ES2372686T3 - Anitcuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína clfa y modo de empleo en el tratamiento y prevención de infecciones. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une al subdominio de unión CIf33 de la proteína CIfA de S. aureus, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal 12-9 que tiene (i) una secuencia ligera variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17 y sus degenerados; y (ii) una cadena pesada variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 y sus degenerados

Description

Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína CLFA y modo de empleo en el tratamiento y prevención de infecciones

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere de manera general a anticuerpos que hayan sido generados contra el factor de aglutinación A (o ClfA), una proteína localizada en la superficie de Staphylococcus aureus y otras bacterias Staphylococcus, y en particular a un anticuerpo monoclonal contra la proteína ClfA y sus fragmentos o proteínas activas procedentes de su dominio de unión a fibrinógeno tal como Clf33, y su uso en la inhibición de la unión de la proteína ClfA a fibrinógeno o fibrina y al tratamiento o la prevención de infecciones por Staphylococcus aureus.

Antecedentes de la invención

[0002] La colonización con éxito del hospedador es un proceso necesario para que la mayoría de microorganismos puedan provocar infecciones en animales y seres humanos. La adhesión microbiana es la primera etapa crucial en una serie de acontecimientos que eventualmente dan lugar a la enfermedad. Los microorganismos patógenos colonizan el hospedador atacando los tejidos del hospedador o biomateriales implantados acondicionados para el suero, tales como catéteres, articulaciones artificiales, e injertos vasculares, mediante adhesinas específicas presentes en la superficie de las bacterias. Las MSCRAM™s (Moléculas adhesivas de la matriz que reconocen componentes de la superficie microbiana) son una familia de adhesinas de la superficie celular que reconocen y que se unen específicamente a diferentes componentes de la matriz extracelular del hospedador. Una vez que la bacteria se ha adherido y ha colonizado con éxito los tejidos del hospedador, su fisiología se ve drásticamente alterada y se segregan componentes dañinos tales como toxinas y enzimas proteolíticas. Además, las bacterias adherentes a menudo producen una película biológica y rápidamente se vuelven más resistentes al efecto letal de la mayoría de los antibióticos.

[0003] S. aureus provoca un abanico de infecciones que van desde lesiones cutáneas tales como infecciones de heridas, impétigo, y forúnculos a dolencias que suponen un peligro para la vida, incluyendo neumonía, artritis séptica, sepsis, endocarditis, e infecciones relacionadas con los materiales biológicos. Se sabe que S. aureus expresa un repertorio de MSCRAMMs diferentes que pueden actuar individual o conjuntamente para facilitar la adhesión microbiana a componentes tisulares específicos del hospedador. Las MSCRAMMs proporcionan una diana excelente para el ataque inmunológico por parte de los anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales. La presencia de anticuerpos apropiados de alta afinidad dirigidos contra MSCRAMMs puede proporcionar un ataque de doble filo, primero los anticuerpos pueden evitar la adherencia microbiana y segundo los niveles incrementados de anticuerpos contra MSCRAMMs facilitan que el organismo se elimine rápidamente del cuerpo mediante muerte opsonofagocítica.

[0004] No obstante, aún queda el problema de identificar y utilizar la información concerniente a las MSCRAMMs de S. aureus, tal como la proteína ClfA, para generar anticuerpos monoclonales eficaces debido a la variabilidad en las propiedades de unión de las diferentes MSCRAMMs y su papel en la capacidad de infección y propagación de las infecciones bacterianas. En particular, ha sido un problema desarrollar anticuerpos monoclonales que se puedan unir a la ClfA y que se pueden usar para inhibir o dificultar la unión de la ClfA de estafilococo al fibrinógeno o la fibrina y, así, ser útil en procedimientos de prevención o tratamiento de infecciones por estafilococo. Por tanto, sigue siendo un objetivo muy deseable en el campo de las enfermedades infecciosas el desarrollo de anticuerpos monoclonales y otras composiciones que tengan éxito en el tratamiento y prevención de una amplia variedad de infecciones por estafilococo, particularmente inhibiendo o dificultando la capacidad de unión de la bacteria al fibrinógeno o la fibrina.

[0005] El documento WO 00/64925 describe el uso de anticuerpos basados en las regiones CIf40 y CIf41 de la CIfA en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias de estafilococo.

[0006] El documento US 6.008.341 describe el aislamiento de la proteína de unión a fibrinógeno de S. aureus y su uso en la generación de anticuerpos.

[0007] O'Connell y col. (J. Biol. Chem. Vol. 273, No. 12, pp 6821-6898; 1998) investiga la proteína CIfA de S. aureus y demuestra que la región A de CIfA puede unir Ca2+ y que la interacción entre la región A de CIfA y el fibrinógeno está inhibida por concentraciones milimolares de Ca2+.

[0008] Hartford y col. (Molecular Microbiol. (1997) 25(6), 1065-1076 también estudia la proteína CIfA de S. aureus y, en particular, si la región R tiene un papel en la presentación en superficie del dominio de unión al fibrinógeno de la región A.

[0009] Hartford y col. (J. Biol. Chem. Vol. 276, No. 4 pp 2466-2473; 2001) también describe el estudio de la proteína CIfA de S. aureus, y en particular su unión al fibrinógeno. Los autores describen anticuerpos policlonales generados contra un truncado recombinante de CIfA, compuesto de los restos 5000-559 de la región A. Han encontrado que estos anticuerpos son capaces de bloquear la interacción entre S. aureus y el fibrinógeno.

Resumen de la invención

[0010] Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal que se pueda unir al subdominio Clf33 de la proteína ClfA de S. aureus y, así, ser útil en procedimientos para el tratamiento

o la prevención de infecciones por estafilococo. El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal 12-9 que tiene

(i)

una secuencia ligera variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17 y sus degenerados; y

(ii)

una cadena pesada variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 y sus degenerados.

[0011] También es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal que sea capaz de unirse a ClfA, y que haya sido generado a partir de los subdominios de unión de la proteína ClfA de S. aureus, Clf33, o sus fragmentos activos, para su utilización en procedimientos de tratamiento o protección frente a infecciones por estafilococo.

[0012] También es un objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal contra las proteínas Clf33 que puede ser útil para evitar la adherencia de bacterias estafilococo, inhibiendo o dificultando la unión de la proteína ClfA a fibrinógeno o fibrina.

[0013] Es un objeto adicional de la invención proporcionar secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen para la secuencia ligera variable y las secuencias pesadas variables del anticuerpo monoclonal de la presente invención.

[0014] Es otro objeto más de la presente invención proporcionar un anticuerpo monoclonal 12-9 contra el subdominio Clf33 de ClfA que proteja frente a una infección por S. aureus, y que pueda conseguir reactividad cruzada frente a otros tipos de infecciones por estafilococo.

[0015] Éstos y otros objetos se proporcionan en virtud de la presente invención que comprende el aislamiento y uso del anticuerpo monoclonal 12-9 contra los subdominios de unión de la proteína ClfA, Clf33, para la prevención y tratamiento de infecciones por estafilococo. La presente solicitud describe de esta forma el descubrimiento, producción, caracterización, y evaluación in vivo de un anticuerpo monoclonal 12-9 dirigido contra Clf33 de ClfA, una proteína localizada en la superficie y expresada virtualmente por todas las cepas de S. aureus. Los datos presentados en este documento demuestran claramente que el anticuerpo monoclonal 12-9 dirigido contra los subdominios activos de ClfA, tales como Clf33, se pueden usar para tratar o proteger frente a infecciones por S. aureus.

[0016] El descubrimiento y aislamiento de anticuerpos monoclonales dirigidos contra ClfA según la presente invención se puede usar para dificultar o inhibir la unión de la proteína ClfA al fibrinógeno o la fibrina y, así, ser útil en procedimientos para el tratamiento o la prevención de infecciones por estafilococo. También se describen composiciones y vacunas adecuadas basadas en los subdominios aislados de la proteína ClfA y los anticuerpos generados contra ellos, así como procedimientos para su uso.

[0017] Estas formas de realización y otras modificaciones y formas alternativas dentro del alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia después de la lectura de la presente memoria descriptiva y/o las referencias citadas en el presente documento.

Breve descripción de las Figuras

[0018]

La Figura 1 es una gráfica de un análisis de Biacore usado para medir la unión de ClfA y la posterior unión/inhibición del fibrinógeno cuando anticuerpos monoclonales 13-1 ó 13-2 de acuerdo con la presente invención se unen a un chip usando un anticuerpo de conejo dirigido contra la Fc de ratón (RAM-Fc).

La Figura 2 es una gráfica de un análisis de Biacore del anticuerpo monoclonal quimérico 12-9 de acuerdo con la presente invención.

La Figura 3 es una gráfica de un análisis de citometría de flujo del anticuerpo monoclonal quimérico 12-9 que muestra la unión a S. aureus (cepa de Newman).

La Figura 4 es una gráfica que muestra la afinidad de unión del anticuerpo monoclonal quimérico y humanizado 12-9 a ClfA, de acuerdo con la invención.

La Figura 5 es una gráfica que muestra la protección contra Staphylococcus aureus en un modelo de exposición letal murino.

La Figura 6 es una gráfica que muestra la inhibición celular total de la adherencia de S. aureus a fibrinógeno inmovilizado usando los anticuerpos monoclonales de la presente invención.

La Figura 7 es una gráfica que muestra la unión comparativa de S. aureus usando los anticuerpos monoclonales 129 murino, 12-9 quimérico y 12-9 humanizado de acuerdo con la presente invención.

La Figura 8 es una representación de las secuencias de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable de los anticuerpos monoclonales de la presente invención que presentan las secuencias conservadas en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS

[0019] De acuerdo con la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal 12-9 que se puede unir a la proteína ClfA de S. aureus, y este anticuerpo monoclonal se ha generado contra el subdominio de unión activo de la proteína, Clf33, que ha sido aislado y purificado por los presentes inventores. Se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal 12-9 de acuerdo con la invención trata y protege frente a infecciones por S. aureus.

[0020] Anteriormente, McDevitt y col. (McDevitt y col., 1994, Mol. Microbiol. 11, 237-248) identificó una proteína superficial de 92 kDa, procedente de la cepa de Newman de S. aureus, y demostró que era responsable de la aglutinación de la bacteria dependiente del fibrinógeno, y ahora está descrita en la patente de EE.UU. Nº

6.177.084. El gen, designado CIfA, se clonó y se secuenció, y esto está descrito en la patente de EE.UU. Nº 6.008.341, y esta región, que representa una proteína de 896 aminoácidos según lo predicho a partir de la secuencia de ADN, media la adherencia de la bacteria a las superficies recubiertas de fibrinógeno, identificando así a la CIfA como una MSCRAMM™. El gen CIfA consta de un dominio citoplasmático, un dominio transmembrana, un dominio de anclaje a la pared celular y una región (designada R) que conecta los dominios de anclaje a la célula con la región A NH2 terminal (compuesta de un único segmento de 520 restos). El dominio de unión a fibrinógeno de esta MSCRAMM se ha localizado en un segmento de 218 restos dentro de la región A. McDevitt y col. (McDevitt y col., 1995, Mol. Microbiol. 16, 895-907) ha demostrado que la región A de CIfA es suficiente para el fenotipo de aglutinación.

[0021] No obstante, previamente nadie ha sido capaz de generar anticuerpos monoclonales contra la proteína ClfA de S. aureus. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal 12-9 aislado y/o purificado que se puede unir al subdominio de unión de la proteína ClfA, Clf33, y así puede ser útil en procedimientos de prevención y tratamiento de infecciones por estafilococo cuando se usa en cantidades eficaces para evitar o tratar dichas infecciones. Este anticuerpo monoclonal se puede producir usando, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975), u otras formas adecuadas conocidas en la materia, y además se puede preparar en forma de anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados, o humanos de maneras que serán muy conocidas en este ámbito. Aún adicionalmente, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar a partir de una cadena sencilla, tal como las cadenas ligera o pesada, y además se pueden preparar a partir de fragmentos activos de un anticuerpo que retenga las características de unión (por ejemplo, especificidad y/o afinidad) del anticuerpo completo. Por fragmentos activos se quiere decir un fragmento de anticuerpo que tiene la misma especificidad de unión que el anticuerpo completo que se une a la proteína ClfA, y el término "anticuerpo" como se usa en el presente documento está previsto que incluya dichos fragmentos. Adicionalmente, el antisuero

preparado usando el anticuerpo monoclonal 12-9 también está contemplado por la presente invención y se puede preparar mediante una serie de formas adecuadas que serán reconocidas por la persona experta en la materia.

[0022] Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos contra ClfA se pueden preparar mediante una serie de formas adecuadas que serán muy conocidas en la materia, tal como el método de Kohler y Milstein bien establecido y descrito anteriormente que se puede utilizar para generar anticuerpos monoclonales. En uno de dichos procedimientos, los ratones son inyectados intraperitonealmente una vez a la semana durante un periodo prolongado con una proteína ClfA recombinante purificada, o un subdominio aislado de la proteína tal como CIf40, CIf33, o CIfA N3, o una de sus partes activas, seguido por una prueba sanguínea obtenida de los ratones inmunizados para determinar la reactividad a la ClfA. Después de la identificación de los ratones reactivos a la ClfA, los linfocitos aislados procedentes de los bazos murinos se fusionan con células de mieloma de ratón para producir hibridomas positivos para los anticuerpos dirigidos contra ClfA que a continuación se aíslan y se cultivan, seguido de purificación y determinación del isotipo.

[0023] Con el fin de generar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención, se prefiere que éstos se generen usando proteínas C#N CIf33 preparadas por recombinación mediante procedimientos convencionales muy conocidos en la materia. Por ejemplo, uno de dichos procedimientos emplea el uso del vector de expresión pQE-30 de E. coli como vector de expresión para la clonación y expresión de proteínas y péptidos recombinantes.

[0024] Usando la PCR, el dominio A de CIfA (CIf40 que representa los aminoácidos 40-559 o CIf33 que representa los aminoácidos 221-550) se amplificó a partir de ADN genómico de la cepa de Newman de S. aureus y se subclonó en el vector de expresión pQE-30 de E. coli (Qiagen), que permite la expresión de una proteína de fusión recombinante que contiene seis restos de histidina. Este vector se transformó posteriormente en la cepa ATCC 55151 de E. coli, crecida en un fermentador de 15 l a una densidad óptica (DO600) de 0,7 e inducida con isopropil-1-beta-D-galactósido (IPTG) 0,2 mM durante 4 horas. Las células se recogieron usando un dispositivo de fibras huecas de AG Technologies (tamaño de poro de 0,45 μm) y la pasta celular se congeló a -80°C. Las células se lisaron en 1X PBS (10 ml de tampón/1 g de pasta celular) usando 2 pasadas a través de una prensa francesa a 1100 psi. Las células lisadas se centrifugaron a 17.000 rpm durante 30 minutos para retirar los restos celulares. El sobrenadante se pasó por una columna quelante HiTrap Chelating (Pharmacia) de 5 ml cargada con NiCl2 0,1 M. Después de la carga, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM (Tampón A). La proteína se eluyó usando un gradiente del 0-100% de tampón Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, imidazol 200 mM (Tampón B) sobre 30 volúmenes de columna. La CIf40 o CIf33 eluyeron al ~13% de Tampón B (imidazol ~26 mM). La absorbancia se controló a 280 nm. Las fracciones que contenían la CIf40 o CIf33 se dializaron en 1x PBS.

[0025] A continuación la proteína se sometió a un protocolo de extracción de endotoxinas. Los tampones usados durante este protocolo se limpiaron de endotoxinas al pasarlos por columnas de sefarosa Mono-Q de 5 ml (Pharmacia). La proteína se dividió en partes iguales en 4 tubos de 15 ml. El volumen de cada tubo se llevó a 9 ml con Tampón A. Se añadió 1 ml de Triton X-114 al 10% a cada tubo y se incubó con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos se pusieron en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos, se recogió la fase superior acuosa de cada tubo y se repitió la extracción del detergente. Las fases acuosas procedentes de la segunda extracción se combinaron y se pasaron a través de una columna quelante IDA de 5 ml (Sigma), cargada con NiCl2 0,1 M para extraer el detergente restante. La columna se lavó con 9 volúmenes de columna de Tampón A antes de eluir la proteína con 3 volúmenes de columna de Tampón B. El eluyente se pasó por una columna Detoxigel de 5 ml (Sigma) y el eluido se recogió y se volvió a pasar por la columna. El eluido procedente del segundo pasaje se recogió y se dializó en 1x PBS. El producto purificado se analizó para determinar el nivel de concentración, pureza y de endotoxinas antes de la administración en ratones.

[0026] La secuencia de aminoácidos para la CIf40 obtenida de esta forma se presenta en el presente documento como SEQ ID NO: 2, y está codificada por ácidos nucleicos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, o sus degenerados. Además, la secuencia de aminoácidos para Clf33 obtenida de esta forma se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 4, y está codificada por ácidos nucleicos que tienen la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, o sus degenerados.

[0027] Después del aislamiento del subdominio Clf33 activo de la proteína ClfA, se pueden producir anticuerpos monoclonales para esta proteína mediante una serie de formas adecuadas. Por ejemplo, en un procedimiento preferido, la proteína Clf33 purificada se usó para generar un plantel de anticuerpos murinos monoclonales. En resumen, un grupo de ratones Balb/C recibió una serie de inmunizaciones subcutáneas de 50 μg de proteína CIf40 o CIf33 en disolución o mezclada con adyuvante como se describe a continuación:

Inyección

Día Cantidad (μg) Vía Adyuvante

Primaria

0 50 Subcutánea Medio completo de Freund

Refuerzo #1

14 5 (CIf40) Intravenosa PBS

10 (CIfA33)

[0028] Tres días después de la dosis de refuerzo final, se extrajeron los bazos, se separaron en una sola suspensión celular y se recogieron los linfocitos. A continuación los linfocitos se fusionaron a una línea celular de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC #1581). La fusión celular, el subsiguiente cultivo en placa y la alimentación se llevaron a cabo según el protocolo de Production of Monoclonal Antibodies de Current Protocols in Immunology (Capítulo 2, Unidad 2).

[0029] Todos los clones generados en la fusión a continuación se sometieron a selección para la producción de anticuerpos específicos dirigidos contra Clf40 usando un ensayo de ELISA estándar. Los clones positivos se expandieron y se sometieron a más pruebas. Originalmente se identificaron 15 clones positivos y se clonaron mediante dilución limitante para una mayor caracterización. Los clones celulares únicos se sometieron a pruebas para su actividad en un ELISA de unión directa, un ELISA modificado para medir la inhibición de la unión de fibrinógeno a Clf40, la unión de células bacterianas completas por citometría de flujo y la afinidad para la unión de Clf40 mediante análisis de Biacore.

[0030] Se recogieron muestras bacterianas de S. aureus (cepas de Barnett, 67-0, ATCC#25923 y ATCC#49230), se lavaron y se incubaron con Mab 13-2, 12-9, 13-1 o PBS solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquear los sitios de la proteína A con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con F(ab’)2 de cabra dirigida contra F(ab’)2-FITC de ratón que sirvió como anticuerpo de detección. Después del marcaje del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través del citómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana se recogieron y se midieron 10.000 casos.

[0031] Placas de 96 pocillos de alta afinidad se recubrieron con 1 mg/ml de una disolución de CIf40 en PBS (pH 7,4), se taparon, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación las placas se lavaron con PBS, Tween 20 al 0,05% y se bloquearon con una disolución de BSA al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el sobrenadante del anticuerpo monoclonal y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron y se añadió 0,1 mg/ml de una disolución de fibrinógeno humano a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Se añadió anticuerpo de oveja dirigido contra fibrinógeno conjugado a AP a una dilución de 1:750 en PBS, Tween 20 al 0,05%, BSA al 1% y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron y se añadió pNPP (disolución de revelado) a una concentración final de 1 mg/ml. Las placas se incubaron durante 15-30 minutos a 37°C y los resultados se leyeron a 405 nm y se analizaron usando un lector Perkin Elmer HTS 7000 Bio-Assay.

[0032] Los análisis cinéticos se llevaron a cabo en un Biacore 3000 usando el Método de captura del ligando incluido en el software. Un anticuerpo de conejo dirigido contra la Fc de ratón (Biacore) se acopló por una amina a un chip CM5. El anticuerpo monoclonal sometido a análisis a continuación se pasó por el chip, permitiendo la unión a la fracción Fc. A continuación se pasaron por la superficie del chip concentraciones variables de la proteína CIf40 o CIf33 y se recogieron los datos. Usando el software Evaluation proporcionado por Biacore (Versión 3.1) se midieron las kon y koff y se calcularon las KA y KD.

[0033] Como se muestra en los datos siguientes, las inmunizaciones para generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra CIf40 o fracciones activas de CIf40 (regiones N2N3 o N3) han proporcionado anticuerpos monoclonales con perfiles de reactividad y reactividad cruzada diferentes y diversos.

[0034] A pesar de que se prefiere la producción de anticuerpos usando formas recombinantes de la proteína CIfA, los anticuerpos se pueden generar a partir de proteínas CIfA naturales aisladas y purificadas, y regiones de las mismas, y los anticuerpos monoclonales o policlonales se pueden generar usando proteínas CIfA o sus regiones activas de la misma manera que se ha descrito anteriormente para obtener dichos anticuerpos. Aún hay disponibles otras formas convencionales para generar anticuerpos dirigidos contra CIfA, usando proteínas CIfA purificadas recombinantes o naturales, o sus regiones activas, como reconocerá alguien experto en la materia.

[0035] Como reconocerá alguien experto en la materia, los anticuerpos de la presente invención también pueden formar parte de composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un ser humano o un animal con el fin de tratar o evitar una infección provocada por bacterias de estafilococo. Las composiciones farmacéuticas que contiene los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos efectivos de los mismos, se

pueden formular en combinación con cualquier vehículo, excipiente o transportador farmacéutico eficaz que se use habitualmente en esta materia, incluyendo soluciones salinas, dextrosa, agua, glicerol, etanol, otros compuestos terapéuticos, y sus combinaciones. Como reconocerá la persona experta en esta materia, el vehículo, excipiente o transportador particular variará dependiendo del paciente y de la dolencia del paciente, y para las composiciones de la invención serán adecuados una variedad de modos de administración, como reconocerá la persona experta en esta materia. Los procedimientos de administración adecuados de cualquier composición farmacéutica descrita en esta solicitud incluyen, pero no están limitados a, administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal e intradérmica.

[0036] Para la administración por vía tópica, la composición se formula en forma de ungüento, crema, gel, loción, gotas (como gotas para los ojos y gotas para los oídos), o disolución (como lavados bucales). Vendas o apósitos quirúrgicos, suturas y aerosoles pueden estar impregnados con la composición. La composición puede contener aditivos convencionales, tales como agentes conservantes, disolventes para promover la penetración, y emolientes. Las formulaciones tópicas también pueden contener vehículos convencionales tales como bases de crema o ungüento, etanol o alcohol oleico.

[0037] En general también serán aplicables a la presente invención formas adicionales de composiciones de anticuerpos, y otras informaciones concernientes a composiciones, procedimientos y aplicaciones con respecto a otras MSCRAMM™s que supongan anticuerpos para las MSCRAMM™ de la ClfA y que se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 6.288.214 (Hook y col.).

[0038] Las composiciones de anticuerpo de la presente invención que se generan contra el subdominio de la proteína ClfA también se pueden administrar con un adyuvante adecuado en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmunógena contra el conjugado. Por ejemplo, los adyuvantes adecuados pueden incluir alum (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio), que se usa ampliamente en seres humanos, y otros adyuvantes como la saponina y su componente purificado el Quil A, el adyuvante completo de Freund, el adyuvante de RIBBI, y otros adyuvantes usados en investigación y aplicaciones veterinarias. También pueden ser útiles otras preparaciones adicionales químicamente definidas tales como el dipéptido de muramilo, el monofosforil lípido A, conjugados fosfolipídicos como los descritos por Goodman-Snitkoff y col., J. Immunol. 147:410-415 (1991), la encapsulación del conjugado dentro de un proteoliposoma como se describe por Miller y col., J. Exp. Med. 176:1739-1744 (1992) y la encapsulación de la proteína en vesículas lipídicas tales como las vesículas lipídicas Novasome™ (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH).

[0039] En cualquier caso, las composiciones de anticuerpo de la presente invención así serán útiles para interferir con, modular, e inhibir las interacciones de unión entre la ClfA en bacterias de estafilococo y el fibrinógeno de las células y tejidos del hospedador, o en el desplazamiento de las bacterias de estafilococo que se hayan unido al fibrinógeno asociado a las células y tejidos del hospedador. Por consiguiente, la presente invención tendrá una aplicabilidad particular en el desarrollo de composiciones y procedimientos de prevención o tratamiento de infecciones por estafilococo, y en la inhibición de la unión de bacterias de estafilococo a tejidos y/o células del hospedador.

[0040] Los procedimientos que se proporcionan en el presente documento sirven para prevenir o tratar una infección por estafilococo, que comprenden la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo contra la subregión Clf33 de ClfA como se ha descrito anteriormente en cantidades eficaces para tratar o prevenir la infección. Además, estos anticuerpos monoclonales han demostrado ser útiles al dificultar la unión de bacterias de estafilococo a fibrinógeno o fibrina, y así han demostrado ser eficaces en el tratamiento o prevención de infecciones de bacterias de estafilococo tales como S. aureus. Es más, los anticuerpos de acuerdo con la invención son doblemente eficaces puesto que han demostrado tener una reactividad cruzada sobre una amplia variedad de cepas de S. aureus, lo que mejorará la eficacia y eficiencia de las composiciones basadas en los anticuerpos monoclonales de la presente invención.

[0041] Por consiguiente, de acuerdo con la invención, la administración del anticuerpo de la presente invención en cualquiera de las formas convencionales descritas anteriormente (por ejemplo, por vía tópica, parenteral, intramuscular, etc.) proporcionará de esta forma un procedimiento extremadamente útil para el tratamiento o prevención de infecciones por estafilococo en pacientes humanos o animales. Por cantidad eficaz se quiere decir aquel nivel de uso, tal como el título de un anticuerpo, que será suficiente para evitar la adherencia de la bacteria o para inhibir la unión de la bacteria de estafilococo a las células hospedadoras, y así ser útil en el tratamiento o prevención de una infección por estafilococo. Como reconocerá la persona con conocimientos ordinarios en esta materia, el nivel de título de anticuerpo necesario para ser eficaz en el tratamiento o prevención de una infección por estafilococo variará dependiendo de la naturaleza y la dolencia del paciente, y/o la gravedad de la infección por estafilococo previamente existente.

[0042] Además del uso del anticuerpo 12-9 para la subregión Cfl33 de la proteína CflA para tratar o prevenir la infección por S. aureus como se ha descrito anteriormente, la presente invención contempla el uso de este anticuerpo en una variedad de formas, incluyendo la detección de la presencia de S. aureus para diagnosticar una infección por estafilococo, ya sea en un paciente o en un equipo médico que también haya podido ser infectado. Un procedimiento preferido para detectar la presencia de infecciones por estafilococo supone las etapas de obtención de una muestra sospechosa de estar infectada con una o más especies o cepas de la bacteria de estafilococo, tal como una muestra tomada de un individuo, por ejemplo, de su sangre, saliva, tejidos, hueso, músculo, cartílago, o piel. A continuación las células se lisan, y se extrae el ADN, se precipita y se amplifica. Después del aislamiento de la muestra, se pueden llevar a cabo ensayos diagnósticos utilizando el anticuerpo de la presente invención para detectar la presencia de S. aureus, y dichas técnicas de ensayo para la determinación de la presencia en una muestra son muy conocidas por los expertos en la materia e incluyen procedimientos como el radioinmunoensayo, el análisis de transferencia de Western y análisis de ELISA. En general, se contempla un procedimiento de diagnóstico de una infección por S. aureus donde a una muestra sospechosa de estar infectada por S. aureus se le ha añadido el anticuerpo contra la proteína Clf33A de acuerdo con la presente invención, y S. aureus está indicado por la unión del anticuerpo a las proteínas Clf33A en la muestra.

[0043] Por consiguiente, el anticuerpo 12-9 u otros descritos en el presente documento se pueden usar para la detección específica de proteínas map de estafilococo, para la prevención de infecciones por bacterias de estafilococo, para el tratamiento de una infección en curso, o para el uso como herramientas de investigación. El término "anticuerpos" como se usa en el presente documento incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, de cadena sencilla, biespecíficos, simianizados, y humanizados o primatizados así como fragmentos Fab, tales como los fragmentos que mantienen la especificidad de unión de los anticuerpos a las proteínas Clf33A, incluyendo los productos de una librería de expresión de inmunoglobulinas Fab. Por consiguiente, la invención contempla el uso de cadenas sencillas tales como las cadenas variables pesadas y ligeras de los anticuerpos como se expondrá a continuación. La generación de cualquiera de estos tipos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo es muy conocida por los expertos en la materia. En este caso, se ha generado y aislado el anticuerpo monoclonal 12-9 para la proteína Clf33 y ha demostrado proteger frente a la infección por estafilococo.

[0044] Cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente se pueden marcar directamente con un marcador detectable para la identificación y cuantificación de las bacterias de estafilococo. Los marcadores para su uso en inmunoensayos son conocidos de manera general por los expertos en la materia e incluyen enzimas, radioisótopos, y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromógenas, incluyendo partículas coloreadas como perlas de oro o látex coloidal. Los inmunoensayos adecuados incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).

[0045] Alternativamente, el anticuerpo se puede marcar indirectamente mediante una reacción con sustancias marcadas que tengan una afinidad por las inmunoglobulinas. El anticuerpo puede estar conjugado a una segunda sustancia y se puede detectar con una tercera sustancia marcada que tenga afinidad por la segunda sustancia conjugada al anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar conjugado a biotina y el conjugado anticuerpobiotina se puede detectar usando avidina o estreptavidina marcada. De manera similar, el anticuerpo puede estar conjugado a un hapteno y el conjugado anticuerpo-hapteno se puede detectar usando anticuerpo dirigido contra elhapteno marcado. Éstos y otros procedimientos para el marcaje de anticuerpos y ensayos con conjugados son muy conocidos por los expertos en la materia.

[0046] Los anticuerpos para CIf33 como se han descrito anteriormente también se pueden usar en instalaciones o laboratorios de producción para aislar cantidades adicionales de las proteínas, tal como mediante cromatografía de afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención también se pueden utilizar para aislar cantidades adicionales de la proteína ClfA o sus fragmentos activos.

[0047] El anticuerpo aislado 12-9 de la presente invención, o sus fragmentos activos, también se pueden utilizar en el desarrollo de vacunas para la inmunización pasiva frente a infecciones por estafilococo. Además, cuando se administra en forma de composición farmacéutica en una herida o se usa para recubrir dispositivos médicos o biomateriales poliméricos in vitro e in vivo, los anticuerpos de la presente invención pueden ser útiles en aquellos casos en los que haya una infección previa por estafilococo debido a la capacidad de este anticuerpo para restringir e inhibir adicionalmente la unión de S. aureus a fibrinógeno o fibrina y así limitar el grado y la propagación de la infección. Además, el anticuerpo se puede modificar según sea necesario de manera que, en ciertos casos, sea menos inmunógeno en el paciente al que se administra. Por ejemplo, si el paciente es un ser humano, el anticuerpo se puede "humanizar" trasplantado las regiones determinantes de complementaridad del anticuerpo derivado de hibridoma en un anticuerpo monoclonal humano como se describe, por ejemplo, por Jones y col., Nature 321:522-525 (1986) o Tempest y col. Biotechnology 9:266-273 (1991) o “chapar” (“veneered”) cambiando los restos de la estructura murina expuesta a la superficie en las regiones variables de la inmunoglobulina para mimetizar un equivalente estructural homólogo humano como se describe, por ejemplo, en Padlan, Molecular Imm. 28:489-498 (1991). Es más, cuando así se desea, los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden administrar

junto con un antibiótico adecuado para potenciar aún más la capacidad de las presentes composiciones para luchar contra infecciones bacterianas.

[0048] Los dispositivos médicos o biomateriales poliméricos a recubrir con los anticuerpos, proteínas y fragmentos activos descritos en el presente documento incluyen, pero no están limitados a, grapas, suturas, válvulas cardíacas de sustitución, dispositivos de asistencia cardiacos, lentes de contacto duras y blandas, implantes de lentes intraoculares (cámara anterior o cámara posterior), u otros implantes tales como incrustaciones de la córnea, querato-prótesis, endoprótesis vasculares, dispositivos de epiqueratofalia, derivaciones de glaucoma, grapas retinales, indentación escleral, prótesis dentales, dispositivos tiroplásticos, dispositivos laringoplásticos, injertos vasculares, prótesis de tejido duro y blando, incluyendo pero no limitado a, bombas, aparatos eléctricos, incluyendo estimuladores y registradoras, prótesis auditivas, marcapasos, laringe artificial, implantes dentales, implantes mamarios, implantes de pene, tendones cráneo/faciales, articulaciones artificiales, tendones, ligamentos, meniscos y discos, huesos artificiales, órganos artificiales como páncreas artificial, corazones artificiales, miembros artificiales, y válvulas cardiacas, endoprótesis, cables, cables guía, catéteres venosos centrales e intravenosos, dispositivos de angioplastia con balón y láser, dispositivos vasculares y cardiacos (sondas, catéteres, balones), asistencias ventriculares, componentes de diálisis sanguínea, oxigenadores sanguíneos, dispositivos uretralureterales/urinarios (catéteres de Foley, endoprótesis, sondas y balones), catéteres de las vías respiratorias (tubos y manguitos endotraqueales y de traqueostomía), tubos de alimentación enteral (incluyendo sondas nasogástricos, intragástricos y de yeyuno), tubos de drenaje de heridas, tubos para drenar las cavidades del cuerpo como las cavidades pleural, peritoneal, craneal, y pericárdica, bolsas de sangre, tubos de ensayo, tubos de extracción de sangre, tubos de vacío, jeringas, agujas, pipetas, puntas de pipeta y conductos para la sangre.

[0049] Los expertos en la materia entenderán que el término "recubierto" o "recubrir", como se usa en el presente documento, significa aplicar el anticuerpo o un fragmento activo, o una composición farmacéutica derivada del mismo, a una superficie del dispositivo, preferentemente una superficie exterior que estará expuesta a infección por bacterias de estreptococos. La superficie del dispositivo no tiene por qué estar completamente cubierta por la proteína, anticuerpo o fragmento activo.

[0050] En una forma de realización preferida, el anticuerpo 12-9 también se puede usar como vacuna pasiva que será útil en el suministro de anticuerpos adecuados para tratar o prevenir una infección por estafilococo. Como reconocerá alguien experto en esta materia, una vacuna puede estar empaquetada para la administración en una serie de formas adecuadas, como mediante administración por vía parenteral (es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o nasofaríngea (es decir, intranasal). Una de dichas formas es aquella en la que la vacuna se inyecta intramuscularmente, por ejemplo, en el músculo deltoides, sin embargo, el modo de administración particular dependerá de la naturaleza de la infección bacteriana a tratar y de la dolencia del paciente. La vacuna se combina preferentemente con un vehículo farmacéuticamente aceptable para facilitar su administración, y el vehículo normalmente es agua o una disolución salina taponada, con o sin un agente conservante. La vacuna se puede liofilizar para su resuspensión en el momento de su administración o mantener en disolución.

[0051] La dosis preferida para la administración de una composición de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es aquella cantidad que será eficaz en la prevención o tratamiento de una infección por estafilococo, y se reconocerá fácilmente que esta cantidad variará enormemente dependiendo de la naturaleza de la infección y de la dolencia del paciente. Como se ha indicado anteriormente, una "cantidad eficaz" de un anticuerpo o agente farmacéutico a usar de acuerdo con la invención está previsto que signifique una cantidad no tóxica, pero suficiente, del agente de manera que se produzca el efecto profiláctico o terapéutico deseado. Como se apuntará a continuación, la cantidad exacta del anticuerpo o de agente particular necesario variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, y condición general del sujeto, la gravedad de la dolencia a tratar, el vehículo o adyuvante particular usado y su modo de administración, y similares. Por consiguiente, la "cantidad eficaz" de cualquier composición de anticuerpo particular variará en base a las circunstancias particulares, y alguien con conocimientos en la materia puede determinar en cada caso de aplicación la cantidad eficaz apropiada usando sólo experimentación rutinaria. La dosificación se deberá ajustar para adecuarse al individuo al cual se administra la composición y variará con la edad, el peso y el metabolismo del individuo. Las composiciones adicionalmente pueden contener estabilizantes o conservantes farmacéuticamente aceptables, tales como timerosal (sal sódica de etil(2-mercaptobenzoato-S) de mercurio) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

[0052] Cuando se usan con marcadores adecuados u otras biomoléculas o compuestos químicos detectables apropiados, los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento son útiles para propósitos tales como el diagnóstico in vivo e in vitro de infecciones por estafilococo o detección de bacterias de estafilococo. La investigación en laboratorio también se puede facilitar mediante el uso de dichos anticuerpos. Los expertos en la materia conocen bien los diversos tipos de marcadores y procedimientos de conjugación de marcadores a los anticuerpos de la invención, tales como los expuestos a continuación.

[0053] Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar (directamente o por quelación) a un radiomarcador tal como, pero no restringido a, 32P, 3H, 14C, 35S, 125I, o 131I. La detección de un marcador se puede llevar a cabo mediante procedimientos tales como recuento por centelleo, espectrometría de rayos gamma o autorradiografía. También son útiles los marcadores bioluminiscentes, tales como los derivados de la luciferina de luciérnaga. La sustancia bioluminiscente se une covalentemente a la proteína mediante procedimientos convencionales, y la proteína marcada se detecta cuando una enzima, tal como la luciferasa, cataliza una reacción con ATP provocando que la molécula bioluminiscente emita fotones de luz. Para marcar proteínas también se pueden usar fluorógenos. Ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y sus derivados, ficoeritrina, aloficocianina, ficocianina, rodamina, y Texas Red. Los fluorógenos se detectan en general mediante un detector de florescencia.

[0054] La localización de un ligando en las células se puede terminar marcando un anticuerpo como se ha descrito anteriormente y detectando el marcador de acuerdo con procedimientos muy conocidos por los expertos en la materia, tales como microscopía de inmunofluorescencia usando procedimientos como los descritos por Warren y Nelson (Mol. Cell. Biol, 7: 1326-1337, 1987).

[0055] Como se ha indicado anteriormente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención, o porciones activas o fragmentos del mismo, es particularmente útil para interferir con la interacción física inicial entre el patógeno estafilococo responsable de la infección y un hospedador mamífero, tal como la adhesión de la bacteria a las proteínas de la matriz extracelular del mamífero como el fibrinógeno, y esta interferencia con la interacción física puede ser útil tanto en el tratamiento de pacientes como en la prevención o reducción de la infección bacteriana o de los dispositivos médicos implantables para hacerlos seguros para su uso.

[0056] En otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un kit que puede ser útil en el aislamiento e identificación de bacterias e infecciones por estafilococo que comprende el anticuerpo de la presente invención en una forma adecuada, tal como liofilizado en un único recipiente que a continuación se activa con la adición de una muestra acuosa sospechosa de contener la bacteria estafilococo. Dicho kit normalmente incluirá un contenedor adecuado para albergar el anticuerpo en una forma adecuada junto con un reactivo de inmunodetección adecuado que permitirá la identificación de complejos que se unen al anticuerpo de la invención. Por ejemplo, el reactivo de inmunodetección puede comprender una señal o marcador detectable adecuado, tal como biotina o una enzima que produzca un color detectable, etc., que normalmente puede estar unido al anticuerpo o que se puede utilizar de otras formas adecuadas para así proporcionar un resultado detectable cuando el anticuerpo se une al antígeno.

[0057] Resumiendo, el anticuerpo de la presente invención que se une a la proteína Clf33 o a sus fragmentos activos son extremadamente útiles en el tratamiento o la prevención de infecciones por estafilococo en pacientes humanos y animales y en dispositivos implantables médicos y de otro tipo. Por consiguiente, en el presente documento también se describen procedimientos de identificación y aislamiento de anticuerpos que se pueden unir a Clf33 y que se pueden usar en procedimientos de tratamiento de infecciones por estafilococo que suponen la muerte opsonofagocítica de las bacterias.

EJEMPLOS

[0058] Se proporcionan los siguientes ejemplos que ilustran aspectos de las formas de realización preferidas de la presente invención. Los expertos en la materia deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención, y así se pueden considerar que constituyen formas preferidas para su puesta en práctica. No obstante, aquellos expertos en la materia deben apreciar, en vista de la presente memoria descriptiva, que se pueden introducir muchos cambios en las formas de realización específicas descritas y aun así obtener resultados iguales o similares sin apartarse del alcance de la invención.

Ejemplo 1. Aislamiento y secuenciación de CIf40 y CIf33

[0059] Usando la PCR, el dominio A de CIfA (CIf40 que representa los aminoácidos 40-559 o CIf33 que representa los aminoácidos 221-550) se amplificó a partir de ADN genómico de la cepa de Newman de S. aureus y se subclonó en el vector de expresión pQE-30 de E. coli (Qiagen), que permite la expresión de una proteína de fusión recombinante que contiene seis restos de histidina. Este vector se transformó posteriormente en la cepa ATCC 55151 de E. coli, crecida en un fermentador de 15 l a una densidad óptica (DO600) de 0,7 e inducida con isopropil-1-beta-D-galactósido (IPTG) 0,2 mM durante 4 horas. Las células se recogieron usando un dispositivo de fibras huecas de AG Technologies (tamaño de poro de 0,45 μm) y la pasta celular se congeló a -80°C. Las células se lisaron en 1X PBS (10 ml de tampón/1 g de pasta celular) usando 2 pasadas a través de una prensa francesa a 1100 psi. Las células lisadas se centrifugaron a 17.000 rpm durante 30 minutos para retirar los restos celulares. El sobrenadante se pasó por una columna quelante HiTrap Chelating (Pharmacia) de 5 ml cargada con NiCl2 0,1 M.

Después de la carga, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM (Tampón A). La proteína se eluyó usando un gradiente del 0-100% de tampón Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, imidazol 200 mM (Tampón B) sobre 30 volúmenes de columna. La CIf40 o CIf33 eluyeron al ~13% de Tampón B (imidazol ~26 mM). La absorbancia se controló a 280 nm. Las fracciones que contenían la CIf40 o CIf33 se

5 dializaron en 1x PBS.

[0060] A continuación la proteína se sometió a un protocolo de extracción de endotoxinas. Los tampones usados durante este protocolo se limpiaron de endotoxinas al pasarlos por columnas de sefarosa Mono-Q de 5 ml (Pharmacia). La proteína se dividió en partes iguales en 4 tubos de 15 ml. El volumen de cada tubo se llevó a 9 ml 10 con Tampón A. Se añadió 1 ml de Triton X-114 al 10% a cada tubo y se incubó con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos se pusieron en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos, se recogió la fase superior acuosa de cada tubo y se repitió la extracción del detergente. Las fases acuosas procedentes de la segunda extracción se combinaron y se pasaron a través de una columna quelante IDA de 5 ml (Sigma), cargada con NiCl2 0,1 M para extraer el detergente restante. La columna se lavó con 9

15 volúmenes de columna de Tampón A antes de eluir la proteína con 3 volúmenes de columna de Tampón B. El eluyente se pasó por una columna Detoxigel de 5 ml (Sigma) y el eluido se recogió y se volvió a pasar por la columna. El eluido procedente del segundo pasaje se recogió y se dializó en 1x PBS. El producto purificado se analizó para determinar el nivel de concentración, pureza y de endotoxinas antes de la administración en ratones.

20 [0061] Las secuencias de proteína y ácidos nucleicos se incluyen a continuación. La secuencia de aminoácidos de Clf40 se incluye a continuación como SEQ ID NO: 2, y está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1, y también estará codificada por sus secuencias degeneradas. La secuencia de aminoácidos de Clf33 se incluye a continuación como SEQ ID NO: 4, y está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 3, y también estará codificada por sus secuencias degeneradas.

Ejemplo 2. Producción de anticuerpos monoclonales usando Clf40 y Clf33

[0062] La proteína Clf40 o Clf33 purificada se usó para generar un plantel de anticuerpos murinos monoclonales. En resumen, un grupo de ratones Balb/C recibió una serie de inmunizaciones subcutáneas de 50 μg 30 de proteína CIf40 o CIf33 en disolución o mezclada con adyuvante como se describe a continuación en la Tabla I:

Tabla I

Inyección

Día Cantidad (μg) Vía Adyuvante

Primaria

0 50 Subcutánea Medio completo de Freund

Refuerzo #1

14 5 (CIf40) Intravenosa PBS

10 (CIfA33)

[0063] Tres días después de la dosis de refuerzo final, se extrajeron los bazos, se separaron en una sola

35 suspensión celular y se recogieron los linfocitos. A continuación los linfocitos se fusionaron a una línea celular de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC #1581). La fusión celular, el subsiguiente cultivo en placa y la alimentación se llevaron a cabo según el protocolo de Production of Monoclonal Antibodies de Current Protocols in Immunology (Capítulo 2, Unidad 2).

40 [0064] Todos los clones generados en la fusión a continuación se sometieron a selección para la producción de anticuerpos específicos dirigidos contra Clf40 usando un ensayo de ELISA estándar. Los clones positivos se expandieron y se sometieron a más pruebas. Originalmente se identificaron 15 clones positivos y se clonaron mediante dilución limitante para una mayor caracterización. Los clones celulares únicos se sometieron a pruebas para su actividad en un ELISA de unión directa, un ELISA modificado para medir la inhibición de la unión de

45 fibrinógeno a Clf40, la unión de células bacterianas completas por citometría de flujo y la afinidad para la unión de Clf40 mediante análisis de Biacore. Los resultados de las pruebas se incluyen en la Tabla II a continuación:

Tabla II :

Anticuerpo monoclonal ClfA

Cinéticas de unión Inhibición de unión a Fbg Unión a S. aureus Barnett Unión a S. aureus 67-0 Unión a S. aureus ATCC #25923 Unión a S. aureus ATCC #49230

F12-9

kon 7,74 x 105 koff 4,46 x 10-4 KD 5,76 x 10-10 50-70% 72% 62% 60% 94%

F13-1

kon 1,11 x 105 koff 6,13 x 10-3 KD 5,51 x 10-6 0-15% - - - 9%

F13-2

kon 1,19 x 105 koff 2,81 x 10-4 KD 2,35 x 10 -9 40-60% 59% 65% 55% 93%

Unión a bacterias completas

5 [0065] Se recogieron muestras bacterianas de S. aureus (cepas de Barnett, 67-0, ATCC#25923 y ATCC#49230), se lavaron y se incubaron con Mab 13-2, 12-9, 13-1 o PBS solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquear los sitios de la proteína A con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con F(ab’)2 de cabra dirigida contra F(ab’)2-FITC de ratón que sirvió como anticuerpo de detección. Después del marcaje del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través del

10 citómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana se recogieron y se midieron 10.000 casos.

Inhibición (ELISA)

15 [0066] Placas de 96 pocillos de alta afinidad se recubrieron con 1 μg/ml de una disolución de CIf40 en PBS (pH 7,4), se taparon, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación las placas se lavaron con PBS, Tween 20 al 0,05% y se bloquearon con una disolución de BSA al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el sobrenadante del anticuerpo monoclonal y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron y se añadió 0,1 mg/ml de una

20 disolución de fibrinógeno humano a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Se añadió anticuerpo de oveja dirigido contra fibrinógeno conjugado a AP a una dilución de 1:750 en PBS, Tween 20 al 0,05%, BSA al 1% y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron y se añadió pNPP (disolución de revelado) a una concentración final de 1 mg/ml. Las placas se incubaron durante 15-30 minutos a 37°C y los resultados se leyeron a 405 nm y se analizaron usando un lector

25 Perkin Elmer HTS 7000 Bio-Assay.

Análisis cinéticos

[0067] Los análisis cinéticos se llevaron a cabo en un Biacore 3000 usando el Método de captura del ligando

30 incluido en el software. Un anticuerpo de conejo dirigido contra la Fc de ratón (Biacore) se acopló por una amina a un chip CM5. El anticuerpo monoclonal sometido a análisis a continuación se pasó por el chip, permitiendo la unión a la fracción Fc. A continuación se pasaron por la superficie del chip concentraciones variables de la proteína CIf40 o CIf33 y se recogieron los datos. Usando el software Evaluation proporcionado por Biacore (Versión 3.1) se midieron las kon y koff y se calcularon las KA y KD.

Ejemplo 3. Estudios adicionales de CIf40 y CIf33

[0068] Usando la PCR, el dominio A de CIfA (CIf40 que representa los aminoácidos 40-559, el dominio N2N3 de CIf33 que representa los aminoácidos 221-550 o el dominio Clf-N3 que representa los aminoácidos 370-559) se 5 amplificó a partir de ADN genómico de la cepa de Newman de S. aureus y se subclonó en el vector de expresión pQE-30 de E. coli (Qiagen), que permite la expresión de una proteína de fusión recombinante que contiene seis restos de histidina. Este vector se transformó posteriormente en la cepa ATCC 55151 de E. coli, crecida en un fermentador de 15 l a una densidad óptica (DO600) de 0,7 e inducida con isopropil-1-beta-D-galactósido (IPTG) 0,2 mM durante 4 horas. Las células se recogieron usando un dispositivo de fibras huecas de AG Technologies (tamaño 10 de poro de 0,45 μm) y la pasta celular se congeló a -80°C. Las células se lisaron en 1X PBS (10 ml de tampón/1 g de pasta celular) usando 2 pasadas a través de una prensa francesa a 1100 psi. Las células lisadas se centrifugaron a 17.000 rpm durante 30 minutos para retirar los restos celulares. El sobrenadante se pasó por una columna quelante HiTrap Chelating (Pharmacia) de 5 ml cargada con NiCl2 0,1 M. Después de la carga, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM (Tampón A). La proteína se eluyó

15 usando un gradiente del 0-100% de tampón Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, imidazol 200 mM (Tampón B) sobre 30 volúmenes de columna. La proteína CIf eluyó al ~13% de Tampón B (imidazol ~26 mM). La absorbancia se controló a 280 nm. Las fracciones que contenían la CIf40 o CIf33 se dializaron en 1x PBS.

[0069] A continuación la proteína se sometió a un protocolo de extracción de endotoxinas. Los tampones

20 usados durante este protocolo se limpiaron de endotoxinas al pasarlos por columnas de sefarosa Mono-Q de 5 ml (Pharmacia). La proteína se dividió en partes iguales en 4 tubos de 15 ml. El volumen de cada tubo se llevó a 9 ml con Tampón A. Se añadió 1 ml de Triton X-114 al 10% a cada tubo y se incubó con rotación durante 1 hora a 4°C. Los tubos se pusieron en un baño de agua a 37°C para separar las fases. Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos, se recogió la fase superior acuosa de cada tubo y se repitió la extracción del detergente. Las

25 fases acuosas procedentes de la segunda extracción se combinaron y se pasaron a través de una columna quelante IDA de 5 ml (Sigma), cargada con NiCl2 0,1 M para extraer el detergente restante. La columna se lavó con 9 volúmenes de columna de Tampón A antes de eluir la proteína con 3 volúmenes de columna de Tampón B. El eluyente se pasó por una columna Detoxigel de 5 ml (Sigma) y el eluido se recogió y se volvió a pasar por la columna. El eluido procedente del segundo pasaje se recogió y se dializó en 1x PBS. El producto purificado se

30 analizó para determinar el nivel de concentración, pureza y de endotoxinas antes de la administración en ratones.

Producción del anticuerpo monoclonal

[0070] La proteína Clf40, Clf33 o N3 purificada se usó para generar un plantel de anticuerpos murinos

35 monoclonales. En resumen, un grupo de ratones Balb/C recibió una serie de inmunizaciones subcutáneas de 1-10 mg de proteína en disolución o mezclada con adyuvante como se describe a continuación en la tabla III:

Tabla III:

Inyección RIMMS Día Cantidad (mg) Vía Adyuvante #1 0 5 Subcutánea FCA/RIBI #2 2 1 Subcutánea FCA/RIBI #3 4 1 Subcutánea FCA/RIBI #4 7 1 Subcutánea FCA/RIBI #5 9 1 Subcutánea FCA/RIBI

Inyección convencional Día Cantidad (mg) Vía Adyuvante Primaria 0 5 Subcutánea FCA Refuerzo #1 14 1 Intraperitoneal RIBI Refuerzo #2 28 1 Intraperitoneal RIBI Refuerzo #3 42 1 Intraperitoneal RIBI

40 [0071] En el momento del sacrificio (RIMMS) o siete días después de una dosis de refuerzo (convencional) se recogió el suero y se tituló en ensayos de ELISA frente a MSCRAMMs o en células completas (S. aureus y S. epidermidis). Tres días después de la dosis de refuerzo final, se extrajeron los bazos o los nódulos linfáticos, se separaron en una sola suspensión celular y se recogieron los linfocitos. A continuación los linfocitos se fusionaron a una línea celular de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC #1581). La fusión celular, el subsiguiente cultivo en placa y la

45 alimentación se llevaron a cabo según el protocolo de Production of Monoclonal Antibodies de Current Protocols in Immunology (Capítulo 2, Unidad 2).

[0072] Todos los clones generados en la fusión a continuación se sometieron a selección para la producción de anticuerpos específicos dirigidos contra Clf40, SdrG o FnbpA usando un ensayo de ELISA estándar. Los clones

50 positivos se expandieron y se sometieron a más pruebas. Los candidatos se sometieron a más pruebas para su actividad en un ELISA de unión directa, un ELISA modificado para medir la inhibición de la unión de fibrinógeno a

Clf40, la unión de células bacterianas completas por citometría de flujo y la unión de Clf40/inhibición de la unión de fibrinógeno-Clf40 mediante análisis de Biacore.

Análisis de Biacore

[0073] A lo largo de todo el análisis, la velocidad de flujo permaneció constante a 10 ml/min. Antes de la inyección de Clf40, el anticuerpo de prueba se adsorbió al chip a través de la unión RAM-Fc. A tiempo 0, se inyectó CIfA 40 a una concentración de 30 mg/ml en el chip durante 3 minutos, seguido de 2 minutos de disociación. Esta fase del análisis medía las cinéticas de asociación y disociación relativas de la interacción Mab/CIfA. En la segunda fase del análisis, se midió la capacidad de la CIfA unida al Mab para interaccionar y unirse al fibrinógeno. Se inyectó fibrinógeno a una concentración de 100 mg/ml en el chip y después de 3 minutos se tomó un punto de observación.

Unión a bacterias completas

[0074] Se recogieron muestras bacterianas (Newman), se lavaron y se incubaron con Mab o PBS solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquear los sitios de la proteína A con IgG de conejo (50 mg/ml). Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con F(ab’)2 de cabra dirigida contra F(ab’)2-FITC de ratón que sirvió como anticuerpo de detección. Después del marcaje del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través del citómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana se recogieron y se midieron 10.000 casos.

Inhibición (ELISA)

[0075] Placas de 96 pocillos de alta afinidad se recubrieron con 1 μg/ml de una disolución de CIf40 en PBS (pH 7,4), se taparon, y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación las placas se lavaron con PBS, Tween 20 al 0,05% y se bloquearon con una disolución de BSA al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el sobrenadante del anticuerpo monoclonal y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron y se añadió 0,1 mg/ml de una disolución de fibrinógeno humano a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron. Se añadió anticuerpo de oveja dirigido contra fibrinógeno conjugado a AP a una dilución de 1:750 en PBS, Tween 20 al 0,05%, BSA al 1% y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron y se añadió pNPP (disolución de revelado) a una concentración final de 1 mg/ml. Las placas se incubaron durante 15-30 minutos a 37°C y los resultados se leyeron a 405 nm y se analizaron usando un lector Perkin Elmer HTS 7000 Bio-Assay.

Ejemplo 4. Inmunización con anticuerpos monoclonales completos o partes de los mismos generados contra CIf40 con diferentes patrones de reactividad

[0076] La Tabla IV a continuación muestra los resultados de las pruebas de inmunización con las regiones activas de la presente invención, incluyendo CIf40, CIf33 (que constituye la región N2N3 del dominio A de ClfA), y la región N3 de CIfA sola.

Tabla IV Antígeno Fusión Monoclonal Reactividad ELISA Biacore Citometría de Inhibición FYI flujo

CIf40 SdrG FnbpA Unión Inhibición

CIfA N3 incluye los siguientes: RIMMS F29-19 Y N N N N nt nt

F29 F30 F31 F32 F34 F36 F29-71 Y N N N N nt nt F29-92 Y N N N N nt nt F31-20 Y N N N N nt nt F31-36 Y N N N N nt nt F31-100 Y N N N N nt nt F31-195 Y N N N N nt nt F32-22 Y N N N N nt nt F34-15 Y N N N N nt nt F36-77 Y N N N N nt nt F36-197 Y N N N N nt nt

CIfA N2N3 (CIf33) incluye los Convencional INH-M010001 Y N N Y N Y Y 12-9

siguientes: F11 F12 F17 F18 F12-3 Y nt nt Y nt Y N F12-1 Y nt nt Y nt Y N F12-5 Y nt nt Y nt Y N F12-10 Y nt nt Y nt Y Y

CIfA N2N3 (CIf33) incluye los RIMMS F33-7 Y N N Y Y Y nt

siguientes: F33 F35 F38 F40 F35-279 Y N N Y Y N nt F35-177 Y N N Y N Y nt F40-7 Y N N Y Y Y nt F38-300 Y N N Y Y N nt F35-129 Y N N N N nt nt

CIf40 incluye los siguientes: F13 Convencional INH-M000030 Y nt nt Y N Y Y 13-2

F14 F15 F16 INH-M010004 Y nt nt Y N Y N 15-EC6 INH-M010003 Y nt nt Y N N N 13-1 F13-6 Y nt nt Y nt Y Y Y = un resultado positivo N = un resultado negativo Nt = no probado

[0077] Los resultados presentados en esta tabla demuestran que las inmunizaciones que generan anticuerpos monoclonales con CIf40 o partes de CIf40 (N2N3 o N3) proporcionan anticuerpos monoclonales con perfiles de reactividad amplia y diversa y que presentan una reactividad cruzada sustancial en una amplia variedad de cepas de estafilococo.

Ejemplo 5: Uso del Biacore para seleccionar Mabs de alta afinidad que bloquean la unión de CIf40 al fibrinógeno.

Análisis de Biacore

[0078] A lo largo del experimento representado en la Figura 1, la velocidad de flujo permaneció constante a 10 ml/min. Antes de la inyección de CIfA 40, 946 RU de Mab 13-1 y 768 RU de Mab 13-2 se adsorbieron al chip a través de la unión RAM-Fc. A tiempo 0 en la gráfica, se inyectó CIfA 40 a una concentración de 30 mg/ml en el chip durante 3 min seguido de 2 minutos de disociación. El Mab 13-1 unió 58 RU de CIfA y el Mab 13-2 unió 168 RU de CIfA al final del periodo de inyección de CIfA. Esta fase del experimento mide las cinéticas de asociación y disociación relativas de la interacción Mab/CIfA. En la segunda fase del experimento se mide la capacidad del Mab unido a CIfA para interaccionar y unirse al fibrinógeno. Se inyectó fibrinógeno a una concentración de 100 mg/ml en el chip y después de 3 minutos se unieron 64 RU de fibrinógeno a la CIfA unida al Mab 13-1, pero se unieron 0 RUs de fibrinógeno a la CIfA unida al Mab 13-2.

Ejemplo 6. Comparación del Mab 13.2 frente a la cepa Barnett de S. aureus y S. aureus ATCC 25923

Ampliación y purificación del anticuerpo

[0079] Se crecieron células de hibridoma en medio RPMI/DMEM, 1X Nutridoma-SP que contiene piruvato sódico 2 mM, L-glutamina 4 mM y 2X penicilina-estreptomicina hasta volúmenes de cultivo de 2-3 litros. A continuación los sobrenadantes del hibridoma se recogieron por centrifugación. Los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0,45 μm y la IgG se purificó por afinidad usando cromatografía con la proteína G. Los anticuerpos monoclonales se eluyeron usando glicina 0,1 M, pH 2,7 y se neutralizaron inmediatamente con la décima parte en volumen de tampón Tris 2 M, pH 8,0. A continuación la IgG purificada se dializó contra tampón fosfato salino 1X D a pH 7,4. Si es necesario, el anticuerpo purificado se concentró y se congelaron alícuotas.

Cepas de Staphylococcus aureus

[0080] Se tomaron células de S. aureus de una disolución madre de glicerol congelada y se inocularon en una única placa de agar con sangre y se crecieron durante 24 horas a 37°C. A continuación las colonias aisladas se transfirieron a las placas de agar con sangre. Se inocularon 80 placas para preparar 50 ml de la disolución madre final congelada. A continuación las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C. Después de la incubación, las colonias se extrajeron de la superficie de cada placa con un rascador y se llevaron a cuatro tubos de 50 ml que contienen 10 ml de 1X PBS (20 placas por tubo) mientras se pasaba suavemente por el vórtex para eliminar las bacterias del rascador. A continuación se añadieron 10 ml más de 1X PBS a los 10 ml de suspensión bacteriana, mientras se pasaba vigorosamente por el vórtex para facilitar la separación de cualquier resto de agar de la bacteria. La suspensión se sedimentó por centrifugación a 3500g a 4°C durante 10 minutos. La bacteria se lavó en D-PBS y se resuspendió en 50 ml de medio de congelación. La disolución madre bacteriana se puso en alícuotas de 1 ml por congelación instantánea en un baño de etanol/hielo seco y se llevó a un congelador a -80°C. La concentración (CFU/ml) de la disolución madre congelada se determinó descongelando una alícuota de 1 ml, y preparando diluciones seriadas entre 10-5 y 10-11. Las diluciones se cultivaron por duplicado en placas de agar con sangre y se incubaron a 37°C durante 16-18 horas. Se determinaron las CFU/ml (CFU/ml=(media del nº de colonias X factor de dilución)/0,050 ml) y se promedió para cada dilución con el fin de determinar las CFU/ml medias. El día de la inyección, se descongelaron alícuotas de cada cepa, se combinaron en un tubo por cepa, y se pasaron por el vórtex.

Animal, sexo, especie, número, edad y fuente

[0081] Se adquirieron ratones hembra Balb/C (5-6 semanas de edad) en Taconic Quality Laboratory Animals and Services for Research (Germantown, NY). Se dejó que los animales se aclimataran durante al menos 14 días antes del inicio del tratamiento. Tras su llegada, los ratones se examinaron, y se alojaron en grupos (5/jaula) en jaulas de policarbonato del tamaño de una caja de zapatos con un lecho absorbente. Todos los ratones se pusieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas según las normas necesarias para la cría encontradas en la Guía de la NIH para el Cuidado y uso de animales de laboratorio.

Identificación y distribución aleatoria

[0082] Todos los animales se identificaron de forma única con el uso de tatuajes en las colas antes de la

5 dosificación. Antes de iniciar el tratamiento, los animales se pesaron individualmente y se evaluó su estado de salud. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente y se asignaron a grupos de tratamiento usando pesos corporales estratificados.

Anticuerpos monoclonales específicos (Mab) para ClfA, isotipo

10 [0083] Anticuerpos monoclonales murinos específicos para ClfA se sometieron al isotipado usando el sistema de cuantificación diferencial Becton Dickenson Cytometric Bead Array for Murine Isotyping. El isotipo se determinó usando citometría de flujo según el protocolo del fabricante.

13.1 CIf40 Mab, IgG, 15 13.2 CIf40 Mab, IgG,

12.9 CIf33 Mab, IgG,

Controles

20 [0084] ATTC 1771, IgG1

El Tampón fosfato salino, pH 7,4 (PBS) se adquirió en Life Technologies, Inc. (Cat. No. 10010-023; Lote No: 1078749).

25 Diseño experimental [0085]

Tabla V

TRATAMIENTO

EXPOSICIÓN

Grupo Nº

Nº de ratones Anticuerpo Dosis Vía Frecuencia Punto temporal Bacteria Dilución de la disolución madre Volumen/ Vía

1

12 13-2 36 mg/kg i.p. Una vez -18 hr. ATCC 25923 1:20 0,1 ml/IV

2

15 CRL17 71 36 mg/kg mg/kg ATCC 25923 1:20

3

15 D-PBS N/A ATCC 25923 1:20

4

12 13-2 36 mg/kg Barnett 1:20

5

15 CRL17 71 36 mg/kg Barnett 1:20

6

15 D-PBS N/A Barnett 1:20

Datos de los animales in vivo

[0086] Los ratones se trataron mediante inyección intraperitoneal (IP; 0,5 ml) con 0,5 mg de anticuerpo monoclonal 13-2, anticuerpo monoclonal control del isotipo CRL-1771, o PBS. 18 horas después de la administración de la IgG, los ratones se expusieron a la cepa de Barnett de S. aureus o S. aureus ATCC 25923 con una sola inyección intravenosa (IV). Se hizo el seguimiento de los ratones durante 12 días, momento en el que todos 35 los ratones restantes se sacrificaron. Entre los grupos de tratamiento se detectaron diferencias significativas en los tiempos de supervivencia relativos. El 83% (10/12) de los ratones que habían recibido el Mab 13-2, el 13% (2/15) de los animales que habían recibido el CRL-1771, y el 0% (0/15) de los que habían recibido el PBS sobrevivieron a la exposición bacteriana con la cepa Barnett de S. aureus (13-2 vs. PBS, p<0,0001; 13-2 vs. CRL-1771, p = 0,0009). El análisis estadístico de los datos de los animales se llevó a cabo usando un Análisis de supervivencia Kaplan-Meier

con una prueba Mantel-Cox (logrank). En el experimento en el que el S. aureus ATCC 25923 era la bacteria a la que se exponía al animal, sobrevivieron el 67% (8/12) de los ratones a los que se les había administrado el Mab 13-2, sobrevivieron el 27% (4/12) en el grupo tratado con CRL-1771, y sólo sobrevivió el 7% (1/15) en el grupo tratado con PBS (13-2 vs. CRL-1771, p=0,02; 13-2 vs. PBS, 0,0002). Estos resultados indican claramente que los anticuerpos

5 monoclonales específicos para MSCRAMM proporcionan un nivel de protección significativo frente a la infección letal con cepas de S. aureus.

Ejemplo 7. Aislamiento y secuenciación de secuencias de regiones variables

10 A. Anticuerpo monoclonal 13-2

[0087] Se aisló el ARN mensajero procedente de células de hibridoma de CIfA 13-2 usando el kit Fast Track

2.0 (Invitrogen; cat #K4500). Resumiendo, 1,4x108 células de hibridoma cultivadas en medio DMEM-10 con FBS al 10% se lavaron con PBS, se sedimentaron por centrifugación y a continuación se lisaron en detergente que contiene 15 Protein/RNase Degrader. Se aisló el ARNm PolyA+ mediante purificación por afinidad en oligo-dT celulosa. La síntesis de la primera cadena de ADNc se consiguió usando 5 μg de ARNm y transcriptasa inversa en un kit de síntesis de ADNc (Novagen; cat #69001-3) que contiene 20 pmol de cebadores específicos de oligonucleótidos 3' de ratón (Novagen; cat# 69796 y 69812) para cada una de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables. Se amplificó una porción (5 a 50 ng) del ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el 20 PCR Reagent System (Life Technologies; cat#10198-018) y un grupo de cebadores específicos de las cadenas variables pesada y ligera de ratón (Novagen; cat# 70081-3, 5 pmol cada uno) durante 30 ciclos (inicio en caliente a 94°C y a continuación ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min y 72°C durante 1 min). Los productos de la PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 1% ultrapuro en tampón de acetato sódico y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos de la PCR que coincidían con el tamaño 25 predicho se escindieron del gel y se purificaron usando columnas BIO 101 Geneclean Spin (cat #1101-400) para la ligación en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por la transformación en E. coli TOP10 competente (Invitrogen; cat# K4500). Después de aislar el ADN del plásmido usando el kit QlAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat# 27106), se identificaron los clones positivos con insertos mediante la digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa, seguido por la secuenciación en un secuenciador automático ABI usando los

30 cebadores directo M13 e inverso M13.

[0088] Las secuencias resultantes fueron las siguientes:

13-2VLA-1 (secuencia variable ligera)

[0089]

• Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

13-2VHC-3 (secuencia variable pesada)

[0090]

•

Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

B.

Anticuerpo monoclonal 12-9

[0091] Se aisló el ARN mensajero procedente de células de hibridoma de CIfA 12-9 usando el kit Fast Track

2.0 (Invitrogen; cat #K4500). Resumiendo, 1,4x108 células de hibridoma cultivadas en medio DMEM-10 con FBS al 10% se lavaron con PBS, se sedimentaron por centrifugación y a continuación se lisaron en detergente que contiene Protein/RNase Degrader. Se aisló el ARNm PolyA+ mediante purificación por afinidad en oligo-dT celulosa. La síntesis de la primera cadena de ADNc se consiguió usando 5 μg de ARNm y transcriptasa inversa en un kit de síntesis de ADNc (Novagen; cat #69001-3) que contiene 20 pmol de cebadores específicos de oligonucleótidos 3' de ratón (Novagen; cat# 69796 y 69812) para cada una de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables. Se amplificó una porción (5 a 50 ng) del ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el PCR Reagent System (Life Technologies; cat#10198-018) y un grupo de cebadores específicos de las cadenas variables pesada y ligera de ratón (Novagen; cat# 70081-3, 5 pmol cada uno) durante 30 ciclos (inicio en caliente a 94°C y a continuación ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min y 72°C durante 1 min). Los productos de la PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 1% ultrapuro en tampón de acetato sódico y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos de la PCR que coincidían con el tamaño predicho se escindieron del gel y se purificaron usando columnas BIO 101 Geneclean Spin (cat #1101-400) para la ligación en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por la transformación en E. coli TOP10 competente (Invitrogen; cat# K4500). Después de aislar el ADN del plásmido usando el kit QlAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat# 27106), se identificaron los clones positivos con insertos mediante la digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa, seguido por la secuenciación en un secuenciador automático ABI usando los cebadores directo M13 e inverso M13.

[0092] Las secuencias resultantes fueron las siguientes:

12-9VLA-1 (secuencia variable ligera)

[0093]

• Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

12-9VLA-1 (secuencia variable pesada) [0094]

•

Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

C.

Anticuerpo monoclonal 35-220.

15 Aislamiento y secuenciación de secuencias de las regiones variables:

[0095] Se aisló el ARN mensajero procedente de células de hibridoma de CIfA 35-220 usando el kit Fast Track

2.0 (Invitrogen; cat #K4500). Resumiendo, 1,4x108 células de hibridoma cultivadas en medio DMEM-10 con FBS al 10% se lavaron con PBS, se sedimentaron por centrifugación y a continuación se lisaron en detergente que contiene

20 Protein/RNase Degrader. Se aisló el ARNm PolyA+ mediante purificación por afinidad en oligo-dT celulosa. La síntesis de la primera cadena de ADNc se consiguió usando 5 μg de ARNm y transcriptasa inversa en un kit de síntesis de ADNc (Novagen; cat #69001-3) que contiene 20 pmol de cebadores específicos de oligonucleótidos 3' de

ratón (Novagen; cat# 69796 y 69812) para cada una de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables. Se amplificó una porción (5 a 50 ng) del ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el PCR Reagent System (Life Technologies; cat#10198-018) y un grupo de cebadores específicos de las cadenas variables pesada y ligera de ratón (Novagen; cat# 70081-3, 5 pmol cada uno) durante 30 ciclos (inicio en caliente a 5 94°C y a continuación ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min y 72°C durante 1 min). Los productos de la PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 1% ultrapuro en tampón de acetato sódico y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos de la PCR que coincidían con el tamaño predicho se escindieron del gel y se purificaron usando columnas BIO 101 Geneclean Spin (cat #1101-400) para la ligación en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por la transformación en E. coli TOP10 competente

10 (Invitrogen; cat# K4500). Después de aislar el ADN del plásmido usando el kit QlAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat# 27106), se identificaron los clones positivos con insertos mediante la digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa, seguido por la secuenciación en un secuenciador automático ABI usando los cebadores directo M13 e inverso M13.

15 [0096] Las secuencias resultantes fueron las siguientes:

35-220VLD-4 (ADN de la secuencia variable ligera)

[0097]

35-220VLD-4 (secuencia variable ligera) 25 [0098]

• Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

30 35-220VHC-1 (ADN de la secuencia variable pesada) [0099]

35-220VHC-1 (secuencia variable pesada) [0100]

•

Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

D.

Anticuerpo monoclonal 35-006

10 Aislamiento y secuenciación de secuencias de las regiones variables:

[0101] Se aisló el ARN mensajero procedente de células de hibridoma de CIfA 35-006 usando el kit Fast Track

2.0 (Invitrogen; cat #K4500). Resumiendo, 1,4x108 células de hibridoma cultivadas en medio DMEM-10 con FBS al 10% se lavaron con PBS, se sedimentaron por centrifugación y a continuación se lisaron en detergente que contiene 15 Protein/RNase Degrader. Se aisló el ARNm PolyA+ mediante purificación por afinidad en oligo-dT celulosa. La síntesis de la primera cadena de ADNc se consiguió usando 5 μg de ARNm y transcriptasa inversa en un kit de síntesis de ADNc (Novagen; cat #69001-3) que contiene 20 pmol de cebadores específicos de oligonucleótidos 3' de ratón (Novagen; cat# 69796 y 69812) para cada una de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables. Se amplificó una porción (5 a 50 ng) del ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el 20 PCR Reagent System (Life Technologies; cat#10198-018) y un grupo de cebadores específicos de las cadenas variables pesada y ligera de ratón (Novagen; cat# 70081-3, 5 pmol cada uno) durante 30 ciclos (inicio en caliente a 94°C y a continuación ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min y 72°C durante 1 min). Los productos de la PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 1% ultrapuro en tampón de acetato sódico y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos de la PCR que coincidían con el tamaño 25 predicho se escindieron del gel y se purificaron usando columnas BIO 101 Geneclean Spin (cat #1101-400) para la ligación en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por la transformación en E. coli TOP10 competente (Invitrogen; cat# K4500). Después de aislar el ADN del plásmido usando el kit QlAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat# 27106), se identificaron los clones positivos con insertos mediante la digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa, seguido por la secuenciación en un secuenciador automático ABI usando los

30 cebadores directo M13 e inverso M13.

[0102] Las secuencias resultantes fueron las siguientes:

35-006VLD-1 (ADN de la secuencia variable ligera)

[0103] 35-006VLD-1 (secuencia variable ligera) [0104]

5 • Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

35-006VHC-1 (ADN de la secuencia variable pesada)

[0105]

35-006VHC-1 (secuencia variable pesada) 15 [0106]

• Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados

20 Ejemplo 8. Generación de anticuerpo 12-9 quimérico con equivalencia en las cinéticas de unión y en la reactividad de células completas al anticuerpo murino 12-9.

[0107] Se generó anticuerpo 12-9 quimérico usando regiones constantes humanas (cadena ligera: kappa;

cadena pesada: G1, 3 ó 4) aisladas a partir de sangre entera de voluntarios humanos (selección de ARN PolyA y 25 amplificación por PCR de la primera cadena de ADNc). Para la expresión en células de mamífero, se añadió un

único sitio de restricción Bsm 1 al extremo 5' de ambas secuencias de la región variable de la cadena pesada y

ligera. En el extremo 3' (la unión de procesamiento alternativo a la respectiva región constante) se añadió un sitio

Bsiw1 a la región variable de la cadena ligera y se añadió un sitio Apa1 a la región variable de la cadena pesada.

Esto se consiguió con el diseño de cebadores de oligonucleótidos y amplificación por PCR del molde apropiado del 30 ADN de 12-9 seguido de la secuenciación confirmatoria del ADN.

[0108] La expresión de versiones quiméricas de la proteína 12-9 se consiguió usando el vector de expresión

en mamíferos pCEP4 (Invitrogen, cat# V044-50) que contiene una secuencia de secreción líder de la

inmunoglobulina humana (Bsm1 como sitio de clonación) con la región constante kappa para la expresión de la 35 cadena ligera o la región constante gamma (1, 3 ó 4) para la expresión de la cadena pesada. El plásmido de

expresión en mamíferos estaba diseñado para la expresión tanto de las cadenas pesada como ligera con

promotores del hCMV distintos sobre el mismo plásmido o la expresión de las cadenas ligera y pesada sobre plásmidos pCEP4 diferentes mediante co-transfección. El anticuerpo 12-9 quimérico funcional se expresó después de la transfección del ADN plasmídico que contiene las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 12-9 en células HEK293 EBNA con Fugene (Roche Diagnostic, cat#1814443) bajo selección con higromicina (300 μg/ml). Los

5 sobrenadantes se recogieron y se analizaron por Biacore para las cinéticas de unión y citometría de flujo para la unión a células de S. aureus.

[0109] Los resultados representados en las Figuras 2 y 3 con anticuerpo 12-9 quimérico recombinante confirman que la secuencia de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 12-9 replica las cinéticas de unión y la

10 especificidad del anticuerpo 12-9 original caracterizado como un sobrenadante de hibridoma.

Ejemplo 9. Humanización de las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo 12-9

[0110] Este proceso de humanización se centra en cambiar solamente los restos de las regiones variables de

15 ratón expuestos al disolvente que no están involucrados en la especificidad y afinidad de la molécula por el antígeno ClfA diana. La información para estas determinaciones utiliza las determinaciones de disponibilidad del disolvente publicadas por Padlan (un procedimiento posible para reducir la inmunogenicidad de los dominios variables del anticuerpo mientras se conservan sus propiedades de unión al ligando. Molecular Immunology, 28(4); 489-498, 1991), y para realizar estas determinaciones no se usó una modelización molecular por simulación computerizada o

20 algoritmos para determinar los epítopos de los linfocitos T.

[0111] El enfoque representa un proceso mediante el cual los restos de la región variable de ratón de las cadenas ligera y pesada se cambian mediante mutagénesis dirigida de sitio para reflejar la arquitectura expuesta de la superficie de la mayor parte de la región variable humana homóloga en las bases de datos públicas. 25 Específicamente, a los aminoácidos que definen las cadenas variables pesada y ligera se les asignó un número de posición de Kabot y una designación de &quot;exposición&quot; basada en Padlan, permitiendo el alineamiento de los aminoácidos a partir de cada subgrupo de estructuras humanas (I-III para la cadena pesada y I-IV para la cadena ligera). Para confirmar este análisis, se llevó a cabo una búsqueda en BLAST en la base de datos de la inmunoglobulina humana así como en la base de datos de todas las proteínas donde la región variable con la 30 homología más elevada a la secuencia de ratón (tanto en línea germinal como en línea madura) se seleccionó y se alineó con la secuencia murina de interés. Una vez alineada, se identificó el subgrupo humano con la homología más elevada a la secuencia de ratón. Los restos de aminoácidos de ratón expuestos se mutaron para mimetizar la mayor parte del subgrupo humano homólogo. En los casos en los que se encontró más de un aminoácido en el subgrupo en esa posición, se usó el aminoácido representado en la secuencia de la línea germinal humana con la

35 homología más elevada al anticuerpo 12-9. Estos cambios se consiguieron con oligonucleótidos mutágenos mediante PCR seguida de secuenciación conformacional del ADN.

12-9VL-Hu (ADN de la secuencia ligera variable humanizada)

40 [0112]

12-9VL-Hu (secuencia ligera variable humanizada)

[0113]

Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados, los aminoácidos en negrita representan cambios en 5 la humanización.

12-9VH-Hu (ADN de la secuencia pesada variable humanizada) [0114]

12-9VH-Hu (secuencia pesada variable humanizada) 15 [0115]

Los aminoácidos que representan una CDR están subrayados, los aminoácidos en negrita representan cambios en la humanización.

20 Ejemplo 10. Comparación de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CIfA, 12-9A (INH-M010001) y 35

052.1 (INH-M01016), con el anticuerpo CRL1771 control de isotipo coincidente, INH-M000029, en un modelo de sepsis de ratón usando la cepa 67-0 de S. aureus resistente a meticilina (MRSA).

25 [0116] El propósito de este ejemplo es caracterizar los efectos protectores de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CIfA, 12-9A (INH-M010001) y 35-052.1 (INH-M01016) comparados con el anticuerpo CRL1771 control de isotipo coincidente (INH-M000029) usando una dosis de 0,3 mg de anticuerpo y la cepa 67-0 de S. aureus en un modelo de sepsis de ratón.

Especie

Cepa Sexo Número Edad* Peso* Fuente*

Ratones

Balb/C Hembras 90 4-5 semanas 12-16 gramos Taconic Farms, Inc. (Germantown, NY)

*Intervalo estimado al inicio del estudio.

[0117] La dosificación se llevó a cabo con la administración de una inyección intraperitoneal (i.p.) de anticuerpo monoclonal a los animales adecuados (véase a continuación). La administración del anticuerpo se llevó a cabo aproximadamente 18 horas antes de la inyección intravenosa (i.v.) de S. aureus. La infección sistémica se midió usando un solo parámetro (mortalidad).

TRATAMIENTO

EXPOSICIÓN

Grupo #

Nº de ratones Anticuerpos Dosis Vía Frecuencia Punto temporal* Bacteria CFU Volumen/Vía

1

30 12-9A 0,3 mg. i.p. Una vez -18 hr. S. aureus 67-0 ~108 0,1 ml./ i.v.

2 3

30 30 35-052 CRL1771 0,3 mg. 0,3 mg.

*Los puntos temporales reflejan las horas posteriores a la exposición bacteriana

Preparación, almacenamiento y manipulación:

Staphylococcus aureus

5 [0118] Se tomaron células de la cepa 67-0 de MRSA de una disolución madre de glicerol congelada, se inocularon en una única placa de agar con sangre y se crecieron durante 24 horas a 37°C. A continuación las colonias aisladas se transfirieron a nuevas placas de agar con sangre. Se inocularon 80 placas para preparar 50 ml de la disolución madre final congelada. A continuación las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C. Después de

10 la incubación, las colonias se extrajeron de la superficie de cada placa con un rascador y se llevaron a cuatro tubos de 50 ml que contienen 10 ml de 1X PBS (20 placas por tubo) mientras se pasaba suavemente por el vórtex para eliminar las bacterias del rascador. A continuación se añadieron 10 ml más de 1X PBS a los 10 ml de suspensión bacteriana, mientras se pasaba vigorosamente por el vórtex para facilitar la separación de cualquier resto de agar de la bacteria. La suspensión se sedimentó por centrifugación a 3500g a 4°C durante 10 minutos. La bacteria se lavó en

15 D-PBS y se resuspendió en 50 ml de medio de congelación. La disolución madre bacteriana se puso en alícuotas de 1 ml por congelación instantánea en un baño de etanol/hielo seco y se llevó a un congelador a -80°C. La concentración (CFU/ml) de la disolución madre congelada se determinó descongelando una alícuota de 1 ml, y preparando diluciones seriadas entre 10-5 y 10-11. Las diluciones se cultivaron por duplicado en placas de agar con sangre y se incubaron a 37°C durante 16-18 horas. Se determinaron las CFU/ml (CFU/ml=(media del nº de colonias

20 X factor de dilución)/0,050 ml) y se promedió para cada dilución con el fin de determinar las CFU/ml medias. El día de la inyección, se descongelarán alícuotas de cada cepa, se combinarán en un tubo por cepa, y se pasarán por el vórtex. A continuación se prepararán diluciones de cada disolución madre.

Anticuerpo monoclonal 12-9A contra CIfA, INH-M010001 (LN: IAA2E1354)

25 [0119] Se purificó el anticuerpo monoclonal 12-9A (IgG, subtipo) a partir de medio de cultivo de hibridoma exento de suero usando cromatografía de afinidad con proteína G. Se informó de que el material estaba a una concentración de 7,0 mg/ml con una concentración de endotoxina de 1,0 EU/mg de proteína. El material se almacenó refrigerado a 4°C. El día de la inyección, el material se diluirá a 0,6 mg/ml y se administrarán 0,5 ml

30 mediante una inyección intraperitoneal al grupo apropiado de animales. La dosis final que se administrará será de 0,3 mg de IgG.

Anticuerpo monoclonal 35-052.1 contra CIfA, INH-M01016 (LN: IAA2H1422)

35 [0120] Se purificó el anticuerpo monoclonal 35-052.1 (IgG, subtipo) a partir de medio de cultivo de hibridoma exento de suero usando cromatografía de afinidad con proteína G. Se informó de que el material estaba a una concentración de 4,2 mg/ml con una concentración de endotoxina de 1,0 EU/mg de proteína. El material se almacenó refrigerado a 4°C. El día de la inyección, el material se diluirá a 0,6 mg/ml y se administrarán 0,5 ml mediante una inyección intraperitoneal al grupo apropiado de animales. La dosis final que se administrará será de

40 0,3 mg de IgG.

Anticuerpo monoclonal CRL 1771 control (INH-M000029, LN: IAA2E1337)

[0121] Se purificó el anticuerpo monoclonal CRL 1771 (IgG, subtipo) a partir de medio de cultivo de hibridoma

45 exento de suero usando cromatografía de afinidad con proteína G. Se informó de que el material estaba a una concentración de 5,0 mg/ml con una concentración de endotoxina de 0,2 EU/mg de proteína. El material se

almacenó refrigerado a 4°C. El día de la inyección, el material se diluirá a 0,6 mg/ml y se administrarán 0,5 ml mediante una inyección intraperitoneal al grupo apropiado de animales. La dosis final que se administrará será de 0,3 mg de IgG.

5 Alojamiento, comida, agua y entorno:

[0122] Tras la recepción, todos los animales fueron examinados y se alojaron en grupo (5/jaula) en jaulas de policarbonato del tamaño de una caja de zapatos con un lecho absorbente Bed-o-cobb. Todos los animales tienen libre acceso al alimento (Harlan/Teklad Mouse Pelleted Diet #7012) y agua corriente con un ciclo de 12 horas de luz

10 oscuridad. Todos los aspectos del cuidado de los animales y las condiciones de cría necesarias se harán de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y uso de animales de laboratorio.

Identificación y distribución aleatoria

15 [0123] Todos los animales se identificaron de forma única con el uso de tatuajes en las colas antes del tratamiento. Antes del tratamiento, los animales se pesaron individualmente y se volvió a evaluar su estado de salud. Los ratones se asignaron a grupos de tratamiento basándose en una distribución aleatoria usando pesos corporales estratificados.

20 [0124] Los datos demuestran el valor terapéutico de un anticuerpo dirigido contra ClfA tal como 12-9 que interfiere con la adhesión ClfA-fibrinógeno comparado con un control isotípico no específico de ClfA (CRL 1771) así como un control específico (35-052) que reconoce la CIfA en un sitio independiente de la unión de CIfA-fibrinógeno.

Ejemplo 11. Reconocimiento por parte del anticuerpo 12-9 y 35-052 de la cepa de S. aureus en comparación 25 con el isotipo control (CRL 1771)

[0125] Se recogieron muestras bacterianas de S. aureus (cepas de Newman -WT, 67-0, 560 Sal 1, 203 Sal 2, 451 Sal 4, 206 Sal5, 397 Sal 6, 49, 189, 203 y 4046) a las tres horas y después de toda la noche, se lavaron y se incubaron con Mab 12-9, 35-52 o 1771 solo (control) a una concentración de 2 mg/ml después de bloquear los sitios 30 de la proteína A con IgG de conejo (50 mg/ml). Las cepas de S. aureus que contienen una designación Sal representan 5 linajes distintos que representan el 65,68% de todos los aislados clínicos (Booth, y col., Infect. Immun. 69, 345-353, 2001). Además, se analizaron las cepas de Newman CIfA::emr (deficiente en CIfA) y NewmanSpa::kan (deficiente en proteína A) de la misma manera como controles de la especificidad. Después de la incubación con anticuerpo, las células bacterianas se incubaron con F(ab’)2 de cabra dirigida contra F(ab’)2-FITC de ratón que sirvió

35 como anticuerpo de detección. Después del marcaje del anticuerpo, las células bacterianas se aspiraron a través del citómetro de flujo FACScaliber para analizar la emisión de fluorescencia (excitación: 488, emisión: 570). Para cada cepa bacteriana se recogieron y se midieron 10.000 casos.

Tabla VI. Reactividad de la cepa de S. aureus

Intensidad de fluorescencia (Media geométrica)

Cepa de S, aureus

Tiempo de cultivo 12-9 35-052 CRL 1771

Newman silvestre

3 hr 30,8 11,1 0,5

toda la noche

44,3 30 0,9

67-0

3 hr 11,2 4,2 2

toda la noche

27,6 1,9 1,1

560 SAL 1

3 hr 28,8 8,4 3,9

toda la noche

36,1 6,2 1,2

203 SAL2

3 hr 16,1 0,6 2,2

toda la noche

40,4 1,9 1,4

451 SAL4

3 hr 1,1 0 0

toda la noche

12,9 0 0

206 SAL5

3 hr 8,8 1,3 1

toda la noche

33,5 7,7 0,9

397 SAL6

3 hr 28,9 7,9 0,3

toda la noche

62,1 40,0 1,0

49 Europa

3 hr 7,3 1,2 0

toda la noche

11,3 5,7 0

189 Japón

3 hr 11,0 0 0

toda la noche

15,7 0 0

203 Singapur

3 hr 22,1 3,3 0,1

toda la noche

15,4 2,5 0,2

4046 USA

3 hr 27,7 2,5 1,3

toda la noche

23,5 1,2 0,3

Newman CIfA::emr

3 hr 0,2 0,3 0,2

toda la noche

1,4 0,8 0,9

Newman Spa::kan

3 hr 18,6 4,9 0

toda la noche

23,9 9,2 0

D Indica actividad positiva

Estos datos resaltan la importancia de seleccionar un anticuerpo dirigido contra CIfA (tal como 12-9) que sea capaz de reconocer un epítopo funcional de la molécula CIfA; es decir, el sitio de unión para el fibrinógeno.

5 [0126] Se identificó a otro grupo de aislados de S. aureus, una representación de 11 complejos genotípicos clonales diferentes como causas de enfermedad desproporcionadamente habituales, derivados mediante el tipado de secuencias multi-locus (Day, y col. 2001. A link between virulence and ecological abundance in natural populations of Staphylococcus aureus. Science, 292:114-116). Cada cepa se sometió a pruebas para su reactividad frente al anticuerpo 12-9 mediante citometría de flujo como se ha descrito anteriormente.

Tabla VII. Reactividad del anticuerpo 12-9 con aislados de S. aureus

Designación de la cepa de S. aureus

Tipo de secuencia Complejo clonal Reactividad a 12-9

16

25 8 +

96

47 10 +

117

12 4 +

138

30 9 +

150

9 14 +

160

34 7 +

207

15 5 +

252

36 9 +

315

8 3 +

364

39 9 +

396

30 9 +

433

5 2 +

434

8 3 +

451

5 2 +

456

45 10 +

458

15 5 +

476

1 1 +

481

47 10 +

512

1 1 +

597

25 8 +

720

22 7 +

730

45 10 +

837

12 4 +

863

20 11 +

888

39 9 +

959

34 9 +

Ejemplo 12. Homología de la región variable en anticuerpos dirigidos contra ClfA que inhiben la unión de células completas de S. aureus

Esta reactividad demuestra adicionalmente la conservación del epítopo del anticuerpo 12-9 sobre ClfA en cepas aisladas de S. aureus, lo que sugiere que la unión de ClfA-fibrinógeno está funcionalmente conservada.

[0127] Un resultado inesperado en la selección de anticuerpos dirigidos contra ClfA basada en la capacidad 20 para inhibir la unión de ClfA a fibrinógeno fue la similitud en las secuencias de aminoácidos de las regiones

determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones de las cadenas variables ligera y pesada. Para perfilar esto, se seleccionaron anticuerpos dirigidos contra ClfA en base a la inhibición de la unión de células enteras de S. aureus a placas recubiertas con fibrinógeno usando el siguiente procedimiento: los anticuerpos de interés se diluyeron de manera seriada comenzando a 4 μg/ml en tampón de ensayo. Al mismo tiempo, un cultivo de S. aureus (Newman spa::kan) se lavó, se bloqueó con IgG de conejo y a continuación se tiñó con tinción de ADN fluorescente permeable a células Syto 13 y se incubó durante 10 minutos. Se mezclaron volúmenes iguales de células teñidas y anticuerpo diluido y se incubó a 4°C durante 30 minutos, y a continuación se añadió cada muestra a pocillos duplicados de placas de microtitulación bloqueadas/recubiertas con fibrinógeno humano. Las placas se incubaron a 4°C durante una hora, se lavaron, se añadió tampón a cada pocillo y se leyó en un lector de placas de fluorescencia.

[0128] Las cadenas ligera y pesada variables de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CIfA, 12-9, 132, 35-006 y 35-220 así como CRL 1771 (control no específico) se clonaron y se secuenciaron para obtener una secuencia de aminoácidos predicha de la siguiente manera. Resumiendo, 1,4x108 células de hibridoma cultivadas en medio DMEM-10 con FBS al 10% se lavaron con PBS, se sedimentaron por centrifugación y a continuación se lisaron en detergente que contiene Protein/RNase Degrader. Se aisló el ARNm PolyA+ mediante purificación por afinidad en oligo-dT celulosa. La síntesis de la primera cadena de ADNc se consiguió usando 5 μg de ARNm y transcriptasa inversa en un kit de síntesis de ADNc (Novagen; cat #69001-3) que contiene 20 pmol de cebadores específicos de oligonucleótidos 3' de ratón (Novagen; cat# 69796 y 69812) para cada una de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables. Se amplificó una porción (5 a 50 ng) del ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el PCR Reagent System (Life Technologies; cat#10198-018) y un grupo de cebadores específicos de las cadenas variables pesada y ligera de ratón (Novagen; cat# 70081-3, 5 pmol cada uno) durante 30 ciclos (inicio en caliente a 94°C y a continuación ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min y 72°C durante 1 min). Los productos de la PCR se fraccionaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 1% ultrapuro en tampón de acetato sódico y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos de la PCR que coincidían con el tamaño predicho se escindieron del gel y se purificaron usando columnas BIO 101 Geneclean Spin (cat #1101-400) para la ligación en el plásmido pCR2.1-TOPO (Invitrogen), seguido por la transformación en E. coli TOP10 competente (Invitrogen; cat# K4500). Después de aislar el ADN del plásmido usando el kit QlAprep Spin Miniprep (QIAGEN; cat# 27106), se identificaron los clones positivos con insertos mediante la digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa, seguido por la secuenciación en un secuenciador automático ABI usando los cebadores directo M13 e inverso M13.

[0129] Como se muestra en la Figura 7, los datos muestran que hay una conservación considerable en la mayor parte de la porción variable de las cadenas de inmunoglobulina que definen la especificidad de unión para los anticuerpos monoclonales dirigidos contra ClfA con la inhibición de la unión de S. aureus a fibrinógeno. Esta homología está representada en tres fusiones diferentes que generan hibridomas (12, 13 y 35); en condiciones variables como las de preparación del antígeno de ClfA, el procedimiento y la secuencia de las inmunizaciones antes de la fusión. En particular, estos datos revelaron regiones conservadas consenso en las regiones CDR1 y CDR2 de la cadena pesada variable de anticuerpos monoclonales que se unen a CIfA así como regiones conservadas en las regiones CDR1, CDR2, y CDR3 de las cadenas ligeras variables de los anticuerpos de la presente invención. Así, estos datos muestran que la preparación de anticuerpos con las secuencias conservadas deben tener las mismas propiedades de unión y así entrarán dentro del alcance de la presente invención.

[0130] Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos que se unirán a ClfA se pueden preparar usando las cadenas ligera o pesada variables que tienen las mismas regiones CDR claves como se indica en el consenso de la Figura 8. En particular, estos anticuerpos incluirán aquellos que presentan una cadena pesada variable donde la región CDR1 incluye la secuencia RYSVH, y/o una región CDR2 que incluye la secuencia MIWGGGNTDYNSALKS, y una cadena ligera variable que presenta una región CDR1 que incluye la secuencia KSSQSVLYSSNQKNYLA, una región CDR2 que incluye la secuencia WASTRES, y/o una región CDR3 que incluye la secuencia HQYLSSYT.

Ejemplo 13. Expresión de anticuerpos 12-9 humanizados para uso clínico y preclínico

[0131] Para la expresión simultánea de las cadenas polipeptídicas ligera y pesada de la inmunoglobulina, se clonaron los dos genes en un único plásmido con cada gen bajo el control de un promotor de hCMV-MIE diferente. Este vector con los dos genes contiene una única copia del marcador seleccionable GS (Lonza; Slough, RU) para su introducción en la célula hospedadora en un único episodio de transfección. Las células se transfectaron usando Fugene-6 (Roche) en las condiciones sugeridas por el fabricante. Los sobrenadantes se sometieron a ensayo en líneas celulares derivadas de manera estable o transitoria y se compararon con el anticuerpo 12-9 murino y quimérico derivado.

[0132] Este ejemplo demuestra que el anticuerpo 12-9 humanizado se puede humanizar, clonar y expresar en un único casete de expresión capaz de producir rendimientos para apoyar la calidad y pureza a escala comercial.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0133]

<110> PATTI, Joseph M HUTCHINS, Jeff T DOMANSKI, Paul PATEL, Pratiksha HALL, Andrea

<120> MONOCLONAL ANTIBODIES TO THE CLFA PROTEIN…

<130> P07069US04/BAS

<150> 60/308,116

<151> 2001-07-30

<150> 60/298,413

<151> 2001-06-18

<150> 60/274,611

<151> 2001-03-12

<150> 60/264,072

<151> 2001-01-26

<160> 20

<170> Patently version 3.1

<210> 1

<211> 1560

<212> ADN

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

<210> 2

<211> 520

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus 5 <400> 2

<210> 3

<211> 990 10 <212> ADN

<213> Staphylococcus aureus

<400> 3

<210> 4

<211> 331

<212>

PRT 5 <213> Staphylococcus aureus

<400> 4

<210> 5

<211> 336

<212>

ADN 5 <213> Staphylococcus aureus

<400> 5

<210> 6

<211> 112 10 <212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 6

<210> 7

<211> 354

<212> ADN 5 <213> Staphylococcus aureus

<400> 7

<210> 8

<211> 118 10 <212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 8

<210> 9

<211> 336

<212> ADN 5 <213> Staphylococcus aureus

<400> 9

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 10

<210> 11

<211> 363

<212> ADN

<213> Staphylococcus aureus 10 <400> 11

<210> 12

<211> 121

<212> PRT 5 <213> Staphylococcus aureus

<400> 12

<210> 13

<211> 336

<212> ADN

<213> Staphylococcus aureus

<400> 13

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213>

Staphylococcus aureus 10 <400> 14

<210> 15

<211> 354

<212> ADN

<213> Staphylococcus aureus

<400> 15

<210> 16

<211> 118

<212> PRT

<213>

Staphylococcus aureus 10 <400> 16

<210> 17

<211> 336

<212> ADN 5 <213> Staphylococcus aureus

<400> 17

<210> 18

<211> 112 10 <212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 18

<210> 19 5 <211> 363

<212> ADN

<213> Staphylococcus aureus

<400> 19

10 <210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 20

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal que se une al subdominio de unión CIf33 de la proteína CIfA de S. aureus, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal 12-9 que tiene

   (i)

   una secuencia ligera variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17 y sus degenerados; y

   (ii)

   una cadena pesada variable codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19 y sus degenerados

2. 2.

   El anticuerpo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo trata o previene una infección por S. aureus en un ser humano o un animal.

3. 3.

   El anticuerpo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo inhibe la unión de bacterias de estafilococo a fibrinógeno o fibrina.

4. 4.

   El anticuerpo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo es adecuado para la administración por vía parenteral, oral, intranasal, subcutánea, en aerosol o intravenosa a un ser humano o un animal.

5. 5.

   El anticuerpo según la reivindicación 1 donde el anticuerpo monoclonal es de un tipo seleccionado del grupo constituido por anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos, humanizados y humanos.

6. 6.

   El anticuerpo según la reivindicación 1 donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla.

7. 7.

   El anticuerpo según la reivindicación 1 que se genera contra una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

8. 8.

   El anticuerpo según la reivindicación 7, donde la proteína presenta una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos según la SEQ ID NO: 3, o sus degenerados.

9. 9.

   El anticuerpo según la reivindicación 1 que tiene una cadena ligera variable seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 18.

10. 10.

    El anticuerpo según la reivindicación 1 que tiene una cadena pesada variable seleccionada del grupo constituido por las SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 20.

11. 11.

    Antisuero aislado que contiene un anticuerpo según la reivindicación 1.

12. 12.

    Un kit diagnóstico que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 y medios para detectar la unión de ese anticuerpo.

13. 13.

    El kit diagnóstico según la reivindicación 12 donde dicho medio para la detección de la unión comprende un marcador detectable que está unido a dicho anticuerpo.

14. 14.

    Un procedimiento de diagnóstico de una infección por S. aureus que comprende la adición de un anticuerpo según la reivindicación 1 a una muestra sospechosa de estar infectada con S. aureus, y la determinación de si se han unido anticuerpos a la muestra.

15. 15.

    Una composición farmacéutica para prevenir o tratar una infección por S. aureus que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo de la reivindicación 1 o un vehículo, transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. 16.

    Un anticuerpo según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento o prevención de una infección por S. aureus que comprende la administración a un paciente humano o animal de una cantidad eficaz de dicho anticuerpo.

17. 17.

    El anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un antibiótico fisiológicamente

    aceptable.

18. 18.

    El anticuerpo según la reivindicación 1 que presenta reactividad cruzada con múltiples cepas de S. aureus.

19. 19.

    El anticuerpo según la reivindicación 1 que reconoce el dominio A de la proteína ClfA de S. aureus.

20. 20.

    El anticuerpo según la reivindicación 1 que tiene una cadena ligera variable que presenta la secuencia

    de aminoácidos SEQ ID NO: 10 y una cadena pesada variable que presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID 10 NO: 12.