ES2373878T3 - Antígenos de leishmania para su uso en la terapia y la diagnosis de la leismaniasis. - Google Patents

Antígenos de leishmania para su uso en la terapia y la diagnosis de la leismaniasis. Download PDF

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Abstract

Un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania, teniendo el antígeno la secuencia de aminoácidos citada en el SEQ ID NO: 24.

Description

Antígenos de Leishmania para su uso en la terapia y la diagnosis de la leismaniasis
REFERENCIA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere en general a composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leismaniasis, y para estimular respuestas inmunitarias en pacientes. La invención está relacionada más concretamente con polipéptidos que comprenden una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania o una de sus variantes, y a vacunas y composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de tales polipéptidos. Las vacunas y composiciones farmacéuticas se pueden utilizar, por ejemplo, para la prevención y la terapia de la leismaniasis, así como para la detección de la infección por Leishmania.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los organismos de Leishmania son parásitos protozoicos intracelulares de macrófagos que causan una amplia gama de enfermedades clínicas en seres humanos y animales domésticos, principalmente perros. En algunas infecciones, el parásito puede permanecer durmiente durante muchos años. En otros casos, el anfitrión puede desarrollar una variedad de formas de leismaniasis. Por ejemplo, la enfermedad puede ser asintomática o se puede manifestar en forma de leismaniasis visceral subclínica, que se caracteriza por unos síntomas leves de malestar, diarrea y hepatomegalia intermitente. Los pacientes con enfermedad subclínica o asintomática tienen normalmente bajos títulos de anticuerpo, dificultando de este modo la detección de la enfermedad con las técnicas convencionales. De manera alternativa, la leismaniasis se puede manifestar en forma de enfermedad cutánea, que es un problema médico grave pero es generalmente auto-limitante, o en forma de una enfermedad de las mucosas altamente destructiva, que no es auto-limitante. Finalmente, y muy gravemente, la enfermedad se puede manifestar en forma de infección visceral aguda que afecta al bazo, al hígado y a los ganglios linfáticos, que no tratada, es generalmente una enfermedad fatal. Los síntomas de leismaniasis visceral aguda incluyen hepatoesplenomegalia, fiebre, leucopenia, anemia e hipergammaglobulinemia.
La leismaniasis es un problema grave en la mayor parte del mundo, incluyendo Brasil, China, Este de África, India y zonas de Oriente Medio. La enfermedad también es endémica en la región Mediterránea, incluyendo el sur deFrancia, Italia, Grecia, España, Portugal y Norte de África. El número de casos de leismaniasis ha aumentado espectacularmente en los últimos 20 años, y en la actualidad existen millones de casos de esta enfermedad en todo el mundo. Cada año se diagnostican aproximadamente 2 millones de nuevos casos, 25% de los cuales son de leismaniasis visceral. No obstante, no existen en la actualidad vacunas u otros tratamientos eficaces.
Levick et al. (1996, Molecular and Biolochemical Parasitology, 76, 1-2, 345-348) han publicado previamente un análisis con etiquetas de secuencias expresadas de una genoteca de ADNc líder empalmado de promastigotas de Leishmania major. Este documento describe numerosos antígenos de Leishmania hipotéticos pero no proporciona datos sobre su inmunogenicidad potencial.
Con frecuencia la diagnosis exacta de la leismaniasis es difícil de lograr. Existen 20 especies de Leishmania que infectan a los seres humanos, incluyendo L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropica, y L. guyanensis, y no existen signos o síntomas distintivos que indiquen inequívocamente la presencia de infección por Leishmania. Se han utilizado métodos para la detección de los parásitos, pero estos métodos no son sensibles ni prácticos clínicamente. Las pruebas cutáneas actuales utilizan típicamente parásitos completos o lisados. Tales pruebas son generalmente insensibles, irreproducibles y propensas a reacción cruzada con una variedad de otras enfermedades. Además, las preparaciones empleadas en dichas pruebas son a menudo inestables. De este modo, existe la necesidad de métodos mejorados para la detección de la infección por Leishmania.
Las vacunas experimentales actuales que consisten en organismos completos no han mostrado ser eficaces en seres humanos. Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad en la técnica de vacunas para prevenir la leismaniasis en seres humanos y perros, y de composiciones terapéuticas mejoradas para el tratamiento de la leismaniasis.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Expuesto brevemente, la presente invención proporciona composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leismaniasis, así como para estimular respuestas inmunitarias en pacientes. En un aspecto, se proporcionan polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania, que tiene la secuencia de aminoácidos citada en el SEQ ID NO: 24. También se proporcionan las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos anteriores, los vectores de expresión recombinantes que comprenden estas secuencias de ADN y las células anfitrionas transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.
En aspectos relacionados, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los polipéptidos descritos en la presente memoria, o una molécula de ADN que codifica tales polipéptidos, y un portador fisiológicamente aceptable. También se proporcionan vacunas que comprenden uno o más de tales polipéptidos o moléculas de ADN, junto con un intensificador de la respuesta inmunitaria no específica. En realizaciones específicas de estos aspectos, el antígeno de Leishmania tiene una secuencia de aminoácidos citada en el SEQ ID No: 24.
Se describen en la presente memoria las composiciones farmacéuticas y las vacunas que comprenden al menos dos polipéptidos diferentes, comprendiendo cada polipéptido una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias citadas en los SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 20, 22, 24, 26, 36-38, 41, 50-53, 82, y sus variantes que difieren solamente en sustituciones y/o modificaciones conservativas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más de los polipéptidos de la invención combinados con un antígeno de Leishmania conocido.
Las composiciones farmacéuticas y las vacunas comprenden antígenos de Leishmania solubles.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas como se han descrito antes para inducir inmunidad protectora frente a la leismaniasis en un paciente.
También se describen en la presente memoria métodos y kits de diagnóstico para detectar la infección por Leishmania en un paciente. Los métodos comprenden: (a) poner en contacto células dérmicas de un paciente con una composición farmacéutica como se ha descrito más arriba; y (b) detectar una respuesta inmunitaria en la piel del paciente, detectando a partir de allí la infección por Leishmania en el paciente. Los kits de diagnóstico comprenden:
(a) una composición farmacéutica como se ha descrito más arriba; y (b) un aparato suficiente para poner en contacto la composición farmacéutica con las células dérmicas de un paciente.
También se describen en la presente memoria los métodos para estimular una respuesta inmunitaria celular y/o humoral en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o una vacuna como se ha descrito más arriba.
Los métodos descritos en la presente memoria son adecuados para tratar a un paciente aquejado de una enfermedad sensible a la estimulación con IL-12, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o una vacuna como se ha descrito más arriba.
Estos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra la estimulación de la proliferación de las células T obtenidas de ratones BALB/c inmunizados para L. donovani (representada por el índice de estimulación) por medio de macrófagos infectados con L. donovani después de la incubación durante 24, 48 y 72 horas.
La Figura 2 ilustra perfiles de HPLC representativos de péptidos aislados de moléculas de MHC de clase II de macrófagos P388D1. El Panel A muestra péptidos aislados de macrófagos no infectados y el panel B muestra péptidos aislados de macrófagos infectados con L. donovani. Las flechas del panel B indican picos de péptidos presentes solamente en la preparación de macrófagos infectados.
La Figura 3 ilustra la expresión y purificación del antígeno de Leishmania Ldp23 en forma de una proteína de fusión recombinante. El Panel A muestra un gel de SDS-PAGE teñido con Azul de Coomassie de E. coli lisado sin (calle 1) y con (calle 2) inducción por IPTG de la expresión de Ldp23. La flecha indica la proteína de fusión recombinante. El Panel B muestra la proteína de fusión después de la escisión de un gel de SDS-PAGE preparativa, electroelución, diálisis frente a PBS y SDS-PAGE analítica.
La Figura 4 presenta un análisis de transferencia Northern del ARN total preparado a partir de L. donovani,
L. major, L. amazonensis y L. pifanoi con un gen Ldp23 marcado con P32. 1, 2 y 3 hacen referencia al ARN obtenido a partir de promastigotas en la fase de crecimiento logarítmica, promastigotas en la fase de crecimiento estacionaria y formas amastigotas, respectivamente.
La Figura 5 muestra un análisis de transferencia Western de antígenos de promastigotas de L. donovani incubados con suero de conejo pre-inmunitario (calle A) o con antisuero de conejo anti-Ldp23 (calle B).
La Figura 6 ilustra la expresión en superficie de Ldp23 sobre promastigotas de L. donovani vivas. La línea discontinua muestra la inmunofluorescencia indirecta producida utilizando suero de ratón pre-inmune y la línea continua muestra el resultado obtenido con antisuero anti-GST-Ldp23 de ratón. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante FACScan.
Figura 7 muestra la estimulación de la proliferación de células T específicas de Leishmania por Ldp23. Los resultados se presentan como el número de células relativo como una función de la intensidad de fluorescencia. Las células T (105/pocillo) fueron purificadas a partir de ganglios linfáticos de ratones BALB/c inmunizados en la almohadilla de la pata con promastigotas de L. donovani en CFA y fueron cultivadas con diferentes concentraciones de Ldp23 recombinante purificado en presencia de 2 x 105 células mononucleares de bazo BALB/c normales tratadas con Mitomicina C. La proliferación de las células T se midió a las 27 horas del cultivo. Los valores se expresan como cpm y representan la media de incorporación de [3H]TdR de cultivos por triplicado.
La Figura 8 ilustra la producción de citoquina inducida por Ldp23 por células de ganglios linfáticos de ratones BALB/c. Los cultivos fueron incubados con cantidades variantes de Ldp23 o producto lisado de Leishmania, presentado en μg/mL, y fueron analizados mediante ELISA para determinar la producción de interferón-y (panel A) o interleuquina-4 (panel B), ambos los cuales se muestran en ng/mL.
La Figura 9 muestra la amplificación por PCR de ARNm de citoquinas aislados de PBMC de un paciente con leismaniasis de las mucosas (Panel A) y leismaniasis cutánea (panel B) y después de la estimulación con polipéptidos representativos de la presente invención. Las calles O y – indican el nivel de productos de PCR al inicio del cultivo y después de 72 horas de cultivo, respectivamente, en ausencia de polipéptido añadido; las calles Lb, 83a y 83b indican el nivel de productos de PCR después de cultivar PBMC con producto lisado de L. braziliensis, y los antígenos Lbhsp83a y Lbhsp83b de Leishmania, respectivamente.
La Figura 10 presenta una comparación de los niveles de interferón-y (panel A) y TNF-a (panel B) en los sobrenadantes de cultivos de PBMC de 72 horas de individuos infectados con Leishmania y de control en respuesta a la estimulación con producto lisado de parásito o los polipéptidos indicados.
La Figura 11 ilustra los niveles de IL-10 p40 (en pg/mL) en el sobrenadante de cultivo de PBMC de individuos infectados con L. braziliensis y controles no infectados 72 horas después de la estimulación con producto lisado de promastigotas del parásito (Lb), Lbhsp83a o Lbhsp83b.
La Figura 12 presenta las reactividades de sueros de pacientes infectados con L. braziliensis con los polipéptidos representativos de la presente invención en un ELISA convencional. Los valores se expresan como la absorbancia a 405 nm.
Las Figuras 13A y 13B ilustran el nivel de IL-4 e IFN-y (en pg/mL) secretados estimulados en cultivos de ganglios linfáticos de ratón mediante la adición de los polipéptidos representativos de la presente invención.
La Figura 14 muestra el nivel de IFN-y (en pg/mL) secretado por PBMC humanas infectadas con Leishmania y no infectadas estimuladas por el antígeno M15 de Leishmania, en comparación con los niveles estimulados por producto lisado de L. major y L-Rack, un antígeno que no parece ser reconocido por seres humanos infectados con Leishmania.
La Figura 15 muestra el nivel de IFN-y (en pg/mL) secretado por PBMC humanas infectadas y no infectadas estimuladas por antígenos de Leishmania solubles (antígenos S), en comparación con los niveles estimulados por producto lisado de L. major y L-Rack.
La Figura 16 ilustra la proliferación de cultivos de ganglios linfáticos murinos estimulados mediante la adición de los polipéptidos representativos de la presente invención. Los valores se expresan en cpm.
La Figura 17 muestra la proliferación de PBMC humanas, preparadas a partir de individuos inmunes a Leishmania y no infectados, estimulados por M15 en comparación con la proliferación estimulada por producto lisado de L. major y L-Rack. Los valores se expresan en cpm.
La Figura 18 ilustra la proliferación de PBMC humanas, preparadas a partir de individuos infectados con Leishmania y no infectados, estimulados por antígenos de Leishmania solubles en comparación con la proliferación estimulada por el medio de cultivo, el producto lisado de L. major y L-Rack. Los valores se expresan en cpm.
La Figura 19 presenta una comparación de una secuencia Lbhsp83 (SEQ ID NO: 6) con secuencias homólogas de L. amazonensis (Lahsp83) (SEQ ID NO: 16), T. cruzi (Tchsp83) (SEQ ID NO: 17) y humanas (Huhsp89) (SEQ ID NO: 18).
La Figura 20 ilustra la reactividad de sueros de conejo originados contra antígenos de Leishmania solubles con producto lisado de promastigota de Leishmania (calle 1) y antígenos de Leishmania solubles (calle 2).
La Figura 21 muestra el ADNc y la secuencia de aminoácidos pronosticada para el antígeno Lmsp1a de Leishmania.
La Figura 22 muestra una transferencia Southern de ADN genómico de L. major digerido con un panel de enzimas de restricción (calles 1 a 7) y otras seis especies de Leishmania digeridas con PstI (calles 8 a 13) sondeadas con el inserto de ADNc completo de Lmsp1a.
La Figura 23 muestra una transferencia Southern de ADN genómico de L. major digerido con un panel de enzimas de restricción, otras seis especies de Leishmania digeridas con PstI y los patógenos infecciosos T. cruzi y T. brucei, sondeadas con el inserto de ADNc completo del antígeno MAPS-1A de Leishmania.
La Figura 24 ilustra la proliferación de PBMC aisladas de individuos no infectados, pacientes con leismaniasis de las mucosas activa y pacientes post infección por kala-azar, estimuladas por MAPS-1A.
La Figura 25 ilustra la proliferación de cultivos de ganglios linfáticos murinos estimulados por MAPS-1A.
La Figura 26 ilustra la reactividad de MAPS-1A con sueros de pacientes humanos con leismaniasis.
La Figura 27 ilustra la reactividad de MAPS-1A con sueros de ratones inmunizados contra y/o infectados con leismaniasis.
La Figura 28 ilustra la eficacia de la inmunización o bien con antígenos solubles de Leishmania o bien una mezcla de Ldp23, LbeiF4A y M15 más coadyuvante al conferir protección contra la infección (medida mediante hinchazón de la almohadilla de la pata) en un sistema modelo de leismaniasis murina, en comparación con la administración de coadyuvante solo.
La Figura 29 ilustra la eficacia de la inmunización con MAPS-1A más coadyuvante al conferir protección contra la infección (medida mediante la hinchazón de la almohadilla de la pata) en un sistema modelo de leismaniasis murina, en comparación con la administración de coadyuvante solo.
Las Figuras 30A y B ilustran la proliferación de cultivos de ganglios linfáticos murinos estimulados con LcgSP8, LcgSP10 o LcgSP3.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se ha indicado más arriba, la presente invención está dirigida generalmente a composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar la leismaniasis, así como para estimular respuestas inmunitarias en pacientes. Las composiciones de la invenció sujeto incluyen polipéptidos que comprenden una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos citada en el SEQ ID NO: 24, las composiciones de la presente invención pueden incluir múltiples polipéptidos seleccionados con el fin de proporcionar un aumento de protección frente a una variedad de especies de Leishmania.
Los polipéptidos de la presente invención comprenden porciones inmunogénicas de antígenos de Leishmania que comprenden la secuencia citada en el SEQ ID NO: 24 (referida en la presente memoria como MAPS-1A). Según se utiliza en la presente memoria, el término "polipéptido" abarca las cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas completas (esto es, antígenos), donde los residuos de aminoácido están conectados por medio de enlaces covalentes. De este modo, un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de uno de los antígenos anteriores puede consistir exclusivamente en la porción inmunogénica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar del antígeno de Leishmania nativo o pueden ser heterólogas, y tales secuencias pueden (pero no necesitan) ser inmunogénicas. Un antígeno "que tiene" una secuencia concreta es un antígeno que contiene, en su secuencia completa, la secuencia citada. El antígeno nativo puede, o no, contener secuencias de aminoácidos adicionales.
Una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania es una porción que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria (esto es, celular y/o humoral) en un paciente actualmente o previamente infectado con Leishmania (tal como un ser humano o un perro) y/o en cultivos de células de ganglio linfático o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos actualmente o previamente infectados con Leishmania. Las células en las cuales se provoca una respuesta pueden comprender una mezcla de tipos de células o pueden contener células componentes aisladas (incluyendo, pero no limitadas a, células T, células NK, macrófagos, monocitos y/o células B). En particular, las porciones inmunogénicas son capaces de inducir la proliferación de las células T y/o una respuesta de citoquinas de tipo Th1 dominante (p. ej., producción de IL-2, IFN-y, y/o TNF-a por células T y/o células NK; y/o la producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o células B). Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente memoria pueden ser identificadas generalmente utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo los métodos representativos proporcionados en la presente memoria.
Las composiciones y métodos descritos en la presente invención también incluyen variantes de los polipéptidos anteriores. Una "variante" polipeptídica, según se utiliza en la presente memoria, es un polipéptido que difiere del antígeno nativo solamente en sustituciones y/o modificaciones conservativas, de manera que se conserva la capacidad del polipéptido para inducir una respuesta inmunitaria. Las variantes polipeptídicas muestran preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y muy preferiblemente al menos aproximadamente 95% con los polipéptidos identificados. De manera alternativa, tales variantes pueden ser identificadas modificando una de las secuencias de polipéptidos anteriores y evaluando las propiedades inmunogénicas del polipéptido modificado utilizando, por ejemplo, los procedimientos representativos descritos en la presente memoria.
Una "sustitución conservativa" es aquella en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos espere que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanezcan esencialmente inalteradas. En general, Los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservativos: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.
Las variantes pueden también (o alternativamente) ser modificadas, por ejemplo, mediante la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima sobre las propiedades inmunogénicas, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede ser conjugado con una secuencia señal (o líder) en el extremo N terminal de la proteína que dirige co-traduccionalmente o post-traduccionalmente la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede ser conjugado con un conector u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (p. ej., poly-His), o para intensificar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede ser conjugado con una región Fc de inmunoglobulina.
Una "variante" nucleotídica es una secuencia que difiere de la secuencia de nucleótidos citada por tener una o más deleciones, sustituciones o adiciones de nucleótidos. Dichas modificaciones se pueden introducir fácilmente utilizando mecanismos de mutagénesis convencionales, tales como la mutagénesis específica del sitio dirigida por oligonucleótidos como ilustran, por ejemplo, Adelman et al. (DNA, 2:183, 1983). Las variantes nucleotídicas pueden ser variantes alélicas de origen natural, o variantes de origen no natural. Las variantes nucleotídicas muestran preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80% y muy preferiblemente al menos aproximadamente 90% con la secuencia citada. Tales secuencias nucleotídicas variantes hibridarán generalmente con la secuencia de nucleótidos citada en condiciones restrictivas. Según se utiliza en la presente memoria, "condiciones restrictivas" hace referencia a un prelavado en una solución de 6X SSC, SDS al 0,2%; hibridación a 65°C, 6X SSC, SDS al 0,2% durante la noche; seguido de dos lavados de 30 minutos cada uno en 1X SSC, SDS al 0,1% a 65°C y dos lavados de 30 minutos cada uno en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C.
"Polipéptidos" según se describe en la presente memoria también incluye los polipéptidos combinados. Un "polipéptido combinado" es un polipéptido que comprende al menos una de las porciones inmunogénicas anteriores y una o más secuencias de Leishmania inmunogénicas adicionales, que están unidas por medio de un enlace peptídico en una única cadena de aminoácidos. Las secuencias se pueden unir directamente (esto es, sin aminoácidos intermedios) o pueden estar unidas por medio de una secuencia conectora (p. ej., Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos componentes.
En general, los antígenos de Leishmania que tienen propiedades inmunogénicas, y las secuencias de ADN que codifican tales antígenos, se pueden preparar utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos a partir de una o más especies de Leishmania incluyendo, pero no limitadas a, L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropica, y L. guyanensis. Tales especies son asequibles, por ejemplo, de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC), Rockville, MD. Por ejemplo, se pueden utilizar péptidos aislados de moléculas del MHC de clase II de macrófagos infectados con una especie de Leishmania para rescatar los correspondientes antígenos del donante de Leishmania. Las moléculas del MHC de clase II son expresados principalmente por las células del sistema inmunitario, incluyendo los macrófagos. Estas moléculas presentan péptidos, que tienen normalmente 13-17 aminoácidos de longitud, derivados de antígenos foráneos que están degradados en vesículas celulares. Los antígenos peptídicos unidos son reconocidos después por las células T CD4. Por consiguiente, se pueden utilizar péptidos foráneos aislados de moléculas del MHC de clase II de, por ejemplo, macrófagos murinos infectados con Leishmania para identificar proteínas de Leishmania inmunogénicas.
En resumen, se pueden aislar péptidos derivados de antígenos de Leishmania comparando el perfil de la HPLC en fase reversa de los péptidos extraídos de macrófagos infectados con el perfil de péptidos extraídos de células no infectadas. Los péptidos que dan origen a distintos picos de HPLC únicos para macrófagos infectados pueden ser secuenciados después utilizando, por ejemplo, la química de Edman como describen Edman y Berg, en Eur J. Biochem, 80:116-132 (1967). Después se puede amplificar un fragmento de ADN correspondiente a una porción de un gen de Leishmania que codifica el péptido a partir de una genoteca de ADNc de Leishmania utilizando un cebador efector oligonucleotídico derivado de la secuencia peptídica y un cebador antisentido oligo dT. El fragmento de ADN resultante se puede utilizar después como sonda para escrutar una genoteca de Leishmania en busca de un ADNc completo o un clon genómico que codifica el antígeno de Leishmania. Tales escrutinios se pueden realizar generalmente utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como los descritos por Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Este enfoque se puede utilizar para identificar un antígeno de Leishmania donovani de 23 kD (referido en la presente memoria como Ldp23). La secuencia de una molécula de ADN que codifica Ldp23 se proporciona en el SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de Ldp23 se proporciona en el SEQ ID NO: 4. Utilizando los métodos descritos en la presente memoria, se ha demostrado que Ldp23 induce una respuesta inmunitaria Th1 en células T preparadas a partir de ratones infectados con Leishmania.
Como alternativa, se puede escrutar una genoteca de ADNc o de expresión genómica de Leishmania con suero de un individuo infectado con Leishmania, utilizando mecanismos bien conocidos por un experto en la técnica. Las moléculas de ADN que codifican antígenos reactivos se pueden utilizar después para expresar el antígeno recombinante para la purificación. Las propiedades inmunogénicas de los antígenos de Leishmania purificados se pueden evaluar después utilizando, por ejemplo los métodos representativos descritos en la presente memoria.
Por ejemplo, los sueros de ratones infectados con Leishmania se pueden utilizar para escrutar una genoteca de ADNc preparada a partir de amastigotas de Leishmania. Los clones reactivos pueden ser expresados después y las proteínas recombinantes pueden ser analizadas para determinar su capacidad para estimular células T o células NK derivadas de individuos inmunes a Leishmania (esto es, individuos que tienen evidencia de infección, documentada por una reactividad serológica positiva con anticuerpos específicos de Leishmania y/o una respuesta DTH específica de Leishmania, sin síntomas clínicos de leishmaniasis). Este procedimiento se puede utilizar para obtener una molécula de ADN recombinante que codifica el antígeno de Leishmania denominado M15. La secuencia de dicha molécula de ADN se proporciona en el SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada se proporciona en el SEQ ID NO: 2.
Se puede utilizar un enfoque similar para aislar una molécula de ADN genómico que codifica un antígeno inmunogénico de Leishmania braziliensis, referido en presente memoria como Lbhsp83. Más específicamente, se puede aislar un clon genómico que codifica Lbhsp83 escrutando una genoteca de expresión de L. braziliensis con sueros de un individuo infectado con Leishmania. El ADN que codifica Lbhsp83 es homólogo al gen que codifica la proteína de choque térmico eucariótica de 83 kD. La secuencia de una molécula de ADNc que codifica casi todo Lbhsp83 se presenta en el SEQ ID NO: 5, y la secuencia de aminoácidos codificada se proporciona en el SEQ ID NO: 6. Utilizando los métodos descritos más abajo, se ha encontrado que Lbhsp83 estimula la proliferación, y un perfil de citoquina Th1 y Th2 mixto, en PBMC aisladas de pacientes infectados con L. braziliensis. Por consiguiente, Lbhsp83 es un antígeno inmunogénico de Leishmania. Se ha descubierto que las regiones de Lbhsp83 que no están conservadas con el gen de mamífero son particularmente potentes para la estimulación de células T y la unión de anticuerpos. Tales regiones pueden ser identificadas, por ejemplo, mediante inspección visual de la comparación de secuencias proporcionada en la Figura 19.
Este enfoque también se puede utilizar para aislar una molécula de ADN que codifica un antígeno inmunogénico de
L. tropica de 210 kD, referido en la presente memoria como Lt-210. La preparación y caracterización de Lt-210, y sus porciones inmunogénicas (tales como Lt-1 y las secuencias repetidas y no repetidas inmunogénicas), se describen con detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con el Núm. de Serie 08/511.872, presentada el 4 de Agosto de 1995. La secuencia de una molécula de ADN que codifica Lt-1 se proporciona en el SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en el SEQ ID NO: 8.
El enfoque anterior se puede utilizar además para aislar una molécula de ADN que codifica un antígeno de L. braziliensis referido en la presente memoria como LbeIF4A. En resumen, dicho clon puede ser aislado escrutando una genoteca de expresión de L. braziliensis con sueros obtenidos de un paciente aquejado de leismaniasis de las mucosas, y analizando los antígenos reactivos para determinar la capacidad para estimular las respuestas proliferativas y la producción de citoquina Th1 preferente en PBMC aisladas de pacientes infectados con Leishmania, como se describe más abajo. La preparación y caracterización de LbeIF4A se describe con detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con los Núms. de Serie 08/454.036 y 08/488.386, que son una continuación de parte de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos con el Núm. de Serie 08/232.534, presentada el 22 de Abril de 1994. La secuencia de una molécula de ADN que codifica LbeIF4A se proporciona en el SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO: 10. También se pueden aislar homólogos de LbeIF4A, tales como el encontrado en L. major, utilizando este enfoque, y están dentro del alcance de la presente invención.
Las composiciones descritas en la presente invención también pueden contener, o alternativamente, contienen antígenos de Leishmania solubles. Según se utiliza en la presente memoria, "antígenos de Leishmania solubles" hace referencia a una mezcla de al menos 8 antígenos de Leishmania diferentes que pueden ser aislados del sobrenadante de promastigotas de Leishmania de cualquier especie desarrolladas durante 8-12 horas en medio sin proteína. En resumen, los organismos se hacen crecer hasta la fase log tardía en medio complejo con suero hasta que alcanzan una densidad de 2-3 x 107 organismos viable por mL de medio. Los organismos se lavan cuidadosamente para separar los componentes del medio y se resuspenden a 2-3 x 107 organismos viables por mL de medio sin suero definido que consiste en partes iguales de RPMI 1640 y medio 199, ambos de Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Después de 8-12 horas, el sobrenadante que contiene antígenos de Leishmania solubles se separa, se concentra 10 veces y se somete a diálisis frente a solución salina tamponada con fosfato durante 24 horas. La presencia de al menos ocho antígenos diferentes en la mezcla de antígenos de Leishmania se puede confirmar utilizando SDS-PAGE (esto es, por medio de la observación de al menos 8 bandas diferentes). Las propiedades inmunogénicas de los antígenos de Leishmania solubles se pueden confirmar evaluando la capacidad de la preparación para lograr una respuesta inmunitaria en cultivos de células de ganglios linfáticos y/o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos actualmente o previamente infectados con Leishmania. Dicha evaluación se puede realizar como se describe más abajo.
Los antígenos individuales presentes en la mezcla de antígenos de Leishmania solubles se pueden aislar inmunizando ratones o conejos con sobrenadante de cultivo de Leishmania, que contiene antígenos solubles, y empleando el suero resultante para escrutar una genoteca de expresión de ADNc de Leishmania como se describe con detalle más abajo. Este procedimiento se puede utilizar para aislar moléculas de ADN recombinantes que codifican los antígenos de L. major referidos en la presente memoria como Lmsp1a, Lmsp9a y MAPS-1A. Las secuencias de ADN que codifican Lmsp1a, Lmsp9a y MAPS-1A se proporcionan en los SEQ ID NO: 19, 21 y 23, respectivamente, estando representadas las correspondientes secuencias de aminoácidos pronosticadas en los SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente. De un modo similar, se pueden utilizar sueros de ratones o conejos inmunizados con sobrenadante de cultivo de L. major para escrutar una genoteca de ADN genómico de L. major. Como se detalla más abajo, este procedimiento se puede utilizar para aislar moléculas de ADN que codifican los antígenos de L. major referidos en la presente memoria como LmgSP1, LmgSP3, LmgSP5, LmgSP8, LmgSP9, LmgSP13, LmgSP19, y moléculas de ADN que codifican los antígenos de L. chagasi LcgSP1, LcgSP3, LcgSP4, LcgSP8, y LcgSP10. Las secuencias de ADN que codifican estos antígenos se proporcionan en los SEQ ID NO: 2935 y 44-48, respectivamente, siendo proporcionadas las correspondientes secuencias de aminoácidos en los SEQ ID NO: 36-42 y 49-53. Los antígenos de L. major referidos en la presente memoria como 1G6-34, 1E6-44, 4A5-63, 1B11-39, 2A10-37, 4G2-83, 4H6-41 y 8G3-100 pueden ser aislados por medio de la clonación de la expresión de células T CD4+ como se describe más abajo. Las secuencias de ADN que codifican estos antígenos se proporcionan en los SEQ ID NO: 72-79, respectivamente, siendo proporcionadas las correspondientes secuencias de aminoácidos pronosticadas en los SEQ ID NO: 80-87. Las propiedades inmunogénicas de los antígenos de Leishmania aislados se pueden evaluar utilizando, por ejemplo, los métodos representativos descritos en la presente memoria.
Con independencia del método de preparación, los antígenos descritos en la presente memoria son inmunogénicos. En otras palabras, los antígenos (y las porciones inmunogénicas de los mismos) son capaces de lograr una respuesta inmunitaria en cultivos de células de ganglios linfáticos y/o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de individuos actualmente o previamente infectados con Leishmania. Más específicamente, los antígenos, y las porciones inmunogénicas de los mismos, tienen la capacidad de inducir la proliferación de las células T y/o lograr una respuesta de citoquinas de tipo Th1 dominantemente (p. ej., producción de IL-2, IFN-y, y/o TNF-a por células T y/o células NK; y/o producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o células B) en las células aisladas de individuos actualmente o previamente infectados con Leishmania. Un individuo infectado con Leishmania puede estar aquejado de una forma de leismaniasis (tal como subclínica, cutánea, de las mucosas o visceral activa)
o puede ser asintomático. Tales individuos pueden ser identificados utilizando métodos conocidos para los expertos en la técnica. Los individuos con leismaniasis pueden ser identificados basándose en descubrimientos clínicos asociados con al menos uno de los siguientes: aislamiento de parásitos a partir de las lesiones, un ensayo cutáneo positivo con producto lisado de Leishmania o un ensayo serológico positivo. Los individuos asintomáticos son individuos infectados que no tienen signos o síntomas de la enfermedad. Dichos individuos pueden ser identificados basándose en un ensayo serológico positivo y/o un test cutáneo con producto lisado de Leishmania.
El término "PBMC", que hace referencia a una preparación de células nucleadas que consiste principalmente en linfocitos y monocitos que están presentes en la sangre periférica, incluye tanto las mezclas de células como las preparaciones de uno o más tipos de células purificadas. Las PBMC se pueden aislar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las PBMC se pueden aislar mediante centrifugación en gradiente por densidad, por ejemplo, a través de Ficoll® (Winthrop Laboratories, Nueva York). Los cultivos de ganglios linfáticos se pueden preparar generalmente inmunizando ratones BALB/c (p. ej., en la almohadilla de la pata trasera) con promastigotas de Leishmania emulsionadas en coadyuvante completo de Freünd. Los ganglios linfáticos drenados pueden ser extirpados después de la inmunización y las células T pueden ser purificadas en una columna con anti-Ig de ratón para separar las células B, seguido de un pase a través de una columna de Sephadex G10 para separar los macrófagos. De un modo similar, las células de los ganglios linfáticos se pueden aislar de un ser humano después de la biopsia o la extirpación quirúrgica de un ganglio linfático.
La capacidad de un polipéptido (p. ej., un antígeno de Leishmania o una porción o una variante del mismo) para inducir una respuesta en cultivos de PBMC o ganglio linfático se puede evaluar poniendo en contacto las células con el polipéptido y midiendo una respuesta adecuada. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 2 x 105 células oscila entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 100 μg, y preferiblemente es de aproximadamente 1-10 μg. La incubación del polipéptido con las células se realiza por lo general a 37°C durante aproximadamente 1-3 días. Después de la incubación con el polipéptido, las células se analizan en busca de una respuesta apropiada. Si la respuesta es una respuesta proliferativa, se puede emplear cualquiera de una variedad de mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden exponer a un pulso de timidina radiactiva y se puede medir la incorporación de la marca al ADN celular. En general, un polipéptido que da como resultado al menos un aumento de tres veces en la proliferación por encima del fondo (esto es, la proliferación observada para las células cultivadas sin polipéptido) se considera capaz de inducir la proliferación.
De manera alternativa, la respuesta que se va a medir puede ser la secreción de una o más citoquinas (tales como interferón-y (IFN-y), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-12 (p70 y/o p40), interleuquina-2 (IL-2) y/o factor de necrosis tumoral-a (TNF-a)) o el cambio de nivel de ARNm que codifica una o más citoquinas específicas. En particular, la secreción de interferón-y, interleuquina-2, factor de necrosis tumoral-a y/o interleuquina-12 es indicativa de una respuesta Th1, que es responsable del efecto protector frente a Leishmania. Los análisis de cualquiera de las citoquinas anteriores se pueden realizar en general utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como el análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA). Los anticuerpos adecuados para su uso en tales análisis se pueden obtener de una variedad de fuentes tales como Chemicon, Temucula, CA y PharMingen, San Diego, CA, y se pueden utilizar generalmente de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El nivel de ARNm que codifica una o más citoquinas específicas se puede evaluar, por ejemplo, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En general, un polipéptido que es capaz de inducir, en una preparación de aproximadamente 1-3 x 105 células, la producción de 30 pg/mL de IL-12, IL-4, IFN-y, TNF-a o IL-12 p40, o 10 pg/mL de IL-12 p70, se considera capaz de estimular la producción de una citoquina.
Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente memoria se pueden preparar e identificar utilizando mecanismos bien conocidos, tales como los resumidos por Paul, en Fundamental Immunology, 3ª ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y referencias allí citadas. Tales técnicas incluyen el escrutinio de polipéptidos derivados del antígeno nativo en busca de propiedades inmunogénicas utilizando, por ejemplo, las técnicas representativas descritas en la presente memoria. Una porción inmunogénica de un polipéptido es una porción que, en tales análisis representativos, genera una respuesta inmunitaria (p. ej., proliferación y/o producción de citoquina) que es esencialmente similar a la generada por el antígeno completo. En otras palabras, una porción inmunogénica de un antígeno puede generar al menos aproximadamente 25%, y preferiblemente al menos aproximadamente 50%, de la respuesta generada por el antígeno completo en los análisis modelo descritos en la presente memoria.
Se pueden generar porciones y otras variantes de antígenos inmunogénicos de Leishmania mediante métodos sintéticos o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden ser generados utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden ser sintetizados utilizando cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipamiento para la síntesis automatizada de polipéptidos se encuentra disponible en el mercado de proveedores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, y se puede hacer funcionar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un antígeno nativo se pueden preparar fácilmente a partir de una secuencia de ADN que codifica el antígeno. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas de anfitrión/vector adecuados que secretan proteína recombinante al medio de cultivo se pueden concentrar primero utilizando un filtro disponible en el mercado. Tras la concentración, el producto concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente una proteína recombinante.
En general, se puede emplear cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos en la técnica para expresar los polipéptidos recombinantes de esta invención. La expresión se puede lograr en cualquier anfitrión apropiado que haya sido transformado o transfectado con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN que codifique un polipéptido recombinante. Las células anfitrionas adecuadas incluyen procariotas, levaduras y células eucarióticas superiores. Preferiblemente, las células anfitrionas empleadas son E. coli, levaduras, o una línea celular de mamífero tal como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar antígenos de origen natural, porciones de antígenos de origen natural, u otras variantes de los mismos. Por ejemplo, se pueden preparar generalmente variantes de un antígeno nativo utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como mutagénesis específica del sito dirigida por oligonucleótidos, y se pueden separar secciones de la secuencia de ADN para permitir la preparación de polipéptidos truncados.
Se describen en la presente memoria secuencias de repetición epitópica o epítopos antigénicos, de un antígeno de Leishmania, junto con polipéptidos que comprenden al menos dos de tales epítopos antigénicos contiguos. Según se utiliza en la presente memoria, un "epítopo" es una porción de un antígeno que reacciona con sueros de individuos infectados con Leishmania (esto es, un epítopo es unido específicamente por uno o más anticuerpos presentes en tales sueros). Como se ha comentado más arriba, los epítopos de los antígenos descritos en la presente solicitud pueden ser identificados generalmente utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Se describen en la presente memoria epítopos antigénicos que comprenden una secuencia de aminoácidos proporcionada en los SEQ ID NO: 43, 56, 57 o 58. Como se comenta con mayor detalle más abajo, los epítopos antigénicos proporcionados en la presente memoria se pueden emplear en la diagnosis y el tratamiento de la infección por Leishmania, ya sea solos o combinados con otros antígenos o epítopos antigénicos de Leishmania. Los epítopos antigénicos y los polipéptidos que comprenden tales epítopos se pueden preparar mediante métodos sintéticos, como se describe generalmente más arriba y con detalle en el Ejemplo 15.
En ciertos aspectos de la presente invención, descritos con detalle más abajo, los polipéptidos, epítopos antigénicos y/o antígenos de Leishmania solubles pueden ser incorporados a composiciones farmacéuticas o vacunas. Como aclaración, el término "polipéptido" se utilizará cuando se describan realizaciones específicas de las composiciones terapéuticas y los métodos de diagnóstico de la invención. Sin embargo, estará claro para un experto en la técnica que los epítopos antigénicos de la presente invención también pueden ser empleados en tales composiciones y métodos.
Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales puede contener una
o más de las secuencias anteriores (o variantes de las mismas), y un portador fisiológicamente aceptable. Las vacunas comprenden uno o más de los polipéptidos anteriores y un intensificador de la respuesta inmunitaria no específica, tal como un coadyuvante (p. ej., LbeIF4A, interleuquina-12 u otras citoquinas) o un liposoma (en el cual se incorpora el polipéptido). Las vacunas pueden contener adicionalmente un vehículo de liberación, tal como una microesfera biodegradable (descrita, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.897.268 y 5.075.109). Las composiciones farmacéuticas y las vacunas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros antígenos de Leishmania, ya sea incorporados a un polipéptido combinado ya sea presentes en uno o más polipéptidos separados.
De manera alternativa, una composición farmacéutica o vacuna puede contener ADN que codifica uno o más de los polipéptidos descritos más arriba, de manera que el polipéptido es generado in situ. En tales composiciones farmacéuticas y vacunas, el ADN puede estar presente en cualquiera de una variedad de sistemas de liberación conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, bacterias y sistemas de expresión virales. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para su expresión en el paciente (tal como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de liberación bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido sobre su superficie celular. En una realización preferida, el ADN puede ser introducido utilizando un sistema de expresión viral (p. ej., vaccinia u otro poxvirus, retrovirus, o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus de replicación competente, no patógeno (defectuoso). Los mecanismos para incorporar ADN en tales sistemas de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica. El ADN también puede estar "desnudo", como describen, por ejemplo, Ulmer et al., en Science 259:1745-1749 (1993) y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692 (1993). La absorción de ADN desnudo se puede incrementar revistiendo con el ADN cuentas biodegradables, que son eficazmente transportadas a las células.
Si bien se puede emplear cualquier portador adecuado conocido por los expertos en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de portador variará dependiendo del modo de administración. Para la administración parenteral, tal como la inyección subcutánea, el portador comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (p. ej., galactida poliláctica) también se pueden emplear como portadores para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.897.268 y 5.075.109.
Se puede emplear cualquiera de una variedad de coadyuvantes en las vacunas de esta invención para intensificar de manera no específica la respuesta inmunitaria. La mayor parte de los coadyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger el antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador no específico de respuestas inmunitarias, tal como lípido A, Bordella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los coadyuvantes adecuados se encuentran disponibles en el mercado, por ejemplo, en forma de Coadyuvante Incompleto y Coadyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mn), Coadyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), alúmina, microesferas biodegradables, lípido A monofosforilado y quil A. Los coadyuvantes preferidos incluyen LbeIF4A, IL-12 y otras citoquinas tales como IFN-y o factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). En virtud de su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria Th1 exclusiva, es particularmente preferido el uso de LbeIF4A, y sus variantes, como coadyuvante en las vacunas de la presente invención.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir múltiples polipéptidos seleccionados con el fin de proporcionar una mejor protección contra una variedad de especies de Leishmania. Tales polipéptidos se pueden seleccionar basándose en la especie de origen del antígeno nativo o basándose en un alto grado de conservación de la secuencia de aminoácidos entre diferentes especies de Leishmania. Una combinación de polipéptidos individuales puede ser particularmente eficaz como vacuna profiláctica y/o terapéutica debido a que (1) la estimulación de la proliferación y/o producción de citoquina por polipéptidos individuales puede ser aditiva, (2) la estimulación de la proliferación y/o la producción de citoquina por polipéptidos individuales puede ser sinérgica, (3) los polipéptidos individuales pueden estimular los perfiles de citoquina de tal manera que sean complementarios entre sí y/o (4) los polipéptidos individuales pueden ser complementarios entre sí cuando algunos de ellos son expresados más abundantemente en la especie individual o cepa de Leishmania responsable de la infección. Una combinación preferida contiene polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 y LbeIF4A. De manera alternativa, o además, la combinación puede incluir uno o más polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de otros antígenos de Leishmania descritos en la presente memoria, y/o antígenos de Leishmania solubles.
Las composiciones farmacéuticas y vacunas anteriores se pueden utilizar, por ejemplo, para inducir inmunidad protectora contra Leishmania en un paciente, tal como un ser humano o un perro, para prevenir la leishmaniasis. Las dosis y los métodos de administración apropiados para estos fines se describen con detalle más abajo.
Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en la presente memoria también se pueden utilizar para estimular una respuesta inmunitaria, que puede ser celular y/o humoral, en un paciente. Para los pacientes infectados por Leishmania, las respuestas inmunitarias que se pueden generar incluyen una respuesta inmunitaria Th1 preferente (esto es, una respuesta caracterizada por la producción de las citoquinas interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-12 y/o interferón-y, así como factor de necrosis tumoral-a). Para pacientes no infectados, la respuesta inmunitaria puede ser la producción de interleuquina-12 y/o interleuquina-2, o la estimulación de células T gamma delta. En cualquier categoría de paciente, la respuesta estimulada puede incluir la producción de IL-12. Tales respuestas también se pueden lograr en muestras biológicas de PBMC o sus componentes derivados de individuos infectados por Leishmania o no infectados. Como se ha indicado más arriba, los análisis para cualquiera de las citoquinas anteriores se pueden realizar generalmente utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como el análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA).
Las composiciones farmacéuticas y vacunas adecuadas para su uso en este aspecto de la presente invención son aquellas que contienen al menos un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos citada en el SEQ ID NO. 24. Preferiblemente, los polipéptidos empleados en las composiciones farmacéuticas y vacunas son complementarios, como se ha descrito más arriba. También se pueden emplear antígenos de Leishmania solubles, con o sin polipéptidos adicionales.
Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en la presente memoria también se pueden utilizar para tratar a un paciente aquejado de una enfermedad sensible a la estimulación por IL-12. El paciente puede ser cualquier animal de sangre caliente, tal como un ser humano o un perro. Tales enfermedades incluyen infecciones (que pueden ser, por ejemplo, bacterianas, virales o protozoicas) o enfermedades tales como cáncer. En una realización, la enfermedad es la leismaniasis, y el paciente puede presentar síntomas clínicos o puede ser asintomático. En general, la sensibilidad de una enfermedad concreta a la estimulación por IL-12 se puede determinar evaluando el efecto del tratamiento con una composición farmacéutica o vacuna de la presente invención sobre las secuelas clínicas de la inmunidad. Por ejemplo, si el tratamiento da como resultado una respuesta Th1 agudizada o la conversión de un perfil Th2 en Th1, acompañadas de una mejora clínica en el paciente tratado, la enfermedad es sensible a la estimulación por IL-12. La administración de polipéptidos puede ser como se describe más abajo, o se puede prolongar durante un período de tiempo más largo, dependiendo de la indicación. Preferiblemente, los polipéptidos empleados en las composiciones farmacéuticas y las vacunas son complementarios, como se ha descrito más arriba. Una combinación particularmente preferida contiene polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 y LbeIF4A, Lmsp1a, Lmsp9a, y MAPS-1A. También se pueden emplear antígenos solubles de Leishmania, con o sin polipéptidos adicionales.
Las rutas y la frecuencia de la administración, así como la dosificación, para los aspectos anteriores de la presente invención variarán de individuo a individuo y pueden ser análogos a los utilizados actualmente en la inmunización frente a otras infecciones, incluyendo infecciones protozoicas, virales y bacterianas. En general, las composiciones farmacéuticas y las vacunas se pueden administrar por medio de inyecciones (p. ej., intracutáneas, intramusculares, intravenosas o subcutáneas), intranasalmente (p. ej., mediante aspiración) u oralmente. Se puede administrar entre 1 y 12 dosis a lo largo de un período de 1 año. Para la vacunación terapéutica (esto es, el tratamiento de un individuo afectado), se administran preferiblemente 12 dosis, a intervalos de un mes. Para el uso profiláctico, se administran preferiblemente 3 dosis, a intervalos de 3 meses. En cada caso, se pueden suministrar vacunaciones de refuerzo periódicamente después de eso. Los protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o ADN que, cuando se administra como se ha descrito más arriba, es capaz de originar una respuesta inmunitaria en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente de la leismaniasis durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producido in situ por el ADN de una dosis) oscila de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 mg por kg de anfitrión, típicamente de aproximadamente 10 μg a aproximadamente 100 μg. Los tamaños de las dosis adecuadas variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente oscilarán de aproximadamente 0,1 mL a aproximadamente 5 mL.
Se describen en la presente memoria los métodos para utilizar uno o más de los polipéptidos descritos más arriba para diagnosticar la infección por Leishmania en un paciente utilizando una prueba cutánea. Según se utiliza en la presente memoria, una "prueba cutánea" es cualquier análisis realizado directamente en un paciente en el que se mide la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (tal como endurecimiento y enrojecimiento acompañante) después de la inyección intradérmica de uno o más polipéptidos como se ha descrito más arriba. Dicha inyección se puede llevar a cabo utilizando cualquier dispositivo adecuado suficiente para poner en contacto el polipéptido o los polipéptidos con las células de la dermis del paciente, tal como una jeringa para tuberculina o una jeringa de 1 mL. Preferiblemente, la reacción se mide al menos 48 horas después de la inyección, más preferiblemente 72 horas después de la inyección.
La reacción DTH es una respuesta inmunitaria mediada por células, que es mayor en pacientes que han sido expuestos previamente al antígeno de ensayo (esto es, una porción inmunogénica de un polipéptido empleado, o una de sus variantes). La respuesta se puede medir visualmente, utilizando una regla. En general, el endurecimiento que es mayor de aproximadamente 0,5 cm de diámetro, preferiblemente mayor de aproximadamente 1,0 cm de diámetro, es una respuesta positiva, indicativa de infección por Leishmania, que se puede manifestar o no en forma de una enfermedad activa.
Los polipéptidos de esta invención se formulan preferiblemente, para su uso en una prueba cutánea, en forma de composiciones farmacéuticas que contienen al menos un polipéptido y un portador fisiológicamente aceptable, como se ha descrito más arriba. Tales composiciones contienen típicamente uno o más de los polipéptidos anteriores en una cantidad que oscila de aproximadamente 1 μg a 100 μg, preferiblemente de aproximadamente 10 μg a 50 μg en un volumen de 0,1 mL. Preferiblemente, el portador empleado en tales composiciones farmacéuticas es una solución salina con conservantes apropiados, tales como fenol y/o Tween 80®.
Los polipéptidos de la invención se pueden emplear también combinados con uno o más antígenos de Leishmania conocidos en la diagnosis de la leismaniasis, utilizando, por ejemplo, la prueba cutánea descrita más arriba. Preferiblemente, los polipéptidos individuales se seleccionan de tal manera que sean complementarios entre si. Los ejemplos de los antígenos de Leishmania conocidos que se pueden emplear provechosamente junto con los polipéptidos de la invención incluyen K39 (Bums et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993 90:775-779).
Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación. En la medida en la que los ejemplos se refieren a una materia sujeto que se encuentra fuera de las reivindicaciones, los ejemplos se proporcionan como una pauta general para el experto en la técnica.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
PREPARACIÓN DE M15
Este Ejemplo ilustra la preparación de un antígeno M15 de Leishmania, que tiene la secuencia proporcionada en el SEQ ID NO: 2.
Se escrutó una genoteca de expresión de ADNc de amastigotas de L. major (cepa Friedlan) preparada en el vector }ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando sueros obtenidos de ratones BALB/c infectados con L. major (8 semanas después de la inoculación). Se escrutaron aproximadamente
40.000 placas y se purificaron cuatro clones que expresaban antígenos reactivos hasta la homogeneidad mediante dos rondas consecutivas de escrutinio de baja densidad. Se extirparon insertos de fagémidos Bluescript a partir clones positivos para un análisis adicional. Con posterioridad de utilizó un fragmento de restricción EcoRI/SstII desde el extremo 5' de un inserto de ADNc parcial aislado durante el escrutinio de la primera ronda (pLma1-1) como sonda para volver a escrutar en busca de clones que contenían los insertos de ADNc completos. La sonda se marcó para una actividad muy específica (109 cpm/μg) con [32P]dCTP utilizando el método del cebado al azar y se utilizó para escrutar 10.000 placas de la genoteca de expresión de L. major descrita más arriba. Los clones positivos se compararon mediante digestión con enzimas de restricción y se seleccionó el clon con el inserto más largo (pflI-1) para el siguiente análisis.
Se realizaron análisis de la secuencia de ADN en un secuenciador automático de Applied Biosystems utilizando polimerasa de Taq y terminadores ddNTP acoplados a colorante y cebadores de secuenciación marcados con colorante. La secuencia completa del inserto de 2685 pb se determinó utilizando una combinación de cebadorsecuenciación dirigida y mediante secuenciación de una serie de subclones de deleción con Exonucleasa III solapantes generados utilizando el sistema Erase-abase (Promega, Madison, WI). La secuencia de este inserto se proporciona en el SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos deducida se proporciona en el SEQ ID NO: 2.
El inserto completo del clon pfII-1 fue escindido mediante digestión con BamHI/KpnI y fue subclonado en marco en pQE31 digerido con BamHI/KpnI (QUIAGEN) para generar el constructo pM151A. La E. coli que contenía este constructo expresó induciblemente altos niveles del antígeno de L. major codificado por pfII-1 (denominado M15) con la adición de una etiqueta de 6-histidinas en el extremo amino. Se indujeron cultivos de gran volumen (500 ml) de células anfitrionas de E. coli que contenían el constructo pM151A para que expresaran proteína recombinante mediante la adición de IPTG 2 mM en la fase semi-logarítmica de crecimiento. El crecimiento continuó durante 4 a 5 horas y después se sedimentaron las bacterias y se lavaron una vez con PBS frío. Las bacterias fueron resuspendidas en 20 ml de tampón de lisis (Na2HPO4 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, �-mercaptoetanol 10 mM) que contenía 20 mg de lisozima y se lisaron mediante incubación durante 1 hora a 4°C seguido de breve sonicación. El material insoluble se separó mediante centrifugación a 10.000 xg durante 10 minutos y aunque se encontró que la proteína recombinante estaba uniformemente distribuida entre las fracciones solubles e insolubles, se descartó el material insoluble en este punto. La proteína recombinante que contenía la etiqueta de histidina amino terminal se purificó por afinidad utilizando una resina Ni-NTA (QIAGEN) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En resumen, se añadieron 8 ml de Ni-NTA resuspendida en tampón de lisis a la fracción de producto lisado soluble y se llevó a cabo la unión con un mezclado constante durante 1 hora a 4°C. Después la mezcla se cargó en una columna de flujo por gravedad y se dejó que el material no unido fluyera. La matriz de Ni-NTA se lavó 3 veces con 25 ml de tampón de lavado (Na2HPO4 50 mM, pH 6,0, NaCl 300 mM, �-mercaptoetanol 10 mM) y el material unido se hizo eluir en 25 ml de tampón de elución (Na2HPO4 50 mM, pH 5,0, NaCl 300 mM, �-mercaptoetanol 10mM). El material eluido se sometió a diálisis frente a 3 cambios de PBS, se filtró en condiciones estériles y se almacenó a -20°C. Se demostró mediante análisis SDS-PAGE que la proteína recombinante purificada estaba libre de cualquier cantidad significativa de proteína de E. coli. Se supuso que un pequeño número de bandas de peso molecular inferior eran productos proteolíticos del antígeno de L. major basándose en su reactividad mediante análisis de transferencia western. Se generó un antisuero policlonal de título elevado contra M15 en conejos mediante inyección subcutánea repetida de proteína recombinante. El análisis de transferencia Western de los productos lisados de promastigotas y amastigotas de L. major utilizando este antisuero indicó que la proteína era expresada constitutivamente a lo largo de todo el ciclo vital del parásito.
EJEMPLO 2
PREPARACIÓN DE LDP23
Este Ejemplo ilustra la preparación de un antígeno Ldp23 de Leishmania, que tiene la secuencia proporcionada en el SEQ ID NO: 4.
A. Purificación de Péptidos asociados a la Clase II del MHC de Macrófagos P388D1 Infectados con L. donovani
Para averiguar si la infección in vitro de los macrófagos cargaría sus moléculas de la clase II del MHC con péptidos del parásito, se llevaron a cabo experimentos iniciales para someter a ensayo la capacidad de la línea celular P388D1 de macrófagos infectados con L. donovani para presentar antígenos del parásito a las células T específicas de L. donovani. Esta línea celular de macrófagos se seleccionó porque tiene el mismo haplotipo H-2 que el ratón BALB/c, que es una cepa de ratón moderadamente susceptible a la infección por L. donovani y seleccionada para llevar a cabo los experimentos in vivo. Utilizando una proporción de 3-5 parásitos por célula y una incubación inicial a la temperatura ambiente durante 4-6 horas seguida de 37°C durante 24-48 horas, se infectaron casi el 90% de los macrófagos. El nivel de expresión de la molécula de clase II del MHC, determinado mediante análisis FACS, indicó que la infección no causaba efecto sobre los niveles de expresión de la clase II del MHC cuando se comparaban con las células de control no infectadas.
Para someter a ensayo la capacidad de células P388D1 infectadas con L. donovani para presentar antígenos del parásito, se infectaron los macrófagos como se ha indicado más arriba y se incubaron a 26°C durante 6 horas, y después a 37°C durante 24, 48 ó 72 horas. En cada uno de estos momentos, las células no adherentes y los parásitos libres se lavaron y las células adherentes se soltaron mecánicamente, se lavaron y se fijaron con paraformaldehído. Después se utilizaron estas células como células presentadoras de antígenos (APC) para células T de ganglios linfáticos purificados de ratones BALB/c inmunizados con promastigotas de L. donovani. Para generar estas células T específicas anti-L. donovani, se inmunizaron ratones BALB/c (H-2d) de ambos sexos (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a las 8 - 14 semanas de edad en la almohadilla de la pata trasera con 5-10 x 106 promastigotas de L. donovani emulsionadas en coadyuvante completo de Freünd (CFA) (Difco Laboratories, Madison, MI) como describen Rodrigues et al., en Parasite Immunol. 14:49 (1992). Los ganglios linfáticos drenados se extirparon 8 días después de la inmunización y las células T se purificaron en una columna anti-Ig de ratón para separar las células B, como describen Bunn-Moreno y Campos-Neto, en J. Immunol. 127:427 (1981), seguido de un pase a través de una columna Sephadex G10 para separar los macrófagos.
Se calculó el índice de estimulación dividiendo las cpm obtenidas para las células cultivadas en presencia de macrófagos P388D1 infectados por las cpm obtenidas de las células cultivadas en presencia de macrófagos no infectados, pero sometidas a las mismas condiciones que los macrófagos infectados. Los resultados mostrados en la Figura 1 indican que los macrófagos P388D1 infectados con L. donovani procesan los antígenos del parásito y que la presentación óptima se produce después de las 48 horas de infección. No se observó estimulación de las células T por los macrófagos no infectados.
Para aislar la Case II del MHC asociada con los péptidos de L. donovani, se infectaron los macrófagos P388D1 con promastigotas de L. donovani para una incubación inicial de 6 horas a la temperatura ambiente. Los cultivos se transfirieron después a 37°C durante el resto del período de incubación de 48 horas. A una razón de 3-5 parásitos por macrófago cerca del 90% de los macrófagos se infectaron después de 24 horas de incubación a 37°C.
Las moléculas de la clase II del MHC fueron purificadas después por afinidad. Se utilizaron aproximadamente 1,5 x 1010 macrófagos P388D1 infectados con L. donovani o un número igual de no infectados para cada purificación. Las células se cosecharon, se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos en tampón de lisis frío (PBS, Nonidet P40 al 1%, yodoacetamida 25 mM, azida de sodio al 0,04%, aprotinina 1 mM y PMSF 1 mM). El material insoluble se separó mediante centrifugación a 40.000 g durante 1 hora y el sobrenadante se recicló durante la noche a 4°C sobre una columna Sepharose anti-moléculas de clase II del MHC (H-2d) de 5 ml (columna de Proteína G Sepharose a la cual se había unido el anticuerpo monoclonal MK-D6). Los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma MK-D6 (Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD) se emplearon como fuente para el anticuerpo monoclonal anti-clase II del MHC (H-2d). La columna se lavó con 50 ml de tampón de lisis y después con 50 ml de PBS que contenía detergente de octil-glucopiranósido al 0,5%. Las moléculas unidas se hicieron eluir de la columna con ácido acético 1 M en NaCl al 0,2%. Las molécula de MHC/péptido se separaron de la IgG (anticuerpo monoclonal MK-D6) utilizando una unidad de filtro Centricon 100 (Amicon Division, W.R. Grace & Co., Beverly, MA). Los péptidos se disociaron después de las moléculas de clase II mediante la adición de ácido acético 2,5 M, seguido de separación utilizando una unidad de filtro Centricon 10. La preparación de péptido resultante, presente en la muestra de bajo peso molecular, se secó después utilizando un concentrador Speed Vac (Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY).
Los péptidos se redisolvieron en 200 μl de TFA al 0,05% y se separaron mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) utilizando una columna C-18 Vydac de 2,1 mm x 25 cm a una velocidad de flujo de 0,15 ml/min empleando un gradiente de acetonitrilo de 1 a 30% (60 min) seguido de un gradiente 30 a 60% (30 min) y después un gradiente 60 a 80% (90-110 min). Las células P388D1 no infectadas fueron procesadas de un modo similar para que sirvieran como control de fondo para los péptidos asociados con la clase II del MHC endógena. La Figura 2 muestra un experimento representativo; se indican cuatro picos distintos que están presentes solamente en el material aislado de macrófagos infectados (panel B), y no en el material aislado de macrófagos no infectados (panel A).
De las tres extracciones de péptidos independientes, se aislaron veinticinco picos de péptidos por HPLC distintos de los macrófagos infectados con L. donovani y se sometieron a análisis de la secuencia de proteínas utilizando la degradación de Edman automática en un secuenciador de proteínas en fase gaseosa Applied Biosystems 477. El análisis de la secuencia de proteína y de aminoácidos fue realizado por W. M. Keck Foundation, Biotechnology Resource Laboratory, Yale University, New Haven, CT. Prácticamente en ninguna de las determinaciones, se pudo realizar la asignación para la primera posición. Asimismo, en la mayoría de los casos la definición de los residuos de aminoácidos de las 10-15 posiciones se basó en la dominancia cuantitativa de un residuo sobre los otros. Utilizando este enfoque, las secuencias obtenidas para diversos péptidos mostraron la presencia de 3-6 residuos diferentes en muchos de los 10-15 ciclos de secuencia analizados para cada determinación, reflejando una mezcla de péptidos. Además, no se pudieron obtener secuencias para algunos picos debido a que los péptidos fueron bloqueados. No obstante, se determinaron tres secuencias de péptidos. Se investigaron las secuencias de aminoácidos en busca de la identidad con proteínas de la base de datos GenBank utilizando los programas GENPETP, PIR y SWISSPROT. El análisis de la base de datos de secuencias reveló que uno de los péptidos era muy homólogo a la gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa de varias especies. Otro péptido tenía homología con el factor de elongación de varias especies, incluyendo Leishmania. La tercera secuencia no estaba claramente relacionada con ninguna de las proteínas conocidas, y se muestra más abajo:
XQXPQ(L/K)VFDEXX (SEQ ID NO:11).
B. Clonación y Secuenciación del Gen Ldp23
Con el fin de recuperar la proteína de L. donovani que había sido procesada en un péptido asociado con las moléculas de clase II del MHC de macrófagos infectados, se seleccionó la secuencia peptídica de origen incierto para guiar la estrategia para clonar el correspondiente gen del parásito. Inicialmente se amplificó un fragmento de ADN a partir de ADNc de promastigota de L. donovani por medio de PCR. El cebador efector fue un oligonucleótido derivado del péptido (5' >GGAATTCCCCInCAGCTInGTInTTCGAC < 3') (SEQ ID NO: 12) que contenía un sitio para una endonucleasa de restricción EcoRI (subrayado). Las bases se seleccionaron siguiendo el uso preferente de codones de L. donovani, como describen Langford et al., en Exp. Parasitol. 74:360 (1992). Se utilizó inosina para los residuos de las posiciones 4, 6 y 7 debido a la baja garantía del uso de codones para los correspondientes aminoácidos. Además, el ácido L-glutámico carboxi terminal no fue incluido para el diseño del cebador. El cebador antisentido fue un oligonucleótido de poli-timidina (oligo dT, cebador aguas abajo) que contenía un sitio para la endonucleasa de restricción XhoI.
El fragmento génico fue amplificado a partir de una preparación de ADNc de promastigota de L. donovani utilizando las siguientes condiciones de reacción: un ciclo de 3 min a 94°C seguido inmediatamente de 35 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 45°C y 1 min a 72°C. El ADNc de L. donovani se preparó a partir de 5 x 107 formas promastigotas lavadas recogidas en la fase de crecimiento log (3 días de cultivo). El ADNc se obtuvo utilizando un kit Invitrogen cDNA Cycle® (Invitrogen Co., San Diego, CA). Los cebadores oligonucleotídicos fueron sintetizados por el Laboratorio de Síntesis de ADN, Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Yale.
Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel. Solamente se obtuvo una banda de aproximadamente 300 pb. Este fragmento se clonó y su secuencia confirmó la secuencia del cebador basado en el péptido incluyendo el codón de ácido glutámico, deliberadamente no incluido en la secuencia del cebador.
El fragmento del gen amplificado por PCR se ligó en el vector pCR® utilizando el sistema de clonación de TA (Invitrogen Co., San Diego, CA). Los transformantes se seleccionaron en medio LB que contenía 100 μg/ml de ampicilina y se aisló el ADN plasmídico utilizando el kit de purificación de ADN Wizard® Minipreps (Promega Co., Madison, WI). El ADN del inserto fue liberado con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI (New England Biolabs, Beverly, MA), purificado de una electroforesis en gel de agarosa y marcado con P32 utilizando un método de cebado al azar (Megaprime Labeling Kit, Amersham Life Science, Buckinghamshire, Inglaterra).
Este fragmento de ADN se utilizó como sonda para escrutar una genoteca de ADNc de promastigota de L. donovani como describen Skeiky et al., en Infect. Immun. 62:1643 (1994). Se escindió un ADNc de aproximadamente 650 pb (Ldp23) del fagémido mediante escisión in vivo utilizando el protocolo de Stratagene. Se realizó la secuenciación del ADN utilizando el sistema Sequenase versión 2 (kit de secuenciación de ADN) en presencia o ausencia de 7desaza-GTP (United States Biochemical, Cleveland, OH). La secuencia se proporciona como el SEQ ID NO: 3, y muestra la completa homología con el fragmento de PCR de 300 pb original. Se identificó un marco de lectura abierto de 525 pb que contenía un codón ATG que sigue a las últimas 4 bases de la secuencia líder empalmada y 3 codones de terminación adyacentes a la cola de poli A. Este marco también codifica la secuencia carboxi terminal (KVFDE) (SEQ ID NO: 13) del péptido asociado a la clase II del MHC purificado. El análisis de la secuencia de la secuencia de proteínas deducida reveló un sitio de glicosilación potencial (Asn-Cys-Ser) en las posiciones 68-70.
Se realizó un análisis de la secuencia utilizando los Programas de University of Wisconsin Genetics Computer Group y las bases de datos GenBank y EMBL de secuencias de proteínas y ADN. La búsqueda de homología del gen Ldp23 con secuencias conocidas no reveló ninguna homología significativa.
C. Expresión Bacteriana y Purificación de la Proteína Recombinante
La proteína donadora del péptido de L. donovani recombinante se produjo en E. coli transformada con el vector de expresión pGEX 2T en el que se había subclonado en marco el gen Ldp23. Se utilizó la PCR para subclonar el gen clonado en marco en el vector de expresión pGEX 2T. Los cebadores que contenían las enzimas de los sitios de restricción apropiados, los codones de inicio y terminación fueron: 5' >GGATCCATGGTCAAGTCCCACTACATCTGC <3' (SEQ ID NO: 14) para el cebador aguas arriba y 5' >GAATTCAGACCGGATAGAAATAAGCCAATGAAA <3' (SEQ ID NO: 15) para el cebador aguas abajo (los sitios de restricción de BamHI y EcoRI están subrayados respectivamente). Las condiciones de la PCR fueron las indicadas más arriba para la amplificación del fragmento de ADN relacionado con el péptido original. El molde utilizado fue el plásmido pBluescript que contenía el gen clonado de la genoteca de ADNc.
La expresión en exceso de la proteína de fusión recombinante se completó desarrollando la E. coli (DH5a) transformada e induciendo el promotor tac con isopropil-�-tiogalactopiranosido (IPTG) 1 mM (Stratagene, La Jolla, CA). Se recogieron las células, se centrifugaron, y se analizaron para determinar la presencia de la proteína de fusión por medio de SDS-PAGE. Se produjo una proteína de fusión con glutation-S-transferasa de 43-44 kD, indicando una proteína de Leishmania de aproximadamente 18 kD, ya que la glutation-S-transferasa (GST) tiene un PM de 26 kD. Sin embargo, la proteína de fusión fue muy insoluble y por lo tanto no pudo ser purificada mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de glutatión. El uso de bajas concentraciones de detergentes como SDS, sarcosilo, desoxicolato, y octilglucopiranosido durante las etapas de extracción fue eficaz para solubilizar la proteína pero desafortunadamente evitó su unión a la columna de glutatión. Otras maniobras, tales como el desarrollo de E. coli y la incubación e inducción del promotor tac con IPTG a 33°C, no mejoraron la solubilidad de la proteína. Sin embargo, se logró la purificación mediante SDS-PAGE preparativa. La banda se visualizó con KCl 0,1 M, se cortó y se sometió a electroelución a partir del gel seguido de diálisis exhaustiva frente a PBS y concentración sobre filtros Centricon 10.
Se obtuvieron aproximadamente 500 μg de proteína purificada. La proteína purificada se muestra en la Figura 3. En el panel A, se hizo crecer la E. coli (DH5a) transformada con el vector de expresión pGEX 2T que contenía el gen Ldp23 en medio LB y se indujo el promotor tac con IPTG durante 3 horas. Las células se sedimentaron, se resuspendieron en tampón de carga y se sometieron a SDS-PAGE (10%) en condiciones reductoras. El gel se tiñó con azul de Coomassie. La calle 1 muestra la E. coli no inducida y la calle 2 muestra la E. coli inducida. La flecha indica la proteína recombinante. El panel B muestra la proteína preparada como en el panel A y sometida a SDS-PAGE preparativa. La banda correspondiente a la proteína de fusión recombinante expresada en exceso se identificó mediante KCl, corte, electroelución de la tira de gel, se sometió a diálisis frente a PBS y se sometió a SDS-PAGE analítica (12%). Los números del lado izquierdo indican los pesos moleculares de los marcadores. Los intentos para purificar la proteína de Leishmania escindiéndola de la proteína de fusión con GST con trombina fueron infructuosos.
D. Expresión de Ldp23
Para averiguar si el péptido Ldp23 es expresado en organismos de Leishmania, se realizó una transferencia Northern utilizando un ARN preparado a partir de diferentes fases de crecimiento de promastigotas (logarítmico y estacionario) y de la forma amastigota de estos parásitos.
El ARN se preparó a partir de 2 x 107 células de parásito utilizando el kit de aislamiento de ARN Micro (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones recomendadas por la compañía. El ARN se preparó a partir de promastigotas de L. donovani (fase de crecimiento logarítmica); a partir de promastigotas de L. major (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria); a partir de L. amazonensis, tanto promastigotas (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria) como amastigotas purificadas de ratones infectados CBA/J; y a partir de L. pifanoi, tanto promastigotas (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria) como amastigotas (de medio de cultivo axénico). Las promastigotas de L. donovani (cepa 1S), L. amazonensis (MHOMBR/77/LTB0016), L. major (MHOM/IR/79/LRC-L251) y L. pifanoi (MHOM/VE/60/Ltrod) se hicieron crecer y se mantuvieron a 26°C en medio de Schneider que contenía FCS al 20% y 50 μg/ml de gentamicina. Las formas amastigotas de L. amazonensis se obtuvieron mediante centrifugación diferencial de una lesión de la almohadilla de &quot;tipo pus&quot; de un ratón CBA/J infectado durante 6 meses con este parásito. Se obtuvieron amastigotas de L. pifanoi de cultivo axénico como han informado previamente Pan et al., en J. Euk. Microbiol. 40:213 (1993).
La hibridación se llevó a cabo a 45°C en presencia de formamida al 50%, 5x solución de Denhardt, SDS al 0,1%, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón de hebra sencilla y 5x SSPE utilizando filtros de membrana de 0,45 μm Nytran (Schleicher &amp; Schuell, Keene, NH). La sonda fue el gen Ldp23 marcado con P32.
La Figura 4 demuestra que se observaba una única banda de ARN de 680 pb para todas las fases de crecimiento y formas de todas las Leishmania sometidas a ensayo. En la Figura 4, los números 1, 2 y 3 hacen referencia al ARN obtenido de promastigotas en la fase de crecimiento logarítmico, promastigotas en la fase de crecimiento estacionario y formas amastigotas, respectivamente, y los números del lado izquierdo indican los pesos moleculares de los marcadores en pares de bases. Este resultado coincide con el tamaño del gen correspondiente (525 pb) y con el peso molecular de la proteína expresada y los puntos de distribución ubicua y de expresión de este gen dentro del género Leishmania.
E. Inducción de una Respuesta de Anticuerpos Anti-L. donovani en Ratones y Conejos por Proteína Recombinante Purificada
Con el fin de evaluar la inmunogenicidad de la proteína de Leishmania recombinante, y para investigar su expresión en los parásitos, se inmunizaron ratones y conejos con la proteína de fusión con GST en CFA. Se inmunizaron ratones BALB/c en la almohadilla de la pata trasera con 5-10 μg de proteína emulsionada en CFA. Se determinó la concentración de proteína utilizando el reactivo Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Los ratones se reforzaron 7 días más tarde con 5-10 μg de proteína emulsionada en coadyuvante incompleto de Freünd (IFA) inoculados en la cavidad peritoneal. Los ratones se desangraron 7 días después de la segunda inmunización. Se inmunizaron conejos blancos New Zealand (Millbrook Farm, Aniherst, MA) de acuerdo con el siguiente protocolo: una inyección intramuscular (IM) de 25-30 μg de proteína recombinante purificada emulsionada en CFA en cada muslo el día uno; una inyección IM de 25-30 μg de proteína purificada emulsionada en IFA en cada hombro el día 7; el día 15, se inyectaron en el tejido subcutáneo 25-30 μg de la proteína purificada en PBS. El conejo se desangró 7 días después de la última inmunización.
Se prepararon sueros y se midió la respuesta de anticuerpos anti-Leishmania mediante análisis de transferencia Western y mediante FACScan. En ambos casos se utilizaron promastigotas de L. donovani como antígeno. Se hicieron crecer aproximadamente 2 x 106 promastigotas de L. donovani en medio de Schneider durante 3 días (fase log), se lavaron con PBS, se lisaron con tampón de carga para SDS-PAGE y se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras utilizando un gel de poliacrilamida al 15%. Las proteínas se transfirieron sobre la membrana de transferencia Immobilon-P de 0,45 μ (Millipore Co., Bedford, MA) utilizando un aparato de electrotransferencia de tipo húmedo (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, Bio Rad Life Science Division, Richmond, CA) durante 2 horas a 50 V. Las membranas se bloquearon durante la noche a la temperatura ambiente con PBS que contenía suero de cabra normal al 3% (NGS), Tween-20 al 0,2% y azida de sodio al 0,05%, seguido de 3 lavados con PBS. Las transferencias se incubaron después durante 3-4 horas a 4°C con una dilución 1/200 de suero de conejo preinmune (calle A, Figura 5) o con la misma dilución de antisuero de conejo anti-proteína de fusión (calle B, Figura 5). Los sueros fueron absorbidos previamente 2x con Mycobacterium tuberculosis H-37 RA desecado no viable (Difco Laboratories, Detroit, MI) y fueron diluidos en PBS que contenía NGS al 1% y leche bovina desnatada en polvo al 5% (Carnation, Nestlé Food Company, Glendale, CA). Las membranas se lavaron después con PBS, se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente con anticuerpo anti-IgG de conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Promega, Madison, WI), se lavaron una vez con PBS y 2x tampón Veronal pH 9,4. La reacción se visualizó utilizando la mezcla sustrato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato y nitroazul de tetrazolio (Kirkegaard &amp; Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La Figura 5 demuestra que el antisuero anti-proteína recombinante de conejo detecta una única proteína de 23 kDa (Ldp23) en la preparación de antígeno de extracto bruto de Leishmania. No se observaron bandas cuando se utilizó un antisuero anti-GST (no mostrado). Por otra parte, el análisis FACScan (Figura 6) demuestra que el anticuerpo inducido por el Ldp23 recombinante reacciona con promastigotas de L. donovani vivas intactas, indicando de este modo una expresión en la superficie celular de esta molécula sobre estos organismos. La línea discontinua de la Figura 6 muestra la inmunofluorescencia indirecta producida utilizando suero de ratón pre-inmune y la línea continua de la Figura 6 muestra el resultado obtenido con antisuero anti-GST-Ldp23 de ratón. Ambos sueros fueron diluidos 1/100. Los parásitos se lavaron con tampón de tinción y se incubaron con anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón de cabra conjugado con FITC. La intensidad de fluorescencia se analizó mediante FACScan.
F. Reconocimiento de Ldp23 Recombinante por Células T de Ganglio Linfático Específicas de Leishmania
Para someter a ensayo la sensibilidad de las células T a la proteína Ldp23, se realizaron dos grupos de experimentos. En el primer experimento, se estimularon células T de ganglios linfáticos (105/pocillo) de ratones BALB/c inmunizados con promastigotas de L. donovani (como se ha descrito más arriba) para que proliferaran con 2 x 105 células de bazo mononucleares normales tratadas con Mitomicina C (APC) y se pulsaron con la proteína de fusión recombinante purificada. Se midió la proliferación de las células T a las 72 horas de cultivo. Los valores se expresan en la Figura 7 en forma de cpm y representan la media de la incorporación de [3H]TdR de cultivos por triplicado. Las cpm de las células del fondo (células T + APC) cultivadas en presencia de medio solo fueron 1291. La Figura 7 demuestra que las células T específicas de Leishmania proliferan bien y de una manera dependiente de la dosis para Ldp23 recombinante. No se observó respuesta cuando se añadió GST purificada en lugar de la proteína de fusión recombinante ni cuando se estimuló la proliferación de las células T de ganglio linfático de ratones inmunizados con CFA sola en presencia de la proteína de fusión de Leishmania (no mostrado).
El reconocimiento de la proteína Ldp23 recombinante por células T específicas para Leishmania también se sometió a ensayo utilizando dos modelos murinos de leismaniasis, los ratones BALB/c altamente susceptibles a L. major y los ratones CBA/J susceptibles a L. amazonensis como describen Champsi y McMahon-Pratt, en Infect. Immun. 56:3272 (1988). Estos modelos fueron seleccionados para investigar el patrón de citoquinas inducido por Ldp23. En el modelo de leismaniasis en ratón, la resistencia está asociada con las citoquinas Th 1 mientras la susceptibilidad está ligada a las respuestas Th 2.
Se obtuvieron células de ganglio linfático 3 semanas después del inicio de la infección de ratones BALB/c con L. major y se midió la capacidad de estas células para reconocer la Ldp23 recombinante por la proliferación y por la producción de las citoquinas IFN-y e IL-4. Se cultivaron 2 x 106 células del ganglio linfático poplíteo drenado de ratones infectados durante 72 horas en presencia de Ldp23 recombinante o producto lisado de Leishmania. Se midieron los niveles de IFN-y e IL-4 en los sobrenadantes de cultivo por medio de ELISA como se ha descrito previamente (Chatelain et al., J Immunol. 148:1172 (1992), Curry et al., J. Immunol. Meth. 104:137 (1987), y Mossman y Fong, J. Immunol. Meth. 116:151 (1989)) usando anticuerpos monoclonales anti IFN-y e IL-4 específicos (PharMingen, San Diego, CA).
Ldp23 estimuló la proliferación de estas células (no mostrado) e indujo un tipo de respuesta de citoquina Th 1 típico como indicó la producción de elevados niveles de IFN-y (panel A de la Figura 8) y no de IL-4 (panel B de la Figura 8). La estimulación de estas células con un producto lisado bruto de Leishmania produjo un perfil de citoquinas Th mixto. Se obtuvo exactamente el mismo patrón de producción de citoquina de los ratones CBA/J infectados con L. amazonensis (no mostrado). Estos resultados indican claramente que Ldp23 es un activador potente y selectivo de las citoquinas Th 1 por células de ratón.
EJEMPLO 3
PREPARACIÓN DE HSP83
Este Ejemplo ilustra la preparación de un antígeno de Leishmania Hsp83, que tiene la secuencia proporcionada en el SEQ ID NO: 6.
Se construyó una genoteca de expresión genómica con ADN sometido a cizalla de L. braziliensis (MBOM/BR/75/M2903) en el bacteriófago }ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). La genoteca de expresión se escrutó con suero preadsorbido con Escherichia coli de un individuo con ML infectado por L. braziliensis. Se purificaron las placas inmunorreactivas, y el fagémido pBSK(-) se escindió por medio de los protocolos sugeridos por el fabricante. Se realizaron deleciones anidadas con exonucleasa III para generar deleciones solapantes para preparaciones de molde de hebra sencilla y secuenciación. Se aislaron moldes de hebra sencilla después de la infección con el fago coadyuvante VCSM13 como recomienda el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenciaron mediante el método de terminación de la cadena didesoxi o mediante el sistema Taq Dye Terminator utilizando el secuenciador automático de Applied Biosystems modelo 373A.
Los antígenos recombinantes producidos por estos clones fueron purificados a partir de 500 ml de cultivos inducidos por isopropil--D-tiogalactopiranósido (IPTG) como describen Skeiky et al., en J. Exp. Med. 176:201-211 (1992). Después estos antígenos fueron analizados para determinar su capacidad para estimular en PBMC de individuos infectados con Leishmania la proliferación y secreción de citoquinas. Se obtuvo sangre periférica de individuos que vivían en una zona (Corte de Pedra, Bahia, Brasil) donde es endémica L. braziliensis y donde se han realizado estudios epidemiológicos, clínicos, e inmunológicos durante más de una década, y se aislaron PBMC de sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad a través de Ficoll (Winthrop Laboratories, Nueva York, N.Y.). Para los análisis de proliferación in vitro, se cultivaron de 2 X 105 a 4 X 105 células por pocillo en medio completo (RPMI 1640 con un suplemento de gentamicina, 2-mercaptoetanol, L-glutamina, y suero humano A+ seleccionado combinado al 10%; Trimar, Hollywood, Calif.) en placas de fondo redondo de 96 pocillos con o sin 10 μg de los antígenos indicados por ml o 5 μg de ficohemaglutinina por ml (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Mo.) durante 5 días. Después las células se pulsaron con 1 μCi de [3H]timidina durante las 18 horas finales del cultivo. Para la determinación de la producción de citoquina se cultivaron de 0,5 a 1 ml de PBMC de 1 X 106 a 2 X 106 células por ml con o sin los antígenos de Leishmania durante 48 y 72 h.
Los sobrenadantes y las células se cosecharon y se analizaron para determinar la citoquina o los ARNm de citoquina secretados. Se sometieron a análisis alícuotas de los sobrenadantes en busca de interferón-gamma (IFNy), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleuquina-4 (IL-4), e IL-10 como describen Skeiky et al., en J. Exp. Med. 181:1527-1537 (1995). Para el análisis por PCR del ARNm de citoquina, se aisló el ARN total de las PBMC y se sintetizó ADNc utilizando poli(dT) (Pharmacia, Piscataway, NJ) y transcriptasa inversa de virus de la micoblastosis aviar. Después de la normalización con respecto a �-actina, se amplificó el ADNc diluido mediante PCR utilizando polimerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) con concentraciones 0,2 μM de los respectivos cebadores externos 5' y 3' en un volumen de reacción de 50 μl. Las secuencias de nucleótidos de los pares primarios y las condiciones de PCR utilizadas fueron las descritas por Skeiky et al., en J. Exp. Med. 181:1527-1537 (1995). Los autores de la presente invención verificaron que sus condiciones de PCR estaban dentro del intervalo semicuantitativo realizando inicialmente diluciones seriadas de los ADNc y variando el número de ciclos utilizados para la PCR. Los plásmidos que contenían las secuencias humanas para IL-2, IFN-y, IL-4, IL-10, y �-actina fueron digeridos, y los insertos de ADN fueron purificados después de la separación sobre geles de agarosa al 1%. Se prepararon sondas radiomarcadas con P32 mediante el método de cebado al azar. Se analizaron los productos de la PCR mediante electroforesis sobre geles de agarosa al 1,5%, se transfirieron a membranas de nailon, y se sondearon con el inserto de ADN marcado con P32 apropiado.
Se identificó un clon recombinante en el análisis anterior que, después de la comparación de secuencias de su secuencia de aminoácidos pronosticada con las secuencias de otras proteínas, fue identificado como un homólogo de la proteína de choque térmico de 83 kD eucariótica de Leishmania braziliensis (Lbhsp83). La secuencia del clon se proporciona en el SEQ ID NO: 5 y la secuencia de la proteína deducida se proporciona en el SEQ ID NO: 6. Basándose en la homología, este clon, denominado Lbhsp83a, parece carecer de los primeros 47 residuos de los 703 residuos de aminoácido completos. Lbhsp83 tiene una homología global del 94% (identidad del 91% y 3% de sustituciones conservativas), 91% (identidad del 84% y 7% de sustituciones conservativas) y 77% (identidad del 61% y 16% de sustituciones conservativas) con hsp83 de L. amazonensis, hsp83 de T. cruzi y hsp89 humano, respectivamente. También se aisló un segundo clon (denominado Lbhsp83b), que contenía la porción C-terminal de 43 kD de hsp83 (residuos 331 a 703). La Figura 19 presenta una comparación de la secuencia de Lbhsp83 con hsp83 de L. amazonensis (Lahsp83), hsp83 de T. cruzi (Tchsp83) y hsp89 humano (Huhsp89).
Los resultados de los análisis de proliferación utilizando Lbhsp83a se muestran en la Tabla 1. Las células de todos los pacientes con leismaniasis de la mucosa (ML) proliferaron fuertemente en respuesta a Lbhsp83a, con índices de estimulación (IE) que oscilaban entre 19 y 558 (en comparación con 20 a 1.634 para el producto lisado de parásito). La proliferación de PBMC a partir de pacientes con leismaniasis cutánea (CL) fue variable y excepto para los niveles de dos pacientes (IV y VII), los niveles fueron significativamente inferiores a los de los pacientes con ML. Como comparación, las respuestas proliferativas de los individuos con CL autocurable a Lbhsp83a fueron similares a las de los individuos con ML. Sin embargo, las respuestas de los seis individuos autocurables a Lbhsp83 fueron sistemáticamente superiores a las respuestas a Lbhsp83b. Esto sugiere que las PBMC de pacientes con CL autocurable reconocen preferentemente uno o más epítopos de las células T localizados dentro de la porción amino de Lbhsp83.
Tabla 1
Proliferación In vitro de PMBC de Individuos Infectados con L. braziliensis en Respuesta a Lbhsp83
Grupo y Paciente
Incorporación de [3H]timidina media [103 cpm (DT)], IE con:
Producto lisado
Lbhsp83a Lbhsp83b
ML
I
41,3, (1,3), 294 32,5, (6,6), 221 46,7, (1,4), 318
II
44,2, (0,5), 104 20, (3,7), 47 36,7, (0,76), 86
III
27,4, (1,5), 150 8,1, (1,7), 44 9,9, (0,32), 54
IV
52,7, (3,3), 138 54,1, (6,2), 142 32,0, (1,3), 84
V
140,6, (7,6), 308 151,8, (57), 333 150,4, (7,9), 331
VI
15,8, (1,8), 20 21,3, (4,4), 28 14,4, (1,3), 19
VII
300,1, (9,4), 1634 102,1, (7,6), 558 41,7, (4,9), 228
CL
I
0,26, (0,0), 1,5 0,57, (0,3), 3,3 0,43, (0,17), 3,3
II
55,63, (8,6), 218 0,42, (0,0), 1,6 0,8, (0,14), 3,2
III
0,39, (0,5), 4,0 3,4, (0,5), 9 2,6, (0,9), 6,6
IV
19,14, (1,3), 87 7,17, (0,6), 32 5,9, (0,9), 27
V
0,32, (0,2), 3,0 1,47, (0,5), 14 0,3, (0,1), 3,0
VI
0,77, (0,1), 4,7 1,44, (0,2), 9 1,3, (0,6), 8,0
VII
4,01, (1,0), 2,0 60,3, (8,5), 15 66,7, (3,9), 16,6
CL autocurable
I
19,7, (4,4), 94 61,3, (4,6), 293 5,0, (2,0), 24
II
0,6, (0,1), 6,5 7,0, (2,0), 79 1,2, (0,8), 13
III
59,6, (7,1), 519 49,4, (3,1), 429 21,4, (3,7), 186
IV
0,2, (0,1), 1,6 13,1, (1,7), 108 0,6, (0,1), 5
V
27,1, (2,0), 225 6,3, (2,6), 52 3,0, (1,5), 25
VI
130,3, (14), 340 28,2, (2,9), 74 7,7, (3,8), 20
Proliferación In vitro de PMBC de Individuos Infectados con L. braziliensis en Respuesta a Lbhsp83
Grupo y Paciente
Incorporación de [3H]timidina media [103 cpm (SD)], SI con:
Producto lisado
Lbhsp83a Lbhsp83b
Control (no infectado)
I
0,19, (0,0), 1,4 0,18, (0,0), 1,3 0,40, (0,16), 2,8
II
0,31, (0,1), 1,7 0,19, (0,0), 1,0 0,27, (0,0), 1,5
III
0,44, (0,2), 4,1 0,48, (0,1), 5,0 0,51, (0,2), 5,2
IV
0,4, (0,1), 3,2 0,52, (0,2), 5,1 0,50, (0,1), 5,0
5 Se realizó un análisis más detallado de los patrones de citoquinas de las PBMC de pacientes con ML mediante PCR con transcriptasa inversa. Se evaluaron los ARNm de citoquinas en las células antes del cultivo (Figura 9, calles O) o después del cultivo en ausencia (calles -) o presencia del antígeno indicado durante 48 y 72 h. La Figura 4A muestra los resultados de cinco de los seis pacientes con ML cuyas PBMC fueron analizadas. En aproximadamente la mitad de los pacientes con ML, las PBMC no cultivadas (en reposo) tuvieron niveles detectables de ARNm para IFN-y, IL
10 2, e IL-4 pero no para IL-10. Las PBMC de los pacientes con CL, no obstante, tuvieron ARNm para IL-10 en el estado de reposo además de los ARNm para las otras citoquinas sometidas a ensayo (Figura 4B). Después del cultivo in vitro sin antígeno, los niveles de ARNm para IFN-y, IL-2, e IL-4 en las células en reposo de pacientes con ML disminuyeron a los niveles de fondo mientras los niveles de ARNm de IL-10 aumentaron. Por el contrario, las PBMC de la mayor parte de los pacientes con CL tuvieron ARNm para IL-10 estable o incrementado, mientras los ARNm para IL-2, IFN-y, e IL-4 fueron reducidos a niveles apenas detectables en ausencia de estimulación de antígeno.
En las PBMC de tres pacientes con ML, la estimulación con el producto lisado dio como resultado un incremento de la expresión del ARNm para IFN-y, IL-2, e IL-4 pero no para IL-10. En comparación, ambos polipéptidos Lbhsp83 lograron la producción de ARNm para IFN-y e IL-2 a partir de las PBMC de todos los pacientes con ML sometidas a ensayo. Por el contrario, los perfiles de ARNm para IL-10 e IL-4 difirieron para los dos polipéptidos hsp83. Lbhsp83a estimuló la producción de ARNm de IL-10 pero no de IL-4 (pacientes I, II, III, y IV), mientras Lbhsp83b estimuló la producción de ARNm de IL-4 pero no de IL-10 en los seis pacientes.
Todos los pacientes con CL sometidos a ensayo respondieron a ambos polipéptidos Lbhsp83 así como al producto lisado de parásito regulando al alza la síntesis de los ARNm para IL-2 e IFN-y, y en dos de cuatro pacientes (I y IV), el nivel de ARNm para IL-4 también se incrementó, indicando la estimulación de ambas citoquinas Th1 y Th2. Curiosamente y como en el caso de PBMC no cultivadas de pacientes con ML que no tenían niveles detectables de ARNm de IL-10, Lbhsp83a y no Lbhsp83b estimularon la síntesis de ARNm de IL-10 en las PBMC de un paciente con CL (IV). No obstante, en los otros tres pacientes (I, II, y III) con niveles en reposo de ARNm de IL-10, ambos polipéptidos rLbhsp83 así como el producto lisado de parásito regularon a la baja la expresión del ARNm de IL-10.
También se analizaron los sobrenadantes de PBMC para determinar la presencia de IFN-y, TNF-a, IL-4, e IL-10 secretados. Las células de todos los pacientes con ML y CL autocurable (siete y seis pacientes, respectivamente) y de cuatro de siete pacientes con CL se analizaron para determinar el IFN-y secretado después de la estimulación con ambos polipéptidos rLbhsp83, producto lisado de parásito y Lbhsp70, una proteína homóloga de L. braziliensis a la proteína de choque térmico de 70 kD eucariótica (Figura 10A). En general, rLbhsp83a estimuló la secreción de niveles superiores de IFN-y en las PBMC del paciente que rLbhsp83b (0,2 a 36 y 0,13 a 28 ng/ml, respectivamente). La presencia de IFN-y secretado se correspondía con el correspondiente ARNm detectado por la PCR.
Las PBMC de cuatro de los cinco pacientes con ML (I, II, V, y VII) tuvieron niveles de TNF-a en el sobrenadante superiores (0,8 a 2,2 ng/ml) a los detectados en los cultivos de PBMC de controles no infectados después de la estimulación con producto lisado de parásito (Figura 10B). De un modo similar, las mismas PBMC fueron estimuladas por rLbhsp83 para producir niveles de TNF-a en el sobrenadante que oscilaban de 0,61 a 2,9 ng/ml. En comparación con los de los controles no infectados, las PBMC de tres (I, V, y VI), cinco (I, II, IV, V, y VI), y dos (II y V) de seis individuos analizados produjeron niveles superiores de TNF-a en respuesta al producto lisado de parásito, rLbhsp83a, y rLbhsp83b, respectivamente. Los niveles de TNF-a producidos por las PBMC de pacientes con CL en respuesta a producto lisado de parásito fueron comparables a los producidos por los controles no infectados. No obstante, rLbhsp83 estimuló la producción de TNF-a en las PBMC de dos de estos pacientes. rLbhsp83a estimuló niveles superiores de producción de TNF-a que rLbhsp83b. En ausencia de estimulación con antígeno, solamente las PBMC de pacientes con ML (cinco o seis) produjeron niveles detectables de TNF-a en el sobrenadante (60 a 190 pg/ml).
En concordancia con el ARNm para IL-10, se detectó IL-10 por medio de ELISA en los sobrenadantes de cultivo de PBMC estimuladas con antígeno de pacientes con ML y CL. Los niveles (49 a 190 pg) fueron significativamente superiores (hasta 10 veces) después de la estimulación con rLbhsp83a en comparación con los posteriores a la estimulación de forma paralela de las mismas células con rLbhsp83b (Figura 11). El producto lisado de parásito también estimuló la producción de IL-10 en las PMBC de algunos de los pacientes. Aunque rLbhsp83 estimuló la producción de IL-10 en las PMBC de individuos no infectados, con una excepción, los niveles fueron inferiores a los observados con las PBMC de los pacientes. No se detectó IL-4 en ninguno de los sobrenadantes analizados. Por lo tanto, el nivel de cualquier IL-4 secretada está por debajo del límite de detección del ELISA empleado (50 pg/ml). Tomados juntos, los resultados demuestran que un perfil de citoquina de tipo Th1 predominante está asociado con las PBMC de individuos infectados con L. braziliensis después de la estimulación con polipéptidos rLbhsp83.
Para determinar la correlación entre las respuestas observadas de las células T y la producción de anticuerpo para Lbhsp83, los autores de la presente invención compararon las reactividades de los anticuerpos (inmunoglobulina G) para Lbhsp83 en sueros de los tres grupos de pacientes (Figura 12). Las reactividades en ELISA de los sueros de pacientes que tienen ML con rLbhsp83a fueron comparables a las observadas con el producto lisado de parásito, y en general, existía una correlación directa entre el título de anticuerpo anti-Lbhs83 de pacientes con ML y la proliferación de células T. De las 23 muestras de suero de los pacientes con ML analizadas, 22 fueron positivas (~96%) con valores de absorbancia de 0,20 a >3,0. Once de las muestras de suero de pacientes con ML tuvieron valores de densidad óptica que fueron >1. En general, los pacientes con CL tuvieron títulos de anticuerpo anti-
Lbhsp83 significativamente inferiores ( = 0,74; desviación típica de la media [ETM] = 0,1) en comparación con las de los pacientes con ML. Por lo tanto, los títulos de anticuerpos anti-rhsp83 de pacientes con ML y CL se correspondían con sus respectivas respuestas proliferativas de las células T. Los títulos de anticuerpo anti-rLbhsp83
fueron significativamente superiores en pacientes con ML ( = 1,5; ETM = 0,2) que en pacientes con CL autocurable ( = 0,35; ETM = 0,056), aunque sus respuestas proliferativas de las células T fueron similares. De hecho los títulos de anticuerpo anti-Lbhsp83 en los pacientes con CL autocurable fueron comparables a los de los
controles no infectados (
= 0,24; ETM = 0,028). Utilizando 2 desviaciones típicas mayores que el valor de absorbancia media del control no infectado (0,484) como un criterio para la reactividad positiva para Lbhsp83, ocho de nueve de las muestras de suero de pacientes autocurables fueron negativas.
EJEMPLO 4
PREPARACIÓN DE CLONES QUE CODIFICAN LT-210
Este Ejemplo ilustra la preparación de clones que codifican porciones del antígeno de Leishmania Lt-210, y que tiene la secuencia proporcionada en el SEQ ID NO: 8.
Se construyó una genoteca de expresión a partir de ADN genómico de L. tropica (MHOM/SA/91/WR1063C). El ADN fue aislado solubilizando promastigotas de L. tropica en Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, EDTA 50 mM, SDS al 1% y tratamiento con 100 μg/ml de ARNasa A y 100 μg/ml de proteinasa K. Después la muestra se extrajo secuencialmente con un volumen igual de fenol, fenol:cloroformo (1:1), y Cloroformo. El ADN se hizo precipitar añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol del 95%. El producto precipitado se resuspendió en Tris 10 μM, EDTA 1 mM. El ADN se sometió a cizalla mediante el pase a través de una aguja de calibre 30 a un intervalo de tamaño de 2-6 kilobases, y se reparó mediante incubación con DNA PolI en presencia de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 100 μM cada uno. Se ligaron adaptadores de EcoRI a los fragmentos de ADN. Tras la eliminación de los adaptadores no ligados por medio del pase sobre una columna Sephadex® G-25, se insertaron los fragmentos en Lambda ZapII cortado con EcoRI (Stratagene, La Jolla, CA).
Se cultivaron en placa aproximadamente 43.000 pfu y se escrutaron con sueros aislados de pacientes con leismaniasis viscerotrópica (VTL). Los sueros de los pacientes con VTL fueron recibidos de los Drs. M. Grogl y A. Magill. El grupo de pacientes con VTL incluía ocho individuos a partir de los cuales se aislaron los parásitos y se cultivaron, siete de los cuales tenían una infección confirmada por L. tropica. Cuatro de los otros pacientes fueron negativos para el cultivo, pero todavía se consideró que estaban infectados basándose en el análisis por PCR o en un frotis de anticuerpo monoclonal positivo (Dr. Max Grogl, comunicado personal). Las muestras de suero de los 11 pacientes infectados se reunieron y la reactividad anti-E. coli se eliminó mediante cromatografía de afinidad (Sambrook et al., supra, págs. 12.27-12.28). Los fagos lambda que expresaban proteínas reactivas fueron detectados después de la unión al anticuerpo por proteína A – peroxidasa de rábano picante y sustrato ABTS.
Se identificaron y se purificaron tres clones, Lt-1, Lt-2, y Lt-3, que contenían una porción del gen Lt-210. Los clones tenían un tamaño que oscilaba de 1,4 a 3,3 kb y codificaban polipéptidos de 75 kD, 70 kD, y 120 kD, respectivamente. Estos tres clones contienen secuencias parciales del gen Lt-210. Lt-1 y Lt-2 son clones solapantes y fueron seleccionados para su estudio adicional.
Se determinaron las secuencias de ADN de Lt-1 y Lt-2. Se utilizó la digestión con exonucleasa III para crear deleciones solapantes de los clones (Heinikoff, Gene 28:351-359, 1984). Se preparó un molde de hebra sencilla y se determinó la secuencia con el Secuenciador Automático de Applied Biosystems modelo 373A o mediante secuenciación didesoxi de Sanger. Se determinó la secuencia de ambas hebras de la porción codificante del clon Lt
1. Se determinó la secuencia parcial de una hebra del clon Lt-2.
El SEQ ID NO: 7 presenta la secuencia de ADN de Lt-1, y el SEQ ID NO: 8 proporciona la secuencia de aminoácidos pronosticada del marco de lectura abierto. La secuencia de ADN de la porción codificante del clon Lt-1 incluye una secuencia de nucleótidos repetida en la porción 5' del clon que contiene ocho copias de una repetición de 99 pb, tres copias de una unidad de repetición de 60 pb, que es parte de la repetición de 99 pb más grande, y 800 pb de secuencia no repetida. La secuencia de aminoácidos deducida de la repetición de 99 pb contiene degeneraciones limitadas. La masa de la proteína recombinante pronosticada es de 67.060 Dalton. Una búsqueda en la base de datos de PIR con la secuencia de aminoácidos pronosticada del marco de lectura abierto dio una homología no significativa con las secuencias sometidas previamente. La estructura secundaria pronosticada de la porción repetida del clon es completamente a-helicoidal.
El análisis de la secuencia de Lt-2 reveló que la porción 3' del clon consistía en una mezcla de repeticiones de 60 y 99 pb que eran idénticas, exceptuando las degeneraciones ocasionales, a las repeticiones de 60 y 99 pb observadas en Lt-1. En conjunto, los datos de secuenciación sugieren que Lt-1 y Lt-2 son porciones diferentes del mismo gen, estando Lt-2 aguas arriba de Lt-1, posiblemente con un pequeño solapamiento.
El análisis de hibridación confirmó que rLt-2 y rLt-1 contienen secuencias solapantes. Los ADN genómicos de varias especies de Leishmania fueron tratados con una variedad de enzimas de restricción, separados mediante electroforesis en gel de agarosa, y transferidos a un filtro de membrana Nytran (Schleicher &amp; Schuell, Keene, NH). Los insertos de rLt-1 y rLt-2 se marcaron con 32P-CTP por medio de transcriptasa inversa a partir de cebadores oligonucleotídicos al azar y se utilizaron como sondas después de la separación de los nucleótidos no incorporados sobre una columna Sephadex G-50. Las hibridaciones utilizando la sonda rLt-1 o rLt-2 se realizaron en NaH2PO4 0,2 M/NaCl 3,6 M a 65°C, mientras la hibridación utilizando la sonda rLt-lr se realiza en NaH2PO4 0,2 M/NaCl 3,6 M/EDTA 0,2 M a 60°C durante la noche. Los filtros se lavan en NaCl 0,075 M/citrato de sodio 0,0075 M pH 7,0 (NaCl 0,15 M/citrato de sodio 0,0150 M para la sonda Lt-lr), más SDS al 0,5% a la misma temperatura que la hibridación.
Se analizaron los ADN genómicos de numerosas especies de Leishmania incluyendo L. tropica por medio de transferencias Southern como se ha descrito más arriba utilizando los insertos Lt-1, Lt-2, y Lt-1r por separado como sondas. En conjunto, varios productos digeridos de ADN de L. tropica indican que este gen tiene un bajo número de copias. Se observó un patrón de solapamiento similar utilizando el inserto Lt-1 o Lt-2 como sonda, de acuerdo con la premisa de que estos dos clones contienen secuencias próximas o solapantes entre sí. Además, las secuencias que hibridan con estos clones están presentes en otras especies de Leishmania.
Los productos aislados de L. tropica tienen una heterogeneidad limitada. Se realizaron los análisis Southern del ADN genómico digerido de cuatro cepas de parásito L. tropica aisladas de pacientes con VTL y tres cepas de parásito L. tropica aisladas de casos de CL (dos humanos, uno canino). El inserto Lt-lr descrito más abajo se marcó y se utilizó como sonda. Los siete productos aislados de L. tropica diferentes dieron intensidades y patrones de restricción similares, solamente con un único polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción entre los productos aislados. Estos datos, junto con los análisis de Southern con enzimas adicionales, indican una heterogeneidad limitada en esta región entre los productos aislados de L. tropica.
Las proteínas recombinantes de Lt-1 y Lt-2 se expresaron y se purificaron. El ajuste de deleción anidada de Lt-1 formado para la secuenciación incluía un clon referido como Lt-lr, que contiene una y un tercio de las repeticiones. Este polipéptido también fue expresado y purificado. La escisión in vivo del fagémido pBluescript SK- de Lambda Zap II se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las partículas de virus del fagémido se utilizaron para infectar E. coli XL-1 Blue. Se indujo la producción de proteína por medio de la adición de IPTG. La proteína se recuperó lisando primero los sedimentos de la bacteria inducida en tampón (LB, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM) utilizando una combinación de lisozima (750 μg/mL) y sonicación. Se recuperaron rLt-1, rLt-2, y rLt-1r, a partir de los cuerpos de inclusión después de la solubilización en urea 8 M (rLt-1 y rLt-2) o urea 4M (rLt-1r). Las proteínas rLt-1 y rLt-2 se enriquecieron y se separaron mediante precipitación con sulfato de amonio al 25%40% y se enriqueció rLt-1r mediante precipitación con sulfato de amonio al 10%-25%. Las proteínas se purificaron adicionalmente mediante electroforesis en gel preparativa en SDS-PAGE al 10%. Las proteínas recombinantes se hicieron eluir de los geles y se sometieron a diálisis en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se midió la concentración mediante el análisis BCA de Pierce (Rockford, IL), y se evaluó la pureza mediante tinción con azul de Coomassie después de la SDS-PAGE.
EJEMPLO 5
PREPARACIÓN DE LBEIF4A
Este ejemplo ilustra la clonación molecular de una secuencia de ADN que codifica el antígeno ribosomal LbeIF4A de
L. braziliensis.
Se construyó una genoteca de expresión genómica con ADN sometido a cizalla de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) en bacteriófago }ZAPII (Stratagene, La Jolla, CA). La genoteca de expresión se escrutó con suero de paciente pre-adsorbido en E. coli de un individuo infectado con leismaniasis de las mucosas infectado con
L. braziliensis. Se purificaron las placas que contenían antígenos recombinantes inmunorreactivos, y se escindió el fagémido pBSK(-) utilizando los protocolos del fabricante. Se realizaron deleciones anidadas con Exonucleasa III para generar deleciones solapantes para las preparaciones de moldes de hebra sencilla y secuenciación. Se aislaron moldes de hebra sencilla después de la infección con el fago coadyuvante VCSM13 como recomienda el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenciaron mediante el método de terminación de la cadena didesoxi o mediante el sistema de colorante-terminador de Taq utilizando el Secuenciador Automático de Applied Biosystems Modelo 373A.
Los antígenos recombinantes inmunorreactivos se analizaron después en análisis con células T de pacientes para determinar su capacidad para estimular una producción proliferativa y de citoquinas, como se describe en los Ejemplos 7 y 8 más abajo.
Se identificó un clon recombinante en los análisis anteriores que, después de la comparación de secuencias de su secuencia de aminoácidos pronosticada con las secuencias de otras proteínas, fue identificado como un homólogo del factor de iniciación eucariótico 4A de Leishmania braziliensis (eIF4A). El clon aislado (pLeIF.1) carecía de los primeros 48 residuos de aminoácido (144 nucleótidos) de la secuencia de la proteína completa. El inserto pLeIF.1 se utilizó con posterioridad para aislar la secuencia genómica completa.
El SEQ ID NO: 9 muestra toda la secuencia de nucleótidos del polipéptido LbeIF4A completo. El marco de lectura abierto (nucleótidos 115 a 1323) codifica una proteína de 403 aminoácidos con un peso molecular pronosticado de 45,3 kD. Una comparación de la secuencia de la proteína pronosticada de LbeIF4A con las proteínas homólogas de tabaco (TeIF4A), ratón (MeIF4A), y levadura (YeIF4A) muestra una exhaustiva homología de secuencia, siendo los primeros 20-30 aminoácidos los más variables. Las longitudes (403, 413, 407, y 395 aminoácidos), los pesos moleculares (45,3, 46,8, 46,4, y 44,7 kDa), y los puntos isoeléctricos (5,9, 5,4, 5,5, y 4,9) de LbeIF4A, TeIF4A, MeIF4A y YeIF4A, respectivamente, son similares. LbeIF4A muestra una homología global del 75,5% (identidad de 57%, 18,5% de sustituciones conservativas) con TeIF4A, 68,6% (identidad de 50%, 18,6% de sustituciones conservativas) con MeIF4A y 67,2% (identidad de 47,6%, 19,6% de sustituciones conservativas) con YeIF4A.
EJEMPLO 6
PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS DE LEISHMANIA SOLUBLES
Este Ejemplo ilustra la preparación de antígenos de Leishmania solubles a partir de un sobrenadante de cultivo de L. major. Se hicieron crecer promastigotas de L. major hasta la fase log tardía en medio complejo con suero hasta que alcanzó una densidad de 2-3 x 107 organismos viables por mL de medio. Los organismos se lavaron cuidadosamente para separar los componentes del medio y se resuspendieron a 2-3 x 107 organismos viables por mL de medio sin suero definido que consistía en partes iguales de medio RPMI 1640 y medio 199, ambos de Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Después de 8-12 horas, se separó el sobrenadante, se concentró 10 veces y se sometió a diálisis frente a solución salina tamponada con fosfato durante 24 horas. Después se determinó la concentración de proteína y la presencia de al menos ocho antígenos diferentes se confirmó mediante SDS-PAGE. Esta mezcla es referida en la presente memoria como &quot;antígenos de Leishmania solubles&quot;.
EJEMPLO 7
COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE INTERLEUQUINA-4 E INTERFERÓN-y ESTIMULADA POR ANTÍGENOS DE LEISHMANIA
Este Ejemplo ilustra las propiedades inmunogénicas de los antígenos preparados de acuerdo con los Ejemplos 1, 2, 5 y 6, determinadas por su capacidad para estimular IL-4 e IFN-y en cultivos de ganglio linfático de ratones infectados y en preparaciones de PBMC humanas. Los cultivos de ganglios linfáticos para su uso en estos estudios se prepararon a partir de ratones BALB/c infectados con L. major 10 días después de la infección, como se describe en el Ejemplo 2. Se prepararon PBMC utilizando sangre periférica obtenida de individuos con infecciones curadas por L. donovani que eran sensibles inmunológicamente a Leishmania. La diagnosis de los pacientes se realizó mediante descubrimientos clínicos asociados al menos con uno de los siguientes: aislamiento de parásitos de las lesiones, un ensayo cutáneo positivo con producto lisado de Leishmania o un ensayo serológico positivo. Los individuos no infectados fueron identificados basándose en la carencia de signos o síntomas clínicos, una carencia de historial de exposición o viaje a zonas endémicas, y la ausencia de respuesta serológica o celular a antígenos de Leishmania. La sangre periférica se recogió y se aislaron las PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad a través de Ficoll® (Winthrop Laboratories, Nueva York).
Se analizaron los sobrenadantes de cultivo para determinar los niveles de IL-4 e IFN-y secretados. Se cuantificó el IFN-y mediante un doble ELISA sándwich utilizando mAb anti-IFN-y humano (Chemicon, Temucula, CA) y suero anti-IFN-y humano de conejo policlonal. Se utilizó rIFN-y humano (Genentech Inc., San Francisco, CA) para generar una curva patrón. Se cuantificó la IL-4 de los sobrenadantes por medio de un doble ELISA sándwich utilizando mAb anti-IL-4 humana de ratón (M1) y un suero anti-IL-4 humana de conejo (P3). Se utilizó IL-4 humana (Immunex Corp., Seattle, WA) para generar una curva patrón que oscila de 50 pg/ml a 1 ng/ml.
Las Figuras 13A y 13B, ilustran el nivel medio de IL-4 y IFN-y secretados, respectivamente, 72 horas después de la adición de 10 μg/mL de cada uno de los siguientes antígenos a un cultivo de ganglios linfáticos preparado como se ha descrito más arriba: antígeno de Leishmania soluble (esto es, un extracto preparado a partir de promastigotas rotas que contiene antígenos de membrana e internos (SLA)), Ldp23, LbeIF4A (LeIF), Lbhsp83, M15 y LmeIF (el homólogo de LbelF4A de L. major). También se muestran los niveles de IL-4 e IFN-y secretados al medio solo (esto es, no estimulado). Si bien SLA logró una respuesta Th2 predominantemente a partir de células de ganglio linfático de ratones infectados con Leishmania, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83 y M15 lograron cantidades relativamente pequeñas de IL-4 y grandes de IFN-y, de acuerdo con un perfil de respuesta Th1.
La Figura 14 muestra el nivel de IFN-y secretado en un producto filtrado de cultivo de preparaciones de PBMC humanas infectadas y no infectadas 72 horas después de la adición de 10 μg/mL de producto lisado de L. major, M15 o L-Rack, un antígeno de Leishmania inmunodominante en la leismaniasis murina. De un modo similar, la Figura 15 ilustra el nivel de IFN-y secretado en producto filtrado de cultivo de preparaciones de PBMC humanas infectadas y no infectadas 72 horas después de la adición de 10 μg/mL de producto lisado de L. major, antígenos de Leishmania solubles (preparados como se describe en el Ejemplo 6) o L-Rack. Estos resultados indican que los antígenos de Leishmania M15 y solubles, pero no L-Rack, son potentes estimuladores de la producción de IFN-y en PBMC de pacientes, pero no en PBMC de individuos no infectados. De este modo, los antígenos de Leishmania M15 y solubles logran un perfil de citoquina Yh1 dominante tanto en ratones como en seres humanos infectados con
Leishmania.
EJEMPLO 8
COMPARACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN ESTIMULADA POR ANTÍGENOS DE LEISHMANIA
Este Ejemplo ilustra las propiedades inmunogénicas de los antígenos preparados de acuerdo con los Ejemplos 1, 2, 5 y 6, determinadas por su capacidad para estimular la proliferación en cultivos de ganglio linfático de ratones infectados y en preparaciones de PBMC humanas.
Para los análisis de proliferación in vitro, se cultivaron 2 - 4 x 105 células/pocillo en medio completo (RPMI 1640 con un suplemento de gentamicina, 2-ME, L-glutamina, y suero humano A+ seleccionado combinado al 10%; Trimar, Hollywood, CA) en placas de fondo plano de 96 pocillos con o sin 10 μg/ml de los antígenos indicados o 5 μg/ml de PHA (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) durante cinco días. Las células se pulsaron después con 1 μCi de [3H]-timidina durante las 18 horas finales del cultivo.
La Figura 16 ilustra la proliferación observada después de la adición de 10 μ g/mL o 20 μg/mL de cada uno de los siguientes antígenos a un cultivo de ganglios linfáticos preparado como se describe en el Ejemplo 7: SLA, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83, y M15. También se muestra el nivel de proliferación sin la adición de antígeno. Los datos se representan como las cpm medias. Estos resultados demuestran que una variedad de antígenos de Leishmania son capaces de estimular la proliferación de células de los ganglios linfáticos de ratones infectados con Leishmania.
Las Figuras 17 y 18 ilustran la proliferación observada en preparaciones de PBMC humanas de individuos inmunes a Leishmania y no infectados después de la adición de 10 μg/mL de antígenos de Leishmania M15 y solubles, respectivamente. Estos valores se comparan con la proliferación observada después de la adición de medio de cultivo, producto lisado de L. major o L-Rack. Los resultados demuestran que los antígenos de Leishmania M15 y solubles estimulan la proliferación en PBMC inmunes a Leishmania, pero no en PBMC obtenidas de individuos no infectados, demostrando que los antígenos M15 y soluble (pero no L-Rack) son reconocidos por las PBMC de individuos inmunes a Leishmania debido a una infección previa.
EJEMPLO 9
PREPARACIÓN DE LMSP1A Y LMSP9A
Este Ejemplo ilustra la preparación de dos antígenos de Leishmania solubles, Lmsp1a y Lmsp9a.
A. Purificación de Lmsp1a y Lmsp9a a partir de una mezcla de antígenos de L. major solubles
Se originó un suero de conejo de título elevado contra antígenos solubles de L. major, preparados como se ha descrito más arriba en el Ejemplo 6. Específicamente, se inmunizó subcutáneamente un conejo blanco New Zealand en múltiples sitios con 180 μg de antígenos solubles de L. major en una suspensión que contenía 100 μg de muramil dipéptido y coadyuvante incompleto de Freund al 50%. Seis semanas más tarde se administró al conejo un refuerzo subcutáneo de 100 μg de la misma preparación de antígeno soluble en coadyuvante incompleto de Freund. Esto estuvo seguido de dos refuerzos intravenosos espaciados dos semanas, cada uno con 100 μg de la preparación de antígeno soluble. Se recogió el suero de conejo 11 días después del refuerzo final.
Se eliminaron las reactividades de los anticuerpos anti-E. coli de los sueros de conejo mediante pre-adsorción sobre filtros de nitrocelulosa que contenían E. coli lisada. Los sueros adsorbidos se evaluaron mediante análisis de transferencia Western utilizando 10 μg de producto lisado de promastigotas de Leishmania (calle 1) y 1 μg de mezcla de antígenos solubles de L. major (calle 2). Como se muestra en la Figura 20, se encontró que el suero de conejo era reactivo con siete antígenos dominantes de la mezcla de antígenos solubles de L. major con pesos moleculares que oscilaban de 18 a >200 kDa. Una exposición cuatro veces más prolongada de la misma transferencia reveló tres especies inmunorreactivas adicionales con pesos moleculares menores de 18 kDa. El mismo suero reaccionó con aproximadamente 10 antígenos del producto lisado de promastigota, pero con un patrón significativamente diferente del observado con los antígenos solubles de L. major (Figura 20). Esto parece indicar una potencial modificación post-traduccional del mismo antígeno antes (localización intracelular) y después de la secreción/eliminación. Tales modificaciones pueden incluir la escisión de una secuencia líder y/o la adición de moléculas de carbohidratos a los antígenos secretados/eliminados.
El suero de conejo descrito más arriba se utilizó con posterioridad para escrutar una genoteca de expresión de ADNc de L. major preparada a partir de ARN de promastigota de L. major utilizando el kit Lambda ZAP unidireccional (uni-ZAP) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se escrutaron un total de 70.000 pfu de la genoteca de ADNc amplificada con el suero de conejo a una dilución 1:250. Se confirmaron 19 clones positivos en el escrutinio terciario. Los fagémidos fueron escindidos y el ADN de cada uno de los 19 clones fue secuenciado utilizando un secuenciador automático Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 373A. Se encontró que los 19 clones representaban dos secuencias distintas, referidas como Lmsp1a y Lmsp9a. Las secuencias de ADNc determinadas para Lmsp1a y Lmsp9a se proporcionan en los SEQ ID NO: 19 y 21, respectivamente, proporcionándose las correspondientes secuencias de aminoácidos en los SEQ ID NO: 20 y 22, respectivamente.
B. Caracterización de Lmsp1a y Lmsp9a
La Fig. 21 muestra el ADNc completo (SEQ ID NO: 19) y la secuencia de aminoácidos pronosticada (SEQ ID NO: 20) para el antígeno Lmsp1a. El inserto EcoRI/XhoI tiene 1019 pb y contiene los siguientes rasgos: a) los últimos 17 nt de la secuencia líder empalmada característica de todos los ARNm codificados nuclearmente por Trypanosoma; b) 39 nt de secuencia no traducida 5'; c) un marco de lectura abierto de 453 nt de longitud que codifica una secuencia de aminoácidos deducida de 151 con una masa molecular pronosticada de 16.641 kDa; y d) 471 nt de la secuencia no traducida 3' que termina con una cola de poliA. La secuencia de aminoácidos pronosticada contiene los tres sitios potenciales de fosforilación en los residuos de aminoácido 3, 85 y 102. Además, Lmsp1a contiene una secuencia RGD en el residuo 104, una secuencia que puede jugar un papel en la invasión por parásitos del macrófago. Se ha demostrado que las secuencias RGD median la unión de varias proteínas de adherencia a sus receptores de la superficie celular. No existe una secuencia líder obvia (señal secretora) en la porción amino terminal sugiriendo que la proteína podría ser eliminada o excretada. Lmsp1a parece ser uno de los antígenos más abundantes encontrados en el sobrenadante de cultivo de promastigotas vivas, puesto que 17 de los 19 clones contienen secuencias de longitudes variables idénticas a Lmsp1a.
La comparación de la secuencia de aminoácidos de Lmps1a con secuencias conocidas utilizando el sistema DNA STAR (Versión 87) reveló que Lmsp1a comparte entre 65% y 70% de homología con la proteína nucleósido difosfato quinasa eucariótica, también referida en ratón y ser humano como gen inhibidor de la metástasis tumoral.
El análisis de transferencia Southern del ADN genómico de L. major (cepa Friedlander) digerido con un panel de enzimas de restricción (calles 1 a 7) y otras seis especies de Leishmania de diferentes localizaciones geográficas digerido con PstI (calles 8 a 13) utilizando el inserto de ADNc completo de Lmps1a, demostró que Lmsp1a está presente en todas las especies caracterizadas por un alto grado de conservación (Fig. 22). Esto sugiere una trascendencia evolutiva para el mantenimiento de Lmsp1a y la existencia de especies homólogas entre todas las especies de Leishmania.
Los dos clones de ADNc restantes aislados de la mezcla de antígenos solubles de L. major representan secuencias idénticas (referidas como Lmsp9a; SEQ ID NO: 21), sugiriendo que las dos copias resultan de la amplificación de la genoteca primaria. La secuenciación del ADNc de Lmsp9a reveló que el clon no contiene la secuencia 5' completa puesto que carece tanto del líder empalmado como de las secuencias no traducidas 5'. El extremo 3' del ADNc contiene un tramo de poliA, como cabría esperar para un ARNm de Leishmania. De la secuencia traducida pronosticada (SEQ ID NO: 22), 34 de los 201 aminoácidos (17%) representan residuos de cisteína. La comparación de la secuencia de la proteína pronosticada con las de las proteínas conocidas, como se ha descrito más arriba, reveló cierta homología con otras proteínas ricas en cisteína tales como el antígeno superficial principal de trofozoito de Giardia lamblia y furina proteasas.
EJEMPLO 10
PREPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MAPS-1A
Este Ejemplo ilustra la preparación y caracterización del antígeno de Leishmania MAPS-1A (SEQ ID NO: 24).
Se obtuvo una reserva de suero a partir de 5 ratones BALB/c a los que se había administrado una inmunización primaria y dos refuerzos con sobrenadante de cultivo de promastigotas de L. major bruto como se describe más abajo en el Ejemplo 12. Con posterioridad se demostró que estos ratones estaban protegidos cuando se sensibilizaron con una dosis de promastigotas de L. major vivas que se ha encontrado que son letales por lo general. Los sueros de ratones obtenidos de este modo se utilizaron para escrutar una genoteca de expresión de ADNc de amastigotas de L. major preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se aislaron varios clones sero-reactivos y se secuenciaron utilizando un secuenciador automático Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 373A (Foster City, CA).
Se encontró que uno de estos clones, referido en la presente memoria como MAPS-1A, estaba completo. La comparación del ADNc y de las secuencias de aminoácidos deducidas para MAPS-1A (SEQ ID No: 23 y 24, respectivamente) con secuencias conocidas del banco de genes utilizando el sistema DNA STAR no reveló homologías significativas con las secuencias de Leishmania conocidas, aunque se encontró cierta similitud de secuencia con un grupo de proteínas, conocidas como antioxidantes específicos de tiol, encontrados en otros organismos.
Se preparó la proteína MAPS-1A recombinante que tiene una etiqueta HIS amino terminal utilizando un sistema de expresión de E. coli de alto nivel y se purificó una proteína recombinante mediante cromatografía de afinidad como se ha descrito en el Ejemplo 1. El análisis de transferencia Southern del ADN genómico de L. major digerido con un panel de enzimas de restricción, otras siete especies de Leishmania digeridas con PstI, y otros dos patógenos de enfermedades infecciosas (T. cruzi y T. brucei), utilizando el inserto completo de MAPS-1A, demostró que MAPS-1A está presente en las ocho especies de Leishmania sometidas a ensayo (Figura 23). El análisis de transferencia Northern de ARN de promastigota y amastigota de L. major indicó que MAPS-1A es expresada constitutivamente.
Utilizando cebadores oligonucleotídicos (SEQ ID NO: 27 y 28) basados en la secuencia de ADNc de MAPS-1A proporcionada en el SEQ ID NO: 23, se aisló el gen correspondiente a partir de L. tropica por medio de PCR (utilizando 30 ciclos de la siguiente secuencia de etapas de temperatura: 94°C, 1 minuto; 50°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto). La secuencia de ADNc determinada para la proteína MAPS-1A de L. tropica se proporciona en el SEQ ID NO: 25, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en el SEQ ID NO: 26.
La capacidad de MAPS-1A recombinante para estimular la proliferación celular se investigó como sigue. Se prepararon como se ha descrito más arriba en el Ejemplo 7, PBMC de 3 pacientes infectados con L. braziliensis que tenían leismaniasis de las mucosas activa, de 4 pacientes después de infección con kala-azar (previamente infectados con L. chagasi y/o L. donovani) y de 3 individuos no infectados. Se determinó la capacidad de MAPS-1A para estimular la proliferación de estas PBMC como se ha descrito en el Ejemplo 8 anterior. Como se muestra en la Figura 24, se observaron niveles significativos de proliferación de PBMC específica de MAPS-1A en 2 de los 7 pacientes con Leishmania.
Se determinó la capacidad de MAPS-1A para estimular la proliferación en cultivos de ganglio linfático de ratones como se ha descrito en el Ejemplo 8. La Figura 25 muestra la cantidad de proliferación estimulada por MAPS-1A (a 25 μg/ml, 5 μg/ml y 1 μg/ml) en comparación con la estimulada por el control positivo ConA y por proteínas del sobrenadante de promastigotas de L. major bruto, 20 días después de la infección con L. major. Las células aisladas 20 días después de la infección fueron altamente sensibles a MAPS-1A, mientras las células aisladas 10 días después de la infección no fueron sensibles.
EJEMPLO 11
INMUNORREACTIVIDAD DE ANTÍGENOS DE LEISHMANIA SOLUBLES CON SUEROS DE PACIENTES INFECTADOS CON LEISHMANIA
La reactividad de MAPS-1A con sueros de individuos no infectados, de pacientes con leismaniasis humana con infección cutánea, de pacientes humanos con leismaniasis visceral aguda, y de ratones BALB/c infectados con L. major se determinó como sigue.
Los análisis se realizaron en placas de 96 pocillos revestidas con 200 ng de antígeno diluido hasta 50 μL en tampón de revestimiento de carbonato, pH 9,6. Los pocillos se revistieron durante la noche a 4°C (o 2 horas a 37°C). Los contenidos de la placa se eliminaron a continuación y los pocillos se bloquearon durante 2 horas con 200 μL de PBS/BSA al 1%. Después de la etapa de bloqueo, los pocillos se lavaron cinco veces con PBS/Tween 20® al 0,1%. A continuación se añadieron 50 μL de suero, diluido 1:100 en PBS/Tween 20® al 0,1%/BSA al 0,1%, a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron a continuación de nuevo cinco veces con PBS/Tween 20® al 0,1%.
El producto conjugado enzimático (peroxidasa de rábano picante - Proteína A, Zymed, San Francisco, CA) se diluyó a continuación 1:10.000 en PBS/Tween 20® al 0,1%/BSA al 0,1%, y se añadieron a cada pocillo 50 μL del producto conjugado diluido y se incubó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Después de la incubación, los pocillos se lavaron cinco veces con PBS/Tween 20® al 0,1%. Se añadieron 100 μL de sustrato de tetrametilbenzidinaperoxidasa (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), no diluido, y se incubó durante aproximadamente 15 minutos. La reacción se detuvo con la adición de 100 μL de H2SO4 1 N a cada pocillo, y las placas se leyeron a 450 nm.
Como se muestra en la Figura 26, aproximadamente 50% de las muestras de pacientes con leismaniasis humana mostraron reactividades con MAPS-1A recombinante sustancialmente por encima del fondo. La Figura 27 muestra la reactividad de MAPS-1A con diluciones crecientes de sueros de ratones BALB/c a los que se había administrado previamente (i) solución salina; (ii) coadyuvante B. pertussis; (iii) antígenos de Leishmania solubles más B. pertussis;
(iv) promastigotas de L. major vivas o (v) antígenos de Leishmania solubles más B. pertussis seguido de promastigotas de L. major vivas (como se describe más abajo en el Ejemplo 12). Se observaron absorbancias considerablemente mayores con sueros de ratones infectados con promastigotas de L. major vivas y con ratones infectados con promastigotas de L. major vivas después de la inmunización con antígenos de Leishmania solubles más B. pertussis, que con sueros de los otros tres grupos de ratones, indicando que los títulos de anticuerpos anti-MAPS-1A se incrementan después de la infección por Leishmania.
EJEMPLO 12
USO DE ANTÍGENOS DE LEISHMANIA PARA LA VACUNACIÓN CONTRA LA INFECCIÓN POR LEISHMANIA
Este ejemplo ilustra la eficacia de los antígenos de Leishmania para conferir protección contra una enfermedad en el sistema modelo de leismaniasis murina experimental. Para una discusión del sistema modelo de leismaniasis murina véase, por ejemplo, Reiner et al. Annu. Rev. Immunol., 13:151-77, 1995.
La eficacia de (i) antígenos de Leishmania solubles brutos, (ii) MAPS-1A, y (iii) una mezcla de Ldp23, LbeIF4A y M15, como vacunas contra la infección por Leishmania se determinó como sigue. Se inmunizaron ratones BALB/c (5 por grupo) intra-peritonealmente tres veces a intervalos bisemanales con (i) 30 μg de antígenos de Leishmania solubles brutos, (ii) 20 μg de MAPS-1A o (iii) una mezcla que contenía 10 μg de cada uno de LeIF, Ldp23 y M15, junto con 100 μg del coadyuvante C. parvum. Dos grupos de control se inmunizaron con solución salina o con C. parvum solo. Dos semanas después de la última inmunización, los ratones se sensibilizaron con 2 x 105 promastigotas de L. major en la fase logarítmica tardía. La infección se controló semanalmente midiendo la hinchazón de la almohadilla de la pata. La cantidad de hinchazón de la almohadilla de la pata observada en los ratones inmunizados con antígenos de Leishmania solubles brutos, una mezcla de Ldp23, LbeiF4A y M15 (Figura 28), o MAPS-1A (Figura 29) fue significativamente menor que la observada en ratones inmunizados con C. parvum solo. Estos resultados demuestran que los antígenos de Leishmania de la presente invención son eficaces para conferir protección contra la infección por Leishmania.
EJEMPLO 13
AISLAMIENTO DE ADN QUE CODIFICA ANTÍGENOS SOLUBLES DE UNA GENOTECA DE ADN GENÓMICO DE L. MAJOR
Este ejemplo, ilustra el aislamiento de siete genes de antígenos de Leishmania solubles de una genoteca de ADN genómico de L. major.
Se preparó una genoteca de expresión de ADN genómico de L. major a partir de promastigotas de L. major utilizando el kit Lambda ZAP unidirecciónal (uni-ZAP) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Esta genoteca se escrutó con un suero de conejo de alto título originado contra antígenos de L. major solubles, como se ha descrito más arriba en el Ejemplo 9. Se identificaron siete clones positivos. El fagémido se escindió y el ADN de cada uno de los siete clones se secuenció utilizando un secuenciador automático Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 373A. Las secuencias de ADN para estos antígenos, referidos como LmgSP1, LmgSP3, LmgSP5, LmgSP8, LmgSP9, LmgSP13, LmgSP19, se proporcionan en los SEQ ID NO: 29-35, respectivamente, proporcionándose las secuencias de aminoácidos correspondientes en los SEQ ID NO: 36-42, respectivamente. Se encontró que LmgSP13 contenía una secuencia repetida de 39 aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 43.
Estudios posteriores dieron como resultado el aislamiento de una secuencia completa para LmgSP9. La secuencia de ADN completa se proporciona en el in SEQ ID NO: 54, proporcionándose la secuencia de aminoácidos pronosticada correspondiente en el SEQ ID NO: 55. Se encontró que la secuencia de aminoácidos contenía seis unidades repetidas de 14 aminoácidos (SEQ ID NO: 56), proporcionándose cada unidad dividida adicionalmente en 7 unidades de aminoácidos, en los SEQ ID NO: 57 y 58.
La comparación de las secuencias de ADN y aminoácidos de los antígenos aislados descritos como se ha descrito más arriba, reveló homologías no significativas para LmgSP1, LmgSP3, y LmgSP13. Se encontró que LmgSP5 estaba relacionado con la familia PSA2 conocida. Se encontró que LmgSP8 guardaba cierta homología con una secuencia identificada previamente en E. coli (ácido 2-succinil-6-hidroxi-2,4-ciclohexadien-1-carboxílico sintasa). Se encontró que LmgSP9 y LmgSP19 eran homólogas a una proteína de superficie hidrófila de L. major referida como Gene B (Flinn, H.M. et al. Mol. Biochem. Parasit. 65:259-270, 1994), y a la ubiquitina, respectivamente. Hasta donde tienen conocimiento los autores de la presente invención, no se ha mostrado previamente que ninguno de estos antígenos logre respuestas en células T o B.
La reactividad de LmgSP9 recombinante con sueros de pacientes con leismaniasis visceral, (tanto de Sudán como de Brasil) y de donantes normales se evaluó mediante ELISA como se ha descrito más arriba. Los valores de absorbancia se compararon con los obtenidos utilizando el antígeno K39 de Leishmania conocido descrito anteriormente, empleándose producto lisado de L. chagasi como control positivo. Los resultados representativos de estos análisis se proporcionan más abajo en la Tabla 2, donde todos los pacientes de Brasil y los de Sudán designados &quot;VL&quot; fueron infectados con leismaniasis visceral. Los resultados demostraron que LmgSP9 detecta específicamente el anticuerpo en la mayoría de los individuos con leismaniasis visceral, independientemente de la localización geográfica. En algunos casos, los valores de absorbancia de la reactividad del anticuerpo con LmgSP9 fueron comparables con los observados con K39. Además, LmgSP9 detectó varios casos de leismaniasis que no se detectaron utilizando K39. Estos resultados indican que LmgSP9 se puede utilizar para complementar la reactividad de K39.
Tabla 2
REACTIVIDAD DE LMGSP9 CON SUEROS DE PACIENTES CON LEISHMANIA
Paciente Núm.
Producto lisado de L. chagasi K39 LmgSP9
Muestras Sudanesas:
B19
1,067 0,306 0,554
B25
1,884 3,435 0,974
B43
1,19 3,225 0,86
B47
2,405 2,892 0,375
B50
0,834 0,748 0,432
B58
0,921 0,235 0,92
B63
1,291 0,303 0,764
B70
0,317 0,089 3,056
VL4
1,384 3,035 2,965
VL11
0,382 0,144 0,142
VL12
0,277 0,068 0,098
VL13
0,284 0,12 0,194
Muestras Brasileñas:
105
3,508 3,53 0,374
106
2,979 3,373 2,292
107
2,535 3,444 0,46
109
1,661 3,415 3,319
111
3,595 3,537 0,781
112
2,052 3,469 0,63
113
3,352 3,429 0,963
114
2,316 3,437 1,058
115
2,073 3,502 1,186
116
3,331 3,461 0,96
Donantes Normales:
129
0,157 0,104 0,08
130
0,195 0,076 0,095
131
0,254 0,134 0,086
132
0,102 0,035 0,043
Con el fin de obtener una especificidad superior para la detección de anticuerpos en sueros de pacientes de leismaniasis visceral, se aisló un homólogo de LmgSP9 de L. chagasi, uno de los agentes causantes de la 5 leismaniasis visceral. Se escrutaron un total de 80.000 pfu de una genoteca genómica de L. chagasi amplificada con la región codificante completa de LmgSP9 (amplificado a partir del ADN genómico de L. major). Siete clones que hibridaron se purificaron hasta la homogeneidad. Las secuencias de ADN determinadas para dos de estos clones, referidos como Lc Gene A y Lc Gene B, se proporcionan en los SEQ ID NO: 59 y 60, respectivamente, proporcionándose las secuencias de aminoácidos pronosticadas correspondientes en los SEQ ID NO: 61 y 62, 10 respectivamente. Se encontró que el marco de lectura abierto para Lc Gene A mostraba alguna homología con Gene A/C, aislado previamente de L. major (McKlean et al., Mol. Bio. Parasitol., 85:221-231, 1997). El marco de lectura abierto para Lc Gene B mostró alguna homología con Gene B de L. major, comentado anteriormente, y se encontró
que contenía once repeticiones de una unidad repetida de 14 aminoácidos (SEQ ID NO: 63), estando cada repetición dividida adicionalmente en dos unidades de 7 aminoácidos, proporcionadas en los SEQ ID NO: 64 y 65.
Los potenciales diagnósticos de Lc Gene A y Lc Gene B se evaluaron mediante ELISA como se ha descrito más arriba utilizando sueros de pacientes con leismaniasis visceral de Sudán y Brasil, y de controles no infectados. Los valores de absorbancia se compararon con los obtenidos utilizando LmgSP9. Se obtuvieron valores de absorbancia mucho mayores con Lc Gene A y Lc Gene B que con LmgSP9, con Lc Gene B parecía ser más eficaz que con Lc Gene A en la detección de anticuerpos en algunos casos. Estos resultados indican que Lc Gene B es muy eficaz en la diagnosis de la leismaniasis visceral.
Con el fin de evaluar el potencial diagnóstico de las repeticiones encontradas en Lc Gene B, se sintetizaron una serie de 6 péptidos (SEQ ID NO: 66-71; referidos como Pep 1-6), que diferían en un residuo R o H. Se llevó a cabo un ELISA utilizando la proteína Lc Gene B completa y los seis péptidos. Los valores de absorbancia obtenidos con Pep 3 fueron superiores a los obtenidos con los otros 5 péptidos, sin embargo no fueron tan altos como los obtenidos con la proteína completa.
EJEMPLO 14
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL ADN QUE CODIFICA ANTÍGENOS SOLUBLES DE UNA GENOTECA DE ADN GENÓMICO DE L. CHAGASI
Este ejemplo, ilustra la preparación de cinco genes de antígenos de Leishmania solubles de una genoteca de ADN genómico de L. chagasi.
Se preparó una genoteca de expresión de ADN genómico de L. chagasi a partir de promastigotas de L. chagasi utilizando el kit Lambda ZAP unidireccional (uni-ZAP) (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Esta genoteca se escrutó con un suero de conejo de alto título originado contra antígenos de L. major solubles, como se ha descrito más arriba en el Ejemplo 9. Se identificaron cinco clones positivos. El fagémido se escindió y el ADN de cada uno de los Cinco clones se secuenció utilizando un secuenciador automático Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 373A. Las secuencias de ADN para estos antígenos, referidos como LcgSP1, LcgSP3, LcgSP4, LcgSP8, y LcgSP10, se proporcionan en los SEQ ID NO: 44-48, respectivamente, proporcionándose las secuencias de aminoácidos correspondientes en los SEQ ID NO: 49-53, respectivamente.
La comparación de estas secuencias con secuencias conocidas en el banco de genes como se ha descrito más arriba, no reveló homologías conocidas con LcgSP3, LcgSP4, LcgSP8 y LcgSP10. Se encontró que LcgSP1 era homólogo con el antígeno conocido HSP70.
Las Figuras 30A y B ilustran la respuesta proliferativa de ganglios linfáticos murinos a LcgSP8, LcgSP10 y LcgSP3 recombinantes. También se recogieron los ganglios linfáticos de ratones BALB/c 17 días después de la infección con
L. major. La infección se produjo por medio de inyección en la almohadilla de la pata de 2 x 106 parásitos/almohadilla de la pata. Las células se estimularon con antígeno recombinante y la proliferación se midió a las 72 horas utilizando3H-timidina. La Figura 30A muestra las CPM, una medición directa de la actividad mitótica en respuesta a los antígenos, y la Figura 30B muestra en índice de estimulación, que mide la respuesta proliferativa relativa al control negativo.
EJEMPLO 15
AISLAMIENTO DE ADN QUE CODIFICA LOS ANTÍGENOS DE L. MAJOR MEDIANTE CLONACIÓN DE EXPRESIÓN DE CÉLULAS T CD4+
Este ejemplo, ilustra el aislamiento de antígenos de células T de L. major utilizando un enfoque de escrutinio de células T directo.
Las líneas de células T CD4+ específicas de Leishmania se obtuvieron de PBMC de un individuo que dio resultado posito en una prueba cutánea para Leishmania pero no tenía historia clínica de enfermedad. Estas líneas de células T se utilizaron para escrutar una genoteca de expresión de ADNc de amastigota de L. major preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los clones inmunorreactivos se aislaron y secuenciaron como se ha descrito más arriba. Las secuencias de ADNc determinadas para los 8 clones aislados referidas como 1G6-34, 1E6-44, 4A5-63, 1B1139, 2A10-37, 4G2-83, 4H6-41, 8G3-100 se proporcionan en los SEQ ID NO: 72-79, respectivamente, proporcionándose las secuencias de aminoácidos pronosticadas correspondientes en los SEQ ID NO: 80-87, respectivamente. Se cree que las secuencias de ADNc proporcionadas para 1E6-44, 2A10-37, 4G2-83, 4H6-41 y 8G3-100 representan clones parciales. Se encontró que todos estos clones estimulan la proliferación de células T.
La comparación de estas secuencias con las del banco de genes como se ha descrito más arriba no reveló homologías conocidas con el antígeno 4A5-63. Se encontró que 1G6-34 tenía alguna homología con la histona H2B identificada previamente en L. enrietti. Los antígenos 1E6-44, 1B11-39 y 8G3-100 mostraron alguna homología con las secuencias identificadas previamente en otros eucariotas, en particular Saccharomyces cerevisae. Se encontró que 2A10-37 y 4H6-41 eran homólogos a las dos proteínas alfa tubulina identificadas previamente de L. donovani y beta tubulina de L. major, respectivamente, y se encontró que 4G2-83 era homólogo al factor 2 de iniciación de la elongación identificado previamente en T. cruzi.
EJEMPLO 15 SÍNTESIS DE POLIPÉPTIDOS
Los polipéptidos se pueden sintetizar en un sintetizador de péptidos de Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A utilizando la química FMOC con activación mediante HPTU (hexafluorofosfato de O-Benzotriazol-N,N,N',N'tetrametiluronio). Se puede anclar una secuencia Gly-Cys-Gly al extremo amino del péptido para proporcionar un método de conjugación, unión a una superficie inmovilizada, o marcaje del péptido. La escisión de los péptidos del soporte sólido se puede llevar a cabo utilizando la siguiente mezcla de escisión: ácido trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Después de escindirlos durante 2 horas, los péptidos se pueden precipitar en metil-t-butil-éter frío. Los sedimentos peptídicos se pueden disolver a continuación en agua que contiene ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) y liofilizar antes de la purificación por medio de HPLC de fase inversa C
18. Se puede utilizar un gradiente de acetonitrilo de 0% a 60% (conteniendo TFA al 0,1%) en agua (conteniendo TFA al 0,1%) para eluir los péptidos. Después de la liofilización de las fracciones puras, los péptidos se pueden caracterizar utilizando electropulverización u otros tipos de espectrometría de masas y por medio de análisis de aminoácidos.
Listado de secuencias
(1)
INFORMACIÓN GENERAL:
(i) SOLICITANTE: Corixa Corporation
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTÍGENOS DE LEISHMANIA PARA USO EN LA TERAPIA Y LA DIAGNOSIS DE LEISHMANIASIS
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA
(A)
DESTINATARIO: SEED and BERRY LLP
(B)
CALLE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
(C)
CIUDAD: Seattle
(D)
ESTADO: Washington
(E)
PAÍS: USA
(F)
ZIP: 98104-7092
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D)
APLICACIÓN: Patent In Release #1.0, Version #1.30
(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-FEB-1998
(C)
CLASIFICACIÓN:
(viii) DATOS DEL ABOGADO/AGENTE:
(A)
NOMBRE: Maki, David J.
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 31,392
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: 210121.42001PC
(ix) DATOS PARA TELECOMUNICACIÓN:
(A)
TELÉFONO: (206) 622-4900
(B)
TELEFAX: (206) 682-6031
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 3134 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 10 (ix) CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
(B)
LOCALIZACIÓN: 421..2058
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 546 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 676 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE / CLAVE: CDS
10 (B) LOCALIZACIÓN: 26..550
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 175 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 2040 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE / CLAVE: CDS
10 (B) LOCALIZACIÓN: 62..2029
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 656 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1771 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE / CLAVE: CDS
10 (B) LOCALIZACIÓN: 1..1698
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 566 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 1618 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(ix)
CARACTERÍSTICA:
10 (A) NOMBRE / CLAVE: CDS
(B) LOCALIZACIÓN: 115..1323
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 403 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 12 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE / CLAVE: Sitio modificado
10 (B) LOCALIZACIÓN: 6
(D) INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Cuando Xaa es o bien un resto Leu o un resto Lys&quot;
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: -
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Cuando n es inosina&quot;
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: -
(B)
LOCALIZACIÓN: 17
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Cuando n es inosina&quot;
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: -
(B)
LOCALIZACIÓN: 20
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Cuando n es inosina&quot;
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12: GGAATTCCCC NCAGCTNGTN TTCGAC 26
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14: GGATCCATGG TCAAGTCCCA CTACATCTGC 30
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA :
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15: GAATTCAGAC CGGATAGAAA TAAGCCAATG AAA 33
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 701 aminoácidos 15 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 704 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 732 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1019 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
(B)
LOCALIZACIÓN: 71..523
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 151 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1523 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
(B)
LOCALIZACIÓN: 14..973
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 320 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 797 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
(B)
LOCALIZACIÓN: 27..623
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 199 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 637 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania tropica
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
(B)
LOCALIZACIÓN: 7..624
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 206 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: /desc = &quot;cebador (MAPS-1-5ÕHis) de 50 PCR para amplificar simultáneamente cDNA de MAPS-1 para ambos L. major y L. tropica mientras se añaden 6 restos Hiz al extremo amino-terminal de la proteína codificada.&quot;
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27: 15 CAATTACATA TGCATCACCA TCACCATCAC ATGTCCTGCG GTAACGCCAA G ' 51
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
5 (A) DESCRIPCIÓN: /desc = &quot;cebador (MAPS-1-3ÖR1) de 3' PCR para amplificar simultáneamente cDNA de MAPS-1 para ambos L. major y L. tropica.&quot;
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28: CATGGAATTC TTACTGCTTG CTGAAGTATC C 31
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 520 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 600 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble 25 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 600 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 10 (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 600 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 600 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 15 (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 516 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 822 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 146 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 77 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 68 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 65 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido 15 (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 78 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 169 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 98 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 39 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania major
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 600 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1748 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 560 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 600 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 10 (vi) FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:
15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1053 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:49:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 136 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:
5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 510 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:51:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:52:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 63 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido 15 (C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
(A)
ORGANISMO: Leishmania chagasi 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:53:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 324 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(vi)
FUENTE ORIGINAL: 10 (A) ORGANISMO: Leishmania chagasi
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:54:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1585 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: doble
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:55:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 320 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:56:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:57:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:58:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:59:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 264 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:60:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 744 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:
15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:61:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 80 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:62: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 247 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:63:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE / CLAVE: Sitio modificado
10 (B) LOCALIZACIÓN: 6
(D) INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Xaa puede ser o bien His o Arg&quot;
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOMBRE / CLAVE: Sitio modificado
(B)
LOCALIZACIÓN: 12 15 (D) INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Xaa puede ser o bien Gly o Asp&quot;
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: Sitio modificado
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Xaa puede ser o bien Asp o Gly&quot; 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:64:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: Sitio modificado
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Xaa puede ser o bien His o Arg&quot;
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:65:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NAME/tOrY: Sitio modificado
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Xaa puede ser o bien Gly o Asp&quot;
(ix)
CARACTERÍSTICA:
(A)
NOMBRE / CLAVE: Sitio modificado
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= &quot;Xaa puede ser o bien Asp o Gly&quot;
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:66:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:67:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:
10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:68:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 45 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C) CADENA: 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:69:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:70:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LErIGTH: 31 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:
10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 45 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:72:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 664 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:73:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1432 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:74:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 873 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:75:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1238 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:76:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 712 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:77:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1086 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:78:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 447 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:79:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 375 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:80: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:81:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 381 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:82:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 191 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0:83:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 273 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:84:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 200 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:85:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 361 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:86:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 149 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86:
(2)
INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:87:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 69 aminoácidos
(B)
TIPO: aminoácido
(C)
CADENA:
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87:

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania, teniendo el antígeno la secuencia de aminoácidos citada en el SEQ ID NO: 24.
  2. 2. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de 5 acuerdo con la reivindicación 1.
  3. 3.
    Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 2.
  4. 4.
    Una célula anfitriona transformada o transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 3.
  5. 5.
    Una composición farmacéutica que incluye el polipéptido de la reivindicación 1, o la molécula de ADN aislada de la reivindicación 2 y un portador fisiológicamente aceptable.
    10 6. Una vacuna que incluye el polipéptido de la reivindicación 1 o la molécula de ADN de la reivindicación 2, junto con un intensificador de la respuesta inmunitaria no específico.
  6. 7. Una composición farmacéutica de la reivindicación 5 para su uso en la inducción de inmunidad protectora contra la Leismaniasis en un paciente.
  7. 8. La vacuna de la reivindicación 6 para su uso en la inducción de inmunidad protectora contra la Leismaniasis en un 15 paciente.
  8. 9. La composición farmacéutica de la reivindicación 5 para su uso en la detección de la infección por Leishmania en un paciente.
ES04000341T 1997-02-12 1998-02-12 Antígenos de leishmania para su uso en la terapia y la diagnosis de la leismaniasis. Expired - Lifetime ES2373878T3 (es)

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US08/798,841 US6709661B1 (en) 1995-09-22 1997-02-12 Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis
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US920609 1997-08-27

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