ES2373209T3 - Método para producir polihidroxialcanoato. - Google Patents

Abstract

Un método para producir polihidroxialcanoato (PHA), que comprende (i) cultivar en un medio de cultivo que comprende ácido tereftálico y/o una sal del mismo y/o un éster del mismo una o más cepas bacterianas que son capaces de acumular PHA a partir de ácido tereftálico o una sal o un éster del mismo y que se seleccionan de la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el número de registro NCIMB 41538, la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el número de registro NCIMB 41537 y la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el número de registro NCIMB 41539; y (ii) recuperar el PHA producido del medio de cultivo.

Description

Metodo para producir polihidroxialcanoato

La presente invenci6n se refiere a un metodo para producir polihidroxialcanoato (PHA) y a nuevas cepas bacterianas usadas en el metodo.

5 El poli(tereftalato de etileno) (PET) es uno de los muchos plasticos basados en productos petroquimicos que contribuyen mucho a la comodidad de la vida diaria. El mejor conocido en todo el mundo para su uso en botellas de plastico, se produce a una escala de muchos millones de toneladas en todo el mundo. Oebido al exito del PET, se ha convertido, como otros plasticos, en un problema de residuos principal. Mas de 5.400 millones de libras (2.400 millones de kg) de botellas de PET estaban en los estantes en los Estados Unidos en 2006. En general, menos del

10 25% de estas botellas se reciclan, y asi la gran mayoria de las botellas de PET en todo el mundo terminan en un vertedero. Esto ocurre a pesar de que esta disponible una variedad de tecnologias de reciclado tales como trituraci6n mecanica para el uso de PET residual en la industria de las fibras, el reprocesamiento de PET residual para la utilizaci6n en contacto con alimentos, y pir6lisis (tratamiento termico en ausencia de aire) de PET residual para generar materiales de alimentaci6n quimicos.

15 El PET puede degradarse mediante pir6lisis hasta sus componentes monomericos, acido tereftalico y etilenglicol. Sin embargo, el acido tereftalico resultante se usa generalmente como un material de alimentaci6n quimico para la resintesis de PET, que es un producto no biodegradable y por consiguiente de poco valor. Asi, factores tales como el coste relativamente alto de la clasificaci6n de PET residual y el poco valor del producto aguas abajo contribuyen a los escasos indices de reciclado para el PET.

20 PHA es el termino general para una gama de diversos polimeros biodegradables que consisten en poliesteres de acidos (R)-3-hidroxialcanoicos. Estos polimeros son de interes debido a una amplia gama de aplicaciones y al hecho de que son completamente biodegradables, ofreciendo asi problemas de residuos escasos o no a largo plazo.

Estos polimeros pueden se acumulados por algunas bacterias intracelularmente como materiales de almacenamiento de carbono. Se ha observado que la acumulaci6n de PHA se produce en bacterias en respuesta a

25 una gama de factores de estres ambiental tales como limitaci6n de nutrientes inorganicos. Los sustratos que se suministran a las bacterias para acumular PHA se dividen en dos grupos 1) sustancias relacionadas con PHA, es decir, acidos alcanoicos (acidos grasos) que se asemejan a los mon6meros que constituyen los PHA (acidos (R)-3hidroxialcanoicos) y 2) sustratos no relacionados con PHA, que son sustratos que no se asemejan a los mon6meros que constituyen los PHA, p. ej. glucosa.

30 Un objetivo de la invenci6n es mitigar o eliminar las desventajas asociadas con el reciclado de PET.

Tambien es un objetivo de la invenci6n proporcionar un metodo para producir PHA a partir del producto de degradaci6n de PET, a saber acido tereftalico y/o una sal del mismo y/o un ester del mismo.

Oe acuerdo con la invenci6n, se proporciona un metodo para producir polihidroxialcanoato (PHA), que comprende (i) cultivar en un medio de cultivo que comprende acido tereftalico y/o una sal del mismo y/o un ester del mismo una o

35 mas cepas bacterianas que son capaces de acumular PHA a partir de acido tereftalico o una sal o un ester del mismo y que se seleccionan de la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538, la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537 y la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el numero de registro NCIMB 41539; y (ii) recuperar el PHA producido del medio de cultivo.

40 La invenci6n tambien proporciona la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538. La secuencia de rONA de 16S de la cepa G016, presentada en el N° IO SEC 1, comparte 99% de homologia con una cepa de Pseudomonas putida conocida (OQ 133506, vease la Tabla 2).

La invenci6n proporciona ademas la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537. La secuencia de rONA de 16S de la cepa G019, presentada en el N° IO SEC 2, comparte 99% de homologia

45 con una cepa de Pseudomonas putida conocida (AY512611, vease la Tabla 2).

La invenci6n proporciona ademas la cepa de Pseudomonas frederiksbergensis G023 que tiene el numero de registro NCIMB 41539. La secuencia de rONA de 16S de la cepa G023, presentada en el N° IO SEC 3, comparte 99% de homologia con una cepa de Pseudomonas frederiksbergensis conocida (AJ249382, vease la Tabla 2).

Cada una de las cepas G016 de Pseudomonas putida, cepa G019 de Pseudomonas putida y cepa G023 de

50 Pseudomonas frederiksbergensis es capaz de acumular PHA a partir de acido tereftalico o una sal o un ester del mismo.

Segun se describe con mas detalle en el Ejemplo 1 (A) posteriormente, la secuencia de bases de rONA de 16S de cada una de las cepas de la invenci6n se analiz6 e identific6 usando el programa BLAST de la base de datos del GenBank NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), y cada una de las cepas se deposit6 el 24 de enero de 2008 en la instituci6n depositaria NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Escocia, una autoridad depositaria internacional bajo el Tratado de Budapest.

El PHA recuperado del medio de cultivo comprende ventajosamente al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90%, lo mas preferiblemente al menos 95% de PHA de longitud de cadena media (mcl). El mclPHA se clasifica segun comprenda unidades repetitivas derivadas de mon6meros de acido 3hidroxialcanoico que contienen 6 atomos de carbono (C6) a 14 atomos de carbono (C14). Preferiblemente, al menos 80%, mas preferiblemente 85%, aun mas preferiblemente al menos 90%, lo mas preferiblemente al menos 95% del mclPHA comprende unidades repetitivas de mon6meros C8, C10 y C12. Mas preferiblemente, el mclPHA comprende unidades repetitivas en una cantidad en peso respectiva de mclPHA de 15%-25% de C8, 40%-50% de C10 y 30%-40% de C12, preferiblemente segun se determina usando un cromat6grafo de gases (GC) de la serie Agilent 6890N equipado con una columna BP-21 de 30 m x 0,25 mm x 0,2 !m (J & W Scientific), y mas preferiblemente segun se confirma usando un GC Agilent 6890N equipado con un espectrofot6metro de masas inerte de la serie 5973, usando una columna HP-1 de 12 m x 0,2 mm x 0,33 !m (Hewlett-Packard). En una realizaci6n preferida, la cantidad de C8, C10 y C12 totaliza 100%.

Los PHA se clasifican generalmente como PHA de longitud de cadena corta (sclPHA), PHA de longitud de cadena media (mclPHA) o PHA de longitud de cadena larga (lclPHA), dependiendo del numero de atomos de carbono de los mon6meros constituyentes de los mismos. El sclPHA comprende mon6meros de C3-C5, el mclPHA comprende mon6meros de C6-C14 y el lclPHA comprende mon6meros de mas de 14 carbonos (> C14). Esta variaci6n en la longitud de cadena del mon6mero da lugar a diferentes propiedades en el polimero, teniendo tanto los sclPHA como los IclPHA propiedades no deseables, teniendo los sclPHA un alto grado de cristalinidad y siendo rigidos y fragiles, y siendo los lclPHA pegajosos y muy dificiles de manejar. Las propiedades de los sclPHA y lclPHA limitan la gama de sus aplicaciones. Los mclPHA, segun se producen mediante el metodo de la invenci6n, y que pueden comprender mon6meros seleccionados de mon6meros C6, C8, C10, C12 y C14, tienen propiedades mucho mas deseables, siendo elast6meros con una baja temperatura de transici6n vitrea y teniendo propiedades que son adecuadas para una amplia gama de aplicaciones incluyendo caucho biodegradable y materiales de revestimiento. Por lo tanto, la producci6n de mclPHA de acuerdo con la invenci6n proporciona ventajosamente un polimero que tiene una amplia gama de aplicaciones y es biodegradable.

Sales de acido tereftalico utiles en la invenci6n incluyen sales de metales alcalinos y metales alcalinoterreos y mezclas de las mismas, tales como sales s6dicas y potasicas, y sales magnesicas, calcicas y baricas. Se prefieren sales mono- o di-s6dicas o potasicas de acido tereftalico. El tereftalato monos6dico se prefiere especialmente. En una realizaci6n especialmente preferida, el acido tereftalico o la sal o el ester del mismo esta en la forma de tereftalato monos6dico, tambien denominado en la presente memoria tereftalato s6dico o acido tereftalico (sal s6dica).

Esteres de acido tereftalico que pueden usarse en la invenci6n incluyen mono- y di-esteres de acido tereftalico y mezclas de los mismos. Mono- y di-esteres de acido tereftalico adecuados incluyen mono- y di-esteres alquilicos C1-C4 y mono- y di-esteres glic6licos.

El acido tereftalico o la sal o el ester del mismo puede obtenerse a partir de hidr6lisis o pir6lisis de poli(tereftalato de etileno) (PET), preferiblemente pir6lisis de PET, que produce una fracci6n s6lida, liquida o gaseosa. Si se requiere una sal de tereftalato, la fracci6n s6lida se hace reaccionar con una base, preferiblemente con un hidr6xido de metal alcalino o metal alcalinoterreo. Si se requiere un ester, la fracci6n s6lida se hace reaccionar con un alcohol adecuado. En una realizaci6n particularmente preferida, la fracci6n s6lida obtenida mediante pir6lisis de PET se hace reaccionar con hidr6xido s6dico, para formar tereftalato s6dico

El metodo de la invenci6n comprende preferiblemente cultivar la una o mas cepas en el medio de cultivo durante un periodo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, mas preferiblemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 60 horas, lo mas preferiblemente de aproximadamente 48 horas, a una temperatura de aproximadamente 25'C a aproximadamente 35'C, prefer iblemente aproximadamente 30'C.

En el metodo de la invenci6n, el medio de cultivo comprende preferiblemente la cepa G019 y/o la cepa G016.

En el metodo de la invenci6n, el medio de cultivo esta preferiblemente limitado para el nitr6geno, con un contenido de nitr6geno maximo de aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente 0,067 g/l de medio de cultivo. Una fuente de nitr6geno adecuada es el fosfato s6dico am6nico (NaNH4HP04.4H20)

En el metodo de la invenci6n, recuperar el PHA producido del medio de cultivo comprende preferiblemente extraer el PHA producido usando el siguiente metodo. Los cultivos se recolectan mediante centrifugaci6n a 6000 x g/20 min,

las celulas se recogen y se resuspenden en 1/100 del volumen de cultivo original de tamp6n de fosfato 50 mM (pH 7). Las suspensiones de celulas se centrifugan de nuevo a 6000 x g/20 min y el sobrenadante se descarta. Los pelets de celulas se liofilizan. El material celular seco se resuspende en 10 volumenes de acetona y la suspensi6n se remueve vigorosamente a 25'C durante 12-20 h. La suspensi6n se centrifuga a continuaci6n a 6000 rpm x g/20 min y el sobrenadante se retiene. El sobrenadante se filtra a traves de un filtro de PTFE de 1 !m y el disolvente se evapora a vacio hasta 1/10-1/25 del volumen original. El producto es una suspensi6n de PHA que a continuaci6n se anade gota a gota a metanol refrigerado (en la relaci6n 1:20). El polimero de PHA se recolecta mediante centrifugaci6n a 6000 rpm x g/20 min y se seca bajo vacio.

Ventajas de la invenci6n incluyen las siguientes:

Proporciona una metodo limpio de bajo coste para producir PHA. El coste de la producci6n de PHA a traves de fermentaci6n esta inextricablemente ligado al coste del sustrato de partida. Asi, el uso de acido tereftalico (sal s6dica), el producto de degradaci6n de un plastico residual petroquimico facilmente obtenido y econ6mico (PET), como un material de alimentaci6n para bacterias segun se describe en la presente memoria, proporciona una fuente econ6mica, limpia y fiable para la sintesis de PHA.

El PHA producido es un polimero de alto valor. Especificamente, en contraste con sclPHA que tienen un alto grado de cristalinidad y que son rigidos y fragiles, y lclPHA que son pegajosos y muy dificiles de manejar, los PHA capaces de producirse en la presente memoria son mclPHA que tienen propiedades mucho mas deseables, siendo elast6meros con una temperatura de transici6n vitrea baja.

El PHA producido es completamente biodegradable y tiene una amplia gama de aplicaciones que varian de aplicaciones biomedicas a envasado.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invenci6n pero se apreciara que la invenci6n no se limita a estos ejemplos:

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 (A)

Pirólisis Hidrolítica de PET

Poli(tereftalato de etileno) (PET) virgen (Krupp-Formoplast) fue suministrado a una planta de pir6lisis a escala de laboratorio (segun se describe en Yoshioka et al., 2004. Pyrolysis of poly(ethylene terephthalate) in a fluidized bed plant. Polymer Oegradation and Stability. 86:499-504) a una velocidad de alimentaci6n de 1.035 kg/h. El lecho fluidizado calentado electricamente tenia un diametro de 130 mm. 9 kg de arena de cuarzo con diametros de entre 0,3 y 0,5 mm conducian a una altura de 480 mm en el lecho fluidizado que se mantenia a una temperatura de 450'C. ElPETentraba enel reactor delecho fluidizado a traves deun transportador de tornillo. Los productosde pir6lisis calientes (vease la Tabla 1) pasaban a un cicl6n para ser limpiados mediante pequenas cantidades de cargas y a continuaci6n se enfriaban al mezclar con agua fria hasta temperatura ambiente en un precipitador (desublimador). En el precipitador, toda la fracci6n s6lida incluyendo el acido tereftalico se desublim6 para generar un polvo blanco. El lecho de arena se fluidiz6 mediante vapor de agua con un caudal de 2,5 kg/h. Los s6lidos se analizaron mediante un sistema de HPLC-MS (HP 1100, columna Multospher® 100) usando un detector de ordenaci6n de diodos a 220 nm. Las fracciones de gas y aceite se caracterizaron por cromatografia de gases (GC-FIO, HP 5890 Machery & Nagel SE 52) y GC-MS (Fisons Instruments VG 70 SE, Machery & Nagel SE 52).

Medio de Crecimiento Bacteriano

El medio minimo E2 (por litro: 3,5 g de NaNH4HP04.4H20, 7,5 g de K2HP04.3H20, 3,7 g de KH2P04, 0,25 g de MgS04.7H20, 2,78 g de FeS04.7H20, 1,98 g de MnCl2.4H20, 2,81 g de CoS04.7H20, 1,47 g de CaCl2.2H20, 0,17 g de CuCl2.2H20, 0,29 g de ZnS04.7H20; para condiciones de nitr6geno limitado, se us6 1,0 g/l de NaNH4HP04.4H20) se prepar6 y se us6 como el medio de base suplementado con tereftalato s6dico como la fuente de carbono y energia para todas las tecnicas de cultivo analizadas en la presente memoria. El tereftalato s6dico se prepar6 al tomar toda la fracci6n s6lida de la pir6lisis de PET (en la forma del polvo blanco mencionado anteriormente) y disolverla en una soluci6n equimolar de hidr6xido s6dico (Sigma).

Aislamiento de Bacterias del Suelo

1 kg de suelo se recogi6 de suelo expuesto a PET en una zona industrial en Irlanda usada para moldear granulos de PET en productos de PET. Los granulos estaban presentes en el suelo adyacente al entorno de la fabrica. El suelo se tamiz6 bajo condiciones asepticas hasta un tamano de particula de 5 mm, a continuaci6n se anadieron 10 g de suelo a 90 ml de soluci6n de Ringer esteril (Sigma), esto se someti6 a turbulencia durante 5 min para homogeneizar

la muestra. 1 ml de esta se anadi6 a 9 ml de soluci6n de Ringer esteril, esto se repiti6 para obtener una diluci6n de 10-5 de la muestra de suelo original. Las diluciones en serie se extendieron en placas sobre medio E2 s6lido que contenia 1,1 g/l de tereftalato s6dico como la unica fuente de carbono y energia. Se seleccionaron 32 aislados mediante diferenciaci6n visual de la morfologia de colonias de contraste. Estos 32 aislados de las muestras de suelo se hicieron crecer a continuaci6n en un cultivo en matraz agitado segun se describe posteriormente y se probaron con respecto a la acumulaci6n de PHA.

Condiciones de crecimiento para la acumulación de PHA

Los 32 aislados de suelo se hicieron crecer en experimentos en matraz agitado, en los que cada cepa se hizo crecer en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenia 50 ml de medio E2 (4,2 g de TA/l) a 30'C con agitaci6n a 200 rpm. Para rastrear organismos capaces de acumulaci6n de PHA, la fuente de nitr6geno inorganica fosfato s6dico am6nico (NaNH4HP04.4H20) se limitaba a 1 g/l (67 mg de nitr6geno/l).

Rastreo de PHA y Análisis de la Composición.

Los 32 aislados de suelo se hicieron crecer en matraces agitados como se describe anteriormente durante 48 horas y se probaron con respecto a la acumulaci6n de PHA como sigue. Material celular (5-10 mg) o estandar de PHA aislado de P. putida CA-3 para el que se conoce la composici6n de PHA (Ward PG, de Roo G, 0'Connor KE. Accumulation of polyhydroyalkanoate from styrene and phenylacetic acid by Pseudomonas putida CA-3. Appl Environ Microbiol. Abril de 2005; 71(4):2046-52) se resuspendi6 en 2 ml de metanol acidificado (H2S04 al 15%, v/v) y 2 ml de cloroformo que contenian 6 mg/l de ester metilico de benzoato como un estandar interno. La mezcla se us6 en tubos de ensayo de Pyrex de 15 ml y se incub6 a 100'C durante 3 h (con inversiones frecuentes). La soluci6n se extrajo con 1 ml de agua (turbulencia vigorosa 2 min). Las fases se dejaron separar antes de retirar la capa superior (agua). La fase organica (capa inferior) se sec6 con Na2S04 antes de un analisis adicional. Las muestras se analizaron en un cromat6grafo de gases (GC) de la serie Agilent 6890N equipado con una columna BP-21 de 30 m x 0,25 mm x 0,25 !m (J & W Scientific) usando un modo de divisi6n (relaci6n de divisi6n 10:1). Se emple6 un metodo de estufado que comprendia 60'C durante 2 min, incrementando en 5'C/min hasta 200'C durante 1 min. Para la identificaci6n de los picos, se usaron acidos (R)-3-hidroxidodecanoicos obtenidos comercialmente (Sigma) y el estandar de PHA identificado anteriormente (Ward et al., 2005). La determinaci6n de los mon6meros de PHA se confirm6 usando un Agilent 6890N GC equipado con un espectrofot6metro de masas inerte de la serie 5973, usando una columna HPEP 1 de 12 m x 0,2 mm x 0,33 !m (Hewlett-Packard), con un metodo de estufado de 50'C durante 3 min, incrementando en 10'C/min hasta 250'C durante 1 min y comparando con los estandares mencionados anteriormente. Solo 3 cepas exhibian altas densidades 6pticas (0O540 de 4,0) y se encontr6 que producian PHA. Estas 3 cepas se seleccionaron para un analisis adicional, segun se trata posteriormente. Adicionalmente, otras 6 cepas que exhibian buen crecimiento (0O540 de 4,0), pero que no producian PHA, se seleccionaron aleatoriamente para comparaci6n, segun se describe con mas detalle en el Ejemplo 1 (B).

Ensayo de Determinación de Nitrógeno

La concentraci6n de nitr6geno en el medio de crecimiento se verific6 a lo largo del tiempo usando el siguiente metodo. La concentraci6n de nitr6geno (ion amonio) en el medio se verific6 tomando muestras de 1 ml del matraz de cultivo a diversos puntos temporales y centrifugando las muestras a 13.200 rpm durante 2 min. El sobrenadante se retuvo y se diluy6 100 veces en agua desionizada. Se anadi6 1 ml de tamp6n de fenol-nitroprusiato (por litro: 30 g de Na3P04·12H20; 30 g de Na3C5H507; 3 g de EOTA, pH 12; 120 g de fenol) a 2,5 ml de muestra diluida y se mezcl6. Se anadieron a la mezcla 1,5 ml de soluci6n de hipocloruro (52,5 ml de soluci6n de hipocloruro s6dico (4% de cloro disponible) hasta 1000 ml de Na0H 1 M) y se mezcl6 mediante inversi6n. Se dej6 que se desarrollara el color durante 45 min a 25'C en la oscuridad. La absorbancia a 635 nm se ley6 usando un espectrofot6metro Helios delta. Tambien se gener6 una curva estandar usando concentraciones conocidas de fosfato s6dico am6nico.

Determinación de la Utilización de Ácido Tereftálico durante el Crecimiento

La concentraci6n de TA en el medio se verific6 tomando muestras de 1 ml del matraz de cultivo en diversos puntos temporales y centrifugando las muestras a 13.200 rpm durante 2 min. El sobrenadante se retuvo, se filtr6 y se analiz6 mediante HPLC. A fin de analizar la muestra y mantener una relaci6n lineal entre el area de los picos en el cromatograma de HPLC y la concentraci6n de TA, las muestras tenian que diluirse de modo que la concentraci6n de TA en la preparaci6n final no superara 0,63 g/l. Se gener6 una curva estandar de concentraciones de TA a partir de tereftalato s6dico obtenido comercialmente (Sigma) para establecer la relaci6n entre la concentraci6n de TA y el area de los picos en la HPLC. Se us6 un HPLC de la serie Agilent 1100 usando un columna C18 0OS Hypersil (125 mm x 3 mm, tamano de particula 5 !m) (Thermo) y las muestras se eluyeron isocraticamente usando acido f6rmico al 0,2% y acetonitrilo (relaci6n 80:20, respectivamente) a 0,5 ml/min y se leyeron en un detector UV-Vis a 230 nm.

Determinación de las propiedades de polímeros de PHA

Resonancia magnética nuclear (NMR). La NMR en soluci6n se registr6 en un Bruker OPX400 con 1H a 400,13 MHz y 13C at 100,62 MHz. Los espectros de 1H y 13C-NMR a 400 MHz de PHA aislado de P. putida G019 registrados a 20'C en C0Cl3 se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. El disolvente cloroformo-d y tetrametilsilano (TMS) se usaron como referencias internas para los desplazamientos quimicos en 13C y 1H NMR, respectivamente. Los espectros de 13C NMR se registraron con desacoplamiento de protones. Tipicamente, se acumulaban 2200 transiciones. Las areas de los picos del espectr6metro se obtuvieron directamente mediante integraci6n de senales estandar.

Análisis térmico. Se realiz6 calorimetria de exploraci6n diferencial (OSC) con calorimetro Pyris-Oiamond de Perkin Elmer calibrado hasta estandares de indio. Las muestras que pesaban 7-8 mg se encapsularon en cubetas de aluminio selladas hermeticamente y se calentaron de -70'C a 100'C a una velocidad de 10'C/min. Para det erminar la temperatura de transici6n vitrea (Tg), las muestras se mantuvieron a 100'C durante 1 min y se extinguieron rapidamente hasta -70'C.Lasmuestras se recalentaron a continuaci6n desde -70'Chasta 100'Ca 10'C/mi n para determinar la temperatura de fusi6n (Tm) y la Tg. La Tm se tom6 en el pico de la endoterma de fusi6n, mientras que la Tg se tom6 en el punto medio del cambio capacidad calorifica, respectivamente.

Análisis termogravimétrico (TGA). Para determinar la estabilidad termica y el perfil de descomposici6n de las muestras, se llev6 a cabo TGA en un analizador termogravimetrico Pyris 1 de Perkin Elmer calibrado usando estandares de niquel y hierro. Cada muestra se pes6 hasta alrededor de 7 mg y se puso en una cubeta de platino y se calent6 de 30'C a 700'C a la velocidad de calent amiento de 10'C/min bajo una atm6sfera de aire.

Análisis mecánico dinámico (DMA). El OMA se llev6 a cabo en un analizador mecanico Perkin-Elmer. Las medidas dinamicas se realizaron en modo de extensi6n sobre muestras de pelicula inmovilizadas con dimensiones de 5 x 2,8 x 0,5 mm. Los experimentos se realizaron bajo atm6sfera de nitr6geno a un intervalo de temperatura de -100'C a 50'C a una velocidad de calentamiento de 2 'C/min y una frecuencia de 0,1, 1 y 10 Hz. La Tg se identific6 por una caida brusca en el m6dulo de almacenamiento y el pico correspondiente en el m6dulo de perdida. La temperatura de transici6n vitrea por OMA es dependiente de la frecuencia y detectable a una temperatura superior en comparaci6n con los datos de OSC cuasi estaticos. La temperatura en el punto maximo del m6dulo de perdida (En) se tom6 como la medida de la temperatura de transici6n vitrea.

Cromatografía de penetración en gel. La distribuci6n de pesos moleculares se obtuvo mediante cromatografia de penetraci6n en gel (GPC) usando una columna mixta C + gel PL con 5 mm de gel PL (Perkin Elmer) con detector UV-Vis PELV 290 a 254 nm. Se us6 cloroformo de calidad espectrosc6pica como el eluyente a un caudal de 1,0 ml/min., una concentraci6n de la muestra de 1% en peso y volumenes de inyecci6n de 500 !l. Se gener6 una curva de calibraci6n del peso molecular con estandares de poliestireno con baja polidispersidad usando el software Turbochrom 4.0.

Análisis de difracción de rayos X (XRD). Se realiz6 XRO a temperatura ambiente y los estandares de difracci6n se recogieron en un difract6metro Siemens O500 equipado con una fuente de radiaci6n de Cu-Ka. El haz de rayos X se hacia funcionar por radiaci6n C!-Ka (A = 0,1514 nm), a 40 KV y 30 mA. Los datos se obtuvieron a partir de 2-60'

(28) a una velocidad de exploraci6n de 0,1'C/min.

Identificación de rDNA de 16S.

Las tres cepas de los 32 aislados de suelo capaces de acumular PHA con TA como la unica fuente de carbono y energia se seleccionaron y clasificaron mediante el analisis de secuencia de genes de rRNA de 16S. Cada aislado se hizo crecer sobre agar LB. El ONA gen6mico de cada bacteria se extrajo como sigue. Las cepas se cultivaron en 30 ml de medio LB durante 24 h con remoci6n, 200 rpm a 30'C. Las celulas se recolectaron mediante centrifugaci6n a 4000 x g durante 10 min, se lavaron dos veces en soluci6n de sacarosa al 10% y se resuspendieron en 10 ml de soluci6n de lisis (sacarosa 0,3 M, EOTA 25 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, que contiene 2 U de RNasa). Se anadi6 Lysozyme (Sigma, 10 mg) y la suspensi6n bacteriana se incub6 a 37'C durante 20 min. Se anadieron SOS al 10% (1 ml) y proteinasa K (Sigma, 5 mg) con incubaci6n adicional a 55'C durante 1 h. Oespues de la adici6n de NaCl 5 M (3,6 ml) y cloroformo, 15 ml, la muestra se hizo girar verticalmente durante 20 min. Oespues de la centrifugaci6n a 6000 x g durante 20 min, la fase acuosa se transfiri6 con una pipeta de diametro interno grande a un tubo limpio. El ONA se precipit6 mediante la adici6n de 1 volumen de isopropanol y se arroll6 usando una pipeta de Pasteur sellada antes de transferirse a un tubo de microcentrifuga y enjuagarse con 1 ml de etanol al 70%. ONA secado al aire se disolvi6 en tamp6n de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 y EOTA 10 mM). Los genes de rRNA de 16S se amplificaron mediante PCR usando cebadores 27F (agagtttgatcmtggctcag), presentados como el N° IO SEC 4, y 1392R (acgggcggtgtgtgtrc), presentado como el N° IO SEC 5, y las secuencias se determinaron mediante GATC-Biotech, Alemania. Las secuencias de rONA de 16S se compararon con secuencias conocidas en la base de datos del GenBank NBCI mediante el programa BLAST. Las secuencias resultantes, presentadas como N° IO SEC 1-3, se analizan posteriormente con referencia a la Tabla 2.

Descripción de las Figuras:

Figura 1. Acumulaci6n de PHA por (A) Pseudomonas putida G016, (B) Pseudomonas putida G019 y (C) Pseudomonas frederiksbergensis G023 en un matraz agitado que contiene medio de crecimiento que consiste en 4,2 de tereftalato s6dico y 67 mg/l de nitr6geno a 30'C. COW g/l (�), la acumulaci6n de PHA g/l (�), la concentraci6n de TA (�) y la concentraci6n de nitr6geno g/l (�) suministrado como fosfato s6dico

5 am6nico se verificaron todas a lo largo de un periodo de 48 h. Todos los datos mostrados son el promedio de al menos tres determinaciones independientes.

Figura 2. Espectro de 1H NMR a 400 MHz del mclPHA aislado de P. putida G019 registrado a 20'C en COCl3.

Figura 3. Espectro de 13C NMR del mclPHA aislado de P. putida G019 registrado a 20'C en COCl3.

10 RESULTADOS

Pirólisis de Poli(tereftalato de etileno).

La pir6lisis de PET daba como resultado la generaci6n de una fracci6n s6lida, liquida y gaseosa, segun se muestra en la Tabla 1 posteriormente.

Tabla 1

Composici6n del Producto Porcentaje en Peso (%)

SÓLIDOS 77

�cido

tereftalico 51,0 0lig6meros 20,0

�cido

benzoico 1,0 otros 5,0

ACEITE 6,3

Etilenglicol 0,75 Aldehido acetico 5,10 0tros 0,45

GASES 18

C02 13,0 C0 3,5 Hidr6geno 0,18 Eteno 1,0 0tros 0,34

66% de la fracci6n s6lida estaba en la forma de TA monomerico y casi 26% de la fracci6n s6lida estaba constituido por olig6meros de TA. Toda la fracci6n s6lida se desublim6 segun se describe anteriormente para crear un polvo blanco, se recogi6 y se us6 como un material de alimentaci6n para la sintesis de PHA usando las cepas bacterianas de la invenci6n. La adici6n de la fracci6n s6lida de pir6lisis de PET (en la forma del polvo blanco) a una soluci6n 20 equimolar de hidr6xido s6dico daba como resultado la hidr6lisis de los olig6meros y un incremento en la proporci6n de TA que constituye la fracci6n s6lida. La fracci6n s6lida disuelta en el hidr6xido s6dico contenia 99% de mon6mero de TA en la forma de tereftalato s6dico. La fracci6n liquida (aceite) de pir6lisis constituia 6,3% del peso

total de los productos de pir6lisis y contenia predominantemente aldehido acetico y cantidades pequenas de etilenglicol. La fracci6n gaseosa constituia 18% de los productos de pir6lisis y contenia predominantemente C02. La fracci6n liquida y la gaseosa se quemaban para proporcionar energia para la pir6lisis de PET.

Segun se describe anteriormente, de los 32 aislados rastreados solo tres acumulaban niveles detectables de PHA.

5 Estos tres organismos se identificaron usando tecnicas de rONA de 16S segun se describe anteriormente. Las tres cepas compartian 99% de homologia con especies de Pseudomonas conocidas (Tabla 2). Se encontr6 que dos de las tres cepas de Pseudomonas, G016 y G019, procedian de la especie putida, y se presentan como N° IO SEC 1 y 2, respectivamente. Se encontr6 que la otra cepa, Pseudomonas G023, era de la especie frederiksbergensis, y se presenta como N° IO SEC 3.

10 Tabla 2

Aislado Acumuladores de PHA

Coincidencia más próxima del GenBank: Número de registro Clasificación % de Homología % de Cobertura

G016 (N° IO SEC 1)

OQ133506 Pseudomonas putida 99 97

G019 (N° IO SEC 2)

AY512611 Pseudomonas putida 99 99

G023 (N° IO SEC 3)

AJ249382 Pseudomonas frederiksbergensis 99 99

Composición de PHA

Los espectros de 1H-NMR y 13C para el PHA producido a partir de la cepa G019 se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Las asignaciones de los picos eran tipicas de derivados de PHA de longitud de cadena media.

15 Conversión de Tereftalato Sódico derivado de PET en PHA en Experimentos en Matraz Agitado.

Las tres cepas de acuerdo con la invenci6n acumulaban PHA hasta entre 23 y 27% del peso seco de celulas total alcanzado, cuando se aportaba bien TA (sal s6dica) disponible comercialmente o bien TA (sal s6dica) derivado de la pir6lisis de PET. Cada una de las cepas G016, G019 y G023 producia PHA de alta calidad, a saber mclPHA. Especificamente, el PHA acumulado incluia mon6meros de acido 3-hidroxialcanoico que contenian 8, 10 y 12

20 carbonos (Tabla 3). El TA (sal s6dica) disponible comercialmente se us6 como una comparaci6n con TA derivado de PET. Los niveles y la composici6n de PHA eran identicos a partir de ambas fuentes.

Tabla 3

Cepa bacteriana

PHA (% CDW) 3-OH-OCT* 3-OH-DEC** 3-OH-DODEC***

P. Putida G016

27 22 48 30

P. putida G019

23 24 45 31

P. frederiksbergensis G023

24 19 44 37

� 3-0H-0CT = acido 3-hidroxioctanoico, ��3-0H-OEC = acido 3-hidroxidecanoico, ���3-0H-O0OEC = acido 3hidroxidodecanoico.

Aunque la homologia de secuencia de rONA de 16S indicaba una fuerte similitud entre estas bacterias, a menudo,

25 especies estrechamente relacionadas tienen diferentes capacidades de acumulaci6n de PHA. En efecto, la composici6n de PHA de las tres cepas parece casi identica (Tabla 3). Sin embargo, el PHA de P. putida G023 contenia una proporci6n superior de acido 3-hidroxidodecanoico (12 carbonos) en comparaci6n con PHA de las otras dos cepas.

La acumulaci6n de PHA por cada una de las tres cepas se verific6 a lo largo del tiempo para determinar cuando se produce el comienzo de PHA asi como el transcurso del tiempo para la producci6n de PHA. Los tres organismos se hicieron crecer en matraces agitados bajo las condiciones limitadas en nitr6geno con 4,2 g/l de tereftalato s6dico (generado mediante pir6lisis de PET). Se verificaron la concentraci6n de nitr6geno (como amonio), la concentraci6n 5 de TA, el peso seco de las celulas y la cantidad de PHA acumulado (vease la Figura 1). Las tres bacterias tenian patrones de crecimiento similares, mostraban un largo periodo de retardo en el crecimiento (de entre 8-12 h) que coincidia con un retardo en la utilizaci6n de TA, a pesar de hacerse crecer en precultivos nocturnos sobre TA (4,2 g/l). Ourante la fase exponencial del crecimiento, las cepas G016, G019 y G023 consumian TA en 0,135 g/l/h, 0,157 g/l/h y 0,121 g/l/h, respectivamente, y tenian velocidades de crecimiento especificas de 0,04 h-1, 0,043 h-1 y

10 0,049 h-1. Las tres cepas consumian el TA completamente dentro del mismo periodo de tiempo (Figura 1).

Propiedades del Material de PHA

Las propiedades del polimero de PHA extraido de G016, G019 y G023 se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4

Cepa

Entalpía del punto de fusión�Hm Temperatura de fusión cristalinaTm (°C) Temperatura de transición vítreaTg (°C) Peso Molecular MW Peso molecularmedio numéricoMN Índice dePolidispersidadPD % deCristalinidad

G016

12,75 35,36 -53,13 7,43 x 104 3,76 x 104 1,97 26,8

G019

10,75 34,19 -53,14 12,32 x 104 5,19 x 104 2,37 18,71

G023

11,78 35,75 -53,38 9,38 x 104 4,4 x 104 2,10 31,09

El analisis por cromatografia de penetraci6n en gel (GPC) mostraba que los polimeros de PHA variaban en peso molecular (Mw) de 74 kOa a 123 kOa (Tabla 4). La distribuci6n de pesos moleculares (Mw/Mn) de los PHA variaba de 1,9 a 2,4 (Tabla 4) y estos valores son tipicos para mclPHA. El analisis por OSC mostraba que los polimeros de PHA producidos mediante el metodo de la invenci6n son parcialmente cristalinos, segun se evidencia por la presencia de un pico de fusi6n. Los tres polimeros producidos con las diferentes cepas bacterianas de la invenci6n mostraban una Tg similar, con ligeros cambios en sus valores de Tm y �Hm (Tabla 4). Se us6 difracci6n de rayos X (XRO) de peliculas coladas para calcular la cristalinidad de los polimeros. Los picos de difracci6n fuertes se localizaban en los 28 = 19,58, 21,38 y 19,38 para muestras de PHA producidas a partir de G016, G019 y G023, respectivamente. Los valores de cristalinidad calculados para G016, G019 y G023 se muestran en la Tabla 4. Los tres productos de PHA tenian patrones de degradaci6n termica similares. El maximo de degradaci6n del pico se producia a aproximadamente 308'C con un hombro de alta temperatura mas evidente a aproximadamente 350'C en la termografia diferencial. La degradaci6n del polimero era completa para los 370'C, quemandose todos los materiales carbonosos residuales producidos durante la degradaci6n termica a aproximadamente 600'C. Asi, los PHA producidos mediante estas tres cepas eran termoplasticos.

EJEMPLO 1 (B)

Oe los 32 aislados originales descritos en el Ejemplo 1 (A) anterior, seis de los 29 aislados restantes que se encontraba que no producian PHA se seleccionaron aleatoriamente y se clasificaron mediante analisis de secuencia de genes de rRNA de 16S de acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 1 (A). Las secuencias de rONA de 16S resultantes se compararon con secuencias conocidas en la base de datos del GenBank NCBI mediante el programa BLAST, y los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

Aislado (no productores de PHA)

Coincidencia más próxima del GenBank: Número de registro Clasificación % de Homología % de Cobertura

G0 13A (N° IO SEC 6)

AB008001 Pseudomonas putida 99 99

G0 1 (N° IO SEC 7)

EU111737.2 Pseudomonas putida 100 99

G0 6 (N° IO SEC 8)

AY823622.1 Pseudomonas putida 100 99

G0 8 (N° IO SEC 9)

EF093130.1 Pseudomonas sp. 99 99

G0 14 (N° IO SEC 10)

Y17052 Burkholderia glathei 99 99

TA 1 (N° IO SEC 11)

AM402950 Stenotrophomonas sp. 98 99

Se encontr6 que cuatro de los seis aislados procedian del genero Pseudomonas, siendo tres de las cuatro cepas de Pseudomonas especificamente de la especie putida. La utilizaci6n de acido tereftalico (sal s6dica) por estas seis cepas se verific6 segun se describe en el Ejemplo 1 (A), y se encontr6 que aunque se utilizaba tereftalato s6dico, no se producia PHA. Puesto que se ha mostrado que algunas cepas de Pseudomonas putida (p. ej. las cepas mostradas en la Tabla 5) son incapaces de acumular PHA a partir de tereftalato s6dico (presumiblemente, simplemente produciendo biomasa en su lugar), es sorprendente que se encontr6 que la cepa G0 16 de Pseudomonas putida y la cepa G0 19 de Pseudomonas putida acumulan PHA a partir de tereftalato s6dico. Oe forma similar, en vista del hecho de que una cepa de Pseudomonas sp. era incapaz de acumular PHA a partir de tereftalato s6dico, tambien es sorprendente que se encontraba que la cepa G0 23 de Pseudomonas frederiksbergensis acumulaba PHA a partir de tereftalato s6dico.

EJEMPLO 2 (Ejemplo Comparativo)

Tres cepas bacterianas convencionales que se sabe que utilizan TA como una unica fuente de carbono y energia, a saber Comamonas testosteroni YZW-O, Comamonas testosteroni T-2 y Comamonas testosteroni PSB-4, identificadas en la Tabla 6, se probaron con respecto a la acumulaci6n de PHA. Se sabe que estas tres cepas utilizan TA, pero no producian PHA (presumiblemente, produciendo simplemente biomasa en su lugar). La utilizaci6n de acido tereftalico (sal s6dica) se verific6 como se describe en el Ejemplo 1 (A), y se encontr6 que, aunque se utilizaba tereftalato s6dico, no se producia PHA.

Tabla 6

Fuente

Cepa

Wang et al.1

Comamonas testosteroni YZW-O

OSMZ2

Comamonas testosteroni T-2

OSMZ2

Comamonas testosteroni PSB-4

1Wang Y. Z.; Zhou Y.; Zylstra G. J. Molecular analysis of isophthalate and terephthalate degradation by Comamonas testosteroni YZWO. Environ Health Perspect. 1995. 103 Supl 5: 9-12. 2OSMZ = the German resource centre for biological material. Junker F.; Saller E.; Schlafli 0ppenberg H. R.; Kroneck P. M.; Leisinger T.; Cook A. Oegradative pathways for p-toluenecarboxylate and p-toluenesulfonate and their multicomponent oxygenases in Comamonas testosteroni strains PSB-4 and T-2. Microbiology. 1996. 142, 2419-2427.

Este ejemplo comparativo es una evidencia adicional del resultado sorprendente alcanzado por las cepas de la invenci6n, cepa G0 16 de Pseudomonas putida, la cepa GO19 de Pseudomonas putida y la cepa G023 de

5 Pseudomonas frederiksbergensis. Oado que se encontr6 que los degradadores de TA conocidos eran incapaces de producir PHA, es sorprendente que las cepas de la invenci6n fueran capaces de acumular PHA a partir de TA (sal s6dica).

En resumen, aunque existen algunas cepas que son capaces de degradar TA y existen algunas cepas que son capaces de producir PHA, hasta ahora no han existido cepas que sean capaces de utilizar TA para producir PHA.

10 LISTAO0 OE SECUENCIAS

�110> University College Oublin, National University of Ireland, Oublin

�120> Metodo para producir polihidroxialcanoato

�130> P88811PC00

�150> 0806234.1 15 �151> 2008-04-07

�150> S2008/0641

�151> 2008-07-30

�160> 11

�170> PatentIn versi6n 3.5 20 �210> 1

�211> 1427

�212> ONA

�213> Pseudomonas putida G016

�400> 1

�210> 2

�211> 1401

�212> ONA

�213> Pseudomonas putida G019

�400> 2

�210> 3

�211> 1398

�212> ONA

�213> Pseudomonas frederiksbergensis G023

�400> 3 �210> 4

�211> 20

�212> ONA

5 �213> Secuencia artificial �220>

�223> cebador

�400> 4

agagtttgat cmtggctcag 20 10 �210> 5

�211> 17 �212> ONA

�213> Secuencia artificial �220>

�223> cebador

5 �400> 5 acgggcggtg tgtgtrc 17

�210> 6

�211> 1391

�212> ONA 10 �213> Pseudomonas putida G013A

�400> 6

�210> 7

�211> 1294

�212> ONA

�213> Pseudomonas putida G0 1

�400> 7

�210> 8

�211> 1301 10 �212> ONA

�213> Pseudomonas putida G0 6 �220>

�221> caracteristica misc�

�222> (52)..(54)

�223> n es a, c, g o t

�400> 8

�210> 9

�211> 1310

�212> ONA

10 �213> Pseudomonas sp. G0 8 �220> �221> caracteristica misc�

�222> (59)..(61)

�223> n es a, c, g o t �220> �221> caracteristica misc�

�222> (289)..(289)

5 �223> n es a, c, g o t �220> �221> caracteristica misc�

�222> (445)..(445)

�223> n es a, c, g o t

10 �220> �221> caracteristica misc�

�222> (458)..(458)

�223> n es a, c, g o t

�400> 9

�210> 10

�211> 1393

�212> ONA

�213> Burkholderia glathei G0 14

�400> 10

�210> 11

�211> 1520

�212> ONA

�213> Stenotrophomonas sp. TA 1

�400> 11

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un metodo para producir polihidroxialcanoato (PHA), que comprende (i) cultivar en un medio de cultivo que comprende acido tereftalico y/o una sal del mismo y/o un ester del mismo una o mas cepas bacterianas que son capaces de acumular PHA a partir de acido tereftalico o una sal o un ester del mismo y que se seleccionan de la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538, la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537 y la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el numero de registro NCIMB 41539; y (ii) recuperar el PHA producido del medio de cultivo.

2. 2.

   Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en el que el medio de cultivo comprende la cepa G019 y/o la cepa G016.

3. 3.

   Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en el que el PHA recuperado del medio de cultivo comprende al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, mas preferiblemente al menos 90%, lo mas preferiblemente al menos 95% de PHA de longitud de cadena media (mcl).

4. 4.

   Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 3, en el que al menos 80%, preferiblemente 85%, mas preferiblemente al menos 90%, aun mas preferiblemente al menos 95% del mclPHA comprende unidades repetitivas de mon6meros C8, C10 y C12.

5. 5.

   Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en el que el mclPHA comprende unidades repetitivas de mon6meros C8, C10 y C12 en una cantidad en peso respectiva de mclPHA de 15%-25% de C8, 40%-50% de C10 y 30%-40% de C12.

6. 6.

   Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que una sal de acido tereftalico esta presente en el medio de cultivo y en el que, preferiblemente, la sal se selecciona de sales de metales alcalinos y metales alcalinoterreos y mezclas de las mismas, especialmente sales s6dicas y potasicas, y sales magnesicas, calcicas y baricas.

7. 7.

   Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 6, en el que la sal es una sal mono- o di-s6dica o potasica de acido tereftalico.

8. 8.

   Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 7, en el que la sal es tereftalato monos6dico.

9. 9.

   Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que un ester de acido tereftalico esta presente en el medio de cultivo y en el que, preferiblemente, el ester se selecciona de mono- y di-esteres de acido tereftalico y mezclas de los mimos, especialmente mono- y di-esteres alquilicos C1-C4 y mono- y di-esteres glic6licos.

10. 10.

    Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el acido tereftalico o la sal o ester del mismo puede obtenerse a partir de hidr6lisis o pir6lisis de poli(tereftalato de etileno) (PET), preferiblemente pir6lisis de PET.

11. 11.

    Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en donde el metodo comprende cultivar la una o mas cepas en el medio de cultivo durante un periodo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 72 horas, preferiblemente de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 60 horas, mas preferiblemente aproximadamente 48 horas, a una temperatura de aproximadamente 25'C a aproximadamente 35'C, preferiblemente aproximadamente 30'C.

12. 12.

    Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el medio de cultivo esta limitado en nitr6geno, con un contenido maximo de nitr6geno de aproximadamente 0,5 g/l, preferiblemente 0,067 g/l de medio de cultivo.

13. 13.

    la cepa GO16 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41538.

14. 14.

    la cepa GO19 de Pseudomonas putida que tiene el numero de registro NCIMB 41537.

15. 15.

    la cepa GO23 de Pseudomonas frederiksbergensis que tiene el numero de registro NCIMB 41539.

    Figura 2 Figura 3