ES2371900A1 - Procedimiento para aumentar o disminuir el desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una planta leñosa. - Google Patents
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Abstract
La presente invención consiste en una aplicación biotecnológica del gen RAV1 (Related to ABI3 and Viviparous 1) y su homólogo RAV2 en relación a su capacidad, cuando se modifican sus niveles de expresión o bien la actividad de las proteínas que codifican, para incrementar o disminuir el desarrollo de ramas silépticas y/o prolépticas en especies leñosas. Mediante la modificación de la expresión de dichos genes es posible aumentar la producción de biomasa de una plantación de especies leñosas, o bien reducir el número de nudos en el tronco de especies leñosas de interés maderero.
Description
Procedimiento para aumentar o disminuir el
desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una planta
leñosa.
La invención se encuadra en los sectores
técnicos de la biotecnología y la explotación forestal con
finalidades energéticas, químicas o madereras.
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Las plantaciones en turnos cortos (Short
Rotation Forestry, SRF) de especies forestales de crecimiento
rápido bajo un sistema de manejo intensivo representan una de las
fuentes de biomasa más interesantes. Las principales especies
explotadas con este modelo son el chopo (Populus spp.), el
eucalipto (Eucalyptus spp.) o el sauce (Salix spp.),
con un turno de tala entre los 2 y 10 años. Por un lado, la biomasa
lignocelulósica es apta para producir biocarburantes en forma de
combustibles líquidos o gaseosos para el transporte, y biolíquidos o
combustibles líquidos destinados a usos energéticos distintos del
transporte, como la producción de electricidad o calor. Por otro
lado, este tipo de plantaciones forestales pueden establecerse en
terrenos marginales o agrícolas excedentarios, por lo que no
compiten de un modo directo con el cultivo alimentario por los
suelos fértiles. Sin embargo, su rendimiento con fines
bioenergéticos sigue siendo objeto de mejora, ya que es todavía un
factor limitante importante que las aleja de ser económica y
comercialmente viables.
El rendimiento de biomasa lignocelulósica es un
rasgo genético altamente complejo. Constituye el resultado integrado
y combinado de otros tantos rasgos complejos, cada uno de ellos
controlado a su vez por varios genes. Entre estos rasgos se
encuentran, por ejemplo, la altura del árbol, el diámetro del
tronco, el número y área de las hojas o el número de ramas. En los
últimos años, algunos equipos de investigación han abordado el
problema a través de la identificación de las regiones genómicas
implicadas en la regulación de estos rasgos en especies leñosas
mediante el mapeo de QTL (Quantitative Trait Loci). En este
sentido, el trabajo de Rae et al. (Five QTL hotspots for
yield in short rotation coppice bioenergy poplar: the Poplar Biomass
Loci. BMC Plant Biology 2009, vol. 9, p. 23) realizado con
una familia de 320 genotipos del híbrido Populus trichocarpa x P.
deltoides cultivados en turnos cortos resulta especialmente
interesante. En este trabajo se identifican cinco QTLs responsables
del 20% de la variación entre estos genotipos en cuanto al
rendimiento de biomasa. Además se describen las correlaciones
positivas existentes entre diámetro y área basales de tallos y ramas
a partir del primer año y su rendimiento de biomasa en ese año y en
los años siguientes hasta cinco, y entre el número de ramas
silépticas que crecen en el primer año y el diámetro y área basales
de tallos y ramas a partir del primer año. En la mayoría de especies
leñosas en latitudes templadas, las yemas laterales no brotan
durante la misma estación en que se forman. Estas yemas, las
prolépticas, deben pasar el invierno para poder brotar y formar
ramas en la siguiente primavera. Las yemas silépticas, en cambio,
que aparecen sobre todo durante la etapa juvenil del árbol, no
necesitan de los fríos invernales para su desarrollo en ramas.
Por lo tanto la ramificación siléptica no solo
incrementa significativamente el crecimiento general del chopo,
sobre todo durante los primeros años, sino que también se perfila
como un rasgo valioso que permite predecir tempranamente el
rendimiento final de biomasa de una plantación.
El gen RAV1 (Related to ABI3 and
Viviparous 1) pertenece a la familia de factores de
transcripción RAV, caracterizada por la presencia en su estructura
primaria de los dominios de unión a DNA AP2/EREBP (Apetala2/Ethylene
Response Element Binding Factor) y B3 (Kagaya et al., RAV1, a
novel DNA-binding protein, binds to bipartite
recognition sequence through two distinct
DNA-binding domains uniquely found in higher plants.
Nucleic acids research 1999, vol. 27, p.
470-478; Yamasaki et al., Solution structure
of the B3 DNA binding domain of the Arabidopsis
cold-responsive transcription factor RAV1. The
plant cell 2004, vol. 16, p. 3448-3459). Según
la literatura, en la planta herbácea Arabidopsis thaliana los
genes RAV1 (AtRAV1; AT1G13260) y RAV2
(AtRAV2/TEM2; AT1G68840) estarían implicados en la respuesta
al frío independiente de ácido abscísico (Sakuma et al.,
DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of
Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration-
and cold-inducible gene expression. Biochemical
and biophysical research communications 2002, vol. 290, p.
998-1009) y en la respuesta a otros estímulos
externos como los mecánicos (Kagaya and Hattori, Arabidopsis
transcription factors, RAV1 and RAV2, are regulated by
touch-related stimuli in a
dose-dependent and biphasic manner. Genes and
genetic systems 2009, vol. 84, p. 95-99).
AtRAV1 actuaría además como regulador negativo en el
desarrollo de raíces laterales y hojas de la roseta así como, junto
con los genes TEMPRANILLO1 (TEM1; AT1G25560) y
AtRAV2/TEM2, en el tiempo de floración (Hu et al.,
Arabidopsis RAV1 is down-regulated by
brassinosteroid and may act as a negative regulator during plant
development. Cell research 2004, vol. 61, p.
3947-3947; Castillejo and Pelaz, The balance between
CONSTANS and TEMPRANILLO activities determines FT expression to
trigger flowering. Current biology 2008, vol. 18, p.
1338-1343). También se ha descrito a AtRAV1
como regulador positivo en el proceso de senescencia de las hojas
(Woo et al., The RAV1 transcription factor positively
regulates leaf senescence in Arabidopsis. Journal of experimental
botany 2010, vol. 61, p. 3947-3957). Por otro
lado en tomate (Solanum lycopersicum), el gen RAV2
modula la respuesta de defensa a la bacteria patógena Ralstonia
solanacearum (Li et al., Tomato RAV transcription factor
is a pivotal modulator involved in the
AP2/EREBP-mediated defense pathway. Plant
Physiology 2011, vol. 156, p. 213-227). En estos
trabajos se ha relacionado la función de los genes AtRAV1 (Hu
et al., 2004), TEM1 y AtRAV2/TEM2 (Castillejo
and Pelaz, 2008) de A. thaliana con el control de aspectos
del crecimiento y el desarrollo distintos a la regulación de la
ramificación, ya que la manipulación de su expresión en esta especie
herbácea no causa un mayor número de ramas. Sin embargo, ninguna de
estas publicaciones del arte relaciona el gen RAV1 con la regulación
del desarrollo de la ramificación en ninguna especie leñosa.
La solicitud WO 2006/132616 A1 describe la
función reguladora de los genes RAV1 y RAV2 en el
silenciamiento génico en plantas. Esta patente tiene un interés
genérico en la tecnología de la manipulación genética de plantas,
pero no se relaciona su objeto de protección con los procesos del
desarrollo controlados por dichos genes RAV ni con la
productividad vegetal.
Por otra parte, la supresión de la expresión de
los genes RAV1 y RAV2 debería inhibir la aparición de
ramas y ocasionar un número menor de nudos en el tronco del árbol,
con lo que se obtendrían maderas de alta calidad. La inhibición de
ramificación siléptica y/o proléptica se revela así como una posible
herramienta de gran valor
comercial.
comercial.
El problema que se plantea entonces en la
técnica es conseguir de forma eficaz una modificación de la cantidad
o calidad de la producción de madera de una planta leñosa, según se
necesite, para incrementar el beneficio de sus productos derivados.
La solución que propone la presente invención es modificar por
procedimientos técnicos la expresión de los genes RAV1 y
RAV2 en dicha planta leñosa e influir así en su producción de
ramificación siléptica y/o proléptica.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención describe una modificación
genética aplicable a especies leñosas que permite modificar el
desarrollo de ramas silépticas desde muy temprana edad de las
plantas.
Consiste en una aplicación biotecnológica del
gen RAV1 (Related to ABI3 and Viviparous 1) y su
homólogo RAV2 en relación a su capacidad, cuando se modifican
sus niveles de expresión, o bien la actividad de las proteínas
codificadas por ellos, para aumentar o disminuir el grado de
desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una especie
leñosa.
Una primera realización de la invención es, por
tanto, un procedimiento para aumentar o disminuir el desarrollo de
ramificación siléptica y/o proléptica en una planta leñosa respecto
a su variedad silvestre, que comprende modificar la expresión de los
genes RAV1 y/o RAV2, o de sus derivados funcionales.
Esta modificación de la expresión se puede producir en la planta
completa o bien específicamente en un tejido u órgano, y puede ser
permanente o temporal.
En el ámbito de la presente solicitud se
entiende por "expresión de un gen" el producto proteico
resultado del conjunto de mecanismos que efectúan la decodificación
de la información contenida en dicho gen procesada mediante
transcripción, traducción y modificaciones postraduccionales a la
forma final de la proteína.
Los inventores han observado que, al expresar la
región codificante del gen RAV1, aislada de Castanea
sativa Miller (CsRAV1) bajo el control de un promotor
constitutivo en el híbrido Populus tremula x P. alba (clon
INRA 717 1-B4), todos los individuos de los diez
eventos de transformación que han analizado desarrollan en un breve
periodo de tiempo ramas silépticas a partir de las yemas laterales.
Este periodo de tiempo es de aproximadamente un mes tras su
trasplante a tierra desde cultivo in vitro. El desarrollo
descrito no se produce, en cambio, en los chopos control sin
transformar de tipo silvestre (WT,
wild-type). De esta observación se deduce que la
sobreexpresión continuada del gen CsRAV1 es responsable de la
formación temprana de ramas silépticas en el chopo.
Por otro lado, dada la alta identidad de
secuencia existente entre las proteínas RAV1 y RAV2 de
Populus trichocarpa (91,9%) y, por lo tanto, su
posible redundancia funcional, el aumento de la expresión de un gen
RAV2 podría tener un efecto similar sobre la ramificación que
la sobreexpresión de CsRAV1.
El genoma del género Populus y en
concreto de la especie P. trichocarpa, cuya secuencia se
conoce y es de libre acceso a través de las bases de datos públicas
NCBI o Phytozome, contiene cinco genes que codifican factores de
transcripción RAV, dos de los cuales, a los que se han denominado
PtRAV1 y PtRAV2, son homólogos a los genes AtRAV1,
AtRAV2/TEM2 y TEM1 arriba mencionados. Otras especies
leñosas como Eucalyptus grandis, Vitis vinifera, Citrus
clementina, C. sinensis o Prunus persica, cuyas
secuencias genómicas están disponibles en las bases de datos
públicas, también contienen genes homólogos a PtRAV1, PtRAV2,
AtRAV1, AtRAV2/TEM2 y TEM1.
Estos son ejemplos de polinucleótidos
procedentes de otras especies vegetales que comparten un origen
evolutivo común con CsRAV1, es decir, polinucleótidos
homólogos a CsRAV1 que codifican proteínas con funciones
total o parcialmente iguales o equivalentes y que también podrían
ser utilizados en su totalidad o en parte en el procedimiento de la
invención. Así, un nuevo aspecto de la invención se refiere a las
secuencias nucleotídicas de otros genes que codifican polipéptidos
que, al igual que CsRAV1, contienen simultáneamente los dominios AP2
y B3 (Kagaya et al., RAV1, a novel
DNA-binding protein, binds to bipartite recognition
sequence through two distinct DNA-binding domains
uniquely found in higher plants. Nucleic acids research 1999,
vol. 27, p. 470-478). La identificación de los
dominios AP2 y B3 se realizará mediante aplicaciones bioinformáticas
tales como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul et
al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new
generation of protein database search programs. Nucleic Acid
Research 1997, vol. 25, p. 3389-3402) o
Conserved Domain Database (CCD; Marchler-Bauer et
al., CDD: a Conserved Domain Database for the functional
annotation of proteins. Nucleic Acid Research 2011, vol. 39,
p. D225-D229).
El primer aspecto de la invención es una
herramienta para incrementar la producción de biomasa de una
plantación forestal modificada genéticamente de este modo, cuya
aplicación biotecnológica presenta gran interés en diversos sectores
industriales.
De forma que una realización es el procedimiento
de la invención, en que dicha modificación de la expresión de
RAV1 y/o RAV2 es una sobreexpresión. Dicha
sobreexpresión comprende preferiblemente la introducción de una
construcción génica en la planta. En una realización más preferible,
dicha construcción génica comprende la fusión a un promotor de un
gen que codifica un polipéptido que contiene simultáneamente los
dominios AP2 y B3, o su derivado funcional; preferiblemente dicho
gen es RAV1 y/o RAV2 y más preferiblemente es
CsRAV1. En otra realización preferible, el promotor utilizado
es un promotor constitutivo, preferiblemente CaMV35S, cauliflower
mosaic virus 35S, o su derivado funcional. En otra realización
preferible, dicho promotor es un promotor inducible. Otra
realización complementaria a las anteriores es que dicho promotor
sea un promotor específico de tejido u órgano.
Otra realización de la invención es el gen
CsRAV1 aislado de Castanea sativa Miller, que regula la
producción siléptica y proléptica de la especie, y está identificado
por la SEQ ID NO:1. Esta SEQ ID NO:1 tal cual reportada incluye una
región 5' no traducida previa al codon iniciador, de forma que una
realización preferible es el CsRAV1 identificado por una secuencia
con al menos un 91,7% de identidad respecto a SEQ ID NO:1. Otra
realización preferible es la proteína obtenida en la expresión de
CsRAV1 identificada por la SEQ ID NO: 2. El gen y la proteína
resultante se pueden utilizar en su totalidad o en parte en los
procedimientos de la presente invención.
Otra realización preferible más es un vector de
expresión que comprende el gen CsRAV1 y el promotor CaMV35S,
o sus derivados funcionales. Otra realización muy preferible es una
planta leñosa con al menos un polinucleótido codificante de CsRAV1,
o sus análogos funcionales, integrado de forma estable en el genoma
de las células.
Otra realización de la invención es el
procedimiento de la invención en que dicha sobreexpresión se obtiene
por al menos una mutación o una inserción de T-DNA
en un gen que codifica un polipéptido que contiene simultáneamente
los dominios AP2 y B3, preferiblemente dicho gen es RAV1 y/o
RAV2, o sus derivados funcionales.
En sentido inverso, una disminución de la
expresión del gen RAV1 en una especie leñosa en la que la
ramificación siléptica fuera frecuente debe dar lugar a la reducción
de la misma, o bien a la reducción de la ramificación proléptica al
año siguiente.
Este segundo aspecto de la presente invención
incluye no solo la reducción individual de la expresión de los genes
RAV1 o RAV2 sino que puede incluir la reducción
conjunta de la expresión de ambos genes. Es decir, reduciría la
ramificación siléptica y/o proléptica en una especie leñosa gracias
a la disminución de la expresión de los genes RAV1 y/o
RAV2 por técnicas de silenciamiento génico, a través de la
producción endógena de anticuerpos específicos contra las proteínas
RAV1 y/o RAV2 o bien mediante la introducción de mutaciones o
inserciones de T-DNA.
Según lo anterior, otra realización es el
procedimiento de la invención en que dicha modificación de la
expresión de RAV1 y/o RAV2 es una disminución de la
expresión.
Preferiblemente, esta disminución de la
expresión comprende silenciamiento génico, más preferiblemente por
RNAs de interferencia, microRNAs o mensajeros antisentido. Otra
realización más es que dicha disminución comprenda la introducción
de una construcción génica a la planta, y preferiblemente que dicha
construcción génica comprenda la fusión a un promotor de un gen que
codifica un polipéptido que contiene simultáneamente los dominios
AP2 y B3, o su derivado funcional. Dicho gen es preferiblemente
RAV1 y/o RAV2. Una realización más preferible es que
dicho promotor sea un promotor constitutivo, preferiblemente
CaMV35S, cauliflower mosaic virus 35S, o su derivado
funcional. Otra realización preferible es que dicho promotor sea
inducible. Otra realización complementaria a las anteriores, es que
el promotor sea un promotor específico de tejido u órgano.
Otra realización preferible de la invención es
que esta disminución de la expresión comprenda la producción
endógena de al menos un anticuerpo específico contra una proteína
que contenga simultáneamente los dominios AP2 y B3; preferiblemente
dicha proteína es RAV1 y/o RAV2.
Otra realización preferible es que esta
disminución de la expresión comprenda al menos una mutación o una
inserción de T-DNA en un gen que codifica un
polipéptido que contiene simultáneamente los dominios AP2 y B3;
preferiblemente dicho gen es RAV1 y/o RAV2 o sus derivados
funcionales.
Este segundo aspecto de la invención supone una
herramienta para reducir el número de nudos en el tronco en especies
leñosas de interés maderero modificadas genéticamente de este
modo.
Las técnicas para la obtención de construcciones
y plantas transgénicas, así como el manejo de las herramientas
bioinformáticas de análisis a las que se hace referencia en la
presente solicitud pertenecen al ámbito de la ingeniería genética,
el cultivo in vitro y la bioinformática y son ampliamente
conocidas por los expertos en la materia.
La modificación genética de la invención, ya sea
en un sentido o en otro, es potencialmente aplicable a cualquier
genotipo de una especie leñosa, por lo que permite aprovechar las
características adaptativas de dicho genotipo a un determinado
hábitat.
La presente invención tiene aplicaciones, por
tanto, en diversos sectores industriales. El incremento del
rendimiento de biomasa de plantaciones forestales en turnos cortos
puede tener interés para la industria energética interesada en la
utilización de biomasa para la producción de biocombustibles, para
la industria química interesada en la elaboración de productos
químicos a partir de esta biomasa, así como para las industrias
selvícolas e industrias del papel.
De forma que una realización más de la invención
es una célula de planta leñosa con la expresión de RAV1 y/o RAV2
modificada. Una realización preferible más es una planta leñosa
transgénica con la expresión de RAV1 y/o RAV2 modificada. Otra
realización es el producto vegetal obtenido a partir de esa planta
leñosa transgénica, preferiblemente un biolíquido y más
preferiblemente un biocarburante.
Por otra parte, la reducción de la ramificación
siléptica y/o proléptica y, por lo tanto, del número de nudos en el
tronco de una especie leñosa también puede tener interés para las
industrias selvícolas y madereras interesadas en el aprovechamiento
forestal maderable.
Así, otra realización muy preferible es la
madera obtenida a partir de una planta leñosa transgénica con la
expresión de RAV1 y/o RAV2 modificada.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Abundancia relativa del transgén
CsRAV1 en diez transformantes independientes del híbrido
Populus tremula x P. alba (clon INRA 717
1-B4). Los transformantes independientes, o eventos,
se designan como CsRAV1 OE (overexpressor) seguido del
símbolo # y un número. Los valores representan el promedio de tres
réplicas técnicas \pmSD (desviación estándar).
Figura 2: Imágenes de (A) el evento CsRAV1 OE
#59 de la figura 1 de Populus tremula x P. alba (clon INRA
717 1-B4), donde se aprecia el desarrollo de ramas
silépticas a partir de las yemas laterales, señaladas con flechas,
acompañada de una imagen general de dicho evento; y (B) un individuo
Populus tremula x P. alba (clon INRA 717
1-B4) de tipo silvestre en el que no se produce este
desarrollo. Las plantas tienen una edad de 35 días, contados desde
el trasplante a tierra a partir del cultivo in vitro.
Figura 3: Abundancia relativa de los genes
PtaRAV1 (barras con rayas diagonales) y PtaRAV2
(barras con rayas horizontales) en ocho transformantes
independientes del híbrido Populus tremula x P. alba (clon
INRA 717 1-B4). Los transformantes independientes, o
eventos, se designan como PtaRAV1&2 KD
(knock-down) seguido del símbolo # y un
número. Los valores representan el promedio de tres réplicas
técnicas \pmSD (desviación estándar).
\vskip1.000000\baselineskip
Con la intención de mostrar la presente
invención de un modo ilustrativo aunque en ningún modo limitante, se
aportan los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
La región codificante del gen RAV1,
aislada a partir de tallos de Castanea sativa Miller
(CsRAV1) se clonó en el vector binario pGWB2 (Nakagawa et
al., Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for
realizing efficient construction of fusión genes for plant
transformation. Journal of bioscience and bioengineering
2007, vol. 104, p. 34-41) portador del promotor
constitutivo CaMV35S (cauliflower mosaic virus 35S). Esta
construcción se utilizó para transformar vía infección con
Agrobacterium tumefaciens (cepa GV3101/pMP90), explantos
obtenidos de plántulas jóvenes de 4 semanas cultivadas in
vitro del híbrido Populus tremula x P. alba (clon INRA
717 1-B4). En todos los pasos de cultivo in
vitro los medios se prepararon con 1X Murashige & Skoog 1B
(Duchefa), 2% sacarosa (Merck), 0,7 o 0,8% agar (explantos y callos
o brotes y plántulas, respectivamente; BD Bacto), y se ajustaron a
pH 5,8 con 0,1 N de hidróxido de sodio. Tras dos días de cultivo en
un medio suplementado con 0,01 mg/L tidiazurón
(Sigma-Aldrich) y 1 mg/L ácido
2,4-diclorofenoxiacético
(Sigma-Aldrich) para inducir la desdiferenciación
celular en estos explantos, se infectaron sumergiéndolos durante 15
minutos en un cultivo 2YT (16 g/L triptona BD Bacto, 10 g/L extracto
de levadura BD Bacto, 5 g/L cloruro de sodio Merck) de A.
tumefaciens con una densidad óptica de 0,05 (\lambda=660). Los
explantos así infectados siguieron cultivándose en el mismo medio
durante dos días más. A continuación, se transfirieron a un medio
suplementado con 0,02 mg/L tidiazurón, 1 mg/L ácido
2,4-diclorofenoxiacético, 50 mg/L kanamicina sulfato
(Roche), 20 mg/L higromicina B (Duchefa) y 250 mg/L cefotaxima
(Duchefa), y se cultivaron hasta obtener callos de un tamaño de 0,5
cm^{3}. Estos callos se transfirieron entonces a un medio
suplementado con 0,004 mg/L tidiazurón, 0,05 mg/L ácido
naftalenacético (Sigma-Aldrich), 50 mg/L kanamicina
sulfato, 20 mg/L higromicina B y 250 mg/L cefotaxima para que sus
células reiniciaran la diferenciación y se desarrollaran en brotes.
Por último, cuando estos brotes alcanzaron una altura de 1 cm, se
diseccionaron y se enraizaron en un medio suplementado con 0,5 mg/L
ácido indolacético (Sigma-Aldrich), 50 mg/L
kanamicina sulfato, 20 mg/L higromicina B y 125 mg/L cefotaxima para
generar plántulas de chopo completas. Una vez analizadas, se
seleccionaron las plántulas que expresaban el transgén (Figura 1),
se trasplantaron a tierra y se cultivaron en invernadero en
condiciones de día largo, 16 horas de luz por 8 horas oscuridad, a
una temperatura de 20\pm2ºC. En estas condiciones y en el periodo
de entre 30 y 40 días, cuando las plantas alcanzaron una altura de
entre 30 y 40 cm, empezaron a desarrollar ramificación siléptica. No
lo hicieron en cambio, las plantas control no transgénicas (Figura
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de transferirlas a tierra, las plántulas
del Ejemplo 1 se analizaron mediante PCR cuantitativa a tiempo real
(qRT-PCR) para detectar y cuantificar la expresión
del transgén integrado en su genoma nuclear y descartar aquellos
eventos en los que el transgén no se expresara. Los métodos
empleados para la extracción de RNA total, para la síntesis de cDNA,
así como la composición y las condiciones en que se realizaron las
reacciones de qRT-PCR se detallan en Ibañez et
al., Overall alteration of circadian clock gene expression in
the chestnut cold response. PLoS ONE 2008, vol. 3, e3567
(doi: 10.1371/journal.pone.0003567). El RNA usado para llevar
a cabo dicho análisis se obtuvo de hojas de plantas jóvenes de 2
meses cultivadas in vitro. Los cebadores usados para detectar
la expresión de CsRAV1 fueron los identificados por las SEQ
ID NO:3 y SEQ ID NO:4. El análisis de la abundancia relativa del
transgén CsRAV1 en individuos de tipo silvestre representa el
control negativo. Se utilizó como referencia el RNA ribosómico 18S
usando los cebadores identificados por las SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6
descritos en Bohlenius et al. (CO/FT regulatory module
controls timing of flowering and seasonal growth cessation in trees.
Science 2006, vol. 312, p. 1040-1043).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objeto de disminuir la expresión de los
genes RAV1 y RAV2, se generó una construcción RNA de
interferencia en horquilla (hpiRNA) a partir de la secuencia
de RAV1 de Populus alba -homólogo al gen
CsRAV1- en el vector binario pHELLSGATE12 (Helliwell and
Waterhouse, Constructs and methods for
high-throughput gene silencing in plants.
Methods 2003, vol. 30, p. 289-295), portador
del promotor constitutivo CaMV35S. Concretamente, para realizar esta
construcción se utilizó la región comprendida entre los dominios de
unión a DNA AP2/EREBP y B3 del gen RAV1 de P. alba,
cuya secuencia se especifica en la SEQ ID NO:7. Dado el elevado
grado de homología global existente entre las secuencias de DNA
codificantes de los genes RAV1 (NCBI Reference Sequence
XM_002315922.1) y RAV2 (XM_002311402.1) de P.
trichocarpa (91,1%), la construcción se diseñó para silenciar la
expresión conjunta de los genes endógenos RAV1 y RAV2
y evitar así un posible efecto parcial sobre la inhibición en el
desarrollo de ramas. Esta construcción se utilizó para transformar
vía infección con Agrobacterium tumefaciens (cepa
GV3101/pMP90), explantos obtenidos de plántulas jóvenes de 4 semanas
cultivadas in vitro del híbrido Populus tremula x P.
alba (clon INRA 717 1-B4). En todos los pasos de
cultivo in vitro los medios se prepararon con 1X Murashige
& Skoog 1B (Duchefa), 2% sacarosa (Merck), 0,7 ó 0,8% agar
(explantos y callos o brotes y plántulas, respectivamente; BD
Bacto), y se ajustaron a pH 5,8 con 0,1 N de hidróxido de sodio.
Tras dos días de cultivo en un medio suplementado con 0,01 mg/L
tidiazurón (Sigma-Aldrich) y 1 mg/L ácido
2,4-diclorofenoxiacético
(Sigma-Aldrich) para inducir la desdiferenciación
celular en estos explantos, se infectaron sumergiéndolos durante 15
minutos en un cultivo 2YT (16 g/L triptona BD Bacto, 10 g/L extracto
de levadura BD Bacto, 5 g/L cloruro de sodio Merck) de A.
tumefaciens con una densidad óptica de 0,05 (\lambda=660). Los
explantos así infectados siguieron cultivándose en el mismo medio
durante dos días más. A continuación, se transfirieron a un medio
suplementado con 0,02 mg/L tidiazurón, 1 mg/L ácido
2,4-diclorofenoxiacético, 50 mg/L kanamicina sulfato
(Roche), 20 mg/L higromicina B (Duchefa) y 250 mg/L cefotaxima
(Duchefa), y se cultivaron hasta obtener callos de un tamaño de 0,5
cm^{3}. Estos callos se transfirieron entonces a un medio
suplementado con 0,004 mg/L tidiazurón, 0,05 mg/L ácido
naftalenacético (Sigma-Aldrich), 50 mg/L kanamicina
sulfato, 20 mg/L higromicina B y 250 mg/L cefotaxima para que sus
células reiniciaran la diferenciación y se desarrollaran en brotes.
Por último, cuando estos brotes alcanzaron una altura de 1 cm, se
diseccionaron y se enraizaron en un medio suplementado con 0,5 mg/L
ácido indolacético (Sigma-Aldrich), 50 mg/L
kanamicina sulfato, 20 mg/L higromicina B y 125 mg/L cefotaxima para
generar plántulas de chopo completas. Una vez analizadas, se
seleccionaron las plántulas en las que la expresión de los genes
endógenos PtaRAV1 y PtaRAV2 se hubiera visto
disminuida respecto a la expresión de dichos genes en las plántulas
de tipo silvestre (Figura 3). Estas plántulas se trasplantaron a
tierra y se cultivaron en invernadero en condiciones de día largo,
16 horas de luz por 8 horas oscuridad, y a una temperatura de
20\pm2ºC. Los resultados de la ramificación proléptica están por
obtener tras el invierno 2011-2012. La hipótesis
lógica es que estas plantas deben desarrollar un número menor de
ramas y, por tanto, el número de nudos en la madera obtenida a
partir de sus tallos será también menor incrementando así el valor
comercial de la madera.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de transferirlas a tierra, las plántulas
que se obtuvieron en el Ejemplo 3 se analizaron mediante PCR
cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) para
cuantificar la expresión de los genes endógenos PtaRAV1 y
PtaRAV2 y seleccionar aquellas en las que la expresión de los
mismos se hubiera visto disminuida respecto a su expresión en
plántulas silvestres. Los métodos empleados para la extracción de
RNA total, para la síntesis de cDNA, así como la composición y las
condiciones en que se realizaron las reacciones de
qRT-PCR se detallan en Ibáñez et al., Overall
alteration of circadian clock gene expression in the chestnut cold
response. PLoS ONE 2008, vol. 3, e3567 (doi:
10.1371/journal.pone.0003567). El RNA usado para llevar a cabo dicho análisis se obtuvo de hojas de plantas jóvenes de 2 meses cultivadas in vitro, sometidas a una temperatura de 4ºC durante 3 horas. Los cebadores usados para detectar la expresión de PtaRAV1 fueron los identificados con las SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9; para PtaRAV2 los cebadores fueron los identificados con la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:11. El análisis de la abundancia relativa de los genes PtaRAV1 y PtaRAV2 en individuos de tipo silvestre representa el control positivo y el calibrador. Como referencia se utilizó el RNA ribosómico 18S, usando los cebadores identificados por las SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 descritos en Bohlenius et al. (CO/FT regulatory module controls timing of flowering and seasonal growth cessation in trees. Science 2006, vol. 312, p. 1040-1043).
10.1371/journal.pone.0003567). El RNA usado para llevar a cabo dicho análisis se obtuvo de hojas de plantas jóvenes de 2 meses cultivadas in vitro, sometidas a una temperatura de 4ºC durante 3 horas. Los cebadores usados para detectar la expresión de PtaRAV1 fueron los identificados con las SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9; para PtaRAV2 los cebadores fueron los identificados con la SEQ ID NO:10 y la SEQ ID NO:11. El análisis de la abundancia relativa de los genes PtaRAV1 y PtaRAV2 en individuos de tipo silvestre representa el control positivo y el calibrador. Como referencia se utilizó el RNA ribosómico 18S, usando los cebadores identificados por las SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 descritos en Bohlenius et al. (CO/FT regulatory module controls timing of flowering and seasonal growth cessation in trees. Science 2006, vol. 312, p. 1040-1043).
Claims (41)
1. Procedimiento para aumentar o disminuir el
desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una planta
leñosa respecto a su variedad silvestre, que comprende modificar la
expresión de los genes RAV1 y/o RAV2, o de sus
derivados funcionales.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en que dicha modificación se produce en la planta completa.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en que dicha modificación se produce específicamente en un tejido u
órgano.
4. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en que dicha modificación es permanente.
5. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en que dicha modificación es temporal.
6. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en que dicha modificación de la expresión de
RAV1 y/o RAV2 es una sobreexpresión.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en que dicha sobreexpresión comprende la introducción de una
construcción génica en la planta.
8. Un procedimiento según la reivindicación 7,
en que dicha construcción génica comprende la fusión a un promotor
de un gen que codifica un polipéptido que contiene simultáneamente
los dominios AP2 y B3, o su derivado funcional.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en que dicho gen es RAV1 y/o RAV2.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en que dicho gen es CsRAV1.
11. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en que dicho promotor es un promotor
constitutivo.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en que dicho promotor constitutivo es CaMV35S, cauliflower mosaic
virus 35S, o su derivado funcional.
13. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en que dicho promotor es un promotor
inducible.
14. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 13, en que dicho promotor es un promotor
específico de tejido u órgano.
15. El gen CsRAV1 aislado de Castanea sativa
Miller identificado por la SEQ ID NO:1.
16. El CsRAV1 aislado de Castanea sativa
Miller identificado por una secuencia con al menos un 91,7% de
identidad respecto a SEQ ID NO:1.
17. La proteína obtenida en la expresión de
CsRAV1 identificada por la SEQ ID NO: 2.
18. Vector de expresión que comprende el gen
CsRAV1 y el promotor CaMV35S, o sus derivados
funcionales.
19. Planta leñosa con al menos un polinucleótido
codificante de CsRAV1, o sus análogos funcionales, integrado de
forma estable en el genoma de las células.
20. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en que dicha sobreexpresión se obtiene por al menos una mutación o
una inserción de T-DNA en un gen que codifica un
polipéptido que contiene simultáneamente los dominios AP2 y B3.
21. Un procedimiento según la reivindicación 20,
en que dicho gen es RAV1 y/o RAV2, o sus derivados
funcionales.
22. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en que dicha modificación de la expresión de
RAV1 y/o RAV2 es una disminución de la expresión.
23. Un procedimiento según la reivindicación 22,
en que dicha disminución de la expresión comprende silenciamiento
génico.
24. Un procedimiento según la reivindicación 23,
en que dicho silenciamiento génico se obtiene por RNAs de
interferencia, microRNAs o mensajeros antisentido.
25. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, en que dicha disminución comprende la
introducción de una construcción génica a la planta.
26. Un procedimiento según la reivindicación 25,
en que dicha construcción génica comprende la fusión a un promotor
de un gen que codifica un polipéptido que contiene simultáneamente
los dominios AP2 y B3, o su derivado funcional.
27. Un procedimiento según la reivindicación 26,
en que dicho gen es RAV1 y/o RAV2.
28. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones 26 ó 27, en que dicho promotor es un promotor
constitutivo.
29. Un procedimiento según la reivindicación 28,
en que dicho promotor constitutivo es CaMV35S, cauliflower mosaic
virus 35S, o su derivado funcional.
30. Un procedimiento según una de las
reivindicaciones 26 ó 27, en que dicho promotor es inducible.
31. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 26 a 30, en que dicho promotor es un promotor
específico de tejido u órgano.
32. Un procedimiento según la reivindicación 22,
en que dicha disminución comprende la producción endógena de al
menos un anticuerpo específico contra una proteína que contenga
simultáneamente los dominios AP2 y B3.
33. Un procedimiento según la reivindicación 32,
en que dicha proteína es RAV1 y/o RAV2.
34. Un procedimiento según la reivindicación 22,
en que dicha disminución se obtiene por al menos una mutación o una
inserción de T-DNA en un gen que codifica un
polipéptido que contiene simultáneamente los dominios AP2 y B3.
35. Un procedimiento según la reivindicación 34,
en que dicho gen es RAV1 y/o RAV2, o sus derivados
funcionales.
36. Célula de planta leñosa con la expresión de
RAV1 y/o RAV2 modificada.
37. Planta leñosa transgénica con la expresión
de RAV1 y/o RAV2 modificada.
38. Producto vegetal obtenido a partir de una
planta leñosa transgénica con la expresión de RAV1 y/o RAV2
modificada.
39. Un producto vegetal según la reivindicación
38, en que dicho producto vegetal es un biolíquido.
40. Un producto vegetal según la reivindicación
39, en que dicho biolíquido es un biocarburante.
41. Madera obtenida a partir de una planta
leñosa transgénica con la expresión de RAV1 y/o RAV2 modificada.
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| ES201131186A ES2371900B2 (es) | 2011-07-13 | 2011-07-13 | Procedimiento para aumentar o disminuir el desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una planta leñosa. |
| EP12791214.5A EP2733211A2 (en) | 2011-07-13 | 2012-06-26 | Method for increasing or decreasing the development of sylleptic or proleptic branching in a ligneous plant |
| PCT/ES2012/070471 WO2013007848A2 (es) | 2011-07-13 | 2012-06-26 | Procedimiento para aumentar o disminuir el desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una planta leñosa |
| US14/232,538 US20140259229A1 (en) | 2011-07-13 | 2012-06-26 | Method for increasing or decreasing the development of sylleptic or proleptic branching in a ligneous plant |
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|---|---|---|---|
| ES201131186A ES2371900B2 (es) | 2011-07-13 | 2011-07-13 | Procedimiento para aumentar o disminuir el desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una planta leñosa. |
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| ES2371900A1 true ES2371900A1 (es) | 2012-01-11 |
| ES2371900B2 ES2371900B2 (es) | 2012-11-26 |
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| ES201131186A Active ES2371900B2 (es) | 2011-07-13 | 2011-07-13 | Procedimiento para aumentar o disminuir el desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una planta leñosa. |
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| EP (1) | EP2733211A2 (es) |
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| WO2001090343A2 (en) * | 2000-05-22 | 2001-11-29 | Cold Spring Harbor Laboratory | Nucleotide sequences encoding ramosa 1 gene and methods of use for same |
| WO2005001050A2 (en) * | 2003-06-06 | 2005-01-06 | Arborgen, Llc. | Transcription factors |
| WO2006132616A1 (en) * | 2005-06-02 | 2006-12-14 | University Of South Carolina | An endogenous regulator of rna silencing in plants |
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- 2011-07-13 ES ES201131186A patent/ES2371900B2/es active Active
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- 2012-06-26 WO PCT/ES2012/070471 patent/WO2013007848A2/es not_active Ceased
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Also Published As
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