ES2375053T3

ES2375053T3 - Péptido derivado de la interleucina-1-beta y su aplicación terapéutica.

Info

Publication number: ES2375053T3
Application number: ES03740584T
Authority: ES
Inventors: Jean-Francois Zagury
Original assignee: Vaxconsulting
Current assignee: Vaxconsulting
Priority date: 2002-04-10
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2012-02-24
Anticipated expiration: 2023-04-09
Also published as: RU2004132871A; US8529881B2; WO2003084979A3; MXPA04009841A; EP2314311A2; EP2314311B1; US7641895B2; US8277792B2; RU2326125C2; JP2005530723A; NZ536351A; KR101101004B1; EP2314312A3; US7892529B2; TNSN04200A1; CA2480996C; WO2003084979A2; SI2314311T1; KR20040108709A; US7393523B2

Abstract

Vacuna que contiene un compuesto inmunogénico que comprende un péptido que tiene un tamaño comprendido entre 10 y 30 aminoácidos, y que tiene más de 80% de identidad con la secuencia peptídica de citoquina IL-1 beta siguiente: 123-STSQAENMPV-132 (ID SEQ Nº 3); en la que dicho compuesto inmunogénico no comprende otros epítopos de dicha citoquina y en la que dicho compuesto inmunogénico es capaz de generar en un sujeto anticuerpos que reconocen la citoquina nativa.

Description

Péptido derivado de la interleucina-1-beta y su aplicación terapéutica

La presente invención se refiere a nuevos péptidos y a su aplicación terapéutica.

La inmunización activa anti-citoquina es una estrategia de inmunoterapia activa desarrollada desde 1990 por Zagury y otros, que se basa, en particular, en la solicitud de patente WO 92/22577.

Esta idea ha sido recogida por varios equipos de científicos que han publicado en revistas científicas internacionales inmunizaciones activas contra la proteína entera de IFNα, multimerizada mediante tratamiento con glutaraldehído (Gringeri y otros, JAIDS 1999; 20:358-70), una proteína TNFα quimérica que consiste en el acoplamiento de la proteína nativa del TNFα con un epítopo T de la ovalbulmina (Dalum y otros, Nature Biotechnology, 1999; 17:66669), en contra de la IL9 entera acoplada con KLH (Richard y otros, PNAS, 2000; 97:767-72) o también, de la IL5 entera quimérica con un epítopo T de toxina tetánica (Hertz y otros, J. Immunol, 2001; 167:3792-99).

Estos enfoques han confirmado la factibilidad de inmunizaciones autólogas anti-citoquinas, pero algunos de estos éxitos ocultan los ensayos infructuosos descritos por algunos autores: algunas citoquinas no permiten obtener anticuerpos suficientemente protectores y de efecto clínico, y la misma citoquina preparada de forma eficaz de una manera no lo será de otra (Richard y otros, PNAS, 2000; 97:767-72).

Tratando de explicar este fenómeno, la solicitante ha observado que hasta ahora todos los autores han utilizado unas citoquinas enteras (eventualmente, ligeramente modificadas), lo que conlleva unas dificultades, en particular, a los siguientes niveles:

-: dilución del poder inmunogénico de los determinantes antigénicos de interés (para las respuestas B y T)

-: posible génesis facilitando anticuerpos in vivo (respuesta B).

Por lo tanto, sería deseable disponer de antígenos que permitieran obtener anticuerpos suficientemente protectores frente a citoquinas, y que limitaran su actividad.

El documento WO-A-98/51705 describe unos péptidos de h RANTES, MIP1α y MIP1β, comprendidos entre la segunda y la tercera cisteína de estas quimioquinas que se enlazan al co-receptor CCR5.

El documento WO-A-98/34631 describe unos péptidos procedentes de cadenas γ de receptores de citoquinas utilizados para bloquear la fijación de la citoquina o la activación del receptor.

El documento WO-A-94/01457 describe unos péptidos de IFNα utilizados como sustancias portadoras de compuestos farmacéuticos.

El documento EP-A-0218531 describe unos péptidos de IL1 utilizados para la preparación de anticuerpos.

El documento WO-A-00/53219 divulga el uso de péptidos derivados de VEGF para obtener vacunas para una inmunización activa o para obtener anticuerpos para inmunizar pasivamente al ser humano o animales. Uno de los péptidos, generado a partir del dominio de enlace de VEGF al receptor neuropilina, es capaz de inhibir metástasis B16BL6, inducidas experimentalmente en ratones.

La invención se define mediante las reivindicaciones.

Debido a su longitud, los péptidos de citoquina, según la invención, corresponden a un número limitado de epítopos de la citoquina, en general, a uno o dos epítopos de la citoquina, y están, por lo tanto, desprovistos de otros numerosos epítopos que ellas contienen.

Por "citoquina" se entiende tanto las citoquinas naturales, como las citoquinas quimio-atractivas, también denominadas quimioquinas. Se prefieren las citoquinas humanas. La expresión "que interactúan" significa que estos anticuerpos, por ejemplo, bien porque reconocen la proteína nativa tal como se puede demostrar mediante un ensayo inmunológico (ELISA, transferencia western), bien porque bloquean el enlace de la citoquina con su receptor tal como se puede demostrar mediante un ensayo de actividad biológica o mediante un ensayo de competición bioquímica, tienen un efecto clínico beneficioso in vivo.

Los péptidos de citoquina, según la invención, proceden o derivan de una citoquina. Por el término "provienen" se entiende que su secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la citoquina. Por la expresión "derivan de" se entiende que su secuencia de aminoácidos es mayoritariamente idéntica a la de la citoquina, pero que presente algunas diferencias, tal como se explicará a continuación.

Al menos, un aminoácido de los péptidos de citoquina de la invención, y preferiblemente dos aminoácidos consecutivos, posee(n) uno de sus átomos separado por menos de 5 angstroms de un átomo del receptor correspondiente a dicha citoquina. Está ventajosamente separado por menos de 4,5 angstroms, en particular separado por menos de 4 ángstroms y particularmente separado por menos de 3,5 ángstroms de un átomo del receptor que corresponde a dicha citoquina.

En general, el átomo afectado del aminoácido se encuentra en la cadena lateral de dicho aminoácido.

En unas condiciones preferidas de aplicación de la invención 2, en particular 3, y preferiblemente 4 aminoácidos consecutivos del péptido de citoquina responden a este mismo criterio de separación.

Esta separación se evalúa en datos estructurales, por ejemplo, de cristalografía, o también mediante RMN que da unos resultados similares a las medidas cristalográficas.

Los péptidos de citoquina anteriores constan ventajosamente de más de 8, en particular más de 10, particularmente más de 12 y muy particularmente más de 15 aminoácidos.

En otras condiciones preferidas de aplicación de la invención, los péptidos de citoquina anteriores constan de menos de 35, ventajosamente menos de 30, en particular menos de 25 y particularmente menos de 20 aminoácidos. Generalmente, las secuencias más cortas corresponden a unos péptidos que contienen un solo grupo de, al menos, dos aminoácidos consecutivos que constan de, al menos, uno de sus átomos separados por menos de 5 angstroms de un átomo del receptor correspondiente a dicha citoquina, mientras que las secuencias más largas corresponden en general a unos péptidos, según la invención, que contienen dos o incluso tres grupos o más de tales aminoácidos consecutivos. En efecto, estos grupos pueden estar separados por varios, por ejemplo, 10 aminoácidos tal como en el caso de IL1β.

Entre los péptidos de citoquina anteriores, se retiene el péptido siguiente:

- 123-STSQAENMPV-132 de hlL1β

Tal como es conocido por el experto en la técnica de la inmunología, son posibles modificaciones de las cadenas peptídicas naturales sin por ello modificar la naturaleza de las propiedades inmunológicas de los péptidos inmunogénicos. Se pueden citar por lo tanto los derivados de péptidos de citoquina que son altamente homólogos a estas secuencias naturales, por ejemplo que tienen más de 80% de homología o incluso más de 90% de homología con el péptido nativo correspondiente, conservando al mismo tiempo las propiedades inmunológicas de este sitio epitópico del péptido nativo. Su zona de homología puede variar de 5 a 40 residuos, por ejemplo de 8 a 40 residuos,

o también de 8 a 35 residuos, preferiblemente de 10 a 35 residuos, pero también de 12 a 35 residuos, en particular de 12 a 30 residuos, más particularmente de 15 a 30 residuos y muy particularmente de 15 a 25 residuos.

Los derivados de péptidos de citoquina pueden contener unos residuos modificados, con la condición de que las modificaciones no disminuyan sensiblemente la inmunogenicidad, mediante adición de radicales químicos (metilo, acetilo, etc.) o mediante modificación estereoquímica (uso de aminoácidos de serie D). Los derivados peptídicos de citoquina deben inducir, como los péptidos de citoquina, anticuerpos que interactúan con la citoquina.

Los derivados peptídicos de citoquina según la invención pueden constar de una o más modificaciones en los aminoácidos de los que están constituidos tales como deleciones, sustituciones, adiciones o funcionalizaciones (tales como acilación) de uno o más aminoácidos, en la medida en la que estas modificaciones siguen en el ámbito precisado antes (caracteres inmunológicos). En general, por ejemplo, la sustitución de un residuo de leucina por un residuo de isoleucina no modifica tales propiedades; las modificaciones deben afectar en general menos de 40% de aminoácidos, en particular menos de 30%, preferiblemente menos de 20% y muy particularmente menos de 10% de los aminoácidos del péptido natural. Es importante que los anticuerpos inducidos por los péptidos modificados sean activos frente a la citoquina nativa.

Estas modificaciones están al alcance del experto en la técnica que puede verificar la incidencia de las modificaciones mediante unos ensayos simples. La inmunogenicidad de tales derivados modificados se puede evaluar mediante ELISA después de la inmunización de ratones, siendo el antígeno ensayado mediante ELISA la citoquina entera o el péptido de citoquina inmunizante, o mediante unos ensayos de bloqueo de la unión citoquinareceptor. Las eventuales modificaciones afectan preferiblemente a menos de 8 aminoácidos, ventajosamente a menos de 6 aminoácidos, en particular a menos de 4 aminoácidos, y particularmente a 3 aminoácidos o menos, como 2 ó 1 solo aminoácido.

La invención tiene asimismo por objeto un compuesto caracterizado porque contiene al menos un péptido de citoquina o derivado del péptido de citoquina anterior. Tal compuesto puede comprender unas repeticiones de péptidos/derivados idénticos, o unas combinaciones de péptidos/derivados diferentes, ya sea en forma lineal o en forma de estructura en candelabro o de acoplamientos mixtos de proteínas portadoras. Tal compuesto puede asimismo presentarse en forma ciclada. Así, unos péptidos de citoquina o los derivados peptídicos de citoquina

según la invención pueden, por ejemplo, ser insertados en secuencias más largas de aminoácidos, dando, en particular, una mejor conformación, o ser combinados con unos epítopos T exógenos (ya sea para inmunizaciones proteicas o mediante ADN).

Ventajosamente, pueden ser asociados de manera covalente a proteínas portadoras tal como, por ejemplo, KLH.

Como se ha observado, los péptidos de citoquina según la invención corresponden en general a un pequeño número de epítopos de la citoquina. Cuando están en particular insertados, combinados o asociados, los compuestos anteriores no constan de otros epítopos de dicha citoquina.

Estos péptidos de citoquina o derivados de citoquina podrán ser incluidos en cualquier secuencia de proteína que no comprenderá ninguna homología con los demás epítopos de la citoquina natural. Por ejemplo, podrán ser los sitios de unión al receptor, en los extremos de los cuales se añade simplemente una cisteína para conferir al péptido una estructura cíclica. Otro ejemplo es un péptido rodeado de secuencias de epítopos T de la toxina tetánica. También otro ejemplo podrá comprender un péptido que corresponde a la secuencia del sitio de unión al receptor, pero en el que algunos aminoácidos están sustituidos por sus isómeros de serie D a fin de evitar sus efectos agonistas. En efecto, podrá ser eventualmente ventajoso utilizar unos derivados peptídicos que no tienen ninguna actividad agonista sobre el receptor a fin de que el inmunogénico no pueda interferir con la respuesta inmunitaria.

Con el fin de aumentar la respuesta inmunitaria, estos péptidos de citoquina o derivados de citoquina podrán ser acoplados a proteínas portadoras. Los métodos de acoplamiento y la proteína portadora considerados podrán ser diferentes según el péptido determinado: podrá tratarse, por ejemplo, de la proteína Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) y Tetanus Toxoid (TT) conjugados a los péptidos mediante métodos químicos bien conocidos por el experto en la técnica, como los de acoplamiento por la carbodiimida, o por el glutaraldehído o por la bencidina bisdinitrogenada. La realización de estos acoplamientos podrá ser facilitada por la adición o incorporación de aminoácidos a la secuencia, como, por ejemplo, lisinas, histidinas, tirosinas o cisteínas. Tales compuestos peptídicos acoplados a un epítopo T exógeno (que provienen de plasmodium falciparum, de KLH, etc.), ya sea de manera química o genética entran, asimismo, en el ámbito de la invención.

Se puede, asimismo, aplicar unos acoplamientos en red de tipo candelabro o de moléculas tales como la transferrina

o la ferritina para estimular eficazmente la respuesta inmunitaria.

Los péptidos, según la invención, pueden ser, en particular, producidos mediante síntesis química o mediante ingeniería genética o mediante cualquier otro método adaptado. La síntesis de péptidos cíclicos, injertando en caso de necesidad uno o más aminoácidos al final de cadena tal como unas cisteínas para crear un puente disulfuro, permite encontrar una parte de la estructura secundaria que estos fragmentos peptídicos poseen en la estructura tridimensional de la proteína.

Los péptidos de citoquina, derivados de citoquina, y sus compuestos según la invención, poseen propiedades farmacológicas muy interesantes. Están provistos en particular de propiedades anticitoquinas notables. Ellos son, en efecto, inmunogénicos y capaces de generar en un sujeto unos anticuerpos que reconocen la citoquina nativa. Estos péptidos no contienen los otros numerosos epítopos que provienen de la citoquina a la que corresponden.

Estas propiedades están ilustradas a continuación en la parte experimental. Estas justifican el uso de los péptidos descritos antes, a título de fármaco.

El hecho de limitarse a estos péptidos próximos del sitio de unión al receptor, con la exclusión de los demás epítopos de citoquinas, da, en particular, la ventaja de limitar la generación de anticuerpos que faciliten o que potencien la actividad citoquínica. Además, permiten aumentar la calidad de la inmunización anticitoquínica debido a que se limita el número de determinantes antigénicos determinados.

Los fármacos, según la presente invención, encuentran uso, por ejemplo en el tratamiento tanto curativo como preventivo de las enfermedades relacionadas con las alteraciones del sistema inmunitario que implican sobreproducciones de citoquinas, como por ejemplo las enfermedades autoinmunes (que comprenden entre otros la esclerosis en placas, la poliartritis reumatoide, la soriasis, la diabetes autoinmune, el lupus), la alergia o el asma, los cánceres o el SIDA. Así, está claro que la lucha contra IL1β o TNFα puede ser útil en la poliartritis reumatoide, la lucha contra IFNγ, IL18, IL23 o IL12 puede ser útil en la lucha contra la esclerosis en placas, o la diabetes autoinmune, la lucha contra IL4, IL5 e IL13 puede ser útil contra la alergia o el asma, la lucha contra IL10 o vEGF puede ser útil contra ciertos cánceres. Más generalmente, las alteraciones Th1/Th2 que dirigen la respuesta inmunitaria en sí y que hacen intervenir clásicamente IL12, IL2, IL4, IL6, IL10, IL13, IFNγ, TNFα se podrán beneficiar de un reajuste del equilibrio mediante la inmunización activa. Son sólo algunos ejemplos, y la invención tiene asimismo por objeto cualquier tratamiento del cuerpo humano, basado en una inmunización activa (ADN o péptido) que implica las secuencias peptídicas mencionadas antes, con la exclusión de los demás epítopos de las citoquinas. Estas secuencias podrán ser modificadas tal como se indica en la presente descripción, y las inmunizaciones por ADN se harán mediante simple traducción a partir del código genético.

La respuesta inmunitaria humoral podrá ser evaluada mediante ensayos ELISA o ensayos que muestran la inhibición de la unión de la citoquina nativa con su receptor. La respuesta celular podrá ser evaluada en presencia de ensayos de proliferación celular frente al péptido utilizado.

Los principales agentes activos inmunogénicos según la invención pueden ser utilizados de esta manera:

Se administra a un paciente un péptido de citoquina o derivado de citoquina o compuesto inmunogénico según la presente invención, por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular, en cantidad suficiente para ser eficaz en el plano terapéutico, a un sujeto que tenga necesidad de tal tratamiento. La dosis administrada puede estar comprendida, por ejemplo, entre 1 y 1000 μg, en particular entre 10 y 500 μg por vía subcutánea, una vez por mes durante tres meses, y después periódicamente en función del porcentaje de anticuerpos séricos inducidos, por ejemplo cada 2-6 meses. Se podrá administrar en una misma preparación dos o más moléculas inmunógénicas diferentes para inducir unos anticuerpos que neutralizan todos los sitios funcionales deletéreos en el caso en el que una sola molécula inmunógénica no porta todos los sitios activos de la citoquina sobreproducida que se desea neutralizar.

La invención tiene por objeto las vacunas que contienen al menos un péptido de citoquina o derivado de citoquina o compuesto inmunogénico antes citado, a título de principio activo.

A título de fármacos, un péptido de citoquina o derivado de citoquina o compuesto inmunogénico de la invención puede ser incorporado en composiciones farmacéuticas destinadas a cualquier vía convencional de uso en el campo de las vacunas, en particular por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa u oral. La administración puede tener lugar en dosis única o repetida una o más veces después de un cierto intervalo de tiempo.

El agente inmunogénico puede estar acondicionado solo o mezclado con un excipiente o mezcla de excipientes farmacéuticamente aceptables tal como un coadyuvante. La presente solicitud tiene más particularmente por objeto una vacuna que contiene a título de inmunogénico un péptido de citoquina o derivado de citoquina o compuesto inmunogénico anteriormente citado.

La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de preparación de una composición descrita anteriormente, caracterizado porque se mezcla, según métodos conocidos en sí, el o los principios activos con unos excipientes aceptables, en particular farmacéuticamente aceptables.

La administración a un paciente de un péptido de citoquina o de un derivado de citoquina o de un compuesto inmunogénico, según la invención, corresponde a una inmunoterapia activa. Puede ser, asimismo, interesante proceder a una inmunoterapia pasiva, es decir, suministrar a un paciente directamente unos anticuerpos que este necesita.

Las preparaciones vaccíneas podrán ser acondicionadas para la vía intranasal en forma de gel con el carbopo como excipiente, de gotas nasales o de spray, y para la vía oral en forma de cápsulas gastroresistentes, de grageas o de gránulos gastroresistentes.

En el caso de vacuna ADN administrada por vía sistémica o mucosal, la presentación galénica del plásmido podrá ser una suspensión en un líquido fisiológico tal como el PBS fisiológico (tampón de fosfato = PBS). Los plásmidos podrán estar incluidos en microesferas de polímero biodegradable (PLG, PLA, PCL) y administradas en cápsulas gastroresistentes para ingestión (vía oral). El ADN podrá, asimismo, ser expresado en un vector vivo bacteriano, de tipo salmonella o viral de tipo adenovirus o poxvirus.

La presente solicitud tiene finalmente por objeto un procedimiento de inmunización activa de pacientes, caracterizado porque se utiliza a título de inmunogénico un péptido de citoquina o un derivado de citoquina o un compuesto inmunogénico tal como se han descritos anteriormente, ventajosamente asociado a uncoadyuvante de inmunidad mineral, oleoso o de síntesis.

Las inmunizaciones podrán hacerse clásicamente, en particular, por unos péptidos o unos compuestos inmunogénicos tales como unos conjugados, preferiblemente en presencia de uncoadyuvante, por ejemplo ISA 51 o Alun. Las inmunizaciones podrán hacerse a base de ADN (secuencias homólogas a los sitios de unión combinadas con epítopos T exógenos) utilizando un ADN desnudo o un vector de expresión que contiene un promotor adaptado como, por ejemplo, pCR3.1. Los ADN administrados podrán ser protegidos de las nucleasas mediante el uso de radicales adecuados (CpG, etc.). En particular, se podrá hacer seguir de una inmunización inicial por ADN mediante recuerdos clásicos con la ayuda de los compuestos peptídicos.

Las condiciones preferidas de la aplicación de los péptidos descritos anteriormente se aplican asimismo a los demás objetos de la invención indicados anteriormente.

La figura 1 y la figura 2, que es una ampliación de la figura 1, representan la estructura cristalográfica del péptido que proviene de IL10 en contacto con su receptor. Se distingue la citoquina IL10 (a la izquierda) en contacto con su

receptor (a la derecha).

En la figura 2, se puede observar que los aminoácidos marcados en negro están separados por menos de 4 angstroms (d = punteado entre dos bolas negras). Corresponden de abajo a arriba a los pares:

192IL10R serina frente a 28IL10 ácido aspártico (3,18 Å), 100IL10R ácido aspártico y 101IL10R ácido glutámicofrente a 34IL10 lisina (3,83 Å y 3,84 Å), y 94IL10R asparagina frente a 39IL10 metionina (3,70 Å). Para cada aminoácido, se ha determinado un punto central estando como el baricentro del carbono alfa del aminoácido considerado, del extremo de la cadena lateral y de un tercer punto seleccionado estando como el más extremo de los dos anteriores en la cadena lateral. La distancia de medida es la distancia que separa los puntos centrales de los aminoácidos respectivamente de la citoquina y de su receptor. Se puede evidentemente definir las distancias utilizando otros métodos habituales.

Los ejemplos siguientes ilustran la presente invención a título comparativo, pero no forman parte de la invención.

Ejemplo 1:

Se ha sintetizado el péptido KLHLQGQDMEQQ (SEC ID Nº 37) a partir de la secuencia de IL1β humana, se ha añadido el residuo K a la secuencia natural para permitir un enlace al KLH mediante acoplamiento con la ayuda de glutaraldehído.

Se han inmunizado cinco ratones en presencia del coadyuvante ISA51. Para la primera inyección realizada a D0 (día 0), se prepara una emulsión de 40 μg de inmunogénico en una cantidad de ISA51 suficiente para preparar 100 μl de emulsión. Para el recuerdo a D21 y D40, se prepara 100 μl de emulsión que contiene 20 μg de inmunogénico. Se han inmunizado cinco ratones en paralelo como controles con KLH en el mismocoadyuvante.

De D60, se extrae suero y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

La absorbancia media obtenida para cada ratón se presenta en la tabla siguiente:

Ratón: 1 2 3 4 5 Media

Péptido: 1,34 0,08 1,86 0,90 1,56 1,15

Control: 0,05 0,11 0,08 0,12 0,06 0,08

La existencia de anticuerpos que neutralizan la citoquina nativa ha podido ser evaluada de la manera siguiente: 20 unidades de citoquina IL1β nativa son preincubadas con un suero de ratón (inmunizado o de control) diluido del 1/100ª al 1/2000ª durante 2h a 37ºC. Se añade después el conjunto a unas células EL4, dispuestas a 50.000 células en micropocillos. La producción de IL2 se evalúa después de 24 horas en el sobrenadante mediante un ensayo ELISA sándwich (diagnóstico R&D). El porcentaje de inhibición de la producción de IL2 indica el porcentaje de neutralización de IL1β. Tal como se puede ver, se observan unas respuestas para los ratones inmunizados pero no para los controles.

Ratón: 3 5 Media

Péptido: 93% 8% 52%

Control: 11% 12% 6%

Ejemplo 2:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido de síntesis que proviene del vEGF humano: KPHQGQHIGEMS. (SEC ID Nº 38). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora KLH mediante reacción con glutaraldehído. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

La absorbancia media obtenida para cada ratón se presenta en la tabla siguiente: Ejemplo 3:

Ratón: 1 2 3 4 5 Media

Péptido: 1,50 1,00 0,86 0,98 1,63 1,19

Control: 0,05 0,13 0,07 0,10 0,08 0,09

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido de síntesis que proviene del TNFα humano que es:

5 KYQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQL (SEC ID Nº 39). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora KLH mediante reacción con diazobencidina. Se han añadido los residuos K e Y a la secuencia natural para permitir una unión al KLH mediante acoplamiento con la ayuda de glutaraldehído. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

10 La absorbancia media obtenida para cada ratón se presenta en la tabla siguiente:

Ratón: 1 2 3 4 5 Media

Péptido: 1,64 1,14 1,96 1,02 0,78 1,31

Control: 0,11 0,16 0,09 0,11 0,18 0,13

La existencia de anticuerpos que neutralizan la citoquina nativa ha podido ser evaluada de la manera siguiente: 50

15 unidades de citoquina TNFα nativa son preincubadas con un suero de ratón (inmunizado o de control) diluido al 1/200ª durante 2h a 37°C. Se añade después el conju nto a unas células L929, dispuesto a 25.000 células por micropocillos. La lisis de las células se evalúa después de 24 horas mediante coloración con azul de naftol negro (Sigma). El porcentaje de inhibición de la lisis indica el porcentaje de neutralización del TNFα, y tal como se puede ver, se observan respuestas para los ratones inmunizados pero no para los controles.

Ratón: 3 5 Media

Péptido: 93% 79% 61%

Control: 14% 1% 6%

Ejemplo 4:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que proviene de IFNγ humano que es: KKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKN (SEC ID Nº 40). Este péptido se ha sintetizado químicamente en forma de

25 MAPS. Este péptido MAPS se ha acoplado después a la proteína portadora Tétanus Toxoid mediante reacción con glutaraldehído. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

La absorbancia media obtenida para cada ratón se presenta en la tabla siguiente: 30

Ratón: 1 2 3 4 5 Media

Péptido: 1,56 1,05 0,98 1,80 1,64 1,41

Control: 0,10 0,12 0,23 0,08 0,09 0,12

La existencia de anticuerpos que neutralizan la citoquina nativa ha podido ser evaluada de la manera siguiente: 100 unidades de citoquina nativa son preincubadas con un suero de ratón (inmunizado o de control), diluido al 1/250ª durante 2h a 37°C. Se añade después el conjunto a cé lulas RAW 264,7, dispuestas a 300.000 células en pocillos de

35 2 ml. La expresión de CMH de clase II sobre las células se evalúa mediante citometria de flujo después de 24 horas, mediante marcado con anticuerpos anti-CMH de clase II acoplados con fluoresceína. El porcentaje de inhibición de la expresión de CMH de clase II indica el porcentaje de neutralización de IFNγ, y tal como se puede ver, se observan unas inhibiciones para los ratones inmunizados pero no para los controles. El límite de significado para estos experimentos es de 30%.

Ratón: 1 3 5 Media

Péptido: 40% 67% 83% 63%

Control: 25% -10% 7% 13%

Ejemplo 5: Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que proviene de IL10 humana que es: 45 DECNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNC (SEC ID Nº 41). Este péptido se ha sintetizado químicamente, y se ha 7

añadido una cisteína a cada extremo a fin de realizar un péptido cíclico. Este péptido se ha acoplado después a la proteína portadora KLH mediante reacción con carbodiimida. Se ha añadido asimismo el resto DE a la secuencia natural para permitir un enlace al KLH mediante reacción con carbodiimida. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

Ratón: 1 2 3 4 5 Media

Péptido: 1,94 0,96 1,85 0,97 1,5 1,44

Control: 0,29 0,52 0,17 0,26 0,36 0,32

10 Ejemplo 6:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que corresponde a IL4 humana que es: KQLIRFLKRLDRNLWGLAG (SEC ID Nº 42). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora KLH mediante reacción al glutaraldehído. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan

15 unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

Ratón: 1 2 4 5 Media

Péptido: 1,06 1,25 0,87 1,24 1,07

Control: 0,34 0,09 0,16 0,12 0,19

20 Ejemplo 7:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que corresponde a IL12p40 humana que es: KKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCE (SEC ID Nº 43). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora Tetanos Toxoïde mediante reacción a la bencidina bis-dinitrogenada (diazo). Después de la inmunización en las

25 mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

Ratón: 1 2 4 5 Media

Péptido: 0,95 1,06 1,14 0,87 1,12

Control: 0,06 0,12 0,05 0,09 0,08

30 Ejemplo 8:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que proviene de IL18 humana que es: KYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFID (SEC ID Nº 44). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora KLH

35 mediante reacción con glutaraldehído. Se ha añadido el residuo K a la secuencia natural para permitir un enlace al KLH mediante acoplamiento con la ayuda del glutaraldehído. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

40 La absorbancia media obtenida para cada ratón se presenta en la tabla siguiente:

Ratón: 1 2 3 4 5 Media

Péptido: 1,85 1,13 0,99 1,24 1,54 1,35

Control: 0,31 0,09 0,27 0,16 0,24 0,21

Ejemplo 9: 45 Se han inmunizado 5 ratones con el péptido sintético que proviene de IP10 humano que es: KKKGEKRCLNPESKA 8

(SEC ID Nº 45). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora Tetanos Toxoïde mediante reacción al glutaraldehído. Los tres residuos K presentes en la secuencia natural permiten un enlace al KLH mediante acoplamiento con la ayuda de glutaraldehído. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

Ratón: 1 3 4 5 Media

Péptido: 1,16 1,24 1,09 0,88 1,07

Control: 0,32 0,11 0,20 0,09 0,19

10 Ejemplo 10:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que corresponde a IL5 humana que es: KLQEFLGVMNTEWI (SEC ID Nº 46). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora KLH mediante reacción al glutaraldehído. Se ha añadido el residuo K a la secuencia natural para permitir un enlace a KLH mediante acoplamiento con la ayuda de

15 glutaraldehído. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

Ratón: 1 3 4 5 Media

Péptido: 1,25 1,87 1,10 0,88 1,26

Control: 0,51 0,42 0,09 0,38 0,32

20 Ejemplo 11:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que corresponde a TGFβ2 humano que es: DTILYYIGKTPKIE (SEC ID Nº 47). Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora KLH mediante reacción con carbodiimida. Se ha añadido

25 del residuo D a la secuencia natural para permitir un enlace mediante acoplamiento. Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

Ratón: 1 2 4 5 Media

Péptido: 0,95 1,15 1,17 1,08 1,07

Control: 0,40 0,09 0,26 0,29 0,28

Ejemplo 12:

Se han inmunizado 5 ratones con el péptido que corresponde a IL6 humana que es: KQIRYILDGISA (SEC ID Nº 25).

35 Se ha acoplado este péptido a la proteína portadora TT mediante reacción con bencidina bis-dinitrogenada (diazo). Después de la inmunización en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se extrae suero a D60 y se realizan unos ensayos ELISA con la citoquina nativa para revelar la presencia de anticuerpos.

La absorbancia media obtenida para cada ratón se presenta en la tabla siguiente: 40

Ratón: 1 2 4 5 Media

Péptido: 1,11 1,27 1,34 0,32 1,01

Control: 0,11 0,15 0,14 0,21 0,21

Ejemplo 13: Los ADN que corresponden a los péptidos 1-APVRSLNCTL-10 (GCACCTGTACGATCACTGAACTGCACGCTC) 45 (SEC ID Nº 48), 29-LHLQGQDMEQQ-39 (CTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAACAA) (SEC ID Nº 49) y 9

123-STSQAENMPV-132 (AGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGCCCGTC) (SEC ID N° 50) de IL1β se han sintetizado y separado de los epítopos T de la toxina tetánica: AQYIKANSKFIGITEL (SEC ID Nº 55) (CAGTACATCAAGGCTAACTCCAAGTTCATCGGTATCACTGAGCTG) (SEC ID Nº 51) y del KLH: VDTVVRKNVDSL (GTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTT) (SEC ID Nº 52), mediante espaciadores

(SEC ID Nº 53).

Esta secuencia de ADN, clonada en pRSET-A, codifica por lo tanto para un polipéptido compuesto que se produce y

10 purifica mediante ingeniería genética en forma de proteína de fusión poli-histidina. Este polipéptido se utiliza como inmunogénico tal como en el ejemplo 1.

La respuesta de los anticuerpos de ratones se mide contra IL1β nativa mediante ELISA y se encuentran los valores siguientes:

Ratón: 1 2 3 4 5 Media

Péptido: 0,86 0,73 1,68 1,55 1,83 1,33

Control: 0,23 0,11 0,21 0,29 0,17 0,20

Ejemplo 14.

Los ADNc que corresponden a los péptidos 1-APVRSLNCTL-10 (GCACCTGTACGATCACTGAACTGCACGCTC)

20 (SEC ID Nº 48), 29-LHLQGQDMEQQ-39 (CTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAACAA) (SEC ID Nº 49) y 123-STSQAENMPV-132 (AGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGCCCGTC) (SEC ID Nº 50) de IL1β se han sintetizado y separado con epítopos T de la toxina tetánica AQYIKANSKFIGITEL (CAGTACATCAAGGCTAACTCCAAGTTCATCGGTATCACTGAGCTG) (SEC ID Nº 51) y del KLH: VDTVVRKNVDSLGTTGACACCACCAGAAAAAATGTTGACTCCCTT) (SEC ID Nº 52) mediante espaciadores GYG.

(SEC ID Nº 53).

Esta secuencia de ADN, clonada en pCR3.1, codifica por lo tanto un polipéptido IL1β bajo el control del promotor de 30 CMV.

Se realiza una primera inyección intramuscular inyectando 100 μg de vector en una disolución salina de 100 μl. Se realizan 2 recuerdos a D21 y D40 con el péptido del ejemplo 13 (inmunización de tipo "prime-boost"). A D60 la respuesta de anticuerpos se evalúa mediante ensayo ELISA sobre la citoquina nativa en los 5 ratones inmunizados y

35 los 5 ratones control.

El resultado es el siguiente: Ejemplo 15.

Ratón: 2 3 4 5 Media

Péptido: 0,35 1,88 1,64 0,24 1,13

Control: 0,11 0,18 0,08 0,23 0,14

La vacuna está formada de una emulsión de agua en aceite constituida de 50% de ISA 51 (Seppic, Paris) y de 50% 5 de una disolución acuosa de péptido del ejemplo 1 (50 μg/dosis).

Ejemplo 16: Vacuna a base del inmunogénico plasmídico para vacunación ADN de tipo sistémica IL10.

Se han puesto en suspensión unos plásmidos que codifican a los péptidos APVRSLNCTL y LHLQGQDMEQQ de 10 IL1β (20 μg/dosis) en 0,2 ml de PBS para una administración intramuscular.

Ejemplo 17.

Se ha preparado una vacuna formada de una emulsión de agua en aceite de 50% de ISA (SEPPIC, Paris) y de 50% 15 de una disolución acuosa del péptido de síntesis KYQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQL derivado de TNFα

humano acoplado al KLH (100 μg/dosis).

LISTADO DE SECUENCIAS

20 <110> Jean-François, ZAGURY

<120> Péptidos procedentes de citoquinas y su aplicación en terapéutica

<130> bif022175 pct

<160> 55

<170> PatentIn version 3,2 25

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <400> 1

<210>2

<211> 11 35 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

40 <210>3

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> PRT 50 <213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 16 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

15 <210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 36

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9 30 <211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <400> 12

<210> 13

<211> 31 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

25 <210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 35

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

10 <210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 24

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19 25 <211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <400> 20

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

10 <210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 13

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24 25 <211> 36

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <400> 25

<210> 26

<211> 36 40 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

10 <210> 28

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 10

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30 25 <211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

30 <210>31

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <400> 31

<210> 32

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

10 <210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 18

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35 25 <211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <400> 36

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 12 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

15 <210> 39

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 24

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41 30 <211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens 40 <400> 42

<210> 43

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

10 <210> 44

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 17

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46 25 <211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35 <400> 47

<210> 48

<211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 32

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50 15 <211> 30

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 45

<212> ADN

<213> Homo sapiens 25 <400> 51

<210> 52

<211> 33 30 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 52

35 <210> 53

<211> 291

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211>9

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 16

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 55

Claims

REIVINDICACIONES

1. Vacuna que contiene un compuesto inmunogénico que comprende un péptido que tiene un tamaño comprendido

entre 10 y 30 aminoácidos, y que tiene más de 80% de identidad con la secuencia peptídica de citoquina IL-1 beta 5 siguiente:

123-STSQAENMPV-132 (ID SEQ Nº 3);

en la que dicho compuesto inmunogénico no comprende otros epítopos de dicha citoquina y en la que dicho 10 compuesto inmunogénico es capaz de generar en un sujeto anticuerpos que reconocen la citoquina nativa.
2. Vacuna, según la reivindicación 1, para un uso para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes.
3. Vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho péptido está acoplado a una proteína 15 portadora.
4. Vacuna, según la reivindicación 3, en la que dicha proteína portadora se selecciona entre KLH, Tetanus Toxoid, la transferrina y la ferritina.

20 5. Vacuna, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además uncoadyuvante de inmunidad mineral, oleoso o de síntesis.
6. Vacuna, de ADN que codifica el péptido, tal como se ha definido en la reivindicación 1. 25

Figura 1

Figura 2