ES2372206A1 - Fitasas truncadas de bifidobacterias y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Fitasas truncadas de Bifidobacterias y sus usos.La presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que consiste en una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia aminoacídica carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana, situada en el extremo carboxi-terminal de la secuencia original, y dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es fitasa. Dicho polinucleótido procede preferiblemente de las cepas Bifidobacterium pseudocatenulatum (en adelante B. pseudocatenulatum) ATCC27919 o de Bifidobacterium longum subsp. infantis (B. longum subsp. infantis) ATCC15697. Además, la presente invención se refiere al uso del polinucleótido, o a cualquiera de los productos descritos en la invención, para reducir el contenido de fitatos de un alimento o para producir mio-inositol trifosfato (InsP3).
Description
Fitasas truncadas de Bifidobacterias y
sus usos.
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la biotecnología y de la alimentación, en concreto, la
presente invención se refiere a fitasas truncadas de
Bifidobacterias, solubles y fácilmente purificables, que
pueden aplicarse a todos los alimentos que comprendan productos
vegetales que posean alto contenido de fitatos, como por ejemplo,
que comprendan cereales y legumbres, tanto para consumo humano como
para consumo animal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos a base de cereales, oleaginosas y
legumbres pueden contener sustancias antinutritivas tales como el
ácido fítico (hexakisfosfato de mio-inositol,
InsP_{6} o Ins(1,2,3,4,5,6)P_{6}) y sus
sales (fitatos), la mayor forma de almacenamiento de fósforo en
semillas y polen (Fretzdorff y Brümmer, 1992. Cereal Chem,
69: 266-270).
El fitato se encuentra como
poli-anión en un amplio intervalo de pH y por
consiguiente posee una alta afinidad por componentes de los
alimentos con cargas positivas, tales como los minerales, elementos
traza y proteínas (Cheryan, 1980. Crit. Rev Food Sci Nutr,
13: 297-335). La mayor preocupación sobre la
presencia de fitatos en la dieta humana y animal es el efecto
negativo sobre la absorción de minerales. Estas sustancias son
capaces de formar complejos insolubles con metales al pH del tracto
gastrointestinal lo que produce la disminución de la
biodisponibilidad de minerales (Erdman, 1979. J Am Oil Chem
Soc, 56: 736-741; Zemel y Shelef, 1982. J
Food Sci, 47: 535-537). Muchas investigaciones
han demostrado que una dieta rica en fitatos causa deficiencia en
zinc, calcio, hierro, magnesio, manganeso y cobre, particularmente
en dietas desequilibradas, en poblaciones de riesgo y en
alimentación animal (Sandberg et al., 1982. J Nut, 48:
185-189; Weaver et al., 1991. J Nut,
121: 1769-1775; Sandberg et al., 1999. Am
J Clin Nut, 70: 240-246). Estudios in
vitro e in vivo indicaron que una desfosforilación
parcial del ácido fítico o fitatos disminuye el efecto negativo en
la absorción de minerales (Sandberg et al., 1989. J Food
Sci, 54: 159-161; Larsson y Sandberg, 1991. J
Cereal Sci, 14: 141-149). Los alimentos
contienen mezclas de diferentes fosfatos de mio-inositol con
diferentes formas isoméricas, las cuales pueden interactuar con
otros componentes de los alimentos y en ciertas condiciones el
tetrafosfato (InsP_{4}) o el trifosfato de
mio-inositol (InsP_{3}) podrían disminuir o
incrementar la absorción de minerales (Shen et al., 1998.
J Nutr Biochem, 9: 298-301; Sandberg et
al, 1999. Am J Clin Nutr, 70:
240-246).
La hidrólisis completa o avanzada del
InsP_{6} en productos alimenticios a base de cereales y
leguminosas disminuye el efecto negativo en la absorción de
minerales y se generan productos de hidrólisis intermedios que
poseen actividad biológica específica en el organismo humano, lo que
podría afectar positivamente la salud. Se ha demostrado que algunos
isómeros de InsP_{3} e InsP_{4} tienen efectos
farmacológicos importantes como anti-inflamatorio,
en prevención de complicaciones diabéticas, implicados en el
crecimiento y diferenciación celular, o la regulación del calcio
intracelular (Shears, 1998, Biochim Biophys Acta, 1436:
49-67; Shi et al., 2006. Subcell
Biochem, 39: 265-292).
Generalmente el fósforo en forma de fitato no
está disponible para los animales monogástricos, es decir, animales
no rumiantes, ya que no disponen de la enzima digestiva fitasa, que
es necesaria para separar el fósforo de la molécula de fitato. Sin
embargo los animales rumiantes pueden asimilar el fósforo del fitato
ya que disponen de microorganismos en el rumen que producen fitasa.
La enzima fitasa tiene la capacidad de romper enlaces en los que el
fósforo está unido a la molécula de fitato y de este modo produce la
liberación del mismo.
Actualmente no existen fitasas para consumo
humano. Están disponibles fitasas comerciales para ser administradas
en la elaboración de piensos de animales monogástricos. Los
productos que actualmente se comercializan son: Natuphos (BASF),
Ronozyme P (Novozymes a/S), Phzyme (Danisco A/S, Diversa), Finase
(AB Enzymes), Allzyme (Alltech).
Aspergillus niger es el microorganismo
que produce la fitasa extracelular más activa. En la actualidad
existen fitasas comerciales disponibles obtenidas por fermentación
de Aspergillus genéticamente modificado (Natuphos, Novo y
Finase) y por extracción del medio de cultivo de Aspergillus
no modificado genéticamente (Allzyme). El uso de fitasas comerciales
podría mejorar la bioaccesibilidad de los minerales de los productos
a base de cereales o leguminosas mediante la eliminación del fitato,
lo cual es una práctica común en alimentación animal. Normalmente
para su producción se emplean cultivos de hongos de
Aspergillus y Trichoderma. Sin embargo, hasta el
momento, las fitasas comerciales no son utilizadas para consumo
humano, ya que no son consideradas de grado alimentario. Además,
muchas fitasas comerciales no son específicas de fitato.
Por tanto, se identifica un problema en el
estado de la técnica que consiste en la necesidad de proveer fitasas
procedentes de microorganismos GRAS/QPS (Generally Regarded as
Safe/Qualified Presumption of Safety). Este problema queda
parcialmente resuelto tal como indican algunas publicaciones que se
refieren al uso de bifidobacterias para la degradación de fitato
(Palacios et al., 2008. Eur. Food Res. Technol., 226:
825-831; Palacios et al. 2008. Food
Microbiol, 25: 169-176, Sanz Penella et
al., 2009. J Agric Food Chem, 57:
10239-10244). Como consecuencia, queda pendiente la
solución completa al problema planteado, de forma eficaz, es decir,
mediante el aislamiento de secuencias que codifiquen para fitasas y
donde estas fitasas presenten una solubilidad aceptable que facilite
su purificación.
\newpage
Esta tarea supondría aportar al estado de la
técnica una herramienta de gran utilidad en la disponibilidad de
fósforo procedente de la molécula de fitato así como el aumento de
la biodisponibilidad de minerales. Para ello es necesario tener en
cuenta que cambios en un sólo aminoácido en una proteína pueden
provocar alteraciones en el plegamiento de la misma que ocasionen la
pérdida de actividad fitasa, por tanto, la consecución de dicha
herramienta tecnológica podría no ser obvia. Hasta la fecha no se ha
descrito ningún gen codificante de un enzima fitasa en cepas de
Bifidobacterium y los genomas secuenciados de
Bifidobacterium no portan genes que codifiquen ninguna
proteína con homología a fitasas conocidas. La búsqueda de proteínas
que presenten distintos dominios fosfatasa en Bifidobacterium
pseudocatenulatum ATCC27919 y Bifidobacterium longum
subsp. infantis ATCC15697 da como resultado multitud de
proteínas hipotéticas. Dos de estos genes (BLON_0263 y
BIFPSEUDO_03792) codificaban proteínas con un dominio histidín
fosfatasa ácida. Estas dos proteínas hubieran quedado en principio
excluidas del análisis, ya que las características de los extractos
de fitasas impuros descritos para Bifidobacterium en
bibliografía indicaron que el pH óptimo de reacción se encontraba
cercano al pH neutro, la reacción tendía a la acumulación de
InsP_{3} y el extracto era más específico de fitatos que
p-nitrofenilfosfato (Haros et al., 2005. FEMS
Microbiol Lett, 247: 231-239; Haros et
al., 2007. Int J Food Microbiol, 117:
76-84; Haros et al., 2009. Int J Food
Microbiol, 135: 7-14).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un
polinucleótido aislado que consiste en una secuencia nucleotídica
que codifica para una secuencia aminoacídica de
Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con
respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, donde dicha
secuencia aminoacídica carece de la secuencia que codifica para la
hélice transmembrana, situada en el extremo
carboxi-terminal de la secuencia original, y dicha
secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es
fitasa. Dicho polinucleótido procede preferiblemente de las cepas
Bifidobacterium pseudocatenulatum (en adelante B.
pseudocatenulatum) ATCC27919 o de Bifidobacterium longum
subsp. infantis (B. longum subsp. infantis)
ATCC15697. La secuencia aminoacídica para la que codifica el
polinucleótido puede tener unida a su extremo
amino-terminal una secuencia que codifica para un
péptido señal. Asimismo, la presente invención también se refiere al
producto de expresión del polinucleótido, a la secuencia
aminoacídica aislada codificada por dicho polinucleótido, al vector
o a la célula que comprende el polinucleótido o a la población
celular que comprende dicha célula. Además, la presente invención se
refiere al uso del polinucleótido o a cualquiera de los productos
descritos para reducir el contenido de fitatos de un alimento o para
producir mio-inositol trifosfato (InsP_{3}), o a
diversos métodos para la producción del polinucleótido.
La presente invención provee un polinucleótido
aislado que codifica para una proteína con actividad fitasa
procedente de bacterias del género Bifidobacterium. Dicha
proteína está truncada y como consecuencia puede purificarse de
forma más eficaz que la proteína original de la que procede ya que
carece de una secuencia que codifica para una hélice transmembrana,
situada en el extremo carboxi-terminal de la
secuencia original. La proteína truncada presenta una serie de
ventajas técnicas relevantes respecto al estado de la técnica, entre
ellas podemos destacar:
- -
- Presenta mayor solubilidad que la proteína original sin modificar.
- -
- Dicha proteína truncada sigue presentando alta especificidad por el fitato a pesar de haber eliminado un fragmento de la misma. El resto de fitasas comerciales no presentan tanta especificidad.
- -
- El polinucleótido que codifica para la proteína truncada se traduce con mayor facilidad en un sistema homólogo o heterólogo como una proteína soluble. Es decir, para un tiempo dado, al emplear un sistema de expresión determinado, se obtendrá más cantidad de proteína con actividad fitasa si se expresa un polinucleótido que codifica para la proteína truncada que si se expresa un polinucleótido que codifica para la proteína original (completa).
- -
- A pesar de que la secuencia nucleotídica es una secuencia rica en nucleótidos G y C, se expresa adecuadamente en E. coli, lo cual permite su obtención de forma dirigida y controlada con vectores optimizados para este sistema de expresión heterólogo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha descrito en el apartado anterior,
hasta la fecha no se ha descrito ningún gen codificante de un enzima
fitasa en cepas de Bifidobacterium. Los inventores de la
presente invención llevaron a cabo la búsqueda de proteínas que
presentasen distintos dominios fosfatasa en Bifidobacterium
pseudocatenulatum ATCC27919 y Bifidobacterium longum
subsp. infantis ATCC15697, obteniendo multitud de proteínas
hipotéticas. Se seleccionaron dos de los genes que codificaban para
dichas proteínas (BLON_0263 y BIFPSEUDO_03792) y sus proteínas se
caracterizaron por tener un dominio histidín fosfatasa ácida. Debido
a que en el estado de la técnica se había sugerido que el pH óptimo
de los extractos de fitasas impuros descritos para
Bifidobacterium se encontraba cercano al pH neutro, las
proteínas seleccionadas por los inventores podrían haber quedado
excluidas por el experto en la materia para solucionar el problema
técnico de la invención. Sin embargo, los resultados obtenidos por
los inventores, mostrados en el apartado correspondiente, muestran
que mediante la selección de dichas enzimas (por la presencia en la
secuencia aminoacídica de dominios putativos de anclaje a la
superficie celular y su localización celular) y gracias al
truncamiento de las mismas, se obtuvieron las proteínas en forma
soluble con actividad fitasa procedentes de Bifidobacterium
pseudocatenulatum ATCC27919 y Bifidobacterium longum
subsp. infantis ATCC15697.
Por otra parte, la proteína procede de
microorganismos considerados GRAS/QPS (Generally Regarded as
Safe/Qualified Presumption of Safety) y utilizados comúnmente
como probióticos en preparados alimenticios. Esto puede facilitar su
inclusión en alimentos en los que la hidrólisis de fitatos y la
formación de nuevos isómeros de fosfatos de mio-inositol
pueda suponer una ventaja a nivel nutricional y de salud.
Por tanto, en la presente invención se provee
una enzima con actividad fitasa altamente específica para el fitato
incluyendo las herramientas necesarias para su purificación,
eliminando parte de la secuencia aminoacídica de dicha proteína.
Dicho truncamiento no supone cambios en la estructura terciaria de
la proteína de modo que se conserva la actividad de la misma.
Así pues, un aspecto de la presente invención se
refiere a un polinucleótido aislado que consiste en una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de
Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con
respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su
longitud, donde dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya
actividad mayoritaria es fitasa. La secuencia aminoacídica carece de
una secuencia que codifica para la hélice transmembrana, situada en
el extremo carboxi-terminal de la secuencia
original. Preferiblemente el polinucleótido aislado consiste en una
secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica
de Bifidobacterium que tiene al menos un 56%, 57%, 58%, 59%,
60%, 61%, 63%, 65%, 67%, 69%, 71%, 73%, 75%, 77%, 79%, 81%, 83%,
85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de
identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en
toda su longitud.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un polinucleótido aislado que consiste en una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de
Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con
respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3, en toda su
longitud, donde dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya
actividad mayoritaria es fitasa. La secuencia aminoacídica carece de
una secuencia que codifica para la hélice transmembrana, situada en
el extremo carboxi-terminal de la secuencia
original. Preferiblemente el polinucleótido aislado consiste en una
secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica
de Bifidobacterium que tiene al menos un 56%, 57%, 58%, 59%,
60%, 61%, 63%, 65%, 67%, 69%, 71%, 73%, 75%, 77%, 79%, 81%, 82%,
83%, 85%, 87%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o
99% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:
3, en toda su longitud.
La secuencia de aminoácidos puede estar
codificada por cualquier secuencia nucleotídica que de lugar a
cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la invención por
medio de la transcripción de la secuencia nucleotídica a un ARN
mensajero y su posterior traducción a la secuencia de aminoácidos.
Debido a que el código genético es degenerado, un mismo aminoácido
puede ser codificado por diferentes codones (tripletes), por ello,
la misma secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas
secuencias de nucleótidos.
El término secuencia original se refiere a la
secuencia aminoacídica de la proteína, sin truncar, es decir, la
secuencia que comprende el péptido que codifica para la hélice
transmembrana, así como el péptido señal correspondiente.
La secuencia aminoacídica codificada por el
polinucleótido de la invención puede presentar variantes. Estas
variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia
aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad de
la proteína. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la
secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en
muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones,
deleciones o adiciones. Dichas sustituciones incluyen, aunque sin
limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido
aspártico (Asp), entre Usina (Lys) y Arginina (Arg), entre
asparagina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina
(Thr), y entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala),
leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (Ile). Las variaciones
pueden ser variaciones existentes en la naturaleza como por ejemplo
variaciones alélicas, o generadas artificialmente como por ejemplo
mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no
provocan modificaciones esenciales en las características o
propiedades esenciales de la proteína.
La proteína adicionalmente puede incluir
secuencias secretoras, secuencias que permitan su purificación como
colas de histidinas, prosecuencias o secuencias que aumenten su
estabilidad durante la producción de la proteína.
El género Bifidobacterium está integrado
por bacterias Gram-positivas, anaeróbicas,
saprofitas de la flora intestinal que residen en el colon, ayudando
en la digestión. Algunas bifidobacterias son usadas como
probióticos. En la presente invención, la secuencia nucleotídica que
codifica para la fitasa se aísla de al menos una cepa seleccionada
de la lista de especies que comprende, pero sin limitarse, B.
adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum,
B. boum, B. breve, B. catenulatum, B. choerinum, B. coryneforme, B.
cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B.
globosum, B. indicum, B. infantis, B. inopinatum, B. lactis, B.
magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudolongum, B. pullorum, B.
ruminantium, B. saeculare, B. subtile, B. suis, B. thermacidophilum,
B. thermophilum. B. pseudocatenulatum o B. longum.
Preferiblemente la secuencia nucleotídica que codifica para la
fitasa se aísla de al menos una cepa de la especie B.
pseudocatenulatum (preferiblemente de la cepa ATCC27919) o B.
longum subsp. infantis (preferiblemente de la cepa
ATCC15697).
SEQ ID NO: 1 corresponde con la secuencia
aminoacídica truncada de la proteína fitasa de B.
pseudocatenulatum ATCC27919. Dicha secuencia carece tanto de la
secuencia aminoacídica que codifica para el péptido señal del
extremo amino-terminal como de la secuencia que
codifica para la hélice transmembrana del extremo
carboxi-terminal.
En la Tabla 1 se ofrecen los porcentajes de
identidad entre diferentes secuencias aminoacídicas de fitasas de
Bifidobacterias, además del género Clavibacter y
Rhodococcus. La expresión "porcentaje (%) de identidad"
entre dos secuencias de aminoácidos, tal como se entiende en la
presente invención, se refiere al número de posiciones aminoacídicas
sobre la longitud total de la secuencia que se compara, donde todos
los aminoácidos en esa posición son idénticos. Como puede
observarse, el porcentaje de identidad de las proteínas de las
bifidobacterias adquiere valores desde el 59% al 83%. La secuencia
más diferente al resto de Bifidobacterias parece ser la de B.
pseudocatenulatum ATCC27919 ya que muestra los porcentajes de
identidad más bajos con respecto a las secuencias aminoacídicas del
resto de cepas del género Bifidobacterium. El porcentaje de
identidad más bajo es el que muestran las secuencias de B.
pseudocatenulatum ATCC27919 y B. longum subsp.
infantis ATCC15697 entre sí, sin embargo, tal como se
demuestra en la presente invención, las dos secuencias muestran
actividad fitasa mayoritaria y las dos proteínas se encuentran más
solubles que la respectiva proteína no truncada (ver el apartado de
ejemplos).
Las cepas de B. pseudocatenulatum
ATCC27919 y B. longum subsp. infantis ATCC15697 han
sido depositadas en otras colecciones de cultivos además de la
American Type Culture Collection (ATCC). Así pues, la cepa de
B. pseudocatenulatum ATCC27919 también se ha depositado en
autoridades de depósito de microorganismos con los números CECT5776;
cepa B1279; AS 1.2277; BCRC (antiguamente CCRC) 15476; CCUG 34989;
CIP 104168; DSM 20438; HAMBI 562; JCM 1200; LMG 10505; CUETM
89-16; CCTM 3069; Scardovi B1279. Por otra parte, la
cepa de B. longum subsp. infantis ATCC15697 también se
ha depositado en autoridades de depósito de microorganismos con los
números CECT 4551; CCRC 14602; CCTM La 3067; CCUG 18368; CCUG 30512;
CIP 64.67; CUETM 89-19; DSM 20088; JCM 1222; LMG
8811; LMG 10499; NCFB 2205; NCTC 11817; Reuter S12.
De esta forma el porcentaje de al menos un 55%
de identidad con respecto a la secuencia amioacídica SEQ ID NO: 1
está justificado, ya que microorganismos de otros géneros tienen una
secuencia con identidades que van desde el 36% al 41% de identidad
con respecto a la secuencia amioacídica SEQ ID NO: 1, porcentaje muy
alejado con respecto a los obtenidos entre cepas de bifidobacterias.
Los porcentajes de identidad se han obtenido mediante el programa
ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2) del Instituto
Europeo de Bioinformática del Laboratorio Europeo de Biología
Molecular. (EMBL-EBI) que permite realizar un
alineamiento de dichas secuencias y asigna dichos porcentajes de
forma automática.
Los números de acceso de las
secuencias citadas en esta tabla son: B. longum subsp.
infantis ATCC15697 (YP_002321769), B.
pseudocatenulatum ATCC27919 (ZP_03743199), B. dentium
ATCC 27678 (EDT45330),
B. longum DJO10A (YP_001955145.1), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382 (YP_001221200.1), Rhodococcus erythropolis PR4 (YP_002763531.1)
B. longum DJO10A (YP_001955145.1), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382 (YP_001221200.1), Rhodococcus erythropolis PR4 (YP_002763531.1)
El porcentaje de identidad de la secuencia
aminoacídica se refiere al número de aminoácidos idénticos en las
posiciones aminoacídicas equivalentes de la longitud total de la
secuencia de la presente invención que se compara, es decir, en toda
su longitud.
La "hélice transmembrana" o hélice de
membrana se refiere a la secuencia aminoacídica que constituye uno o
varios segmentos apolares que se encuentran embebidos en la bicapa
lipídica de la membrana celular. Estos segmentos apolares están
constituidos por una o varias hélices \alpha, que constituye el
principal motivo de estructura secundaria de la proteína.
Dicha secuencia se caracteriza porque carece de
una secuencia que codifica para la hélice transmembrana, situada en
el extremo carboxi-terminal de la secuencia original
sin truncar. El péptido que codifica para la hélice transmembrana
tiene la función de fijar la proteína fitasa original a la membrana
celular, provocando su insolubilidad y por tanto la dificultad de
ser purificada. Además, dicha proteína, a pesar de estar truncada,
conserva su actividad enzimática fitasa y su alta especificidad por
el fitato.
La enzima también presenta actividad fosfatasa,
sin embargo, esta actividad es minoritaria. La actividad fitasa y
fosfatasa de las enzimas se puede determinar por medio de la medida
de la especificidad de las mismas por determinados sustratos (ver
tabla 6). Para determinar la "actividad mayoritaria fitasa" de
la enzima de la presente invención se puede usar cualquier técnica
conocida en el estado de la técnica y dicha actividad sería
mayoritaria siempre que la actividad fitasa sea mayor que la
actividad fosfatasa. Preferiblemente la actividad fitasa puede
determinarse mediante la medida de la especificidad de la enzima por
el fitato respecto de la especificidad de la misma enzima por el
sustrato p-nitrofenilfosfato (pNPP). Por tanto, de
acuerdo con los resultados mostrados en la tabla 6, la "actividad
mayoritaria fitasa" de dicha enzima se refiere a que la relación
entre actividad fitasa/actividad fosfatasa es mayor de 50, 60, 70,
80, 90 ó 100. Preferiblemente la relación entre actividad
fitasa/actividad fosfatasa es igual o mayor de 90 y más
preferiblemente la relación entre actividad fitasa/actividad
fosfatasa es igual o mayor de 100.
En este caso la actividad fitasa se define en
U_{fit}/mg de proteína y la actividad fosfatasa se define en
U_{fot}/mg de proteína.
U_{fit}: \mumoles de fósforo inorgánico
liberados por hora a 50ºC y pH: 6,0; empleando como sustrato fitato
de potasio.
U_{fot}: \mumoles p-nitrofenol
liberados por hora a 50ºC y pH: 6,0; empleando como sustrato
p-nitrofenilfosfato.
La actividad de la proteína fitasa es
identificada con tres números; EC 3.1.3.8, EC.3.1.3.26 y
EC.3.1.3.72. Dichos números han sido asignados por la Enzyme
Commission number de acuerdo a las reacciones químicas que
catalizan (IUBMB Enzyme Nomenclature, CAS Registry Number
9001-42-7). La enzima con
actividad EC 3.1.3.8 se denomina, pero sin limitarse, fitasa, fitato
3-fosfatasa,
mio-inositol-hexafosfato
3-fosfohidrolasa ó 3-fitasa. La
enzima con actividad EC.3.1.3.26 se denomina, pero sin limitarse,
fitasa, fitato 6-fosfatasa,
mio-inositol-hexafosfato
6-fosfohidrolasa ó 6-fitasa. La
enzima con actividad EC.3.1.3.72 se denomina, pero sin limitarse,
fitasa o 5-fitasa.
En la presente invención, el término
"proteína" o "enzima" se puede usar como equivalente al
término "secuencia aminoacídica" teniendo en consideración que
la proteína es la secuencia aminoacídica plegada, es decir, con
estructura terciaria. A su vez, el término "secuencia
aminoacídica" es sinónimo del término "secuencia
polipeptídica".
En este punto cabe argumentar que actualmente no
existen métodos fiables capaces de predecir la estructura terciaria
de una proteína a partir de su secuencia aminoacídica. Se dispone de
métodos capaces de predecir aspectos más sencillos de su estructura,
a partir de los cuales se puede derivar cierta información sobre su
posible función. La estructura terciaria de una proteína parece
estar determinada fundamentalmente por la especificidad de su
secuencia aminoacídica. Sin embargo, la falta de precisión en la
determinación de los parámetros básicos de los que se derivaría la
estructura terciaria hace que los métodos de predicción más fiables
sean aquellos basados en el conocimiento, combinación de métodos
estadísticos y empíricos. A pesar de esto, no es posible predecir de
forma fiable la estructura terciaria de la proteína fitasa de la
presente invención y con ello su actividad enzimática, a partir de
secuencia aminoacídica. Por ello, la eliminación de un fragmento de
la proteína podría dar lugar a una proteína cuya actividad
enzimática se vería disminuida respecto de la proteína original
(nativa). Sin embargo, la secuencia aminoacídica aislada, truncada
respecto de la secuencia aminoacídica original, no presenta la
pérdida de actividad fitasa, derivándose de ello la no obviedad de
dicha secuencia truncada.
Una realización preferida de la invención se
refiere al polinucleótido aislado que consiste en una secuencia
nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica de
Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con
respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 en toda su
longitud, donde además dicha secuencia aminoacídica tiene unida a su
extremo amino-terminal una secuencia que codifica
para un péptido señal. Preferiblemente el péptido señal procede de
una secuencia que tiene su origen en la secuencia original de la que
procede el polinucleótido aislado de la invención.
El péptido señal tiene una secuencia de
aminoácidos que conduce a la proteína que la contiene a una
determinada localización en la célula. De acuerdo con el sistema Sec
de transporte, las proteínas, cuando todavía están en el citoplasma
(pre-proteína) están dotadas de una secuencia,
llamada péptido señal, en el extremo N-terminal. El
péptido señal de la pre-proteína entra a través del
canal Sec de la membrana celular citoplasmática), con lo que el
péptido señal aparece por el lado exterior de la membrana. De esta
forma, el péptido es escindido de la secuencia de la
pre-proteína por medio de la acción de una
peptidasa, lo que produce la liberación al exterior de proteína
madura. La proteína madura puede estar anclada a su vez a la
membrana citoplasmática, como es el caso de la proteína original o
nativa de la presente invención.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Por tanto, la secuencia aminoacídica de la
presente invención puede tener unida a su extremo
amino-terminal una secuencia que codifica para un
péptido señal y de esta forma la proteína es liberada al exterior de
la célula, facilitando con ello la purificación de la proteína ya
que no sería necesaria la lisis de las células hospedadoras para su
liberación.
Otra realización preferida se refiere al
polinucleótido aislado, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID
NO: 1, de B. pseudocatenulatum ATCC27919. Dicha secuencia
aminoacídica carece de la secuencia que codifica para la hélice
transmembrana, delimitada por el aminoácido 613 y 639, incluidos
ambos, de la secuencia original SEQ ID NO: 2, y además, dicha
secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es
fitasa. La secuencia SEQ ID NO: 2 es la secuencia aminoacídica
completa (no truncada) de la enzima fitasa de B.
pseudocatenulatum ATCC27919 (NQ de acceso ZP_03743199). Una
realización más preferida de la invención se refiere al
polinucleótido aislado, donde dicha secuencia aminoacídica tiene
unida a su extremo amino-terminal la secuencia del
péptido señal SEQ ID NO: 5. Esta secuencia SEQ ID NO: 5 está
delimitada por el aminoácido 1 y el 52, incluidos ambos, de la
secuencia original SEQ ID NO: 2.
Otra realización preferida se refiere al
polinucleótido aislado, donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID
NO: 3, de B. longum subsp. infantis ATCC15697. Dicha
secuencia aminoacídica carece de la secuencia que codifica para la
hélice transmembrana, delimitada por el aminoácido 600 y 623,
incluidos ambos, de la secuencia original SEQ ID NO: 4, y además,
dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad
mayoritaria es fitasa. Una realización más preferida de la invención
se refiere al polinucleótido aislado, donde dicha secuencia
aminoacídica tiene unida a su extremo amino- terminal la secuencia
del péptido señal SEQ ID NO: 6. Esta secuencia SEQ ID NO: 6 está
delimitada por el aminoácido 1 y el 32, incluidos ambos, de la
secuencia original SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia
aminoacídica truncada de la proteína fitasa de B. longum
subsp. infantis ATCC15697. Dicha secuencia carece tanto de la
secuencia aminoacídica que codifica para el péptido señal del
extremo amino-terminal como de la secuencia que
codifica para la hélice transmembrana del extremo
carboxi-terminal. La secuencia SEQ ID NO: 4 es la
secuencia aminoacídica completa (no truncada u original) de la
enzima fitasa de B. longum subsp. infantis
ATCC15697.
En adelante, para hacer referencia a cualquier
polinucleótido descrito en el aspecto anterior o en sus
realizaciones preferidas se puede usar el término "polinucleótido
de la invención" o "polinucleótido de la presente
invención".
Otros aspectos de la presente invención son: El
producto de expresión del polinucleótido de la invención; la
secuencia aminoacídica aislada codificada por el polinucleótido de
la invención; el producto de expresión anterior encapsulado o la
secuencia aminoacídica anterior encapsulada; o el vector que
comprende el polinucleótido de la invención.
El término "producto de la expresión del
polinucleótido" tal como se entiende en la presente invención
hace referencia a cualquier producto resultante de la expresión de
la secuencia de nucleótidos. Así pues, como producto resultante de
la expresión de la secuencia se entiende, por ejemplo, el ARN que se
obtiene de la transcripción de la secuencia, el ARN procesado, la
proteína resultante de la traducción del ARN en cualquiera de sus
estados de procesamiento o posteriores modificaciones de la
secuencia nucleotídica en el interior de la célula siempre que la
secuencia resultante tenga su origen en la secuencia original
transferida o no pierda la característica funcional que la
caracteriza, es decir, la actividad fitasa mayoritaria.
El término "vector" se refiere a un
fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un
determinado huésped y, como el término lo indica, puede servir de
vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que haya sido
fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un fragmento de
ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente invención,
el vector puede comprender el polinucleótido de la invención. Los
vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, bacteriófagos o vectores
virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con
la definición realizada de vector. Preferiblemente el vector es un
plásmido. Un ejemplo de plásmido es el de la serie pQE, tal como se
muestra en los ejemplos de la presente invención.
El término "encapsulado/a" se refiere a que
el producto de expresión del polinucleótido o secuencia aminoacídica
codificada por el polinucleótido de la invención (enzima), están
recubiertos con materiales de distinta naturaleza para obtener
partículas de tamaño micrométrico. El producto resultante del
encapsulado se denomina micropartícula, microcápsula ó microesfera,
sin excluir otros términos usados en el estado de la técnica. La
aplicación industrial del producto encapsulado es, por ejemplo, pero
sin limitarse, conseguir una liberación sostenida o controlada del
producto de expresión o de la enzima, conseguir proteger el producto
de expresión o de la enzima protegerlos del pH, de la temperatura,
de la degradación enzimática o de otros factores físicos que
pudieran restar actividad en dicha enzima.
Los materiales de recubrimiento para llevar a
cabo dicho microencapsulado se seleccionan de la lista que
comprende: grasa (por ejemplo pero sin limitarse, cera ó alcohol
estearílico), al menos una proteína (por ejemplo pero sin limitarse,
gelatina o albúmina), al menos un polímero (natural; por ejemplo
pero sin limitarse, alginato, dextrano o quitosano/semisintético;
por ejemplo pero sin limitarse, derivado de celulosa/sintético; por
ejemplo pero sin limitarse, derivado acrílico o poliéster
alifático), o cualquiera de sus combinaciones.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los métodos para microencapsular son conocidos
por un experto en la materia. Por ejemplo, pero sin limitarse, se
puede microencapsular mediante: extracción/evaporación del solvente,
coacervación/separación de fases, atomización (Spay driying),
gelificación iónica o polimerización interfacial. Otros métodos
pueden encontrarse en Gabrie M.H. Meesters (2010) (Capítulo 9,
Encapsulation of Enzymes and Peptides, En: Encapsulation
Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing.
Páginas 253-268).
Otro aspecto más de la presente invención es una
célula aislada que comprende:
- -
- El polinucleótido de la invención,
- -
- el producto de expresión del polinucleótido de la invención,
- -
- la secuencia aminoacídica aislada codificada por el polinucleótido de la invención,
- -
- el producto de expresión anterior encapsulado o la secuencia aminoacídica anterior encapsulada, o
- -
- el vector que comprende el polinucleótido de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "célula" tal como se entiende en
la presente invención hace referencia a una célula procariótica o
eucariótica. Una realización más preferida de la presente invención
se refiere a la célula descrita en el párrafo anterior, donde dicha
célula es procariota. Según una realización más preferida la célula
procariota es de una especie diferente de B.
pseudocatenulatum y B. longum subsp. infantis. La
especie diferente de célula procariota puede ser E. coli. Los
inventores demuestran que, a pesar de que la secuencia nucleotídica
es rica en nucleótidos G y C, se expresa eficazmente en E.
coli, lo cual es un resultado no esperado.
La célula transformada con un vector que
comprende el polinucleótido de la invención, puede incorporar la
secuencia en alguno de los ADN de la célula; nuclear, mitocondrial
y/o cloroplástico, o permanecer como parte de un vector que posee su
propia maquinaria para autoreplicarse. La selección de la célula que
ha incorporado cualquiera de las secuencias de la invención se lleva
a cabo por medio de cualquier método conocido en el estado de la
técnica, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante auxotrofías o
mediante la expresión de cualquier marcador de selección.
En adelante, para hacer referencia a cualquier
célula descrita en los párrafos anteriores se puede usar el término
"célula de la invención" o "célula de la presente
invención".
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a la población celular que comprende la célula de la invención.
Dicha población celular puede estar formada por cualquier célula de
la presente invención, por células de una sola cepa o línea celular,
por combinación de células de la cepa de B. pseudocatenulatum
ATCC27919 y B. longum subsp. infantis ATCC 15697 o por
combinación de cualquiera de ellas con otras células de cepas
diferentes de la misma especie o línea celular del género
Bifidobacterium o de otro género. Es decir, la población
celular aislada puede ser un cocultivo de células de al menos una
cepa ATCC27919 o ATCC15697 con células de cualquier otra cepa.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere al uso del polinucleótido de la invención, del producto de
expresión del polinucleótido de la invención (o dicho producto de
expresión encapsulado), de la secuencia aminoacídica aislada
codificada por el polinucleótido de la invención (o dicha secuencia
aminoacídica encapsulada), del vector que comprende el
polinucleótido de la invención, de la célula de la invención o de la
población celular de la invención, para reducir el contenido de
hexafosfato de mio-inositol (InsP_{6}) de un
alimento. Según una realización preferida, el alimento es
esencialmente vegetal. Según otra realización más preferida, el
alimento vegetal comprende cualquier parte de la semilla de dicho
vegetal, en cualquier estado de procesamiento. La semilla puede
proceder de cualquier vegetal como por ejemplo, pero sin limitarse,
de una planta leguminosa, de una planta gramínea o de pseudocereales
(por ejemplo, pero sin limitarse, amaranto, quinoa). Según una
realización aún más preferida, las semillas proceden de al menos una
planta leguminosa. Según otra realización aún más preferida, las
semillas proceden de al menos una planta gramínea. Según otra
realización preferida, el alimento está destinado a la alimentación
de animales monogástricos. Según una realización más preferida el
alimento es un pienso.
El hexafosfato de mio-inositol
(InsP_{6}) es el ácido fítico. El mio-inositol
hexafosfato, hexafosfato de mio-inositol, hexakisfosfato de
mio-inositol o hexafosfoinositol se puede abreviar como
InsP_{6} o IP_{6}. La sal del ácido fítico es el
fitato. En la presente invención se puede usar el término
"fitato" para hacer referencia al InsP_{6} o a
cualquiera de sus sales. Generalmente el fósforo en forma de fitato
no está disponible para los animales monogástricos, es decir, no
rumiantes, ya que no disponen de la enzima digestiva fitasa, que es
necesaria para separar el fósforo de la molécula de fitato. Sin
embargo los animales rumiantes pueden asimilar el fósforo del fitato
ya que disponen de microorganismos intestinales que producen
fitasa.
El término "esencialmente vegetal" tal como
se entiende en la presente invención se refiere a que el alimento
vegetal tiene compuestos alimenticios cuyo origen no es vegetal pero
más del 50% de los compuestos alimenticios que integran dicho
alimento tienen origen vegetal.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
La planta gramínea de la que se usan las
semillas es una planta de la subfamilia Pooideae, dicha
planta se selecciona de la lista que comprende una planta de Tribu
Aveneae, preferiblemente, pero sin limitarse, del género
Avena, más preferiblemente la especie Avena sativa (avena);
de la Tribu Triticeae, preferiblemente, pero sin limitarse,
del género Hordeum (más preferiblemente la especie Hordeum
vulgare [cebada]), Secale (más preferiblemente la especie
Secale cereale [centeno]) o Triticum (más
preferiblemente la especie Triticum aestivum)] de la Tribu
Oryzeae, preferiblemente, pero sin limitarse, del género
Oryza, más preferiblemente la especie Oryza sativa
(arroz); o de la Tribu Andropogoneae, preferiblemente, pero
sin limitarse, del género Shorgum o del género Zea,
más preferiblemente la especie Zea mays (maíz).
La planta gramínea de la que se usan las
semillas es una planta de la subfamilia Faboideae,
Caesalpinioideae o Mimosoideae. Preferiblemente la planta
de la subfamilia Faboideae se selecciona del género de la
lista que comprende Pisum, Phaseolus, Vicia, Cicer, Medicago
o Glycine.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere al uso del polinucleótido de la invención, del producto de
expresión del polinucleótido de la invención (o dicho producto de
expresión encapsulado), de la secuencia aminoacídica aislada
codificada por el polinucleótido de la invención (o dicha secuencia
aminoacídica encapsulada), del vector que comprende el
polinucleótido de la invención, de la célula de la invención o de la
población celular de la invención, para producir trifosfato de
mio-inositol (InsP_{3}). El trifosfato de
mio-inositol, mio-inositol trifosfato o
trifosfoinositol se puede abreviar como InsP_{3} o
IP_{3}. El InsP_{3} tiene una importante
aplicación en salud dado que los trifosfatos de mio-inositol
están implicados en numerosas funciones biológicas en el organismo,
como por ejemplo en la desintoxicación de metales pesados (ES
2054628).
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al método para la producción del polinucleótido de la invención, que
comprende:
- a.
- amplificar mediante una técnica de PCR el fragmento de la secuencia nucleotídica que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su longitud, usando como molde un ADN cromosómico de Bifidobacterium,
- b.
- clonar dicho fragmento en un vector de expresión, y
- c.
- transformar dicho vector en una célula huésped para su replicación.
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica de PCR del paso (a) del método se
selecciona de las técnicas de PCR del estado de la técnica conocidas
por el experto en la materia. La amplificación del fragmento de la
secuencia nucleotídica se lleva a cabo mediante el uso de al menos
dos cebadores donde uno de ellos se unirá a la hebra molde (cebador
directo) y el otro a la hebra complementaria (cebador reverso), en
una posición que permita obtener, mediante sucesivas amplificaciones
con una enzima ARN/ADN polimerasa termorresistente, el fragmento que
codifica para la fitasa de la presente invención, tal como se indica
en el paso (a).
El vector de expresión contiene las secuencias
necesarias para la replicación y expresión de la secuencia
nucleotídica que codifica para la fitasa de la presente invención en
la célula huésped del paso (b) del método. Dicha célula huésped
puede ser una célula procariota, por ejemplo, pero sin limitarse al
menos una célula de Escherichia. coli.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere al método, donde la amplificación del paso (a)
se lleva cabo mediante el cebador directo SEQ ID NO: 7 y el cebador
reverso SEQ ID NO: 8, y el molde es ADN es cromosómico de B.
pseudocatenulatum ATCC27919. Otra realización preferida de la
presente invención se refiere al método donde la amplificación del
paso (a) se lleva cabo mediante el cebador directo SEQ ID NO: 9 y el
cebador reverso SEQ ID NO: 10, y el molde es ADN es cromosómico de
B. longum subsp. infantis ATCC15697.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al método para reducir el contenido de fitatos de un alimento, que
comprende:
- a.
- poner en contacto el alimento con la secuencia aminoacídica aislada codificada por el polinucleótido de la invención (o con dicha secuencia aminoacídica encapsulada), con la célula de la invención, o con la población celular que comprende dicha célula de la invención, e
- b.
- incubar la mezcla obtenida en el paso (a) a un pH de entre 3,5 y 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de incubación de la mezcla,
según el paso (b), se seleccionan de acuerdo con los resultados
mostrados en las figuras 1A y B.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere al método para producir InsP_{3}, que
comprende:
- a.
- poner en contacto una composición que comprende ácido fítico o al menos una sal de fitato con la secuencia aminoacídica aislada codificada por el polinucleótido de la invención, con la célula de la invención, o con la población celular que comprende dicha célula de la invención,
\global\parskip1.000000\baselineskip
- b.
- incubar la mezcla obtenida en el paso (a) a un pH de entre 3,5 y 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Es conocido que la adición de fitasas de origen
fúngico disminuye el contenido de fitatos en productos de panadería
durante la etapa de amasado, fermentación y primera etapa del
horneado (Haros et al., 2001. Eur Food Res Technol.,
213: 317-322; Haros et al., 2001. J Agr
Food Chem, 49: 5450-5454; Sanz Penella et
al., 2008. J Cereal Sci, 48: 715-721).
Durante la etapa de amasado (7 minutos) y reposo de la masa a 24ºC
(10 minutos) la inclusión de fitasa fúngica en la formulación de pan
integral provocó una disminución de entre 17,3% y 51,9% del fitato
inicial en la harina, dependiendo de la dosis adicionada (Haros
et al., 2001. J Agr Food Chem, 49:
5450-5454). Türk y Sandberg (1992. J Cereal
Sci, 15: 281-294) observaron que la inclusión de
ingredientes como leche en la formulación de pan integral podría
retrasar significativamente el efecto de la fitasa fúngica comercial
para hidrolizar a los fitatos. Pan integral elaborado con masas
precocidas adicionadas con fitasa fúngica comercial conservadas en
congelación por largos períodos de tiempo (3 meses) disminuyen
significativamente el contenido de fitatos durante el proceso de
congelación, almacenamiento, descongelación y cocción completa
(Rosell et al, 2009. J Cereal Sci, 50:
272-277).
272-277).
Por tanto, la reducción del contenido de fitatos
de un alimento o la degradación enzimática de los fitatos en los
procesos de elaboración de alimentos depende de numerosos factores
tales como el pH, temperatura del proceso, tiempo, contenido de
agua, concentración de sales minerales, aditivos y el propio proceso
(Türk y Sandberg, 1992. J Cereal Sci, 15:
281-294). Así pues, la incubación mencionada en el
paso (b) del método para reducir el contenido de fitatos de un
alimento o para producir InsP_{3} se lleva a cabo a un pH
que se selecciona de un intervalo de entre 3,5 y 7,5,
preferiblemente el pH se selecciona de un intervalo de entre 3,75 y
7,25; de entre 4 y 7; de entre 4,25 y 7,75; de entre 4,5 y 7; de
entre 4,75 y 6,75; o de entre 5,5 y 6,5. La temperatura a la que se
llevan a cabo los procesos dependerá del tipo de alimento que se
pretenda tratar así como del tipo de material con el que se
microencapsula la enzima. Por tanto el método puede llevarse a cabo
a temperaturas muy diferentes como por ejemplo aproximadamente a
4ºC, aproximadamente a 60ºC o a una temperatura que se selecciona
de entre 24ºC y 60ºC, preferiblemente de entre 27ºC y 57ºC, de entre
30ºC y 55ºC ó de entre 35ºC y 50ºC. El tiempo dependerá del resto de
parámetros o incluso de los alimentos que deban tratarse.
La sal de fitato del paso (a) se selecciona de
la lista que comprende, pero sin limitarse, sal de sodio, sal de
potasio, sal de calcio, sal de magnesio o sal
cálcico-magnésica.
Una realización preferida de la presente
invención se refiere al método para reducir el contenido de fitatos
de un alimento o al método para producir InsP_{3}, donde la
incubación del paso (b) se lleva a cabo a un pH de entre 5,5
y
6,5.
6,5.
Otra realización preferida de la presente
invención se refiere al método para reducir el contenido de fitatos
de un alimento o al método para producir InsP_{3}, donde la
composición del paso (a) además comprende calcio o al menos una sal
de calcio, en el caso de emplear la secuencia aminoacídica SEQ ID
NO: 3 de B. longum subsp. infantis, la célula de la
invención que la comprende, o la población celular que comprende
dicha célula.
La sal de calcio se selecciona de la lista que
comprende, pero sin limitarse, carbonato de calcio, fosfato de
calcio, gluconato de calcio, cloruro de calcio, pidolato de calcio,
lactogluconato de calcio o docusato de calcio.
Según una realización más preferida, la sal de
calcio es cloruro de calcio. Tal como se observa en la Tabla 7, el
uso de cloruro de calcio aumenta la actividad de la enzima truncada
procedente de la secuencia fitasa de B. longum subsp.
infantis en un 24%.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1. Muestra el efecto del pH y la
temperatura en la actividad fitasa de las fitasas truncadas de B.
pseudocatenulatum y B. longum Subsp. infantis
producidas y purificadas a partir de E. coli .
A. Muestra el efecto del pH.
B. Muestra el efecto de la temperatura.
La actividad representada se refiere a la
actividad relativa tomando como100% la actividad máxima de cada una
de las enzimas.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Fig. 2. Muestra la cinética de la hidrólisis
de fitatos y la generación de fosfatos de mio-inositol de
menor grado de fosforilación por las fitasas truncadas de B.
pseudocatenulatum y B. longum Subsp. infantis
producidas y purificadas a partir de E. coli .
A. Muestra la cinética de la hidrólisis de
fitatos y la generación de fosfatos de mio-inositol de menor
grado de fosforilación por la fitasa purificada de B.
pseudocatenulatum.
B. Muestra la cinética de la hidrólisis de
fitatos y la generación de fosfatos de mio-inositol de menor
grado de fosforilación por la fitasa purificada de B. longum
Subsp. infantis.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 3. Muestra el perfil proteico obtenido
por cromatografía de intercambio iónico (eje de las abcisas
tiempo en minutos; eje de las ordenadas en mAU, miniunidades de
absorbancia a 280 nm).
Fase móvil tampón Tris-HCl 20 mM
a pH 7,2.
Gradiente de elución 200-300 mM
de NaCl a 1 mL/min.
Detector UV/Visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 4. Muestra el perfil proteico del
extracto crudo obtenido por cromatografía de intercambio iónico en
las condiciones mostradas a continuación (eje de las abcisas
tiempo en minutos; eje de las ordenadas en mAU, miniunidades de
absorbancia a 280 nm):
Fase móvil tampón Tris-HCl 20 mM
a pH 7,2.
Gradiente de elución 0-250 mM de
NaCl a 1 mL/min.
Detector UV/Visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 5. Muestra el perfil proteico obtenido
por cromatografía de intercambio iónico en las condiciones mostradas
a continuación (eje de las abcisas tiempo en minutos; eje de las
ordenadas en mAU, miniunidades de absorbancia a 280 nm):
Fase móvil tampón Tris-HCl 20 mM
a pH 7,5
Gradiente de elución 0,1 M de NaCl a 1
mL/min.
Detector UV/Visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 6. Muestra el perfil proteico obtenido
por cromatografía de intercambio iónico-FPLC en las
condiciones mostradas a continuación (eje de las abcisas tiempo
en minutos; eje de las ordenadas en mAU, miniunidades de absorbancia
a 280 nm):
Fase móvil tampón Tris-HCl 25 mM
a pH 7,5.
Gradiente de elución 0-500 mM de
NaCl a 6 mL/min.
Detector UV/Visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 7. Muestra el perfil proteico obtenido
por cromatografía de intercambio iónico-FPLC en las
condiciones mostradas a continuación (eje de las abcisas tiempo
en minutos; eje de las ordenadas en mAU, miniunidades de absorbancia
a 280 nm):
Fase móvil tampón Tris-HCl 25 mM
a pH 7,5.
Gradiente de elución 0-250 mM de
NaCl a 1 mL/min.
Detector UV/Visible.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 8. Muestra geles
SDS-PAGE con la expresión de las fitasas de B.
pseudocatenulatum y B. longum Subsp. infantis en
E. coli .
Completa: Fitasa de longitud completa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Truncada: fitasa que carece del fragmento
C-terminal.
Soluble: Fracción soluble.
Insoluble: Fracción insoluble.
Las flechas indican la presencia de fitasa en la
fracción soluble.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 9. Muestra geles
SDS-PAGE con la expresión de la fitasa de B.
longum subsp. infantis en E. coli utilizando
diferentes concentraciones de inductor (IPTG).
Completa: Fitasa de longitud completa.
Truncada: Fitasa que carece del fragmento
C-terminal.
Soluble: Fracción soluble.
Insoluble: Fracción insoluble.
La flecha indica la presencia de fitasa en la
fracción soluble.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores. Los siguientes
ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de
patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención.
Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han
de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se
reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos no pretenden limitar
el campo de aplicación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de bifidobacterias empleadas en este
estudio fueron proporcionadas por la ATCC: B.
pseudocatenulatum ATCC27919 (Scardovi et al., 1979.
International Journal Systematic Bacteriology, 29:
291-311) y B. longum subsp. infantis
ATCC15697 (Reuter, 1971. International Journal Systematic
Bacteriology, 21: 273-275), las cuales fueron
originalmente aisladas de intestino humano.
En un primer ensayo sobre el análisis de la
actividad fitasa en B. longum Subsp. infantis y B.
pseudocatenulatum se observó que en ambas cepas tal actividad
estaba asociada a la célula, de manera que se desechó la idea de
utilizar el sobrenadante del medio de cultivo para su purificación.
Se desarrolló un método eficiente para la disrupción de las células,
con el fin de obtener la enzima en solución para poder comenzar con
los pasos de purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando dicho método de disrupción de las
células se procedió a determinar la localización de la actividad
enzimática en B. longum Subsp. infantis y B.
pseudocatenulatum. Además de determinar la actividad fitasa,
también se determinó actividad fosfatasa, en el sobrenadante
(extracto citoplasmático) y en el pellet (pared celular). Los
valores de actividad se presentan en la Tabla 2. En dicha tabla se
observa que la actividad fitasa se encuentra tanto en el
sobrenadante (compuesto por extracto citoplasmático y membranas)
como en el pellet (correspondiente a la pared celular). Sin
embargo, la actividad fitasa del sobrenadante fue más específica en
ambas especies.
\vskip1.000000\baselineskip
Se decidió comenzar con la purificación de la
fitasa de B. longum Subsp. infantis. Para ello se
preparó un litro de cultivo de la cepa de esta especie y se empleó
el método de disrupción desarrollado para la preparación del
extracto citoplasmático.
Para comenzar con la puesta a punto del método
de purificación se decidió emplear cromatografía de intercambio
iónico (columna TSK gel DEAE-5PW), empleando como
fase móvil tampón Tris-HCl 20 mM a pH 7,2, un
gradiente de elución desde 200 a 300 mM de NaCl a un flujo de 1
mL/min, recogiéndose 25 fracciones de 1 mL cada una, con detector
UV/Visible, condiciones previamente utilizadas en purificación de
fosfatasa ácida de Lactobacillus pentosus (Palacios et
al., 2005. J Appl Microbiol, 98:
229-237). El cromatograma resultante se muestra en
la Fig. 3. El gradiente empleado no mostró una resolución de picos
satisfactoria, dado que no se obtuvo separación de las proteínas del
extracto crudo. Se realizó una segunda prueba modificando el
gradiente de NaCl desde una concentración de 0 a 250 mM. La
separación proteica mejoró sustancialmente, tal como se muestra en
la Fig. 4. La línea vertical divide el cromatograma en dos zonas, la
zona de la izquierda (hasta el minuto 19) indica las proteínas que
no se adhieren a la columna, mientras que la zona de la derecha
corresponde a la zona de elución con NaCl, por lo tanto las que se
adhieren a la columna. Se midió la actividad fitasa en todas las
fracciones recogidas, encontrándose ésta en la fracción
correspondiente al primer pico del cromatograma (Fig. 4). La
actividad fosfatasa se encontró en las primeras 17 fracciones. En
ensayos previos, se confirmó que la actividad fosfatasa no se
encuentra en fracciones posteriores. En la Tabla 3 se muestran los
datos de actividad fitasa y fosfatasa en las distintas fracciones
del cromatograma de la Fig. 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones en las que se encontró actividad
se reunieron y se volvió a analizar por HPLC acoplado a la columna
de filtración en gel (TSKgel G3000 PWXL). Como fase móvil se empleó
solución 20 mM Tris-HCl a pH 7,5 conteniendo 0,1 M
de NaCl. En el cromatograma se observa que la resolución de los
picos mejoró (Fig. 5).
Para progresar en la separación cromatográfica
se decidió emplear otra columna de intercambio aniónico (Columna
Resource Q), acoplada a FPLC (Fast protein liquid
chromatography) (AKTA Purifier, GE Healthcare, Uppsala, Suecia).
Para trabajar con esta nueva columna se diseñó un nuevo método de
separación siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empleó
como fase móvil 25 mM Tris-HCl a pH 7,5, con
gradiente de NaCl de 0 a 500 mM en 60 mL, a un flujo de 6 mL/min
(Fig. 6). Nuevamente se obtuvo un pico que corresponde a la fracción
de proteína que no se adhería a la columna (Fracción Nº 2) y
posteriormente otro pico que correspondía a la fracción que se
adhería a la columna. Se observó que no existía buena resolución de
picos, de manera que se decidió cambiar las condiciones operativas.
Se empleó la misma fase móvil, reduciendo el gradiente de NaCl a un
intervalo entre 0 y 250 mM, a un flujo de 1 mL/minuto (Fig. 7). Se
midió actividad fitasa y actividad fosfatasa en las distintas
fracciones eluídas, observándose un pico de actividad nuevamente en
la fracción que no se adhirió a la columna (Tabla 4).
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Este resultado junto al hecho que la fracción
que no se adhería a la columna presentaba un aspecto turbio, llevó a
la conclusión de la posibilidad de la existencia de restos de
membrana en el sobrenandante y que la actividad fitasa se encontrara
en las membranas y no en el extracto citoplasmático. De manera que
se decidió ultracentrifugar (100000 g durante 1 hora, rotor 70TI -
Beckman) el sobrenadante obtenido tras la disrupción celular, para
separar eficientemente dicha turbidez y finalmente comprobar la
hipótesis planteada. Una vez que se consiguió separar eficientemente
el pellet del sobrenadante se midió actividad fitasa y
fosfatasa en las tres fracciones celulares obtenidas: pared,
membranas y extracto citoplasmático (Tabla 5).
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\vskip1.000000\baselineskip
El resultado obtenido indicó que la actividad
fitasa se encontraba en las fracciones celulares de pared celular y
membrana, ya que no se encontró actividad ninguna en el sobrenadante
libre de restos celulares. La fracción de membranas se resuspendió
en tampón Tris-HCl 20 mM a pH 6,15 en presencia de
1% Tritón X100, con el fin de liberar y solubilizar la enzima. Sin
embargo, la actividad fitasa no se recuperó en el sobrenadante tras
el tratamiento. El experimento se repitió nuevamente desde el
principio, resuspendiéndose la nueva fracción de membranas en tampón
Tris-HCl 20 mM a pH 6,15 en presencia de 15% de
glicerol, pero nuevamente la actividad fitasa no se recuperó en el
sobrenadante con el nuevo tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha mostrado en el ejemplo 1, la
actividad fitasa mayoritaria se encontraba localizada en la
membrana. Tras el análisis de las secuencias de los genomas de B.
longum subsp. infantis y B. pseudocatenulatum en
busca de proteínas con dominios fitasa o fosfatasa se identificaron
los genes BLON_0263 y BIFPSEUDO_03792 que codificaban proteínas
hipotéticas (YP_002321769 y ZP_03743199) con un dominio
histidín-fosfatasa ácida. Se predijo la presencia de
un péptido señal de secreción (aminoácidos 1 al 32 en YP_002321769 y
aminoácidos 1 al 52 en ZP_03743199). A pesar de que la actividad
fitasa determinada en células de B. longum subsp.
infantis y B. pseudocatenulatum mostraba un perfil de
actividad semejante a fitasas alcalinas (pH, acumulación de
InsP_{3} y alta especificidad) se decidió estudiar estas
histidín-fosfatasas ácidas putativas ya que en el
extremo carboxi-terminal de las proteínas fue
identificada una secuencia que parecía cumplir con los requisitos de
hidrofobicidad de un péptido de anclaje a membrana. La purificación
de dichas fitasas supuso una dificultad en un primer momento debido,
tal como fue demostrado por los autores de la presente invención, a
que las proteínas parecían estar asociadas a la membrana celular. En
intentos preliminares no se consiguió purificar adecuadamente la
proteína. Se evaluó así la posibilidad de identificar fragmentos que
pudieran interferir en la recuperación de dichas proteínas. Después
de diversos análisis se determinó la posibilidad de que estas
secuencias pudieran estar favoreciendo el anclaje de la proteína a
la membrana celular (tal y como se había determinado empíricamente
para la actividad fitasa presente en las células de
Bifidobacterium) impidiendo de esta manera su liberación y
como consecuencia su correcta purificación (ejemplo 2.3). Por tanto
los cebadores mencionados en el ejemplo 2.2 se diseñaron para
conseguir unas proteínas que careciesen de dicho péptido que
probablemente era el causante de su adhesión a la membrana celular.
En el ejemplo 2.3 se muestra que la eliminación de este péptido
favorece la solubilidad y por tanto la purificación de las proteínas
a partir de E. coli. La expresión de estas proteínas y su
posterior caracterización llevó a la conclusión de que los genes
BLON_0263 y BIFPSEUDO_03792 codifican las fitasas de B.
longum subsp. infantis y B. pseudocatenulatum,
respectivamente (ejemplo 3).
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Los genes de ambas fitasas fueron amplificados
por PCR con los oligonucleótidos: PHY1 5'
GCTAGATCTATGGA
GGCTGACGGCCGG (SEQ ID NO: 9) y PHY2 5-GACAAGCTTTCAGACCGAACTTCCGGTACGTGCC (SEQ ID NO: 10) (B. longum subsp. infantis ATCC15697) y PHY4 5-GCTAGATCTGGGGAAGGAACCGCCCGG (SEQ ID NO: 7) y PHY5 5-CACAAGCTTTCACGTCACGTTTGAACCGGTTTTG (SEQ ID NO: 8) (B. pseudocatenulatum ATCC27919) y ADN cromosómico de ambas cepas, respectivamente, usando la polimerasa "Expand High Fidelity PCR System" (Roche) bajo las siguientes condiciones: 94ºC 5 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC 1 minuto, hibridación 55ºC 1 minuto y extensión a 72ºC 2 minutos, seguido de una extensión final a 72ºC 12 minutos.
GGCTGACGGCCGG (SEQ ID NO: 9) y PHY2 5-GACAAGCTTTCAGACCGAACTTCCGGTACGTGCC (SEQ ID NO: 10) (B. longum subsp. infantis ATCC15697) y PHY4 5-GCTAGATCTGGGGAAGGAACCGCCCGG (SEQ ID NO: 7) y PHY5 5-CACAAGCTTTCACGTCACGTTTGAACCGGTTTTG (SEQ ID NO: 8) (B. pseudocatenulatum ATCC27919) y ADN cromosómico de ambas cepas, respectivamente, usando la polimerasa "Expand High Fidelity PCR System" (Roche) bajo las siguientes condiciones: 94ºC 5 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC 1 minuto, hibridación 55ºC 1 minuto y extensión a 72ºC 2 minutos, seguido de una extensión final a 72ºC 12 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por
electroforesis en agarosa y aislados mediante el GFX PCR y Gel
Band Purification Kit (GE healthcare). Los fragmentos se
digirieron con los enzimas BglII y HindIII (sitios de restricción
añadidos en los oligonucleótidos subrayados) y se clonaron en el
vector pQE80 (Qiagen) digerido con BamHI e HindIII, dando lugar a
los plásmidos pQEPHYI (B. longum subsp. infantis
ATCC15697) y pQEPHY2 (B. pseudocatenulatum ATCC27919). En
estos plásmidos los enzimas fitasas se expresan en forma de una
fusión amino-terminal con una cola de seis
histidinas (6XHis) para facilitar su purificación. La construcción
excluyó los péptidos señal de secreción
(amino-terminal) y una secuencia que se estimó
pertenecer a la hélice transmembrana
carboxi-terminal presentes en las dos proteínas.
Ambos plásmidos se transformaron en la cepa de Escherichia
coli M15.
Las células de E. coli M15 transformadas
se crecieron en 500 mL de LB con ampicilina 100 \mug/ml a 37ºC en
agitación hasta una densidad óptica a 600 nm de 0.6.
La expresión de las enzimas fitasa se indujo
añadiendo IPTG hasta 0.1 mM y continuando la incubación durante
3-4 horas. Las células se recogieron por
centrifugación, se lavaron con tampón Tris-HCl 100
mM pH 7.4 y se resuspendieron en 5 ml del mismo tampón con 1 mg/ml
de lisozima, 0.5 mM de PMSF y 0,5 mM de DTT incubándose 30 minutos a
37ºC.
\newpage
Dichas células se rompieron mediante sonicación
(5 pulsos de 20 segundos). Tras centrifugar a 15.000 rpm (rotor
SS34, centrífuga Beckman) 30 minutos, los sobrenadantes se filtraron
en filtros de 0.45 \mum y se aplicaron a columnas de
Ni-NTA (Qiagen) de 1 ml. Tras diversos lavados, las
proteínas de fusión portando el tag 6X(His) se eluyeron en un
tampón que contenía 300 mM de imidazol. Tras su análisis por
SDS-PAGE, las fracciones conteniendo las fitasas se
dializaron frente a tampón Tris-HCl 100 mM pH 7.4, 1
mM EDTA, 10% de glicerol y 50 mM de NaCl y se purificaron por FPLC
(Äktapurifier, GE Healthcare) en una columna de intercambio iónico
(ResourceQ), eluyendo mediante un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1
M en tampón Tris-HCl 20 mM pH 6.0. Las fracciones
con fitasa se recogieron y diversas alícuotas se conservaron a
-80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 8 muestra unos geles
SDS-PAGE con la expresión de las fitasas de B.
pseudocatenulatum y B. longum Subsp. infantis en
E. coli. Se muestra la fracción de proteínas insolubles y
solubles de clones que sobreexpresan la fitasa completa o con la
delección de una putativa hélice transmembrana en el extremo
carboxi-terminal. Como se observa, las fitasas se
expresan muy eficazmente en E. coli, aunque la práctica
totalidad de la proteína se encuentra en forma insoluble (cuerpos de
inclusión o asociada a fragmentos de membrana). Sin embargo, la
delección del fragmento carboxi-terminal da lugar a
unas fitasas que muestran un porcentaje de proteína soluble
(indicado por flechas negras). Fueron estas proteínas solubles las
que se purificaron, caracterizándose su actividad fitasa. Los geles
de la Fig. 8 muestran un experimento de inducción en E. coli
utilizando 1 mM IPTG (plásmido pQE80) a 37ºC. Posteriores ensayos
con menor concentración de IPTG dieron lugar a un incremento en la
porción de proteína soluble. A modo de ejemplo la Fig. 9 muestra la
inducción de la expresión y la solubilidad de la fitasa de B.
longum subsp. infantis con diferentes concentraciones de
IPTG en E. coli. Se observa que mientras la fitasa original
(completa) es totalmente insoluble, la fitasa truncada se puede
obtener en forma soluble (indicada por la flecha negra). El hecho de
que las fitasas se expresen en gran cantidad en E. coli
facilitaría diversas estrategias encaminadas, bien a obtener más
porcentaje de proteína soluble o a desarrollar protocolos de
desnaturalización (solubilización) y purificación de la proteína
seguidos de una renaturalización.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad fitasa se determinó mediante el
método descrito por Haros et al. (2005. FEMS Microbiology
Letters, 247: 231-239). La reacción consistió en
250 \muL de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,5, conteniendo fitato
potásico 1,2 mM, y 50 \muL de cada uno de los extractos eluidos de
la columna cromatográfica. Tras incubar durante 15 minutos a 50ºC,
la reacción fue detenida añadiendo 50 \muL de ácido
tricloroacético al 20% (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Steinhein, Alemania), se dejó reposar 10 minutos a 0ºC y se
centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC (Centrifuge 5415R,
Eppendorf AG, Hamburg, Alemania). En el sobrenadante se determinó el
fósforo liberado por determinación espectrofotométrica del complejo
de color amarillo que se forma cuando el
orto-fosfato reacciona con el molibdovanadato de
amonio en medio ácido, según el método descrito por Tanner y Barnett
(1986. J Assoc Off Anal Chem, 69: 777-785)
adaptado a escala micro en lector de microplacas (Spectromax 190,
Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) según Haros et al
(2001. Eur Food Res Technol, 213: 317-322). A
100 \muL del sobrenadante se añadieron 100 \muL de reactivo de
molibdovanadato (Fluka Chemie GmbH, Burchs, Suiza) diluido (1/5).
Tras reposar 10 minutos a 30ºC se midió la absorbancia a 400 nm. Las
muestras fueron analizadas por
duplicado.
duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de la temperatura fue determinada en
un intervalo desde 27ºC hasta 80ºC empleando el método estándar de
determinación de actividad fitasa a pH 5,5 en tampón
acético/acetato.
El efecto del pH sobre la actividad fitasa fue
estudiado en un intervalo de pH entre 3,0 a 8,0 incubando a
temperatura óptima de reacción (50ºC) según el método estándar. Los
tampones se emplearon a una concentración 100 mM y fueron los
siguientes: citrato/NaOH, pH 3,0; acético/acetato pH
3,6-5,5; bis/tris pH 6,0-7,3;
tris/HCl, pH 8,0.
La actividad de la fitasa purificada de B.
pseudocatenulatum presentó un pH óptimo entre 5.5 y 6.5 (Fig.
1A), siendo la temperatura óptima de reacción de
50-55ºC (Fig. 1B). La fitasa de B. longum
subsp. infantis mostró máxima actividad al mismo pH (5.5) y
temperatura 50ºC (Fig. 1A y B, respectivamente). Las enzimas también
fueron activas en un amplio intervalo de pH entre 4,5 y 7,5 para la
fitasa de B. pseudocatenulatum y entre 4,5 y 6,5 para la
fitasa de B. longum subsp. infantis, conservando el
50% o más de su actividad óptima (Fig. 1A).
\newpage
Ambas enzimas fueron activas en un amplio
intervalo de temperaturas siendo superior al 40% de la actividad
máxima entre 30 y 55ºC (B. longum subsp. infantis) y
entre 30 y 60ºC (B. pseudocatenulatum). Este intervalo
incluye la temperatura fisiológica lo que podría ser importante
tanto en alimentación humana como en alimentación animal (Fig.
1B).
\vskip1.000000\baselineskip
Fue analizada la actividad relativa de las
enzimas purificadas frente a distintos ésteres fosfatos a 1,2 mM. Se
determinó por medida del fósforo liberado al cabo de la incubación
en condiciones óptimas de reacción según la metodología descrita
anteriormente. Las actividades enzimáticas se expresaron en forma
relativa frente a la obtenida empleando fitato dipotásico como
sustrato. Los diferentes sustratos estudiados fueron:
fosfoenolpiruvato,
fructosa-6-fosfato,
glucosa-6-fosfato, desoxiAMP,
glucosa-1-fosfato,
gliceraldehído-3P, ATP, ADP, AP, fructosa
1,6-bisfosfato, paranitrofenilfosfato (pNPP).
Las enzimas aisladas de bifidobacterias
mostraron tener una alta especificidad por el fitato, mientras que
la actividad frente a una amplia variedad de sustratos
monofosforilados es menor al 7% (relativo al fitato) y en la mayoría
de los casos la actividad es nula (Tabla 6). La alta especificidad
es una de las características deseadas de una fitasa comercial.
\vskip1.000000\baselineskip
El posible efecto activador o inhibidor sobre la
actividad fitasa fue determinado por la adición de distintas
sustancias químicas en la mezcla de reacción. Los posibles
sustancias activadoras o inhibidoras de la actividad enzimática
estudiadas fueron: cloruro de calcio (CaCl_{2}), cloruro de
cobalto (CoCl_{2}), cloruro de manganeso (MnCl_{2}), ácido
iodoacético (IAA), fluoruro de potasio (KF),
beta-mercaptoetanol,
etilendiaminotetra-acético (EDTA) y fluoruro de
sulfonil-fenil-metilo (PMSF).
La actividad fitasa fue determinada según ensayo
estándar de reacción en presencia de 5 mM de las sustancias químicas
anteriormente mencionadas y expresadas en forma relativa a la
actividad obtenida en ausencia de los posibles compuestos
inhibidores o activadores.
El efecto de varios compuestos químicos en la
actividad fitasa se muestra en la Tabla 7. La mayoría de los
compuestos estudiados, con excepción del ácido yodoacético (IAA),
presentaron efectos inhibitorios en la actividad enzimática. El
mecanismo de inhibición enzimática del ácido yodoacético es por
bloqueo de grupos sulfidrilos, mostrando en este estudio ningún
efecto inhibitorio de las fitasas de bifidobacterias en la
concentración ensayada.
El PMSF suele ser un inhibidor de enzimas, en
este estudio inhibió en mayor medida la enzima de B. longum
Subsp. infantis, mientras que la fitasa de B.
pseudocatenulatum presentó una ligera inhibición.
Los metales divalentes actuaron inhibiendo a las
fitasa con la excepción del calcio que actuó como activador de la
actividad en la enzima de B. infantis. Los agentes quelantes
como el EDTA también pueden ejercer su acción inhibidora de la
actividad por secuestro de metales del sitio activo de la enzima, lo
cual podría ser lo que ocurre con las fitasas de
bifidobacterias.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación y determinación de los fosfatos
de mio-inositol se realizó según la metodología descrita por
Türk y Sandberg (1992. J Cereal Sci, 15:
281-294) y más tarde modificada por Sanz Penella
et al. (2008. J Cereal Sci, 48:
715-721).
La enzima fue incubada en solución de acetato de
sodio 0,1 M a pH 5,5, a 50ºC durante 3 horas en presencia de fitato
de potasio como sustrato (InsP_{6}). A distintos intervalos
de tiempo se extrajeron alícuotas de 250 \muL para estudiar la
cinética de degradación de InsP_{6} y la generación de
fosfatos de mio-inositol con menor grado de fosforilación. La
reacción enzimática fue detenida por shock término durante 5 minutos
a 100ºC.
La separación y cuantificación de los fosfatos
de mio-inositol se llevó a cabo por cromatografía líquida de
alta resolución en fase reversa. La fase móvil consistió en
metanol:ácido fórmico 0,05 M (51:49), conteniendo 1,5% (v/v) de
hidróxido de tetrabutilamonio (Sigma-Aldrich, St
Louis, MO, USA), ajustado a pH 4,3 con ácido sulfúrico 9 M (Sigma,
St Louis, MO). El análisis cromatográfico fue llevado a cabo con un
cromatógrafo líquido HP1050 (Hewlett Packard, Waldbronn, Alemania),
equipado con un detector de índice de refracción HP 1047A (Hewlett
Packard, Waldbronn, Alemania). Las muestras (50 \muL) fueron
inyectadas en el cromatógrafo para la separación y cuantificación de
fosfatos de mio-inositol mediante una columna Tracer Excel
120 ODS-B (5 \mum x 15 cm x 0,4 cm; Teknokroma,
Barcelona, España). Las condiciones cromatográficas fueron: flujo 1
mL fase móvil/min y temperatura de la columna 35ºC. Para la
identificación de fosfatos de mio-inositol se utilizó un
hidrolizado de ácido fítico en solución acuosa al 50% (p/v) (Sigma,
St Louis, MO). Como solución estándar se utilizó fitato de potasio 5
mM (Sigma, St Louis, MO). Las muestras fueron analizadas por
duplicado.
En las Fig. 2A y B se muestra la cinética de
desaparición de fitatos o hexakisfosfato de mio-inositol
(InsP_{6}) y la generación de fosfatos de
mio-inositol con menor grado de fosforilación con el tiempo
de reacción. Se observa que la desaparición de InsP_{6} se
produjo inmediatamente en la primera media hora de reacción con la
generación y desaparición inmediata del pentakisfosfato de
mio-inositol (IP_{5} o InsP_{5}).
Paralelamente se generó el tetrakisfosfato de mio-inositol
(IP_{4} o InsP_{4}) el cual también es sustrato de
la enzima y desapareció con el tiempo de reacción, siendo su
desaparición más lenta con la fitasa de B. longum subsp.
infantis. La hidrólisis de los
InsP_{6-4} dio lugar a la generación del
trifosfato de mio-inositol (IP_{3} o
InsP_{3}), cuya concentración se incrementó con el tiempo
de reacción permaneciendo en concentraciones elevadas después de 3
horas de incubación.
Las enzimas de bifidobacterias parecen no actuar
sobre el InsP_{3} y acumularlo tras actuar sobre los
fitatos. Esto podría tener una importante implicación en salud dado
que los trifosfatos de mio-inositol están implicados en
numerosas funciones biológicas en nuestro organismo, de hecho
algunos de ellos encuentran su destino como fármacos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Consejo Superior de investigaciones
Científicas
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<120> Fitasas truncadas de
Bifidobacterium y sus usos
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.676
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 560
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Bifidobacterium
pseudocatenulatum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 639
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Bifidobacterium
pseudocatenulatum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 567
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Bifidobacterium longum Subsp.
infantis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 623
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<212> PRT
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<213> Bifidobacterium longum Subsp.
infantis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 52
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<212> PRT
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<213> Bifidobacterium
pseudocatenulatum
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Bifidobacterium longum Subsp.
infantis
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador PHY4 de Bifidobacterium
pseudocatenulatum que incluye el sitio de restricción agatct
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<400> 7
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\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 34
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PHY5 de Bifidobacterium
pseudocatenulatum que incluye el sitio de restricción AAGCTT
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<400> 8
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\hskip1cm
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<210> 9
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PHY1 de Bifidobacterium
longum Subsp. infantis que incluye el sitio de
restricción agatct
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 34
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PHY2 de Bifidobacterium
longum Subsp. infantis que incluye el sitio de
restricción AAGCTT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (31)
1. Polinucleótido aislado que consiste en una
secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica
de Bifidobacterium que tiene al menos un 55% de identidad con
respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su
longitud, donde dicha secuencia aminoacídica es una proteína cuya
actividad mayoritaria es fitasa, carece de la secuencia que codifica
para la hélice transmembrana y además dicha secuencia aminoacídica
tiene unida a su extremo amino-terminal una
secuencia que codifica para un péptido señal.
2. Polinucleótido aislado según la
reivindicación 1 que consiste en una secuencia nucleotídica que
codifica para una secuencia aminoacídica de Bifidobacterium
que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia
aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su longitud, donde dicha
secuencia aminoacídica es una proteína cuya actividad mayoritaria es
fitasa y carece de la secuencia que codifica para la hélice
transmembrana.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1,
donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1, de
Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC27919 y dicha secuencia
aminoacídica:
- a.
- carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana, delimitada por el aminoácido 613 y 639, incluidos ambos, de la secuencia original SEQ ID NO: 2,
- b.
- es una proteína con actividad fitasa, y
- c.
- tiene unida a su extremo amino-terminal la secuencia del péptido señal SEQ ID NO: 5.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Polinucleótido según la reivindicación 2,
donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1, de
Bifidobacterium pseudocatenulatum ATCC27919 y dicha secuencia
aminoacídica:
- a.
- carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana, delimitada por el aminoácido 613 y 639, incluidos ambos, de la secuencia original SEQ ID NO: 2, y
- b.
- es una proteína con actividad fitasa.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Polinucleótido según la reivindicación 1,
donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 3, de
Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC15697 y
dicha secuencia aminoacídica:
- a.
- carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana, delimitada por el aminoácido 600 y 623, incluidos ambos, de la secuencia original SEQ ID NO: 4, y
- b.
- es una proteína con actividad fitasa, y
- c.
- tiene unida a su extremo amino-terminal la secuencia del péptido señal SEQ ID NO: 6.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Polinucleótido según la reivindicación 2,
donde la secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 3, de
Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC15697 y
dicha secuencia aminoacídica:
- a.
- carece de la secuencia que codifica para la hélice transmembrana, delimitada por el aminoácido 600 y 623, incluidos ambos, de la secuencia original SEQ ID NO: 4, y
- b.
- es una proteína con actividad fitasa.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Producto de expresión del polinucleótido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Secuencia aminoacídica aislada codificada por
el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6.
9. Producto de expresión según la reivindicación
7 o secuencia aminoacídica según la reivindicación 8, donde dicho
producto de expresión o dicha secuencia aminoacídica están
encapsuladas.
10. Vector que comprende el polinucleótido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Célula que comprende el polinucleótido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el producto de expresión
según la reivindicación 7 ó 9, la secuencia aminoacídica según la
reivindicación 8 ó 9, o el vector según la reivindicación 10.
12. Célula según la reivindicación 11, donde
dicha célula es procariota.
13. Célula según la reivindicación 12, donde la
especie procariota es una especie diferente de Bifidobacterium
pseudocatenulatum y Bifidobacterium longum subsp.
infantis.
14. Población celular que comprende la célula
según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.
15. Uso del polinucleótido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, del producto de expresión según la
reivindicación 7 ó 9, de la secuencia aminoacídica según la
reivindicación 8 ó 9, del vector según la reivindicación 10, de la
célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o de la
población celular según la reivindicación 14, para reducir el
contenido de hexafosfato de mio-inositol (InsP_{6})
de un alimento.
16. Uso según la reivindicación 15, donde el
alimento es esencialmente vegetal.
17. Uso según la reivindicación 16, donde el
alimento vegetal comprende cualquier parte de la semilla de dicho
vegetal, en cualquier estado de procesamiento.
18. Uso según la reivindicación 17, donde las
semillas proceden de al menos una planta leguminosa.
19. Uso según la reivindicación 17, donde las
semillas proceden de al menos una planta gramínea.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
14 a 18, donde el alimento está destinado a la alimentación de
animales monogástricos.
21. Uso según la reivindicación 20, donde el
alimento es un pienso.
22. Uso del polinucleótido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, del producto de expresión según la
reivindicación 7 ó 9, de la secuencia aminoacídica según la
reivindicación 8 ó 9, del vector según la reivindicación 10, de la
célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o de la
población celular según la reivindicación 14, para producir
trifosfato de mio-inositol (InsP_{3}).
23. Método para la producción del polinucleótido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:
- a.
- amplificar mediante una técnica de PCR el fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su longitud, usando como molde un ADN cromosómico de Bifidobacterium,
- b.
- clonar dicho fragmento en un vector de expresión, y
- c.
- transformar dicho vector en una célula huésped para su replicación.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Método según la reivindicación 23, donde la
amplificación del paso (a) se lleva cabo mediante el cebador directo
SEQ ID NO: 7 y el cebador reverso SEQ ID NO: 8, y el molde es ADN es
cromosómico de Bifidobacterium pseudocatenulatum.
25. Método según la reivindicación 24, donde la
amplificación del paso (a) se lleva cabo mediante el cebador directo
SEQ ID NO: 9 y el cebador reverso SEQ ID NO: 10, y el molde es ADN
es cromosómico de Bifidobacterium longum subsp.
infantis.
26. Método para reducir el contenido de
InsP_{6} de un alimento que comprende:
- a.
- poner en contacto el alimento con la secuencia aminoacídica según la reivindicación 8 ó 9, con la célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o con la población celular según la reivindicación 14, e
- b.
- incubar la mezcla obtenida en el paso (a) a un pH de entre 3,5 y 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Método para producir InsP_{3} que
comprende:
- a.
- poner en contacto una composición que comprende ácido fítico o al menos una sal de fitato con la secuencia aminoacídica según la reivindicación 8 ó 9, con la célula según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, o con la población celular según la reivindicación 14,
- b.
- incubar la mezcla obtenida en el paso (a) a un pH de entre 3,5 y 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 26 ó 27, donde la incubación del paso (b) se lleva
a cabo a un pH de entre 5,5 y 6,5.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 27 ó 28, donde la composición del paso (a) además
comprende calcio o al menos una sal de calcio, en el caso de emplear
la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 de Bifidobacterium
longum subsp. infantis, la célula según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13 que la comprende, o la población celular
según la reivindicación 14 que comprende dicha célula.
30. Método según la reivindicación 29, donde la
sal de calcio es cloruro de calcio.
31. Método para aumentar la solubilidad de una
proteína fitasa de Bifidobacterium, que comprende eliminar la
secuencia que codifica para la hélice transmembrana del extremo
carboxi-terminal, donde la proteína truncada
resultante tiene al menos un 55% de identidad con respecto a la
secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, en toda su longitud.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES201030438A ES2372206B1 (es) | 2010-03-24 | 2010-03-24 | Fitasas truncadas de bifidobacterias y sus usos. |
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|---|---|---|---|
| ES201030438A ES2372206B1 (es) | 2010-03-24 | 2010-03-24 | Fitasas truncadas de bifidobacterias y sus usos. |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2008097619A2 (en) * | 2007-02-07 | 2008-08-14 | Danisco Us, Inc., Genencor Division | Variant buttiauxella sp. phytases having altered properties |
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2010
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-
2011
- 2011-03-24 WO PCT/ES2011/070198 patent/WO2011117452A1/es not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008097619A2 (en) * | 2007-02-07 | 2008-08-14 | Danisco Us, Inc., Genencor Division | Variant buttiauxella sp. phytases having altered properties |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAROS, M. et al. 'Myo-inosotol hexakisphophate degradation by Bifidobacterium infantis ATCC 15697'. INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY. 10.06.2007. Vol. 117, Nº 1, páginas 76-84. Todo el documento, especialmente Tabla 1. * |
| HAROS, M. et al. 'Phytase activity as a novel metabolic in Bifidobacterium'. FEMS MICROBIOLOGY LETTERS. 15.06.2005. Vol. 247, Nº 2, páginas 231-239. Todo el documento, especialmente Tabla 1. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011117452A1 (es) | 2011-09-29 |
| ES2372206B1 (es) | 2013-01-18 |
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