requerido para ayudar al humedecimiento del canal de fluidos por la muestra fluida. Los canales 73 de fluido en la capa espaciadora pueden ser troquelados en la capa espaciadora o ser provistos por cualesquiera otros medios eficaces para proporcionar una capa espaciadora con los canales de fluidos requeridos. Una ventaja de tal construcci6n es que el dispositivo microflufdico puede ser construido facilmente, sin necesidad de moldear los canales de fluido en las capas base como en la realizaci6n de la Figura 7.
Las microplacas de la presente invenci6n incluyen diversas realizaciones, tales como la microplaca que contiene micropocillos mostrada en las Figuras 11 y 12. Como se muestra en las Figuras, la microplaca incluye una porci6n 61 base dentro de la cual estan formados una multitud de micropocillos 63. Los micropocillos 63 pueden ser de cualquier configuraci6n adecuada, tal como hexagonal o cilfndrica, como se representa. La Figura 11 representa la presencia de una placa o lamina 65 de cobertura en la parte superior de la porci6n 61 base para sellar los micropocillos. La placa o lamina de cobertura puede comprender una pelfcula sellable por calor impresa molecularmente, o puede tener propiedades sensibles a la presi6n. Como se representa en la Figura 11, un material adecuado, tal como un sustrato liofilizado, etc. puede estar unido, segun se desee, a la superficie interna de la placa
o lamina de cobertura en el caso de que la superficie interna de la placa o lamina exhiba propiedades adhesivas sensibles a la presi6n, o mediante el uso de otros medios adhesivos. En el contexto de la presente invenci6n, la placa o lamina de cobertura, al menos en la superficie interna de la misma que cubre los micropocillos, esta impresa molecularmente. Tales propiedades pueden ser proporcionadas por el uso de un adhesivo sensible a la presi6n, o por el uso de una pelfcula sellable por calor de la manera mostrada anteriormente.
Una realizaci6n alternativa de la microplaca se muestra en las Figuras 13 y 14, que comprende una microplaca de pocillos abiertos que tiene una porci6n 77 base que contiene una pluralidad de microorificios 79 cortados o moldeados en la misma y que pasan completamente a traves de la porci6n 77 base. La porci6n 77 base estarfa provista de placas o capas de cobertura frontales a fin de sellar los respectivos microorificios 79 de tal modo que las muestras lfquidas respectivas puedan ser colocadas en la misma. Cualquiera o ambas de la porci6n base o las porciones de cobertura (no mostrado) adyacentes a los orificios pueden ser impresas molecularmente. Las placas o capas de cobertura pueden ser unidas a la placa base por medios adhesivos adecuados, tales como adhesivos sensibles a la presi6n o propiedades adhesivas sellables por calor de las placas o capas de cobertura.
La presente invenci6n puede emplear una multitud de pelfculas polimericas que pueden ser impresas molecularmente para proporcionar propiedades deseadas. Los polfmeros que pueden ser modificados de esta manera son bien conocidos en la tecnica. Son ejemplares de tales polfmeros los siguientes polfmeros: poliolefinas, que incluyen, pero no se limitan a, polietileno, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), poli(acetato de vinilo), poli(cloruro de vinilideno), poli(acido acrflico), poli(acido metacrflico), poli(metacrilato de metilo), poli(acrilato de etilo), poliacrilamida, poliacrilo- nitrilo, polipropileno, poli(1-buteno), poli(2-buteno), poli(1-penteno), poli(2-penteno), poli(3-metil-1-penteno), poli(4metil-1-penteno), 1,2-poli-1,3-butadieno, 1,4-poli-1,3-butadieno, poliisopreno, policloropreno, copolfmero de etilenoacetato de vinilo, policarbonato, copolfmero de etileno-acrilato de isobutilo, asf como copolfmeros aleatorios o de bloques de dos o mas poliolefinas o una poliolefina y una no olefina. De manera similar, tambien se pueden emplear mezclas de dos o mas polfmeros.
El polfmero tambien puede comprender un poliester tal como poli(tereftalato de etileno), poli(isoftalato-tereftalato de etileno), copolfmeros de poli(tereftalato de 1,4-ciclohexanodimetileno), poli(isoftalato de 1,4-ciclohexanodimetileno), y copolfmeros de isoftalato-tereftalato; poli(tereftalato e isoftalato de 1,4-fenileno) y copolfmeros; poli(dicarboxilato de (1,4-fenilen-4,4'-difenilo)); poliesteres derivados de acidos dibasicos alifaticos, tales como acidos maleico, adfpico y sebacico, y compuestos polihidroxilados tales como polietilenglicol, neopentilglicol, butilenglicol, glicerol, pentaeritritol y celulosa. Preferiblemente, los polfmeros formadores de pelfcula usados en la presente invenci6n exhiben una Tg o Tc suficiente para permitir que el polfmero sea formador de pelfcula, asf como para permitir que la pelfcula de polfmero resultante sea sellable por calor a una temperatura suficientemente baja (p. ej. en el intervalo de entre 70 y 100°C).
Se pueden usar diversos tensioactivos para imprimir molecularmente el polfmero. Los tensioactivos que son adecuados para el uso en la presente invenci6n incluyen cualquier tensioactivo que comunique de manera eficaz propiedades superficiales hidr6filas a la pelfcula de polfmero hidr6foba. Aunque la identidad de tales tensioactivos no es crftica para la practica de la presente invenci6n, se prefieren los tensioactivos ani6nicos. Sin embargo, los ejemplos de tales tensioactivos (sin limitaci6n) son sales de amonio o sales de sodio de alquilfenoxi(polietilenoxi)etanol, perfluoroalquilsulfonatos de amonio, etc. Los tensioactivos ejemplares incluyen preferiblemente una
o mas funcionalidades hidroxilo, acido carboxflico, acido sulf6nico y amina. Esta presente una discusi6n detallada de tensioactivos en Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technologies, 2� Edici6n, Vol. 19, paginas 512-564, que se incorpora en la presente memoria por referencia.
El tensioactivo puede ser mezclado en una cantidad de, por ejemplo, hasta aproximadamente 15% en peso, basado en el peso total del polfmero y el tensioactivo, tal como en una cantidad de entre 0,05 y 15% en peso.
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Preferiblemente, el tensioactivo se mezcla con el polfmero en una cantidad en el intervalo de entre aproximadamente 3 y 6% en peso.
Es por tanto evidente que se puede usar con ventaja un adhesivo impreso molecularmente en los dispositivos descritos anteriormente, proporcionando una superficie que incluye, por ejemplo, un tensioactivo impreso molecularmente para proporcionar propiedades superficiales hidr6filas mejoradas, una superficie adhesiva impresa molecularmente que esta impresa para recoger un(os) interferente(s) especffico(s) de un lfquido a ser analizado, o una superficie adhesiva impresa molecularmente para recoger un(os) componente(s) especffico(s) para los cuales se va a hacer un analisis. Ventajosamente, las propiedades impresas molecularmente de la capa adhesiva pueden ser adaptadas facilmente para cumplir el resultado final deseado consistente con los objetos de la presente invenci6n. Las Figuras 15-17 demuestran las ventajas de la presente invenci6n a este respecto.
La Figura 15 es una representaci6n grafica del efecto sobre determinada concentraci6n de glucosa usando un MIP impreso para acido urico y acido asc6rbico. La Figura 16 es una representaci6n grafica del efecto sobre determinada concentraci6n de glucosa usando 5% en peso de MIPs impresos para acido urico y acido asc6rbico en la masa de un adhesivo sensible a la presi6n. La Figura 17 es una representaci6n grafica del efecto sobre determinada concentraci6n de glucosa usando 5% en peso de MIPs impresos para acido urico y acido asc6rbico en la superficie de un adhesivo sensible a la presi6n.
Con respecto a la realizaci6n de la "masa", la concentraci6n de MIP es 5% en la masa del adhesivo. Se mezcla 5% en peso del MIP para s6lidos adhesivos en la disoluci6n de adhesivo antes de revestir el adhesivo sobre una pelfcula de soporte.
Con respecto a la realizaci6n de la "superficie", la concentraci6n de MIP es 5% en la superficie del adhesivo, suspendiendo 5% en peso de MIP para s6lidos adhesivos en un disolvente y revistiendo la suspensi6n sobre una pelfcula desprendible. La disoluci6n adhesiva es revestida sobre una pelfcula de soporte, y despues del secado y curado, la pelfcula adhesiva es laminada sobre la superficie del forro revestido con MIP. Alternativamente, el adhesivo se puede revestir directamente sobre la parte superior del forro revestido con MIP. Alternativamente, la suspensi6n de MIP se puede revestir o pulverizar directamente sobre la parte superior del revestimiento adhesivo.
Los resultados de las Figuras 15-17 confirman que la retirada de acido urico y/o acido asc6rbico de un fluido a ser analizado en cuanto a la glucosa permite que la sensibilidad del analisis de la glucosa sea mejorada significativamente.
Por ejemplo, la Figura 15 demuestra que la eficacia de la determinaci6n de la glucosa aumenta de 92,7% para el ensayo de control (sin MIP) a 98% para un MIP impreso con acido urico, y a 99,3% para un MIP impreso con acido asc6rbico.
La Figura 16 demuestra que la eficacia de la determinaci6n de la glucosa aumenta de 96% para el ensayo de control (sin MIP) a 97,1% para un MIP impreso con acido urico, y a 98,7% para un MIP impreso con acido asc6rbico.
La Figura 17 demuestra que la eficacia de la determinaci6n de la glucosa aumenta de 96,5% para el ensayo de control (sin MIP) a 98,1% para un MIP impreso con acido urico, y a 99,1% para un MIP impreso con acido asc6rbico.
Es por consiguiente una ventaja de la practica de la presente invenci6n proporcionar un metodo para el analisis de una muestra lfquida por el cual se puede conseguir una eficacia de analisis aumentada significativamente mediante el uso de un polfmero impreso molecularmente que ha sido impreso con un interferente presente en la muestra lfquida para llevar a cabo el analisis.
A modo de explicaci6n adicional de las Figuras 15-17, se prepar6 una disoluci6n patr6n acuosa que contenfa 150 mg/dl de glucosa, 10 mg/dl de acido urico y 10 mg/dl de acido asc6rbico. La glucosa se ensaya segun el metodo descrito en el Ejemplo 4 usando el kit de glucosa Glucose G2 Autokit de WAKO Chemicals USA, Inc. Haciendo referencia a la Figura 15, se mezclaron 5 gramos de polfmero no impreso (control) durante 1 minuto con 100 gramos de la disoluci6n patr6n. Se tom6 una alfcuota de 0,2 ml de muestra de la mezcla y se analiz6 para la glucosa. Se encontr6 un valor de 139 mg/dl de glucosa, lo que indica que la presencia de acido urico y acido asc6rbico reduce la precisi6n de la medida de la glucosa. Cuando este experimento se repiti6 usando un MIP impreso con acido urico, se midi6 un valor de glucosa de 147 mg/dl. De manera similar, el experimento se repiti6 usando un MIP impreso con acido asc6rbico y se midi6 un valor de glucosa de 149 mg/dl. Estos resultados indican que los MIPs para acido urico y acido asc6rbico reducen el efecto de los compuestos interferentes y aumentan la exactitud de la medida de la glucosa.
Haciendo referencia a la Figura 16, se cre6 un canal flufdico tubular usando un revestimiento adhesivo que contenfa 5% de polfmero no impreso en la masa del adhesivo (control). Se hizo pasar un ml de la disoluci6n patr6n anterior a traves del adhesivo, y despues se recogi6 para el analisis de la glucosa segun el Glucose G2 Autokit. Se midi6 un valor de glucosa de 144,1 mg/dl en el fluido eluido. Este experimento se repiti6 usando un adhesivo que contenfa 5% de MIP impreso con acido urico en la masa del adhesivo. Se midi6 un valor de glucosa de 145,7 mg/dl. De manera similar, el experimento se repiti6 usando un adhesivo que contenfa 5% de MIP impreso con acido asc6rbico en la masa del adhesivo. Se midi6 un valor de glucosa de 148,0 mg/dl. Estos resultados muestran que los adhesivos que contienen MIPs para acido urico y acido asc6rbico usados como canales flufdicos aumentan la exactitud de la medida de la glucosa.
Haciendo referencia a la Figura 17, similar a los experimentos para la Figura 16, se crearon canales flufdicos tubulares usando adhesivos que contenfan 5% de polfmeros impresos en la superficie del adhesivo. La concen5 traci6n de glucosa en un control con un polfmero no impreso en la superficie del adhesivo fue 144,7 mg/dl. Usar el MIP impreso con acido urico en la superficie del adhesivo dio una concentraci6n de glucosa de 147,1 mg/dl. El MIP impreso con acido asc6rbico en la superficie del adhesivo dio una concentraci6n de glucosa de 148,6 mg/dl. Estos resultados ilustran el aumento en la exactitud de la medida de la glucosa usando adhesivos que contienen MIPs impresos para retirar componentes interferentes. El polfmero impreso molecularmente puede estar en la masa del
10 adhesivo o en la superficie. Se espera que la combinaci6n de dos o mas MIPs en un adhesivo para retirar compuestos interferentes multiples proporcionarfa ventajas en muchos ensayos.
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Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un adhesivo que comprende al menos un polfmero reticulado impreso molecularmente.
  2. 2.
    Un adhesivo de la reivindicaci6n 1, que comprende multiples polfmeros impresos molecularmente.
  3. 3.
    Un adhesivo de la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en el que un polfmero impreso molecularmente contiene sitios de impresi6n para uno o mas compuestos diana.
  4. 4.
    Un adhesivo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho adhesivo es un adhesivo sensible a la presi6n.
  5. 5.
    Un adhesivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho adhesivo es un adhesivo de sellado por calor.
  6. 6.
    Un adhesivo de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polfmero esta impreso con un tensioactivo.
  7. 7.
    Un adhesivo de la reivindicaci6n 1, en el que dicho polfmero esta impreso con un componente contenido por la sangre.
  8. 8.
    Un adhesivo de la reivindicaci6n 7, en el que dicho polfmero esta impreso con al menos uno de acido urico, acetaminofeno o acido asc6rbico.
  9. 9.
    Un adhesivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polfmero esta impreso con acido urico y/o acido asc6rbico.
  10. 10.
    Un adhesivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polfmero esta impreso con glucosa.
  11. 11.
    Un adhesivo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polfmero impreso molecularmente esta presente en dicho adhesivo en la forma de un polvo como mezcla con el mismo.
  12. 12.
    Un adhesivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho polfmero impreso molecularmente esta presente en una superficie de dicho adhesivo.
  13. 13.
    Un metodo para preparar un adhesivo como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende las etapas de proporcionar los mon6meros polimerizables requeridos para formar el polfmero deseado que es para ser impreso molecularmente, combinar dichos mon6meros polimerizables con un componente adaptado para imprimir dicho polfmero y que es compatible con dichos mon6meros, copolimerizar y reticular dichos mon6meros polimerizables para formar un polfmero impreso en mezcla con dicho componente adaptado para imprimir dicho polfmero, y combinar dicho polfmero reticulado impreso molecularmente con un adhesivo.
  14. 14.
    Un dispositivo de diagn6stico in vitro de flujo lateral que comprende una carcasa, medios en la carcasa para introducir una muestra a ser ensayada en dicho dispositivo, medios en dicha carcasa para la recogida de fluidos, y una tira de soporte que tiene separados por un espacio un primer y segundo extremos, en donde dicha tira de soporte esta comprendida de un adhesivo como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
  15. 15.
    Un dispositivo de flujo lateral de la reivindicaci6n 14, que comprende ademas una membrana microporosa o porosa unida a dicha tira de soporte entre dichos primer y segundo extremos.
  16. 16.
    Un dispositivo de diagn6stico in vitro microflufdico comprendido de una base que tiene al menos un canal de fluidos dentro del cual una muestra fluida a ser ensayada pasa desde un orificio de entrada hasta una zona de detecci6n, en el que dicho al menos un canal de fluidos esta encerrado por al menos una superficie de cierre, en donde al menos una superficie del canal de fluidos esta comprendida de un adhesivo que comprende un polfmero reticulado impreso molecularmente.
  17. 17.
    Un dispositivo microflufdico de la reivindicaci6n 16, en el que dicha al menos una superficie de cierre esta sellada por calor a dicha base para sellar dicho al menos un canal de fluidos.
  18. 18.
    Un dispositivo microflufdico de la reivindicaci6n 16, en el que la superficie de dicha al menos una superficie de cierre que se enfrenta a dicho al menos un canal de fluidos exhibe propiedades adhesivas sensibles a la presi6n.
  19. 19.
    Un dispositivo microflufdico de la reivindicaci6n 17, en el que la superficie de dicha al menos una superficie de cierre que se enfrenta a dicho al menos un canal de fluidos esta impresa molecularmente con un tensioactivo.
  20. 20.
    Un dispositivo microflufdico de la reivindicaci6n 17, en el que dichos canales de fluidos estan troquelados en dicha capa adhesiva.
  21. 21.
    Un dispositivo de diagn6stico in vitro comprendido de una microplaca que tiene una placa base que tiene formados en la misma una multitud de microorificios o cavidades y al menos una cubierta colocada en relaci6n de sellado para dichos microorificios o cavidades, en donde una superficie de al menos dicha cubierta que sella dichos
    microorificios o cavidades esta comprendida de un adhesivo que comprende un polfmero reticulado impreso molecularmente.
  22. 22.
    Un dispositivo de diagn6stico de la reivindicaci6n 21, en el que dicha al menos una parte de cubierta esta sellada por calor a dicha base para sellar dichos microorificios o cavidades.
    5 23. Un dispositivo de diagn6stico de la reivindicaci6n 21, en el que la superficie de dicha al menos una cubierta que se enfrenta a dichos microorificios o cavidades exhibe propiedades adhesivas sensibles a la presi6n.
  23. 24.
    Un dispositivo de diagn6stico de la reivindicaci6n 21, en el que la superficie de dicha al menos una cubierta que se enfrenta a dichos microorificios o cavidades esta impresa molecularmente con un tensioactivo.
  24. 25.
    Un metodo para realizar un analisis de una muestra lfquida que contiene un componente a ser analizado en
    10 cuanto a identidad y/o cantidad, que comprende poner en contacto dicha muestra lfquida con un adhesivo que comprende un polfmero reticulado que ha sido impreso con dicho componente, y realizar dicho analisis en base a la cantidad de dicho componente absorbida por dicho polfmero que ha sido previamente impreso con dicho componente.
  25. 26. Un metodo de la reivindicaci6n 25, en el que dicho polfmero es como se define en una cualquiera de las 15 reivindicaciones 2 a 10.
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