ES2371506T3 - Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo de señales fluorescentes intermedias. - Google Patents

Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo de señales fluorescentes intermedias. Download PDF

Info

Publication number
ES2371506T3
ES2371506T3 ES07874282T ES07874282T ES2371506T3 ES 2371506 T3 ES2371506 T3 ES 2371506T3 ES 07874282 T ES07874282 T ES 07874282T ES 07874282 T ES07874282 T ES 07874282T ES 2371506 T3 ES2371506 T3 ES 2371506T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
signal
antibody
target
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07874282T
Other languages
English (en)
Inventor
Robert John Filkins
Michael Christopher Montalto
Anup Sood
Michael J. Gerdes
Maximilian Lewis Seel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Electric Co
Original Assignee
General Electric Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by General Electric Co filed Critical General Electric Co
Application granted granted Critical
Publication of ES2371506T3 publication Critical patent/ES2371506T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Un procedimiento de detectar múltiples dianas en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con una primera sonda; (b) unir físicamente la primera sonda con una primera diana; (c) observar una primera señal de la primera sonda; (d) aplicar un agente químico que comprende una base, un nucleófilo o un agente oxidante para modificar la primera señal; (e) poner en contacto la muestra con una segunda sonda; (f) unir físicamente la segunda sonda con una segunda diana; y (g) observar una segunda señal de la segunda sonda;

Description

Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo de señales fluorescentes intermedias
Antecedentes
En el presente documento se divulgan procedimientos para analizar secuencialmente una muestra biológidca para discernir características de la muestra, por ejemplo, la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en una muestra biológica.
Se han usado varios procedimientos en biología y en medicina para observar dianas diferentes en una muestra biológica. Por ejemplo, se puede realizar análisis de proteínas en secciones histológicas y otras preparaciones citológicas usando las técnicas de histoquímica, inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia.
Muchas de las técnicas actuales pueden detectar únicamente unas pocas dianas a la vez (tal como, IHC cuando el número de dianas detectables está limitado por el sistema de detección basado en fluorescencia) en una única muestra. Análisis adicionales de dianas pueden requerir el uso de muestras biológicas adicionales de la fuente, lo que limita la capacidad para determinar las características relativas de las dianas, tales como la presencia, ausencia, concentración y/o distribución espacial de múltiples dianas biológicas en la muestra biológica. Además, en ciertos casos, se dispone de una cantidad limitada de la muestra para el análisis o la muestra individual puede requerir más análisis. Por tanto se necesitan procedimientos, agentes y dispositivos capaces de analizar repetidamente una muestra individual.
Breve descripción
En algunas realizaciones se proporcionan procedimientos de detección de múltiples dianas en una muestra biológica. Los procedimientos incluyen las etapas de poner en contacto la muestra con una primera sonda, unir físicamente la primera sonda con una primera diana, observar una primera señal de la primera sonda, aplicar un agente químico que comprende una base, un nucleófilo o un agente oxidante para modificar la primera señal, poner en contacto la muestra con una segunda sonda, unir físicamente la segunda sonda con una segunda diana y observar una segunda señal de la segunda sonda. El procedimiento de poner en contacto, unir, observar y modificar se puede repetir de forma iterativa.
En algunas realizaciones se proporcionan kits para la detección de múltiples dianas en una muestra biológica. El kit incluye una primera sonda capaz de unirse a una primera diana y proporcionar una primera señal y una segunda diana capaz de unirse a una segunda diana y proporcionar una segunda señal. La primera sonda responde a un agente químico para dar como resultado la modificación de la primera señal. Los kit proporcionados en el presente documento pueden también incluir sondas adicionales (p. ej., segunda, tercera o enésima) capaces de unirse a una diana y proporcionar múltiples dianas.
En algunas realizaciones se proporcionan dispositivos que incluyen un sistema de manipulación de muestras, un sistema de dispensación de reactivos y un sistema de detección de señal. El dispositivo se puede usar para detectar múltiples dianas en una muestra biológica usando el procedimiento que incluye las etapas de: poner en contacto la muestra con una primera sonda, unir físicamente la primera sonda con una primera diana, observar una primera señal de la primera sonda, aplicar un agente químico para modificar la primera señal, poner en contacto la muestra con una segunda sonda, unir físicamente la segunda sonda con una segunda diana y observar una segunda señal de la segunda sonda.
Breve descripción de las figuras
La FIG.1 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 como función de la longitud de onda, tras 10 minutos y 15 minutos.
La FIG.2 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 como función de la longitud de onda.
La FIG.3 es el espectro de absorbancia de la Muestra 4 como función de la longitud de onda, tras 30 minutos y 140 minutos.
La FIG.4 es el espectro de absorbancia de la Muestra 5 como función de la longitud de onda, tras 20 minutos, 60 minutos y 210 minutos.
La FIG.5 es el espectro de absorbancia de la Muestra 6 como función de la longitud de onda, tras 12 minutos y 16 minutos.
La FIG. 6 es el espectro de absorbancia de la Muestra 8 como función de la longitud de onda, tras 22 minutos, 70 minutos y 210 minutos.
La FIG.7 es el espectro de absorbancia de las Muestras 9a, 10a y 11a como función de la longitud de onda. La FIG.8 es el espectro de absorbancia de las Muestras 9b y 10b como función de la longitud de onda. La FIG.9 es el espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b como función de la longitud de onda. La FIG. 10 es el espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 como función de la longitud de onda. La FIG. 11 es el espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 como función de la longitud de onda. La FIG. 12 representa las micrografías (con un aumento 10x) de la muestra 18a (antes de la modificación de la
señal) y la Muestra 18b (tras la modificación de la señal).
La FIG. 13 representa las micrografías (con un aumento 10x) de la muestra 19a (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 19b (tras la modificación de la señal). La FIG. 14 representa las micrografías de la muestra 20a (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 20b
(tras la modificación de la señal).
La FIG. 15 representa las micrografías de las muestras 21a y 21b (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 21c (tras la modificación de la señal). La FIG. 16 representa las micrografías de las muestras 22a y b (antes de la modificación de la señal) y la Muestra
22c (tras la modificación de la señal). La FIG. 17 representa las micrografías de las Muestras 23a-e. La FIG. 18 representa las micrografías de la muestra 24a (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 24b
(tras la modificación de la señal). La FIG. 19 representa las micrografías de las muestras 25a (canales Cy3 y Cy5), la Muestra 25b (canales Cy3 y
Cy5) y las Muestras 25c-25j. La FIG. 20 representa las micrografías de las Muestras 26a-h. La FIG. 21 representa las micrografías de las Muestras 27a-c. La FIG. 22 es un gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las imágenes del Ejemplo 20.
La FIG. 23 muestra la comparación entre las micrografías de las Muestras 28a-c y 29a-c. La FIG. 24 representa las micrografías de las Muestras 30a-d. La FIG. 25 representa las micrografías de las Muestras 30c-f. La FIG. 26 es un gráfico de intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo en las Muestras 30c y 30d. La FIG. 27 representa las micrografías de las Muestras 31a, 31b y 31c. La FIG. 28 representa las micrografías de las Muestras 32a, 32b y 32c.
Descripción detallada
Para describir y subrayar con más claridad y concisamente la materia objeto de la invención reivindicada se proporcionan las definiciones siguientes para términos específicos que se usan en la descripción siguiente y en las reivindicaciones adjuntas.
Las formas del singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen las referencias al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La expresión aproximadamente, como se usa en el presente documento a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se puede aplicar para modificar cualquier representación cuantitativa que podría variarse permisivamente sin que de cómo resultado un cambio en la función básica a la que se refiere. En consecuencia con esto, un valor modificado por un término tal como “aproximadamente” no se tiene que limitar al valor preciso especificado. A menos que se indique otra cosa, debe entenderse que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como el peso molecular, las condiciones de reacción, usadas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, están modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. De acuerdo con esto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva siguiente y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar en función de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención. Como mínimo, cada parámetro numérico debería interpretarse, al menos, a la luz del número de dígitos significativos
indicados y aplicando técnicas de redondeo habituales.
Como se usa en el presente documento, la expresión “muestra biológica” se refiere a una muestra obtenida de un sujeto biológico, incluida una muestra de tejido o fluido biológico obtenido in vivo o in vitro. Dichas muestras pueden ser, entre otros, fluido corporal (p. ej., sangre, plasma sanguíneo, suero u orina), órganos, tejidos, fracciones y células aisladas de mamíferos, incluidos seres humanos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de la muestra biológica, incluidos tejidos (p. ej., porciones en secciones de un órgano o tejido). Las muestras biológicas también pueden incluir extractos de una muestra biológica, por ejemplo, un antígeno de un fluido biológico (p. ej., sangre u orina). Las muestras biológicas pueden estar dispersas en solución o pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido, tal como en transferencias, ensayos, matrices, portaobjetos de vidrio, placas de microtitulación o de ELISA.
Una muestra biológica puede ser de origen procariota o eucariota (p. ej., insectos, protozoos, aves, peces, reptiles). En algunas realizaciones, la muestra biológica es de mamífero (p. ej., rata, ratón, vaca, perro, mono, cobaya o conejo). En ciertas realizaciones, la muestra biológica es de origen de primate (p. ej., chimpancé o ser humano).
Como se usa en el presente documento, el término “diana” se refiere al componente de una muestra biológica que se puede detectar cuando está presente en la muestra biológica. La diana puede ser cualquier sustancia para la cual existe un aglutinante específico natural (p. ej., un anticuerpo) o para la cual se puede preparar un aglutinante específico (p. ej., un aglutinante de molécula pequeña o un aptámero). En general, la porción aglutinante de la sonda se puede unir a una diana a través uno o más restos químicos pequeños de la diana o un componente estructural tridimensional de la diana (p. ej., estructuras 3D que resultan del plegamiento de los péptidos). La diana pueden incluir uno o más péptidos, proteínas (p. ej., anticuerpos, aficuerpos o aptámeros), ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos, ADN, ARN o aptámeros), polisacáridos (p. ej., lectinas, azúcares), lípidos, enzimas, sustratos enzimáticos, ligandos, receptores, antígenos o haptenos.
Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina que se une específicamente, y se define como complementaria, a una organización polar y espacial concreta de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse mediante técnicas bien conocidas en la material, tales como la inmunización de un huésped y la recolección de sueros (policlonal) o preparando líneas celulares híbridas continuas o recogiendo la proteína secretada (monoclonal), o clonando y expresando secuencias nucleotídicas o versiones mutageneizadas de las mismas, codificando al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o fragmento de la misma, en las que las inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgGI, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM. Fragmentos de anticuerpo funcionales pueden incluir porciones de un anticuerpo capaz de conservar la unión a una afinidad similar a un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, Fab, Fv y F(ab’)2, o Fab’). Además, se pueden usar agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos cuando sea adecuado, siempre que se mantenga sustancialmente la afinidad de unión por una molécula concreta.
Como se usa en el presente documento, el término “sonda” se refiere a un agente que incluye un aglutinante y un generador de señal. En algunas realizaciones, el aglutinante y el generador de señal de la sonda están reunidos en una única entidad (p. ej., una molécula radioactiva o fluorescente capaz de unirse a una diana). En realizaciones alternativas, el aglutinante y el generador de señal están reunidos en entidades pequeñas (p. ej., un anticuerpo primario capaz de unirse a una diana y un anticuerpo secundario capaz de unirse al anticuerpo primario).
Cuando el aglutinante y el generador de señal son entidades distintas, se pueden aplicar a una muestra biológica en una única etapa o en múltiples etapas. El aglutinante y el marcador pueden estar unidos directamente (p. ej., a través de una molécula fluorescente incorporada en el aglutinante) o indirectamente (p. ej., a través de un ligador, que puede incluir un sitio de escisión) y aplicarse a la muestra biológica en una única etapa. En algunas realizaciones en las que el aglutinante y el generador de señal son entidades distintas se pueden pre-fijadas antes de la aplicación a la muestra biológica y aplicarse a la muestra biológica en una única etapa. En otras realizaciones en las que el aglutinante y el generador de señal son entidades distintas, se pueden aplicar a una muestra biológica de forma independiente y asociar tras la aplicación.
Como se usa en el presente documento, el término “aglutinante” se refiere a una molécula biológica que se puede unir de forma no covalente a una o más dianas en la muestra biológica. Un aglutinante se puede unir específicamente a una diana. Aglutinantes adecuados pueden incluir uno o más de péptidos naturales o modificados, proteínas (p. ej., anticuerpos, aficuerpos o aptámeros), ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos, ADN, ARN o aptámeros), polisacáridos (p. ej., lectinas, azúcares), lípidos, enzimas, sustratos o inhibidores enzimáticos, ligandos, receptores, antígenos, haptenos y similares. Se puede seleccionar un aglutinante adecuado en función de la muestra que se va a analizar y las dianas disponibles para detección. Por ejemplo, una diana en la muestra puede incluir un ligando y el aglutinante puede incluir un receptor o una diana puede incluir un receptor y la sonda puede incluir un ligando. De forma similar, una diana puede incluir un antígeno y el aglutinante puede incluir un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo o viceversa. En algunas realizaciones, una diana puede incluir un ácido nucleico y el aglutinante puede incluir un ácido nucleico complementario. En algunas realizaciones, tanto la diana como el aglutinante pueden incluir proteínas capaces de unirse entre sí.
Como se usa en el presente documento, la expresión “generador de señal” se refiere a una molécula capaz de proporcionar una señal detectable usando una o más técnicas de detección (p. ej., espectrometría, calorimetría, espectroscopia o inspección visual). Ejemplos adecuados de una señal detectable pueden incluir una señal óptica, una señal eléctrica o una señal radioactiva. Ejemplos de generadores de señal útiles en los procedimientos de la invención incluyen, por ejemplo, un cromóforo, un fluoróforo, una marca activa de Raman, un marcador radioactivo, una enzima, un sustrato enzimático o combinaciones de los mismos. Como se ha indicado anteriormente, con respecto a la sonda, el generador de señal y el aglutinante pueden estar presentes en una única entidad (p. ej., una proteína de unión a la diana con un marcador fluorescente o radio arcado). Y, en otras realizaciones, el aglutinante y el generador de señal son entidades pequeñas (p. ej., una proteína receptora y un anticuerpo marcado contra la proteína receptora concreta) que se asocian entre sí antes o tras la introducción en la muestra. Como se usa en el presente documento, el término “fluoróforo” se refiere a un compuesto químico que, cuando se excita por la exposición a una longitud de onda concreta de luz, emite luz (a una longitud de onda diferente). Los fluoróforos pueden describirse en términos de su perfil de emisión o “color”. Los fluoróforos verdes (por ejemplo Cy3, FITC, y verde Oregón) pueden caracterizarse por su emisión a longitudes de onda generalmente en el intervalo de 515-540 nanómetros. Los fluoróforos rojos (por ejemplo Rojo Texas, Cy5 y tetrametilrodamina) pueden caracterizarse por su emisión a longitudes de onda generalmente en el intervalo de 590-690 nanómetros. Ejemplos de fluoróforos incluyen, entre otros, ácido 4-acetamido-4’-isotiocianatoestilben-2,2’-disulfónico, derivados de acridina e isotiocianato de acridina, ácido 5-(2’-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS), 3,5-disulfonato de 4amino-N-[3-vinilsulfonil]fenol]naftalimida (Amarillo Lucifer VS), N-(4.anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida, Amarillo Brillante, coumarina, derivados de coumarina, 7-amino-4-metilcoumarina (AMC, Coumarina 120), 7-aminotrifluorometilcouluarina (Coumaran 151), cianosina; 4’-6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5,5’’-dibromopirogalolsulfoneftaleína (rojo bromopirogalol), 7-dietilamino3-(4’-isotiocianatofenol)—metilcoumarina, ácido 4,4’diisotiocianatodihidro-estilben-2,2’-disulfónico, ácido 4,4’-diisotiocianatoestilben-2,2’-disulfónico, cloruro de 5[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo), eosina, derivados de eosina tales como isotiocianato de eosina, eritrosina, derivados de eritrosina tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados tales como 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2’,7’dimetoxi-4’,5’-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), QFITC (XRITC); derivado de fluorescamina (fluorescente tras la reacción con aminas); IR144; IR1446; isotiocianato de verde malaquita; 4-metilumbeliferona; orto-cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; rojo fenol, ficoeritrina B; derivado de o-ftaldialdehído (fluorescente tras la reacción con aminas); pireno y derivados, tales como pireno, butirato de pireno y butirato de succinidimidil-1-pireno; rojo reactivo 4 (Cibacron, RTM. Rojo brillante 3B-A), rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), rodamina lisamina B, cloruro de sulfonilo, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, sulforodamina B, sulforodamina 101 y derivado de cloruro de sulfonilo de sulforodamina 101 (rojo Texas); N,N,N’N’-tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA); tetrametilrodamina, isocianato de tetrametilrodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico y derivados de quelato de latanida, puntos cuánticos, cianinas, pigmentos de pirelio y escuaraínas.
Como se usa en el presente documento, la expresión “unión específica” se refiere al reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes por la otra en comparación con un reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Las moléculas pueden tener áreas sobre sus superficies o en cavidades que dan lugar a un reconocimiento específico entre las dos moléculas que se producen a partir de una o más interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o interacciones hidrófobas. Ejemplos de unión específica incluyen, entre otros, interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones enzima-sustrato, interacciones polinucleotídicas y similares. En algunas realizaciones, una molécula aglutinante puede tener una constante de asociación de equilibrio intrínseco (KA) por la diana no inferior a aproximadamente 105 M-1 en condiciones ambiente (es decir un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, y una temperatura que varía de aproximadamente 0º C a aproximadamente 37 ºC.)
Como se usa en el presente documento, “in situ” se refiere, en general, a un acontecimiento que se produce en la ubicación original, por ejemplo, en órgano o tejido intacto o en un segmento representativo de un órgano o tejido. En algunas realizaciones, el análisis in situ de las dianas describe análisis de sondas unidas a las dianas localizadas en una muestra de células enteras o de tejido, esté la membrana celular. El análisis in situ proporciona información contextual que puede perderse cuando la diana se elimina de su sitio de origen. De acuerdo con esto, el análisis in situ de las dianas describe el análisis de la sonda unida a la diana localizada dentro de una muestra de célula entera o de tejido, esté la membrana celular completamente intacta o parcialmente intacta cuando la sonda unida a la diana permanece dentro de la célula. Además, los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar para analizar las dianas in situ en muestras de células o tejidos que están fijadas o no fijadas.
La invención incluye realizaciones que se refieren, en general, a procedimientos aplicables en aplicaciones
analíticas, diagnósticas o pronosticas, tales como detección de analitos, histoquímica, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser particularmente aplicables en histoquímica, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.
Los procedimientos divulgados se refieren, en general, a la detección de múltiples dianas en una única muestra biológica. En algunas realizaciones se divulgan procedimientos de detección de múltiples dianas en una única muestra biológica usando el mismo canal de detección. Las dianas pueden estar presentes sobre la superficie de células en suspensión, sobre la superficie de frotis de citología, sobre la superficie de secciones histológicas, sobre la superficie de micromatrices de ADN, sobre la superficie de micromatrices de proteínas o sobre la superficie de soportes sólidos (tales como geles, transferencias, portaobjetos de vidrio, perlas o placas de ELISA).
Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden permitir la detección de una pluralidad de dianas en la misma muestra biológica con poco o ningún efecto sobre la integridad de la muestra biológica. La detección de las dianas en la misma muestra biológica puede proporcionar además información espacial sobre las dianas en la muestra biológica. Los procedimientos divulgados en el presente documento también pueden ser aplicables a aplicaciones analíticas, en las que puede estar disponible una cantidad limitada de muestra biológica para el análisis y puede que la misma muestra tenga que procesarse para múltiples análisis, Adicionalmente, se puede usar el mismo canal de detección para la detección de diferentes dianas en la muestra, lo que permite menos requisitos químicos para el análisis de múltiples dianas. Los procedimientos pueden además facilitar análisis basados en los procedimientos de detección, que pueden estar limitados en el número de dianas detectables de forma simultánea por las limitaciones de las señales resolubles. Por ejemplo, usando detección basada en fluorescencia, el número de dianas que se pueden detectar de forma simultánea puede estar limitada a aproximadamente cuatro, ya que sólo se pueden resolver aproximadamente cuatro señales fluorescentes en base a sus propiedades de longitud de onda de excitación y de emisión. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden permitir la detección de más de cuatro dianas usando un sistema de detección basado en fluorescencia.
En algunas realizaciones, el procedimiento de detección de múltiples dianas en una muestra biológica incluye la detección secuencia de dianas en la muestra biológica . En general, el procedimiento incluye las etapas de detectar una primera diana en la muestra biológica, modificando la señal de la primera diana usando un agente químico y detectando una segunda diana en la muestra biológica. El procedimiento puede además incluir repetir la etapa de modificación de la señal de la segunda diana, seguido de detección de una tercera diana en la muestra biológica, etc.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye las etapas de poner en contacto una muestra biológica con una primera sonda y la unión física de una primera sonda con su primera diana. El procedimiento incluye además observar una primera señal procedente de la primera sonda. Para modificar la primera señal se aplica un agente químico a la sonda. El procedimiento incluye además poner en contacto la muestra biológica con una segunda sonda y la unión física de la segunda sonda con una segunda diana en la muestra biológica, seguido de la observación de una segunda señal procedente de la segunda sonda.
Muestras biológicas
Una muestra biológica de acuerdo con una realización de la invención puede ser sólida o fluida. Ejemplos adecuadas de muestras biológicas pueden incluir, entre otros, cultivos, sangre, plasma, suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, orina, heces, lágrimas, saliva, aspirados con aguja, secciones externas de la piel tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, tumores, órganos, cultivos celulares o constituyentes de cultivos celulares, o secciones de tejido sólido. En algunas realizaciones, la muestra biológica puede analizarse como tal, es decir sin recoger y/o aislar la diana de interés. En una realización alternativa, puede realizarse la recolección y aislamiento de las dianas antes del análisis. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser particularmente adecuados para el análisis in vitro de las muestras biológicas.
Una muestra biológica puede incluir cualquiera de las muestras mencionadas anteriormente con independencia de su estado físico, tales como, entre otras, tratadas mediante congelación o tinción o de otro modo. En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir compuestos que no están entremezclados de forma natural con la muestra en la naturaleza, tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijantes, nutrientes, antibióticos o similares.
En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una muestra de tejido, una célula entera, un constituyente celular, un citoespín o un frotis celular. En algunas realizaciones, una muestra biológica incluye esencialmente una muestra de tejido. Una muestra de tejido incluye una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto biológico que puede tener una función similar. En algunas realizaciones, una muestra de tejido puede incluir una colección de células similares obtenidas de un tejido de un ser humano. Ejemplos
adecuados de tejidos humanos incluyen, entre otros, (1) epitelio; (2) tejidos conjuntivos, incluidos vasos sanguíneos, hueso y cartílago, (3) tejido muscular y (4) tejido nervioso. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido obtenido de una muestra de tejido u órgano fresco, congelado y/o conservado o biopsia o aspirado, sangre o cualquier constituyente de la sangre, fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial, o células de cualquier tiempo de gestación o desarrollo del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede incluir células primarias o cultivadas o líneas celulares.
En algunas realizaciones, una muestra biológica incluye secciones de tejido de colon, tejido de mama normal, cáncer de próstata, adenocarcinoma de colon, micromatriz de tejido de mama TMA de mama o próstata normal. Una sección de tejido puede incluir una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una lámina fina de tejido o células cortadas de una muestra de tejido. En algunas realizaciones, se pueden obtener múltiples secciones de muestras de tejido y someter a análisis, siempre que los procedimientos divulgados en el presente documento se puedan usar para análisis de la misma sección de la muestra de tejido con respecto a al menos dos dianas diferentes (a nivel morfológico o molecular). En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se puede analizar con respecto a al menos cuatro dianas diferentes (a nivel morfológico o molecular). En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se puede analizar con respecto a más de cuatro dianas diferentes (a nivel morfológico o molecular). En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se puede analizar a los niveles tanto morfológico como molecular. Una sección de tejido, si se usa como muestra biológica, puede tener un espesor en el intervalo que es inferior a aproximadamente 100 micrómetros, en un intervalo que es inferior a aproximadamente 50 micrómetros, en un intervalo que es inferior a aproximadamente 50 micrómetros o en un intervalo que es inferior a aproximadamente 10 micrómetros.
Dianas
Una diana de acuerdo con una realización de la invención puede estar presente sobre la superficie de una muestra biológica (por ejemplo, un antígeno sobre una superficie de una sección de tejido) o presente en el grueso de la muestra (por ejemplo, un anticuerpo en una solución tampón). En algunas realizaciones, una diana puede no estar presente de forma inherente sobre la superficie de una muestra biológica y la muestra biológica puede tener que procesarse para hacer que la diana esté disponible sobre la superficie. En algunas realizaciones, la diana puede ser soluble en un fluido corporal, tal como sangre, plasma sanguíneo, suero u orina. En algunas realizaciones, la diana puede estar en un tejido, bien sobre una superficie celular, o dentro de una célula.
Adecuadamente, la(s) diana(s) que se van a analizar pueden estar determinadas por el tipo y la naturaleza del análisis requerido para la muestra biológica. En algunas realizaciones, una diana puede proporcionar información sobre la presencia o ausencia de un analito en la muestra biológica. En otra realización, una diana puede proporcionar información sobre el estado de una muestra biológica. Por ejemplo, si la muestra biológica incluye una muestra de tejido, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden usarse para detectar dianas que pueden ayudar en la comparación de diferentes tipos de células o tejidos, en la comparación de diferentes estadios de desarrollo, en la detección de la presencia de una enfermedad o anomalía o en la determinación del tipo de enfermedad o anomalía
Las dianas adecuadas pueden incluir uno o más péptidos, proteínas (p. ej., anticuerpos, aficuerpos o aptámeros), ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos, ADN, ARN o aptámeros), polisacáridos (p. ej., lectinas, azúcares), lípidos, enzimas, sustratos enzimáticos, ligandos, receptores, antígenos o haptenos. Una o más de las dianas mencionadas anteriormente pueden ser características de células concretas, mientras que otras dianas pueden asociarse con una enfermedad o afección concretas. En algunas realizaciones, las dianas en una muestra tisular que se pueden detectar y analizar usando los procedimientos divulgados en el presente documento pueden incluir, entre otros, dianas pronósticas, hormonas o dianas receptores de hormonas, dianas linfoides, dianas tumorales, dianas asociadas al ciclo celular, tejido neural y dianas tumorales o dianas de clúster de diferenciación.
Ejemplos adecuados de dianas pronósticas pueden incluir dianas enzimáticas tales como galactosil transferasa II, enolasa específica de neuronas, protón ATPasa-2 o fosfatasa ácida.
Ejemplos adecuados de dianas hormonales o receptoras de hormonas pueden incluir gonadotropina coriónica humana (HCG), hormona adrenocorticotropa, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata (PSA), receptor de estrógenos, receptor de progesterona, receptor de andrógenos, receptor del complemento gC1q-R/p33, receptor de IL-2, receptor de la neurotrofina p75, receptor de PTH, receptor de la hormona tiroides o receptor de insulina.
Ejemplos adecuados de dianas linfoides pueden incluir alfa-antiquimotripsina, alfa-1-antitripsina, diana de células B, bcl-2, bcl-6, antígeno de linfocitos B de 36 kD, BM1 (diana mieloide), BM2 (diana mieloide), galactina-3, granzima B, antígeno de HLA clase I, antígeno de HLA clase II (DP), antígeno HLA de clase II (DQ), antígeno HLA de clase II (DR), defensinas de neutrófilo humano, inmunoglobulina A, inmunoglobulina D, inmunoglobulina G, inmunoglobulina M, cadena ligera kappa, cadena ligera kappa, cadena ligera lambda, antígeno de linfocitos/histocitos, diana de
macrófagos, muramidasa (lisozima), p80 cinasa de linfomas anaplásicos, diana de células plasmáticas, inhibidor de la proteasa leucocitaria secretora, receptor de antígenos de linfocitos T (JOVI 1), receptor de antígenos de linfocitos T (JOVI 3), desoxinucleotidil transferasa terminal o diana de linfocitos B sin clúster.
Ejemplos adecuados de dianas tumorales pueden incluir alfa fetoproteína, apolipoproteína D, BAG-1 (proteína RAP46), CA19-9 (sialil lewisa), CA50 (antígeno mucínico asociado al carcinoma), CA125 (antígeno del cáncer d de ovarios), CA242 (antígeno mucínico asociado al tumor), cromogranina A, clusterina (apolipoproteína J), antígeno epitelial de membrana, antígeno relacionado con el tejido epitelial, antígeno específico epitelial, proteína 15 de líquidos de la enfermedad quística macroscópica, antígeno específico de hepatocitos, heregulina, mucina gástrica humana, glóbulo graso de leche humana, MAGE-1, metaloproteinasas de matriz, melan A, diana del melanoma (HMB45), mesotelina, metalotioneína, factor de transcripción de microftalmia (MITF), glicoproteína del núcleo Muc
1. Glicoproteína Muc-1, glicoproteína Muc-2, glicoproteína Muc-5AC, glicoproteína Muc-6, mieloperoxidasa, Myf-3 (diana del rabdomiosarcoma), Myf-4 (diana del rabdomiosarcoma), MyoD1 (diana del rabdomiosarcoma), mioglobina, proteína nm23, fosfatasa alcalina placentaria, prealbúmina, antígeno específico de próstata, fosfatasa ácida prostática, péptido inhibina prostática, PTEN, diana del carcinoma de células renales, antígeno mucinoso del intestino delgado, tetranectina, factor 1 de transcripción tiroideo 1,inhibidor tisular de la matriz metaloproteinasa 1, inhibidor tisular de la matriz metaloproteinasa 2, tirosinasa, proteína 1 relacionada con la tirosinasa o factor de von Willebrand.
Ejemplos adecuados de las dianas asociadas con el ciclo celular pueden incluir factor 1 de activación de la proteasa de la apoptosis, , bcl-w , bcl-x, bromodesoxiuridina, CAK (quinasa activadora de cdk), proteína de susceptibilidad a la apoptosis celular (CAS), caspasa 2, caspasa 8, CPP32 (caspasa-3), CPP32 (caspasa-3), quinasas dependientes de ciclina, ciclina A, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2, ciclina D3, ciclila E, ciclina G, factor de fragmentación de ADN (extremo N), Fas (CD95), proteína del dominio de muerte asociado con Fas, ligando de Fas, Fen-1, IPO38, Mcl-1, proteínas de mantenimiento de minicromosoma, proteína de reparación de errores de apareamiento (MSH2), poli (ADPRibosa) polimerasa, antígeno nuclear de células en proliferación, proteína p16, proteína p27, p34cdc2, proteína p57 (Kip2), proteína p105, Stat 1 alfa, topoisomerasa I, topoisomerasa II alfa, topoisomerasa III alfa o topoisomerasa II beta.
Ejemplos adecuados de dianas de tejido neural y tumoral pueden incluir alfa B cristalina, alfa-internexina, alfa sinnucleína, proteína precursora amiloide, amiloide beta, calbindina, colina acetiltransferasa, transportador 1 de aminoácidos excitadores, GAP43, proteína ácida de las fibrillas de las células gliales, receptor 2 de glutamato, proteína básica de la mielina, receptor del factor de crecimiento neural (gp75), diana del neuroblastoma, neurofilamento de 68 kD, neurofilamento de 160 kD, neurofilamento de 200 kD, enolasa específica de neuronas, receptor nicotínico alfa 4 de acetilcolina, receptor nicotínico beta 2 de acetilcolina, periferina, producto 9 del gen de proteínas, proteína S-100, serotonina, SNAP-25, sinapsina, sinaptofisina, tau, triptófano hidroxilasa, tirosina hidroxilasa o ubiquitina.
Ejemplos adecuados de dianas de clúster de diferenciación pueden den incluir CD1a, CD1b, CD1 c, CD1d, CD1e, CD2, CD3delta, CD3epsilon, CD3gamma, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8alpha, CD8beta, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CDw93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CDw125, CD126, CD127, CDw128a, CDw128b, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CDw150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD 164, CD165, CD166 y TCR-zeta.
Otras dianas pronóstico adecuadas, dianas hormonales o receptores de hormonas, dianas linfoides, agentes tumorales, dianas asociadas al ciclo celular, dientes de tejido neural y tumorales incluyen la proteína F del centrómero (CENP-F), giantina, involucrina, lamina A y C (XB 10), LAP-70, mucina, proteínas del complejo del poro nuclear, proteína del cuerpo lamelar p180, ran, catepsina D, proteína Ps2, Her2-neu, P53, S100, antígeno diana del tejido epitelial (EMA), TdT, MB2, MB3, PCNA o Ki67.
Sondas
En algunas realizaciones, los presentes procedimientos pueden usar sondas que no incluyen un generador intrínseco de señal. En algunas realizaciones alternativas, la sonda incluye un aglutinante capaz de unirse a la
diana y a un generador de señal capaz de proporcionar una señal detectable. Por tato, en algunas realizaciones, el aglutinante y el generador de señal no están asociados entre sí y pueden presentarse como una mezcla o como componentes separados que se asocian siguiendo la aplicación secuencial del aglutinante y el generador de señal a la muestra biológica. En realizaciones alternativas, el aglutinante y el generador de señal pueden estar asociados entre sí. Como se usa en el presente documento, “asociado” se refiere, en general, a dos entidades (por ejemplo, un aglutinante y un generador de señal) unidas de forma estable entre sí por medios fisicoquímicos. La naturaleza de la asociación puede ser tal que no altere sustancialmente la eficacia de cualquiera de las entidades. Un aglutinante y un generador de señal pueden asociarse entre sí mediante interacciones covalentes o no covalentes. Las interacciones no covalentes pueden incluir, entre otras, interacciones hidrófobas, interacciones iónicas, interacciones por puentes d hidrógeno, interacciones de alta afinidad (tales como, complejos de biotina-avidina o biotina-estreptavidina) u otras interacciones de afinidad.
En algunas realizaciones, un aglutinante y un generador de señal se pueden acoplar entre sí directamente (es decir, sin ligadores). En otras algunas realizaciones, un aglutinante y un generador de señal se pueden conjugar entre sí a través de un ligador. Un ligador puede incluir una forma de estructura o secuencia de unión formada debido a la formación de enlaces no covalentes o covalentes. En algunas realizaciones, el ligador puede ser químicamente estable, es decir puede mantener su integridad en presencia de un agente químico. En algunas realizaciones, el ligador puede ser susceptible a agentes químicos, es decir puede ser capaz de disociarse, escindirse o hidrolizarse en presencia de un agente químico. Ejemplos adecuados de ligadores pueden incluir puentes disulfuro (p. ej., SPDP o SMPT), estructuras/secuencias sensibles al pH, estructuras/secuencias que pueden reducirse en presencia de un agente reductor, estructuras/secuencias que se pueden oxidar en presencia de un agente oxidante, o cualquier otro enlace químico o físico que se puede manipular fácilmente (disociar, escindir o hidrolizar) en presencia de un agente químico.
En algunas realizaciones, el aglutinante puede estar marcado intrínsecamente con un generador de señal (por ejemplo, si el aglutinante es una proteína, durante la síntesis usando un aminoácido marcado de forma que se pueda detectar). Un aglutinante que está marcado de forma intrínseca puede no requerir un generador de señal para su detección. En su lugar, el marcador intrínseco puede ser suficiente para hacer que se pueda detectar la sonda. En realizaciones alternativas, el aglutinante puede marcarse a través de su unión a un generador de señal específico (es decir, se marca de forma extrínseca).
Un aglutinante y un generador de señal pueden estar unidos químicamente entre sí a través de grupos funcionales capaces de reaccionar y formar un enlace en las condiciones adecuadas. Ejemplos adecuados de combinaciones de grupos funcionales pueden incluir, entre otros, éster de amina y aminas o anilinas; acida de acilo y aminas o anilinas; haluros de acilo y aminas, anilinas, alcoholes o fenoles; nitrilo de acilo y alcoholes o fenoles; aldehído y aminas o anilinas; haluro de alquilo y aminas, anilinas, alcoholes, fenoles o tioles; sulfonato de alquilo y tioles, alcoholes o fenoles; anhídrido y alcoholes, fenoles, aminas o anilinas; haluro de arilo y tioles; aziridina y tioles o tioléteres; ácido carboxílico y aminas, anilinas, alcoholes o haluros de alquilo; diazoalcano y ácidos carboxílicos; epóxido y tioles; haloacetamida y tioles; halotriazina y aminas, anilinas o fenoles; hidroazina y aldehídos o cetonas; hidroxiamina y aldehídos o cetonas; imido éster y aminas o anilinas; isocianato y aminas o anilinas; e isotiocianato y aminas o anilinas. Un grupo funcional en uno de los pares de grupos funcionales mencionados anteriormente puede estar presente en un aglutinante y en el generador de señal puede estar presente un correspondiente grupo funcional. Por ejemplo, un aglutinante puede incluir un ácido carboxílico y el generador de señal pueden incluir una amina, anilina, alcohol o haluro de acilo, o viceversa. La conjugación entre el aglutinante y el generador de señal puede efectuarse, en este caso, mediante formación de una amida o un enlace éster.
Aglutinantes
Los procedimientos divulgados en el presente documento implican el uso de aglutinantes que se unen físicamente a la diana de un modo específico. En algunas realizaciones, un aglutinante se puede unir a una diana con suficiente especificidad, es decir un aglutinante se puede unir a una diana con mayor afinidad de lo que lo hace a cualquier otra molécula. En algunas realizaciones, un aglutinante se puede unir a otras moléculas, pero la unión puede ser tal que la unión inespecífica puede estar a niveles basales o casi basales. En algunas realizaciones, la afinidad del aglutinante por la diana de interés puede estar en un intervalo que sea al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o más que su afinidad por otras moléculas. En algunas realizaciones se pueden emplear aglutinantes con la mayor afinidad diferencial, aunque pueden no ser aquéllos con mayor afinidad por la diana.
La unión entre la diana y el aglutinante puede efectuarse mediante unión física. La unión física puede incluir la unión efectuada usando interacciones no covalentes. Las interacciones no covalentes pueden incluir, entre otras, interacciones hidrófobas, interacciones iónicas, interacciones por puentes d hidrógeno o interacciones de afinidad (tales como, complejos de biotina-avidina o biotina-estreptavidina). En algunas realizaciones, la diana y el aglutinante pueden tener áreas sobre sus superficies o en cavidades que dan lugar a un reconocimiento específico entre los dos, lo que tiene como resultado unión física. En algunas realizaciones, un aglutinante puede unirse a una diana biológica en base al ajuste recíproco de una porción de sus formas moleculares.
Los aglutinantes y sus correspondientes dianas pueden considerarse como pares de unión, de los cuales ejemplos no limitantes incluyen pares de unión de tipo inmunitario, tales como antígeno/anticuerpo, fragmento de antígeno/anticuerpo o hapteno/anti-hapteno; pares de unión de tipo no inmunitario, tales como proteína de unión biotina/avidina, biotina/estreptavidina, ácido fólico/folato, hormona/receptor de hormona, lectina/hidrato de carbono específico, enzima/enzima, enzima/sustrato, encima/análogo de sustrato, enzima/seudosustrato (análogos de sustrato que no se pueden catalizar mediante la actividad enzimática), enzima/cofactor, enzima/modulador, enzima/inhibidor o vitamina B18/Factor intrínseco. Otros ejemplos adecuados de pares de unión pueden incluir fragmentos de ácido nucleico complementarios (incluidas, secuencias de ADN, secuencias de ARN, secuencias de LNA, secuencias de PNA y secuencias de ácido nucleico peptídico); Proteína A/anticuerpo; Proteína G/anticuerpo; ácido nucleico/proteína de unión a ácido nucleico; o polinucleótido/proteína de unión a polinucleótido.
En algunas realizaciones, el aglutinante puede ser un aglutinante específico de secuencia o de estructura, en el que la secuencia o la estructura de una diana reconocida y unida por el aglutinante pueden ser suficientemente únicas para dicha diana.
En algunas realizaciones, el aglutinante puede ser específico de estructura y puede reconocer una estructura primaria, secundaria o terciaria de una diana. Una estructura primaria de una diana puede incluir la especificación de su composición atómica y los enlaces químicos que conectan dichos átomos (incluida la estereoquímica), por ejemplo el tipo y la naturaleza de la disposición lineal de los aminoácidos en una proteína. Una estructura secundaria de una diana puede hacer referencia a la forma tridimensional general de los segmentos de biomoléculas, por ejemplo una proteína de una estructura secundaria puede hacer referencia al plegamiento de la cadena “armazón” peptídico en varias conformaciones que pueden tener como resultado el acercamiento de aminoácidos distantes. Ejemplos adecuados de estructuras secundarias pueden incluir, entre otros, alfa hélices, láminas plegadas en beta o hélices aleatorias. Una estructura terciaria de una diana puede ser su estructura tridimensional global. Una estructura cuaternaria de una diana puede ser la estructura formada por su interacción no covalente con una o más dianas o macromoléculas distintas (tales como interacciones proteicas). Un ejemplo de una estructura cuaternaria puede ser la estructura formada por las cuatro subunidades de la proteína globina para fabricar la hemoglobina. Un aglutinante de acuerdo con las realizaciones de la invención puede ser específico de cualquiera de las estructuras mencionadas anteriormente.
Un ejemplo de un aglutinante específico de estructura puede incluir una molécula específica de proteína que se puede unir a una diana proteica. Ejemplos de moléculas específicas de proteínas adecuadas pueden incluir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, ácidos nucleicos (por ejemplo, aptámeros que reconocen las dianas proteicas) o sustratos de proteínas (no catalizables).
En algunas realizaciones, una diana puede incluir un antígeno y un aglutinante puede incluir un anticuerpo. Un anticuerpo adecuado puede incluir anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) o fragmentos de anticuerpos, siempre que se unan específicamente a un antígeno diana.
En algunas realizaciones, una diana puede incluir un anticuerpo monoclonal. Un “anticuerpo monoclonal" puede hacer referencia a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticas excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales pueden estar dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal puede estar dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. Un anticuerpo monoclonal se puede preparar mediante cualquier procedimiento conocido tal como el procedimiento del hibridoma, mediante procedimientos de ADN recombinantes o se pueden aislar a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos.
En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una muestra de célula o de tejido, y los procedimientos divulgados en el presente documento pueden usarse en inmunohistoquímica (IHC). La inmunoquímica puede implicar la unión de un antígeno diana a un aglutinante a base de anticuerpos, para proporcionar información sobre los tejidos o las células (por ejemplo células enfermas frente a normales). Ejemplos de anticuerpos (y las correspondientes enfermedades/células enfermas) adecuados como aglutinantes para los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen, entre otros, anticuerpo del receptor anti-estrógeno (cáncer de mama), anticuerpo del receptor anti-progesterona (cáncer de mama), anticuerpo anti-p53 (múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-Her-2/neu (múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-EGFR (factor de crecimiento epidérmico, múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-catepsina D (cánceres de mana y otros tipos de cáncer), anticuerpo anti-Bcl-2 (células apoptóticas), anticuerpo anti-cadherina E, anticuerpo anti-CA125 (cáncer de ovario y de otro tipo), anticuerpo anti-CA15-3 (cáncer de mama), anticuerpo anti-CA19-9 (cáncer de colon), anticuerpo antic-erbB-2, anticuerpo anti-P-glicoproteína (MDR, resistencia a múltiples fármacos), anticuerpo anti-CEA (antígeno carcinoembrionario), anticuerpo anti-proteína de retinoblastoma (Rb), anticuerpo anti-oncoproteína ras (p21), anticuerpo anti-cuerpos de Lewis X (también denominado CD15), anticuerpo anti-Ki-67 (proliferación celular),
anticuerpo anti-PCNA (múltiples tipos de cáncer), anticuerpo anti-CD3 (linfocitos T), anticuerpo anti-CD4 (linfocitos T colaboradores), anticuerpo anti-CD5 (linfocitos T), anticuerpo anti-CD (timocitos, linfocitos T inmaduros, células NK asesinas naturales), anticuerpo anti-CD8 (linfocitos T supresores), anticuerpo anti-CD9/p24 (ALL), anticuerpo anti-CD10 (también denominados CALLA) (leucemia linfoblástica aguda común), anticuerpo anti-CD11 (monocitos, granulocitos, AML), anticuerpo anti-CD13 (células mielomonocíticas, AML), anticuerpo anti-CD14 (monocitos, granulocitos maduros), anticuerpo anti-CD 15 (enfermedad de Hodgkin), anticuerpo anti-CD19 (linfocitos B), anticuerpo anti-CD20 (linfocitos B), anticuerpo anti-CD22 (linfocitos B), anticuerpo anti-CD23 (linfocitos B humanos, CLL), anticuerpo anti-CD30 (linfocitos T y B activados, enfermedad de Hodgkin), anticuerpo anti-CD31 (marcador de la angiogénesis), anticuerpo anti-CD33 (células mieloides, AML), anticuerpo anti-CD34 (células madre endoteliales,
tumores estromales), anticuerpo anti-CD35 (células dendríticas), anticuerpo anti-CD38 (células plasmáticas, células mieloides y T y B activadas, anticuerpo anti-CD41 (plaquetas, megacariocitos), anticuerpo anti-LCA/CD45 (antígeno común de leucocitos), anticuerpo anti-CD45RO (linfocitos T inductores, colaboradores), anticuerpo anti-CD45RA (linfocitos B), anticuerpo anti-CD39, anticuerpo CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas (apoptosis), anticuerpo anti-CD99 (marcador del sarcoma de Ewings, producto del gen MIC2), anticuerpo anti-CD106 (VCAM-1; células endoteliales activadas), anticuerpo anti-ubiquitina (enfermedad de Alzheimer), anticuerpo anti-CD71 (receptor de transferrina), anticuerpo anti-c-myc (oncoproteína y un hapteno), anticuerpo anti-citoqueratinas (receptor de transferrina), anticuerpo anti-vimentinas (células endoteliales) (linfocitos B y T), anticuerpo anti-proteínas del HPV (papilomavirus humano), anticuerpo anti-cadenas ligeras kappa (linfocitos B), anticuerpo anti-cadenas ligeras lambda (linfocitos B), anticuerpo anti-melanosomas (HMB45) (melanoma), anticuerpo anti-antígeno específico de próstata (PSA) (cáncer de próstata), anticuerpo anti-S-100 (células de melanoma, salivales, gliales), anticuerpo antiantígeno tau (enfermedad de Alzheimer), anticuerpo antifibrina (células epiteliales), anticuerpo anti-queratinas, anticuerpo anti-citoqueratina (tumor), anticuerpo anti-alfa-catenina (membrana celular) o anticuerpo anti-antígeno-Tn (carcinoma de colon, adenocarcinomas y cáncer pancreático).
Otros ejemplos específicos de anticuerpos adecuados pueden incluir, entre otros, antígeno nuclear celular antiproliferación, clon pc10 (Sigma Aldrich, P8825); anti-actina alfa del músculo liso (SmA), clon 1A4 (Sigma, A2547); anti-beta catenina de conejo (Sigma, C 2206); anti-pancitoqueratina de ratón, clon PCK-26 (Sigma, C1801); anti-receptor alfa de estrógenos de ratón, clon 1D5 (DAKO, M 7047); anticuerpo de beta catenina, clon 15B8 (Sigma, C 7738); anti-vimentina de cabra (Sigma, V4630); clon AR441 del receptor de andrógenos del ciclo (DAKO, M3562); factor 7 de Von Willebrand, queratina 5, queratina 8/18, e-cadherina, Her2/neu, receptor de estrógenos, p53, receptor de progesterona, beta catenina; anti-ratón de burro (Jackson Immunoresearch, 715-166-150); o anticonejo de burro (Jackson Immunoresearch, 711-166-152).
En algunas realizaciones, un aglutinante puede ser específico de secuencia. Un aglutinante específico de secuencia puede incluir un ácido nucleico y el aglutinante puede ser capaz de reconocer una disposición lineal concreta de nucleótidos o derivados de los mismos en la diana. En algunas realizaciones, la disposición lineal puede incluir nucleótidos contiguos o derivados de los mismos que pueden cada uno unirse a un correspondiente nucleótido complementario en el aglutinante. En una realización alternativa, la secuencia puede no ser contigua, ya que puede haber uno, dos o más nucleótidos que pueden no tener los correspondientes residuos complementarios en la sonda. Ejemplos adecuados de aglutinantes a base de ácidos nucleicos pueden incluir, entre otros, oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN o de ARN. En algunas realizaciones, ácidos nucleicos adecuados pueden incluir análogos de ácido nucleico, tales como dCTP de dioxigenina, biotina dcTP 7-azaguanosina, azidotimidina, inosina o uridina.
En ciertas realizaciones, tanto el aglutinante como la diana pueden incluir ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, un aglutinante a base de ácido nucleico puede formar un enlace de Watson-Crick con la diana de ácido nucleico. En otra realización, el aglutinante de ácido nucleico puede formar un enlace de Hoogsteen con el ácido nucleico diana, formando de este modo un triplex. Un aglutinante de ácido nucleico que se une mediante enlace de Hoogsteen puede penetrar en la ranura principal de un el ácido nucleico diana e hibridar con las bases ahí localizadas. Ejemplos adecuados de los aglutinantes anteriores pueden incluir moléculas que reconocen y se unen a las ranuras minoritarias y mayoritarias de los ácidos nucleicos (por ejemplo, algunas formas de antibióticos). En ciertas realizaciones, los aglutinantes de ácido nucleico pueden formar enlaces de Watson-Crick y Hoogsteen con el ácido nucleico diana (por ejemplo, las sondas de bisPNA son capaces de formar enlaces de Watson-Crick y Hoogsteen con un ácido nucleico).
La longitud del aglutinante de ácido nucleico puede también determinar la especificidad de la unión. El coste energético de un único error de apareamiento entre el aglutinante y el ácido nucleico diana puede ser relativamente mayor para las secuencias más cortas que para las más largas. En algunas realizaciones, la hibridación de aglutinantes de ácido nucleico más pequeños puede ser más específica que la hibridación de sondas de ácido nucleico más largas, ya que las sondas más largas pueden ser más susceptibles a sufrir errores de apareamiento y pueden seguir uniéndose al ácido nucleico según las condiciones. En ciertas realizaciones, los aglutinantes más cortos pueden exhibir una estabilidad de unión menor a una temperatura y una concentración de sales dadas. En este caso se pueden usar los aglutinantes que pueden exhibir mayor estabilidad para unir secuencias cortas (p. ej.,
bisPNA). En algunas realizaciones, el aglutinante de ácido nucleico puede tener una longitud en el intervalo de aproximadamente 4 nucleótidos a aproximadamente 12 nucleótidos, de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 25 nucleótidos, de aproximadamente 25 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 250 nucleótidos, de aproximadamente 250 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos o de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 1000 nucleótidos. En algunas realizaciones, el aglutinante de ácido nucleico puede tener una longitud en el intervalo que es superior a aproximadamente 1000 nucleótidos. Con independencia de la longitud del aglutinante de ácido nucleico, no todos los residuos de nucleótido del aglutinante se hibridan con nucleótidos complementarios en el ácido nucleico diana. Por ejemplo, el aglutinante puede incluir 50 residuos de nucleótidos de longitud y sólo 25 de dichos residuos de nucleótidos pueden hibridar pueden hibridar con el ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, los residuos de nucleótidos que pueden hibridar pueden ser contiguos entre sí. Los aglutinantes de ácido nucleico pueden ser monocatenarios o pueden incluir una estructura secundaria. En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una muestra de célula o de tejido y la muestra biológica puede someterse a hibridación in situ (ISH) usando un aglutinante de ácido nucleico. En algunas realizaciones, una muestra de tejido puede someterse a hibridación in situ además de inmunohistoquímica (IHC) para obtener la información deseada sobre la muestra de tejido.
Con independencia del tipo de aglutinante y la diana, la especificidad de la unión entre el aglutinante y la diana puede también verse afectada en función de las condiciones de unión (p. ej., condiciones de hibridación en el caso de los ácidos nucleicos complementarios). Las condiciones de unión adecuadas pueden obtenerse mediante modulación de uno o más de pH, temperatura o concentración de sales.
Como se ha indicado en el presente documento anteriormente, un aglutinante puede estar marcado de forma intrínseca (generador de señal o enzima unidos durante la síntesis del aglutinante) con un generador de señal o extrínsecamente marcado (generador de señal fijado durante una etapa posterior). Por ejemplo, para un aglutinante a base de proteínas, se puede preparar un aglutinante marcado de forma intrínseca usando aminoácidos marcados.
De forma similar, un ácido nucleico marcado de forma intrínseca se puede sintetizar usando procedimientos que incorporan nucleótidos marcados con generador de señal directamente en el ácido nucleico en crecimiento. En algunas realizaciones, un aglutinante se puede sintetizar de un modo tal que los generadores de señal se pueden incorporar en una etapa posterior. Por ejemplo, este último marcaje puede conseguirse por medios químicos mediante la introducción de grupos amino o tiol activos en ácidos nucleicos de cadenas peptídicas. En algunas realizaciones, un aglutinante, tal como una proteína (p. ej., un anticuerpo) o un ácido nucleico (p. ej., un ADN) puede variar mediante marcaje químico directo usando técnicas químicas adecuados para los mismos.
En algunas realizaciones se pueden usar combinaciones de aglutinantes que pueden proporcionar mayor especificidad o, en ciertas realizaciones, amplificación de la señal. Por tanto, en algunas realizaciones se puede usar un sándwich de aglutinantes, en el que el primer aglutinante puede unirse a la diana y servir para proporcionar unión secundaria, en el que el aglutinante secundario puede o no incluir un generador de señal, que puede además proporcionar unión terciaria (en caso necesario) en la que el miembro de unión terciaria puede incluir un generador de señal.
Ejemplos adecuados de combinaciones de aglutinantes pueden incluir anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, ácidos nucleicos complementarios u otros pares ligando-receptor (tales como biotina-estreptavidina). Algunos ejemplos específicos de pares de aglutinantes adecuados pueden incluir anti-myc de ratón para proteínas expresadas de forma recombinante con epítopo c-myc, anti-HisG de ratón para proteína recombinante con epítopo His-Tag, anti-xpress de ratón para proteína recombinante con epítopo-cola, anti-cabra de conejo para moléculas primarias de IgG de cabra, secuencia de ácido nucleico complementario para un ácido nucleico, anti-tiol de ratón para proteínas de fusión de tioredoxina, anti-GFP de conejo para proteína de fusión, jacalina para α-D-galactosa y melibiosa para proteínas de unión a hidratos de carbono, azúcares, matriz acoplada a níquel o heparina.
En algunas realizaciones, una combinación de un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario se puede usar como aglutinante. Un anticuerpo primario puede ser capaz de unirse a una región específica de la diana y el anticuerpo secundario puede ser capaz de unirse al anticuerpo primario. Un anticuerpo secundario puede estar fijado a un generador de señal antes de unirse al anticuerpo primario o puede ser capaz de unirse a un generador de señal en una etapa posterior. En una realización alternativa se pueden usar un anticuerpo primario y pares de ligando-receptor de unión específica (tales como biotina-estreptavidina). El anticuerpo primario puede estar fijado a un miembro del par (p. ej., biotina) y el otro miembro (p. ej., estreptavidina) puede estar marcado con un generador de señal. El anticuerpo secundario, avidina, estreptavidina o biotina, pueden estar cada uno marcados de forma independiente con un generador de señal.
En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden usar en un procedimiento de inmunotinción y un anticuerpo primario se puede usar para unirse específicamente al antígeno diana en la muestra de tejido. Un anticuerpo secundario se puede usar para unirse específicamente al anticuerpo primario, formando de este modo un puente entre el anticuerpo primario y un reactivo posterior (p. ej., un generador
de seña), en su caso. Por ejemplo, un anticuerpo primario puede ser IgG de ratón (un anticuerpo creado en ratón) y el correspondiente anticuerpo secundario puede ser anti-ratón de cabra (anticuerpo creado en cabras) que tiene regiones capaces de unirse a una región en una IgG de ratón.
En algunas realizaciones se puede obtener amplificación de señal cuando varios anticuerpos secundarios se pueden unir a epítopos sobre el anticuerpo primario. En un procedimiento de inmunohistoquímica, un anticuerpo primario puede ser el primer anticuerpo usado en el procedimiento y el anticuerpo secundario puede ser el segundo anticuerpo usado en el procedimiento. En algunas realizaciones, un anticuerpo primario puede ser el único anticuerpo usado en un procedimiento de IHC.
Generadores de señal
El tipo de generador de señal adecuado para los procedimientos divulgados en el presente documento pude depender de diversos factores, incluidas la naturaleza del análisis que se está realizando, el tipo de fuente de energía y el detector usado, el tipo de agente químico empleado, el tipo de aglutinante, el tipo de diana o el modo de fijación entre el aglutinante y el generador de señal (p. ej., escindible o no escindible).
Un generador de señal adecuado puede incluir una molécula o un compuesto capaz de proporcionar una señal detectable. Un generador de señal puede proporcionar una señal característica tras la interacción con una fuente de energía o una corriente. Una fuente de energía puede incluir una fuente de radiación electromagnética y una fuente de excitación de fluorescencia. La fuente de radiación electromagnética puede ser capaz de proporcionar energía electromagnética de cualquier longitud de onda, incluida luz visible, infrarrojos y ultravioleta. La radiación electromagnética puede estar en forma de una fuente de luz directa o puede ser emitida por un compuesto de emisión de luz, tal como un fluoróforo donante. Una fuente de excitación de fluorescencia puede ser capaz de fabricar una fuente de fluorescencia o puede dar lugar a emisiones de fotones (es decir, radiación electromagnética, campo eléctrico dirigido, temperatura, contacto físico o alteración mecánica). Generadores de señal adecuados pueden proporcionar una señal capaz de ser detectada por varios procedimientos, incluidas mediciones ópticas (p. ej., fluorescencia), conductividad eléctrica o radioactividad. Generadores de señal adecuadas pueden ser, por ejemplo, emisión de luz, aceptación de energía, fluorescencia, radioactivos o de inactivación.
Un generador de señal adecuado puede ser estérica y químicamente compatible con los constituyentes a los que está unido, por ejemplo un aglutinante. Adicionalmente, un generador de señal adecuado puede no interferir con la unión del aglutinante a la diana ni tampoco puede afectar a la especificidad de unión del aglutinante. Un generador de señal adecuado puede ser de naturaleza orgánica o inorgánica. En algunas realizaciones, un generador de señal puede ser de naturaleza química, peptídica o de ácido nucleico.
Un generador de señal puede ser detectable directamente o indirectamente. Un resto detectable directamente puede ser uno que se pueda detectar directamente por su capacidad para emitir una señal, tal como, por ejemplo, un marcador fluorescente que emite luz de una longitud de onda concreta tras la excitación por la luz de otra longitud de onda característica menor y/o absorber luz de una longitud de onda concreta. Un generador de señal detectable de forma indirecta puede ser uno que se pueda detectar indirectamente por su capacidad para unir, reclutar y, en algunos casos, escindir otro resto, que, a su vez puede emitir una señal. Un ejemplo de un generador de señal detectable de forma indirecta puede ser un generador de señal basado en enzimas, que cuando se pone en contacto con un sustrato adecuado puede escindir el sustrato para proporcionar una señal detectable. Como alternativa, un generador de señal detectable de forma indirecta puede ser capaz de unirse a un compuesto que emita una señal. Por ejemplo, un generador de señal, tal como biotina, que por sí misma no emite una señal, se puede detectar cuando está unida a moléculas de avidina o de estreptavidina marcadas. Otros ejemplos de generadores de señal detectables de forma indirecta pueden incluir ligandos que se unen de forma específica a receptores concretos. Los receptores marcados de forma detectable pueden unirse a aglutinantes marcados con ligando con el fin de detectar los aglutinantes. Por ejemplo, un aglutinante a base de anticuerpos se puede unir a un hapteno pequeño y un generador de señal se puede unir a un anticuerpo anti-hapteno que se puede unir específicamente al hapteno.
Un generador de señal adecuado de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento puede ser susceptible a la manipulación mediante aplicación de un agente químico. En algunas realizaciones, un generador de señal puede ser capaz de ser destruido químicamente tras la exposición a un agente químico. La destrucción química puede incluir la disgregación completa del generador de señal o la modificación del componente de generación de señal del generador de señal. La modificación del componente de generación de señal puede incluir cualquier modificación química (tal como adición, sustitución o eliminación) que puede tener como resultado la modificación de las propiedades de generación de señal. Por ejemplo, la desconjugación de un generador de señal conjugado puede tener como resultado la destrucción de las propiedades cromogénicas del generador de señal. De forma similar, la sustitución de un grupo funcional de inhibición de la fluorescencia en un generador de señal fluorescente puede tener como resultado la modificación de sus propiedades fluorescentes.
En algunas realizaciones un generador de señal se puede asociar con un aglutinante para formar un ligador escindible. Un ligador escindible puede ser susceptible a un agente químico y se puede disociar, hidrolizar o escindir cuando está en contacto con el agente químico. La escisión del ligador escindible puede tener como resultado la eliminación del generador de señal del aglutinante y, en consecuencia, la muestra biológica que se está analizando. La idoneidad de un generador de señal concreto se puede determinar en parte mediante la química del generador de señal, por ejemplo, si un generador de señal es propenso a la destrucción tras la aplicación de un agente químico, puede no ser necesario un enlace escindible entre el generador de señal y el aglutinante. De forma similar, si el generador de señal no es propenso a la destrucción química, se puede usar un ligador escindible para eliminar el generador de señal de la muestra biológica. Ejemplos adecuados de generadores de señal se describen más adelante en el presente documento.
En algunas realizaciones, se puede seleccionar un generador de señal de una molécula de emisión de luz, un radioisótopo (p. ej., P32 o H3, 14C, 125I y 131I), un marcador de densidad óptica y electrónica, una marca activa de Raman, una enzima, un sustrato enzimático (p. ej., un sustrato cromogénico), una molécula de resonancia de espín de electrones (tal como, por ejemplo, radicales de nitroxilo), una molécula de transferencia de carga eléctrica (es decir, una molécula de transducción de carga eléctrica), un nanocristal semiconductor, una nanopartícula semiconductora, un nanocristal de oro coloidal, una microesfera, una perla magnética, una partícula paramagnética, un punto cuántico o una molécula de afinidad (p. ej., una molécula de biotina, una molécula de estreptavidina, una proteína, un péptido, un ácido nucleico, un hidrato de carbono, un antígeno, un hapteno, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un lípido).
En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir una molécula de emisión de luz. Una molécula de emisión de luz puede emitir luz en respuesta al la irradiación con luz de una longitud de onda concreta. Las moléculas de emisión de luz pueden ser capaces de absorber y emitir luz a través de luminiscencia (emisión no térmica de radiación electromagnética por un material tras su excitación), fosforescencia (luminiscencia retardada como resultado de la absorción de radiación), quimioluminiscencia (luminiscencia debido a una reacción química), fluorescencia o fluorescencia polarizada.
In some embodiments, a signal generator may be directly detectable. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir un cromóforo. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir una molécula fluorescente o un fluoróforo. Cromóforos y fluoróforos adecuados pueden incluir una o más moléculas enumeradas anteriormente en el presente documento. En algunas realizaciones, el generador de señal puede ser parte de un par de FRET. El par de FRET incluye dos fluoróforos que son capaces de sufrir FRET para producir o eliminar una señal detectable cuando están colocados cerca uno de otro. Algunos ejemplos de donantes pueden incluir Alexa 488, Alexa 546, BODIPY 493, Oyster 556, Flúor (FAM), Cy3 o TTR (Tamra). Algunos ejemplos de aceptores pueden incluir Cy5, Alexa 594, Alexa 647 u Oyster 656.
En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un fluoróforo. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un fluoróforo que puede estar fijado a un anticuerpo, por ejemplo en un análisis de inmunohistoquímica. Fluoróforos adecuados que se pueden conjugar con un anticuerpo primario incluyen, entre otros, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, rojo VECTOR, ELF (fluorescencia marcada con enzima), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, FluorX, calceína, calcecina-AM, CRYPTOFLUOR.TM, naranja (42 kDa), mandarina (35 kDa), oro (31 kDa), rojo (42 kDa), púrpura (40 kDa), BHMP, BHDMAP, Br-Oregón, amarillo Lucifer, familia de pigmentos Alexa, N-[6-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4il)amino]caproilo] (NBD), BODIPY, difluoruro de dipirrometeno de boro, verde Oregón, rojo MITOTRACKER, DiOC sub.7 (3), DilC.sub.18, ficoeritrina, ficobiliproteínas BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa), espectro azul, espectro agua, espectro verde, espectro oro, espectro naranja, espectro rojo, NADH, NADPH, FAD, pigmentos Infrarrojos (IR), GDP-Ribosa cíclica (cGDPR), blanco calcoflúor, lisamina, umbeliferona, tirosina o triptófano. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un pigmento de cianina. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente uno o más de un pigmento de cianina (p. ej., un pigmento de Cy3, un pigmento de Cy5 o un pigmento de Cy7).
En algunas realizaciones, un generador de señal puede ser detectable indirectamente, por ejemplo una combinación enzima/sustrato enzimático. En algunas realizaciones, una enzima puede precipitar un sustrato soluble para formar un producto insoluble (p. ej., en inmunohistoquímica). Además, una enzima puede catalizar una reacción química de un sustrato cromogénico que se puede medir usando una técnica adecuada. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. Como alternativa, una enzima puede alterar las propiedades de fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. En algunas realizaciones, cuando se pueden usar enzima/sustratos enzimáticos como generadores de señal, el producto de la reacción catalizada por la enzima del sustrato puede ser susceptible al agente químico y dar como resultado una modificación del producto (por ejemplo, destrucción de color usando peróxido de hidrógeno). Ejemplos adecuados de combinaciones enzima-sustrato se describen más adelante en el presente documento.
Peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en el que la peroxidasa de hidrógeno
puede oxidar un precursor del pigmento (p. ej., ortofenileno diamina (OPD) o 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina clorhidrato (TMB)). Otros sustratos de HRPO adecuados pueden incluir, entre otros, 2,2’ azino-di-3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS, verde, hidrosoluble), aminoetil carbazol, 3-amino, 9-etil-carbazol AEC (3A9EC, rojo), alfa-naftol pironina (rojo), 4-cloro-1-naftol (4C1N, azul, azul-negro), 3,3’-diaminobencidina tetraclorhidrato (DAB, marrón), ortodianisidina (verde), o-fenilendiamina (OPD, marrón, hidrosoluble), Azul TACS (azul), TACS Rojo (rojo), 3, 3’,5,5’tetrametilbencidina (TMB, verde o verde/azul), TRUE BLUE (azul), VECTOR VIP (púrpura), VECTORSG (azul-gris ahumado) y sustrato Zymed Blue de HRP (azul intenso).
Como sustrato cromogénico se puede usar fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenilfosfato. Otros sustratos de APR adecuados incluyen, entre otros, Sustrato AP-Azul (precipitado azul, catálogo de Zymed pág. 61); Sustrato AP-Naranja (naranja, precipitado, Zymed), Sustrato AP-Rojo (rojo, precipitado rojo, Zymed), 5-bromo, 4-cloro, 3indolilfosfato (sustrato BCIP, precipitado turquesa), 5-bromo, 4-cloro, 3-indolilfosfato/nitroblue tetrazolio/yodonitrotetrazolio (sustrato BCI-P/TNT, precipitado amarillo-marrón, Biomeda), 5-bromo, 4-cloro, 3indolilfosfato/nitroblue tetrazolio (sustrato BCIP/NBT, azul/púrpura), 5-bromo, 4-cloro, 3-indolilfosfato/nitroblue tetrazolio/yodonitrotetrazolio (BCIP/NBT/INT, precipitado marrón, DA-KO, Rojo Fast Red (rojo), Magenta-fos (magenta), Naftol AS-BI-fosfato (NABP)/Fast Red TR (Rojo), Naftol AS-BI-fosfato (NABP)/New Fuchsin (Rojo), Naftol AS-MX-fosfato (NAMP) /New Fuchsin (Rojo), sustrato AP New Fuchsin (rojo), p-Nitrofenil fosfato (PNPP, amarillo, hidrosoluble), VECTOR Black (negro), VECTOR Blue (azul), VECTOR Red (rojo), Vega Red (color rojo cereza), D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (p.ej., p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa) o un sustrato fluorogénico (p.ej., 4-metilumbeliferil-ß-D-galactosidasa). Otros sustratos de ß-galactosidasa adecuados incluyen entre otros, 5-bromo-4-cloro-3-indoil beta-D-galactopiranósido (X-gal, precipitado azul).
Sustratos de la glucosa oxidasa (GO) adecuados incluyen, entre otros, nitroblue tetrazolio (NBT, precipitado púrpura), tetranitroblue tetrazolio (TNBT, precipitado negro), cloruro de 2-(4-yodofenil)-5-(4-nitrofenil)3-feniltetrazolio (INT, precipitado rojo o naranja), azul tetrazolio (azul), violeta Nitrotetrazolio (violeta) y bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, púrpura). Los sustratos de tetrazolio pueden requerir glucosa como co-sustrato. Los precipitados asociados con cada uno de los sustratos enumerados en el presente documento anteriormente pueden tener firmas de espectro detectables únicos.
Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, una o más de las moléculas mencionadas con anterioridad se pueden usar como generador de señal. En algunas realizaciones, uno o más de los generadores de señal mencionados anteriormente pueden no ser susceptibles a destrucción química y se puede usar un ligador escindible para asociar el generador de señal y el aglutinante. En algunas realizaciones, uno o más de los generadores de señal mencionados anteriormente pueden no ser susceptibles a destrucción de la señal y el generador de señal puede incluir esencialmente una molécula capaz de ser destruida químicamente. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un fluoróforo capaz de ser destruido químicamente. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente un pigmento de cianina capaz de ser destruido químicamente. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir esencialmente uno o más de un pigmento de Cy3, un pigmento de Cy5 o un pigmento de Cy7 capaces de ser destruidos o inactivados químicamente.
Agentes químicos
Un agente químico puede incluir uno o más sustancias químicas capaces de modificar el generador de señal, la enzima o el ligador escindible (si está presente) entre el generador de señal y el aglutinante y comprender un ácido, una base, un nucleófilo o un agente oxidante. Se puede poner en contacto un agente químico con el generador de señal en forma de un sólido, una solución, un gel o una suspensión.
En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir una base, por ejemplo, hidróxido sódico, hidróxido amónico, carbonato de potasio o acetato sódico. En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir un ácido, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido fórmico, ácido trifluoroacético o ácido dicloroacético. En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir nucleófilos, por ejemplo cianuros, fosfinas
o tioles. En algunas realizaciones, un agente químico puede incluir agentes oxidantes, por ejemplo especies de oxígeno activo, radicales hidroxilo, oxígeno singlete, peróxido de hidrógeno u ozono.
Uno o más de los agentes químicos mencionados anteriormente se pueden usar en los procedimientos divulgados en el presente documento, en función de la susceptibilidad del generador de señal, del aglutinante, de la diana o de la muestra biológica al agente químico. En algunas realizaciones, se puede usar un agente químico que esencialmente no afecta a la integridad del aglutinante, la diana y la muestra biológica. En algunas realizaciones, se puede usar un agente químico que no afecta a la especificidad de unión entre el aglutinante y la diana.
En algunas realizaciones, en las que se pueden usar dos o más (hasta cuatro) generadores de señal de forma simultánea, un agente químico puede ser capaz de modificar de forma selectiva uno o más generadores de señal. La susceptibilidad de diferentes generadores de señal a un agente químico puede depender, en parte, de la
concentración del generador de señal, la temperatura o el pH. Por ejemplo, dos fluoróforos diferentes pueden tener diferente susceptibilidad a una base dependiendo de la concentración de la base.
Análisis secuencial de una muestra biológica, contacto y unión a la sonda
Se puede poner en contacto una muestra biológica con una sonda para unir físicamente la sonda a una diana en la muestra biológica. En algunas realizaciones, una diana puede no ser fácilmente accesible para unión con la sonda y una muestra biológica puede procesarse después para facilitar la unión entre la diana y el aglutinante (en la sonda). En algunas realizaciones se puede poner en contacto una sonda con la muestra biológica en forma de una solución. En función de la naturaleza del aglutinante, la diana y la unión entre los dos se puede dejar suficiente tiempo de contacto. En algunas realizaciones, se puede usar un exceso de moléculas aglutinantes para garantizar que todas las dianas en la muestra biológica están unidas. Tras un tiempo suficiente para la acción de unión, la muestra se puede poner en contacto con una solución de lavado (p. ej., una solución tampón adecuada) para eliminar mediante lavado todas las sondas no unidas. Dependiendo de la concentración y del tipo de sondas usadas, una muestra biológica se puede someter a una serie de etapas de lavado usando las mismas o diferentes soluciones de lavado en cada etapa.
En algunas realizaciones, la muestra biológica se puede poner en contacto con más de una sonda en la primera etapa de contacto. La pluralidad de las sondas puede ser capaz de unirse a diferentes dianas en la muestra biológica. Por ejemplo, una muestra biológica puede incluir dos dianas: diana 1 y diana 2, y en este caso se pueden usar dos grupos de sondas: sonda 1 (que tiene el aglutinante 1 capaz de unirse a la diana 1) y sonda 2 (que tiene el aglutinante 2 capaz de unirse a la diana 2). Se puede poner en contacto una pluralidad de sondas con la muestra biológica de forma simultánea (p. ej., como mezcla única) o secuencialmente (p. ej., una sonda se puede poner en contacto con la muestra biológica, seguido de la etapa de lavado para eliminar toda la sonda 1 no unida, seguida del contacto de una sonda 2 con la muestra biológica, y así sucesivamente).
El número de sondas que se pueden unir de forma simultánea a la diana puede depender del tipo de detección usada, es decir, la resolución del espectro que se puede conseguir. Por ejemplo, para generadores de señal basados en fluorescencia se pueden usar, como máximo, cuatro sondas diferentes (proporcionando cuatro señales fluorescentes de resolución espectral) de acuerdo con los procedimientos divulgados. De resolución espectral, en referencia a una pluralidad de generadores de señal fluorescentes, implica que las bandas de emisión de fluorescencia de los generadores de señal son lo suficientemente distintos, es decir suficientemente no solapantes, de modo que los aglutinantes a los que están fijados los respectivos generadores de señal se pueden distinguir sobre la base de la señal fluorescente generada por los respectivos generadores de señal usando sistemas de fotodetección convencionales. En algunas realizaciones, una muestra biológica se puede poner en contacto esencialmente con cuatro o menos de cuatro sondas en la primera etapa de contacto.
En algunas realizaciones, una muestra biológica incluye una célula entera, una muestra de tejido o una micromatriz. En algunas realizaciones, una muestra biológica incluye una muestra de tejido. La muestra de tejido puede obtenerse mediante diversos procedimientos, incluidos, entre otros, escisión quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede estar fresco o congelado. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede estar fijada e incluida en parafina. La muestra de tejido puede estar fijada o conservada de otro modo mediante metodología convencional; la elección de un fijante puede venir determinada por el objetivo para el cual el tejido se va a teñir histológicamente o analizarse de otro modo. La longitud de la fijación puede depender del tamaño de la muestra de tejido y del fijante usado. Por ejemplo, para fijar o conservar una muestra de tejido se puede usar formalina tamponada neutra, Bouin o paraformaldehído.
En algunas realizaciones, en primer lugar se puede fijar la muestra de tejido y, después, deshidratar mediante una serie creciente de alcoholes, infiltrar e incluir en parafina o en otros medios para secciones de modo que se pueda partir la muestra de tejido. En una realización alternativa, una muestra de tejido se puede partir y después fijar. En algunas realizaciones, la muestra de tejido puede incluirse y procesarse en parafina. Ejemplos de parafina que se pueden usar incluyen, entre otros, Paraplast, Broloid y Tissue. Una vez que la muestra de tejido se ha incluido, la muestra se puede partir con un microtomo en secciones que pueden tener un espesor en el intervalo de aproximadamente tres micrómetros a aproximadamente cinco micrómetros. Una vez partidas, las secciones se pueden fijar a portaobjetos usando adhesivos. Ejemplos de adhesivos para portaobjetos pueden incluir, entre otros, silano, gelatina, poli-L-lisina. En realizaciones, su se usa parafina como material de inclusión, las secciones de tejido se pueden desparafinar y rehidratar en agua. Las secciones de tejido se pueden desparafinar usando, por ejemplo, agentes orgánicos (tales como, xilenos o series gradualmente descendentes de alcoholes).
En algunas realizaciones, además de los procedimientos de preparación de muestras tratados anteriormente, la sección de tejido se puede someter a tratamiento adicional antes de, durante o después de inmunohistoquímica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la sección de tejido puede someterse a procedimientos de recuperación de epítopo, tales como calentamiento de la muestra de tejido en tampón citrato. En algunas realizaciones, una sección de tejido pueden someterse opcionalmente a una etapa de bloqueo para minimizar cualquier unión inespecífica.
Tras la preparación de la muestra de tejido, se puede poner en contacto una solución con la sonda (p. ej., solución de anticuerpo marcado en un procedimiento de IHC) con la sección de tejido o la membrana durante un periodo de tiempo suficiente y en condiciones adecuadas para la unión del aglutinante a la diana (p. ej., antígeno en un procedimiento de IHC). Como se ha descrito anteriormente se pueden usar dos procedimientos de detección: directa o indirecta. En una detección directa, un anticuerpo primario marcado con generador de señal (p. ej., un anticuerpo primario marcado con un fluoróforo) se pueden incubar con un antígeno en la muestra de tejido, que se puede visualizar sin posterior interacción con anticuerpos. En una detección indirecta, un anticuerpo primario sin conjugar se puede incubar con un antígeno y, después, un anticuerpo secundario marcado se puede unir al anticuerpo primario. Se puede producir amplificación de señal, ya que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos sobre el anticuerpo primario. En las realizaciones en las que el anticuerpo secundario se puede conjugar con un marcador enzimático se puede añadir un sustrato cromogénico o fluorogénico para proporcionar la visualización del antígeno. En algunas realizaciones, dos o más (como máximo cuatro) anticuerpos primarios (marcados o sin marcar) se pueden poner en contacto con la muestra de tejido. Los anticuerpos sin marcar pueden ponerse en contacto después con los correspondientes anticuerpos secundarios marcados. Observación de una primera señal de la primera sonda
Se puede detectar una señal procedente del generador de señal en la sonda usando un sistema de detección. La naturaleza del sistema de detección usado puede depender de la naturaleza de los generadores de señal usados. El sistema de detección puede incluir un sistema de detección de resonancia de espín de electrones (ESR), un sistema de detección de dispositivo acoplado a carga (CCD) (p. ej., para radioisótopos), un sistema de detección de fluorescencia, un sistema de detección eléctrica, un sistema de detección de película fotográfica, un sistema de detección quimioluminiscente, un sistema de detección enzimática, un sistema de detección por microscopia de fuerza atómica (AFM) (para la detección de microesferas), un sistema de detección por microscopia de tunelización de barrido (STM) (para la detección de microesferas), un sistema de detección óptica, un sistema de detección de campo cercano o un sistema de detección de reflejo interno total (TIR).
Se pueden usar una o más de las técnicas mencionadas anteriormente para observar una o más características de una primera señal procedente de un generador de señal (presente en la primera sonda). En algunas realizaciones, la intensidad de la señal, la longitud de onda de la señal, la localización de la señal, la frecuencia de la señal o la desviación de la señal se pueden determinar usando una o más de las técnicas mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, una o más de las características de la señal mencionadas anteriormente se pueden observar, medir y registrar. En algunas realizaciones, un generador de señal puede incluir un fluoróforo y se puede determinar la longitud de onda de la fluorescencia o la intensidad de la fluorescencia usando un sistema de detección de fluorescencia. En algunas realizaciones se puede observar una señal in situ, es decir, se puede observar una señal directamente a partir del generador de señal asociado a través del aglutinante a la diana en la muestra biológica. En algunas realizaciones se puede analizar una señal procedente del generador de señal en la muestra biológica, obviando la necesidad de distintos sistemas de detección basados en matrices.
En algunas realizaciones, la observación de una señal puede incluir capturar una imagen de la muestra biológica. En algunas realizaciones, como sistema de detección se puede usar un microscopio conectado a un dispositivo de imagen, de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento. En algunas realizaciones, un generador de señal (tal como un fluoróforo) puede excitarse y la señal (tal como una señal de fluorescencia) se puede obtener y registrar en forma de una señal digital (p. ej., una imagen digitalizada). El mismo procedimiento se puede repetir para diferentes generadores de señal (si hay) que están unidos en la muestra usando los filtros de fluorescencia adecuados. Aplicación de un agente químico para modificar la primera señal
Para modificar la señal se puede aplicar un agente químico a la muestra biológica. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede incluir uno o más de un cambio en la característica de la señal, por ejemplo una disminución de la intensidad de la señal, una desviación en el pico de la señal, un cambio en la frecuencia resonante o escisión (eliminación) del generador de señal que tiene como resultado la eliminación de la señal.
En algunas realizaciones, un agente químico puede estar en forma de una solución y la muestra biológica se puede poner en contacto con la solución del agente químico durante una cantidad de tiempo predeterminada. La concentración de la solución del agente químico y el tiempo de contacto puede depender del tipo de modificación de señal deseada. En algunas realizaciones, las condiciones de contacto para el agente químico se pueden seleccionar de modo que el aglutinante, la diana, la muestra biológica y la unión entre el aglutinante y la diana no se vean afectados. En algunas realizaciones, un agente químico puede afectar sólo al generador de señal y el agente químico puede no afectar a la unión diana/aglutinante o a la integridad del aglutinante. Por tanto, a modo de ejemplo, un aglutinante puede incluir un anticuerpo primario o una combinación de anticuerpo primario/secundario. Un agente químico de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento puede afectar sólo al generador de señal, y el anticuerpo primario o la combinación de anticuerpo primario/secundario pueden esencialmente seguir sin verse afectados. En algunas realizaciones, un aglutinante (tales como un anticuerpo primario o la combinación de anticuerpo primario/anticuerpo secundario) puede permanecer unido a la diana en la muestra biológica después de poner en contacto la muestra con el agente químico. En algunas realizaciones, un
aglutinante puede permanecer unido a la diana en la muestra biológica después de poner en contacto la muestra con el agente químico y la integridad del aglutinante puede permanecer esencialmente sin afectar (p. ej., un anticuerpo no se desnaturaliza sustancialmente ni eluye en presencia de un agente químico).
En algunas realizaciones, se puede observar una característica de la señal tras poner en contacto la muestra con el agente químico, para determinar la eficacia de la modificación de la señal. Por ejemplo, se puede observar un color antes de la aplicación del agente químico y el color puede estar ausente tras la aplicación del agente químico. En otro ejemplo se puede observar la intensidad de la fluorescencia de un generador de señal fluorescente antes de poner en contacto con el agente químico y después de poner en contacto con el agente químico. En algunas realizaciones, una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad predeterminada se puede denominar modificación de la señal. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede hacer referencia a una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad en un intervalo de más de aproximadamente 50 por ciento. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede hacer referencia a una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad en un intervalo de más de aproximadamente 60 por ciento. En algunas realizaciones, la modificación de la señal puede hacer referencia a una disminución de la intensidad de la señal en una cantidad en un intervalo de más de aproximadamente 80 por ciento.
Contacto de la muestra con una sonda posterior y unión a una diana posterior
La muestra biológica se puede poner en contacto con una sonda posterior usando uno o más procedimientos descritos en el presente documento anteriormente para la primera sonda. La segunda sonda puede ser capaz de unirse a una diana diferente de la diana unida por la primera sonda. En las realizaciones en las que una pluralidad de sondas se puede poner en contacto con la muestra biológica en la etapas de contacto con la primera sonda, la segunda sonda puede ser capaz de unirse a una diana diferente de las dianas unidas por el primer conjunto de sondas. En algunas realizaciones, una muestra biológica se puede poner en contacto con una pluralidad de sondas en la etapa de contacto con la segunda sonda.
Observación de una segunda señal procedente de una sonda posterior
Se pueden usar uno o más procedimientos de detección descritos anteriormente en el presente documento para observar una o más características de una señal posterior (p. ej., segunda, tercera etc.) procedente de un segundo generador de señal (presente en la sonda posterior). En algunas realizaciones, la intensidad de la señal, la longitud de onda de la señal, la localización de la señal, la frecuencia de la señal o la desviación de la señal se pueden determinar usando una o más de las técnicas mencionadas anteriormente. Similar a la primera señal, una señal posterior (p. ej., una señal de fluorescencia) obtenida se puede registrar en forma de una señal digital (p. ej., una imagen digitalizada). En algunas realizaciones, la observación de una señal posterior puede incluir también capturar una imagen óptica de la muestra biológica.
Contacto de la muestra con una o más tinciones morfológicas
En algunas realizaciones, una muestra biológica puede incluir una célula o un tejido y la muestra se puede poner en contacto con una tinción morfológica antes, durante o después de la etapa de contacto con la primera sonda o la segunda sonda. Una tinción morfológica puede incluir un pigmento que puede teñir diferentes componentes celulares, con el fin de facilitar la identificación del tipo de célula o el estado de enfermedad. En algunas realizaciones, la tinción morfológica puede distinguirse fácilmente de los generadores de señal en la primera sonda y la segunda sonda, es decir la tinción puede no emitir la señal que puede solapar con la señal procedente de la primera sonda o de la segunda sonda. Por ejemplo, para una tinción morfológica fluorescente, la señal de la tinción morfológica puede no ser autofluorescente en la misma longitud de onda que los fluoróforos usados en la primera sonda o la segunda sonda.
Una tinción morfológica puede ponerse en contacto con la muestra biológica antes, durante o después de una cualquiera de las etapas mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con la muestra biológica junto con la primera sonda. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con la muestra biológica antes del contacto de la muestra con el agente químico y tras la unión física de la primera sonda con la diana. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con una muestra biológica después del contacto de la muestra con el agente químico y de la modificación de la señal. En algunas realizaciones, una tinción morfológica se puede poner en contacto con una muestra biológica junto con la segunda sonda. En algunas realizaciones, una muestra biológica se puede poner en contacto con la tinción morfológica después de la unión de la segunda sonda a la diana. En algunas realizaciones, una tinción morfológica puede ser estable frente a un agente químico, es decir las propiedades de generación de señal de la tinción morfológica puede no verse sustancialmente afectada por el agente químico. En algunas realizaciones, cuando una muestra biológica puede teñirse con una sonda y una tinción morfológica al mismo tiempo, la aplicación del agente químico para modificar la señal de la sonda puede no modificar la señal de la tinción morfológica.
En algunas realizaciones, se pueden usar como tinciones morfológicas cromóforos, fluoróforos o enzima/sustratos enzimáticos. Ejemplos adecuados de cromóforos que se pueden usar como tinciones morfológicas (y sus células diana, compartimentos subcelulares o componentes celulares) pueden incluir, entre otros, eosina (componentes celulares alcalinos, citoplasma), hematoxilina (ácidos nucleicos), naranja G (sangre, páncreas y células de la hipófisis), verde claro LF (colágeno), tinción de Romanowsky-Giemsa (morfología celular global), May-Grunwald (células sanguíneas), contratinción con azul (Trevigen), verde de etilo (CAS) (amiloide), amarillo S de Feulgen-Naftol (ADN), Giemsa (tiñe de forma diferencial varios compartimentos celulares), verde de metilo (amiloide), pironina (ácidos nucleicos), amarillo naftol (células sanguíneas rojas), rojo neutro (núcleos), tinción de Papanicolaou (una mezcla de hematoxilina, eosina Y, naranja G y mezcla de marrón de Bismarck (morfología celular global)), contratinción con rojo B (Trevigen), contratinción con rojo C (Trevigen), rojo sirio (amiloide), reactivo de Feulgen (pararosanilina) (ADN), galocianina cromo-alúmina (ADN), galocianina cromo-alúmina y Amarillo naftol S (ADN), verde de metilo-pironina Y (ADN), tionina-reactivo de Feulgen (ADN), naranja acridina (ADN), azul de metileno (ARN y ADN), azul toluidina (ARN y ADN), azul alciano (hidratos de carbono), rojo rutenio (hidratos de carbono), negro sudán (lípidos), Sudán IV (lípidos), rojo O al aceite (lípidos), tinción tricrómica de Van Gieson (fucsina cida y mezcla de ácido pícrico) (células musculares), tinción tricrómica de Masson (mezcla de hematoxilina, fucsina ácida y verde claro) (tiñe colágeno, citoplasma, nucleolos de forma diferente), aldehído fucsina (fibras de elastina) o tinción de Weigert (diferencia las fibras reticulares y colagenosas).
Ejemplos de tinciones morfológicas fluorescentes adecuadas (y sus células diana, compartimentos subcelulares o componentes celulares si procede) pueden incluir, entre otros: 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ácidos nucleicos), eosina (componentes celulares alcalinos, citoplasma), Hoechst 33258 y Hoechst 33342 (dos bisbencimidas) (ácidos nucleicos), yoduro de propidio (ácidos nucleicos), naranja espectral (ácidos nucleicos), verde espectral (ácidos nucleicos), quinacrina (ácidos nucleicos), fluoresceína-faloidina (fibras de actina), cromomicina A 3 (ácidos nucleicos), reacción de acriflavina-Feulgen (ácido nucleico), reacción de auramina O-Feulgen (ácidos nucleicos), bromuro de etidio (ácidos nucleicos). Tinciones de Nissl (neuronas, fluoróforos de ADN de alta afinidad tales como POPO, BOBO, YOYO y TOTO y otros, y proteína verde fluorescente condensada con proteína de unión a ADN (p. ej., histonas, ACMA, quinacrina y naranja acridina.
Ejemplos de enzimas adecuadas (y sus principales localizaciones o actividades celulares) pueden incluir, entre otros, ATPasas (fibras musculares), succinato deshidrogenasas (mitocondria), citocromo c oxidasas (mitocondria), fosforilasas (mitocondria), fosfofructoquinasas (mitocondria), acetil colinesterasas (células nerviosas), lactasas (intestino delgado), fosfastasas ácidas (lisosomas), leucina aminopeptidasas (células hepáticas), deshidrogenasas (mitocondria), miodenilato desaminasas (células musculares), NADH diaforasas (eritrocitos) y sucrasas (intestino delgado).
Repetición de las etapas de contacto, unión y observación
En algunas realizaciones, después de poner en contacto la muestra con una sonda posterior (p. ej., segunda, tercera etc.), la modificación del agente y la administración de la sonda posterior se pueden repetir múltiples veces. En algunas realizaciones, después de observar una segunda señal de la segunda sonda, la muestra biológica se puede poner en contacto con un agente químico para modificar la señal de la segunda sonda. Además, se puede poner en contacto una tercera sonda con la muestra biológica, en la que la tercera sonda puede ser capaz de unirse a una diana diferente de la primera y de la segunda sonda. Asimismo, se puede observar una señal de la tercera sonda, seguida por la aplicación del agente químico para modificar la señal. Las etapas de contacto, unión y observación se pueden repetir retiradamente múltiples veces usando una nª sonda capaz de unirse a etapas adicionales, para proporcionar al usuario información sobre diversas dianas usando diversas sondas y/o generadores de señal.
En algunas realizaciones se puede poner en contacto una serie de sondas con la muestra biológica de forma secuencial para obtener una análisis multiplexado de la muestra biológica. En algunas realizaciones se puede poner en contacto una serie de sondas (incluido, como máximo, 4 sondas en un conjunto) con la muestra biológica de forma secuencial para obtener una análisis multiplexado de la muestra biológica. En general, el análisis multiplexado se refiere al análisis de múltiples dianas en una muestra biológica usando el mismo mecanismo de detección.
Correlación de la primera señal y las señales posteriores
En algunas realizaciones se puede analizar una primera señal, una segunda señal o la primera señal y la segunda señal se pueden analizar para obtener información con respecto a la muestra biológica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presencia o ausencia de una primera señal puede indicar la presencia o ausencia de la primera diana (capaz de unirse al primer aglutinante) en la muestra biológica. De forma similar, la presencia o ausencia de una segunda señal puede indicar la presencia o ausencia de la segunda diana (capaz de unirse al segundo aglutinante en la muestra biológica). En las realizaciones en las que se pueden analizar múltiples dianas usando una pluralidad de sondas, la presencia o ausencia de una señal concreta puede indicar la presencia o ausencia de
la diana correspondiente en la muestra biológica.
En algunas realizaciones se puede medir un valor de intensidad de una señal (p. ej., intensidad de fluorescencia) y puede correlacionarse con la cantidad de diana en la muestra biológica. Una correlación entre la cantidad de diana y la intensidad de señal puede determinarse usando patrones de calibrado. En alguna realización, los valores de intensidad de la primera y la segunda señal se pueden medir y correlacionar con las respectivas cantidades de las dianas. En algunas realizaciones, comparando las dos intensidades de señal se pueden determinar las cantidades relativas de la primera diana y de la segunda diana (entre sí o con respecto a un control). De forma similar, cuando se pueden analizar múltiples dianas usando múltiples sondas, se pueden determinar las cantidades relativas de las diferentes dianas en la muestra biológica a través de la medición de diferentes intensidades de señal. En algunas realizaciones se pueden usar una o más muestras control tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Observando una presencia o ausencia de una señal en las muestras (muestra biológica de interés frente a un control) se puede obtener información sobre la muestra biológica. Por ejemplo, comparando una muestra de tejido enfermo frente a una muestra de tejido normal se puede obtener información sobre las dianas presentes en la una muestra de tejido enfermo. De forma similar, comparando las intensidades de señal entre las muestras (es decir, la muestra biológica de interés y uno o más controles) se puede obtener información sobre la expresión de dianas en la muestra.
En algunas realizaciones se puede observar una localización de la señal en la muestra biológica. En algunas realizaciones, se puede observar una localización de la señal en la señal biológica usando tinciones morfológicas. En algunas realizaciones, se pueden observar localizaciones relativas de dos o más señales. Una localización de la señal se puede correlacionar con una localización de la diana en la muestra biológica, lo que proporciona información sobre la localización de diferentes dianas en la muestra biológica. En algunas realizaciones se puede correlacionar un valor de intensidad de la señal y una localización de la señal para obtener información sobre la localización de diferentes dianas en la muestra biológica. Por ejemplo, puede que ciertas dianas se expresen más en el citoplasma que en el núcleo y al contrario. En algunas realizaciones se puede obtener información sobre la localización relativa de las dianas comparando los valores de localización y de intensidad de dos o más señales.
En algunas realizaciones, una o más de las etapas de observación o correlación se pueden realizar usando medios informáticos. En las realizaciones en las que la(s) señal(es) procedentes del generador de señal se pueden almacenar en forma de imagen(es) digitales se puede llevar a cabo análisis informático de las imagen(es). En algunas realizaciones, las imágenes (p. ej., señales procedentes de la(s) sonda(s) y las tinciones morfológicas) se pueden solapar usando superposición informática para obtener información completa de la muestra biológica, por ejemplo información topológica y de correlación.
En algunas realizaciones, una o más de las etapas mencionadas anteriormente (a) a (g) se pueden automatizar y realizar usando sistemas automáticos. En algunas realizaciones, todas las etapas (a) a (g) pueden realizarse a usando sistemas automáticos.
Los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden aplicar en aplicaciones analíticas, diagnósticas y terapéuticas en biología y en medicina. En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento pueden ser particularmente aplicables en histoquímica, particularmente inmunohistoquímica. El análisis de las muestras celulares o de tejido de un paciente de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento se puede emplear en diagnóstico (p. ej., para identificar pacientes que tengan una enfermedad concreta, hayan estado expuestos a una toxina concreta o estén respondiendo bien a una terapéutica concreta o a un transplante de órgano) y en términos pronósticos (p. ej., para identificar pacientes con probabilidad de desarrollar una enfermedad concreta, de responder bien a una terapéutica concreta o de aceptar un transplante de órgano concreto). Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden facilitar un análisis preciso y fiable de una pluralidad (p. ej., un número infinito) de dianas (p. ej., marcadores de enfermedad) de la misma muestra biológica.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes sólo pretenden ilustrar los procedimientos y realizaciones de acuerdo con la invención y, como tales, no deberán interpretarse como limitaciones impuestas por las reivindicaciones.
Los ejemplos siguientes 1-6 ilustran realizaciones en las que los marcadores son destruidos químicamente por agentes oxidantes, nucleófilos o cambios del pH. Los agentes oxidantes usados son peróxido de hidrógeno (H2O2) y peryodato sódico (NalO4). Los cambios en el pH se obtienen usando una base como hidróxido sódico (NaOH). El tris(2-carboxietil)fosfato creado in situ disolviendo TCEP.HCl en una base es un nucleófilo. Los marcadores incluyen pigmentos de cianina, tales como Cy3, Cy5, y Cy7, y marcadores nucleares, tales como 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La destrucción selectiva de los marcadores se puede obtener variando la concentración, el tipo y el tiempo de exposición al agente oxidante o la base.
Ejemplo 1- Oxidación selectiva de pigmentos de cianina usando peróxido de hidrógeno sin afectar a la DAPI
Mezclando 1 volumen de bicarbonato sódico 1M, 3 volúmenes de agua y 1 volumen del 30 por ciento (v/v) de peróxido de hidrógeno se preparó una solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) en un tampón de bicarbonato sódico. El pH del bicarbonato sódico se ajustó a un pH de 10 usando hidróxido sódico antes de mezclar con peróxido de hidrógeno.
Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina: Cy3, Cy5 y Cy7 en agua a una concentración de aproximadamente 2 micromolar (2 μM). Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de H2O2 para preparar una solución de muestra con una concentración final de aproximadamente 3 por ciento en volumen de H2O2 y pigmento de cianina uno micromolar 1 μM (Muestras 1 ((Cy3), 2 (Cy5) y 3 (Cy7)). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 micromolar (μM) en agua (sin H2O2).
La reacción de oxidación del pigmento de cianina se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia del pigmento en un espectrofotómetro de luz ultravioleta/visible (UV/vis) como una función del tiempo. La FIG. muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 como una función de la longitud de onda tras una duración de 10 minutos y de 15 minutos. El valor de la absorbancia disminuyó considerablemente cuando se comparó con el control. La FIG.2 muestra los valores de las Muestras 1, 2 y 3 como función de la longitud de onda. La absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 se redujo a cero tras una duración de tiempo exhibiendo destrucción química del pigmento por H2O2. La duración del tiempo para las Muestras 1, 2 y 3 fue diferente para cada pigmento distinto: 19 minutos para la Muestra 1,15 minutos para la Muestra 2 y 3 minutos para la Muestra 3.
Una solución de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se preparó en agua a una concentración de aproximadamente 57 μM. Un alícuota de solución DAPI se mezcló con un alícuota de la solución de H2O2 para preparar una solución con una concentración final de aproximadamente 3 por ciento en volumen de H2O2 y 10 microgramos/mililitro de DAPI (Muestra 4). Como control se usó una solución de DAPI 10 microgramos/mililitro en agua (sin H2O2).
La reacción de oxidación del DAPI se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de la Muestra 4 como una función del tiempo. La FIG. 3 muestra espectro de absorbancia de la Muestra 4 como una función de la longitud de onda tras una duración de 30 minutos y de 140 minutos. El valor de la absorbancia de la Muestra 4 no varió mucho, incluso después de un periodo de 140 minutos y estaba en el mismo intervalo que el control, sin exhibir ningún efecto significativo del H2O2 sobre el DAPI.
Ejemplo 2- Oxidación selectiva de pigmentos de cianina usando peryodato sódico sin afectar al DAPI.
Se preparó una solución de peryodato (NaIO4) mezclando una solución 0,2M de NaIO4 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 X. Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina, Cy3, Cy5 y Cy7, en agua a una concentración de aproximadamente 2 micromolar (2 μM). Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de NaIO4 para preparar una solución con una concentración final de aproximadamente 0,1 molar (1μM de NaIO4 y 1 micromolar (1 μM) de pigmento de cianina (Muestras 5 (Cy3), 6 (Cy5) y 7 (Cy7)). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 micromolar (1 μM) en agua (sin NaIO4).
La reacción de oxidación del pigmento de cianina se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia del pigmento en un espectrofotómetro de luz ultravioleta/visible (UV/vis) como una función del tiempo. La FIG. 4 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 5 como una función de la longitud de onda tras una duración de 20 minutos, 60 minutos y 210 minutos. El valor de absorbancia disminuyó como una función del tiempo en comparación con el control. Se observó pérdida de la absorbancia completa tras 210 minutos para la Muestra 5. La FIG.5 muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 6 como función de la longitud de onda, tras una duración de 12 minutos y 16 minutos. El valor de absorbancia disminuyó como una función del tiempo en comparación con el control. Se observó pérdida de la absorbancia completa rápidamente tras 16 minutos.
Una solución de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se prepare en agua a una concentración de aproximadamente 57 μM. Un alícuota de solución DAPI se mezcló con un alícuota de la solución de NalO4 para preparar una solución con una concentración final de aproximadamente 0,1 M de NalO4 y 10 microgramos/mililitro de DAPI (Muestra 8). ). Como control se usó una solución de DAPI 10 μg/ml en agua (sin NalO4).
La reacción de oxidación del DAPI se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de la Muestra 8 como una función del tiempo. La FIG. 6 muestra espectro de absorbancia de la Muestra 8 como una función de la longitud de onda tras una duración de 22 minutos, 70 minutos y 210 minutos. El valor de la absorbancia de la Muestra 8 no varió mucho, incluso después de un periodo de 210 minutos y una cantidad significativa de DAPI permaneció intacta cuando se comparó con el control.
Ejemplo 3- Destrucción selectiva de pigmentos de cianina usando base de hidróxido sódico sin afectar al DAPI
Se preparó una solución de NaOH a una concentración de 0,1M y 1M. Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina, Cy3, Cy5 y Cy7, en agua a una concentración de aproximadamente 2 μM. Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de NaOH de dos concentraciones diferentes de NaOH: NaOH 0,1M (MUESTRAS 9a, 10a y 11a) y NaOH 1M (Muestras 9b, 10b y 11b). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 μM en agua (sin NaOH).
La destrucción básica del pigmento se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las muestras como una función del tiempo. La FIG. 7 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 4 9a, 10a y 11 como una función de la longitud de onda tras una duración inferior a 5 minutos. El valor de la absorbancia de la Muestra 9a no varió mucho y una cantidad significativa de Cy3 permaneció intacta cuando se comparó con el control. La muestra 10a mostró una descomposición del 20 por ciento del pigmento Cy5, mientras que la Muestra 11a mostró una descomposición del 70 por ciento del pigmento Cy7 usando NaOH 0,1M. La FIG. 8 muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9b y 10b como una función de la longitud de onda tras una duración inferior a 5 minutos. La muestra 9b mostró una descomposición del 50 por ciento del pigmento Cy3, mientras que la muestra 10b mostró una descomposición del 80 por ciento del pigmento Cy5 usando NaOH 1M.
Una solución de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se preparó en agua a una concentración de aproximadamente 57 !M. Un alícuota de solución DAPI se mezcló con un alícuota de la solución de NaOH de dos concentraciones diferentes de NaOH 0,1M (Muestras 12a) y NaOH 1M (Muestras 12b). Como control se usó una solución de pigmento DAPI 10 microgramos/mililitro en agua (sin NaOH). La destrucción básica del DAPI se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b como una función del tiempo. La FIG. 9 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b como una función de la longitud de onda. El valor de la absorbancia de las muestras no varió mucho y una cantidad significativa de DAPI permaneció intacta cuando se comparó con el control.
Ejemplo 4- Destrucción selectiva de los pigmentos Cy5 y Cy7 sin afectar a Cy3
Se preparó una solución del 5 por ciento (peso/volumen) de un nucleófilo mezclando clorhidrato de tris[2carboxietil]-fosfina (TCEP.HCl) en tampón de bicarbonato sódico 1M (pH final 7,7). Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina, Cy3, Cy5 y Cy7, en agua a una concentración de aproximadamente 2 μM. Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de TCEP.HCl para preparar las muestras 13 (Cy3), 14 (Cy5) y 15 (Cy7). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 μM en agua (sin TCEP.HCl).
La destrucción del pigmento se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las muestras como una función del tiempo. La Fig. 10 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 como una función de la longitud de onda. El valor de la absorbancia de la Muestra 13 no varió mucho y una cantidad significativa de Cy3 permaneció intacta cuando se comparó con el control tras una duración de 60 minutos. Las muestras 14 y 15 mostraron una descomposición significativa de los pigmentos Cy5 y Cy7 tras una duración de 0,5 minutos.
Ejemplo 5- Destrucción selectiva del pigmento Cy7 sin afectar a Cy3
Se preparó una solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclando una solución del 6 % (v/v) de H2O2 en 0,8 X de BS (pH final de 6,6). Se prepararon tres soluciones distintas de pigmentos de cianina, Cy3, Cy5 y Cy7, en agua a una concentración de aproximadamente 2 micromolar (2 μM). Un alícuota de una solución de pigmento de cianina se mezcló con un alícuota de la solución de H2O2 para preparar las muestras 16 (Cy3), 17 (Cy5) y 15 (Cy7). Como control se usó una solución de pigmento de cianina 1 micromolar (1 μM) en agua (sin H2O2).
La destrucción del pigmento se monitorizó midiendo el espectro de absorbancia de las muestras como una función del tiempo. La Fig. 11 muestra espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 como una función de la longitud de onda. El valor de la absorbancia de la Muestra 16 no varió mucho y una cantidad significativa de Cy3 permaneció intacta cuando se comparó con el control tras una duración de 60 minutos. La muestra 17 mostró una descomposición significativa del pigmento Cy7 tras una duración de 60 minutos.
Los ejemplos 7-21 siguientes ilustran realizaciones de la invención de acuerdo con qué imagen múltiple de las muestras de tejido se lleva a cabo. La tinción múltiple se obtiene mediante tinción, obtención de imágenes, destrucción química de la tinción, retención, obtención de imágenes y repetición de las etapas.
Ejemplo 6 Preparación de muestras de tejido para tinción
Se obtuvieron muestras de tejido humano adulto como portaobjetos de tejido incluido en parafina. Las muestras de
tejido incluyeron portaobjetos de colon (Biochain, T2234090), tejido de mama normal (Biochain, T2234086), cáncer de próstata (Biochain, T2235201-1), adenocarcinoma de colon (Biochain, T2235090-1), micromatriz del tejido de mama (Imgenex, IMH 367, p61), TMA de mama (Imgenex IMH 367, p32) y próstata normal (Biochain, T2234201). Los portaobjetos incluidos en parafina de tejido humano adulto se sometieron a un protocolo de inmunohistoquímica para prepararlos para la tinción. El protocolo incluyó desparafinización, rehidratación, incubación y lavado. La desparafinización se llevó a cabo lavando los portaobjetos con Histochoice (o tolueno) durante un periodo de 10 minutos con agitación frecuente. Tras la desparafinización, la muestra de tejido se rehidrató lavando el portaobjetos con solución de etanol. El lavado se realizó con tres soluciones diferentes de etanol con concentraciones decrecientes. Las concentraciones de etanol usadas fueron 90 % en volumen, 70 % en volumen y 50 % en volumen. El portaobjetos se lavó después con una solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). La permeabilización de la membrana del tejido se llevó a cabo lavando el portaobjetos con una solución de 0,1 por ciento en peso de Triton TX100. Se usó tampón citrato a pH 6,0 (solución Vector Unmasking) para la recuperación del antígeno. Los portaobjetos se expusieron al tampón en un olla a presión durante un periodo de 15 minutos, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente durante un periodo de 20 minutos. A continuación, el portaobjetos se bloqueó contra la unión inespecífica lavando con PBS y 900 microlitros de 3 por ciento en volumen de seroalbúmina bovina (BSA) durante 45 minutos a 37 ºC. Para la tinción con anticuerpos secundarios (opcional), el portaobjetos también se bloqueó con 100 microlitros de suero de especies de huéspedes con anticuerpos secundarios.
Ejemplo 7 Conjugación de los anticuerpos con un pigmento
Los anticuerpos conjugados con pigmento se prepararon de acuerdo con el procedimiento siguiente. Los anticuerpos usados para conjugación y tinción incluyeron antígeno nuclear celular antiproliferación, clon pc10 (Sigma Aldrich, P8825); anti-actina alfa del músculo liso (SmA), clon 1A4 (Sigma, A2547); anti-beta catenina de conejo (Sigma, C 2206); anti-pancitoqueratina de ratón, clon PCK-26 (Sigma, C1801); anti-receptor alfa de estrógenos de ratón, clon 1D5 (DAKO, M 7047); anticuerpo de beta catenina, clon 15B8 (Sigma, C 7738); antivimentina de cabra (Sigma, V4630); clon AR441 del receptor de andrógenos del ciclo (DAKO, M3562); factor 7 de Von Willebrand, queratina 5, queratina 8/18, e-cadherina, Her2/neu, receptor de estrógenos, p53, receptor de progesterona, beta catenina; anti-ratón de burro (Jackson Immunoresearch, 715-166-150); o anti-conejo de burro (Jackson Immunoresearch, 711-166-152).
Una columna de espín micron YM-10 se humidificó con 250 microlitros de PBS y la columna se centrifugó durante 15 minutos. Se pipetearon 500 ml del anticuerpo (200 microgramos/mililitro) en la columna húmeda. Las placas se centrifugaron a 11000 rpm durante 30 minutos a 4 ºC. Después, el anticuerpo/proteína concentrado se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó durante 30 segundos para eliminar la proteína concentrada. Después, una solución tampón de acoplamiento se mezcló con la solución de anticuerpo concentrado. La solución tampón de acoplamiento incluyó carbonato sódico 1M (pH entre 8-9) y se usaron 5 microlitros del tampón por 100 microlitros de la solución de anticuerpo. El anticuerpo y la solución tampón se añadieron a 0,01-0,1 miligramos del pigmento de cianina. El pigmento se reconstituyó en DMSO hasta una concentración de 10-20 mg/ml antes de la incubación con el anticuerpo. La solución resultante se mezcló exhaustivamente pipeteando y todas las burbujas formadas se eliminaron mediante agotación del tubo. La solución se cubrió con papel de aluminio y se incubó a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30-45 minutos. Tras la incubación, la solución se añadió a una columna YM-10 spin y se centrifugó durante 30 minutos a 4 ºC a 11.000 rpm. La solución se lavó con PBS y se centrifugó para eliminar todo el pigmento o el anticuerpo no conjugados. La solución de anticuerpo conjugado con pigmento se diluyó después con 50 por ciento de glicerol y se almacenó en un congelador a -20 ºC.
Ejemplo 8 Tinción y obtención de imágenes de tejido con pigmentos
Un portaobjetos preparado en el ejemplo 6 se incubó con un anticuerpo conjugado con pigmento preparado en el Ejemplo 7. La incubación se realizó en 3 por ciento de BSA durante 45 minutos a 37 ºC. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una extensa serie de lavados con PBS. Cuando se usaron anticuerpos secundarios (opcional), el portaobjetos se incubó con un anticuerpo secundario en BSA durante 45 minutos a 37 ºC. Tras la incubación, el portaobjetos se sometió a una extensa serie de lavados con PBS. Un portaobjetos teñido (opcional) con anticuerpo primario o anticuerpo secundario se sometió a contratinción opcional con la tinción morfológica, DAPI y se cubrió con un cubreobjetos.
Se tomaron imágenes del portaobjetos cubierto usando una cámara. La cámara usada fue una cámara monocromática Leica DFC 350FX de alta resolución montada en un microscopio de fluorescencia Leica DMRA2. El aumento usado fue 20x a menos que se indique lo contrario. Después de la adquisición de imágenes, se retiró el cubreobjetos y el portaobjetos se lavó con PBS para preparar la destrucción de la señal.
Ejemplo 9 Destrucción de pigmento, tinción y obtención de imágenes
Para la destrucción de la señal se usaron una solución de NaOH y una solución de H2O2. Se preparó una solución
de NaOH usando 500 microlitros de 50 por ciento en volumen de NaOH y 49,5 ml de PBS. El pH final de la solución de NaOH fue de aproximadamente 11,9-12,5. Se preparó una solución de H2O2 mezclando 10 ml de carbonato sódico 0,5M (pH 10), 5 ml de 30 por ciento en volumen de H2O2 y 35 ml de agua. Se introdujo un portaobjetos en la solución de NaOH o de H2O2 durante 15 minutos con agitación suave. Tras 15 minutos, el portaobjetos se lavó de nuevo con PBS, se cubrió con cubreobjetos y se obtuvieron imágenes de nuevo (opcional) para comprobar la eficacia de la destrucción del pigmento o se volvió a teñir y a obtener imágenes. Las etapas de repetición de la tinción o de repetición de la obtención de imágenes se llevaron a cabo usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 8. Tras la obtención de imágenes, un portaobjetos se sometió a ciclos de destrucción de señal, tinción y obtención de imágenes, y el procedimiento se repitió un número múltiple de veces. Se obtuvieron imágenes de las muestras de tejido usando 1-9 anticuerpos diferentes. Después de obtener imágenes con la serie de cianina, el portaobjetos se tiñó opcionalmente y se obtuvieron imágenes con tinciones morfológicas de H y E.
Ejemplo 10 Tinción en dos canales y obtención de imágenes de un tejido de colon normal usando NaOH
Un portaobjetos con colon normal se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon pc10 de antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 18a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 18a y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 18b, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La FG. 12 muestra microfotografías (con un aumento de 10X) de la Muestra 18a (antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 18b (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó poco o ninguna señal del Cy3.
Ejemplo 11 Tinción en dos canales y obtención de imágenes de un tejido de colon normal usando NaOH
Un portaobjetos con colon normal se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon 1A4 de alfa-actina de músculo liso de ratón (SmA) y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 19a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 19a y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 19b, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y
9. La FG. 13 muestra microfotografías (con un aumento de 10X) de la Muestra 19a (antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 18b (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó una pequeña cantidad de señal del Cy3.
Ejemplo 12 Tinción en dos canales y obtención de imágenes de un tejido de mama normal usando NaOH
Un tejido de mama normal se tiñó con un anticuerpo primario SmA, se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 y se realizó contratinción con DAPI para formar la Muestra 20a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 20a y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 20b, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento anteriormente en los ejemplos 8 y 9. La Muestra 20b se volvió a teñir con un anticuerpo primario frente a beta-catenina de conejo y se detectó con anti-conejo conjugado con Cy3 de la Muestra 20c. Se obtuvieron imágenes de la muestra 20c y, después, se realizó contratinción con H y E para formar la Muestra 20d, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo.
La FIG. 14 muestra micrografías de la muestra 20a (antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 20b (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó poca o ninguna señal del Cy3 y sólo se observó DAPI. La micrografía de la Muestra 20c mostró que era posible la obtención de imágenes en el mismo canal Cy3 mediante tinción con un anticuerpo diferente. La información morfológica sobre el tejido se obtuvo mediante tinción adicional con H y E (Muestra 20d).
Ejemplo 13 Tinción en dos canales y obtención de imágenes de un tejido de cáncer de próstata usando NaOH
Un tejido de cáncer de próstata se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon PCK26 de anti-pancitoqueratina de ratón y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 21a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 21a y, después, se realizó contratinción con DAPI para formar la Muestra 21b. Se obtuvieron imágenes de la muestra 21b y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 21c, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y
9. La Muestra 21c se volvió a teñir con un anticuerpo primario SmA y se detectó con anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 21d y se obtuvieron imágenes de nuevo.
La FIG. 15 representa las micrografías de las muestras 21a y b (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 21c (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó poca o ninguna señal del Cy3 y
sólo se observó DAPI. La micrografía de la Muestra 21d mostró que era posible la obtención de imágenes en el mismo canal Cy3 mediante tinción con un anticuerpo diferente. La información nuclear sobre el tejido se obtuvo mediante tinción con DAPI (Muestra 21b).
Ejemplo 14 Tinción en dos canales y obtención de imágenes de un adenocarcinoma de colon usando NaOH
Un portaobjetos con adenocarcinoma de colon se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon PCK26 de antipancitoqueratina de ratón y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 22a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 22a y, después, se realizó contratinción con DAPI para formar la Muestra 22b. Se obtuvieron imágenes de la muestra 22b y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 22c, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Muestra 21c se volvió a teñir con un anticuerpo primario SmA y se detectó con anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 22d y se obtuvieron imágenes de nuevo.
La FIG. 16 representa las micrografías de las muestras 22a y b (antes de la modificación de la señal) y la Muestra 22c (tras la destrucción del pigmento). Después del tratamiento con NaOH quedó poca o ninguna señal del Cy3 y sólo se observó DAPI. La micrografía de la Muestra 22d mostró que era posible la obtención de imágenes en el mismo canal Cy3 mediante tinción con un anticuerpo diferente. La información nuclear sobre el tejido se obtuvo mediante tinción con DAPI (Muestra 22b).
Ejemplo 15 Tinción en dos canales y obtención de imágenes de una micromatriz de tejido de mama con medición basal usando NaOH
Se obtuvieron imágenes de micromatriz de tejido de mama (Muestra 23a) en el canal de DAPI y Cy3 para medir la autofluorescencia del tejido. Después, la muestra 23a se tiñó con DAPI para formar la Muestra 23b, se obtuvieron imágenes y después se trató con NaOH para formar la Muestra 23C, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. La Muestra 23a también se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon 1D5 del receptor alfa de estrógenos y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 23d. Se obtuvieron imágenes de la muestra 23d y después se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 23e, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los Ejemplos 8 y 9.
La FIG. 17 muestra microfotografías de las Muestras 23a-e. Las microfotografías de las Muestras 23c y 23e se compararon con la autofluorescencia (basal) observada en la Muestra 23a. Ambas muestras mostraron reducción de señal. La muestra teñida con DAPI mostró reducción de señal posiblemente a causa de la destrucción de los ácidos nucleicos a los que se une el DAPI.
Ejemplo 16 Tinción en tres canales y obtención de imágenes de TMA de mama usando NaOH
Un portaobjetos de TMA de mama se tiñó con un anticuerpo primario frente a un clon PCK-26 de antipancitoqueratina de ratón y se detectó con un anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 24a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 24a y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 32c, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y
9. La Muestra 24b se volvió a teñir con un anticuerpo de beta catenina conjugado directamente con Cy-3 para formar la Muestra 24c y se obtuvieron imágenes de nuevo. La matriz se trató de nuevo con NaOH y se marcó con anticuerpo SmA conjugado directamente con Cy3 para formar la Muestra 24d y se obtuvieron imágenes de nuevo. Las imágenes obtenidas se registraron, seudocolorearon y superpusieron (Muestra 24e) para dar información espacial para expresar el antígeno. La muestra 24d se tiñó adicionalmente con H y E para formar la Muestra 24f.
La FIG. 18 muestra micrografías de la muestra 24a (antes de la destrucción del pigmento) y la Muestra 24b (tras la destrucción del pigmento). Tras el tratamiento con NaOH quedaba poca o ninguna señal del Cy3 y sólo se observó DAPI. Las micrografías de las Muestras 24c y 24c mostraron que era posible la obtención de imágenes en el mismo canal de Cy3 mediante tinción con anticuerpos diferentes. La información morfológica sobre el tejido se obtuvo mediante tinción con H y E (Muestra 24f).
Ejemplo 17 Tinción en doce canales y obtención de imágenes de próstata normal usando NaOH
Se obtuvieron imágenes antes de la tinción hasta el nivel basal de la autofluorescencia procedente de cada canal. Un portaobjetos de próstata normal se tiñó con un cóctel de dos anticuerpos primarios: anti-vimentina de cabra y clon de anti-pancitoqueratina de ratón. Los dos anticuerpos primarios se detectaron con un segundo cóctel de anticuerpos secundarios: anti-ratón de burro conjugado con Cy3 y anti-cabra de burro conjugado con Cy5, para formar la Muestra 25a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 25a y después, se trató con una solución de NaOH. Después, el tejido se tiñó con un segundo cóctel de anticuerpos primarios: clon de receptores de andrógenos y alfa
catenina. Los dos anticuerpos primarios se detectaron con otro cóctel de anticuerpos secundarios conjugados con Cy-3 y Cy-5 para formar la muestra 25b. Se obtuvieron imágenes de la muestra 25b y después, se trató con una solución de NaOH. A esto le siguió las etapas de tinción-obtención de imágenes-tratamiento con NaOH-tinción usando anticuerpos conjugados directamente con Cy (Muestras 25c-25i). Los anticuerpos usados fueron: alfa-actina de músculo liso, beta-catenina, pan-cadherina, factor VII de Von Willebrand, queratina 5, queratina 8/18 y ecadherina. Cada etapa de tinción incluyó contratinción con DAPI (Muestra 25j).
La FIG. 19 muestra las micrografías de las muestras 25a (canales Cy3 y Cy5), la Muestra 25b (canales Cy3 y Cy5) y las Muestras 25c-25j. La Fig. 19 muestra que era posible la obtención de múltiples imágenes en el mismo canal de Cy3 mediante tinción con anticuerpos diferentes. La obtención de múltiples imágenes en 12 canales fue posible siendo 9 de los canales canales de Cy3.
Ejemplo 18 Tinción en cuatro canales y obtención de imágenes de próstata normal usando H2O2
Se obtuvieron imágenes antes de la tinción hasta el nivel basal de la autofluorescencia procedente de cada canal. Un portaobjetos de próstata normal se tiñó con un anticuerpo anti-pancadherina conjugada directamente con cy3 para formar la Muestra 26a. Se obtuvieron imágenes del portaobjetos y se trató con H2O2 (Muestra 26b), se volvió a teñir con SmA conjugado con Cy3 (Muestra 26c), se trató con H2O2 (Muestra 26d), se volvió a teñir con antipancitoqueratina conjugado con Cy3 (Muestra 26e), se trató con H2O2 (Muestra 26f), se volvió a teñir con vicentina conjugada con Cy (Muestra 26g) y se trató con H2O2 (Muestra 26g).
La Fig. 20 muestra micrografías de las Muestras 26a-g. La Fig. 20 muestra que era posible la obtención de múltiples imágenes en el mismo canal de Cy3 mediante tinción con anticuerpos diferentes y destrucción de la señal usando H2O2.
Ejemplo 19. Tinción residual tras tinción para abundantes proteínas usando NaOH
Se obtuvieron imágenes de una próstata normal (Muestra 27a) en el canal de Cy3 para medir la autofluorescencia del tejido. Después, la muestra 27a se tiñó con SmA conjugado con Cy3 para formar la Muestra 27b, se obtuvieron imágenes y después se trató con NaOH para formar la Muestra 27c, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Fig. 21 muestra las microfotografías de las Muestras 27a-c. La tinción residual se observó después del tratamiento con NaOH.
Los valores de tinción residual también se monitorizaron durante la obtención de múltiples imágenes en doce canales descrita en el Ejemplo 17. Usando tinción de Gimp 2.2 se recogieron las intensidades medias de píxel para cada imagen basal y tratada con NaOH y se tabularon. La Fig. 22 muestra un gráfico de la intensidad media del píxel de la basal para cada ciclo en la obtención de imágenes, así como una imagen pequeña de cómo aparecía el basal antes de la tinción. Se observó un pico grande en la intensidad de la tinción residual en el ciclo 4 como SmA, una proteína de expresión abundante se tiñó en el ciclo 3.
Ejemplo 20. Tinción residual tras tinción para abundantes proteínas usando tratamiento con NaOH y con H2O2
Dos portaobjetos de próstata se tiñeron con SmA conjugada directamente con Cy3 (Muestras 28a y 28b). En ambos portaobjetos se usaron etapas de pretratamiento, concentraciones y recuperación de antígeno idénticas y la única diferencia fue el procedimiento de destrucción de señal: siendo el procedimiento uno con NaOH (Muestra 28c) y el otro con H2O2 (Muestra 28d). Dos portaobjetos de próstata se tiñeron con pancadherina conjugada directamente con Cy3 (Muestras 29a y 29b). En ambos portaobjetos se usaron etapas de pretratamiento, concentraciones y recuperación de antígeno idénticas y la única diferencia fue el procedimiento de destrucción de señal; siendo el procedimiento uno con NaOH (Muestra 29c) y el otro con H2O2 (Muestra 29d).
La Fig. 23 muestra microfotografías de comparación directa de tinción con SmA y pancadherina y eliminación de la señal. El H2O2 mostró una eliminación de pigmento más eficaz para SmA y para pancadherina cuando se comparó con NaOH.
Ejemplo 21. Tinción residual tras tinción de múltiples ciclos para abundantes proteínas usando tratamiento con NaOH y con H2O2
Dos portaobjetos de próstata se tiñeron con SmA conjugada directamente con Cy3 (Muestras 30a y 30b). En ambos portaobjetos se usaron etapas de pretratamiento, concentraciones y recuperación de antígeno idénticas y la única diferencia fue el procedimiento de destrucción de señal; siendo el procedimiento uno con NaOH (Muestra 30c) y el otro con H2O2 (Muestra 30d). Los portaobjetos se sometieron a 9 ciclos de tinción y destrucción de señal antes de teñir con pancitoqueratina conjugada con Cy3.
La Figura 24 compara la tinción del primer ciclo con pancadherina con la del 9º ciclo de pancitoqueratina usando
NaOH y H2O2 para destruir la señal tras cada tinción. El H2O2 mostró una eliminación de pigmento más eficaz tras 9 ciclos cuando se comparó con NaOH. La Figura 25 compara el nivel de fondo de las muestras no teñidas (Muestras 30e y 30f) y tras 9 ciclos de tratamiento con NaOH y H2O2 (Muestras 30c y 30d). El H2O2 mostró una eliminación de pigmento más eficaz para SmA y para pancadherina cuando se comparó con NaOH. La FIG. 26 es un gráfico de
5 intensidad media de píxeles del fondo para cada ciclo para los portaobjetos con NaOH y H2O2. El fondo para el portaobjetos de H2O2 fue significativamente menor para cada ciclo tras el basal inicial. Debajo de cada ciclo también hay una pequeña imagen de cada nivel de fondo con la imagen de fondo de NaOH encima y la imagen de fondo de H2O2 en la parte inferior.
Ejemplo 22 Estabilidad del anticuerpo frente a agentes químicos
10 Un portaobjetos de tejido de colon se tiñó con un anticuerpo primario anti-beta-catenina de conejo y se detectó con un anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 31a. Se obtuvieron imágenes de la muestra 31a y después se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 31b, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Muestra
15 31b se volvió a teñir con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 31c y se obtuvieron imágenes de nuevo. La FIG, 27 muestra microfotografías de las Muestras 31 a-c. La FIG. 27 muestra que el anticuerpo primario permanece unido a la muestra tras el tratamiento con NaOH.
Un portaobjetos de tejido de colon se tiñó con un anticuerpo primario anti-PCNA de ratón y se detectó con un anticuerpo secundario anti-ratón de burro conjugado con Cy3 para formar la Muestra 32a. Se obtuvieron imágenes 20 de la muestra 31a y, después, se trató con una solución de NaOH para formar la Muestra 32b, de la que se obtuvieron imágenes de nuevo. Las etapas de tinción, obtención de imágenes y destrucción de pigmentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento en los ejemplos 8 y 9. La Muestra 32b se volvió a teñir con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Cy3 para formar la Muestra 32c y se obtuvieron imágenes de nuevo. La FIG. 28 muestra que el anticuerpo primario sigue unido a la muestra tras el
25 tratamiento con NaOH.
Por tanto, las realizaciones anteriores se deben considerar en todos los aspectos como ilustrativas y no como limitantes de la invención descrita en el presente documento. El alcance de la invención está indicado en las reivindicaciones adjuntas y no en la descripción anterior y, por consiguiente, se pretende que todos los cambios que entren dentro del significado y del alcance de equivalencia de las reivindicaciones estén incluidos en ellas.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de detectar múltiples dianas en una muestra biológica, que comprende:
    (a) poner en contacto la muestra con una primera sonda;
    (b)
    unir físicamente la primera sonda con una primera diana; 5 (c) observar una primera señal de la primera sonda;
    (d)
    aplicar un agente químico que comprende una base, un nucleófilo o un agente oxidante para modificar la primera señal;
    (e)
    poner en contacto la muestra con una segunda sonda;
    (f)
    unir físicamente la segunda sonda con una segunda diana; y 10 (g) observar una segunda señal de la segunda sonda;
  2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la diana se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un polisacárido, un lípido, una enzima, un sustrato enzimático, un ligando, un receptor o un antígeno, un hapteno.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda comprende un aglutinante y un generador de 15 señal.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el generador de está asociado con el aglutinante.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el aglutinante se selecciona un ácido nucleico, un péptido, una proteína, un polisacárido, un lípido, una enzima, un sustrato enzimático, un inhibidor enzimático, un ligando, un receptor, un antígeno o un hapteno.
    20 6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el generador de señal se selecciona de un cromóforo, un fluoróforo, una marca activa de Raman, un marcador radioactivo, una enzima o un sustrato enzimático.
  6. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la modificación de la señal comprende una disminución de la intensidad de la señal, una desviación del pico de la señal, un cambio de la frecuencia resonante o la escisión del generador de señal.
    25 8. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende observar la señal tras la etapa de modificación de señal.
  7. 9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que una o ambas etapas de contacto comprende poner en contacto la muestra con una pluralidad de sondas, cada una con un aglutinante diferente y un generador de señal diferente.
    30 10. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende repetir las etapas (d) a (g) al menos una vez usando una o más sondas en la etapa (e).
  8. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la sonda comprende un anticuerpo y un fluoróforo.
  9. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende correlacionar el valor de la intensidad con una cantidad de la diana en la muestra biológica.
ES07874282T 2006-11-16 2007-11-15 Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo de señales fluorescentes intermedias. Active ES2371506T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US560599 2000-04-28
US11/560,599 US7629125B2 (en) 2006-11-16 2006-11-16 Sequential analysis of biological samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2371506T3 true ES2371506T3 (es) 2012-01-04

Family

ID=39432912

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07874284T Active ES2371507T3 (es) 2006-11-16 2007-11-15 Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo intermedio de detector de fluorescencia.
ES07874282T Active ES2371506T3 (es) 2006-11-16 2007-11-15 Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo de señales fluorescentes intermedias.
ES07871481T Active ES2371290T3 (es) 2006-11-16 2007-11-15 Análisis secuencial de muestras biológicas.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07874284T Active ES2371507T3 (es) 2006-11-16 2007-11-15 Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo intermedio de detector de fluorescencia.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07871481T Active ES2371290T3 (es) 2006-11-16 2007-11-15 Análisis secuencial de muestras biológicas.

Country Status (11)

Country Link
US (5) US7629125B2 (es)
EP (3) EP2082239B1 (es)
JP (1) JP5123314B2 (es)
AT (2) ATE524742T1 (es)
AU (1) AU2007352364B2 (es)
CA (1) CA2669317C (es)
DK (2) DK2082239T3 (es)
ES (3) ES2371507T3 (es)
PL (2) PL2082239T3 (es)
PT (2) PT2082239E (es)
WO (2) WO2008133727A2 (es)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8060348B2 (en) * 2006-08-07 2011-11-15 General Electric Company Systems for analyzing tissue samples
US20080032321A1 (en) * 2006-08-07 2008-02-07 General Electric Company System and methods for analyzing images of tissue samples
US8131476B2 (en) * 2006-08-07 2012-03-06 General Electric Company System and method for co-registering multi-channel images of a tissue micro array
US8305579B2 (en) 2006-11-16 2012-11-06 Thomas Pirrie Treynor Sequential analysis of biological samples
US9201063B2 (en) 2006-11-16 2015-12-01 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US7629125B2 (en) 2006-11-16 2009-12-08 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US20100279272A1 (en) * 2008-02-13 2010-11-04 Michael Craig Burrell Multiplexed analysis methods using sers-active nanoparticles
EP2389585A2 (en) * 2009-01-22 2011-11-30 Li-Cor, Inc. Single molecule proteomics with dynamic probes
US9677125B2 (en) * 2009-10-21 2017-06-13 General Electric Company Detection of plurality of targets in biological samples
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines
US9176032B2 (en) 2011-12-23 2015-11-03 General Electric Company Methods of analyzing an H and E stained biological sample
US8568991B2 (en) 2011-12-23 2013-10-29 General Electric Company Photoactivated chemical bleaching of dyes
WO2013148498A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ventana Medical Systems, Inc. Signaling conjugates and methods of use
IN2014DN07533A (es) * 2012-03-30 2015-04-24 Clarient Diagnostic Services Inc
JP6225163B2 (ja) * 2012-03-30 2017-11-01 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション 単一試料での免疫蛍光及び蛍光系核酸分析
EP2841927B1 (en) * 2012-04-27 2018-01-17 Bio-rad Laboratories, Inc. Stain-free protein quantification and normalization
US9150907B2 (en) 2012-04-27 2015-10-06 General Electric Company Microfluidic flow cell assemblies and method of use
US20150105283A1 (en) 2012-05-30 2015-04-16 Clarient Diagnostics Services, Inc. Multiplexed diagnosis method for classical hodgkin lymphoma
WO2013181127A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Clarient Diagnostic Services, Inc. Multiplexed assay method for lung cancer classification
US20140024024A1 (en) 2012-07-17 2014-01-23 General Electric Company Methods of detecting dna, rna and protein in biological samples
US20140055853A1 (en) 2012-08-27 2014-02-27 General Electric Company Open top microfluidic device for multiplexing
US9850549B2 (en) 2012-10-09 2017-12-26 University Of Utah Research Foundation Monitoring temperature with fluorescence
US20150226743A1 (en) 2012-10-28 2015-08-13 Clarient Diagnostics Services, Inc. Multiplexed method for diagnosing classical hodgkin lymphoma
US9135694B2 (en) 2012-12-04 2015-09-15 General Electric Company Systems and methods for using an immunostaining mask to selectively refine ISH analysis results
US10175174B2 (en) 2012-12-11 2019-01-08 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Photoactivated chemical bleaching of dyes
WO2014099222A1 (en) * 2012-12-17 2014-06-26 Clarient Diagnostic Services, Inc. Chemical bleaching of dyes using radical photoinitiators
JP6462585B2 (ja) 2012-12-20 2019-01-30 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 医学的測定曲線の評価方法
ES2878196T3 (es) * 2012-12-26 2021-11-18 Koninklijke Philips Nv Evaluación de la actividad de la vía de señalización celular mediante el uso de una o más combinaciones lineales de expresiones de genes diana
US9932626B2 (en) 2013-01-15 2018-04-03 Quanterix Corporation Detection of DNA or RNA using single molecule arrays and other techniques
US9915592B2 (en) 2013-03-06 2018-03-13 General Electric Company Methods of analyzing an H and E stained biological sample
ES2804300T3 (es) 2013-03-12 2021-02-05 Ventana Med Syst Inc Microscopía mejorada digitalmente para histología multiplexada
EP2972376B1 (en) 2013-03-15 2018-12-05 Eisai Inc. Methods for determining prognosis of colorectal cancer
HK1213296A1 (zh) * 2013-06-04 2016-06-30 豪夫迈‧罗氏有限公司 用於fret的新化合物及与其相关的方法
US9322051B2 (en) 2013-10-07 2016-04-26 General Electric Company Probing of biological samples
US9778263B2 (en) * 2013-11-13 2017-10-03 General Electric Company Quantitative in situ characterization of biological samples
US9858469B2 (en) 2013-12-30 2018-01-02 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Modular image analysis system and method
US20150198580A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 General Electric Company Coverslip and methods for removing
CN107075545A (zh) 2014-07-30 2017-08-18 哈佛学院院长及董事 探针文库构建
US12216673B2 (en) 2014-09-25 2025-02-04 Oracle International Corporation Techniques for semantic searching
US10516980B2 (en) 2015-10-24 2019-12-24 Oracle International Corporation Automatic redisplay of a user interface including a visualization
US10417247B2 (en) 2014-09-25 2019-09-17 Oracle International Corporation Techniques for semantic searching
US10664488B2 (en) 2014-09-25 2020-05-26 Oracle International Corporation Semantic searches in a business intelligence system
US10101322B2 (en) 2015-02-13 2018-10-16 General Electric Company Photoactivated chemical bleaching of dyes using borates
US9708349B2 (en) 2015-02-13 2017-07-18 General Electric Company Borates for photoactivated chemical bleaching
KR20170007181A (ko) 2015-07-10 2017-01-18 3스캔 인크. 조직학적 염색제의 공간 다중화
US11415516B2 (en) 2015-10-28 2022-08-16 Leica Microsystems Cms Gmbh Method for reduction of autofluorescence from biological samples
KR20180100607A (ko) * 2016-01-07 2018-09-11 크리에티브이 마이크로테크, 인크. 순차적인 형광 소광 및 재염색을 이용한 생물학적 시료의 다중-표현형적 서브타이핑
JP7033081B2 (ja) * 2016-02-08 2022-03-09 ルナフォア・テクノロジーズ・エスアー 試料サイクル多重化及びインサイツイメージングの方法
EP3463452A1 (en) 2016-05-24 2019-04-10 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of non small cell lung cancer (nsclc) that coexists with chronic obstructive pulmonary disease (copd)
WO2018094113A1 (en) * 2016-11-16 2018-05-24 University Of Washington Systems and methods for cyclic fluorescence imaging
KR102476709B1 (ko) 2016-11-21 2022-12-09 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 화학적 조성물 및 이것을 사용하는 방법
EP3551765B1 (en) 2016-12-09 2026-02-04 Ultivue, Inc. Improved methods for multiplex imaging using labeled nucleic acid imaging agents
WO2018122249A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from a microsatellite stable colorectal cancer
WO2018122245A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting the survival time of patients suffering from cms3 colorectal cancer
CA3061429A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Microtubule-targeting drugs as immune checkpoint inhibitors and methods of screening novel immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancers and infectious diseases
WO2018218150A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
US10956237B2 (en) 2017-06-02 2021-03-23 Oracle International Corporation Inter-application sharing of business intelligence data
US11614857B2 (en) 2017-06-02 2023-03-28 Oracle International Corporation Importing, interpreting, and presenting data
US10917587B2 (en) 2017-06-02 2021-02-09 Oracle International Corporation Importing and presenting data
WO2018224688A1 (en) * 2017-06-08 2018-12-13 Lumito Ab A method of analysing a sample for at least one analyte
CN109781975B (zh) * 2017-11-14 2022-05-06 河南乾坤科技有限公司 富集循环稀有细胞的试剂及方法
WO2019139591A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Google Llc Method for creating histopathological ground truth masks using slide restaining
JP7525402B2 (ja) 2018-05-14 2024-07-30 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド 化学的組成物とそれを利用する方法
CA3122569A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 President And Fellows Of Harvard College Amplification methods and systems for merfish and other applications
WO2020141199A1 (en) 2019-01-03 2020-07-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cd8+ t cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer
US20220177978A1 (en) 2019-04-02 2022-06-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
US20220160692A1 (en) 2019-04-09 2022-05-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of sk2 inhibitors in combination with immune checkpoint blockade therapy for the treatment of cancer
SG11202112712RA (en) 2019-06-03 2021-12-30 Inst Nat Sante Rech Med Methods for modulating a treatment regimen
US20240301497A1 (en) 2019-10-17 2024-09-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing nasal intestinal type adenocarcinomas
WO2021170777A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer
CN111351946B (zh) * 2020-03-19 2023-08-18 中南大学湘雅二医院 用于红斑狼疮分型的AIM2+CD4+Trm细胞检测试剂盒及其应用
WO2022002874A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of recurrence and/or death of patients suffering from a solid cancer after preoperative adjuvant therapy and radical surgery
EP4172621A1 (en) 2020-06-30 2023-05-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of recurrence and/or death of patients suffering from a solid cancer after preoperative adjuvant therapies
US20220062898A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Leica Microsystems Cms Gmbh Microfluidic Device for Image Multiplexing
JP2024512567A (ja) 2021-03-23 2024-03-19 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） Ｔ細胞リンパ腫の診断および治療方法
WO2022242849A1 (en) * 2021-05-19 2022-11-24 Leica Microsystems Cms Gmbh Method and device for analyzing a biological sample
US12014830B2 (en) * 2021-04-18 2024-06-18 Mary Hitchcock Memorial Hospital, For Itself And On Behalf Of Dartmouth-Hitchcock Clinic System and method for automation of surgical pathology processes using artificial intelligence
US12578344B2 (en) * 2021-08-09 2026-03-17 Neuroquest Ltd. Compositions, kits, and methods for detecting preclinical alzheimer's disease
EP4472740A1 (en) 2022-01-31 2024-12-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd38 as a biomarker and biotarget in t-cell lymphomas
WO2023175366A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Veracyte Methods for predicting response to an immunotherapeutic treatment in a patient with a cancer
JP2025514669A (ja) 2022-04-11 2025-05-09 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル Ｔ細胞悪性腫瘍の診断及び処置のための方法
WO2023198874A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of t cell-lymphomas
WO2024003310A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the diagnosis and treatment of acute lymphoblastic leukemia
EP4558823A1 (en) 2022-07-22 2025-05-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Garp as a biomarker and biotarget in t-cell malignancies
WO2024023283A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lrrc33 as a biomarker and biotarget in cutaneous t-cell lymphomas
WO2024079192A1 (en) 2022-10-12 2024-04-18 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Cd81 as a biomarker and biotarget in t-cell malignancies

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4405720A (en) * 1981-03-04 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Silver stains for protein in gels
GB8405437D0 (en) 1984-03-01 1984-04-04 Amersham Int Plc Detecting polynucleotide sequences
JP3130513B2 (ja) * 1989-04-19 2001-01-31 イビデン株式会社 生体活性物質測定用装置
US5843640A (en) 1992-06-19 1998-12-01 Northwestern University Method of simultaneously detecting amplified nucleic acid sequences and cellular antigens in cells
AU5355594A (en) 1992-10-09 1994-05-09 Oncor, Inc. Methods for the detection of chromosome structural abnormalities by (in situ) hybridization to fixed tissue
CA2167804A1 (en) 1993-07-20 1995-02-02 Robert H. Singer In vivo nucleic acid hybridization method
FR2711671A1 (fr) 1993-10-22 1995-05-05 Centre Nat Rech Scient Procédé de détection et de quantification d'une séquence nucléotidique dans une population cellulaire.
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
DE4421891C2 (de) 1994-06-23 1996-05-15 Helmut Prof Dr Med Feucht Verfahren zum Nachweis von komplementaktivierenden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene
US5571643A (en) * 1994-07-22 1996-11-05 Martin; Mark T. Spectrophotometric quantitation of images in X-ray film and electrophoresis gel bands
DE69535240T2 (de) * 1994-10-28 2007-06-06 Gen-Probe Inc., San Diego Zusammensetzungen und Verfahren für die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung von einer Mehrheit spezifischer Nuklein Säure Sequenzen
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5763152A (en) * 1995-03-31 1998-06-09 Fuji Photo Film Co., Ltd. Silver halide photographic light-sensitive material
EP0801306A1 (en) 1996-04-10 1997-10-15 Becton, Dickinson and Company Method for immunohistochemically quantitating co-localized molecules
DE19709348C2 (de) 1996-05-29 1999-07-01 Schubert Walter Dr Md Automatisches Multi-Epitop-Ligand-Kartierungsverfahren
WO1998002577A1 (en) 1996-07-15 1998-01-22 The Children's Medical Center Corporation Method to co-detect introduced genes and their products
US6735531B2 (en) * 1996-10-07 2004-05-11 Lab Vision Corporation Method and apparatus for automatic tissue staining
DE19717904A1 (de) 1997-04-23 1998-10-29 Diagnostikforschung Inst Säurelabile und enzymatisch spaltbare Farbstoffkonstrukte zur Diagnostik mit Nahinfrarotlicht und zur Therapie
US6068979A (en) * 1998-04-22 2000-05-30 Lumigen, Inc. Simplified sequential chemiluminescent detection
US6083486A (en) 1998-05-14 2000-07-04 The General Hospital Corporation Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes
EP1095161A2 (en) 1998-07-10 2001-05-02 Chromagen, Inc. Novel polycyclic aromatic fluorogenic substrates for hydrolases
DE19835284C2 (de) 1998-08-05 2001-03-01 Tuhh Tech Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur automatischen Fokussierung und Belichtung von Bildaufnahmesystemen
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
ATE489108T1 (de) 1998-10-09 2010-12-15 Vegenics Ltd Flt4 (vegfr-3) als ziel für tumornachweis (imaging) und antitumortherapie
US6087112A (en) * 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US20020044353A1 (en) * 1999-02-10 2002-04-18 Salzman David B. Spintronic optical shutter
AU3567900A (en) 1999-03-30 2000-10-16 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
US6391649B1 (en) * 1999-05-04 2002-05-21 The Rockefeller University Method for the comparative quantitative analysis of proteins and other biological material by isotopic labeling and mass spectroscopy
WO2001023610A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
DE10014685B4 (de) 2000-03-24 2004-07-01 Schubert, Walter, Dr. Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Zielstrukturen
WO2001086296A2 (en) 2000-05-05 2001-11-15 Agilix Corporation Highly multiplexed reporter carrier systems
IL136232A0 (en) 2000-05-18 2001-05-20 Bar Ilan University Res Author Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population
US6545758B1 (en) * 2000-08-17 2003-04-08 Perry Sandstrom Microarray detector and synthesizer
US20030044353A1 (en) 2001-01-05 2003-03-06 Ralph Weissleder Activatable imaging probes
JP2002323416A (ja) 2001-02-20 2002-11-08 Hitachi Ltd 検査容器
WO2002079771A1 (en) 2001-03-30 2002-10-10 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Silver destaining method
US7219016B2 (en) 2001-04-20 2007-05-15 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
US20020173053A1 (en) 2001-04-27 2002-11-21 Bassam Damaj Multiple simultaneous antigen detection by immunohistochemistry
JP3899845B2 (ja) 2001-05-23 2007-03-28 日本光電工業株式会社 染色標本の脱色方法および装置
EP1414954A2 (en) * 2001-07-09 2004-05-06 Kobenhavns Universitet Epsti1, a gene induced by epithelial-stromal interaction in human breast cancer
US20040241688A1 (en) 2001-07-19 2004-12-02 Cuneyt Bukusoglu Human tissue specific drug screening procedure
DE10143757A1 (de) 2001-09-06 2003-03-27 Werner M Methode zur Darstellung von Merkmalen in Geweben
US8323903B2 (en) 2001-10-12 2012-12-04 Life Technologies Corporation Antibody complexes and methods for immunolabeling
WO2003061711A2 (en) 2002-01-16 2003-07-31 Visen Medical, Inc. Chromophore probes for optical imaging
US6731831B2 (en) 2002-02-27 2004-05-04 Xiang Zheng Tu Optical switch array assembly for DNA probe synthesis and detection
US7166478B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-23 Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
US7776195B2 (en) * 2002-05-28 2010-08-17 Autogenomics, Inc. Integrated sample processing platform
JP2004041121A (ja) * 2002-07-12 2004-02-12 Hitachi Ltd アレルギー解析方法及びシステム
AU2003291249A1 (en) 2002-12-18 2004-07-29 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed immunohistochemical assays using molecular tags
US20040241776A1 (en) 2003-05-22 2004-12-02 Agdia, Inc. Multiplex enzyme-linked immunosorbent assay for detecting multiple analytes
JP3936689B2 (ja) * 2003-09-09 2007-06-27 日本碍子株式会社 シアニン系有機色素劣化環境の検知方法
US7463778B2 (en) * 2004-01-30 2008-12-09 Hewlett-Packard Development Company, L.P Motion estimation for compressing multiple view images
JP4538628B2 (ja) 2004-03-16 2010-09-08 学校法人慶應義塾 遺伝子発現検出方法
JP4189495B2 (ja) * 2004-08-02 2008-12-03 国立大学法人群馬大学 ゲノムｄｎａのメチル化検出方法
AU2006259565B2 (en) * 2005-06-15 2011-01-06 Complete Genomics, Inc. Single molecule arrays for genetic and chemical analysis
JP2007033159A (ja) * 2005-07-25 2007-02-08 Assay Corp 蛍光分子で標識された測定対象物質
JPWO2007055302A1 (ja) * 2005-11-10 2009-04-30 国立大学法人富山大学 生体物質と生体物質結合性物質との結合性評価方法
US7741045B2 (en) * 2006-11-16 2010-06-22 General Electric Company Sequential analysis of biological samples
US8305579B2 (en) * 2006-11-16 2012-11-06 Thomas Pirrie Treynor Sequential analysis of biological samples
US7629125B2 (en) * 2006-11-16 2009-12-08 General Electric Company Sequential analysis of biological samples

Also Published As

Publication number Publication date
EP2383574A2 (en) 2011-11-02
PT2082239E (pt) 2011-12-22
ATE524742T1 (de) 2011-09-15
US8822147B2 (en) 2014-09-02
US20080118944A1 (en) 2008-05-22
ATE524736T1 (de) 2011-09-15
US20120231967A1 (en) 2012-09-13
EP2082239B1 (en) 2011-09-14
PT2082230E (pt) 2011-11-28
US9518982B2 (en) 2016-12-13
CA2669317A1 (en) 2008-11-06
JP5123314B2 (ja) 2013-01-23
PL2082239T3 (pl) 2012-02-29
AU2007352364B2 (en) 2013-03-28
WO2008133727A2 (en) 2008-11-06
US20100047925A1 (en) 2010-02-25
CA2669317C (en) 2015-04-28
US20080118916A1 (en) 2008-05-22
WO2008133729A2 (en) 2008-11-06
ES2371290T3 (es) 2011-12-29
US7629125B2 (en) 2009-12-08
EP2082230A2 (en) 2009-07-29
PL2082230T3 (pl) 2012-02-29
WO2008133727A3 (en) 2009-01-22
DK2082230T3 (da) 2011-12-05
WO2008133729A3 (en) 2009-01-08
EP2082230B1 (en) 2011-09-14
ES2371507T3 (es) 2012-01-04
EP2082239A2 (en) 2009-07-29
EP2383574A3 (en) 2011-11-30
US7741046B2 (en) 2010-06-22
AU2007352364A1 (en) 2008-11-06
EP2383574B1 (en) 2015-08-19
DK2082239T3 (da) 2011-12-19
US20140045251A1 (en) 2014-02-13
JP2010510492A (ja) 2010-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2371290T3 (es) Análisis secuencial de muestras biológicas.
ES2378411T3 (es) Análisis secuencial de muestras biológicas con blanqueo intermedio de detector de fluorescencia
ES2459725T3 (es) Análisis secuencial de muestras biológicas
JP6148682B2 (ja) 色素の光活性化型化学退色