ES2374278T3 - Vacuna canina para la protección contra la erliquiosis. - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna que comprende: una cantidad inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de Ehrlichia canis, en la que dichas cepas de bacterina inactivada comprenden Ehrlichia canis Ebony y Ehrlichia canis Broadfoot, un excipiente farmacológicamente aceptable, y una cantidad inmunogénicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por células

Description

Vacuna canina para la protecci6n contra la erliquiosis

Antecedentes de la invención

La erliquiosis canina es una enfermedad letal producida por Ehrlichia canis (E. canis), un pat6geno intracelular

5 transmitido por la sangre y que infecta a todas las razas de perros en cualquier fase de crecimiento. La erliquiosis canina la transmite principalmente la garrapata marr6n del perro, Rhipicephalus sanguineous, que se cree que es el reservorio principal de la enfermedad. La erliquiosis canina es una enfermedad posiblemente letal que es endemica de los Estados Unidos y que aparece en todo el mundo. Los sintomas normalmente progresan desde una patologia aguda a cr6nica dependiendo de la cepa del organismo y del estado inmune del huesped. En casos agudos, los

10 sintomas incluyen secreci6n nasal y ocular mucopurulenta, deshidrataci6n, hiperplasia reticuloendotelial, fiebre, linfoadenopatia generalizada, esplenomegalia y trombocitopenia. En casos cr6nicos, pueden producirse sintomas variables de anorexia, depresi6n, perdida de estamina, rigidez y reticencia a caminar, edema en las extremidades o en el escroto, y tos o disnea.

Actualmente no existe ninguna vacuna disponible para el tratamiento o la prevenci6n que sea eficaz contra la

15 erliquiosis canina. El tratamiento habitual para todas las formas de erliquiosis es la administraci6n de un antibi6tico, tal como tetraciclina, durante un minimo de 2 semanas para casos agudos, o de 1-2 meses en casos cr6nicos. En casos cr6nicos, las anomalias hematol6gicas pueden persistir durante 3-6 meses, o de por vida. Puede ser necesaria una terapia complementaria para combatir el desgaste y disfunci6n de 6rganos especificos. Claramente, se preferiria la prevenci6n eficaz de la enfermedad en un regimen con antibi6ticos post-infecci6n.

20 Por lo tanto, es un objeto de la presente invenci6n proporcionar una composici6n de vacuna segura y eficaz, util inducir inmunoprotecci6n contra la erliquiosis canina en perros.

Es otro objeto de la presente invenci6n proporcionar un procedimiento para la prevenci6n o mejora de la erliquiosis canina en perros.

Es un objeto adicional de la presente invenci6n proporcionar un procedimiento para inducir la erliquiosis canina en 25 un animal de ensayo. Dicho procedimiento es util para evaluar y estudiar las defensas del huesped y los mecanismos pat6genos y para mejorar el desarrollo de vacunas contra la erliquiosis.

Es una caracteristica de la presente invenci6n que la composici6n de vacuna pueda proteger a los perros contra multiples cepas de E. canis que se originan en una diversidad de regiones geograficas.

Es otra caracteristica de la presente invenci6n que la inmunoprotecci6n eficaz contra la erliquiosis canina pueda 30 impartirse a perros de cualquier edad.

Otros objetos y caracteristicas de la invenci6n seran evidentes a partir de la descripci6n detallada que se expone a continuaci6n en el presente documento.

Sumario de la invención

La presente invenci6n proporciona una composici6n de vacuna segura y eficaz, que comprende: una cantidad

35 inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de Ehrlichia canis en la que dichas cepas de bacterina inactivadas comprenden Erlichia canis ebony y Erlichia canis broadfoot un excipiente farmacol6gicamente aceptable, y una cantidad inmunogenicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por celulas (IMC).

La presente invenci6n tambien proporciona un procedimiento para la prevenci6n o mejora de erliquiosis canina en 40 perros.

Descripción detallada de la invención

El agente causante de la erliquiosis canina es Ehrlichia canis (E. canis), una bacteria gram-negativa del orden Rickettsiales, que aparece individualmente o en inclusiones compactas en leucocitos circulantes de mamiferos y que se trasmite por garrapatas. La erliquiosis canina es endemica en muchas partes de Estados Unidos y se sabe que 45 aparece en todo el mundo. La erliquiosis canina aguda, de origen natural, simula la fiebre maculosa de las Montafas Rocosas. Los casos mas graves se producen en los meses mas calientes, lo que coincide con la mayor actividad del vector de la garrapata. La erliquiosis canina puede ser una enfermedad letal. Muy a menudo es una enfermedad cr6nica que puede afectar a un perro de cualquier edad, produciendo sintomas variables, tales como anorexia, depresi6n, perdida de estamina, rigidez y reticencia a caminar, edema de las extremidades o del escroto, tos o

50 disnea. Hasta el momento, no se conocen tratamientos de vacunaci6n o de inmunizaci6n eficaces disponibles contra la erliquiosis canina.

Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que una composici6n de vacuna, que comprende una cantidad inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de E. canis en la que dichas cepas de bacterina

inactivadas comprenden Erlichia canis ebony y Erlichia canis broadfoot, un excipiente farmacol6gicamente aceptable, y una cantidad inmunogenicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por celulas (IMC), puede administrarse a perros en cualquier etapa de crecimiento para prevenir o mejorar la erliquiosis canina, preferentemente a las 18 semanas de vida o mas.

La bacterina de E. canis adecuada para su uso en la composici6n de vacuna de la presente invenci6n puede ser de una o mas cepas, tales como las denominadas cepa Ebony, Broadfoot, Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venezuela, la cepa Jake de la Universidad del Estado de Carolina del norte (NCSU), los aislados Demon, DJ y Fuzzy de la NCSU, lineas celulares infectadas por E. canis con cualquiera de las cepas designadas, lineas celulares DH82 infectadas por E. canis con cualquiera de las cepas designadas o las lineas celulares DH82 infectadas por E. canis depositadas en la Colecci6n Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD), y con el numero de acceso CRL 10390 proporcionado, segun se desvela en la patente de Estados Unidos numero 5.192.679, o similar. Una bacterina de E. canis adecuada para su uso en la composici6n de vacuna de la presente invenci6n puede ser preferentemente de dos cepas de E. canis, tales como Ebony y Broadfoot.

La cepa Ebony, por ejemplo, tiene una homologia del 99,9 por ciento con la cepa Oklahoma basada en la secuencia de ADN recombinante (ADNr) 16S (es decir, una diferencia de un nucle6tido) [Mathew JS y col., Attempted transmission of Ehrlichia canis by Rhipicephalus sanguineus afterpassage incell culture,Am J Vet Res nov.1998; 57 (11) :1594-8], y se ha demostrado que la garrapata marr6n del perro, (Rhipicephalus sanguineus) (Mathew 1996), en estado ninfa y adulto, puede transmitirla a los perros.

Se ha desvelado que la cepa Florida, contiene un gen principal de proteina inmunorreactiva de 28 kDa conservado (Patente de Estados Unidos N° 8.458.942) y un gen p-30 que pertenece a la familia de genes multiples omp-1 (Patente de Estados Unidos N° 6.432.649). Por otra parte, la Patente de Estados Unidos N° 6.043.085 desvela que la cepa Florida tiene una proteina antigenica inmunodominante de 120 kDa, que contiene 14 repeticiones con 36 aminoacidos cada una, que se supone que esta expuesta en la superficie. Las unidades de repetici6n son hidr6filas y forman el nucleo de las regiones de la proteina expuestas a la superficie y son ricas en serina y en acido glutamico. Cada serina y acido glutamico comprenden el 19% de los aminoacidos de una unidad de repetici6n. Se cree que la cepa Florida es menos virulenta que la cepa Jake de la NCSU de E. canis [Breitschwerdt y col. Doxycycline hyclate treatment of experimental canine Erliquiosis followed by challenge inoculation with two Ehrlichia canis strains, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, feb 1998; 42 (2) :362-68], mientras que la comparaci6n serol6gica con la cepa Oklahoma revel6 una especificidad del 100% y una sensibilidad del 87,5 % [Dawson JE y col. Serologycal comparison of human erliquiosis using two Ehrlichia canis isolates. J Infect Dis. mar 1991; 163 (3) :5647].

Ademas de ser cultivadas en una linea celular canina continua (por ejemplo, DH82) (Keysary A y col. The first isolation, in vitro propagation, and genetic characterization of Ehrlichia canis in Israel, Vet Parasitol abril 1996; 62 (34): 331-40.), la cepa Israel 611 se ha cultivado en una linea celular macr6faga continua de rat6n (por ejemplo, J774.A1) (Keysary A y col. Cultivation of Ehrlichia canis in a contionuous BALB/c mouse macrophage cell culture line, J Vet Diag Invest nov 2001; 13 (6): 521-3). La Israel 611 tiene dos formas de m6rula: (1) completamente empaquetada y (2) holgadamente empaquetada, y la secuencia de su gen de ARNr 16S tiene tres nucle6tidos diferentes a los de la cepa Oklahoma y cuatro nucle6tidos diferentes a los de la cepa Florida, con un hueco de un nucle6tido en cada uno (Keysary, 1996). El grado de diferencia de homologia de la cepa Oklahoma es del 0,54 por ciento, mientras que la diferencia de la cepa Florida es del 0,61 por ciento (Keysary, 1996).

Al igual que la cepa Florida, la cepa Louisiana tiene un gen principal de proteina inmunorreactiva de 28 kDa conservado (Patente de Estados Unidos N° 6.458.942), un gen p 30 que pertenecen a la familia de genes multiples omp-1 (Patente de Estados Unidos N° 6.432.649), y como se desvela en la patente de Estados Unidos N° 6.043.085, una proteina antigenica inmunodominante de 120 kDa, que contiene 14 repeticiones con 36 aminoacidos cada una, que se supone que estan expuestas en la superficie. Las unidades de repetici6n son hidr6filas que forman el nucleo de las regiones de la proteina expuestas a la superficie, y son ricas en serina y acido glutamico. Cada serina y acido glutamico comprenden el 19% de los aminoacidos de una unidad de repetici6n.

Tambien de forma similar, la cepa Oklahoma tiene un gen principal de proteina inmunorreactiva de 28 kDa conservado (Patente de Estados Unidos N° 6.458.942), un gen p-30 que pertenece a la familia de genes multiples omp-1 (Patente de Estados Unidos N° 6.432.649), y como se desvela en la Patente de Estados Unidos N° 6.043.085, una proteina antigenica inmunodominante de 120 kDa, que contiene 14 repeticiones con 36 aminoacidos cada una, que se supone que estan expuestas en la superficie. Las unidades de repetici6n son hidr6filos que forman el nucleo de las regiones de la proteina expuestas a la superficie y son ricas en serina y acido glutamico. Cada serina y acido glutamico comprenden el 19% de los aminoacidos de una unidad de repetici6n. Adicionalmente, McBride JW y col. encontraron que la Oklahoma posee un gen de glucoproteina (2.064 pb) que codifica proteinas de 548 a 688 aminoacidos con supuestas masas moleculares de s6lo 61 y 73 kDa, pero con movilidades electroforeticas de 140 kDa (P140), respectivamente. El gen de la proteina de 140 kDa tiene catorce (14) unidades de repetici6n, casi identicas de 108 pb dispuestas en tandem. La regi6n de 14 repeticiones (78%) del gen P140

(1.620 pb), se expres6 en Escherichia coli. La proteina recombinante present6 masas moleculares que variaban de 1,6 a 2 veces mas que las previstas por las secuencias de aminoacidos. Los anticuerpos contra las proteinas

recombinantes reaccionan con P140 de E. canis. Se detectaron hidratos de carbono en las proteinas recombinantes de E-canis. Un analisis de la composici6n de hidratos de carbono identific6 glucosa, galactosa y xilosa en las proteinas recombinantes. La presencia de un solo sitio para la glucosilaci6n unida a N (Asn-Xaa-Ser/Thr), una falta de efecto de N-glucosidasa, la presencia de 70 y 126 sitios de glucosilaci6n Ser/Thr en las regiones de repetici6n P120 y P140, respectivamente, y una alta relaci6n molar de hidratos de carbono frente a la proteina sugieren que los glucanos pueden unirse al O (McBride JW y col. Glycosilation of Homologous Immunodominant Proteins of Ehrlichia chaffeensis and Eherlichia canis. Infection and Immunity, enero de 2000, 68 (1 ):13-18). La Oklahoma puede cultivarse en la linea celular macr6faga canina DH82 en un medio esencial minimo que contiene un 12,5% de suero bovino fetal y L-glutamina 200 mM (Bowie, MV y col. Potential value of major antigenic protin 2 for serological diagnosis of heartwater and related Ehrlichial infections, Clin Diagnostic Lab. Immun, Mar; 1999, 6 (2):209-15). Una comparaci6n serol6gica con la cepa FL revel6 una especificidad del 100% y una sensibilidad del 87,5% (Dawson 1991, mencionado anteriormente). Se ha encontrado una similitud del 99,9 por ciento, sobre la base de la secuencia de ADNr de 16S, con las cepas Ebony (Mathew 1996), Kagoshima 1 (Unver A y col. Analysis 16S rRNA gen sequences of Ehrlichia canis, Anaplasma platys, and Wolbachia species from canine blood in Japan, Ann NY Acad. Sci. 2003 Jun; 990:692-8) y Venezuela (Unver A y col. Molecular antiogenic comparison of Ehrlichia canis isolates from dogs, ticks, and a human in Venezuela, J Clin Microbiol agosto 2001; 39 (8): 2788 -93).

Para los aislados Demon, DJ y Fuzzy de la NCSU y la cepa Jake, todos poseen un gen principal de proteina inmunorreactiva de 28 kDa conservado (Patente de Estados Unidos N° 6.458.942). Se ha desvelado que DJ, Fuzzy y Jake tambien tienen un gen p 30 que pertenece a la familia de genes multiples omp-1 (Patente de Estados Unidos N° 6.432.649). Se cree que la cepa Jake es mas virulenta que la Florida (Breitschwerdt 1998, mencionado anteriormente).

Se encontr6 que casi toda la secuencia de RNAr de 16S de Kagoshima 1 era mas similar a las secuencias de las cepas Oklahoma y Venezuela de E. canis (un par de bases de diferencia entre 1.387) con un de 99,9 por ciento de identidad de secuencia (Unver de 2003, mencionado anteriormente). Ademas, y de manera similar, para su alta identidad de secuencia con respecto a la cepa Kagoshima 1, la cepa Venezuela tiene una similitud del 99,9 por ciento con respecto a la cepa Oklahoma en base a la secuencia de ADNr de 16S (Unver 2001).

En la realizaci6n practica preferida, la bacterina de E. canis se cultiva en una linea celular canina macr6faga de monocitos, denominada a veces, celulas macr6fagas caninas continuas o linea celular macr6faga canina, mantenida en un medio que contiene RPMI1640 complementado con suero bovino fetal, glucosa y glutamina. Preferentemente, las celulas se cultivan en un medio de mantenimiento que puede ser RPMI1640, OptiMEM, o AIM V, preferentemente RPMI1640, complementado con hasta el 10% de suero bovino fetal, hidrolizado de lactalbumina al 0,5%, Polimixina B 30 μg/ml, piruvato de sodio 110 μg/ml, bicarbonato de sodio 2,5 mg/ml, glucosa 4 mg/ml, Lglutamina 6 mg/ml, sulfato de magnesio 0,55 mg/ml, y se cultivan durante hasta 95 dias, preferentemente durante hasta 35 dias, mas preferentemente entre 5 y 10 dias, para conseguir una dosificaci6n DICT50 ≥ 1x104 (Dosis Infecciosa de Cultivo de Tejido), y despues el cultivo se recoge y se procesa para la inactivaci6n.

Despues, la bacterina E. canis obtenida de esta manera puede inactivarse por medios de inactivaci6n convencionales. Por ejemplo, inactivaci6n quimica usando agentes de inactivaci6n quimicos, tales como etilenimina binaria, beta-propiolactona, formalina, mertiolato, gluteraldehido, dodecil sulfato de sodio, o similares, o una mezcla de los mismos, siendo la formalina el agente de inactivaci6n preferido. La bacterina tambien puede inactivarse por calor o con psoraleno en presencia de luz ultravioleta.

La cantidad inmunizante eficaz de bacterina de E. canis inactivada puede variar dependiendo de la cepa o cepas seleccionadas y puede ser cualquier cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunoprotectora. Son adecuadas cantidades en las que la unidad de dosificaci6n comprende al menos aproximadamente una DICT50 de 1x104 de bacterina de E. canis inactivada.

Como se usa en el presente documento, la expresi6n "agente inductor de una respuesta de anticuerpos" indica cualquier compuesto o combinaci6n de compuestos, capaces de potenciar una respuesta inmune humoral. Son ejemplos tipicos el copolimero de anhidrido maleico de etileno (EMA), emulsiones de latex de un copolimero de estireno con una mezcla de acido acrilico y metacrilico, tales como Neocryl® A-640 (Avecia Neo Resius, Frankfort, IN), hidr6xido de aluminio, o similares, o una mezcla de los mismos. El agente inductor de una respuesta de anticuerpos de la presente invenci6n es preferentemente una mezcla de EMA y Neocryl®. Neocryl® es el nombre comercial registrado de Avecia BV, Sluisweg 12 P.O. Box 123 NL-5140 AC Waalwijk Paises Bajos, para polimeros y copolimeros acrilicos de transmisi6n hidrica. El numero A640 indica una calidad del mismo. Neocryl® A640 es un copolimero acrilico acuosoconestireno no combinado, quetiene un pHde 7,5,unaviscosidad de100 cps (25 'C Brookfield), un peso de 1,03 g/cm3 que se suministra con un 40 por ciento en peso de s6lidos, una gravedad especificade1,30mg/l,unatemperaturadetransici6n vitrea(Tg) de 44 'C,unatemperatura minimaformadora de pelicula (TMFP) de 40 'C y un indice de acidez (no volatil) de 50. Especificamente, Neocryl® A640 es un copolimero acrilico acuoso con estireno no combinado. Mas especificamente, Neocryl ® A640 es una emulsi6n de latex de un copolimero de estireno con una mezcla de acido acrilico y metacrilico.

En la presente invenci6n, son calidades utiles adecuadas del copolimero EMA los copolimeros lineales de etileno anhidrido maleico, tales como EMA-31 (Monsanto Co., St. Louis, MO), que es un copolimero acido funcional. Estos

copolimeros son solubles en agua, finos y blancos, sin polvos fluyendo que tienen las siguientes propiedades tipicas: un punto de reblandecimiento de aproximadamente de 170 'C, una temperatura de descomposici6n de aproximadamente 247 'C, un pH de 2,3 (soluci6n al 1%), y una viscosidad especifica de 0,9-1,2 g/100 ml (soluci6n en dimetilformamida al 1%).

La expresi6n "agente inductor de una respuesta inmune mediada por celulas (IMC)", como se usa en el presente documento, indica cualquier agente, o combinaci6n de agentes, capaces de potenciar una respuesta inmune celular. Son ejemplos tipicos agentes biol6gicos, tales como una cepa atenuada de Mycobacterium bovis, Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) (Calbiochem, La Jolla, CA) o similares, y las citocinas relacionadas con Th1, tales como interleucina-12 (IL-12), interleucina-18 (IL-18), interfer6n gamma o similares, preferentemente IL-12; o sustancias que son emulsiones de aceite en agua, tales como emulsi6n de aceite de parafina en agua como EMULSIGEN® SA (MVP Laboratories, Ralston , NE), aceite SP (una composici6n de escualeno, Pluronic® 121 L y Tween® 80 (el escualeno es de VWR / Kodak, Rochester, NY, y el Pluronic® L121 disponible de BASF, Mt. Olive, Nueva Jersey), SAF- 1 (Syntex adyuvante Formulaci6n-1, una composici6n de analogo de treonilo de dipeptido muramilico con Tween 80, Pluronic® L121 y escualeno, descrita por Byars, NE y Allison, AC, Vaccine, 5(3):223-28) o similares, preferentemente, EMULSIGEN® SA y mas preferentemente, una emulsi6n de aceite en agua. EMULSIGEN® es una marca registrada de Modern Veterinary Products, 5404 Miller Ave. Omaha, Nebraska 68127, EE.UU., para adyuvantes antigenicos veterinarios de una naturaleza de aceite en agua emulsionada. Las letras SA indican una calidad de la misma. EMULSIGEN® SA, una parafina emulsionada en una base oleosa adyuvante, es de color blanco lechoso cuando se mezcla con caldo de soja triptica (TSB) (concentraci6n final al 20%), con una viscosidad de 25-50 cps (viscosimetro de Brookfield LV, huso n° 18, a 30 rpm), y comprende al menos un 80% de gotitas en fase oleosa menores o iguales a ocho (8) micr6metros. Pluronic® es una marca registrada de BASF Corporation para copolimeros de bloque de 6xido de etileno y 6xido de propileno y el numero L121 indica una calidad del mismo.

Las cantidades inmunogenicamente estimulantes del sistema adyuvante pueden variar de acuerdo con el agente inductor de una respuesta de anticuerpos, el agente inductor de IMC, el componente de bacterina E. canis, el grado de una posible exposici6n infecciosa, el procedimiento de administraci6n de la composici6n de vacuna, la etapa de crecimiento y el tamafo del perro, o similares. Por otra parte, las cantidades inmunogenicamente estimulantes del sistema adyuvante son cantidades que son suficientes para potenciar una respuesta inmune frente al agente inmunizante - bacterina de E. canis. En general, son adecuadas cantidades de aproximadamente el 1% al 6% vol/vol, preferentemente de aproximadamente el 4% vol/vol del agente inductor de una respuesta de anticuerpos y de aproximadamente el 3% al 7% vol/vol, preferentemente del 5% vol/vol, del agente inductor de IMC.

Los excipientes farmacol6gicamente aceptables adecuados para su uso en la composici6n de vacuna de la invenci6n pueden ser cualquier excipiente liquido convencional adecuado para composiciones farmaceuticas veterinarias, y preferentemente es una soluci6n salina equilibrada, de manera que sea adecuada para su uso en medios de cultivo de tejido.

Ademas de la bacterina inactivada de E. canis como principio activo, se contempla que la composici6n de vacuna de la invenci6n tambien pueda contener otros componentes activos, tales como un componente antipat6geno dirigido contra el virus de la rabia, enfermedad de Lime (Borrelia burgdorferi), virus del moquillo canino, parvovirus canino, adenovirus canino, coronavirus canino, Giardia; Leptospira interrogans tales como las serovariedades canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa o bratislava o similares, o una combinaci6n de los mismos.

En una realizaci6n de la invenci6n, el componente inactivado de la bacterina de E. canis de la invenci6n puede incorporarse en liposomas usando tecnologia conocida tal y como se describe en Nature, 1974, 252, 252 a 254 o Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-1113. En otra realizaci6n de la invenci6n, el componente inactivado de la bacterina de E. canis de la invenci6n puede conjugarse con compuestos biol6gicos adecuados tales como polisacaridos, peptidos, proteinas, o similares, o una combinaci6n de los mismos.

En una realizaci6n preferida de la invenci6n, la composici6n de vacuna de la invenci6n puede formularse en una forma unitaria de dosificaci6n para facilitar la administraci6n y garantizar uniformidad de la dosificaci6n. En el presente documento, una unidad de dosificaci6n en lo que respecta a la composici6n de vacuna se refiere a unidades fisicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la bacterina de E. canis calculada para producir el efecto inmunogenico deseado junto con el sistema adyuvante y excipiente o vehiculo necesarios.

La composici6n de vacuna de la invenci6n pueden administrarse por via parenteral, por ejemplo, por via intramuscular, por via subcutanea, por via intraperitoneal, por via intradermica o similares, preferentemente, por via subcutanea o por via intradermica, y mas preferentemente, por via subcutanea, o dicha composici6n puede administrarse por via oral o por via intranasal.

Por consiguiente, la presente invenci6n tambien proporciona la composici6n como se describe en el presente documento para la prevenci6n o la mejora de erliquiosis canina en perros

En la realizaci6n practica preferida, la composici6n de vacuna de la invenci6n se administra por via parenteral, por via oral, o por via intranasal, preferentemente por via parenteral, mas preferentemente por via subcutanea, en

cantidades efectivas de acuerdo a un programa determinado por el tiempo de posible exposici6n a un transmisor de la bacteria E. canis. De esta manera, el animal tratado puede tener tiempo para crear inmunidad antes de la exposici6n natural. Por ejemplo, un programa de tratamiento tipico puede incluir la administraci6n parenteral, preferentemente por inyecci6n subcutanea, al menos 5 semanas antes de una posible exposici6n. Se prefieren al menos dos administraciones, por ejemplo, la primera a aproximadamente 5 semanas y una segunda a aproximadamente 2 semanas antes de una posible exposici6n de los animales tratados.

Los cultivos viables de cada una de E. canis Broadfoot (denominada a veces E. canis BF, o Broadfoot), y E. canis Ebony (denominada a veces Ebony) se han depositado (11 de febrero del 2004) en la ATCC (en los terminos y requisitos del Tratado de Budapest en relaci6n con el dep6sito de microorganismos para los fines de un procedimiento de patente), y se les ha otorgado, respectivamente, los numeros de referencia de la ATCC, PTA-5811 para la cepa Broadfoot y PTA-5812 para la cepa Ebony.

Para una comprensi6n mas clara de la invenci6n, a continuaci6n se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y se entiende que no limitan el alcance ni los principios subyacentes de la invenci6n de ninguna manera. De hecho, diversas modificaciones de la invenci6n, ademas de las mostradas y descritas en el presente documento, seran evidentes para los expertos en la materia a partir de los ejemplos que se exponen a continuaci6n en el presente documento y len a descripci6n anterior. Dichas modificaciones tambien pretenden incluirse dentro del ambito de las reivindicaciones adjuntas.

Al menos que se indique lo contrario, todas las partes son partes en peso.

EJEMPLO 1

Evaluación de un modelo de exposición virulento de E. canis

A. Preparación de la reserva de exposición

Se realizaron pases repetidos de la bacteria viva E. canis cepa Ebony en perros. Las muestras de sangre completa de los perros infectados se centrifugaron a 2500 x g durante 15 minutos. La capa leucocitaria se recogi6 y se diluy6 con soluci6n tamponada con fosfato (PBS), despues se estratific6 sobre Histopaque® 1077 y el material estratificado se centrifug6 a 400 x g durante 45 minutos. Se recogieron las CMSP y se lavaron con PBS. Las CMSP lavadas se mezclaron con suero bovino fetal al 20% y dimetilsulf6xido al 10% y se congelaron en nitr6geno liquido. Antes de su uso, la reserva de exposici6n se diluy6 con soluci6n salina tamponada hasta una diluci6n final de 1:3 o 1:4 de reserva de exposici6n: soluci6n salina tamponada.

B. Procedimiento de exposición

En esta evaluaci6n, se distribuyeron, de forma aleatoria en dos grupos, 20 perros de edades comprendidas entre 8 a 12 meses de vida. Los perros se expusieron mediante la via subcutanea con 1 ml de la reserva de exposici6n. Un grupo se expuso con una diluci6n 1:3 de reserva de exposici6n y el resto del grupo se expuso con una diluci6n 1:4 de reserva de exposici6n. Despues de la exposici6n, se observ6 a los perros y se extrajeron muestras de sangre 3 x por semana para controlar los sintomas clinicos de la enfermedad, incluyendo trombocitopenia, durante un total de 56 dias.

C. Observaciones

Los sintomas clinicos observados incluyeron secreciones nasales y oculares mucopurulentas, depresi6n, deshidrataci6n, linfadenopatia y edema corneal. Las secreciones oculares mucopurulentas y la deshidrataci6n fueron los sintomas observados con mas frecuencia. Las secreciones oculares mucopurulentas y la deshidrataci6n son especificas del progreso de la enfermedad y reflejan indirectamente la gravedad de la enfermedad. Para cada sintoma clinico se registr6 una incidencia por punto de tiempo de observaci6n y se compar6 la incidencia total entre los grupos. De los puntos de tiempo observados, el 53% (diluci6n 1:3) y el 35% (diluci6n 1:4) tuvieron secreci6n ocular mucopurulenta y el 44% (diluci6n 1:3 ) y el 30% (diluci6n 1:4) tuvieron deshidrataci6n.

En esta evaluaci6n tambien se observ6 una tasa de mortalidad significativamente elevada. La inducci6n de mortalidad es el indicador mas llamativo de la fuerte patogenesis de la bacterina de E. canis usada en la reserva de exposici6n. Para el tratamiento de diluci6n 1:3, el 100% de los perros cumplieron la definici6n del evento de erliquiosis y para el tratamiento de diluci6n 1:4, el 80% cumplieron la definici6n del evento de erliquiosis. Los datos se muestran en la Tabla I.

Se registraron las temperaturas rectales como un indicador de infecci6n por Ehrlichia. La mayoria de los perros infectados tuvieron alguna incidencia de temperatura rectal elevada. Los datos se muestran en la Tabla II.

Se observ6 trombocitopenia (recuento de plaquetas en sangre por debajo de 200.000 /μl) comenzando aproximadamente a los 12 dias despues de la exposici6n (DPC) y durante el resto del periodo observado. Los datos se muestran en la Tabla III.

Conclusiones

El modelo de exposici6n descrito anteriormente en el presente documento produjo graves sintomas clinicos de erliquiosis canina en perros y proporcion6 una definici6n de evento de enfermedad de erliquiosis para su uso en estudios posteriores y evaluaci6n de tratamientos para esta. La definici6n de evento clinico de erliquiosis canina se definira por mortalidad, al menos tres dias de observaci6n consecutivos de secreci6n ocular mucopurulenta y/o al menos tres dias de observaci6n consecutivos de deshidrataci6n.

TABLA I

Número de

Incidencia total de animales con

síntomas clínicos síntomas % de animales con Duración media

clasificados durante 3 días síntomas durante 3 de síntomas Dilución Síntomas clínicos consecutivos días consecutivos clínicos

Secreci6n nasal

1:3

mucopurulenta 1/10 10% 0,5 dias 5

Secreci6n ocular

1:3

mucopurulenta* 7/10 70% 4,8 dias 48

1:3

Depresi6n 2/10 20% 1,1 dias 11

1:3

Deshidrataci6n* 6/10 60% 4,0 dias 40

1:3

Linfadenopatia 0 0 0 0

1:3

Edema corneal 1/10 10% 1,2 dias 12

1:3

Muerte* 9/10 90% Secreci6n nasal

1:4

0 0 0,1 dias 1

mucopurulenta Secreci6n ocular

1:4

mucopurulenta 7/10 70% 3,8 dias 40

1:4

Depresi6n 0 0 0,7 dias 7

1:4

Deshidrataci6n* 5/10 50% 3,4 dias 34

1:4

Linfadenopatia 0 0 0 0

1:4

Edema corneal 1/10 10% 0,5 dias 5

1:4

Muerte* 4/10 40% ND

* Los sintomas se incluyen en la definici6n del evento de erliquiosis.

TABLA II Temperatura rectal en ºC -Post-exposición Dilución 12 días 14 días 28 días 42 días 56 días

1:3

40,39 40,94 ND ND ND

1:3

39,50 39,56 39,22 37,33 ND

1:3

39,00 39,44 39,72 ND ND

1:3

39,39 39,39 39,00 32,28 ND

1:3

39,00 39,28 39,78 38,94 ND

1:3

39,17 39,44 40,28 38,61 ND

1:3

40,22 40,06 40,44 39,33 38,83

1:3

39,56 39,44 40,06 38,33 ND

1:3

39,22 39,22 40,56 38,39 ND

1:3

39,72 29,28 39,22 39,61 38,83

1:4

39,06 38,78 40,61 38,94 ND

1:4

39,39 39,39 40,00 32,89 ND

1:4

38,94 39,11 40,50 38,61 38,61

1:4

39,39 38,94 39,83 38,89 38,72

1:4

39,22 39,17 40,67 39,22 38,78

1:4

38,89 39,00 39,94 39,44 38,33

1:4

39,72 40,11 39,94 38,67 ND

1:4

39,39 39,50 38,44 39,17 38,39

1:4

38,78 38,89 40,78 39,44 38,44

1:4

39.61 38,89 39,83 ND ND

TABLA III Recuento de plaquetas en sangre 103/ l - Post-exposición

Dilución 0 Días 12 Días 14 Días 19 Días 21 Días 26 Días 28 Días 33 Días 39 Días 56 Días

1:3

407 155/185 101/91,4 1,42/2,95 599/1,24 ND ND ND ND ND

1:3

301 269 164/126 3,3/1,16 4,76/4,9 48,7/50,5 55,5 78,3 4 ND

1:3

497 321 135/164 57,7/41,6 53,8/56,2 107/105 120,0 163 54,3 ND

1:3

534 458 293 2,03/1,29 0,426/1,87 14,6/31,6 8,06 4 5,78 ND

1:3

308 260 205 33,2/20,1 9,59/7,31 6,13/1,89 5,9 52 38,6 ND

1:3

300 374 329 79,2/83 3,47/2,84 0/0,698 2,99 0,788 0,55 ND

1:3

398 360 221 51,41/41,1 50,3/49,6 4,42/6,21 54,6 87,1 62 33,8

1:3

464 413 306 39,2/38 6,38/6,56 55,3/39,3 58,3 97 3,17 ND

1:3

281 225 139/143 1,9/1,41 0/0 5,5/3,55 7,3 2,61 4,2 ND

1:3

263 400 1611162 0,446/0,388 0,612/1,741 7,41/9,23 7,31 8,89 4,82 86,4

1:4

343 342 378 287 139/130 2,71/4,11 1,58 44,9 59,9 ND

1:4

411 343 246 1,61/2,19 1.74/,795 8,58/19,8 6,37 2 ,887 ND

1:4

329 434 452 172/193 109/122 5,45/3,08 3,5 2,47 1,99 0,0

1:4

283 289 156/152 98,1/106 50,4/61,6 6,25/3,84 13,2 56,7 57,1 50,8

1:4

286 269 207 63,9/63 13,6/11,3 104/97,2 18,1 55,9 56,4 68,7

1:4

445 609 490 165/190 89,3/84,6 43,1/42,3 3,32 1,84 1,89 51,3

1:4

306 284 146/141 73,8/54,2 30,21/21,2 8,62/5,07 12,2 9,8 3,73 ND

1:4

315 231 204 38,9/9,96 4,73/2,34 3,17/4,86 10,7 5,37 1,08 81,1

1:4

296 249 380 296 228 55,1 /51,1 42,6 82,9 59 93,1

1:4

317 281 153/182 2,07L689 4,5/5,78 8,58/8,37 8,18 46,1 ND ND

Ejemplo 2

Evaluación de la eficacia inducida por la bacterina de E. canis con adyuvante de BCG

El BCG, una preparaci6n en autoclave de Mycobacterium bovis atenuada, se reconoce como un potente inductor de inmunidad mediada por celulas (IMC). Para determinar los efectos sinergicos de la IMC, la bacterina de E.canis se mezcl6 con adyuvante de BCG a diferentes niveles de concentraci6n. Estudios previos demostraron que la bacterina de E. canis mezclada unicamente con adyuvantes caninos convencionales (que inducen respuestas a anticuerpos) (tales como EMA y Neocryl®) s6lo fueron capaces de inducir una fuerte inmunoprotecci6n secundaria.

A. Materiales y Procedimientos

Se usaron tres grupos de vacunaci6n de 7 perros cada uno y un grupo de control de 6 perros. La vacuna contenia 5 log de DICT50 (dosificaci6n pre-inactivada) de la bacterina de la cepa Ebony de E. canis mezclada con adyuvantes con las siguientes combinaciones de adyuvantes. La vacuna A contenia la bacterina de borrelia burgdoferi (BBB) y EMA/Neocryl®. La vacuna B contenia la bacterina borrelia burgdoferi (BBB), EMA®/Neocryl y 100 μg/dosis de BCG. La Vacuna C contenia la bacterina de borrelia burgdoferi (BBB), EMA/Neocryl® y 1,0 mg/dosis de BCG. Los otros componentes de las tres vacunas eran identicos. El grupo de control de perros no se vacun6.

Los 27 perros se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos. Los primeros tres grupos de 7 perros cada uno, se vacunaron dos veces con la vacuna A, B o C por via subcutanea en un intervalo de 21 dias. El cuarto grupo de 6 perros sirvi6 como control y no recibi6 vacunaci6n. Dieciseis dias despues de la segunda vacunaci6n, todos los perros se expusieron con E. canis virulenta y se observaron durante un total de 56 dias para detectar sintomas clinicos, tomar las temperaturas rectales y detectar cambios de recuentos de plaquetas en sangre.

B. Resultados y Discusión

Los resultados se resumen en la Tabla IV. Cincuenta y seis dias despues de la exposici6n a E. canis virulenta, cuatro de los siete perros (57%), del grupo inoculado con la Vacuna A, mostraron trombocitopenia y temperaturas rectales elevadas. En el grupo inoculado con la vacuna B se observaron los mismos resultados. En los perros del grupo inoculado con la vacuna C, s6lo dos de los 7 (28,5%) perros vacunados mostraron trombocitopenia y temperaturas rectales elevadas durante el estudio. Cinco de los seis de los perros de control (83%) mostraron trombocitopenia y temperaturas rectales elevadas. Los sintomas clinicos de cada grupo se mezclaron y no hubo diferencias entre los grupos. Los cambios de temperatura corporal y recuentos de trombocitos fueron sintomas tipicos de infecci6n por E. canis y erliquiosis.

TABLA IV

Grupo

Componentes de la vacuna Cantidad de perros con trombocitopenia Cantidad de perros con fiebre

Vacuna A

bacterina de E. canis + BBB1 + EMA2/Neocryl® A6403 4 de los 7 perros (57%) 4 de los 7 perros (57%)

Vacuna B

bacterina de E. canis + BBB + EMA/ Neocryl® A640 + 100 μg/dosis de BCG4 4 de los 7 perros (57%) 4 de los 7 perros (57%)

Vacuna C

bacterina de E. canis + BBB + EMA/ Neocryl® A640 + 1,0 mg/dosis de BCG 2 de los 7 perros (28.5%) 2 de los 7 perros (28.5%)

Control

Ninguno 5 de los 6 perros (83%) 5 de los 6 perros (83%)

1 BBB = bacterina de borrelia burgdoferi procedente de las series de producci6n de Fort Dodge Animal Health. 2 Fabricada por Monsanto Co., St. Louis, MO. 3 Fabricada por AVECIA Neo Resius, Frankfort, IN 4 BCG = Bacilo de Calmette-Guerin, que es mycobacterium bovis atenuada, procedente de Calbiochem, La Jolla, CA.

Los resultados de este estudio mostraron claramente que la vacuna mezclada unicamente con adyuvante convencional (que inducen respuestas a anticuerpos) (EMA + Neocryl®) no fue protectora. Lo mismo ocurri6 cuando se us6 la vacuna mezclada con adyuvante con menor dosis de BCG, tal como, 100 μg/dosis. Sin embargo, la vacuna se volvi6 protectora cuando se mezcl6 con adyuvante BCG a 1 mg/dosis. Por lo tanto, la inmunoprotecci6n inducida por un inductor de IMC, BCG, a una concentraci6n suficiente para potenciar la respuesta inmune, da como resutado

una vacuna de bacterina de E.Canis eficaz.

C. Conclusión

La IMC es necesaria para proteger a los perros de infecci6n por E. canis. La bacterina de E. canis mezclada solo con un adyuvante canino convencional, no es eficaz induciendo inmunoprotecci6n in vivo.

EJEMPLO 3 Preparación de una composición de vacuna de E. canis inactivada

Se cultivaron dos cepas de bacterina de E. canis, Ebony y Broadfoot, cada una en celulas DH82 mantenidas en un medio que contenia RPMI1640 complementado suero bovino fetal del 5% al 7%, glucosa al 2% y glutamina 2 moles durante 5 a 14 dias. Los cultivos resultantes se recogieron a una dosificaci6n DICT50 ≥ 1x104. Los cultivos recogidos son ajustaron, se lisaron y despues se inactivaron por adici6n de una soluci6n de formalina al 0,1%, se incubaron a 36 ± 2 'Cdurante un periodode 24-48horas, se afadi6 otra parte de formalina al 0,1% yse incub6 una segunda vez a 36 ± 2 °C durante 24-48 horas. Las dos cepas inactivadas de E. canis se mezclaron entre si a una misma dosis DICT50 de 1x104,5 con el sistema adyuvante descrito a continuaci6n para proporcionar la composici6n de vacuna A.

Composición de vacuna A

Descripción del principio Cantidad por ml

Ebony de E. canis inactivada DICT50 de 1x104,5 Broadfoot deE. canis inactivada DICT50 de 1x104,5 EMA1-31 1% vol/vol NEOCRYL®2 A-640 3% vol/vol Emulsigen®3 SA 5% vol/vol MEM4 C.S. hasta el 100%

1 Fabricado por Monsanto Co., St. Louis, MO. 2 Fabricado por AVECIA Neo Resius, Frankfort, IN 3 Fabricado por MVP Laboratories, Inc., Ralston, NE 4 Medio Esencial Minimo (MEM) fabricado por LTI, Grand Island, NY

EJEMPLO 4

Evaluación de inmunidad, de doce meses de duración, inducida por la composición de vacuna A contra E. canis

En esta evaluaci6n, perros de raza beagle de 15 a 16 semanas de vida, se dividieron en 2 grupos, un grupo de control de 15 perros (no vacunados) y un grupo de 27 perros vacunados. El grupo de perros vacunados recibi6 dos dosis de 1 ml de la composici6n de vacuna A, descrita en el Ejemplo 3, a un intervalo de 21 dias. Doce meses despues de la vacunaci6n, todos los animales de ensayo se expusieron, por via subcutanea, con una diluci6n 1:3 de un grupo de exposici6n congelado establecido de celulas mononucleares de sangre periferica (cmsp) infectadas por

E. canis, como describe en el ejemplo 1. Los animales de ensayo se observaron 3 x por semana comenzando a los 12 dias despues de la exposici6n (DPC). De conformidad con el bienestar animal y con las directrices del Institutional Animal Care y Use Committee (IACUC), cualquier animal de ensayo que estuviera moribundo o en un mal estado de salud se examin6 de cerca por veterinarios con licencia estatal.

Las muestras de suero se evaluaron para determinar anticuerpos de E. canis usando un K-ELISA para cuantificar la respuesta inmune despues de la vacunaci6n. Las muestras de suero se afadieron por duplicado a los pocillos revestidos con proteinas de extracto de celulas enteras de E. canis. Despues, a cada pocillo se le afadi6 inmunoglobulina (IgG) anticanina de cabra conjugada con peroxidasa y las placas se incubaron a 36 ± 2 'C durante 30 minutos. Despues de la retirada del conjugado no unido, las placas se revelaron usando un sistema substitutivo de ATBS. Las placas se leyeron a 405-490 μm durante 20 minutos a intervalos de 35 segundos usando un modo cinetico. Los resultados serol6gicos se muestran en la Tabla V en la que DPVI indica los dias despues de la primera dosis de vacuna; DPV2 indica los dias despues de la segunda dosis de vacuna; MPV2 indica los meses despues de la segunda dosis de vacuna, y DPC indica los dias despues de la exposici6n.

Observaciones

Como puede observarse a partir de los datos serol6gicos de la Tabla V, el grupo vacunado mostr6 un aumento significativo de anticuerpos sobre el grupo de control (no vacunados). Tambien se observ6, despues de la exposici6n, una diferencia significativa en anticuerpos entre los grupos de control y los vacunados. Ademas de los 5 datos serol6gicos, se registraron valores de hematocrito, recuentos de plaquetas, temperaturas rectales y pesos corporales semanales. El porcentaje de hematocrito fue significativamente menos bajo en el grupo vacunado, en comparaci6n con el grupo de control. Los recuentos de plaquetas fueron significativamente menos bajos en el grupo de los vacunados, en comparaci6n con el grupo de control a los 44 dias despues de la exposici6n. La perdida de peso fue significativamente menor en los vacunados en comparaci6n con el grupo de control. En el grupo de control,

10 el 87 por ciento cumplia con la definici6n de evento de erliquiosis canina, incluida la mortalidad. En el grupo de vacunados, el 44 por ciento cumplia con la definici6n de evento de erliquiosis canina durante los 56 dias del periodo de observaci6n clinico.

Conclusiones

La composici6n de vacuna contra E. canis del Ejemplo 3 redujo significativamente la erliquiosis clinica canina en

15 perros. La administraci6n de dos dosis de 1 ml de dicha vacuna indujo inmunidad durante un periodo de al menos 12 meses. Se obtuvo un aumento significativo de anticuerpos contra E. canis en perros mediante la administraci6n de la composici6n de vacuna del Ejemplo 3.

TABLA V

Respuesta de anticuerpos a la vacuna de E.canis inactivada

Grupo de tratamiento

0 DPV1 0 DPV2 14DPV2 3 MPV2 5 MPV2 9 MPV2 0 DPC 14 DPC

Control

0,000 0,000 0,000 0,072 0,054 0,052 0,030 1,024

Control

0,036 0,006 0,003 0,006 0,003 0,000 0,007 0,773

Control

0,036 0,007 0,005 0,000 0,006 0,000 0,004 0,899

Control

0,000 0,000 0,018 0,000 0,003 0,000 0,000 0,800

Control

0,112 0,027 0,000 0,002 0,005 0,000 0,000 0,916

Control

0,089 0,011 0,023 0,000 0,000 0,005 0,003 0,426

Control

0,006 0,001 0,002 0,002 0,000 0,001 0,002 0,186

Control

0,188 0,065 0,044 0,027 0,020 0,019 0,015 0,426

Control

0,054 0,028 0,021 0,000 0,003 0,002 0,000 0,915

Control

0,008 0,000 0,000 0,006 0,000 0,002 0,000 0,442

Control

0,072 0,011 0,000 0,004 0,004 0,005 0,000 0,364

Control

0,014 0,004 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 0,536

Control

0,223 0,098 0,057 0,008 0,009 0,006 0,022 0,675

Control

0,064 0,057 0,033 0,002 0,001 0,001 0,003 0,168

Control

0,034 0,014 0,004 0,002 0,001 0,001 0,000 0,068

Media

0,062 0,022 0,014 0,009 0,007 0,006 0,006 0,574

Vacunados

0,022 0,825 0,976 0,503 0,422 0,349 0,294 1,016

Vacunados

0,028 0,533 0,951 0,245 0,113 0,118 0,121 0,859

Vacunados

0,074 0,810 0,966 0,361 0,216 0,236 0,159 0,964

(continuaci6n)

Respuesta de anticuerpos a la vacuna de E.canis inactivada

Grupo de tratamiento

0 DPV1 0 DPV2 14DPV2 3 MPV2 5 MPV2 9 MPV2 0 DPC 14 DPC

Vacunados

0,035 0,307 0,924 0,246 0,146 0,137 0,091 0,947

Vacunados

0,052 0,377 0,636 0,070 0,034 0,034 0,036 0,663

Vacunados

0,000 0,303 0,889 0,143 0,107 0,067 0,077 0,768

Vacunados

0,061 0,335 0,740 0,097 0,122 0,084 0,061 0,831

Vacunados

0,005 0,403 0,949 0,224 0,191 0,227 0,172 0,772

Vacunados

0,038 0,477 0,885 0,122 0,097 0,158 0,124 0,599

Vacunados

0,020 0,407 0,816 0,075 0,059 0,079 0,045 0,633

Vacunados

0,042 0,463 0,853 0,167 0,101 0,050 0,061 0,886

Vacunados

0,032 0,648 0,945 0,278 0,187 0,185 0,177 1,002

Vacunados

0,050 0,150 0,745 0,196 0,127 0,103 0,071 0,593

Vacunados

0,135 0,652 0,856 0,139 0,080 0,054 0,062 0,866

Vacunados

0,061 0,268 0,900 0,231 0,133 0,089 0,075 0,711

Vacunados

0,119 0,606 0,893 0,243 0,184 0,125 0,101 0,761

Vacunados

0,039 0,335 0,888 0,113 0,062 0,056 0,047 0,734

Vacunados

0,015 0,231 0,911 0,120 0,068 0,051 0,061 0,743

Vacunados

0,030 0,390 0,957 0,108 0,085 0,094 0,048 0,773

Vacunados

0,008 0,295 0,879 0,290 0,209 0,121 0,196 0,828

Vacunados

0,055 0,262 0,737 0,105 0,065 0,076 0,060 0,531

Vacunados

0,041 0,297 0,989 0,306 0,089 0,052 0,145 0,873

Vacunados

0,013 0,226 0,826 0,167 0,090 0,066 0,051 0,706

Vacunados

0,058 0,180 0,518 0,193 0,146 0,093 0,113 0,881

Vacunados

0,065 0,103 0,386 0,050 0,036 0,013 0,000 0,518

Vacunados

0,030 0,159 0,543 0,154 0,168 0,102 0,056 0,416

Vacunados

0,105 0,222 0,364 0,122 0,084 0,039 0,041 0,268

Media

0,046 0,380 0,812 0,188 0,127 0,106 0,094 0,746

EJEMPLO 5

Evaluación de la inmunidad mediada por células en respuesta a la vacuna de E. canis inactivada

5 Se usaron ensayos ELISPOT para IL-12 e IFN-γ canino para evaluar los niveles de IL-12 e IFN-γ en perros vacunados con la bacterina de Ehrlichia canis (E. canis). En comparaci6n con los perros de control, la mayor cantidad de manchas de IL-12 e IFN-γ producidas por las celulas mononucleares de sangre periferica aisladas de perros vacunados indic6 que una respuesta IMC pudo desempefar un papel en la protecci6n contra la infecci6n por

E. canis.

10 A. Materiales y procedimientos

En este estudio se usaron dos grupos de perros: vacunados que recibieron la bacterina de E. canis y controles que no recibieron la bacterina. Se extrajo sangre completa de los perros vacunados y de los de control despues de la primera vacunaci6n con la bacterina de E.canis. Las muestras de sangre completa de los perros vacunados y de control se recogieron mediante punci6n venosa esteril en tubos con EDTA 10 ml. Se aislaron las celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) por centrifugaci6n en un gradiente Percoll. Despues el aislamiento, para cada muestra, se realiz6 el recuento de las CMSP y se determin6 la concentraci6n celular. Despues, las CMSP aisladas se usaron inmediatamente para un ensayo Elispot.

El medio de cultivo completo usado para cultivar las CMPS caninas consisti6 en identicos volumenes de Aim V (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat. N° 12055-083.) y ExCell (JRH Biosciences, Lenexa, KS;. Cat. N° 141610 -500M), suero equino al 10% inactivado por calor (Hyclone, Logan, UT;. Cat. N° SH30074.03) y gentamicina 10 μg/ml.

Ensayo ELISPOT

Preparación de placas Elispot

Placas de IL-12

Con metanol al 70%, placas Immobilon P (Millipore, Burlington, MA) se humedecieron previamente, se lavaron con soluci6n salina tamponada con fosfato (DPBS) Dulbecco-Vogt, se revistieron con 100 μl/pocillo de anticuerpo anti IL12 humana de rat6n (10 μl/ml; Mabtech, Suecia), se diluyeron en tamp6n carbonato, pH 9,6, y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 ± 2 %, durante 2 horas. Despues las placas se lavaron con DPBS + Tween 20 al 0,1% y se bloquearon con medio completo Aim V/ExCell a 36 'C, CO2 al 5 ± 2 %, durante un minimo de 2 horas.

Placas de IFN-γ

Se prepararon placas Elispot para la detecci6n de IFN-γ canina de manera similar a las palcas de IL-12 canina, usando un anticuerpo especifico para IFN-γ canina. Las placas usadas en este estudio se adquirieron de R & D Systems (Minneapolis, MN,. Cat. N° EL781) y se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas placas se revistieron previamente con anticuerpos policlonales anti- IFN-γ caninos.

Preparación de antígenos

Como antigenos para estimular la producci6n de IL-12 y de IFN-γ se usaron inicialmente seis preparaciones celulares diferentes. Estas incluian:

1.

Celulas DH82 vivas infectadas por E. canis.

2.

Lisado de celulas DH82 infectadas por E. canis (las celulas se lisaron por homogeneizaci6n).

3.

Lisado de celulas DH82 infectadas por E. canis inactivadas por tratamiento con formalina

4.

Solo celulas DH82 vivas no infectadas.

5.

Lisado de celulas DH82 no infectadas.

6.

Lisado de celulas DH82 no infectadas inactivadas por tratamiento con formalina.

Las tres primeras preparaciones se usaron para estimular la producci6n de IL-12 y de IFN-γ. Las tres preparaciones restantes se usaron como controles negativos en el ensayo. El dia del ensayo, se recogieron celulas DH82 vivas infectadas y no infectadas por E. canis, se contaron y se determin6 la concentraci6n celular. La cantidad deseada de celulas vivas y de celulas equivalentes del lisado de celulas (tratadas con o sin formalina) se resuspendi6 en el medio de cultivo completo AimV/Excell y se aplicaron al ensayo. En el medio de cultivo completo se prepararon los mit6genos Concanavalina A (Con A) Sigma Cat N° C0412 y Lectina de Phaseolus vulgaris (PHA) Sigma Cat. N° L4144 y se us6 como controles positivos para el ensayo.

Incubación de E. canis y de CMPS

Las placas revestidas con anticuerpos, despues las 2 horas de bloqueo con medio, se lavaron con soluci6n salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) + Tween 20 al 0,1%. A los pocillos revestidos con anticuerpos, se afadieron las celulas DH82 vivas infectadas y no infectadas por E. canis, los lisados de celulas, el medio y el control positivo, a una diluci6n apropiada en volumenes de 150 μl por pocillo. En los pocillos apropiados se afadieron las CMPS que se habian diluido hasta una concentraci6n de celulas deseada en el medio de cultivo completo y 50 μl/pocillo de cultivo de celulas. Despues se incubaron las placas a 36 'C ± 2 'C, CO 2 al 5 ± 2% de 20 a 50 horas dependiendo del ensayo que se estuviera realizando.

Revelado de las placas

Placas de IL-12

Despues de la incubaci6n, las celulas se retiraron lavando con DPBS + Tween 20 al 0,1%. Antes de su uso, el anticuerpo de detecci6n biotinilado (Mabtech, Suecia,. Cat. N° 3450-6) se diluy6 en DPBS + albumina de suero bovino (BSA) al 0,5% a 1,0 μg/ml y se filtr6 a traves de un filtro de jeringa de 0,2 μm. A los pocillos apropiados se

afadieron 100 μl de anticuerpos de detecci6n. Despues las placas se incubaron a 36 'C ± 2 'C, CO 2 al 5 ± 2% durante tres horas. Se retir6 el anticuerpo de detecci6n y las placas se lavaron con DPBS + Tween 20 al 0,1 %. Las placas se incubaron con estreptavidina conjugada con HRP 100 μl/pocillo (KPL, Gaithersburg, MD; Cat. N° 14-30-00) diluida a 1:1000 en DPBS + Tween 20 al 0,1 % a 36 'C, CO2 al 5 ± 2% durante 1 hora.

Durante la incubaci6n, se prepar6 una soluci6n sustrato. En un matraz de vidrio Erlenmeyer, se disolvi6 un comprimido de 20 mg de AEC (3-amino-9-etil-carbazol, Sigma, St. Louis, MO; Cat. N° D4254) en N, Ndimetilformamida (DNF) 2 ml. Una vez disuelto, a la soluci6n sustrato se le afadieron 58 ml de acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0) y 30 μl de per6xido de hidr6geno (H2O2), que despues se filtr6 a traves de un filtro de 0,45 μm antes de su uso.

Para retirar el detergente residual, las placas se lavaron con DPBS + Tween 20 al 0,1 %, seguido de un lavado solo con DPBS. Se afadieron cien μl de soluci6n sustrato a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante un maximo de 20 minutos. La reacci6n se detuvo retirando la soluci6n sustrato y aclarando con agua destilada. Las placas se secaron a temperatura ambiente y las unidades productoras de manchas (SPC) se evaluaron para determinar la cantidad, area e intensidad usando un lector Zeiss Elispot (Carl Zeiss Vision, Oberkochen, Alemania) con un programa informatico KS ELISPOT 4,4.

Placas de IFN-γ

Despues de la incubaci6n, las celulas se retiraron lavando con tamp6n de lavado (R&D Systems, Minneapolis, MN). El anticuerpo de detecci6n biotinilado se diluy6 en un tamp6n de diluci6n 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y antes de su uso se filtr6 a traves de un filtro de jeringa de 0,2 μm. A los pocillos apropiados, se afadieron cien μl de anticuerpos de detecci6n. Las placas se incubaron despues a 36 'C ± 2 'C, CO2 al 5 ± 2% durante tres horas. El anticuerpo de detecci6n se retir6 y las placas se lavaron con tamp6n de lavado. Las placas se incubaron con estreptavidina-AP 100 μl/pocillo diluida de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R & D System, Minneapolis, MN) a 36 'C ± 2 'C, CO2 al 5 ± 2% durante 1 hora.

Despues de la incubaci6n con estreptavidina-AP, las placas se lavaron con tamp6n de lavado y se incubaron con BCIP/NBT (R&D System, Minneapolis, MN) 100 μl por pocillo a temperatura ambiente durante 20 minutos. La reacci6n se detuvo retirando la soluci6n sustrato y aclarando la placa con agua destilada. Despues, las placas se secaron a temperatura ambiente y las unidades productoras de manchas (SPC) se evaluaron para determinar la cantidad, area e intensidad usando un lector Zeiss Elispot (Carl Zeiss Vision, Oberkochen, Alemania) con un programa informatico KS ELISPOT 4,4.

Análisis de Datos

Los resultados se leyeron como celulas formadoras de manchas (SFC) y, dependiendo de la naturaleza de los experimentos, se expresaron de diferente manera. Hubo tres posibles formas de presentar los datos: la cantidad de manchas originales en cada pocillo, la cantidad promedio de manchas para cada tratamiento por cada muestra y el indice de estimulo. El indice de estimulo se calcul6 dividiendo la cantidad promedio de manchas en pocillos no estimulados (solo celulas + medio de cultivo) entre la cantidad promedio de manchas en pocillos estimulados.

B. Resultados e interpretación

Esta evaluaci6n se realiz6 para evaluar la cantidad de celulas secretoras de IL-12 e IFN-γ en CMPS aisladas de perros vacunados contra E. canis.

En este experimento, se us6 un perro de control y tres vacunados. Los resultados del experimento se presentan en las tablas VI y VII. En la Tabla VI, los datos indican que s6lo las celulas DH82 vivas infectadas por E-canis estimulan la producci6n de IL-12 en CMPS en los tres perros vacunados en comparaci6n con la no producci6n en CMPS del perro de control. La estimulaci6n tambien depende de la dosis despues de infectar celulas DH82 con E. canis, teniendo la diluci6n 1:10 de la reserva de E. canis (equivalente a 1x104 celulas/pocillo) mayor cantidad de manchas que la diluci6n 1:1000. El lisado de celulas DH82 infectadas por E. canis con o sin tratamiento con formalina, las celulas DH82 vivas no infectadas, el lisado de celulas DH82 no infectadas y las celulas DH82 lisadas tratadas con formalina, no produjeron ninguna repuesta detectable a IL-12 . Dos de los perros vacunados reaccionaron a un grado mas alto que el tercero vacunado. El perro de control no mostr6 ninguna respuesta a ningun estimulo a excepci6n de una leve respuesta a mit6geno positivo (PHA).

La Tabla VII muestra los resultados de los Elispots de IFN-γ de los mismos cuatro perros. De manera similar que IL12, las celulas DH82 vivas infectadas por E. canis vivas mostraron la mayor inducci6n de manchas de IFN-γ en los tres perros vacunados. La inducci6n tambien depende de la cantidad de celulas infectadas por E. canis, presentandose el nivel mas alto en la diluci6n 1:10 y el nivel mas bajo en la diluci6n 1:1000. El lisado de celulas DH82 infectadas por E. canis produjo una menor cantidad de manchas para los perros vacunados. El lisado tratado con formalina produjo un fondo en la diluci6n 1:1000, pero no produjo manchas en las diluciones 1:10 o 1:100. Esto pudo deberse al efecto inhibidor de la formalina residual sobre la actividad de las celulas mononucleares. Las celulas DH82 no infectadas en las tres preparaciones s6lo produjeron manchas de fondo en comparaci6n con las celulas

DH82 vivas infectadas por E-canis. La respuesta individual de los perros fue similar a la observada en el Elispot de IL-12. Los mismos dos perros vacunados mostraron una mayor respuesta que el tercero y el perro de control mostr6 una menor respuesta a la estimulaci6n solo con mit6geno (Con A).

Los resultados de este experimento demostraron que s6lo las celulas DH82 vivas infectadas por E. canis pueden

5 inducir la producci6n de IL-12 y de IFN-γ por las CMPS. Ni el lisado de celulas DH82 infectadas por E. canis ni el lisado tratado con formalina pudieron usarse debido al bajo efecto de estimulaci6n sobre linfocitos T o monocitos sobre la actividad celular.

C. Resumen

Los datos mostrados en las Tablas VI y VII a continuaci6n en el presente documento demuestran que la IMC puede

10 desempefar una funci6n en la protecci6n de perros vacunados con la bacterina de E. canis. La cantidad aumentada de manchas de IL-12 e IFN-γ para los perros vacunados representa la activaci6n de linfocitos T y de monocitos. TABLA VI Respuesta Elispot para IL-12 en perros inducida por la bacterina de E.canis Dilución del antígeno

1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000

Lisado de celulas DH82 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0infectadas por

E-canis

Lisado de celulas DH82 inactivadas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 infectadas por

E.canis

Lisado de celulas DH82 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 no infectadas

Lisado de celulas DH82 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

inactivadas, no infectadas

Celulas DH82 vivas 0 0 0 8823 2 7624 3 107 1infectadas por

E.canis

Celulas DH82 vivasno 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 infectadas

no 0 0 0 0 1 0 0 0 0 3 0 0estimuladas

Control 3 4 3 8192 6613012011344 33 31 positivo

TABLA VII Respuesta Elispot de IFN- en perros inducida por la bacterina de E.canis Dilución del antígeno

1:10

1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000 1:10 1:100 1:1000

Lisado de celulas DH82 infectadas por E-canis

0 0 0 181 216 104 82 88 75 3 1 1

Lisado de celulas DH82 inactivadas infectadas por E.canis

0 0 0 0 0 116 0 0 76 1 7 3

Lisado de celulas DH82 no infectadas

0 0 0 96 155 106 37 87 87 3 3 2

Lisado de celulas DH82 inactivadas

0 0 0 0 1 109 0 0 95 0 4 4

no infectadas

Celulas DH82 vivas infectadas por E.canis

16 6 0 450 295 183 430 230 72 77 33 4

Celulas DH82 vivas

2 6 0 52 109 117 33 45 106 1 5 1

no infectadas

no estimuladas

0 0 0 77 52 64 90 76 68 3 1 1

Control positivo

33 44 61 270 305 262 210 187 186 281 303 255

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composici6n de vacuna que comprende: una cantidad inmunizante eficaz de dos cepas de una bacterina inactivada de Ehrlichia canis, en la que dichas cepas de bacterina inactivada comprenden Ehrlichia canis Ebony y Ehrlichia canis Broadfoot, un excipiente farmacol6gicamente aceptable, y una cantidad inmunogenicamente estimulante de un sistema adyuvante que consiste esencialmente en un agente inductor de una respuesta de anticuerpos y un agente inductor de una respuesta inmune mediada por celulas

2. 2.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que dicha bacterina inactivada se combina con una o mas cepas de E. canis denominadas Florida, Israel 611, Kogashima 1, Louisiana, Oklahoma, Venezuela, la cepa Jake de la Universidad del Estado de Carolina del Norte (NCSU), los aislados Demon, DJ y Fuzzy de la NCSU, lineas celulares infectadas por E. canis con cualquiera de las cepas indicadas, y una linea celular DH82 infectada por E. canis con cualquiera de las cepas indicadas.

3. 3.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que el agente inductor de una respuesta de anticuerpos se selecciona entre el grupo que consiste en anhidrido maleico de etileno, emulsiones de latex de un copolimero de estireno con una mezcla de acido acrilico y metacrilico, copolimero acrilico de estireno, hidr6xido de aluminio o similar, y una mezcla de los mismos.

4. 4.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en la que el agente inductor de una respuesta inmunitaria mediada por celulas se selecciona del grupo que consiste en una emulsi6n de aceite en agua, una composici6n de escualano con Tween® 80 y copolimeros de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno, una composici6n del analogo de treonilo del dipeptido muramilico con Tween® 80 y copolimeros de escualano y copolimeros de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno, una Mycobacterium bovis atenuada, el bacilo de Calmette-Guerin, citocinas relacionadas con Th1, interleucina-12 (IL-12), interleucina-18 (IL-18), interfer6n gamma, y una mezcla de los mismos.

5. 5.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en la que dicha bacterina inactivada esta presente en una cantidad suficiente para proporcionar al menos 1x104 de DICT50 por dosis unitaria.

6. 6.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 3, en la que el agente inductor de una respuesta de anticuerpos es una mezcla de anhidrido maleico de etileno y de un copolimero acrilico de estireno que esta presente en la cantidad de aproximadamente 1% vol/vol de anhidrido maleico de etileno y aproximadamente 3% vol/vol de copolimero acrilico de estireno.

7. 7.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en la que dicha emulsi6n de aceite en agua se selecciona del grupo que consiste en una emulsi6n de aceite de parafina en agua, una emulsi6n que comprende escualano y un copolimero de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno, una emulsi6n que comprende escualano y un copolimero de bloque de 6xido de etileno y de 6xido de propileno con el analogo de treonilo del dipeptido muramilico, y una mezcla de los mismos.

8. 8.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, que adicionalmente comprende una bacterina de Borrelia burgdoferi.

9. 9.

   La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en la que dicho agente de respuesta inmunitaria mediada por celulas es una emulsi6n de aceite en agua y esta presente en un intervalo de aproximadamente el 3% al 7% vol/vol.

10. 10.

    La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en la que dicho agente de respuesta inmunitaria mediada por celulas es una emulsi6n de aceite en agua y esta presente en una cantidad de aproximadamente el 5% vol/vol.

11. 11.

    Una composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la prevenci6n o mejora de erliquiosis canina en un perro.