ES2373151A1 - Uso de inhibidores de edg2 para el tratamiento de la artritis reumatoide. - Google Patents
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Abstract
Uso de inhibidores de EDG2 para el tratamiento
de la artritis reumatoide.
La presente invención se refiere al nuevo uso de
inhibidores de EDG2 para el tratamiento de la artritis reumatoide,
particularmente en aquellos pacientes que presentan niveles elevados
de moléculas proinflamatorias a pesar de haber sido tratados con
antiinflamatorios, es decir, que no responden a dichos
tratamientos.
Description
Uso de inhibidores de EDG2 para el tratamiento
de la artritis reumatoide.
La presente invención se enmarca en el campo de
la Biología Molecular, la Biología Celular, la Biotecnología y la
Biomedicina. La presente invención se refiere al uso de inhibidores
de EDG2 para el tratamiento de la artritis reumatoide,
particularmente en aquellos pacientes que presentan niveles elevados
de moléculas proinflamatorias a pesar de haber sido tratados con
antiinflamatorios.
\vskip1.000000\baselineskip
La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad
inflamatoria crónica que afecta a las articulaciones periféricas y
cursa con dolor, inflamación y, en muchos casos, incapacidad
funcional, consecuencia de la destrucción progresiva del cartílago y
hueso de las articulaciones afectas (Firestein GS; Nature 2003,
423:356-61; Huber LC et al. Rheumatology
2006, 45:669-675; Pope RM. Nature Rev
Immunol 2002, 2:527-535).
La AR se caracteriza por la hiperplasia de los
sinoviocitos residentes y por la infiltración de células
inflamatorias del torrente circulatorio. Los sinoviocitos y las
células inflamatorias secretan interleuquinas, quimioquinas,
moléculas de adhesión y metaloproteasas que perpetúan la
inflamación. La hiperplasia sinovial es un factor decisivo en la
destrucción articular y hay evidencias que parecen indicar que el
mecanismo responsable de dicha hiperplasia es la resistencia a la
apoptosis de las células sinoviales. Estudios in vitro e
in vivo han mostrado que solamente un pequeño porcentaje de
células sinoviales sufren apoptosis dependiente del ligando de Fas,
TNF\alpha (del inglés "tumor necrosis factor
\alpha") y TRAIL (del inglés
"TNF-related apoptosis-inducing
ligand"), a pesar de expresar receptores de muerte celular
(Baier A et al. Curr Opin Rheumatol 2003,
15:274-279; Korb A et al. Apoptosis 2009,
14:447-454).
La apoptosis es un proceso muy regulado y
fundamental en muchas situaciones fisiológicas. Se pueden distinguir
dos vías principales, la vía extrínseca, mediante la activación de
receptores de muerte, y la vía intrínseca o mitocondrial. En la vía
extrínseca, la unión de FasL, TNF\alpha y TRAIL a sus receptores
lleva al reclutamiento de FADD (del inglés "Fas associated
Death Domain") y
pro-caspasa-8, los cuales forman el
DISC (del inglés "Death-Inducing
Signalling Complex"), donde la caspasa-8 se
activa. A su vez, la caspasa-8 activa la
caspasa-3, que causa finalmente la fragmentación del
ADN y la muerte celular. La vía mitocondrial se induce en
situaciones de hipoxia, privación de factores de crecimiento y
exposición a drogas citotóxicas, llevando a la liberación del
citocromo c y a la activación de caspasa-9 mediada
por Apaf-1 (del inglés "Apoptosis
protease-activating
factor-1") (Ashkenazi A. et al.
Science 1998, 281:1305-1308; Green DR et al.
Science 2004, 305:626-629; Wajant H.
Science 2002, 296:1635-1636).
En los últimos años se han desarrollado nuevos
tratamientos biológicos basados en la inhibición de citoquinas
inflamatorias como TNF\alpha, interleuquina 1
(IL-1) e interleuquina 6 (IL-6), que
han permitido prevenir en muchos casos la progresión de la
enfermedad hacia la destrucción del cartílago y hueso. Sin embargo,
alrededor de un 40% de los pacientes no responden a estas terapias
y, en un porcentaje aún mayor, la respuesta es parcial (Chen YF
et al. Health Technol Assess, 2006, 10(42):
iii-iv, xi-xiii,
1-229.; Rubbert-Roth A et al.
Arthritis Res Ther 2009, 11
Sup 1 :S1).
Sup 1 :S1).
El receptor de ácido lisofosfatídico 1 (LPA1;
LPAR1, EDG2, Gpcr26, GPR26, Mrec1.3, rec.1.3, vzg-1,
VZG1) es un receptor acoplado a proteínas G que en humanos está
codificado por el gen LPAR1 o EDG2. Nochi y
colaboradores (J. Immunology, 2008, 181 (7):5111-9)
han descrito que el receptor de ácido lisofosfatídico 1 (LPAR1 o
EDG2) se expresa en altos niveles en los sinoviocitos de pacientes
con AR y que la unión del ácido lisofosfatídico (LPA) a este
receptor activa la expresión de la ciclooxigenasa 2, una molécula
implicada en la inflamación. Además, Zhao C y colaboradores (Mol
Pharmacol, 2008; 73:587-600) han mostrado que la
unión del LPA a este receptor también induce, en sinoviocitos de
pacientes con AR, la secreción de otras citoquinas inflamatorias
como IL-6 e IL-8. Mototani y
colaboradores (Hum Mol Genet. 2008, 15;
17(12):1790-7) han descrito que determinados
polimorfismos en el gen EDG2 aumentan la probabilidad de
padecer osteoartritis de rodilla. Ikegawa y Mototani (EP2153847A1)
han descrito el uso de agentes inhibitorios de EDG2 para el
tratamiento de una variedad de afecciones que cursan con destrucción
del cartílago y el hueso, entre las que se menciona la artritis
reumatoide. Estos autores describen el efecto antiinflamatorio de
los agentes inhibitorios de EDG2 y proponen su uso para disminuir la
inflamación en todos aquellos pacientes que sufran enfermedades del
cartílago y el hueso.
La mayor parte de los tratamientos de la AR,
tanto farmacológicos como biológicos, están dirigidos a disminuir la
inflamación, por lo que aquellos pacientes que no responden a
tratamientos antiinflamatorios no disponen de ninguna solución. Por
ello, se necesita un nuevo enfoque terapéutico para controlar la
enfermedad en la totalidad de los pacientes con AR, incluidos
aquellos que no responden a tratamientos antiinflamatorios.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere al nuevo uso de
inhibidores de EDG2 para el tratamiento de la artritis reumatoide
(AR), particularmente en aquellos pacientes que presentan niveles
elevados de moléculas proinflamatorias tras el tratamiento con
antiinflamatorios, es decir, que no responden a dichos
tratamientos.
Los autores de la presente invención han
demostrado que la inhibición de EDG2 corrige la hiperplasia de los
sinoviocitos en un ambiente inflamatorio, con TNF\alpha elevado,
el cual media la apoptosis de dichas células. Por tanto, los autores
de la presente invención han demostrado que la inhibición de EDG2 es
eficaz para mejorar la evolución clínica de la AR en un ambiente
inflamatorio donde hay niveles elevados de moléculas inflamatorias
y, más concretamente, donde hay niveles elevados de TNF\alpha.
Además, los autores de la presente invención han
observado que la inhibición de EDG2 no corrige la inflamación, y por
tanto no disminuye los niveles de las moléculas inflamatorias.
Por tanto, la presente invención pretender
aportar una solución al tratamiento de la AR de forma específica en
aquellos pacientes que no responden a las terapias convencionales,
conocidas en el estado de la técnica, y cumplen con los requisitos
especificados a lo largo de la invención relacionados con los
niveles de moléculas proinflamatorias, aportando con ello al campo
de la técnica una herramienta muy útil en la solución de un problema
todavía sin resolver. Así pues, el uso de los inhibidores de EDG2 en
este tipo de pacientes supone una mejora de la calidad de vida de
los mismos, aspecto que hasta la fecha ha permanecido
desatendido.
En este sentido, la presente invención se
refiere al uso de una composición farmacéutica (en adelante
composición farmacéutica de la invención) que comprende al menos un
inhibidor de una proteína cuya secuencia tiene al menos un 95% de
identidad con SEQ ID NO: 1 para preparar un medicamento para el
tratamiento de la AR. Preferiblemente, la composición farmacéutica
comprende al menos un inhibidor de una proteína cuya secuencia tiene
al menos un 97%, más preferiblemente un 98%, aún más preferiblemente
un 99% de identidad con SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la
composición farmacéutica comprende al menos un inhibidor de una
proteína cuya secuencia es SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos del
receptor de ácido lisofosfatídico 1 o EDG2 de humano. Las secuencias
de aminoácidos de EDG2 de chimpancé, vaca, perro, ratón, rata y
gallo presentan una alta homología con la secuencia de humano, como
muestra la tabla 1.
El término "inhibidor" se refiere a una
sustancia o molécula capaz de reducir o eliminar la actividad del
receptor EDG2, bien bloqueando su función o bien reduciendo su
presencia.
La expresión "% de identidad de secuencia"
se refiere al porcentaje de aminoácidos de una secuencia candidata
que es idéntico a los aminoácidos de SEQ ID NO: 1, después de
alinear las secuencias para lograr el máximo porcentaje de identidad
de secuencia. El % de identidad de secuencia se puede determinar por
cualquiera de los procedimientos o algoritmos establecidos en la
técnica, tales como ALIGN o BLAST. En el presente documento, el % de
identidad de secuencia se calcula dividiendo el número de
aminoácidos que son idénticos después de alinear SEQ ID NO: 1 y la
secuencia candidata, entre el número total de aminoácidos de SEQ ID
NO: 1, y multiplicando el resultado por 100.
En una realización preferida, la composición
farmacéutica de la invención se usa para el tratamiento de la AR de
pacientes que presentan mayor cantidad de al menos una molécula
proinflamatoria, respecto de un control, a pesar de haber sido
tratados con al menos un agente antiinflamatorio. Preferiblemente,
la molécula proinflamatoria es TNF. Aún más preferiblemente, es
TNF\alpha.
El término "cantidad", tal y como se emplea
en la presente descripción, se refiere al valor absoluto o relativo
que se obtiene al detectar y cuantificar una molécula
proinflamatoria en una muestra aislada de un paciente de AR. Este
dato se puede comparar con el obtenido para individuos sanos, que
sirven de control.
Un agente antiinflamatorio puede ser cualquier
molécula conocida que tenga un efecto antiinflamatorio. Se conocen
múltiples agentes antiinflamatorios, entre los que se encuentran los
AINES (antiinflamatorios no esteroides), corticoides, metotrexato,
anti-TNF o anti-interleuquina 6
(anti-IL-6). Las dos últimas son
terapias basadas en el bloqueo de TNF o de IL-6
mediante el uso de anticuerpos.
En la presente descripción, se entiende por
moléculas proinflamatorias aquellas moléculas que participan en la
inflamación, promoviendo dicho proceso. Existe una gran variedad de
moléculas proinflamatorias, entre las que se encuentran la
interleuquina 1 (IL-1), interleuquina 8
(IL-8), las prostaglandinas, el óxido nítrico, el
interferón \gamma y el TNF. Además, existen algunas enzimas
proinflamatorias, como la fosfolipasa de tipo II o PLA_{2}, la
ciclooxigenasa 2 (COX-2) o la sintasa de óxido
nítrico inducible (iNOS), que activan la síntesis de factor
activador de plaquetas, leucotrienos, prostanoides u óxido nítrico.
Dentro de los mediadores inflamatorios implicados en la patogénesis
de la AR se encuentran las quimioquinas. Estas moléculas son
potentes quimioatrayentes de las células implicadas en la respuesta
inflamatoria y se ha detectado la expresión de quimioquinas y de sus
receptores en el líquido sinovial y en los sinoviocitos de pacientes
con AR. El factor de necrosis tumoral o TNF\alpha (del inglés
"tumor necrosis factor alpha") es el primer miembro de
la superfamilia de TNF, a la que pertenecen algunas citoquinas
implicadas en la fase aguda del proceso inflamatorio. Los miembros
de esta superfamilia tienen un origen filogenético común y la
mayoría tienen también una función común: promueven la apoptosis y
la activación del factor de transcripción
NF-\kappaB.
Los autores de la presente invención han
estudiado los niveles de algunas moléculas proinflamatorias, como
son la IL-6, la IL-8, la proteína
quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1 o CCL2), la
COX-2, la colagenasa 1 (MMP-1) y la
estromelisina-1 (MMP-3).
La IL-6 es una glucoproteína
segregada por los macrófagos, células T, células endoteliales y
fibroblastos. Su liberación está inducida por la interleuquina 1 y
se incrementa en respuesta a TNF\alpha. Es una citoquina con
actividad antiinflamatoria y proinflamatoria.
La IL-8 es una citoquina de la
familia de las quimioquinas, de naturaleza proinflamatoria. Su
síntesis se realiza en fibroblastos, células endoteliales, monocitos
y macrófagos. Es un potente factor quimiotáctico de neutrófilos,
regula la producción de proteínas de adhesión, la formación de
lípidos bioactivos y amplifica la respuesta inflamatoria local.
MCP-1 induce a los monocitos a
entrar en el tejido desde el torrente sanguíneo para convertirse en
macrófagos tisulares.
COX-2 es responsable de la
biosíntesis de prostanoides implicados en respuesta
inflamatoria.
La MMP-1 y la
MMP-3 son enzimas proteolíticas encargadas de la
degradación de la matriz extracelular en la AR.
MMP-3 desempeña un papel importante como mediadora
de la respuesta inflamatoria en la articulación.
En una realización preferida, el uso de la
invención comprende un aumento en la apoptosis de las células
sinoviales. Preferiblemente, dicha apoptosis es mediada por
TNF\alpha. Cuando la apoptosis es mediada por TNF\alpha, el
ligando TNF\alpha se une a su receptor y activa así la
señalización celular que dirige hacia la muerte celular
controlada.
En una realización preferida de la invención, el
inhibidor es un ácido nucleico (en adelante llamado ácido nucleico
de la invención). Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una
secuencia nucleotídica que codifica para un ARN de interferencia de
una proteína cuya secuencia tiene al menos un 95% de identidad con
SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica que
codifica para el ARN de interferencia tiene como secuencias diana
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y/o SEQ ID NO: 21. En
otra realización preferida de la invención, el inhibidor es un ARN
de interferencia de una proteína cuya secuencia tiene al menos un
95% de identidad con SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, el inhibidor es
un ARN de interferencia cuyas secuencias diana son SEQ ID NO: 18,
SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y/o SEQ ID NO: 21.
Un ARN de interferencia es una pequeña molécula
de unos 20-25 nucleótidos de ARN de doble cadena que
interfiere con la traducción de un ARN mensajero (ARNm) y por tanto
impide la producción de un péptido o proteína, provocando su
deficiencia. En la presente memoria, siRNA (del inglés "small
interfering RNA") se refiere a un ARN de interferencia.
Una secuencia diana de un ARN de interferencia o
de un ADN que codifica para un ARN de interferencia es una secuencia
del ARNm del gen cuya expresión se interfiere, donde se van a unir
los ARN de interferencia para impedir la producción del péptido o
proteína codificado por dicho ARNm.
En una realización preferida de la invención, el
inhibidor es un vector que comprende el ácido nucleico de la
invención. En una realización preferida de la invención, el ácido
nucleico es un vector apropiado para la terapia génica. Un vector es
una molécula de ácido nucleico usada para transferir material
genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector
también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen
elementos de control de la transcripción, como promotores u
operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de
transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la
traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos,
cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y
transposones.
El término "terapia génica", tal y como se
emplea en la presente descripción, se refiere a la transferencia de
un material genético de interés (ADN o ARN) a un huésped para tratar
o prevenir una enfermedad o afección genética o adquirida. El
material genético de interés codifica un producto (un polipéptido o
proteína, un péptido o un ARN funcional) cuya producción in
vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés
puede codificar un ARN de interferencia de valor terapéutico.
En otra realización preferida de la invención,
el inhibidor es un antagonista de EDG2. Preferiblemente, el
antagonista es ki16425.
El término "antagonista", tal y como se
emplea en la presente descripción, se refiere a una sustancia que se
une a un receptor impidiendo la unión del agonista de dicho
receptor, sin provocar ningún efecto. En este caso, el antagonista
impide la unión del ácido lisofosfatídico (LPA) a su receptor,
EDG2.
En otra realización preferida de la invención,
el inhibidor de EDG2 es un anticuerpo o un fragmento de un
anticuerpo.
El término "anticuerpo", tal y como se
emplea en la presente descripción, se refiere a moléculas de
inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas
de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de
unión y fijación de antígeno que se une específicamente
(inmunorreacciona) con una proteína. Hay cinco isotipos o clases
principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM),
inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A
(IgA) e inmunoglobulina E (IgE).
En una realización preferida, el medicamento se
presenta en una forma adaptada a la administración oral. En otra
realización preferida, el medicamento se presenta en una forma
adaptada a la administración parenteral. Preferiblemente, el
medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración
intravenosa. Preferiblemente, el medicamento se presenta en una
forma adaptada a la administración intraarticular. La administración
oral es aquella que se realiza por la boca. La administración
parenteral es aquella que se realiza a través de una inyección o
infusión. Algunos ejemplos de administración parenteral son la
inyección subcutánea, intravenosa, intraarticular o
intramuscular.
En una realización preferida, la composición
farmacéutica de la invención se administra en una cantidad
terapéuticamente eficaz. La expresión "cantidad eficaz" se
refiere a una cantidad de una sustancia suficiente para lograr el
propósito pretendido. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un
inhibidor de EDG2 es una cantidad suficiente para reducir la
activación de la señalización de dicho receptor, que puede ser
extrapolada a partir de los datos obtenidos en ensayos in
vitro como se describe en Gülden y Seibert, 2003. Toxicology,
189: 211-222. Una "cantidad terapéuticamente
eficaz" de un inhibidor para tratar una enfermedad o trastorno es
una cantidad del inhibidor suficiente para reducir o eliminar los
síntomas de la enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de una
sustancia dada variará con factores tales como la naturaleza de la
sustancia, la vía de administración, el tamaño y la especie del
animal que va a recibir la sustancia y el propósito por el que se da
la sustancia. La cantidad eficaz en cada caso individual la puede
determinar empíricamente el experto en la materia de acuerdo con los
procedimientos establecidos en la técnica.
En una realización preferida, el medicamento
además comprende un excipiente farmacológicamente aceptable. El
término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda
a la absorción del inhibidor, lo estabiliza o ayuda a la preparación
del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar
sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes
podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como
por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar,
función de colorante, función de protección del medicamento como por
ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de
una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como
por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora
para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el
intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en
este párrafo.
El término "farmacológicamente aceptable"
se refiere a que el compuesto al que hace referencia esta permitido
y evaluado de modo que es seguro, no es tóxico y no causa efectos
adversos a los organismos a los que se administra.
Otra realización preferida se refiere al uso de
la composición farmacéutica donde el medicamento comprende además un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, el vehículo debe ser
farmacológicamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente
aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de
sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la
elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye,
pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensoactivos.
El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a
cualquiera de los inhibidores de la presente invención. La función
del vehículo es facilitar la incorporación del inhibidor, así como
también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y
administración o dar consistencia y forma a la composición
farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el
vehículo es el diluyente.
En una realización preferida, el medicamento
además comprende otra sustancia activa. En una realización
preferida, el medicamento se administra como terapia combinada. Una
terapia combinada se refiere a que el medicamento se administra
junto con otro medicamento. Preferiblemente, este otro medicamento
es una sustancia inmunomoduladora, es decir, una sustancia capaz de
alterar la respuesta del sistema inmune activándola, suprimiéndola o
modificando algunos de sus mecanismos. Más preferiblemente, la
sustancia inmunomoduladora es el anticuerpo
anti-CD20 (Rituximab) o la proteína de fusión
CTLA4-inmunoglobulina (Orencia, abatacept,
belatacept).
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 1. La deficiencia de EDG2 aumenta la
apoptosis de los sinoviocitos en presencia de TNF\alpha.
Muestra la actividad de caspasa 3/7, que es significativamente mayor
en los sinoviocitos deficientes en EDG2 y especialmente en presencia
de TNF\alpha (p=0,00058, test de Wilcoxon). La caspasa 3/7
activada hidroliza el sustrato luminogénico
DEVD-aminoluciferina y genera una señal
luminiscente directamente proporcional a la actividad de caspasa
3/7, por lo que esta actividad está expresada en RLU (unidades
relativas de luminiscencia).
Fig 2. Muestra el cambio en la expresión génica
en 7 líneas de sinoviocitos con siRNA de EDG2 relativo a la
expresión en las mismas líneas con siRNA inespecífico (control). La
deficiencia de EDG2 incrementa la transcripción inducida por
TNF\alpha de IL-6, IL-8,
MCP-1, COX-2 y
MMP-1, y reduce la transcripción de
MMP-3.
Fig 3. Muestra la cantidad de
IL-6, IL-8 y MCP-1
en sobrenadantes de cultivo de cuatro líneas de sinoviocitos
reumatoides transfectadas con siRNA EDG2 o con siRNA inespecífico
control. La deficiencia de EDG2 incrementa la producción mediada por
TNF\alpha de estos mediadores inflamatorios.
Fig 4. Muestra una disminución significativa del
Score clínico de la artritis reumatoide en los ratones
tratados con Ki16425 respecto a los ratones control, tratados con
vehículo (p=0,03, día 3; p=0,0068, día 6; p=0,0018, día 7;
p=0,00072, día 8 y p=0,00072, día 9).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad del uso de inhibidores de
EDG2 para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron 7 líneas celulares de
sinoviocitos tipo fibroblasto (FLS) con siRNA de EDG2 o con un siRNA
control inespecífico. Se estimularon con 10 ng/ml de TNF\alpha y
se analizó la apoptosis tras 48 horas de tratamiento. Mediante PCR
cuantitativa o en tiempo real se valoró la eficiencia de la
supresión de EDG2, que fue superior al 90% en todas las líneas
celulares transfectadas.
Se analizó la apoptosis de dichas células
mediante la determinación de la actividad de caspasa 3/7 y la
cuantificación de oligonucleosomas. Se observó un incremento
significativo de la apoptosis inducida por TNF\alpha en
sinoviocitos deficientes en EDG2 comparados con los controles
(Figura 1, p=0,00058, test de Wilcoxon). Resultados similares se
obtuvieron en el análisis de liberación de nucleosomas.
Para analizar el efecto de la supresión de EDG2
sobre la respuesta inflamatoria inducida por TNF\alpha en
sinoviocitos reumatoides, se determinaron los niveles de ARN
mensajero (ARNm) de IL-6, IL8/CXCL8,
MCP-1/CCL2, COX-2,
MMP-1 y MMP-3 (estromielisina 1)
tras la estimulación con TNF\alpha, mediante PCR cuantitativa en
tiempo real.
Como se observa en la Figura 2, la supresión de
EDG2 indujo un incremento de la transcripción inducida por
TNF\alpha de IL-6, IL-8,
MCP-1, COX-2 y
MMP-1. Sin embargo, se observó una reducción de la
transcripción de
MMP-3.
MMP-3.
Se confirmó el resultado obtenido por PCR
cuantitativa analizando por ELISA la producción de
IL-6, IL-8 y MCP-1
en sobrenadantes de cultivo de cuatro líneas de sinoviocitos
reumatoides transfectados con siRNA EDG2 o con siRNA inespecífico.
Como se observa en la Figura 3, la supresión de EDG2 incrementó la
producción mediada por TNF\alpha de estos mediadores
inflamatorios.
El conjunto de estos resultados indican que la
sensibilización a la apoptosis mediada por TNF\alpha tras la
supresión de EDG2 en sinoviocitos reumatoides no se acompaña de una
reducción de la respuesta inflamatoria mediada por TNF\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Este trabajo se llevó a cabo en 7 líneas
primarias de FLS procedentes de pacientes con AR. En el laboratorio
se aislaron sinoviocitos a partir de tejido sinovial de pacientes
con AR sometidos a cirugía de reemplazamiento articular o a biopsia
sinovial. Todos los pacientes cumplían los criterios del Colegio
Americano de Reumatología (ACR) de 1987 para el diagnóstico de AR
(Arnett FC y cols. 1988 Arthritis Rheum. 31
(3):315-24). Los sinoviocitos se utilizaron entre
los pases 4 y 8 en todos los experimentos, se cultivaron en medio
DMEM suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), 1%
penicilina-estreptomicina y 1%
L-glutamina a 37ºC y 5% CO_{2} para su posterior
uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta técnica fue utilizada para suprimir la
expresión del Receptor de LPA asociado a proteínas G: EDG2 o LPA1,
en sinoviocitos de pacientes con AR. Se sembraron 8,5 x 10^{4}
células/pocillo en pocillos de placas P6 en DMEM-10%
FBS y se incubaron toda la noche a 37ºC. Después se retiró el medio
y se añadió DMEM 10% FBS sin antibiótico durante 6 horas.
Transcurrido este tiempo, las células se transfectaron con 20 nM de
siRNA de EDG2 o con siRNA control inespecífico (Dharmacon, Fisher
Bioblock Scientific, Cedex, France) en 1,25 \mug/ml del reactivo
de transfección Dharmafect (Dharmacon), diluido en medio
OPTI-MEM I (Gibco). Transcurridas 24 horas, se
retiró el medio de transfección y se añadió DMEM-10%
FBS. Se comprobó la eficiencia del silenciamiento para EDG2 mediante
PCR en tiempo real y en todos los casos fue superior al 90%. Los
experimentos se realizaron 48-96 horas posteriores a
la transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sinovioctos reumatoides se privaron de suero
durante 16 horas en DMEM-1% FBS. Una vez
transcurrido este periodo de tiempo, se estimularon con
TNF-\alpha a una concentración de10 ng/ml. El
tiempo de tratamiento fue puesto a punto en función del ensayo a
realizar. Así pues, los ensayos de expresión y producción de las
citoquinas IL-6 e IL-8, la
quimioquina MCP-1 y las metaloproteasas
MMP-3 y MMP1, y la enzima COX-2 (del
inglés "prostaglandin-endoperoxide synthase
2"), se realizaron a las 12 horas después de iniciado el
tratamiento, y los ensayos de apoptosis se llevaron a cabo a las 48
horas de estimulación con TNF-\alpha (Figura
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante esta técnica se analizaron los niveles
de expresión de ARNm de diferentes genes en sinoviocitos reumatoides
humanos.
En primer lugar, se comprobó el nivel de
silenciamiento para LPA1 en sinoviocitos tratados con el siRNA de
EDG2 frente a la expresión basal en sinoviocitos control. Para ello,
se extrajo el ARN total de los sinoviocitos, cultivados en pocillos
de placas P6 (8,5 x 10^{4} células/pocillo), mediante el kit
Rneasy Kit y el RNase-Free DNase Set (Qiagen GmbH),
siguiendo las instrucciones del fabricante.
La PCR en tiempo real se realizó en un
termociclador Mx3005P Real-Time PCR System
(Strategene, La Jolla, CA, USA) utilizando el kit Brilliant II SYBR
Green Single Step QRT-PCR Master Mix (Stratagene).
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 25
\mul conteniendo 2-5 ng de ARN; 0,5 \muM de cada
cebador; 1,5 mM de MgCl_{2}; 30 nM del colorante de referencia
ROX; 0,04x de StrataScript RT/RNase block enzyme mixture y 1x de
SYBR QRT-PCR master mix. Las muestras se analizaron
por duplicado y los cebadores que se utilizaron se muestran en la
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de amplificación para
EDG2 fueron las siguientes: Síntesis del ADN copia (ADNc) a
50ºC durante 30 minutos; desnaturalización a 95ºC durante 10
minutos seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30
segundos, hibridación a 63ºC durante 1 minuto y elongación a 72ºC
durante 30 segundos. Finalmente, se realizó una curva de disociación
de 55ºC a 95ºC incrementando 1ºC cada segundo. Se utilizó
\beta-actina como normalizador.
También se analizaron los niveles de ARNm de
IL-6, IL-8, MCP-1,
COX-2, MMP-3 y MMP1 en cultivos de
sinoviocitos de pacientes con AR tratados con el siRNA de EDG2 o con
un siRNA inespecífico, sometidos al estímulo con
TNF-\alpha, mediante PCR en tiempo real en un solo
paso.
Las condiciones de amplificación para
IL-6, IL-8 y MCP-1
fueron: síntesis del ADNc a 50ºC durante 30 minutos;
desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos seguida de 40 ciclos de
desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos e hibridación a 63ºC
durante 1 minuto. Finalmente, se realizó una curva de disociación de
55º a 95ºC incrementando 1ºC cada segundo.
Las condiciones de amplificación para
COX-2 fueron las siguientes: síntesis del ADNc a
50ºC durante 30 minutos; desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos
seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30
segundos, hibridación a 60ºC durante 1 minuto y elongación a 72ºC
durante 1 minuto. Finalmente, se realizó una curva de disociación de
55º a 95ºC incrementando 1ºC cada segundo.
Las condiciones de amplificación para
MMP-3 fueron las siguientes: síntesis del ADNc a
50ºC durante 30 minutos; desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos
seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30
segundos, hibridación a 63ºC durante 1 minuto y elongación a 72ºC
durante 1 minuto. Finalmente, se realizó una curva de disociación de
55º a 95ºC incrementando 1ºC cada segundo.
Las condiciones de amplificación para
MMP-1 fueron las siguientes: síntesis del ADNc a
50ºC durante 30 minutos; desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos
seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30
segundos, hibridación y elongación a 57ºC durante 1 minuto.
Finalmente se realizó una curva de disociación de 55º a 95ºC
incrementando 1ºC cada segundo.
Se utilizó \beta-actina como
normalizador. La pureza de los productos amplificados se analizó
mediante electroforesis en gel de agarosa y determinación de la
curva de disociación de cada muestra. El análisis de los resultados
se realizó mediante el método comparativo Ct. 2^{-\Delta\Delta
Ct}, en el que:
Para los sinoviocitos transefctados con siRNA
inespecífico \Delta\DeltaCt = 0 y 2º=1.
Para las sinoviocitos transfectados con siRNA
EDG2 el valor 2^{-\Delta\Delta Ct} indica el incremento o la
disminución en los niveles de expresión génica respecto a los
transfectados con siRNA inespecífico.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante esta técnica se analizaron los niveles
de expresión de las citoquinas IL-6,
IL-8 y de la quimioquina MCP-1
presentes en el sobrenadante de cultivo de sinoviocitos de pacientes
con AR tratados con siRNA de EDG2 o con un siRNA inespecífico. Se
sembraron sinoviocitos reumatoides (10^{4} células/pocillo) en
placas de 96 pocillos en DMEM-10% FBS y se privaron
de suero durante 16 horas en DMEM-1% FBS. Los
sinoviocitos tratados con siRNA de EDG2 o con un siRNA inespecífico
se estimularon con 10 ng/ml de TNF-\alpha durante
12 horas, momento en el que se recogió el sobrenadante para su
análisis posterior.
La determinación de citoquinas se llevó a cabo
mediante los kit de ELISA para IL-6,
IL-8 y MCP-1 (OptEIA ELISA Sets, BD
Pharmingen), siguiendo las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de apoptosis de los sinoviocitos
reumatoides se analizó mediante dos técnicas diferentes, ELISA de
apoptosis y determinación de la actividad de caspasa 3/7 (Fig
1).
Después de suprimir la expresión de EDG2
en sinoviocitos reumatoides mediante siRNA, se sembraron 3x10^{3}
células/pocillo en placas P96 en DMEM-10% FBS y se
privaron de suero durante 16 horas en DMEM-1% FBS.
Posteriormente, se retiró el medio y se estimularon con 1 \mug/ml
de TNF-\alpha durante 48 horas en
DMEM-1% FBS.
El porcentaje de apoptosis se determinó mediante
el Kit Cell Death Detection ELISA (Roche Diagnostics, Spain), que
detecta los mono y oligonucleosomas liberados al citoplasma durante
la apoptosis.
Para cuantificar la actividad de caspasa 3/7, se
sembraron 10x10^{3} células/pocillo en placas P96 en
DMEM-10% FBS y se privaron de suero durante 16 horas
en DMEM-1% FBS. Posteriormente, se retiró el medio y
se estimularon con 1 \mug/ml de TNF-\alpha
durante 48 horas en DMEM-1% FBS. La actividad de
caspasa 3/7 en sinoviocitos tratados con el siRNA de EDG2 o con un
siRNA inespecífico fue determinada mediante el kit
Caspase-Glo^{R} 3/7 Assay (Promega), que determina
la presencia de caspasa 3/7 activada mediante el procesado de un
sustrato luminogénico (DEVD-aminoluciferina). Para
ello, se incubaron las células durante 1 h con el reactivo
reconstituido del kit y la caspasa 3/7 activada de las células
generó la señal luminiscente tras la hidrólisis del sustrato
luminogénico DEVD-aminoluciferina. Dicha señal fue,
por lo tanto, proporcional a la actividad de caspasa 3/7 y se midió
en un lector de microplacas Fluostar OPTIMA (BMG Labtech, Offenburg,
Germany).
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujo artritis en un total de 41 ratones
C57BL/6 de 8-10 semanas de edad mediante la
inyección de 2 dosis de 100 \mul de un suero procedente de ratones
artríticos K/BxN a día 0 y día 2.
22 ratones fueron tratados con 4 dosis de 20
mg/kg del inhibidor Ki16425 en los días 0, 1, 2 y 3 y 19 ratones
fueron tratados con vehículo siguiendo la misma pauta terapéutica.
Se analizó la evolución clínica de la artritis hasta el
día 9.
día 9.
La evolución clínica de la artritis (Fig 4)
mostró una disminución significativa del Score clínico de la
artritis en los ratones tratados con Ki16425 respecto a los
controles tratados con vehículo (p= 0,03, día 3; p=0,0068, día 6;
p=0,0018, día 7; p=0,00072, día 8 y p=0,00072, día 9), lo que indica
una mejora en los resultados clínicos en los animales tratados con
el antagonista de EDG2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujo artritis en ratones C57BL/6 machos y
hembras de 8-10 semanas de edad utilizando el modelo
de artritis pasiva K/BxN. Los ratones K/BxN se obtuvieron al cruzar
ratones transgénicos KRN en fondo B6 con ratones NOD. Estos ratones
transgénicos desarrollan artritis severa, que se inicia precozmente,
a las 2-3 semanas de edad. La inyección de suero
obtenido de ratones K/BxN de 4-8 semanas de edad en
los ratones C57BL/6, provoca el desarrollo de una artritis con
características similares a la AR humana.
Los ratones C57BL/6 se trataron con el inhibidor
competitivo de los receptores EDG, Ki16425 (Cayman Chemicals, Ann
Arbor, Michigan, USA), disuelto en DMSO/PBS (1:3) o se inyectaron
sólo con el vehículo: DMSO-PBS (1:3). El compuesto
Ki16425
(ácido3-[[[4-[4-[[[1-(2-chorophenyl)ethoxy]carbonilo]amino]-3-methyl-5
isoxazoly]phenyl]metil]thio]-propanoico)
es un potente inhibidor de los receptores EDG2/LPA1 (Ki=0,35
\muM) y EDG-7/LPA3 (Ki=0,93 \muM) y, en menor
medida, inhibe el receptor EDG4/LPA2 (Ki=6,5 \muM).
Se inyectaron un total de 22 ratones con Ki16425
y 19 ratones con vehículo, en 5 experimentos diferentes. El esquema
terapéutico fue el siguiente: se indujo artritis mediante inyección
intraperitoneal de 100 \mul de suero K/BxN en los días 0 y 2. Los
ratones se trataron durante 4 días con Ki16425 a una dosis de 20
mg/kg ratón/día. La primera dosis fue administrada el día 0, 30
minutos antes de la inyección de suero K/BxN. La segunda dosis se
administró el día 1; la tercera, el día 2, 30 minutos antes de la
inyección de suero K/BxN y la última se administró el día 3. Los
ratones control se inyectaron con DMSO/PBS (1:3) siguiendo el mismo
esquema terapéutico.
La evolución clínica de la artritis en las patas
traseras y delanteras fue evaluada por dos observadores
independientes los días 3, 6, 7, 8 y 9, siguiendo una escala
semicuantitativa de 0 a 4: grado 0, sin inflamación; grado 1, ligero
edema y eritema en la articulación; grado 2, moderado edema y
eritema; grado 3, severo edema y eritema; grado 4, máxima
inflamación con rigidez da la articulación. Siguiendo esta escala,
se obtiene el "Score clínico" o graduación clínica de la
severidad de la artritis. El máximo valor posible de este
"Score" para cada ratón es de 16 y corresponde a la suma
de los valores máximos obtenidos en cada una de las 4 patas. Los
ratones fueron sacrificados a día 9 para la extracción de las
articulaciones.
Claims (10)
1. Uso de una composición farmacéutica que
comprende al menos un inhibidor de una proteína cuya secuencia tiene
al menos un 95% de identidad con SEQ ID NO: 1 para preparar un
medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide, donde
dicho inhibidor es el antagonista del receptor EDG2, ki16425.
2. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación anterior para el tratamiento de la artritis
reumatoide de pacientes que presentan mayor cantidad de al menos una
molécula proinflamatoria, respecto de un control, a pesar de haber
sido tratados con al menos un agente antiinflamatorio.
3. Uso según la reivindicación anterior donde la
molécula proinflamatoria es TNF.
4. Uso según la reivindicación anterior donde la
molécula proinflamatoria es TNF\alpha.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a
la administración oral o parenteral.
6. Uso según la reivindicación anterior donde el
medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración
intravenosa.
7. Uso según la reivindicación anterior donde el
medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración
intraarticular.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el medicamento además comprende un excipiente
farmacológicamente aceptable.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el medicamento además comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el medicamento además comprende otra sustancia
activa.
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