ES2375577T3

ES2375577T3 - Método de pronóstico.

Info

Publication number: ES2375577T3
Application number: ES07789645T
Authority: ES
Inventors: Arrate Eguiara; Diego TEJEDOR HERN�?NDEZ; Antonio MART�?NEZ MART�?NEZ; Laureano SIMÓN BUELA
Original assignee: Juste Quimico Farmaceutica SA; Progenika Biopharma SA
Current assignee: Juste Quimico Farmaceutica SA; Progenika Biopharma SA
Priority date: 2006-07-12
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2012-03-02
Anticipated expiration: 2027-07-12
Also published as: GB0613844D0; EP2061910A2; ATE529537T1; CA2657493A1; WO2008010085A2; EP2061910B1; US20100087441A1; US8712696B2; WO2008010085A3; DK2061910T3

Abstract

Un método de pronóstico de un f enotipo de r emisión de la artritis reumatoide (RA) en un sujeto que tiene RA, comprendiendo dicho método determinar (i) el genotipo de un individuo al menos en la posición de polimorfismo de un solo nucleótido en rs2476601; y (ii) una representación binaria del nivel de anticuerpo anti-péptido cíclico citrulinado (ANTI-PCC BI) en el suero del sujeto.

Description

Metodo de pronostico.

Solicitudes relacionadas

[0001] Esta solicitud esta relacionada con la Solicitud de Patente del Reino Unido N° 0613844.0, presentada el 12 de julio de 2006.

Campo de la invención

[0002] La invencion se refiere a metodos y productos, en particular, a micromatrices para el genotipado in vitro de variaciones geneticas asociada a artritis reumatoide (RA). La i nvencion se refiere ademas a metodos para el pronostico y tratamiento de la RA, y a productos para su uso en los mismos.

Antecedentes de la invención

[0003] La artritis reumatoide (RA) es un trastorno inflamatorio cronico que caracteristicamente tiene implicacion articular. La prevalencia es de aproximadamente el 0,8 (aproximadamente 2,9 millones de personas en Europa), con algunas variaciones entre grupos etnicos. La RA es mas comun en mujeres que en hombres. [0004] En el proceso patologico de la RA, la inflamacion implica a la membrana sinovial y puede causar danos al cartilago y al propio hueso. Las areas que pueden afectarse incluyen las articulaciones de las manos, munecas, cuello, mandibula, codos, pies y tobillos. Con frecuencia, la RA causa que las articulaciones del cuerpo se vean afectadas de una forma simetrica, lo que significa que la enfermedad ataca a la misma articulacion en ambos lados del cuerpo, por ejemplo, ambas manos. [0005] El diagnostico de RA se realiza actualmente de acuerdo con los criterios expuestos por el Colegio Americano de Reumatologia en 1987 (publicados en Arnett et al., Arthritis and Rheumatism 1988 Mar; 31(3): 31524). [0006] Se usan comunmente varios agentes farmacologicos para gestionar los signos y sintomas de la RA. Estos se incluyen en cuatro clases principales: AINE (farmacos antinflamatorios no esteroideos), que alivian el dolor y la inflamacion asociados con la RA; DMARD (farmacos antirreumaticos modificadores de enfermedad), que tanto alivian los sintomas como ayudan a controlar la RA por modificacion de su proceso patologico); glucocorticoides (un grupo de farmacos antinflamatorios que estan relacionados con el cortisol, una hormona esteroidea natural producida por el cuerpo); y agentes biologicos (farmacos como Kineret® (anakinra), que estan disenados para dirigirse a moleculas especificas en el sistema inmune que contribuyan al proceso patologico de la RA. [0007] Los estudios epidemiologicos y geneticos han proporcionado pruebas de la presencia de factores de susceptibilidad genetica para la RA, que representan aproximadamente el 60% de la variacion en la predisposicion a la enfermedad. La identificacion de aquellos genes relacionados con la RA podria llevar a una mejor compresion de la patogenesis, diagnostico, localizacion y pronostico y, en ultima instancia, a un tratamiento adecuado apropiado. Desde un punto de vista clinico, el diagnostico, pronostico y localizacion tempranos de la enfermedad significaria un cambio importante en las decisiones terapeuticas usadas para el tratamiento. [0008] Los estudios de asociacion han identificado recientemente varios genes en los que una o mas variaciones geneticas dan como resultado un mayor o menor riesgo de contraer esta enfermedad, una mejor o peor respuesta a farmacos y/o un mejor o peor pronostico. Un medio de caracterizacion de multiples variaciones asociadas a RA que pudiera usarse clinicamente proporcionaria un gran avance en el diagnostico y la terapia. [0009] Con frecuencia se usan microplacas de ADN para discriminar entre alelos en loci geneticos. [0010] En 2001, el Consorcio para el Proyecto del Genoma Humano y la compania privada Celara presentaron el primer ejemplo completo del genoma humano con 30.000 genes. A partir de este momento, comenzo la posibilidad de estudiar el genoma completo o de estudios a gran escala (alto rendimiento). Las denominadas "microplacas de ADN", tambien denominadas "micromatrices", "matrices de ADN" o "biomicroplacas de ADN" son aparatos que puede usar la genomica funcional para estudios a gran escala. La genomica funcional estudia cambios en la expresion de genes debidos a factores ambientales y a caracteristicas geneticas de un individuo. Las secuencias genicas presentan pequenas variaciones interindividuales en un unico nucleotido denominadas SNP ("polimorfismo de un solo nucleotido"), que en un pequeno porcentaje estan implicadas en cambios en la expresion y/o funcion de genes que causan ciertas patologias. La mayoria de los estudios que aplican microplacas de ADN estudian la expresion genica, aunque las microplacas tambien se usan en la deteccion de SNP. [0011] La primera microplaca de ADN fue la "transferencia de Southern", en la que se usaron moleculas de acido nucleico marcadas para examinar moleculas de acido nucleico unidas a un soporte solido. El soporte era tipicamente una membrana de nylon.

[0012] Dos avances marcaron el comienzo definitivo de la microplaca de ADN. El uso de un soporte solido no poroso, tal como vidrio, permitio la miniaturizacion de matrices, permitiendo de este modo que se incorporasen un gran numero de caracteristicas de sondas individuales sobre la superficie del soporte a una densidad de >1.000 sondas por cm2. La adaptacion de tecnicas fotolitograficas semiconductoras permitio la produccion de microplacas de ADN que contenian mas de 400.000 oligonucleotidos diferentes en una region de aproximadamente 20 !m2, denominadas microplacas de ADN de alta densidad.

[0013] En general, una microplaca de ADN comprende un soporte solido que contiene cientos de fragmentos de secuencias de di ferentes genes representados en f orma de ADN, A DNc u oligonucleotidos fijos, uni dos a la superficie solida en posiciones fijas. Los soportes son generalmente portaobjetos de vidrio para el microscopio, membranas de nylon o "microplacas" de silicio. Es importante que las secuencias de nucleotidos o sondas se unan al soporte en posiciones fijas, ya que la localizacion robotizada de cada sonda determina el gen cuya expresion se esta midiendo. Las microplacas de ADN pueden clasificarse como:

-: microplacas de ADN de alta densidad: los oligonucleotidos que se encuentran en la superficie del soporte, por ejemplo, portaobjetos de vidrio, se han sintetizado "in situ", mediante un metodo denominado fotolitografia.

-: microplacas de ADN de baja densidad: losoligonucleotidos, ADNc o fragmentos deamplificacion por PCR se depositan en forma de nanogotas en la superficie del soporte, por ejemplo, vidrio, por medio de un robot que imprime esas secuencias de ADN en el soporte. Hay muy pocos ejemplos de microplacas de ADN de baja densidad que e xistan: u na m icroplaca d e A DN p ara detectar 5 m utaciones en el ge n d e t irosinasa; una microplaca de A DN par a d etectar m utaciones en p 54 y k -ras; u na microplaca de A DN par a detectar 12 mutaciones que causan cardiomiopatia hipertrofica; una microplaca de ADN para el genotipado de cepas de Escherichia coli; o microplacas de ADN para detectar patogenos tales como Cryptosporidium parvum o rotavirus.

[0014] Para estudios de expresion genetica, las sondas depositadas en la superficie solida, por ejemplo, vidrio, se hibridan con ADNc sintetizados a partir de ARNm extraidos de una muestra dada. En general, el ADNc se ha marcado co n un f luoroforo. C uanto m ayor se a el numero d e m oleculas de A DNc unidas a su se cuencia complementaria en la microplaca de ADN, mayor sera la intensidad de la senal fluorescente detectada, tipicamente medida con un laser. Esta medida es por tanto un reflejo del numero de moleculas de ARNm en la muestra analizada y, por consiguiente, un reflejo del nivel de expresion de cada gen representado en la microplaca de ADN.

[0015] Las microplacas de ADN de expresion genica tambien contienen tipicamente sondas para la deteccion de la expresion de genes de control, con frecuencia denominados "genes constitutivos", que permiten normalizar los resultados experimentales y que se comparen multiples experimentos de una forma cuantitativa. Con la microplaca de ADN, los niveles de expresion de cientos o miles de genes en una celula pueden determinarse en un solo experimento. El ADNc de un muestra de ensayo y el de una muestra de control pueden marcarse con dos fluoroforos diferentes, de modo que la misma microplaca de ADN puede usarse para estudiar diferencias en la expresion genica.

[0016] Las microplacas de ADN para la deteccion de polimorfismos geneticos, cambios o mutaciones (en general, variaciones geneticas) en la secuencia de ADN comprenden una superficie solida, tipicamente vidrio, sobre la que se depositan un gran numero de secuencias geneticas (las sondas)complementarias alas variaciones geneticas a estudiar. Usando impresoras roboticas convencionales para aplicar sondas a la matriz, puede obtenerse una al ta densidad de caracteristicas de sondas individuales, por ejemplo, pueden conseguirse tipicamente densidades de sondas de 600 caracteristicas por cm2 o mas. La ubicacion de las sondas en una matriz se controla con precision mediante el dispositivo de impresion (robot, impresora de inyeccion, mascara fotolitografica, etc.) y las sondas se alinean en una rejilla. La organizacion de las sondas en la matriz facilita la posterior identificacion de interacciones de sonda-diana especificas. Ademas es comun, pero no necesario, dividir las caracteristicas de la matriz en sectores mas pequenos, tambien en forma de rejilla, a los que posteriormente se hace referencia como submatrices. Las submatrices comprenden tipicamente 32 c aracteristicas de so ndas individuales, aunque ca da su bmatriz puede comprender un numero menor (por ejemplo 16) o mayor (por ejemplo 64 o mas) de caracteristicas.

[0017] Una est rategia usa da para detectar v ariaciones geneticas implica l a hibridacion con se cuencias que reconocen especificamente el alelo normal y el mutante en un f ragmento de ADN obtenido en u na muestra de ensayo. Tipicamente, el fragmento se ha amplificado, por ejemplo, mediante el uso de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), yse ha marcado, por ejemplo, con una molecula fluorescente. Puede usarse un laser para detectar fragmentos marcados unidos en la microplaca y, por lo tanto, un individuo que sea homocigoto para el alelo normal puede distinguirse especificamente de individuos heterocigotos (en el caso de afecciones dominantes autosomicas entonces estos individuos se denominan portadores) o de los que son homocigotos para el alelo mutante.

[0018] Otra estrategia para detectar variaciones geneticas comprende llevar a cabo una reaccion de amplificacion o una reaccion de extension en la propia microplaca de ADN.

[0019] Para metodos basados en hi bridacion di ferencial, existen varios metodos para analizar l os datos de hibridacion para el genotipado:

-: Aumento en el nivel de hibridacion: Se compara el nivel de hibridacion de sondas complementarias con los alelos normales y mutantes.

-: Disminucion en elnivel de hibridacion: Pueden identificarse diferencias en la secuencia entre una muestra de control y una muestra de ensayo por una disminucion en el nivel de hibridacion de los oligonucleotidos totalmente complementarios con una secuencia de referencia. Se produce una perdida completa en individuos homocigotos mutantes, mientras que se produce una perdida de solo el 50% en los heterocigotos. En microplacas de ADN para examinar todas las bases de una secuencia de "n" nucleotidos ("oligonucleotido") de longitud en ambas cadenas, son necesarios un minimo de "2n" oligonucleotidos que solapen con el oligonucleotido previo en toda la secuencia excepto en el nucleotido. Tipicamente, el tamano de los oligonucleotidos es de aproximadamente 25 nucleotidos. El numero aumentado de oligonucleotidos usado para reconstruir la secuencia reduce los errores derivados de fluctuaciones del nivel de hibridacion. Sin embargo, el cambio exacto en la secuencia no puede identificarse con este metodo; posteriormente es necesaria una secuenciacion para identificar la mutacion.

[0020] Cuando se lleva a cabo la amplificacion o extension en la propia microplaca de ADN, se presentan tres metodos a modo de ejemplo:

[0021] En la estrategia de minisecuenciacion, un cebadorespecifico de mutacion se fija sobre el portaobjetos y despues de una reaccion de extension con dideoxinucleotidos fluorescentes, se captura la imagen de la microplaca de ADN con un explorador.

[0022] En la estrategia de extension de cebadores, se disenan dos oligonucleotidos para la deteccion de las secuencias de tipo silvestre y mutante, respectivamente. La reaccion de extension se lleva a cabo posteriormente con un nucleotido marcado fluorescentemente y los nucleotidos restantes sin marcar. En cualquier caso el material de partida puede ser una muestra de ARN o un producto de ADN amplificado por PCR.

[0023] En la estrategia de matrices con etiqueta, se lleva a cabo una reaccion de extension en solucion con cebadores especificos que llevan una secuencia 5' determinada o "etiqueta". El uso de microplacasde ADN con oligonucleotidos complementarios a estas secuencias o "etiquetas" permite la captura de los productos resultantes de la extension. Los ejemplos de esto incluyen la microplaca de ADN de alta densidad "Flex-flex" (Affymetrix).

[0024] Para e l di agnostico g enetico, d ebe t enerse en c uenta la si mplicidad. La n ecesidad de r eacciones de amplificacion y purificacion presenta desventajas para los metodos de extension/amplificacion sobre la microplaca en comparacion con metodos basados en hibridacion diferencial.

[0025] Tipicamente, el analisis de microplacas de ADN se lleva cabo usando tecnicas de hibridacion diferencial. Sin embargo, la hibridacion diferencial no produce una especifidad o sensibilidad tan elevada como los metodos asociados con amplificacion sobre portaobjetos de vidrio. Por esta razon, es necesario el desarrollo de algoritmos matematicos que aumenten la especifidad y sensibilidad de la metodologia de hibridacion (Cutler DJ, Zwick ME, Carrasquillo MN, Yohn CT, Tobi KP, Kashuk C, Mathews DJ, Shah N, Eichler EE, Warrington JA, Chakravarti A. Genome Research; 11: 1913-1925 (2001). La asociacion del polimorfismo PTPN22 y de anticuerpos anti-peptido ciclico citrulinado con laaparicion de RA en el futuro se describe en Johansson M. et al;Arthritis Research & Therapy 2006, 8: R19.

[0026] Por lo tanto, a pesar de los avances en tecnologia, los problemas de los metodos existentes para analizar simultaneamente un gran numero de variaciones geneticas de una forma sensible, especifica y reproducible han impedido la aplicacion de microplacas de ADN para su uso rutinario en el diagnostico clinico.

Descripción resumida de la invención

[0027] Los inventores han identificado nuevos medios para pronosticar fenotipos de RA usando combinaciones de variables de S NP y variables clinicas informativas. Por consiguiente, la invencion proporciona un metodo de pronostico de un fenotipo de artritis reumatoide (RA) en un sujeto, que comprende:

(I): obtener resultados para una o mas variables de polimorfismos de un solo nucleotido yuna o mas variables clinicas enumeradas en la Tabla 11A para el sujeto; y

(II): usar los resultados obtenidos en (I) para pronosticar el fenotipo;

(i): un resultado para una variable de SNP es la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la

posicion del polimorfismo de un solo nucleotido;

(ii): un resultado para la variable clinica ANTI-PCC es el nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado en el suero del sujeto;

en el que (iii) un resultado para la variable clinica ANTI-PCC BI es una representacion binaria del nivel de anticuerpo antipeptido ciclico citrulinado en el suero del sujeto;

(iv): un resultado para la variable clinica VSG es la velocidad de sedimentacion eritrocitaria en la sangre del sujeto;

(v): un resultado para la variable clinica NoARTDOL es el numero de articulaciones dolorosas mencionado por el sujeto;

(vi): un resultado para la variable clinica RF es el nivel de anticuerpo factor reumatoide en el suero del sujeto;

(vii) un resultado para la variable clinica PCR es el nivel de proteina C reactiva en la sangre; y

(viii) un resultado para la variable clinica edad de aparicion es la edad en anos a la que se le diagnostico al sujeto RA;

y en el que:

(a): el fenotipo de RA es una puntuacion de cuestionario de evaluacionde la salud (HAQ) >2 (HAQ>2) y las variables para las que se obtienen resultados en la etapa(I) comprenden las variables de SNP yclinicas de HAQ>2 en la Tabla 11A; y/o

(b): el fenotipo de RA es la presencia de multiples erosiones en las manos y en los pies (RX2) y las variables para las que se obtienen resultados en la etapa (I) comprenden las variables de SNP y clinicas de RX2 en la Tabla 11A; y/o

(c): el fenotipo de RA esrecibir 3 o mas tratamientos diferentes (TTO 30M) ylas variables para las que se obtienen resultados en la etapa (I) comprenden las variables de SNP y clinicas de TTO 30M en la Tabla 11A; y/o

(d): el fenotipo de RA es verse forzado a dejar el empleo debido a RA (dejar el trabajo) y las variables para las que se obtienen resultados en la etapa (I) comprenden las variables de SNP y clinicas de "dejar el trabajo" en la Tabla 11A; y/o

(e): el fenotipo de RA es recibir una protesis articular (intervencion quirurgica) y las variables para las que se obtienen resultados en la etapa (I) comprenden las variables de SNP y clinicas de "intervencion quirurgica" en la Tabla 11A; y/o

(f): el fenotipo de RA es la intolerancia a metotrexato y las variables para las que obtienen resultados en la etapa

(I): comprenden las variables de SNP y clinicas de "intolerancia a metotrexato" en la Tabla 11A; y/o

(g): el f enotipo de R A es la r emision y l as variables para l as que se obt ienen r esultados en l a et apa ( I) comprenden las variables de SNP y clinicas de "remision" en la Tabla 11A.

[0028] La invencion tambien proporciona un metodo de obtencion de una funcion de probabilidad para su uso en el pronostico de un fenotipo de RA, un metodo computacional de obtencion de una funcion de probabilidad para su uso en el pronostico de un fenotipo de RA, yun metodo para el pronostico de un fenotipo de RA en un sujeto, que comprende el uso de una funcion de probabilidad obtenida usando los datos de cualquiera de las Tablas 4 a 10, como se expone en las reivindicaciones.

[0029] Los inventores tambien han identificado SNP que tienen una asociacion alelica significativa con el recidivado del cancer de prostata. Por consiguiente, la invencion tambien proporciona un metodo de pronostico de un fenotipo deRA en un sujeto, que comprende determinar el genotipo del sujeto en una o mas posiciones de polimorfismo de un solo nucleotido seleccionadas de los SNP de la Tabla 12.

[0030] La invencion tambien proporciona un metodo in vitro para genotipar variaciones geneticas asociadas a RA en un individuo, como se expone en las reivindicaciones.

[0031] Los aspectos adicionales de la invencion incluyen un metodo computacional para obtener un genotipo a partir de datos de intensidad de hibridacion de microplaca de ADN, un metodo de obtencion de funciones lineales para su uso en un metodo de genotipado de la invencion, un metodo computacional de obtencion de funciones lineales para su uso en un metodo de genotipado de la invencion, un metodo de diagnostico de RA o susceptibilidad a RA en un individuo, que comprende genotipar a un individuo con respecto a una o mas variaciones geneticas, metodos para seleccionar untratamiento para RA en un sujeto y paratratar la RA en un sujeto, un metodo de identificacion de variaciones geneticas predictivas de un fenotipo de RA particular, y un metodo de prediccion del probable desarrollo de un fenotipo de RA en un individuo usando la variacion o variaciones identificadas.

[0032] Todavia m as aspectos incluyen u n si stema i nformatico que c omprende un procesador y m edios para controlar el procesador para llevar a cabo un metodo computacional de la invencion, un programa informatico que comprende un codigo de programa informatico que,cuando se ejecuta en un ordenador o red de ordenadores, provoca que el ordenador o red de ordenadores lleven a cabo un metodo computacional de la invencion.

[0033] La invencion tambien proporciona una microplaca de ADN o micromatriz adecuada para su uso enlos metodos de la invencion, una sonda oligonucleotidica, pareja de sondas o conjunto de 4 sondas enumerado en la Tabla 2 (Figura 2), un cebador oligonucleotidico o pareja de cebadores enumerado en la Tabla 3 (Figura 3), un kit de amplificacion por PCR, que comprende al menos una pareja de los cebadores enumerados, un kit de diagnostico para ladeteccion de variaciones geneticas asociadas a RA,y un kit para el pronostico de un fenotipo de RA en un sujeto.

[0034] En particular, se describen las realizaciones siguientes.

-: 1. Un metodo de pronostico de un fenotipo de remision dela artritis reumatoide (RA) en un sujeto que tiene RA, comprendiendo dicho metodo determinar (i) el genotipo de un individuo al menos en la posicion de polimorfismo de un solo nucleotido en rs2476601; y (ii) una representacion binaria del nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC BI) en el suero del sujeto.

-: 2. Un metodo de acuerdo con la realizacion 1, en el que el metodo comprende:

(I): obtener resultados:

(i): de la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en el alelo nulo del gen de la Glutation S-transferasa M1 (GSTM1) y en rs2476601; y

(ii): de una representacion binaria del nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC BI) en el suero del sujeto; y

(II): usar los resultados obtenidos en (I) para pronosticar el fenotipo de remision de RA.

-: 3. Un metodo de acuerdo con la realizacion 1 o la realizacion 2, que comprende ademaspronosticar un fenotipo de artritis reumatoide (RA) agresivo en el sujeto, comprendiendo dicho fenotipo de RA agresivo uno o mas de: una puntuacion de cuestionario de evaluacion de la salud (HAQ) de >2 (HAQ>2); la presencia de multiples erosiones en las manos y en los pies (RX2); recibir 3 o mas tratamientos diferentes (TTO 30M); verse forzado a dejar el em pleo deb ido a l a R A ( dejar e l t rabajo); y r ecibir u na pr otesis articular ( intervencion q uirurgica), comprendiendo dicho metodo:

(I): obtener resultados de acuerdo con el modelo 1, modelo 2, modelo 3, modelo 4 y/o modelo 5 para el sujeto; y

(II): usar los resultados obtenidos en (I) para pronosticar el fenotipo de RA agresivo,

en el que:

(a): cuando el fenotipo de RA agresivo comprende una puntuacion de cuestionario de evaluacion de la salud (HAQ) de > 2 ( HAQ>2), di cha et apa ( I) co mprende l os resultados de acuerdo con d icho m odelo 1, comprendiendo dichos resultados:

(i): la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs1800790 y rs2070874M;

(ii): el nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC) en el suero del sujeto; y

(iii) la velocidad de sedimentacion eritrocitaria (VSG) en la sangre del sujeto,

(b): cuando el fenotipo de RA agresivo comprende la presencia de multiples erosiones en las manos y en los pies (RX2), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 2, comprendiendo dichos resultados:

(i): la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs1544410, rs2071592, rs187238 y rs1801275;

(ii): una representacion binaria del nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC BI) en el suero del sujeto; y

(iii) el numero de articulaciones dolorosas (NoARTDOL) mencionadas por el sujeto,

(c): cuando el fenotipo de RA agresivo comprende recibir 3 o mas tratamientos diferentes (TTO 30M), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 3, comprendiendo dichos resultados:

(i): la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs7531668, rs419598 y rs1024611;

(ii): el nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC) en el suero del sujeto;

(iii) el nivel de anticuerpo Factor Reumatoide (RF) en el suero del sujeto;

(iv): el nivel de proteina C reactiva (PCR) en la sangre del sujeto; y

(v): la edad en anos a la que se le diagnostico al sujeto la RA,

(d): cuando el fenotipo de RA agresivo comprende verse forzado a dejar el empleo debido a la RA (dejar el trabajo), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 4, comprendiendo dichos resultados:

(i) la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs1042522, el alelo nulo del gen de la Glutation S-transferasa T1 (GSTT1) y rs1801133,

(e): cuando el fenotipo de RA agresivo comprende recibir una protesis articular (intervencion quirurgica), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 5, comprendiendo dichos resultados:

(i): la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs2268277, rs1042522, rs10735810 y rs3025039;

(iii) la velocidad de sedimentacion eritrocitaria (VSG) en la sangre del sujeto.

-: 4. El metodo de acuerdo con la realizacion 1 o la realizacion 2, en el que el metodo comprende ademas pronosticar el fenotipo de RA de intolerancia a metotrexato, en el que:

dicha etapa (I) comprende ademas obtener resultados de acuerdo con el modelo 6, comprendiendo dichos resultados:

(i): la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en rs1801133; y

(ii): la edad en anos a la que se le diagnostico al sujeto la RA.

-: 5. El metodo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 4, en el que en la etapa (II), solo se usan los resultados obtenidos en la etapa (I) para pronosticar el fenotipo de RA.

-: 6. El metodo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la obtencion de resultados para variables de SNP comprende el analisis de micromatrices o la secuenciacion.

-: 7. El metodo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en el que la obtencion de resultados para variables de SNP comprende el uso de una o mas parejas de sondas oligonucleotidicas enumeradas en la Figura

2.

-: 8. El metodo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en el que la obtencion de resultados para variables de SNP comprende la amplificacion de acido nucleico obtenido del sujeto, y el metodo comprende el uso de una o mas parejas de cebadores oligonucleotidicos enumeradas en la Figura 3.

-: 9. El metodo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (II) comprende:

(i): introducir los resultados determinados en la etapa (I) en una funcion de probabilidad, calculando de este modo un valor de funcion de probabilidad; y

(ii): comparar el valor de la funcion de probabilidad con los valores de la funcion de probabilidad calculados para individuos de fenotipo conocido.

-: 10. El metodo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, que comprende el uso de una funcion de probabilidad obtenida usando los datos de cualquiera de las Tablas 4 a 10.

-: 11. Un metodo de seleccion de un tratamiento adecuado para tratar la RA en un sujeto, comprendiendo el metodo:

(a): p ronosticar un f enotipo d e R A en el sujeto m ediante un m etodo de acu erdo co n cu alquiera d e l as realizaciones anteriores; y

(b): seleccionar un tratamiento que sea adecuado para el fenotipo de RA determinado.

[0035] Todos estos aspectos de la invencion son como se exponen en las reivindicaciones.

Breve descripción de las secuencias

[0036]

Las SEC ID N°: 1-360 son sondas adecuadas para la deteccion de las variaciones geneticas asociadas a RA de la Tabla 1A (o Tabla 1B). Las secuencias de sondas se muestran en la Tabla 2.

Las SEC ID N°: 361-540 son cebadores de PCR adecuados para amplificar regiones de ADN diana que comprenden variaciones geneticas asociadas a RA enumeradas en la Tabla 1A (o Tabla 1B). Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 3.

La SEC ID N°: 541 es un acido nucleico de control externo.

Las SEC ID N°: 542 y 543 son sondas adecuadas para la deteccion del acido nucleico de control externo de la SEC ID N°: 541.

La SEC ID N°: 544 es una secuencia de TAG directa.

La SEC ID N°: 545 es una secuencia de TAG inversa.

Breve descripción de los dibujos

[0037]

Figura 1

Las Tablas 1A y 1B enumeran variaciones geneticas asociadas con RA que pueden analizarse de acuerdo con la invencion. Las secuencias de todos los genes mencionados en las Tablas 1A y 1B se conocen y reconocen en el sitio web siguiente: GeneBank (NcRI), GeneCard (Weizmann Institute of Sciences) y snpper.chip.org (Innate Immunity PLA). La Tabla 1A de la Solicitud del Reino Unido N° 0613844.0 incluia un polimorfismo adicional, el polimorfismo IL6-174. En un aspecto, la Tabla 1A como se usa en la presente memoria puede incluir ademas este polimorfismo.

Figura 2

La Tabla 2 enumera sondas oligonucleotidicas para discriminar entre alelos en los SNP enumerados en las Tablas 1A y 1B. La Tabla enumera dos parejas de sondas para cada SNP (un conjunto de cuatro sondas).

Figura 3

La Tabla 3 enumera cebadores oligonucleotidicos para amplificacion por PCR de cada uno de los SNP enumerados en las Tablas 1A y 1B.

Figura 4

(A): Tabla 4, que muestra los dos SNP (40 y 78) y las 2 variables clinicas (VSG y ANTI-PCC) junto con su significacion (Sig.) y sus oportunidades relativas (Exp (B)) usados para calcular el modelo para la prediccion del fenotipo de HAQ>2. Este modelo proporciona la probabilidad de desarrollar un fenotipo de HAQ>2 a partir de 0 (sin riesgo) a 1 (riesgo maximo).

(B): Curva de ROC (caracteristicas operativas del receptor) obtenida para el modelo de HAQ>2 que permite la estimacion de su potencia discriminatoria. La curva de ROC se ha calculado para maximizar la especifidad, reduciendo de este modo al mismotiempo el indice de "falsos"positivos.Una especifidad del 95% con una sensibilidad del 41% es el punto de corte para este modelo respecto alfenotipo de HAQ>2. Este modelo muestra un valor de cociente de verosimilitud (LR) de 8.

Figura 5

(A): Tabla 5, que muestra los dos SNP (28 y 41) y la variable clinica (ANTI-PCC BI) junto con su significacion (Sig.) y sus oportunidades relativas (Exp (B)) usados para calcular el modelo para la prediccion del fenotipode REMISION (el paciente no preciso ningun tratamiento en los ultimos 5 anos).

(B): Curva de ROC obtenida para el modelo del fenotipo de REMISION. Como se muestra por la curva, se obtuvo una sensibilidad del 71% y una especifidad del 89% con un LR de 6,5 para este modelo.

Figura 6

(A): T abla 6 , que m uestra los cuatro S NP ( 14, 1 5, 20 y 26) y l as dos variables clinicas (numero de articulaciones implicadas y ANTI-PCC BI) junto con su significacion (Sig.) y sus oportunidades relativas (Exp (B)) usados para calcular el modelo para la prediccion del fenotipo de RX2.

(B): Curva de ROC obtenida para el modelo del fenotipo de RX2. Como se muestra por la curva, se obtuvo una sensibilidad del 41% y una especifidad del 95% con un LR de 6,5 para este modelo.

Figura 7

(A): Tabla 7, que muestra los tres SNP (16, 27 y 73) y las cuatro variables clinicas (y ANTI-PCC, FR, PCR y edad de aparicion) junto con su significacion (Sig.) y sus oportunidades relativas (Exp (B)) usados para calcular el modelo para la prediccion del fenotipo de TTO 3OM.

(B): Curva de ROC obtenida para el modelo del fenotipode TTO 3OM. Como se muestra por la curva, se obtuvo una sensibilidad del 31% y una especifidad del 95% con un LR de 6,2 para este modelo.

Figura 8

(A): Tabla 8, que muestra los cuatro SNP (2, 12, 29 y 32) y las dos variables clinicas (y ANTI-PCC y VSG) junto con su significacion (Sig.) y sus oportunidades relativas (Exp (B)) usados para calcular el modelo para la prediccion del fenotipo de intervencion quirurgica.

(B): Curva de ROC obtenida para el modelo del fenotipo de intervencion quirurgica. Como se muestra por la curva, se obtuvo una sensibilidad del 23% y una especifidad del 95% con un LR de 5,4 para este modelo.

Figura 9

(A): Tabla 9,que muestra lostres SNP(32, 42 y50) junto con su significacion(Sig.)y susoportunidades relativas (Exp (B)) usados para calcular el modelo para la prediccion del fenotipo de "dejar el trabajo".

(B): Curva de ROC obtenida para el modelo del fenotipo de "dejar el trabajo". Como se muestra por la curva, se obtuvo una sensibilidad del 10% y una especifidad del 95% con un LR de 1,9 para este modelo.

Figura 10

(A): Tabla 10, que muestra el SNP (50) y la variable clinica (edad de aparicion) junto con su significacion (Sig.) y sus oportunidades relativas (Exp (B)) usados para calcular el modelo para la prediccion del fenotipo de "respuesta a la terapia".

(B): Curva de ROC obtenida para el modelo del fenotipo de "respuesta a la terapia". Como se muestra por la curva, se obtuvo una sensibilidad del 16% y una especifidad del 96% con un LR de 4,3 para este modelo.

Figura 11

(A): La Tabla 11 muestra las variables de SNP y las variables clinicas incluidas en cada uno de los modelos 1 a 7 descritos en la presente memoria. La Tabla indica que variables de SNP y variables clinicas (de las enumeradas en la primera columna) son informativas para determinar cada fenotipo, y muestra que resultado para cada variable esta asociado con un mal pronostico de fenotipo.

(B): La Tabla 11B proporciona mas informacion incluyendo identificadores rs para los SNP de la Tabla 11A.

Figura 12

La Tabla 12 enumera las asociaciones alelicas de SNP individuales con los fenotipos de RA descritos en la presente memoria.

Descripción detallada de la invención

[0038] La artritis reumatoide (RA) presenta variosfenotipos, mas notablemente en terminos de gravedad de la enfermedad. L a enf ermedad l eve se d istingue d e l a enfermedad gr ave y d estructiva, asi co mo l a ve locidad y naturaleza de la progresion de la enfermedad. Se cree que l a heterogeneidad clinica esta correlacionada con la heterogeneidad genetica.

[0039] Usando la Artchip de la presente invencion y la investigacion clinica, los inventores han identificado varios perfiles (basandose en combinaciones de variables de SNP y clinicas) que son informativos para predecir fenotipos de RA. Los inventores han establecido por lo tanto modelos para predecir el curso de la RA en pacientes con RA. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion se refiere a metodos para el pronostico de la RA.

[0040] Por ejemplo, la invencion se refiere a metodos para predecir una RA agresiva, segun este representada por uno o mas de los siguientes fenotipos:

1.: tener un cuestionario de evaluacion de la salud de mas de 2;

2.: tener multiples erosiones en las manos y en los pies;

3.: recibir 3 o mas tratamientos diferentes;

4.: verse obligado a dejar el trabajo; y

5.: necesidad de protesis articular (intervencion quirurgica).

[0041] La invencion tambien se refiere a metodos para predecir la respuesta a la terapia, en particular para predecir la tolerancia a metotrexato. La invencion se refiere ademas a metodos para predecir la remision.

[0042] Los inventores seleccionaron una poblacion de estudio de individuos espanoles, como en el Ejemplo 2. Cada individuo se evaluo clinicamente para determinar la presencia (si) o aus encia (no) de cada uno de siete fenotipos, en concreto los fenotipos 1 a 5 anteriores,el fenotipo de intolerancia a metotrexato yel fenotipo de remision.

[0043] Cada individuo se ensayo tambien para las variables clinicas y analiticas basales, y se genotipo en varios loci geneticos usando la micromatriz de ADN Artchip de la presente invencion (vease el Ejemplo 2). Los inventores usaron despues analisis genetico para seleccionar un subconjunto de los SNP mas informativos para un modelado adicional. Se llevaron a cabo analisis estadisticos para establecer siete modelos (basandose en combinaciones de SNP informativos y variables clinicas informativas) que permitiran una discriminacionfiable entre pacientes con formas alternativas (si y no) de cada fenotipo en la poblacion con alta especifidad, sensibilidad y precision.

[0044] Las variables de SNP y clinicas que se seleccionaron para su inclusion en los modelos 1 a 7 se enumeran en la Tabla 11A (Figura 11A). La Tabla tambien muestra que alelos de SNP estan asociados con un mal pronostico para cada fenotipo. Las variables de SNP incluidas en los modelos se enumeran en mas detalle en la Figura 11B (Tabla 11B).

[0045] El modelo 1 permite la discriminacion entre pacientes que tienen un cuestionario de evaluacion de la salud de mas de 2 y de menos de 2. El modelo 2 permite la discriminacion entre pacientes que tienen o no multiples erosiones en manos y pies. El modelo 3 permite la discriminacion entre pacientes que reciben tres o mas tratamientos diferentes y pacientes que reciben menos de tres tratamientos. El modelo 4 permite la discriminacion entre pacientes cuya enfermedad les obliga a dejar su trabajo y pacientes que no se encuentran en este caso. El modelo 5 permite la discriminacion entre pacientes queprecisanyque no precisan una intervencion quirurgica (protesis articular). El modelo 6 permite la discriminacion de pacientes entre pacientes que tienen y que no tienen intolerancia al metotrexato. El modelo 7 permite la discriminacion de pacientes entre pacientes que consiguen y no que consiguen una remision.

[0046] Las Figuras 4 a 10 m uestran l as curvas de R OC, la sensibilidad, la especificidad y los cocientes de verosimilitud positiva (LR+) de todos los modelos desarrollados por los inventores.

[0047] Las Tablas 4 a 10 muestran el calculo de funciones de probabilidad usando las variables de SNP y clinicas de discriminacion para cada uno de los modelos. Las funciones de probabilidad de regresion se construyen usando el paquete estadistico para las ciencias sociales (SPSS Inc. Headquarters,Chicago, IL, Estados Unidos) Version 14.0, SPSS Version 14. B es el coeficiente asociado a cada genotipo en la funcion de probabilidad. ET es el error en el calculo de B. Wald es la prueba estadistica. GL son los grados de libertad. Sig .P es el valor de B para la prueba de Wald. EXP (B) es el riesgo relativo.

[0048] Las variables clinicas y de SNP identificadas ylos modelos construidos usandolas proporcionan nuevos medios para predecir el desarrollo de cada uno de los fenotipos correspondientes en un sujeto. Por lo tanto, la invencion proporciona metodos para el pronostico de la RA y, en particular, para predecir el riesgo de desarrollar un fenotipo agresivo de RA, un fenotipo de intolerancia a metotrexato y un fenotipo de remision, como se describen en la presente memoria.

[0049] La RA agresiva puede estar representada clinicamente por uno de varios fenotipos de presentacion, y las referencias a la prediccion de RA agresiva pueden referirse a predecir la verosimilitud de desarrollar uno o mas de estos fenotipos.

[0050] Los fenotipos de presentacion para la RA agresiva se enumeran a continuacion.

HAQ>2

[0051] El cuestionario de evaluacion de la salud (HAQ) (publicado en Sokka T, Krishnan E, H�kkinen A, Hannonen P, Arthritis Rheum. Ene 2003; 48(1): 59-63) mide la capacidad de los pacientes con RA para llevar a cabo tareas normales en la vida diaria. Una puntuacion de H AQ demas de 2 ( HAQ>2) indica que la enfermedad RA esta avanzando relativamente rapidamente, y que l a RA es ta causando una i ncapacidad funcional i mportante. Se conocen en la tecnica metodos para llevar a cabo un HAQ y calcular la puntuacion del HAQ.

Multiples erosiones en manos y pies (RX2)

[0052] La presencia de multiples erosiones en las manos y en los pies puede medirsepor inspeccion visual de rayos x de pacientes. Cuanto mayor sea el numero de erosiones, mas agresiva se considera que es la enfermedad (Rossi F, Di Dia F, Galip6 O, Pistorio A, Valle M, Magni-Manzoni S, Ruperto N, Toma P, Martini A, Ravelli A., Arthritis Rheum. Oct 2006 15; 55(5): 717-23). Tipicamente, se considera que un paciente presenta el fenotipo de multiples erosiones si las erosiones estan afectando a multiples articulaciones y se consideran graves.

Recibir >3 tratamientos diferentes (TT0 30M)

[0053] En general, se considera que un paciente presenta el fenotipo de recibir 3 o mas tratamientos diferentes si el paciente no mejora despues de dos tratamientos diferentes y tiene que prescribirse otro.

Obligacion de dejar el trabajo (dejar el trabajo)

[0054] Los medicos en general consideran que una persona que padece una RA agresiva es mas probable que tenga que dejar su trabajo. Se considera que un paciente presenta el fenotipo de dejar el trabajo si el o ella se ve forzado a dejar su empleo debido a la RA.

Recibir una protesis articular (intervencion quirurgica)

[0055] La RA agresiva requiere normalmente una intervencion quirurgica en las articulaciones para insertar protesis articulares (Verstappen SM, Hoes JN, Ter Borg EJ, Bijlsma JW, Blaauw AA, van Albada-Kuipers GA, van Booma-Frankfort C, Jacobs JW., Ann Rheum Dis. Nov 2006; 65(11): 1506-11). Se considera que un paciente presenta este fenotipo si recibe una protesis articular.

[0056] Uno o mas de cualquiera de los modelos para predecir estos fenotipos de presentacion puede considerarse como un modelo para predecir la RA agresiva.

[0057] Otro fenotipo que puede predecirse de acuerdo con la invencion es la probable respuesta a la terapia. En particular, la prediccion de probable intolerancia a metotrexato. En general, la intolerancia a metotrexato se ensaya clinicamente ensayando los efectos toxicos relacionados con la respuesta a la dosis, tales como intolerancia gastrointestinal, anomalias hematologicas, alopecia, hepatotoxicidad y toxicidad pulmonar. Aproximadamente del 30 al 90% de los pacientes a los que se administra metotrexato mostraran intolerancia (McKendry RJ, Dale P., J Rheumatol. Nov 1993; 20(11): 1850-6). En gen eral, se co nsidera q ue un p aciente pr esenta el f enotipo d e metotrexato si muestra un efecto secundario relacionado con la administracion del farmaco.

[0058] La invencion tambien proporciona medios para predecir la verosimilitud de la remision en pacientes con RA. En general, se considera que un sujeto tiene el fenotipo de remision si hay una ausencia completa de dolor en las articulaciones en ausencia de terapia durante al menos cinco anos.

[0059] En general, el sujeto en los presentes metodos es un ser humano. El sujeto puede ser, por ejemplo, chino, japones o caucasico. Preferentemente, el sujeto es un caucasico tal como un individuo espanol. El sujeto puede ser masculino o femenino, incluso si para la artritis reumatoide la proporcion de mujeres respecto a hombres es de 3:1.

[0060] Preferentemente, el sujeto cumple los criterios clinicos para el diagnostico de artritis reumatoide, segun se decidieron por el Colegio Americano de Reumatologia en 1987 (criterios del ACR 1987). Estos criterios se han publicado por Arnette et al (Arthritis and Rheumatism, 1988). Al sujeto ya se le ha diagnosticado RA.

[0061] Tipicamente, el presente metodo puede usarse para pronosticar la verosimilitud del desarrollo de uno o mas de los fenotipos descritos en la presente memoria, por ejemplo, en cualquier momento durante los 5 anos despues del diagnostico.

[0062] Los presentes metodos de pronostico implican determinar un resultado para uno o mas predictores o variables de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP). Las variables de SNP se enumeran en las Tablas 11A y A11B. Los SNP incluidos en los modelos 1 a 7 se enumeran en la Tabla 11A. Los codigos de RefSNP (n° rs) para cada SNP se toman de la Base de Datos de Polimorfismos de un Solo Nucleotido (dbSNP) corregida por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp, el 22 de junio de 2007). Observese que no estan asignados numeros rs a alelos NULOS.

[0063] Un resultado para una variable de SNP dada es la identidad del nucleotido en esa posicion en la secuencia de ADN genomico de un sujeto, o el genotipo del sujeto en ese SNP. Por lo tanto, un resultado para un SNP dado puede ser A, T, C o G.

[0064] La Tabla 11B enumera los polimorfismos que existen en cada uno de los SNP incluidos en los presentes modelos, y la Tabla 11A enumera, para cada SNP, el polimorfismo o alelo que esta asociado con un mal pronostico para cada uno de los fenotipos.

[0065] Los inventores descubrieron que por determinacion de resultados para estos SNP informativos (es decir, identidades de nuc leotidos e n l os SNP), o co mbinaciones particulares de l os mismos, es posible eva luar l a verosimilitud de un fenotipo particular, por ejemplo, RA agresiva, intolerancia a metotrexato o remision, en un sujeto.

[0066] Los presentes metodos de pronostico tambien pueden comprender determinar un resultado para una o mas variables clinicas para un sujeto. Estas variables clinicas tambien se enumeran en la Tabla 11A, junto con el resultado clinico para cada variable que esta asociado con un mal pronostico.

[0067] El ANTI PCC es una variable clinica que se refiere al nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado en el suero del paciente. Esta es una medida en U/ml y esta en el intervalo de 0-1700 U/ml. En los modelos, esta medida es una variable continua que se incluye en la funcion de regresion logistica. Por lo tanto, un resultado para esta variable son las unidades por mililitro medidas en el suero del paciente.

[0068] El ANTI PCC BI es una representacion binaria de la variable clinica ANTI PCC continua. Tipicamente, los niveles en suero de anticuerpo se miden y se determina si el nivel de anticuerpo esta por encima o por debajo de un valor umbral dado. Si el nivel esta por encima del umbral, este se clasifica como elevado (1). Si el nivel esta por debajo del umbral, este se clasifica como reducido o ausente (0). Por lo tanto, un resultado para esta variable es de 0 o 1.

[0069] La sedimentacion eritrocitaria (VSG) es una variable continua y se refiere al tiempo que le lleva a la parte solida de la sangre sedimentar a p artir de la parte liquida. Esto puede medirse (tipicamente en mm/h) usando tecnicas convencionales(Vives-Corrons JL, Jou JM. Sangre (Barc). 1982; 27(4A): 573-8). En los modelos esta medida es una variable continua que se incluye en la funcion de regresion logistica. Por lo tanto, un resultado para esta variable es un valor en mm/h.

[0070] El numero de articulaciones implicadas (NoARTDOL) es una variable continua que se refiere al numero de articulaciones que estan causando dolor al paciente. Tipicamente se evalua por interrogatorio del paciente. En los modelos, esta medida es una variable continua que se incluye en la funcion de regresion logistica. Por lo tanto, un resultado para esta variable es el numero de articulaciones dolorosas mencionadas por los pacientes.

[0071] El ensayo de Factor Reumatoide (RF) se usa principalmente para ayudar adiagnosticar la RA y para distinguirla de otras formasde artritis y otras afecciones que causan sintomas similares de dolor, inflamacion y rigidez articular. El ensayo comprende determinar el nivel de anticuerpo RF (tipicamente en unidades/ml (U/ml)) en el suero de un paciente. Para los fines de los presentes modelos, esto es una variable continua (Greiner A, Plischke H, Kellner H, Gruber R. Ann N Y Acad Sci. Jun 2005; 1050: 295-303).En los modelos, esta medida es una variable continua que se incluye en la funcion de regresion logistica. Por lo tanto, un resultado para esta variable es de U/ml de anticuerpos medidas en el suero del paciente.

[0072] La PCR es una medida de la cantidad de proteina C reactiva en la sangre. La concentracion de proteina C reactiva en la sangre esta relacionada con infecciones e inflamaciones. El ensayo de PCR de laboratorio mide la concentracion de la proteina en el suero en miligramos por litro (mg/l) (Miller VM, Redfield MM, McConnell JP. Curr Vasc Pharmacol. Ene 2007; 5(1): 15-25). En los presentes modelos, esta medida se ha tratado como una variable continua, que se incluye en la funcion de regresion logistica. Por lo tanto, un resultadopara esta variable es la cantidad de proteina medida en la sangre del paciente.

[0073] La edad de aparicion se refiere a la edad en anos a la que se le diagnostico al paciente RA de acuerdo con el ACR 1987. En los presentes modelos, esta medida se ha tratado como una variable continua, que se incluye en la funcion de regresion logistica de los modelos. Por lo tanto, un resultado para esta variable es la edad del paciente cuando se le diagnostico RA.

[0074] La Tabla 11A muestra que variables de SNP y variables clinicas se incluyen en cada uno de los siete modelos para pronosticar fenotipos. Como se usan en la presente memoria, las variables de "(nombre de fenotipo)" para un fenotipo particular son las variables de SNP y variables clinicas seleccionadas de las de la primera columna de la Tabla 11A, que se incluyen en el modelo para pronosticar ese fenotipo, y que son informativas para pronosticar la verosimilitud de que se desarrolle el fenotipo. Por ejemplo, las "variables de HAQ>2" son las variables de SNP y variables clinicas seleccionadas de las de la primera columna de laTabla 11A, que se incluyen en el modelo de HAQ>2 y que son informativas para pronosticar la verosimilitud del fenotipo de HAQ>2 (es decir, FGB rs1800790, IL4 rs2070874, ANTI-PCC y VSG).

[0075] Para cada una de las variables incluidas en cada modelo de fenotipo, la Tabla 11A indica que resultado (alelo de SNP o resultado clinico) esta asociado con o sugiere un mal pronostico para ese fenotipo.

[0076] Por consiguiente, la invencion proporciona en un aspecto un metodo para predecir el curso probable de la RA en un su jeto, que comprende la etapa de determinar u obtener, para ese sujeto, resultados para una o m as variables de SNP y una o mas variables clinicas enumeradas en las Tablas 11A y 11B. Predecir el curso de la RA puede referirse, en particular, a predecir uno o mas de los fenotipos descritos en la presente memoria.

[0077] Los metodos incluyen un metodo para predecir la RA agresiva en un sujeto. Esto puede realizarse por determinacion de la verosimilitud de que el sujeto desarrolle uno o mas de los fenotipos de RA agresiva descritos en la presente memoria.

[0078] Por ejemplo, un metodo puede comprender determinar la verosimilitud de que un sujeto desarrolle el fenotipo de HAQ>2 descrito en la presente memoria. Tipicamente, el metodo comprende determinar u obtener para el sujeto un resultado para cada una de las variables de HAQ>2 enumeradas en la Tabla 11A (variables del modelo 1). El uso de estas variables permite el pronostico del fenotipo de HAQ>2 en una poblacion espanola con un LR+ de 8 (vease el Ejemplo 2 y la Figura 4). Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad usando estas variables en la Tabla 4.

[0079] Por ejemplo, un metodo puede comprender determinar la verosimilitud de que un sujeto desarrolle el fenotipo de multiples erosiones descrito en la presente memoria. Tipicamente, el metodo comprende determinar u obtener para el sujeto un resultado para cada una de las variables de multiples erosiones enumeradas en la Tabla 11A (variables del modelo 2). El uso de estas variables permite el pronostico del fenotipo de multiples erosiones en una poblacion espanola con un LR+de 6,5(vease el Ejemplo 2 y la Figura 6). Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad usando estas variables en la Tabla 6.

[0080] Por ejemplo, un metodo puede comprender determinar la verosimilitud de que un sujeto desarrolle el fenotipo de >3 tratamientos diferentes descrito en la presente memoria. Tipicamente, el metodo comprende determinar u obtener para el sujetoun resultado para cada una de las variables de >3 tratamientos diferentes enumeradas en la Tabla 11A (variables del modelo 3). El uso de estas variables permite el pronostico del fenotipo de >3 tratamientos diferentes en una poblacion espanola con un LR+ de 6,2 (vease el Ejemplo 2 y la Figura 7). Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad usando estas variables en la Tabla 7.

[0081] Por ejemplo, un metodo puede comprender determinar la verosimilitud de que un sujeto desarrolle el fenotipo de dejar el trabajo descrito en la presente memoria. Tipicamente, el metodo comprende determinar u obtener para el sujeto un resultado para cada una de las variables de dejar el trabajo enumeradas en la Tabla 11A (variables del modelo 4). El uso de estas variables permite el pronostico del fenotipo de dejar el trabajo en una poblacion espanola con un LR+ de 1,9 (vease el Ejemplo 2 y la Figura 9). Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad usando estas variables en la Tabla 9.

[0082] Por ejemplo, un metodo puede comprender determinar la verosimilitud de que un sujeto desarrolle el fenotipo de intervencion quirurgica descrito en la presente memoria. Tipicamente, el metodo comprende determinar u obtener para el sujeto un resultado para cada una de las variables de intervencion quirurgica enumeradas en la Tabla 11A (variables del modelo 5). El uso de estas variables permite el pronostico del fenotipo de intervencion quirurgica en una poblacion espanola con un LR+ de 5,4 (vease el Ejemplo 2 y la Figura 8). Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad usando estas variables en la Tabla 8.

[0083] Un metodo puede comprender llevara acabo uno o mas de los ensayos anteriorespara el desarrollo de fenotipos agresivos. Por ejemplo, un metodo puede comprender llevar a cabo al menos 2, 3, 4 o los 5 metodos de ensayo anteriores, usando las variables de modelo correspondientes. Por ejemplo, un metodo puede comprender al menos evaluar la verosimilitud de los fenotipos de HAQ>2, multiples erosiones, >3 tratamientos diferentes e intervencion quirurgica, o los fenotipos de HAQ>2, multiples erosiones y >3 tratamientos diferentes, o los fenotipos de HAQ>2 y multiples erosiones. En un ejemplo, el metodo comprende al menos predecir la verosimilitud del fenotipo de HAQ>2. Las variables ensayadas se seleccionaran por consiguiente en linea con los modelos anteriores y con la informacion de la Tabla 11A.

[0084] Los presentes metodos tambien incluyen un metodo para predecir la verosimilitud de la intolerancia a metotrexato en un paciente. Tipicamente, el metodo comprende determinar u obtenerpara el sujeto un resultado para cada una de las variables de respuesta a la terapia enumeradas en la Tabla 11A (variables del modelo 6). El uso de estas variables permite el pronostico del fenotipo de intolerancia a metotrexato en una poblacion espanola con un LR+ de 4,3 (vease el Ejemplo 2 y la Figura 10). Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad usando estas variables en la Tabla 10.

[0085] Los presentes metodos tambien incluyen un metodo para predecir la verosimilitud de la remision en un paciente. Tipicamente, el metodo comprende determinar u obtener para el sujeto un resultado para cada una de las variables de remision enumeradas en la Tabla 11A (variables del modelo 7). El uso de estas variable permite el pronostico del fenotipo de remision en una poblacion espanola con un LR+ de 6,5 (vease el Ejemplo 2 y la Figura 5). Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad usando estas variables en la Tabla 5.

[0086] Un su jeto puede ensayarse par a determinar el probable d esarrollo de u no o mas de l os f enotipos anteriores. Por ejemplo, un sujeto puede ensayarse para determinar la verosimilitud de desarrollar una RA agresiva (mediante uno o mas de cualquiera de los metodos descritos anteriormente) en combinacion con un ensayo para determinar la verosimilitud de desarrollar intolerancia a metotrexato y/o remision. De forma similar, un sujeto puede ensayarse para determinar la probable remision, asi como la intolerancia a metotrexato. Puede usarse cualquier combinacion de los metodos anteriores, de modo que un sujeto puede evaluarse simultaneamente para determinar el probable desarrollo de masde un fenotipo. Las variablesensayadas se seleccionaran por consiguiente en linea con los modelos anteriores y la informacion de la tabla 11A.

[0087] En un ejemplo, un metodo puede comprender al menos evaluar la verosimilitud de los fenotipos de HAQ>2, multiples erosiones, remision, >3 tratamientos diferentes, intervencion quirurgica y respuesta a la terapia, o los fenotipos de HAQ>2, m ultiples erosiones, r emision, > 3 t ratamientos diferentes e i ntervencion quirurgica, o l os fenotipos de HAQ>2, multiples erosiones, remision y >3 tratamientos diferentes, o los fenotipos de HAQ>2, multiples erosiones y remision. En un ejemplo, el metodo comprende al menos predecir la verosimilitud de los fenotipos de HAQ>2 y remision.

[0088] En un ejemplo, un metodo de la invencion comprende determinar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de HAQ>2, y determinar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de multiples erosiones, y determinar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de >3 tratamientos diferentes, y determinar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de dejar el trabajo, y determinar la verosimilitud dedesarrollar el fenotipode intervencion quirurgica, y determinar la verosimilitud de desarrollar la intolerancia a metotrexato y determinar la verosimilitud de remision en un sujeto. En ese caso tipicamente, se determinan resultados para todas las variables de la Tabla 11A.

[0089] En algunos aspectos los presentes metodos pueden incluir determinar otros factores para un sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede genotiparse para una o mas variaciones geneticas distintas (tales como otros SNP no enumerados en la Tabla 11A u 11B). Estos pueden ser mutaciones asociadas con RA u otra afeccion. Por ejemplo, un sujeto puede genotiparse en uno o mas de los SNP restantes enumerados en la Tabla 1A o 1B, por ejemplo, usando la micromatriz Artchip descrita en la presente memoria. Tambien pueden determinarse otros marcadores (por ejemplo, SNP) asociados con otras enfermedades.

[0090] Los presentes metodos pueden usarse junto con o ademas de ensayos clinicos convencionales.

[0091] Los presentesmetodos permiten una prediccion con precisiondelosfenotipos de RA basandose en un numero relativamente pequeno de SNP informativos y variables clinicas. Esto puede ser ventajoso en el sentido de que permite el uso de tecnicas de genotipado que no serian necesariamente adecuadas para una exploracion de SNP a gran escala, asi como de metodos de genotipado a mayor escala.

[0092] En general, incluso si se ensayan en los presentes metodos un mayor numero de SNP o variaciones o factores geneticos, la prediccion de un fenotipo de RA puede realizarse basandose solamente en los resultados para las variables del modelo de fenotipo correspondiente en la Tabla 11A. Estas variables son suficientes para la prediccion. Por lo tanto, en un ejemplo, los presentes metodos permiten el pronostico diferencial de los fenotipos de RA d escritos en l a presente m emoria, basandose e n (como m aximo) l os resultados para l as variables de los modelos correspondientes en la Tabla 11A.

[0093] En algunos casos sin embargo, puede ser que se usen en la prediccion algunas variables adicionales tales como SNP u otros factores. Por ejemplo, en los presentes metodos, el pronostico puede realizarse basandose en los resultados de un maximo de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 29, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 variables, tales como SNP o SNP asociados a RA. Los SNP pueden comprender (o consistir en)

o seleccionarse de las variables de la Tabla 11A o de las variables de SNP.

[0094] En un aspecto, el metodo puede implicar genotipar un maximo de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 SNP o SNP asociados a RA. El metodo puede implicar genotipar un maximo de (no mas de) todos los SNP de la Tabla 11A, la Tabla 1A o la Tabla 1B. En algunos casos, el metodo co mprende g enotipar co mo m aximo l as variables de S NP p ara uno o m as de l os modelos 1 a 7, seleccionados como se ha descrito anteriormente.

[0095] Preferentemente, el numero y la combinacion de variables tales como SNP usadas para construir un modelo para predecir un fenotipo de acuerdo con la invencion es tal que el modelo permite que la prediccion se realice con un valor de LR+ de al menos 1,5, tal como de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El calculo de valores de LR+ se describe en la presente memoria.

[0096] Una vez que se determina un resultado para cada una de las variables para la prediccion de un fenotipo dado, estos resultados se usan en o se insertan en una funcion de probabilidad adecuada (para la prediccion de ese fenotipo), como se describe en la presente memoria, y se calcula un valor de funcion de probabilidad. Los resultados pueden codificarse para su uso en la funcion de probabilidad y el calculo del valor de la funcion de probabilidad. El valor de la funcion de probabilidad se compara despues con los valores de funcion de probabilidad obtenidos para una poblacion de individuos de fenotipo conocido (determinado clinicamente). El riesgo de que el sujeto tenga o desarrolle el fenotipo particular se determina de este modo.

[0097] Una funcion de probabilidad adecuada para determinar un fenotipo dado puede obtenerse por metodos como los expuestos en el Ejemplo 2 y descritos en la presente memoria. Tipicamente, se proporciona una poblacion de individuos de estudio. Estos individuos son de un fenotipo conocido (determinado clinicamente) con respecto al fenotipo para cuya determinacion se usara la funcion de probabilidad. El diagnostico clinico y de RA puede realizarse siguiendo los criterios del Colegio Americano de Reumatologia (1987) (ACR 1987) como se describe en la presente memoria. Preferentemente, los individuos en la poblacion de estudio cumplen la definicion del ACR de 1987. Cada uno de los fenotipos de RA que pueden evaluarse de acuerdo con la invencion puede diagnosticarse clinicamente como se describe en la presente memoria.

[0098] En un ejemplo, los individuos en la poblacion de estudio pueden cumplir uno o mas, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o los 6 criterios de inclusion completos para la poblacion de estudio en el Ejemplo 2: cumplir los criterios del ACR de 1987 para el diagnostico de RA; tener una aparicion de RA despues de la edad de 18; tener erosiones radiologicas (danos a nivel de las articulaciones afectadas por RA); ser caucasico; tener mas de 5 anos de evolucion; haber sido diagnosticado despues del 1 de enero de 1990.

[0099] La poblacion puede ser, por ejemplo, una poblacion china, japonesa o caucasica, tal como una poblacion espanola. La poblacion puede comprender mujeres y hombres. En un ejemplo, la proporcion de mujeres respecto a hombres puede ser de aproximadamente 3:1. Preferentemente, la poblacion usada para obtener una funcion de probabilidad comprende una muestra representativa de la poblacion en la que se aplicara la funcion de probabilidad.

[0100] En general, se incluyen al menos n individuos en la poblacion de estudio. Tipicamente, n es 200-1000, por ejemplo, 300, 400, 500 o 600. Cuando una funcion de probabilidad es para determinar entre fenotipos alternativos, preferentemente hay numeros aproximadamente equivalentes de individuos con cada uno de los fenotipos alternativos en la poblacion. Por lo tanto, cuando hay dos fenotipos alternativos, A y B, la poblacion es preferentemente aproximadamente el 50% de fenotipo A y el 50% de fenotipo B. Sin embargo, las proporciones pueden se r, por ej emplo, 6 0%/40%, 70% /30%, 80% /20%, 90% /10% o cu alquier di stribucion est adisticamente aceptable. P or ej emplo, c uando la f uncion de probabilidad es par a el pronostico de H AQ>2 f rente a H AQ�2, preferentemente apr oximadamente el 50% de l a po blacion es de f enotipo H AQ>2 det erminado cl inicamente y aproximadamente el 50% de la poblacion es de fenotipo HAQ�2 determinado clinicamente. Cuando la funcion de probabilidad es para el pronostico de multiples erosiones, preferentemente aproximadamente el 50% de la poblacion cumple los criterios clinicos para multiples erosiones y aproximadamente el 50% de la poblacion no los cumple.

[0101] Cada individuo en la poblacion de estudio se ensaya despues para determinar un resultado para cada una de las variables de discriminacion para el fenotipo particular (vease la Tabla 11A). Esto proporciona varios resultados para cada individuo. El ensayo, por ejemplo, el genotipado, puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, mediante analisis de micromatrices como se describe en la presente memoria. El ensayo es tipicamente ex vivo, llevado a cabo en una muestra adecuada obtenida de un individuo.

[0102] Despues pueden analizarse multiples asociaciones de genotipo-fenotipo usando un analisis de regresion logistica multivariable por etapas, usando como variable dependiente el fenotipo de RA determinado clinicamente y como variables independientes los resultados de las variables informativas, por ejemplo, como se recomienda por Balding DJ. (200635). La calidad de ajuste de los modelos obtenidos puede evaluarse usando estadistica de Hosmer-Lemeshow, y su precision puede evaluarse calculando el area bajo la curva (AUC) de la curva de Caracteristicas Operativas del Receptor (ROC) con intervalos de confianza del 95% (vease, por ejemplo, (Janssens ACJW et al., 200636. Se describen metodos adecuados en el Ejemplo 2.

[0103] La sensibilidad, la especifidad y el cociente de verosimilitud positiva (LR+ = sensibilidad/(1-especifidad)) pueden calcularse por medio de curvas de ROC. Preferentemente, el modelo tiene un valor de LR+ de al menos 1,5, por ejemplo de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

[0104] Los valores medios de la f uncion de probabilidad para ca da uno de l os fenotipos alternativos en l a poblacion pueden compararse usando una prueba t. En general, las funciones de probabilidad son capaces de distinguir entre los diferentes fenotipos en la poblacion de estudio de una forma estadisticamente significativa, por ejemplo, a p � 0,05 en un a prueba t. P or l o t anto, l as funciones de pr obabilidad pr oducen u na s eparacion estadisticamente significativa entre individuos de diferente fenotipo en la poblacion.

[0105] Pueden r ealizarse an alisis estadisticos, p or ej emplo, us ando el P aquete E stadistico par a l as Ciencias Sociales (SPSS Inc. Headquarters, Chicago, IL, Estados Unidos) version 14.0.

[0106] Los valores de funcion de probabilidad pueden calcularse para cada individuo de fenotipo conocido en la poblacion de estudio y representarse en una grafica adecuada.

[0107] Para llevar acabo los presentes metodos de pronostico, se calcula un valor de funcion de probabilidad para el individuo de ensayo, y este se compara con los valores de funcion de probabilidad para los individuos de fenotipo conocido en la poblacion de estudio para determinar el riesgo de un fenotipo dado en ese individuo. La comparacion puede realizarse por comparacion con una grafica o por cualquier otro medio adecuado conocido por los expertos en la materia.

[0108] Por lo tanto, por ejemplo, enla obtencion de una funcion de probabilidad para su uso en el pronostico diferencial de HAQ>2 f rente a H AQ�2, se pr oporciona una poblacion de i ndividuos de est udio d iagnosticados clinicamente como HAQ>2 e individuos diagnosticados clinicamente como HAQ�2. Cada individuo puede ensayarse despues para determinar un resultado para cada una de las variables de discriminacion de HAQ>2 (modelo 1) en la Tabla 11A. Se realiza una regresion logistica multiple por etapas sobre los datos de "resultados" y "fenotipo" y se obtiene una funcion de probabilidad que es capaz de distinguir entre los dos grupos fenotipicos en la poblacion de estudio de una forma estadisticamente significativa.

[0109] Por lo tanto, en un aspecto, la invencion proporciona ademas un metodo de obtencion de una funcion de probabilidad para su uso en la determinacion de un fenotipo de RA como se describe en la presente memoria, que comprende:

(i): proporcionar una poblacion de individuos de estudio, en la que cada individuo es de un fenotipo conocido determinado clinicamente con respecto al fenotipo de RA;

(ii): determinar u obtener para cada individuo un resultado para cada una de un conjunto de variables, obteniendo de este modo un conjunto de resultados para cada individuo;

(iii) aplicar un analisis de regresion logistica multiple por etapas a los resultados obtenidos en (ii) y a los fenotipos conocidos mencionados en (i); y

(iv) obtener de este modo una funcion de probabilidad que produce una separacion estadisticamente significativa entre individuos de diferente fenotipo en la poblacion;

en el que:

(a): la funcionde probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de HAQ>2 de acuerdo con la invencion, y el conjunto de variables para las que se determinan u obtienen resultados en la etapa (ii) se selecciona de o consiste en las variables de HAQ>2 de la Tabla 11A;

(b): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de multiples erosiones de acuerdo con la invencion, y el conjunto de variables para las que se determinan u obtienen resultados en la etapa (ii) se selecciona de o consiste en las variables de multiples erosiones de la Tabla 11A;

(c): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de >3 tratamientos diferentes de acuerdo con la invencion, y el conjunto de variables para las que se determinan u obtienen resultados en la etapa (ii) se selecciona de o consiste en las variables de >3 tratamientos diferentes en la Tabla 11A;

(d): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de dejar el trabajo de acuerdo con la invencion, y el conjunto de variables para las que se determinan u obtienen resultados en la etapa (ii) se selecciona de o consiste en las variables de dejar el trabajo de la Tabla 11A;

(e): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de intervencion quirurgica de acuerdo con la invencion, y el conjunto de variables para las que se determinan u obtienen resultados en la etapa (ii) se selecciona de o consiste en las variables de intervencion quirurgica de la Tabla 11A;

(f): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitudde desarrollar el fenotipo de intolerancia a metotrexato de acuerdo con la invencion, yel conjunto de variables para las que se determinan u obtienen resultados en la etapa (ii) se selecciona de o consiste en las variables de HAQ>2 de la Tabla 11A; y/o

(g): la funcionde probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollarel fenotipo de HAQ>2 de acuerdo con la invencion, y el conjunto de variables para las que se determinan u obtienen resultados en la etapa (ii) se selecciona de o consiste en las variables de HAQ>2 de la Tabla 11A.

[0110] La obtencion de las funciones de probabilidad puede llevarse a cabo mediante un ordenador. Por lo tanto, en u n asp ecto, l a i nvencion t ambien se r efiere a un metodo c omputacional de o btencion d e u na f uncion de probabilidad para su uso en la determinacion de un fenotipo de RA, comprendiendo dicho metodo aplicar un analisis de regresion logistica multiple por etapas a los datos de resultados y los datos defenotipo obtenidos de una poblacion de individuos de estudio adecuada, en el que cada individuo es de un fenotipo conocido determinado clinicamente con respecto al fenotipo de RA, obteniendo de este modo una funcion de probabilidad que produce una separacion estadisticamente significativa entre individuos de diferente fenotipo en la poblacion; en el que:

(i): los datos de fenotipo comprenden el fenotipo conocido determinado clinicamente de cada individuo;

(ii): l os datos de r esultados para ca da individuo c omprenden r esultados par a u na o m as variables de polimorfismos de un solo nucleotido y una o mas variables clinicas enumeradas en la columna 1 de la Tabla 11A;

(a): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de HAQ>2 de acuerdo con la invencion, y las variables para las que se obtienen datos de resultados (y mencionadas en (ii)) comprenden o consisten en las variables de HAQ>2 de la Tabla 11A;

(b): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de multiples erosiones de acuerdo con la invencion, y las variables para las que se obtienen datos de resultados (y mencionadas en (ii)) comprenden o consisten en las variables de multiples erosiones de la Tabla 11A;

(c): la funcionde probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de >3 tratamientos diferentes de acuerdo con la invencion, y las variables para las que se obtienen datos de resultados (y mencionadas en (ii)) comprenden o consisten en las variables de >3 tratamientos diferentes de la Tabla 11A;

(d): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de dejar el trabajo de acuerdo con la invencion, y las variables para las que se obtienen datos de resultados (y mencionadas en (ii)) comprenden o consisten en las variables de dejar el trabajo de la Tabla 11A;

(e): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de intervencion quirurgica de acuerdo con la invencion, y las variables para las que se obtienen datos de resultados (y mencionadas en (ii)) comprenden o consisten en las variables de intervencion quirurgica de la Tabla 11A;

(f): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de intolerancia a metotrexato de acuerdo con la invencion, y las variables para las que se obtienen datos de resultados (y mencionadas en (ii)) comprenden o consisten en las variables de HAQ>2 de la Tabla 11A; y/o

(g): la funcion de probabilidad es para pronosticar la verosimilitud de desarrollar el fenotipo de HAQ>2 de acuerdo con la invencion, y las variables para las que se obtienen datos de resultados (y mencionadas en (ii)) comprenden o consisten en las variables de HAQ>2 de la Tabla 11A.

y en el que: [0111] Se han d escrito ant eriormente pobl aciones de est udio y m etodos de analisis estadistico adec uados. Tambien puede hacerse referencia a los presentes Ejemplos.

[0112] Se proporcionan detalles para el calculo de una funcion de probabilidad a partir de las variables de SNP y clinicas enumeradas para cada fenotipo en las Tablas 4 a 10. Pueden realizarse analisis estadisticos, por ejemplo, usando el Paquete Estadistico para las Ciencias Sociales (SPSS Inc. Headquarters, Chicago, IL, Estados Unidos) version 14.0. Estos pueden usarse para el calculo de valores de funcion de probabilidad para su uso en los metodos de la presente memoria. Los datos de las Tablas pueden usarse para construir funciones de probabilidad para su uso en la invencion. Las funciones de probabilidad, junto con la informacion de las Tablas 11A y 11B, pueden usarse para determinar un diagnostico o pronostico de acuerdo con la invencion.

[0113] En un aspecto, la invencion se refiere a funciones de probabilidad construidas u obtenidas usando los datos de cualquiera de las Tablas 4 a 1 0, y a su uso en unmetodo, por ejemplo, un metodo computacional, para pronosticar un fenotipo de RA. La invencion se refiere ademas a los programas informaticos y sistemas informaticos asociados, como se d escriben en la presente m emoria. La invencion t ambien s e r efiere a l as f unciones de probabilidad obtenidas de acuerdo con los presentes metodos y a su uso en los metodos descritos en la presente memoria.

[0114] El pr ocedimiento d e c alculo de un va lor de f uncion de pr obabilidad para un su jeto d e e nsayo y de comparacion del valor con los valores obtenidos a partir de una poblacion de individuos de estudio de fenotipos conocidos para evaluar el riesgo de desarrollar un fenotipo en el sujeto de ensayo tambien puede llevarse a cabo usando un software apropiado.

[0115] Por lo tanto, en un aspecto, la invencion se refiere a un metodo computacional para determinar un fenotipo de RA usando los resultados de variables de discriminacion ("datos de resultados") para ese fenotipo obtenido de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria. En el metodo computacional, los datos de resultados para las variables de discriminacion para un fenotipo particular obtenidos a partir de un sujeto de ensayo (datos de resultados de ensayo) se introducen en una funcion de probabilidad adecuada para producir un valor de funcion de probabilidad para el sujeto de ensayo. El valor de la funcion de probabilidad de ensayo se compara despues con los valores de funcion de probabilidad para individuos de fenotipo conocido, para diagnosticar o pronosticar el fenotipo del individuo de ensayo. La comparacion puede realizarse usando los metodos descritos en la presente memoria.

[0116] La invencion se refiere ademas a un sistema informatico que comprende un procesador y medios para controlar el procesador, para llevar a cabo un metodo computacional descrito en la presente memoria, y a un programa informatico que comprende un codigo de programa informatico que cuando se ejecuta en un ordenador o red de ordenadores provoca que el ordenador o red de ordenadores lleven a cabo el metodo computacional. En un aspecto, el programa informatico se almacena en un medio legible por ordenador.

[0117] Como se ha descrito anteriormente y en los Ejemplos, los presentes inventores tambien han identificado varios polimorfismos de un solo nucleotido (SNP) que muestran la asociacion alelica de un solo locus con los fenotipos de RA descritos en la presente memoria. Los SNP que muestran una asociacion estadisticamente significativa se enumeran en la Tabla 12 (Figura 12). Los valores P se calcularon mediante laprueba deChi cuadrado usando los software SPSS y HelixTree.

[0118] Por identificacion del nucleotido en el ADN genomico de un sujeto en uno (o mas) de estos SNP, es posible evaluar el riesgo o la susceptibilidad de ese individuo al fenotipo dado.

[0119] En un aspecto, la invencion se refiere al uso de uno mas de los SNP de la Tabla 12 en un metodo para pronosticar un fenotipo de RA, en particular para determinar la verosimilitud del desarrollo de un fenotipo de RA con el que el o los SNP estan estadisticamente asociados de forma significativa (Tabla 12), como se describe en la presente memoria.

[0120] Por lo tanto, la invencion se refiere en un aspecto a un metodo para pronosticar el fenotipo de HAQ>2 (como se describe en la presente memoria), que comprende determinar el genotipo de un individuo en uno o mas de los SNP de HAQ>2 de la Tabla 12.

[0121] La invencion tambien se refiere a un metodo para pronosticar el fenotipo de RX2 (como se describe en la presente memoria), que comprende determinar el genotipo de un individuo en uno o mas de los SNP de RX2 de la Tabla 12.

[0122] La invencion tambien se refiere a un metodo para pronosticar el fenotipo de TT0 30M (como se describe en la presente memoria), que comprende determinar el genotipo de un individuo en uno o mas de los SNP de TT0 3 de la Tabla 12.

[0123] La invencion tambien se refiere a un metodo para pronosticar el fenotipo de intervencion quirurgica (como se d escribe en l a pr esente m emoria), q ue co mprende determinar el gen otipo de u n individuo en el SNP de intervencion quirurgica de la Tabla 12.

[0124] La invencion tambien se refiere a un metodo para pronosticar el fenotipo de remision (como se describe en la presente memoria), que comprende determinar el genotipo de un individuo en uno o mas de los SNP de remision de la Tabla 12.

[0125] La invencion tambien se refiere a un metodo para pronosticar el fenotipo de dejar el trabajo (como se describe en la presente memoria), que comprende determinar el genotipo de un individuo en uno o mas de los SNP de dejar el trabajo de la Tabla 12.

[0126] La invencion tambien se refiere a un metodo para pronosticar el fenotipo de intolerancia a metotrexato (como se describe en la presente memoria), que comprende determinar el genotipo de un individuo en uno o mas de los SNP de intolerancia a metotrexato de la Tabla 12.

[0127] En general, los presentes metodos se llevan a cabo ex vivo o in vitro, por ejemplo, usando una muestra obtenida del individuo. Unmetodo puede comprender el uso de los resultados de variables clinicasque se han obtenido mediante los metodos descritos en la presente memoria.

[0128] Se conocen en la tecnica diversos metodos para determinar la presencia o ausencia en una muestra de ensayo de unasecuencia de acidonucleico particular, por ejemplo, una secuenciade acido nucleico que tiene un nucleotido par ticular en u na posi cion de polimorfismo d e un so lo n ucleotido. P or ej emplo, el gen otipo p uede determinarse m ediante an alisis de micromatrices, secuenciacion, ex tension de cebadores, ligacion de oligonucleotidos especificos de alelo, determinacion de masa de productos de extension de cebadores, analisis de polimorfismos en la longitud d e r estriccion, a nalisis de p olimorfismos conformacionales de c adena s encilla, pirosecuenciacion, d HPLC o el ectroforesis en g el c on gradiente des naturalizante ( DGGE). A demas, hab iendo secuenciado el acido nucleico de un individuo o muestra, la informacion de secuencia puede conservarse y posteriormente buscarse sin recurrir al propio acido nucleico original. Por lo tanto, por ejemplo, una alteracion de secuencia o mutacion puede identificarse por exploracion de una base de datos de informacion de secuencia usando un ordenador u otro medio electronico.

[0129] En general, se proporciona una muestra que contiene acido nucleico, que comprende al menos una de las variaciones genetica a ens ayar. E l acido nucleico c omprende un a o mas regiones di ana q ue c omprenden l a variacion o variaciones geneticas (SNP) que deben caracterizarse.

[0130] El acido nucleico puede obtenerse a partir de cualquier muestra biologica apropiada que contenga acido nucleico. La muestra puede tomarse de un fluido o tejido, secrecion, celula o linea celular derivada del cuerpo humano.

[0131] Por ejemplo, pueden tomarse muestras de sangre, incluyendo suero, linfocitos, celulas linfoblastoides, fibroblastos, plaquetas, celulas mononucleares u otras celulas sanguineas, a partir de saliva, higado, rinon, pancreas

o corazon, orina o de cualquier otro tejido, fluido, celula o linea celular derivada del cuerpo humano. Por ejemplo, una muestra adecuada puede ser una muestra de celulas de la cavidad bucal.

[0132] Preferentemente, el acido nucleico se obtiene de una muestra de sangre.

[0133] En general, el acido nucleico se extrae de la muestra biologica usando tecnicas convencionales. El acido nucleico que se extraera de la muestra biologica puede ser ADN, o ARN, tipicamente ARN total. Tipicamente, se extrae ARN si la variacion genetica a estudiar se situa en la secuencia codificante de un gen. Cuando se extrae ARN de la muestra biologica, los metodos pueden comprender ademas una etapa de obtencion de ADNc a partir del ARN. Esto puede llevarse a cabo usando metodos convencionales, tales como transcripcion inversa usando cebadores adecuados. Los procedimientos posteriores se llevan a cabo despues tipicamente sobre el ADN extraido o el ADNc obtenido a partir del ARN extraido. El termino ADN, como se usa en la presente memoria, puede incluir tanto ADN como ADNc.

[0134] En general, las variaciones geneticas a ensayar son conocidas y estan caracterizadas, por ejemplo, en terminos de secuencia. Por lo tanto, pueden obtenerse regiones de acido nucleico que comprenden las variaciones geneticas usando metodos conocidos en la tecnica.

[0135] En un aspecto, las regiones de ADN que contienen las variaciones geneticas (SNP) a identificar (regiones diana) se someten a una reaccion de amplificacion para obtener productos de amplificacion que contienen las variaciones geneticas que se van a identificar. Cualquier tecnica o metodo adecuado puede usarse para la amplificacion.

[0136] Por ejemplo, puede usarse la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (revisada por ejemplo en �PCR protocols; A Guide to Methods and Applications�, Eds. Innis et al, 1990, Academic Press, Nueva York, Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989, y Ehrlich et al, Science, 252: 1643-1650, (1991)). El acido nucleico usado como molde en la reaccion de amplificacion puede ser ADN genomico, ADNc o ARN.

[0137] Otras tecnicas de amplificacion de acido nucleico especificas incluyen activacion del desplazamiento de cadena, el sistema de replicasa QB, la reaccion en cadena de reparacion, la reaccion en cadena de la ligasa, la amplificacion por circulo rodante y la transcripcion activada por ligacion.

[0138] Pueden usarse oligonucleotidos especificos de alelo en PCR para amplificar especificamente secuencias particulares si estan presentes en una muestra de ensayo. La evaluacion de si una banda de PCR contiene una variante genica puede llevarse a cabo de varias formas familiares para los expertos en la materia. El producto de PCR puede tratarse, por ejemplo, de un modo que permita a los inventores visualizar el polimorfismo en un gel de secuenciacion de A DN de poliacrilamida desnaturalizante, co n b andas esp ecificas que estan vi nculadas a l as variantes genicas que se estan seleccionado.

[0139] Los expertos en la materia tienen experiencia en el diseno de cebadores para su uso en procedimientos tales como PCR. Son bien conocidas en la materia diversas tecnicas para sintetizar cebadores oligonucleotidicos, incluyendo metodos de sintesis de fosfotriester y fosfodiester.

[0140] Un as pecto a dicional de la pr esente i nvencion pr oporciona una pareja de c ebadores de amplificacion oligonucleotidicos adecuada para su uso en los metodos descritos en la presente memoria.

[0141] Los cebadores de PCR adecuados para la amplificacion de regiones de ADN diana que comprenden los SNP de la Tabla 1 se enumeran en la Tabla 3A y en la Tabla 3B. Los presentes metodos pueden comprender el uso de uno o mas de estos cebadores o una o mas de las parejas de cebadores enumeradas, de acuerdo con los SNP a genotipar, enlos que estos SNP seseleccionan como se describe en lapresente memoria. En un aspecto,el metodo comprende el uso de todos los cebadores enumerados en las Tablas 3A y 3B. Las condiciones de reaccion adecuadas pueden determinarse usando los conocimientos en la tecnica.

[0142] El acido nucleico amplificado puede secuenciarse despues y/o ensayarse de cualquier otro modo para determinar la presencia o ausencia de una caracteristica particular. El acido nucleico para ensayo puede prepararse a partir de acido nucleico extraido de celulas o en una biblioteca usando una diversidad de otras tecnicas tales como digestion con enzimas de restriccion y electroforesis.

[0143] Por ejemplo, el alelo del al menos un polimorfismo (es decir, la identidad del nucleotido en la posicion de polimorfismo de un s olo nucleotido) pu ede d eterminarse por determinacion de la uni on d e una so nda oligonucleotidica a la region amplificada de la muestra de gen omico. Una sonda oligonucleotidica adecuada comprende una secuencia de nucleotidos que se une especificamente a un alelo particular del al menos un polimorfismo y que no se une especificamente a otros alelos del al menos un polimorfismo. Dicha sonda puede corresponder en secuencia a una region de acido nucleico genomico, o su complementaria, que contiene uno o mas de los SNP descritos en la presente memoria. En condiciones convenientemente rigurosas, la hibridacion especifica de dicha sonda con acido nucleico de ensayo es indicativa de la presencia de la alteracion de secuencia en el acido nucleico de ensayo. Con fines de exploracion eficaces, puede usarse mas de una sonda en la misma muestra de ensayo.

[0144] Los expertos en la materia son bien capaces de emplear condiciones adecuadas de la rigurosidad deseada para una hibridacion selectiva, teniendo en cuentafactores tales como la longitud de los oligonucleotidos y la composicion de bases, la temperatura, etcetera.

[0145] Las condiciones de hibridacion selectivas adecuadas para oligonucleotidos de 17 a 30 bases incluyen la hibridacion durante una noche a 42°C en SSC 6X y el lavado en SSC 6X a una serie de temperaturas crecientes desde 42°C hasta 65°C.

[0146] Se describen otras condiciones y protocolos adecuados en MolecularCloning: a Laboratory Manual: 2� edicion, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

[0147] Un aspecto adicional de la presente invencion proporciona un oligonucleotido que hibrida especificamente con una secuencia de acido nucleico que comprende un alelo particular de un polimorfismo seleccionado del grupo que consiste en los polimorfismos de un solo nucleotido mostrados en la Tabla 1A, 1B o Tabla 18, y que no se unen especificamente a otros alelos del SNP. La hibridacion puede determinarse en condiciones de hibridacion selectiva adecuadas como se describe en la presente memoria.

[0148] Dichos oligonucleotidos pueden usarse en un metodo de exploracion de acido nucleico.

[0149] En algunas realizaciones preferidas, los oligonucleotidos de acuerdo con la presente invencion tienen una longitud d e a l m enos aproximadamente 10 nuc leotidos, m as preferentemente un a l ongitud d e al m enos aproximadamente 15 nucleotidos, mas preferentemente una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleotidos. Los oligonucleotidos pueden se r de hasta 10 0 n ucleotidos de l ongitud, m as preferentemente d e h asta aproximadamente 50 nucleotidos de longitud, mas preferentemente de hasta aproximadamente 30 nucleotidos de longitud. El valor limite de "aproximadamente X nucleotidos", como se ha usado anteriormente, incluye el valor limite de "X nucleotidos". Los oligonucleotidos que hi bridan esp ecificamente co n al elos particulares de l os SNP enumerados en la Tabla 1A se enumeran en la Tabla 2 y se describen en la presente memoria.

[0150] Cuando el acido nucleico es ADN b icatenario, l a hibridacion est ara g eneralmente pr ecedida po r desnaturalizacion para producir ADN de cadena sencilla. La hibridacion puede ser parte de una amplificacion, por ejemplo, pr ocedimiento de P CR, o par te de un pr ocedimiento de sondaje que n o implique am plificacion. Un procedimiento de ejemplo seria una combinacion de PCR e hibridacion de baja rigurosidad. Un procedimiento de exploracion, seleccionado de los muchos disponibles para los expertos en la materia, se usa para identificar acontecimientos de hibridacion con exito y acido nucleico hibridado aislado.

[0151] La union de una sonda a acido nucleico diana (por ejemplo, ADN) puede medirse usando cualquiera de una diversidad de tecnicas a disposicion de los expertos en la materia. Por ejemplo, las sondas pueden marcarse radiactivamente, fluorescentemente o enzimaticamente. Otros metodos que no emplean marcaje de sondas incluyen el examen de pol imorfismos en la longitud de fragmentos de restriccion, la amplificacion usando PCR, la escision con ARNasa y el sondaje con ol igonucleotidos especificos de a lelo. E l so ndaje pu ede emplear l a t ecnica de transferencia de Southern convencional. Por ejemplo, puede extraerse ADN a partir de celulas y digerirse con diferentes enzimas de restriccion. Despues, los fragmentos de restriccion pueden separarse por electroforesis en un gel de agarosa, antes de la desnaturalizacion y transferencia a un filtro de nitrocelulosa. La sonda marcada puede hibridarse conlos fragmentos de ADN sobre el filtro y determinarse la union. El ADN para el sondajepuede prepararse a partir de preparaciones de ARN de celulas.

[0152] Pueden emplearse estrategiasque dependen de la hibridacion entre una sonda yun acido nucleico de ensayo, y la posterior deteccion de un emparejamiento erroneo. En condiciones apropiadas (temperatura, pH, etc.), una s onda ol igonucleotidica hi bridara c on una se cuencia qu e no se a t otalmente co mplementaria. E l gr ado de emparejamiento de bases entre las dos moleculas sera suficiente para que hibriden a pesar de un emparejamiento erroneo. Son bien conocidas en la tecnica diversas estrategias para detectar la presencia de un emparejamiento erroneo entre dos moleculas de acido nucleico que hibridan.

[0153] Por ejemplo, la ARNasa A escinde en el sitio de un emparejamiento erroneo. La escision puede detectarse sometiendo a electroforesis el acido nucleico de ensayo con el que ha hibridado la sonda o sonda pertinente y buscando moleculas mas pequenas (es decir, moleculas con mayor movilidad electroforetica) que el hibrido de sonda/ensayo de longitud completa.

[0154] El acido nucleico en u na muestra de e nsayo, que p uede ser una m uestra de ge nomico o un a region amplificada del mismo, puede secuenciarse para identificar o determinar la identidad de un alelo polimorfico. El alelo del SNP en el acido nucleico de ensayo puede compararse por lo tanto con los alelos de susceptibilidad del SNP como se describen en la presente memoria, para determinar si el acido nucleico de ensayo contiene uno o m as alelos que esten asociados con enfermedad.

[0155] Tipicamente en la secuenciacion, los cebadores complementarios a la secuencia diana se disenan de modo que esten a una distancia adecuada (por ejemplo, 50-400 nucleotidos) del polimorfismo. Despues, la secuenciacion se lleva a cabo usando tecnicas convencionales. Por ejemplo, los cebadores pueden disenarse usando un software que tenga como objetivo seleccionar una secuencia o secuencias dentro de una ventana apropiada, que tengan valores de Tm adecuados y que no posean estructura secundaria o que hibriden con una secuencia no diana.

[0156] La s ecuenciacion de un producto am plificado p uede i mplicar la precipitacion con i sopropanol, la resuspension y secuenciacion usando un kit de secuenciacion con terminadores Dye TaqFS+. Los productos de extension pueden someterse a electroforesis en un secuenciador de ADN ABI 377 y los datos analizarse usando el software Sequence Navigator.

[0157] El analisis de genotipo puede llevarse a cabo mediante analisis de micromatrices. Puede usarse cualquier tecnologia de micromatrices adecuada. Puede usarse la metodologia descrita en Tejedor et al 2005 (Clinical Chemistry 51: 1137-1144), incluyendo el software MG1.0 y en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/IB2006/00796, presentada el 12 de enero de 2006. Esta tecnologia usa una matriz de ADN de baja densidad e hibridacion con sondas oligonucleotidicas especificas de alelo para explorar para SNP. Por lo tanto, en un aspecto, la micromatriz Artchip y la tecnologia de la presente invencion pueden usarse para determinar el genotipo de los SNP informativos, como se describe en la presente memoria.

[0158] Una vez que un sujeto ha recibido un pronostico de un fenotipo de RA particular (un riesgo significativo de desarrollar ese fenotipo de acuerdo con la invencion), puede seleccionarse el tratamiento mas apropiado para ese sujeto. De este modo, la invencion permite un mejor direccionamiento de terapias a pacientes.

[0159] Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo de seleccion de un tratamiento adecuado para un sujeto al que se le ha diagnosticado que tiene RA, comprendiendo el metodo:

(a): determinar la verosimilitud de que se desarrolle un fenotipo de RA particular en el sujeto mediante un metodo descrito en la presente memoria; y

(b): seleccionar un tratamiento adecuado.

[0160] El tratamiento seleccionado puede administrarse despues al sujeto. Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a un metodo de tratamiento de RA en un sujeto, que comprende:

(b): tratar al sujeto con un tratamiento adecuado.

[0161] Por ejemplo, si se determina que un sujeto presenta mayor riesgo de desarrollar un fenotipo de RA agresivo (por uno o masde los metodos descritos en la presente memoria), puede seleccionarse un tratamiento apropiado, por ejemplo, un tratamiento mas intensivo. Si se evalua que es probable que un sujeto sea intolerante a metotrexato, puede proporcionarse una terapia alternativa.

[0162] Pueden proporcionarse medios para llevar a cabo los presentes metodos de pronostico en forma de kit, por ejemplo, en un recipiente adecuado tal como un vial en el que el contenido esta protegido del entorno externo. Por lo tanto, en un aspecto, la invencion se refiere ademas a kits de pronostico adecuados para su uso en los metodos descritos en la presente memoria. Tipicamente, un kit comprende:

(i): medios para determinar resultados para la variable o variables seleccionadas o variables de SNP; y

(ii): instrucciones para determinar el pronostico basandose en los resultados de las variables.

[0163] Los medios (i) pueden comprender una o mas sondas oligonucleotidicas adecuadas para la deteccion de una o mas variables de SNP a determinar. Por ejemplo, los medios (i) pueden comprender una o mas parejas de sondas o conjuntos de sondas enumeradas en la Tabla 2. En un caso, el kit puede comprender todos los conjuntos de sondas de la Tabla 2.

[0164] Los medios (i) pueden comprender una micromatriz adecuada, como se describe en la presente memoria. Los medios (i) pueden comprender una o mas parejas de cebadores de secuenciacion adecuadas para secuenciar una o mas de las variables de SNP a determinar.

[0165] Las instrucciones (ii) comprenden tipicamente instrucciones para usar los resultados determinados usando los medios (i) para el pronostico. Las instrucciones pueden comprender una grafica que muestre los riesgos de recaida de la RA. El kit puede incluir detalles de funciones de probabilidad que pueden usarse en el pronostico, tales como las descritas en la presente memoria.

[0166] Un kit puede incluir en algunos casos un programa informatico como se describe en la presente memoria.

[0167] Un kit puede incluir otros componentes adecuados para su uso en los presentes metodos. Por ejemplo, un kit puede incluir cebadores adecuados para la amplificacion de regiones de ADN diana que contienen los SNP a determinar, tales como los descritos en la presente memoria. Por ejemplo, un kit puede contener una o mas parejas de cebadores enumerados en las Tablas 3. Un kit tambien puede incluir medios de marcaje y deteccion adecuados, controles y/u otros reactivos t ales como t ampones, n ucleotidos o enzimas, por e jemplo, p olimerasa, nucl easa, transferasa.

[0168] Un acido nucleico de acuerdo con la presente invencion, tal como una sonda oligonucleotidica y/o pareja de cebadores de amplificacion, puede proporcionarse como parte de un kit. El kit puede incluir instrucciones para el uso del acido nucleico, por ejemplo, en PCR y/o un procedimiento para determinar la presencia de acido nucleico de interes en una muestra de ensayo. Un kit en el que el acido nucleico esta destinado a su uso en PCR puede incluir uno o mas de otros reactivos necesarios para la reaccion, tales como polimerasa, nucleosidos, solucion de tampon, etc. El acido nucleico puede estar marcado.

[0169] Un kit para su uso en la determinacion de la presencia o ausencia de acido nucleico de interes puede incluir uno o mas articulos y/oreactivos para la realizacion del metodo, tales como medios para proporcionar la propia muestra de ensayo, por ejemplo, un hisopo para retirar celulas de la cavidad bucal o una jeringa para extraer una muestra de sangre (siendo dichos componentes generalmente esteriles).

[0170] En un aspecto adicional, la presente invencion tambien se refiere a microplacas de ADN o micromatrices y a metodos para su uso, que permiten un genotipado fiable de individuos con respecto a multiples variaciones geneticas asociadas a RA simultaneamente y con fines clinicos.

[0171] Por lo tanto, en un aspecto, la invencion proporciona ademas un metodo de genotipado de variaciones geneticas asociadas a RA en un individuo, que es suficientemente sensible, especifico y reproducible para uso clinico. Los inventores han desa rrollado m icromatrices de ADN de b aja dens idad co n sondas especificamente disenadas para su uso en el metodo, y un metodo computacional o algoritmo para interpretar y procesar los datos generados por las matrices.

[0172] En un aspecto, la invencion se refiere a un metodo in vitro para genotipar variaciones geneticas asociadas a RA e n un individuo. E l m etodo p ermite el g enotipado simultaneo d e multiples variaciones geneticas humanas presentes en uno o mas genes de un sujeto. El metodo de la invencion permite la identificacion de cambios de nucleotidos, tales como inserciones, duplicaciones y deleciones, y la determinacion del genotipo de un sujeto para una variacion genetica dada.

[0173] Una variacion genetica o variante genetica se refiere a mutaciones, polimorfismos o variantes alelicas. Una variacion o variante genetica se encuentra entre individuos dentro de la poblacion y entre poblaciones dentro de la especie.

[0174] Una variacion genetica asociada a RA puede referirse a una variacion genetica que este asociada con RA de u na f orma est adisticamente si gnificativa, y qu e p ueda us arse c omo a yuda en el diagnostico, pr onostico o prediccion de la respuesta a la terapia en un individuo.

[0175] Un polimorfismo se refiere a una variacion en la secuencia de nucleotidos de acido nucleico, en la que cada secuencia posible esta presente en una proporcion igual a o superior al 1% de una poblacion; en un caso particular, cuando dicha variacion se produce en solo un nucleotido (A, C, T o G), se denomina polimorfismo de un solo nucleotido (SNP).

[0176] Una mutacion genetica se refiere a una variacion en la secuencia de nucleotidos en un acido nucleico en la que cada secuencia posible esta presente en menos del 1% de una poblacion.

[0177] Una variante alelica o alelo se refiere a un polimorfismo que aparece en el mismo locus en la misma poblacion.

[0178] Por lo tanto, una variacion genetica puede comprender una delecion, sustitucion o insercion de uno o mas nucleotidos. E n un aspecto, l as variaciones geneticas a ge notipar de acu erdo co n l os presentes metodos comprenden SNP.

[0179] Un gen dado puede comprender una o mas variaciones geneticas.Por lo tanto, los presentes metodos pueden usarse para el genotipado de una o mas variaciones geneticas en uno o mas genes.

[0180] Tipicamente el individuo es un ser humano.

[0181] Tipicamente, para una variacion genetica dada, hay tres genotipos posibles:

AA, el individuo es homocigoto para la variacion genetica A (por ejemplo, homocigoto para un alelo de tipo silvestre) BB, el individuo es homocigoto para la variacion genetica B (por ejemplo, homocigoto para un alelo mutante) AB, el individuo es heterocigoto para las variaciones geneticas A y B (por ejemplo, un alelo de tipo silvestre y uno mutante)

[0182] Las variaciones geneticas, tales como SNP, que se van analizar de acuerdo con los presentes metodos, estan asociadas con RA. Los ejemplos de variaciones geneticas asociadas con RA que pueden evaluarse mediante los presentes metodos incluyen las de la Tabla 1A y Tabla 1B (Figura 1).

[0183] Las secuencias de todos los genes mencionados en la Figura 1 se conocen y estan reconocidas en los siguientes sitios web: GeneBank (NCBI), GeneCard (Weizmann Institute of Sciences) y Snpper.chip.org (Innate Immunity PGA). La Tabla 11 proporciona codigos de refSNP (n° rs) para varios SNP. Estos se toman de la Base de Datos de P olimorfismos de un S olo N ucleotido ( dbSNP) corregida por e l N ational C enter f or Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp, el 22 de junio de 2007).

[0184] Al permitir el genotipado clinico de una o mas de las variaciones geneticas anteriores, el presente metodo tiene utilidad, por ejemplo, en el diagnostico de la susceptibilidad a o la presencia de RA en un sujeto. Los presentes metodos de genotipado tambien son utiles en el pronostico de fenotipos de RA, como se describe en la presente memoria.

[0185] Al menos una variacion genetica asociada a RA, por ejemplo, SNP, se analiza en los presentes metodos de genotipado. Los presentes metodos permiten el genotipado simultaneo de multiples variaciones en un individuo y, tipicamente, se analizan multiples variaciones, en general, al menos 10, 12, 14, 16, 18 o 20 variaciones geneticas asociadas a RA. Por ejemplo, pueden ensayarse al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105 o 110 variaciones, o hasta 150, 200, 300, 400, 500 o 600 variaciones, tal como 250, 350 o 450 variaciones.

[0186] Por lo tanto, los metodos de genotipado pueden usarse para genotipar a un individuo con respecto a todas

o a una seleccion de las variaciones de la Tabla 1A o 1B, como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, puede genotiparse al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o todas las variaciones de la Tabla 1A o 1B. Las variaciones a detectar pueden incluir ademas otras variaciones geneticas asociadas a RA.

[0187] La presente invencion tambien incluye metodos en los que se evaluan otras variaciones geneticas ademas de las variaciones geneticas asociadas a RA.

[0188] De acuerdo con los presentes metodos, se proporciona una muestra que contiene acido nucleico, que comprende al menos una de las variaciones genetica a ensayar (el ADN diana). Se describen en la presente memoria muestras adecuadas y metodos para obtener las muestras en relacion con los metodos de pronostico.

[0189] Como se describe, las regiones de ADN que contienen las variaciones geneticas a identificar (regiones de ADN di ana) p ueden s ometerse a u na r eaccion de amplificacion p ara obtener pr oductos de am plificacion q ue contienen las variaciones geneticas a identificar. Puede usarse cualquier tecnica o metodo adecuado para la amplificacion. En general, la tecnica permite la amplificacion (simultanea) de todas las secuencias de A DN que contienen las variaciones geneticas a identificar. En otras palabras, cuando se van a analizar multiples variaciones geneticas, es pr eferible am plificar si multaneamente t odas las regiones de A DN d iana co rrespondientes (que comprenden las variaciones). El realizar la amplificacion en una sola etapa (o en tan pocas etapas como sea posible) simplifica el metodo.

[0190] Por ej emplo, puede l levarse a ca bo un a P CR m ultiple, usa ndo p arejas apropiadas de ce badores oligonucleotidicos de PCR que son capaces de amplificar las regiones diana que contienen las variaciones geneticas a identificar. Puede usarse cualquier pareja de cebadores adecuada que permita una amplificacion especifica de una region de ADN diana. En un aspecto, los cebadores permiten la amplificacion en el menor numero posible de reacciones d e P CR. P or l o t anto, m ediante e l us o d e par ejas apr opiadas de c ebadores oligonucleotidicos y condiciones apropiadas, todas las regiones deADN diana necesarias para genotipar las variaciones geneticas pueden amplificarse para el analisis de genotipado (por ejemplo, microplaca de ADN) con el minimo numero de reacciones. Los cebadores de PCR adecuados para la amplificacion de regiones de ADN diana que comprenden las variaciones geneticas asociadas a RA en la Tabla 1A y 1B se enumeran en las Tablas 3. El presente metodo puede comprender el uso de uno o mas de estos cebadores o una o mas de las parejas de cebadores enumeradas. Por ejemplo, los presentes metodos pueden usarse para el genotipado de variaciones de la Tabla 1A seleccionadas como se ha descrito anteriormente. Los cebadores correspondientes dela Tabla 3 pueden seleccionarse para su uso en consecuencia.

[0191] En un caso, los productos deamplificacion pueden marcarse durantela reaccion de amplificacion con un marcador detectable. El objetivo es ser capaz de detectar posteriormente la hibridacion entre los fragmentos de ADN diana que contienen las variaciones geneticas que se estan analizando y sondas fijadas a un soporte solido. Cuanto mayor sea el grado de hibridacion de un ADN diana marcado con una sonda, mayor sera la intensidad de marcador detectable en esa posicion de sonda.

[0192] Los productos de am plificacion p ueden marcarse p or m etodos convencionales. P or ej emplo, puede incorporarse un nucleotido marcado durante la reaccion de amplificacion o pueden usarse cebadores marcados para la amplificacion.

[0193] El marcaje puede ser directo usando, por ejemplo, marcadores fluorescentes o radiactivos, o cualquier otro marcador conocido por los expertos en la materia. Los ejemplos de fluoroforos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, Cy3 o Cy5. Como alternativa, pueden usarse enzimas para el marcaje de muestras, por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa. Los ejemplos de isotopos radiactivos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, 33P, 125I, o cualquier ot ro m arcador c onocido por los expertos en l a m ateria. En u n caso, el m arcaje d e pr oductos de amplificacion se lleva a cabo usando un nucleotido que se ha marcado directa o indirectamente con uno o mas fluoroforos. En otro ejemplo, el marcaje de productos de amplificacion se lleva a cabo usando cebadores marcados directa o indirectamente con uno o mas fluoroforos.

[0194] El marcaje tambien puede ser indirecto, usando, por ejemplo, metodos quimicos o enzimaticos. Po r ejemplo, un producto de amplificacion puede incorporar un miembro de una pareja de union especifica, por ejemplo, avidina o estreptavidina, conjugado con un marcador fluorescente, y la sonda con la que hibridara puede unirse al otro miembro de la pareja de union especifica, por ejemplo, biotina (indicador), permitiendo que la senal de union de sonda/diana se mida por fluorimetria. En otro ejemplo, un producto de amplificacion puede incorporar un miembro de una pareja de union especifica, por ejemplo, un anticuerpo anti-dioxigenina combinado con una enzima (marcador), y la sonda con la que hibridara puede unirse al otro miembro de la pareja de union especifica, por ejemplo, dioxigenina (indicador). En la hibridacion del producto de amplificacion a la sonda el sustrato enzimatico se convierte en un producto luminoso o fluorescente y la senal puede leerse, por ejemplo, por quimioluminiscencia o fluorimetria.

[0195] El acido nucleico que comprende la variacion o variaciones geneticas a ensayar, por ejemplo, los productos de amplificacion (opcionalmente marcados), puede someterse ademas a una reaccion de fragmentacion, obteniendo de est e m odo al gunos productos de f ragmentacion q ue co mprenden o co ntienen l as variaciones gen eticas a identificar o analizar. Tipicamente, la fragmentacion aumenta la eficacia de la reaccion de hibridacion. La fragmentacion puede llevarse a cabo por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo, poniendo en contacto el acido nucleico, por ejemplo, los productos de amplificacion, con una enzima adecuada tal como ADNasa.

[0196] Si el acido nucleico no se ha marcado previamente, por ejemplo, durante la reaccion de amplificacion (y, tipicamente, cuando no se lleva a cabo una amplificacion o ligacion post-hibridacion en el soporte solido), entonces el marcaje con un marcador detectable puede llevarse a cabo pre-hibridacion por marcaje de los productos de fragmentacion. Se conocen en la materia tecnicas de marcaje adecuadas, y pueden ser directas o indirectas, como se describe en la presente memoria. El marcaje directo puede comprender el uso de, por ejemplo, fluoroforos, enzimas o isotopos radiactivos. El marcajeindirecto puede comprender el uso de, por ejemplo, parejas de union especificas que incorporan, por ejemplo, fluoroforos, enzimas, etc. Por ejemplo, si los productos de amplificacion no se han marcado durante la reaccion de amplificacion, losproductos de fragmentacion pueden someterse a un marcaje directo o indirecto con uno o diversos marcadores, por ejemplo, uno o diversos fluoroforos, aunque pueden usarse otros marcadores conocidos por los expertos en la materia.

[0197] De acuerdo con los presentes metodos, el acido nucleico, por ejemplo, los productos de amplificacion o fragmentacion, que comprende la variacion o variaciones geneticas a detectar (ADN diana), se pone en contacto con sondas oligonucleotidicas que son capaces de detectar las variaciones geneticas correspondientes por hibridacion en condiciones adecuadas.

[0198] Tipicamente, las condiciones de hibridacion permiten la hibridacion especifica entre sondas y los acidos nucleicos diana correspondientes para formar complejos de hibridacion de sonda/diana especificos, minimizando al mismo tiempola hibridacion entre sondas que llevan uno o mas emparejamientos erroneos con el ADN. Dichas condiciones pueden determinarse empiricamente, por ejemplo, variando el tiempo y/o la temperatura de hibridacion y/o el numero y la rigurosidad de las etapas de lavado de la matriz que se realizan despues de la hibridacion, y que estan disenadas para eliminar todas las interacciones de sonda-ADN que sean inespecificas.

[0199] En el metodo, las sondas seproporcionan depositadas en un soporte solido o superficie. Las sondas se depositan en posiciones en el soporte solido de acuerdo con un patron predeterminado, formando una "microplaca de ADN". Se ha descubierto que las microplacas deberian cumplir varios requisitos para usarse en los presentes metodos, por ejemplo, en terminos del diseno de las sondas, el numero de sondas proporcionadaspara cada variacion genetica a detectar y la distribucion de las sondas en el soporte. Estos se describen en detalle en la presente memoria. Los inventores han desarrollado microplacas de genotipado adecuadas para su uso en los presentes metodos y, por c onsiguiente, e n un asp ecto, l a i nvencion pr oporciona u na m icroplaca de A DN o (micro)matriz que comprende una pluralidad de sondas depositadas o inmovilizadas en un soporte solido como se describe en la presente memoria.

[0200] En general, el soporte o fase solida comprende sondas oligonucleotidicas adecuadas para la deteccion de cada variacion genetica a ensayar en el presente metodo. El numero yel tipo de variaciones geneticas a ensayar usando una microplaca puede seleccionarse como se describe en la presente memoria.

[0201] Tipicamente, habra al m enos una s onda qu e sea capaz de h ibridar esp ecificamente co n l a va riacion genetica A(por ejemplo, un alelo de tipo silvestre o normal) (sonda 1) y una sonda que sea capaz de hibridar especificamente co n l a va riacion g enetica B ( por ej emplo, un al elo m utante) ( sonda 2) en l as condiciones de hibridacion seleccionadas. Estas sondas forman una pareja de sondas. La sonda 1 es para la deteccion de la variacion genetica A y la sonda 2 es para la deteccion de la variacion genetica B. Tipicamente, las sondas pueden usarse para discriminar entre A y B (por ejemplo, los alelos de tipo silvestre y mutante). Las sondas pueden examinar la cadena con sentido o la antisentido. Tipicamente, las sondas 1 y 2 examinan la misma cadena de acido nucleico (por ejemplo, la cadena con sentido o la cadena antisentido), aunque en algunos casos las sondas pueden examinar cadenas diferentes. En un aspecto, las sondas 1 y 2 tienen la misma secuencia excepto por el sitio de la variacion genetica.

[0202] En un caso, las sondas en una pareja de sondas tienen la misma longitud. En algunos aspectos, cuando se proporcionan dos o mas parejas de sondas para el analisis de una variacion genetica, las sondas pueden tener todas la misma longitud.

[0203] Preferentemente, se proporciona mas de una pareja de sondas para la deteccion de cada variacion genetica. Por lo tanto, pueden proporcionarse al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas parejas de sondas por variacion genetica. En un aspecto, se proporcionan (al menos) 2 parejas de sondas. El objetivo es reducir el indice de falsos positivos y negativos en los presentes metodos.

[0204] Por ejemplo, para una variacion genetica dada, puede haber:

Una sonda 1 que es capaz de hibridar con la variacion genetica A (por ejemplo, un alelo normal).

Una sonda 2 que es capaz de hibridar con la variacion genetica B (por ejemplo, un alelo mutante).

Una sonda 3 que es capaz de hibridar con la variacion genetica A (por ejemplo, un alelo normal).

Una sonda 4 que es capaz de hibridar con la variacion genetica B (por ejemplo, un alelo mutante).

[0205] Las sondas pueden examinar la misma cadena o cadenas diferentes. Por lo tanto, en una realizacion, las sondas 3 y 4 son las sondascomplementarias de las sondas 1y 2, respectivamente, y estan disenadas para examinar la cadena complementaria. En un aspecto, se prefiere que las sondas proporcionadas para la deteccion de cada variacion genetica examinen ambas cadenas.

[0206] Pueden proporcionarse mas de 2 parejas de sondas para el analisis de una variacion genetica como anteriormente. Por ejemplo, cuando existe una variacion genetica como cualquiera de 4 bases en la misma cadena (por ejemplo, hay tres posibilidades mutantes), puede proporcionarse al menos una pareja de sondas para detectar cada posibilidad. Preferentemente, se proporcionan al menos 2 parejas de sondas para cada posibilidad.

[0207] Por lo tanto, por ejemplo, para un SNP G2677T/A/C, puede proporcionarse al menos una pareja de sondas para la deteccion de G2677T, una pareja para la deteccion de G2677/A, y una pareja para la deteccion de G2677C. Preferentemente, se proporcionan al menos dos parejas de sondas para cada una de estas sustituciones.

[0208] Se conocen en la tecnica varios metodos para disenar sondas oligonucleotidicas adecuadas para su uso en microplacas de ADN.

[0209] Puede usarse un metodo de "embaldosado convencional". En este metodo, se disenan 4 oligonucleotidos que son totalmente complementarios a la secuencia de referencia excepto en la posicion central en la que, tipicamente,se examinalos 4 nucleotidos posibles A, C, G y T. Un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es la microplaca de ADN para el genotipado de VIH-1 (Affymetrix).

[0210] En el "embaldosado alternativo" se disenan 5 oligonucleotidos, de modo que el quinto examina una posible delecion en la secuencia. Un ejemplo de esta estrategia es la microplaca de ADN para detectar mutaciones en p53 (Affymetrix).

[0211] En el "embaldosadoen bloque"se disenan 4 oligonucleotidos que son totalmente complementarios a la secuencia normal y otros 4 totalmente complementarios a la secuencia mutante. El nucleotido que cambia se pone en la posicion central, pero se pone un emparejamiento erroneo de una de las 4 bases(A, C,T o G) 2 nucleotidos antes o d espues de l a posicion de nucleotido que se desea cu estionar. U n ej emplo d e est a est rategia es la microplaca de ADN para la deteccion de mutaciones en el citocromo p450 (Roche y Affymetrix).

[0212] Un ejemplo adicional es el "embaldosado en bloque alternativo", en el que el "emparejamiento erroneo" se usa para aumentar la especifidad del hibrido no solo en una posicion, sino tambien en las posiciones -4, -1, 0, +1 y +4 para identificar el cambio producido en la posicion central o 0. Un ejemplo es la microplaca de ADN para detectar

1.500 SNP (Affymetrix).

[0213] Pueden usarse u na o m as de c ualquiera de estas estrategias para disenar s ondas para l a pr esente invencion. Preferentemente se usa el embaldosado convencional, en particular con 2 parejas de sondas, por ejemplo, 2 parejas de sondas complementarias como anteriormente. Por lo tanto, es preferible que la secuencia oligonucleotidica sea complementaria al ADN o secuencia diana enlas regiones que flanquean el nucleotido o nucleotidos variables. Sin embargo, en algunos casos pueden introducirse uno o mas emparejamientos erroneos, como se ha descrito anteriormente.

[0214] Las sondas oligonucleotidicas para su uso en la presente invencion presentan tipicamente la base que se va a examinar(el sitio de la variacion genetica) en el centro del oligonucleotido. �stees particularmente el caso cuando se usan metodos de hibridacion diferencial, ya que en general esto permite la mejor discriminacion entre sondas emparejadas y emparejadas erroneamente. En estos metodos, tipicamente hay formacion de complejos de hibridacion detectables especificos sin amplificacion en la microplaca post-hibridacion. Por ejemplo, para mutaciones precisas (una sola base), la base que difiere entre el alelo normal y el mutante se pone tipicamente en la posicion central de la sonda. En el caso de inserciones, deleciones y duplicaciones, el primer nucleotido que difiere entre la secuencia normal y la mutante se pone en la posicion central. Se cree que la colocacion de la mutacion en el centro de la sonda maximiza la especifidad.

[0215] Cuando se emplea amplificacion en la microplaca post-hibridacion (por ejemplo, metodos de ligacion o extension de cebadores), las sondas oligonucleotidicas presentan tipicamente la base o bases variables en el extremo 3' de la sonda. Cuando se usa metodologia de OLA, tambien se disenan oligonucleotidos (marcados directa

o indirectamente) que hibridan con complejos de sonda-diana para permitir la ligacion.

[0216] En general, las sondas para su uso en la presente invencion comprenden, o en algunas realizaciones consisten (esencialmente) en 17 a 27 nucleotidos, por ejemplo, 19, 21, 23 o 25 nucleotidos, o 18, 20, 22, 24 o 26 nucleotidos.

[0217] Preferentemente, las sondas individuales proporcionadas para la deteccion de una variacion genetica son capaces de hibridar especificamente conlos alelos normales y mutantes,respectivamente, en las condiciones de hibridacion seleccionadas. Por ejemplo, la temperatura de fusion de los complejos de sonda/diana puede darse a 7585°C, y la hibridacion puede ser durante una hora, aunque tambien pueden ser suficientes temperatura superiores e inferiores e hibridaciones mas largas y mas cortas.

[0218] Las sondas proporcionadas para (adecuadas para) la deteccion de cada variacion genetica (como se ha descrito anteriormente) son tipicamente capaces de discriminar entre la variacion genetica A y B (por ejemplo, los alelos normales y mutantes) en las condiciones de hibridacion dadas como anteriormente. Preferentemente, la capacidad de discriminacion de las sondas es sustancialmente del 100%. Si la capacidad de discriminacion no es del 100%, preferentemente lassondas se redisenan. Preferentemente, la temperatura de fusion de los complejos de sonda/diana se da a 75-85 grados C. Se describen en la presente memoria metodos para ensayar la capacidad de discriminacion.

[0219] En un ejemplo, las sondas proporcionadas para la deteccion de una variacion genetica examinan ambas cadenas y tienen longitudes que varian de 19-27 nucleotidos. Preferentemente, las sondas tienen una capacidad de discriminacion del 100%, y la temperatura de fusion de los complejos de sonda/diana es de 75-85 grados.

[0220] Tipicamente, para obtener sondas para su uso en los presentes metodos, se d isenan y e nsayan experimentalmente varias sondas, por ejemplo, para determinar su especifidad de hibridacion y su capacidad para discriminar entre variantes geneticas (por ejemplo, un alelo normal y uno mutante). Pueden disenarse secuencias de sondas oligonucleotidicas candidatas comosehadescrito anteriormente. �stas pueden variar, por ejemplo, en longitud, especifidad de cadena, posicion de la variacion genetica y grado de complementariedad con la secuencia que flanquea la variacion genetica en el ADN diana. Una vez que se han disenado parejas de sondas, estas pueden ensayarse para determinar su especifidad de hibridacion y su capacidad de discriminacion. La capacidad de sondas especificas para di scriminar entre l as variaciones geneticas A y B ( por ej emplo, al elos normales y mutantes) depende de las condiciones de hibridacion, de la secuencia que flanquea la mutacion y de la estructura secundaria de la secuencia en la region de la mutacion. Usando condiciones de hibridacion estables pueden establecerse los parametros apropiados, tales como las especifidades y longitudes de cadena, para maximizar la discriminacion. Preferentemente, la variacion genetica se mantiene en la posicion central en las sondas ensayadas.

[0221] En la presente memoria se describen metodos para ensayar la capacidad de discriminacion de las sondas. Tipicamente, se proporcionan varias parejas de sondas candidatas y se usan en un metodo de entrenamiento como se describe a continuacion. En general, se ensayan dos parejas de sondas (sondas 1 y 2 y sondas 3 y 4) en el metodo. Por ejemplo, pueden ensayarse dos parejas de sondas que examinan ambas cadenas (complementarias entre si). Si no es posible obtener una discriminacion del 100% entre los tres grupos de genotipado usando las sondas, tipicamente las sondas se redisenan. Las condiciones de hibridacion en el metodo de entrenamiento se mantienen generalmente estables. Tipicamente, la temperatura de fusion de los complejos de sonda/diana es de 7585°C.

[0222] Por ejemplo, partiendo de sondas de 25 nucleotidos que detectan una variacion genetica (por ejemplo, el alelo normal) y otra variacion genetica (por ejemplo, un alelo mutante) en ambas cadenas (con sentido y antisentido), en general puede ensayarse experimentalmente un promedio de 8 sondas para identificar dos parejas definitivas.

[0223] Las sondas se seleccionan para tener una especifidad de hibridacion y una capacidad de discriminacion maximas entre variantes geneticas (por ejemplo, un alelo normal y uno mutante) en condiciones de hibridacion adecuadas. Por ejemplo, las sondas para la deteccion de una variacion genetica dada, por ejemplo, dos parejas de sondas, t ienen t ipicamente una c apacidad d e di scriminacion de sustancialmente el 1 00%. T ipicamente, l a temperatura de fusion de complejos de sonda/diana es a 75-85°C.

[0224] Usando los metodos de la presente memoria los inventores han desarrollado sondas oligonucleotidicas adecuadas para la deteccion de las variaciones geneticas asociadas a RA en la Tabla 1A y 1B. Estas sondas se presentan como SEC ID N°: 1-360 (Tabla 2). Las sondas se enumeran en conjuntos de sondas (90 conjuntos en total), de acuerdo con la variacion genetica a detectar. Se enumeran al menos dos parejas de sondas en cada conjunto.

[0225] En un aspecto, la invencion se refiere a una o mas de cualquiera de las sondas oligonucleotidicas, parejas de sondas o conjuntos de sondas expuestos en las SEC ID N°: 1-360 (Tabla 2) y a su uso en el genotipado, diagnostico o pronostico o metodos terapeuticos de la invencion. La invencion se refiere ademas a una o masde cualquiera de las sondas oligonucleotidicas, parejas de sondas o conjuntos de sondas expuestos en las SEC ID N°: 1-360 para su uso en medicina, por ejemplo, en un metodo de diagnostico o pronostico o terapeutico descrito en la presente memoria. Unamicroplaca de la invencionpuede comprender una o mas delas parejas o conjuntos de sondas enumerados como se describe en la presente memoria.

[0226] En general, las sondas se proporcionan en el soporte repetidas. Tipicamente, se proporcionan al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 repeticiones de cada sonda, en particular, 6, 8 o 10 repeticiones. Por lo tanto, por ejemplo, el soporte (o microplaca de ADN) puede comprender o incluir 10 repeticiones para cada una de las (al menos) 4 sondas usadas para detectar cada variacion genetica (es decir, 40 sondas). Como alternativa, el soporte (o microplaca de ADN) puede comprender o incluir 8 repeticiones para cada una de las (al menos) 4 sondas usadas para detectar cada variacion genetica(es decir, 32 sondas). Todavia ademas el soporte (o microplaca de ADN) puede comprender o incluir 6 repeticiones para cada una de las (al menos) 4 sondas usadas para detectar cada variacion genetica (es decir, 24 sondas). El uso de repeticiones de sondas ayuda a minimizar las distorsiones en la interpretacion de los datos de la microplaca y mejora la fiabilidad de los metodos.

[0227] En general, el soporte tambien comprende una o m as sondas oligonucleotidicas de control. Tambien se proporcionan repetidas como anteriormente. Por lo tanto, el soporte (omicroplaca de ADN) puede comprender ademas uno o mas oligonucleotidos depositados en el so porte que sean ut iles como controles positivos y/o negativos de las reacciones de hibridacion. Si las reacciones de amplificacion o ligacion post-hibridacion se llevan a cabo en la microplaca, tambien puede haber uno o mas controles positivos o negativos de estas reacciones.

[0228] Tipicamente, la microplaca o matriz incluira sondas de control positivo, por ejemplo, sondas que se sabe que son complementarias y que pueden hibridar con secuencias en las moleculas polinucleotidicas diana, sondas que se sabe que hibridan con un ADN de control externo, y sondas de control negativas, por ejemplo, sondas que se sabe que no son complementarias yque no pueden hibridar con secuencias en las moleculas polinucleotidicas diana. La microplaca puede tener uno o mas controles especificos para cada diana, por ejemplo, 2, 3 o m as controles. Tambien puede haber al menos un control para la matriz.

[0229] Los controles positivos pueden sintetizarse, por ejemplo, a lo largo del perimetro de la matriz o en franjas en diagonal a traves de la matriz. La complementaria inversa para cada sonda puede sintetizarse al lado de la posicion de la sonda para servir como control negativo. En otro ejemplo mas, pueden usarse secuencias de otras especies de organismos como controles negativos para contribuir a determinar la hibridacion de fondo (inespecifica).

[0230] Como anteriormente, el soporte (o microplaca de ADN) puede incluir algunos (uno o mas) oligonucleotidos depositados en el soporte que sean utiles como controles positivos y negativos de las reacciones de hibridacion. En general, cada una de las submatrices, por ejemplo, 16, que tipicamente constituyen una microplaca de ADN, esta flanqueada por algunos controles de hibridacion externos que sirven como puntos de referencia que permiten que los puntos dentro de la rejilla se localicen mas facilmente.

[0231] En un caso, la secuencia de nucleotidos de un ADN de control externo es la siguiente (5'->3'):

CEH: GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGAGTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA (SEC ID N°: 541)

y las secuencias de los oligonucleotidos para su deteccion son las siguientes:

ON1: CTTGACGACTCCTGAACGG (SEC ID N°: 542)

ON2: CTTGACGACACCTGAACGG (SEC ID N°: 543)

[0232] Las sondas de control positivo estan disenadas generalmente para hibridar por igual con todas las muestras de ADN diana y proporcionar una intensidad de senal de referencia frente a la que puede compararse la hibridacion del ADN diana (muestra) con las sondas de ensayo. Los controles negativos comprenden "blancos" en los que solo se ha aplicado disolvente (DMSO) al soporte u oligonucleotidos de control que se hanseleccionado para que no muestren hibridacion o muestren una hibridacion unicamente minima con la diana, por ejemplo, ADN humano(el ADN de e nsayo). L a i ntensidad d e cu alquier se nal det ectada en c aracteristicas de ol igonucleotidos de co ntrol negativo o blancos es un indicio de interacciones inespecificas entre el ADN de muestra y la matriz y, por lo tanto, es una medida de la senal de fondo frente a la que debe discriminarse la senal de las interacciones de sonda-muestra reales.

[0233] De forma deseable, el numero de secuencias en la matriz sera tal que cuando el numero de ac idos nucleicos adecuados para ladeteccion de variaciones geneticas es n, el numero de acidos nucleicos de control positivos y negativos es n', donde n' es tipicamente 0,01 a 0,4n.

[0234] En general, el soporte o microplaca es adecuado para genotipar variaciones geneticas asociadas a RA, en particular, el genotipado de acuerdo con los presentes metodos. La microplaca comprende tipicamente sondas adecuadas para la deteccion de al menos una pero, preferentemente, multiples variaciones geneticas asociadas a RA, tipicamente al menos 10, 12, 14, 16, 18 o 20 variaciones. Por ejemplo, pueden ensayarse al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105 o 110 variaciones, o hasta 150, 200, 300, 400, 500 o 600 variaciones, tal como 250, 350 o 450 variaciones.

[0235] Las variaciones geneticas asociadas a RA pueden incluir cualquiera o todas las de la Tabla 1A o 1B. Por lo tanto, una matriz o microplaca puede comprender sondas adecuadas para genotipar a un individuo con respecto a todas las variaciones de la Tabla 1A o 1B, o una seleccion de las variaciones de la Tabla, como se describe en la presente memoria.

[0236] Una microplaca de ADN de acuerdo con la invencion (�Artchip') permite el genotipado simultaneo, sensible, especifico y reproducible de variaciones geneticas asociadas conRA. Se proporcionan ejemplos no limitantes de dichas variaciones en la Tabla 1A y1B. No obstante, el numero de variaciones geneticas contenidas en la Tabla puede aumentarse a medida que se identifiquen posteriormente otras variaciones geneticas y se asocien con RA. Por lo tanto, las variaciones geneticas detectables por la microplaca pueden comprender, o consistir (esencialmente) en las enumeradas en la Tabla 1A o Tabla 1B oen la Figura 11,o unaseleccion de estas, como se describenen relacion conlos presentes metodos. La microplaca comprendera sondas adecuadas para la deteccion de estas variaciones geneticas como se descr ibe en l a pr esente m emoria. P referentemente, cu ando u na m icroplaca comprende sondas para la deteccion de una variacion genetica de la Tabla 1A, la microplaca comprende una o mas de las sondas enumeradas en las SEC ID N°: 1-360 (Tabla 2) como adecuadas para la deteccion de esa variacion genetica, por ejemplo, losconjuntos de sondas enumerados en las SEC ID N°: 1-360 parala deteccion de esa variacion. En un aspecto, la presente microplaca comprende una o mas sondas seleccionadas de las SEC ID N°: 1

360. L as sondas se e numeran e n co njuntos de s ondas, de ac uerdo con l a va riacion g enetica a det ectar. S e proporciona en cada conjunto al menos dos parejas de sondas. Una microplaca puede comprender al menos una pareja de sondas o al menos un conjunto de sondas, o una seleccion de los conjuntos de sondas, por ejemplo, una pareja de sondas o un conjunto de sondas de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o los 90 conjuntos, de acuerdo con las variaciones geneticas que se esten ensayando. Una microplaca puede comprender otras sondas para la deteccion de variaciones de la Tabla 1A u otras variaciones asociadas con RA en lugar de o ademas de las especificamente enumeradas.

[0237] La Artchip puede comprender ademas sondas oligonucleotidicas para la deteccion de variaciones geneticas no asociadas con RA. Por ejemplo, las microplacas pueden comprender sondas para la deteccion de variaciones geneticas tales como SNP asociados con otra afeccion (relacionada) tal como cancer de colon, rectal o de vejiga. Tipicamente, en la Artchip, el numero de acidos nucleicos adecuados para la deteccion de variaciones geneticas asociadas con RA (por ejemplo, las de la Tabla 1A o Tabla 1B o Figura 11) representan al menos el 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o mas de los acidos nucleicos en la matriz.

[0238] En general, el soporte o microplaca tiene de 300 a 40000 acidos nucleicos (sondas), por ejemplo, de 400 a 30000 o de 400 a 20000. La microplaca puede tener de 1000 a 20000 sondas, tal como de 1000 a 15000 o de 1000 a 10000, o de 1000 de 5000. Una microplaca adecuada puede tener de 2000 a 20000, de 2000 a 10000 o de 2000 a 5000 sondas. Por ejemplo, una microplaca puede tener 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 12000, 14000, 16000, 18000 o 20000 sondas. Tambien se preven microplacas mas pequenas de 400 a 1000 sondas, tales como 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 950 sondas.

[0239] En general, la matriz o microplaca de la invencion comprende un soporte o superficie con una matriz ordenada de sitios de union (por ejemplo, hibridacion) o sondas. Por lotanto, la disposicion de las sondas en el soporte esta predeterminada. C ada so nda ( es decir, c ada repeticion de sonda) s e l ocaliza e n una posicion predeterminada conocida en el soporte solido de modo que la identidad (es decir, la secuencia) de cada sonda puede determinarse a partir de su posicion en la matriz. Tipicamente, las sondas estan uniformemente distribuidas en un patron predeterminado.

[0240] Preferentemente, l as sondas depositadas en el s oporte, au nque m antienen una di sposicion predeterminada, no estan agrupadas por variacion genetica sino que tienen una distribucion aleatoria. Tipicamente, tampoco estan agrupadas dentro de la misma variacion genetica. Si se desea, esta distribucion aleatoria puede ser siempre la misma. Por lo tanto, tipicamente, las sondas se depositan en el soporte solido (en una matriz) siguiendo un patron predeterminado de modo que esten distribuidas uniformemente, por ejemplo, entre las dos areas que pueden constituir una microplaca de ADN, pero no agrupadas de acuerdo con la variacion genetica a caracterizar. La distribucion de repeticiones de sondas a traves de la matriz de esta forma contribuye a reducir o eliminar cualquier distorsion de la senal y de la interpretacion de datos,por ejemplo, que surja de una distribucion no uniforme de interferencias de fondo a traves de la matriz.

[0241] Como se ha explicado anteriormente, las sondas pueden disponerse en un soporte en submatrices.

[0242] El soporte, sobre el que se deposita la pluralidad de sondas, puede ser cualquier soporte solido al que puedan unirse oligonucleotidos. Puede usarse en la invencion practicamente cualquier soporte al que pueda unirse o en el que pueda inmovilizarse un oligonucleotido, y que pueda usarse en la produccion de microplacas de ADN. Por ejemplo, dicho soporte puede ser de un material no poroso, por ejemplo, vidrio, silicona, plastico o un material poroso tal como una membrana o filtro (por ejemplo, nylon, nitrocelulosa) o un gel. En una realizacion, dicho soporte es un soporte de vidrio, tal como un portaobjetos de vidrio.

[0243] Las micromatrices se preparan e n g eneral por s eleccion de sondas que c omprenden u na s ecuencia polinucleotidica dada, y despues inmovilizacion de dichas sondas en un soporte solido o superficie. Las sondas pueden disenarse, ensayarse y seleccionarse como se describe en la presente memoria. En general, las sondas pueden comprender secuencias de ADN. En algunas realizaciones, las sondas pueden comprender secuencias de ARN o secuencias de copolimeros de ADN y ARN. Las secuencias polinucleotidicas de las sondas tambien pueden comprender a nalogos d e ADN y/o A RN, o c ombinaciones d e l os m ismos. P or ej emplo, l as se cuencias polinucleotidicas de las sondas pueden ser fragmentos completos o parciales de ADN genomico. Las secuencias polinucleotidicas de las sondas tambien pueden ser secuencias de nucleotidos sintetizadas, tales como secuencias oligonucleotidicas sinteticas. Las secuencias de so ndas pueden si ntetizarse enzi maticamente in vivo, enzimaticamente in vitro (por ejemplo, mediante PCR) o no enzimaticamente in vitro.

[0244] Las micromatrices o microplacas pueden fabricarse de varias formas. Independientemente de como se produzcan, las mi cromatrices co mparten tipicamente ciertas caracteristicas. Las m atrices son r eproducibles, permitiendo que se produzcan y comparen facilmente entre si multiples copias de una matriz dada. Preferentemente, las mi cromatrices se f abrican a pa rtir de materiales que son estables en condiciones de union (por ejemplo, hibridacion de acido nucleico). Las micromatrices son preferentemente pequenas, por ejemplo, de entre 0,25 y 25 o 0,5 y 20 cm2, tal como de 0,5 a 20 cm2 o de 0,5 a 15 cm2, por ejemplo, de 1 a 15 cm2 o de 1 a 10 cm2, tal como de 2, 4, 6 u 8 cm2.

[0245] Las sondas pueden unirse al presente soporte usando tecnicas convencionales para la inmovilizacion de oligonucleotidos en l a superficie de l os soportes. L as tecnicas usadas dependen, entre ot ros factores, de la naturaleza del soporte usado �porosa (membranas, microparticulas, etc.) o no porosa (vidrio, plastico, silicona, etc.)�. En general, las sondas pueden inmovilizarse en el soporte usando tecnicas de inmovilizacion no covalentes o usandotecnicas de inmovilizacion basadas en launion covalente de las sondas al soporte por procedimientos quimicos.

[0246] La preparacion de soportes no porosos (por ejemplo, vidrio, silicona, plastico) requiere, en general, el pretratamiento con grupos reactivos (por ejemplo, amino, aldehido) o el recubrimiento de la superficie del soporte con un miembro de una pareja de union especifica (por ejemplo, avidina, estreptavidina). Asimismo, en general, es aconsejable preactivar las sondas a inmovilizar por medio de grupos correspondientes tales como tiol, amino o biotina para conseguir una inmovilizacion especifica de las sondas en el soporte.

[0247] La inmovilizacion de l as sondas en el soporte puede llevarse a ca bo por metodos convencionales, por ejemplo, por medio de tecnicas basadas en la sintesis in situ de sondas en el soporte (por ejemplo, fotolitografia, sintesis quimica directa, etc.) o mediante tecnicas basadas en, por ejemplo, brazos roboticos que depositan la sonda presintetizada correspondiente (por ejemplo, impresion sin contacto, impresion por contacto).

[0248] En una realizacion, el soporte es un portaobjetosde vidrioy, eneste caso, las sondas, en el numero de repeticiones establecido (por ejemplo, 6, 8 o 10) se imprimen sobre portaobjetos de vidrio pretratados, por ejemplo, recubiertos con am inosilanos, usa ndo un equ ipo p ara la pr oduccion aut omatica de m icroplacas de A DN por deposicion de los oligonucleotidos en los portaobjetos de vidrio ("dispositivo de generacion de micromatrices"). La deposicion se lleva a cabo en condiciones apropiadas,por ejemplo, por medio de entrecruzamientocon radiacion ultravioleta y calentamiento (80°C), manteniendo la humedad y controlando la temperatura durante el procedimiento de deposicion, tipicamente una humedad relativa de entre el 40-50%, y tipicamente a una temperatura de 20°C.

[0249] Las sondas repetidas se distribuyen uniformemente entre las areas o sectores (submatrices) que constituyen tipicamente una microplaca de ADN. El numero de repeticiones y su distribucion uniforme a traves de la microplaca de ADN minimiza la variabilidad que surge del procedimiento de impresion que puede afectar a los resultados experimentales. Asimismo, pueden imprimirse controles de hibridacion positivos y negativos (como se describe en la presente memoria).

[0250] Para controlar la calidad del procedimiento de fabricacion de la microplaca de ADN, en terminos de senal de la hibridacion, interferencia de fondo, especifidad, sensibilidad y reproducibilidad de cada repeticion, asi como las diferencias causadas por variaciones en la morfologia de las caracteristicas de sondas aplicadas puntualmente despues de la impresion, puede usarse un ADN comercial. Por ejemplo, como control de calidad de la impresion de las microplacas de ADN puede llevarse a cabo la hibridacion con un ADN comercial (por ejemplo, k562 DNA High Molecular Weight, Promega).

[0251] En primer lugar, se analiza la morfologia y el tamano de las manchas impresas. En la hibridacion con ADN de control, se cumplen los parametros descritos a continuacion para determinar la fiabilidad de la determinacion de genotipo; en concreto, el cociente entre la intensidad de senal y la interferencia de fondo, el promedio de especifidad y sensibilidad y la reproducibilidad entre copias repetidas de la misma sonda. Este metodo permite que se determine el genotipo correcto del ADN de control.

[0252] Como anteriormente, de acuerdo conel presentemetodo, una muestra de acido nucleico, por ejemplo, productos de amplificacion o fragmentacion, que comprende la variacion o variaciones geneticas a detectar (ADN diana), se pone en contacto con una matriz de sondas como se describe en la presente memoria, en condiciones que permitan que se produzca la hibridacion entre ADN diana y lassondas correspondientes.De este modo se forman complejos de hibridacion especificos entre el acido nucleico diana y las sondas correspondientes.

[0253] La hibridacion de, por ejemplo, productos de fragmentacion, con sondas capaces de detectar las variaciones geneticas correspondientes depositadas en un soporte puede llevarse a cabo usando metodos y dispositivos co nvencionales. En u n c aso, l a h ibridacion se l leva a ca bo usando u na est acion d e hi bridacion automatica. P ara q ue s e produzca l a h ibridacion, los, por ejemplo, productos de f ragmentacion, se po nen e n contacto con las sondas en condiciones que permitan que tenga lugar la hibridacion. El uso de condiciones de hibridacion es tables permite que se opt imice l a l ongitud y l a se cuencia de l as sondas para maximizar la discriminacion entre las variaciones geneticas A y B, por ejemplo, entre secuencias de tipo silvestre y mutantes, como se describe en la presente memoria.

[0254] En un caso, el metodo depende de la hibridacion diferencial, en particular, un aumento en la senal de hibridacion. El metodo implica la formacion de complejos de hibridacion especificos entre ADN diana y las sondas correspondientes. Por lo tanto, el ADN diana que lleve la secuencia de tipo silvestre hibridara con las sondas disenadas para detectar la secuencia de tipo silvestre, mientras que el ADN diana que lleve una secuencia mutante hibridara con las sondas disenadas para detectar esa secuencia mutante. Los complejos de hibridacion se marcan de f orma det ectable por medios descritos en l a pr esente memoria ( por ej emplo, el A DN di ana se m arca directamente, o tanto la diana como la sonda se marcan de tal modo que el marcador solo sea detectable en la hibridacion). P or d eteccion de la intensidad de m arcador d etectable (si e xiste) e n l as pos iciones de s ondas predeterminadas es posible determinar la naturaleza del ADN diana en la muestra. En este caso, las sondas (tambien d enominadas ol igonucleotidos especificos d e al elo, A SO) t ienen pr eferentemente e l nucl eotido o nucleotidos variables en la posicion central, como se describe en la presente memoria.

[0255] En otro caso, la hibridacion de ADN diana con sondas en el soporte solido (microplaca) puede estar seguida de amplificacion en la microplaca, por ejemplo, usando extension de cebadores o ligacion, por ejemplo, tecnologias de ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA) (Eggerding FA, lovannisci DM, Brinson E., Grossman P., W inn-Deen E .S. 1995 H uman M utation, 5: 153-65). E n est e ca so, l as sondas en el soporte co mprenden tipicamente el nucleotido o nucleotidos variables en el extremo 3' de la sonda.

[0256] El marcaje puede llevarse a cabo durantela amplificacion post-hibridacion. El marcaje puede ser por marcaje directo usando, por ejemplo, fluoroforos, enzimas, isotopos radiactivos, etc., o por marcaje indirecto usando, por ejemplo, parejas de union especificas que incorporan fluoroforos, enzimas, etc., mediante el uso de metodos convencionales, tales como los mencionados previamente en relacion con el marcaje de productos de amplificacion

o fragmentacion.

[0257] La amplificacion post-hibridacion puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando la metodologia de "extension de c ebadores". T ipicamente, des pues d e la h ibridacion, se l leva a c abo un a r eaccion de e xtension de l os oligonucleotidoshibridos en el soporte (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio). La extension puede llevarse a cabo con nucleotidosmarcados directa o indirectamente y solo tendra lugar si el extremo 3' del oligonucleotido hibrida perfectamente con el producto de amplificacion.

[0258] La extension de cebadores es un metodo conocido para la discriminacion de genotipos (Pastinen T, Raitio M, Lindroos K, Tainola P, Peltonen L, Syvanen AC. 2000 Genome Research 10: 1031-42.) y puede realizarse de varias f ormas di ferentes. En u na est rategia us ada co munmente, se d isenan un conjunto d e so ndas oligonucleotidicas especificas de alelo para hibridar con las secuencias diana. Las sondas difieren entre si en su nucleotido del extremo 3', que para cada sonda esta disenado para que sea complementario a uno de los posibles nucleotidos polimorficos en una posicion dada.

[0259] Cuando el nucleotido 3' de la sonda es complementario a la secuencia bajo ensayo, entonces el emparejamiento de bases consiguiente permite que una ADN polimerasa extienda el cebador oligonucleotidico por incorporacion de nucleotidos adicionales que pueden estar marcados directa o indirectamente, permitiendo de este modo la identificacion posterior de lassondas que se han extendido ylas que no lo han hecho. Las sondas que se extienden con exito llevan el nucleotido complementario al SNP en su extremo 3' permitiendo de este modo que se determine el genotipo de la muestra de ensayo. Tambien se han desarrollado estrategias similares, por ejemplo, el sistema de mutaciones refractarias a la amplificacion (ARMS).

[0260] Como alternativa, puede llevarse a ca bo una reaccion de ligacion post-hibridacion, por ejemplo, usando metodologia de OLA. Despues de la hibridacion, se lleva a cabo una reaccion de ligacion de los oligonucleotidos hibridados en el soporte (por ejemplo, portaobjetosde vidrio) con oligonucleotidos marcados. Unaligacion tendra lugar solamente si el extremo 3' de la sonda depositada en el soporte hibrida perfectamente con el ADN diana (por ejemplo, producto de amplificacion).

[0261] El ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA) es otro metodo para cuestionar SNP (Eggerding FA, lovannisci DM, Brinson E., Grossman P., Winn-Deen E.S. 1995 Human Mutation, 5: 153-65). El OLA usa una pareja de sondas oligonucleotidicas que hibridan con segmentos adyacentes de ADN diana incluyendo la base variable. La sonda disenada para hibridar con el extremo 5' del nucleotido polimorfico es un oligonucleotido especifico de alelo (ASO) para uno de los alelos diana. La ultima base en el extremo 3' de este ASO se situa en el sitio del polimorfismo del ADN diana; el ASO tambien tiene tipicamente una molecula de biotina en su extremo 5' que funciona como un "gancho" que puede usarse posteriormente para recuperar el oligonucleotido en virtud de la interaccion altamente especifica que experimenta la biotina con la estreptavidina. El oligomero en el lado a la derecha o 3' de la pareja es el oligomero comun (la secuencia es la misma para los dos o mas alelos diferentes que se desee ensayar). El oligomero co mun se si tua en un si tio invariable al l ado d el polimorfismo de l ADN di ana y esta m arcado fluorescentemente en su extremo 3'.

[0262] Si el ASO es perfectamente complementario a la secuencia diana, el ASO hibrida completamente cuando hibrida y se situara plano contra esa diana permitiendo que la ADN ligasa una covalentemente el ASO al oligomero comun. Despues de la reaccion de ligacion, el gancho de biotina se usa para eliminar el ASO y, por ejemplo, tambien se eliminara el oligomero comun marcado fluorescentemente, produciendo una fluorescencia detectable.

[0263] Cuando el ASO no es un emparejamiento perfecto con la secuencia diana, la hibridacion es incompleta y la base 3' del oligomero no presentara emparejamiento de bases con elADN diana,impidiendo de este modo la ligacion. En estas circunstancias, cuando se usa el gancho de biotina para eliminar el ASO, el oligonucleotido comun no se eliminara y, por lo tanto, no hay marcador detectable, por ejemplo fluorescencia, en la molecula eliminada.

[0264] Para d istinguir ent re d os alelos conocidos que difieran e n u na sola base, s on n ecesarios t res oligonucleotidos: dos son oligonucleotidos especificos de alelo (ASO) que difieren entre si solamente en la base terminal 3'; el primero es complementario a un alelo y el segundo es complementario al segundo alelo. El tercer oligonucleotido es complementario a la secuencia invariable adyacente a la base variante.

[0265] Una ve z que ha t enido l ugar l a hi bridacion ( y opc ionalmente l a am plificacion post -hibridacion), puede determinarse la intensidad de marcador detectable en cada posicion de sonda (incluyendo sondas de control). La intensidad de la senal (el valor de intensidad bruto) es una medida de la hibridacion en cada sonda.

[0266] La intensidad de marcador detectable en cada posicion de sonda (cada repeticion de sonda) puede determinarse usando cu alquier m edio ad ecuado. Los medios seleccionados dependeran d e l a na turaleza de l marcador. En general, un dispositivo apropiado, por ejemplo, un explorador, recoge la imagen de la microplaca de ADN hibridada y revelada. Se captura una imagen y se cuantifica.

[0267] En un caso, por ejemplo, cuando usa marcaje fluorescente, despues de la hibridacion (opcionalmente despues de la amplificacion o ligacion post-hibridacion), la microplaca de ADN hibridada y revelada se pone en un explorador para cuantificar la intensidad de marcaje en los puntos en los que ha tenido lugar la hibridacion. Aunque puede us arse practicamente cu alquier e xplorador, e n una r ealizacion se usa un e xplorador co nfocal d e fluorescencia. En este caso, la microplaca de ADN se pone en dicho aparato y la senal emitida por el fluoroforo debido a la excitacion por un laser se explora para cuantificar la intensidad de senal en los puntos en los que ha tenido lugar la hibridacion. Los ejemplos no limitantes de exploradores que pueden usarse de acuerdo con la presente i nvencion i ncluyen ex ploradores co mercializados por las companias siguientes: A xon, A gilent, P erkin Elmer, etc.

[0268] Tipicamente, en la determinacion de la intensidad de marcador detectable en cada posicion de sonda (es decir, para cada repeticion de sonda) se tiene en cuenta la interferencia de fondo, que se elimina. La interferencia de fondo surge debido a la union inespecifica a la matriz de sondas y puede determinarse por medio de controles incluidos en lamatriz.Una vez que se ha determinado la intensidad de la senal de fondo, esta puede restarse del valor de intensidad bruto para cada repeticion de sonda para obtener un valor de intensidad puro. Tipicamente, el fondo local, basadoen la intensidad de senal detectada en las proximidades de cada caracteristica individual, se resta del valor de intensidad de senal bruto. Este fondo se determina a partir de la intensidad de senal en un area predeterminada que rodea a cada caracteristica (por ejemplo, un area de X, Y o Z !m2 centrada en la posicion de la sonda).

[0269] La senal de fondo se determina tipicamente a partir de la senal local de controles "blancos" (solamente disolvente). En muchos casos, el dispositivo, por ejemplo, explorador, que se usa para determinar intensidades de senal proporcionara medios para determinar la senal de fondo.

[0270] Por lo tanto, por ejemplo, cuando el marcador es un marcador fluorescente, los valores de fluorescencia absolutos (valores de intensidad bruta) pueden recopilarse para cada repeticion de sonda y las interferencias de fondo asociadas con cada repeticion de s onda tambien pueden evaluarse para producir valores "puros" para la intensidad de senal en cada posicion de sonda.

[0271] Una vez que se ha hibridado el ADN diana a lamicroplaca y que se ha determinado la intensidad de marcador detectable en las posiciones de repeticiones de sondas en la microplaca (los valores de intensidad brutos), es necesario proporcionar un metodo (modelo) que pueda relacionar los datos de intensidad de la microplaca con el genotipo del individuo.

[0272] Los inventores han descubierto que esto puede realizarse aplicando un algoritmo adecuado a los datos de intensidad. E l al goritmo y el software informatico d esarrollados por l os inventores permiten el a nalisis de l as variaciones geneticas con una sensibilidad y reproducibilidad suficientes como para permitir su uso en un entorno clinico. El algoritmo usa tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos AA, AB y BB para una variacion genetica dada. El metodo implica generalmente cotejar los valores de intensidad para todas las repeticiones de cada sonda, para calcular un valor de intensidad promedio para cada sonda. Opcionalmente, los valores de intensidad brutos para cada repeticion pueden corregirse para tener en cuenta la interferencia de fondo (para obtener un valor de intensidad puro) antes de que se cotejen los valores de intensidad para cada una de las repeticiones.

[0273] En general, para una variacion genetica dada, el analisis e interpretacion de una microplaca comprende las etapas siguientes:

(a) proporcionar la intensidad de marcador detectable en cada repeticion para cada una al menos cuatro sondas (sondas 1, 2, 3 y 4) proporcionadas para la deteccion de la variacion genetica (el valor de intensidad bruto), en la que:

-: la sonda 1 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion genetica A (por ejemplo, un alelo normal) y la sonda 2 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion genetica B (por ejemplo, un alelo mutante);

-: la sonda 3 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion genetica A (por ejemplo, un alelo normal) y la sonda 4 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion genetica B (por ejemplo, un alelo mutante); y

-: las sondas 1 y 2 forman una primera pareja de sondas y las sondas 3 y 4 forman una segunda pareja de sondas;

(b): opcionalmente corregir el valor de intensidad bruto para cada repeticion para tener en cuenta la interferencia de fondo, obteniendo de este modo un valor de intensidad puro;

(c): cotejar los valores de intensidad (opcionalmente puros) para cada una de las repeticiones de cada sonda y determinar un valor de intensidad promedio para cada sonda;

(d): calcular los cocientes 1 y 2, en los que:

Cociente 1 = valor de intensidad promedio para sonda 1 valor de intensidad promedio para sonda 1

+ valor de intensidad promedio para sonda 2

y

Cociente 2 = valor de intensidad promedio para sonda 3 valor de intensidad promedio para sonda 3

+ valor de intensidad promedio para sonda 4

(e) introducir los cocientes 1 y 2 en cada una de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles, AA, AB y BB, en la que:

la F uncion 1 es la f uncion lineal qu e ca racteriza a individuos con e l ge notipo A A y co nsiste e n u na combinacion lineal de los cocientes 1 y 2;

la F uncion 2 es la f uncion lineal qu e ca racteriza a individuos con e l ge notipo A B y co nsiste e n u na combinacion lineal de los cocientes 1 y 2;

la F uncion 3 es la f uncion lineal qu e ca racteriza a individuos con e l ge notipo BB y co nsiste e n u na combinacion lineal de los cocientes 1 y 2;

las funciones lineales estan formadas por coeficientes que acompanan a las variables cociente 1 y 2;

(f): determinar cual de las tres funciones lineales tiene el mayor valor; y

(g): determinar de este modo el genotipo del individuo para la variacion genetica.

[0274] Por lo tanto, la funcion lineal correspondiente al genotipo de ese individuo tendra el mayor valor absoluto.

[0275] Los inventores han descubierto que el uso de repeticiones y promedios calculados a partir de repeticiones es importante para el funcionamiento fiable de la invencion. El uso de las funciones acelera el analisis y permite una mejor discriminacion.

[0276] Preferentemente, l a ca pacidad de d iscriminacion ent re l os tres genotipos es de ( aproximadamente) e l 100%. Si la discriminacion es inferior al 100%, preferentemente las sondas se redisenan.

[0277] El valor de intensidad bruto para cada repeticion de sonda puede determinarse de acuerdo con los metodos descritos anteriormente. Por lo tanto, pueden seleccionarse secuencias de sondas y repeticiones como se describe en la presentememoria. En un ejemplo, se usan 4 sondaspor variacion genetica y se usan 6, 8 o 10repeticiones por sonda.

[0278] Tipicamente, la correccion del valor de intensidad bruto para obtener el valor de intensidad puro para cada repeticion d e sonda c omprende r estar l a interferencia d e f ondo d el v alor br uto. La i nterferencia de f ondo se determina tipicamente usando controles apropiados como se describe en la presente memoria.

[0279] Tipicamente, el calculo del valor de intensidad promedio comprende eliminar valores extremos o atipicos. Por lo tanto, cuando los valores de intensidad (opcionalmente puros) de cada una de las repeticiones de sondas se cotejan, los valores atipicos pueden identificarse y excluirse de consideraciones posteriores. En una realizacion, los valores atipicoscomponen entre el 10% yel 50%, por ejemplo, el 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45% de los valores obtenidos. En una realizacion, se eliminan el 40% de los valores. En una realizacion, se usan 4 sondas con 6, 8 o 10 repeticiones por sonda y los valores extremos o atipicos componen entre el 10% y el 50% de los valores obtenidos.

[0280] Se conocen en la tecnica varias funciones lineales adecuadas. Estas funciones pueden usarse en un analisis de discriminacion lineal para los fines de la presente invencion.

[0281] En un aspecto, la invencion se refiere por lo tanto a un metodo o modelo computacional (algoritmo) para determinar el genotipo con respecto a una variacion genetica dada usando los cocientes 1 y 2 en las tres funciones lineales que se han definido anteriormente (etapas e y f). El metodo puede producir por lo tanto en una realizacion un resultado de genotipo (AA, AB o BB) a partir de una entrada de datosde cocientes 1 y 2. El metodo tambien puede incluir calcular uno o ambos cocientes 1 y2 (etapa d). En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas calcular un valor de intensidad promedio para cada sonda (etapa c) y/o calcular un valor de intensidad puro para cada repeticion de sonda (etapa b). Por lo tanto, la introduccion de datos en el modelo puede comprender uno o mas de los valores de intensidad promedios, valores de intensidad de repeticiones puros o valores de intensidad de repeticiones brutos. El metodo puede comprender ademas determinar el valor de intensidad bruto para cada repeticion de sonda (etapa a). El metodo puede comprender una o mas de las etapas anteriores.

[0282] Para llevar a cabo los metodos anteriores, los coeficientes para las funciones lineales deben determinarse en un procedimiento de entrenamiento usando datos de individuos de control cuyo genotipo para la variacion genetica ya se conoce. Se conocen en la tecnica metodos deentrenamiento. Tipicamente, en dichos metodos se usan datos de entrada (en este caso, tipicamente los cocientes 1 y 2) para los que ya se conoce el resultado (en el presente caso,elgenotipo). Los coeficientes se sustituyen enlastres ecuaciones lineales aleatoriamente y se calcula el resultado. Basandose en ese resultado, se alteran uno o mas coeficientes y los datos introducidos se introducen de nuevo para producir otro resultado. El procedimiento continua hasta que se obtienen coeficientes que optimizan el resultado deseado. Estos coeficientes optimizados se usan despues en las funciones lineales cuando el metodo se aplica a datos de ensayo (cuando el resultado se desconoce todavia).

[0283] Para entrenar el presente modelo, se obtienen los cocientes 1 y 2 para n individuos de control que tienen genotipo AA (por ejemplo, tipo silvestre homocigoto), n individuos de control que tienen genotipo AB (heterocigoto) y n individuos de control que tienen genotipo BB (por ejemplo, mutante homocigoto). Los cocientes pueden obtenerse usando los metodos descritos anteriormente. Los cocientes se introducen como anteriormente y los coeficientes se alteran en un analisis discriminatorio hasta que se obtienen tres funciones lineales que maximizan la discriminacion entre los grupos AA, AB y BB. Estos coeficientes se usan despues en las tres funciones cuando el modelo se usa en muestras de ensayo desconocidas (cuando el genotipo no esta predeterminado).

[0284] Por lo tanto, en un aspecto la invencion proporciona un metodo de obtencion de funciones lineales para su uso en los presentes metodos de genotipado. El metodo comprende tipicamente llevar a cabo las etapas de los metodos de genotipado que se describen, para n individuos de control que tienen genotipo AA (por ejemplo, tipo silvestre homocigoto), n individuos de control que tienen genotipo AB (heterocigoto) y n individuos de control que tienen genotipo BB (por ejemplo, mutante homocigoto) con respecto a una variacion genetica. Los valores de intensidad obtenidos para cada una de las repeticiones de sondas se recopilan como se ha descrito y se aplica un algoritmo.

[0285] Como se describe para los metodos de genotipado, la aplicacion del algoritmo comprende calcular un valor de intensidad promedio para cada sonda y el algoritmo usa tres funciones lineales destinadas a caracterizar cada uno de los tres genotipos posibles, AA, AB y BB para la variacion genetica dada. Los coeficientes se insertan en las funciones de una f orma r epetitiva h asta q ue se obtienen f unciones que m aximizan l a di scriminacion entre l os genotipos en un analisis discriminatorio. Esto proporciona los coeficientes para su uso en las funciones lineales cuando el metodo o algoritmo esta en uso operativo (es decir, para determinar el genotipo de individuos de ensayo).

[0286] El algoritmo o metodo que usa las tres funciones lineales para analizar los datos de intensidad puede ser como se ha descrito anteriormente.

[0287] En algunos casos, el metodo de entrenamiento permite una optimizacion por retroalimentacion. Por lo tanto, a medida que se obtienen valores de intensidad y cocientes para individuos de ensayo y estos se genotipan, los datos de intensidad, por ejemplo, los cocientes, y el genotipo se introducen y se vuelven a calcular los coeficientes para las funciones lineales.

[0288] En un aspecto, la invencion se refiere a unmetodo computacional para entrenamiento.El metodo puede usarse para obtener funciones lineales para su uso en los presentes metodos de genotipado usando los cocientes 1 y 2 obtenidos para cada uno de n individuos que tienen genotipo AA, n individuos que tienen genotipo AB yn individuos que tienen genotipo BB con respecto a una variacion genetica. Los cocientes pueden obtenerse mediante los metodos d escritos anteriormente. E l m etodo co mprende t ipicamente ap licar el a lgoritmo q ue usa l as tres funciones lineales (Funciones 1, 2 y 3) destinadas a caracterizar cada uno de los tres genotipos posibles AA, AB o BB para la variacion genetica de modo que:

la Funcion 1 esla funcion lineal que caracterizaa individuos con el genotipo AA yconsiste en una combinacion lineal de los cocientes 1 y 2;

la Funcion 2 esla funcion lineal que caracteriza a individuos con el genotipo AB yconsiste en una combinacion lineal de los cocientes 1 y 2;

la Funcion 3 es la funcion lineal que caracteriza a individuos con el genotipo BB yconsiste en una combinacion lineal de los cocientes 1 y 2; y

las funciones lineales estan formadas por coeficientes que acompanan a las variables cociente 1 y 2; y obtener funciones lineales que maximicen la discriminacion entre los tres grupos genotipicos AA, AB y BB en un analisis discriminatorio, para obtener los coeficientes que pueden usarse en las funciones lineales cuando el algoritmo se usa en un metodo de ensayo (es decir, esta en uso operativo para determinar el genotipo).

[0289] El algoritmo o metodo que usa las tres funciones lineales para analizar los datos de intensidad puede ser como se ha descrito anteriormente.

[0290] El metodo de entrenamiento computacional puede implicar ademas calcular los cocientes 1 y 2 a partir del valor de intensidad promedio proporcionado para cada una de las sondas y/o cotejar los valores de intensidad de repeticiones de sondas para determinar un valor de intensidad promedio para cada sonda y/o corregir un valor de intensidad bruto para una repeticion de sonda para tener en cuenta la interferencia defondo,obteniendo de este modo valores de intensidad puros para las repeticiones.

[0291] En al gunos casos, el m etodo c omputacional t ambien p ermite u na et apa d e opt imizacion por retroalimentacion como se describe.

[0292] Tipicamente, en el entrenamiento n es >, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En un aspecto, n es > 5. En algunos casos, n puede ser de 10 a 50 o mas, por ejemplo, de 15 a 40 o de 25 a 35, tal como 20 o 30.

[0293] Las sondas y repeticiones de sondas para el metodo de entrenamiento se seleccionan como se describe en la presente memoria. En una realizacion, se usan 4 sondas para cada variacion genetica, con 6, 8 o 10 repeticiones de cada sonda. Una vez seleccionadas, las sondas usadas en el entrenamiento se usan tambien cuando el modelo esta en uso operativo (para determinar un genotipo desconocido). Si las sondas se alteran, tipicamente el modelo debe reentrenarse para optimizar la discriminacion con las nuevas sondas.

[0294] Preferentemente, los coeficientes son tales que la discriminacion entre los tres grupos genotipicos (tanto en uso de entrenamiento como operativo) es sustancialmente del 100%. Si la discriminacion no es del 100%, preferentemente las sondas se redisenan.

[0295] Como ant eriormente, e l m odelo t ambien puede experimentar una o ptimizacion p or r etroalimentacion cuando esta en uso operativo. En ese caso, el modelo se usa primero para determinar el genotipo de un individuo (AA, AB o BB). Los cocientes 1 y 2 para ese individuo se introducen despues en el modelo y los coeficientes en las funciones lineales se alteran segun sea necesario para optimizar la discriminacion entre los tres grupos genotipicos. De este modo, los datos adicionales recopilados a medida que se usa el modelo pueden usarse para optimizar la capacidad de discriminacion de las funciones lineales.

[0296] Existen varios parametros que pueden determinarse y optimizarse para optimizar el rendimiento y la fiabilidad del modelo o metodo analitico.

(i): En un aspecto, los cocientes 1 y 2 determinadas para un individuo se incluyen dentro del intervalo de cocientes 1 y 2 usado para entrenar el modelo (es decir, para optimizar las tres funciones lineales). Si se desea esto puede proporcionar por lo tanto un doble ensayo para el genotipo de un individuo.

(ii): En un aspecto, la intensidad de fluorescencia promedio de 4n repeticiones (donde "n" es el numero de repeticiones para ca da so nda, por ej emplo, 6, 8 o 10 ), por ej emplo, 40 r epeticiones, co n r especto a l a interferencia de fondo es superior a 5.

(iii) En un aspecto, la variacion entre valores de intensidad (brutos o puros) para repeticiones de la misma sonda es de un minimo. Por ejemplo, el coeficiente de variacion entre los valores de intensidad para las repeticiones de una sonda dada es preferentemente inferior a 0,25.

(iv)En un aspecto, el cociente dela sumade los valores de intensidad brutos para todas las repeticiones de sondas en una microplaca respecto a la intensidad de la interferencia defondo es superior a 15 cuando se usa un explorador de fluorescencia.

(v) En un aspecto, el valor de intensidad de senal bruto obtenido paralos controles negativos es � 3 veces superior al valor de intensidad de la interferencia de fondo. Por ejemplo, los controles negativos pueden incluir el "blanco" de DMSO y los oligonucleotidos que no hibridan mencionados anteriormente. La interferencia de fondo es la senal obtenida de las regiones de la matriz en las que no se ha aplicado puntualmente sonda, y pueden determinarse como anteriormente.

[0297] Preferentemente, uno o mas de cualquiera de (i) a (v) es aplicable cuando la intensidad es la intensidad de fluorescencia de un m arcador f luorescente, en par ticular cu ando l a i ntensidad se d etermina por medio de u n explorador fluorescente confocal.

[0298] Asegurar que el m odelo cu mple un o o mas de l os anteriores contribuye a pr oporcionar f iabilidad y reproducibilidad. Uno o mas de cualquiera de (i) a (v) puede ser cierto para el modelo. Preferentemente, el modelo cumple el (i) anterior. En u n e jemplo, (i ), (i i) y (i ii) so n ci ertos. En o tro e jemplo, (i ii), (i v), (v) so n ci ertos. Preferentemente, todos los anteriores son ciertos para el modelo. Esto es aplicable tanto al uso de entrenamiento como operativo.

[0299] Como anteriormente, los cocientes obtenidos experimentalmente conseguidos para una muestra de ensayo pueden co mpararse c on los cocientes obtenidos previamente par a l as (n) m uestras de co ntrol obt enidas de individuos de genotipo conocido, donde n es como anteriormente, habitualmente >5, o >10 o >20. Los cocientes de referencia obtenidos del analisis de las muestras de control permite que se asigneun genotipo a la muestra de ensayo. Por lo tanto, este puede ser un ensayo doble.

[0300] En un caso, el metodo o algoritmo analitico de la invencion comprende una secuencia de las etapas siguientes: usar 4 sondas (2 parejas de sondas) repetidas (6, 8 o 10 repeticiones), calcular la intensidad promedia de cada s onda a par tir de l as i ntensidades co tejadas de l as repeticiones; ca lcular los cocientes 1 y 2 como anteriormente para las 2 parejas de sondas (para detectar las variaciones geneticas A y B); sustituir los cocientes 1 y 2 obtenidos en tres ecuaciones lineales que se han obtenido en un analisis discriminatorio usando los cocientes 1 y 2 calculados para "n" pacientes de control con genotipo AA, "n" pacientes de control con genotipo AB y "n" pacientes de control con genotipo BB (con respecto a la variacion genetica) (en un experimento "n" es 5); y determinar el genotipo de un paciente para la variacion genetica (para cada variacion genetica incluida en la microplaca de ADN) basandose en que funcion lineal tiene el mayor valor absoluto. Los cocientes de ensayo tambien pueden compararse con los cocientes de los "n" pacientes de control para determinar cada genotipo.

[0301] El analisis y la interpretacion anteriores se han descrito con respecto a una variacion genetica. Sin embargo, debe entenderse que la presente microplaca incluye generalmente sondas para la deteccion de multiples variaciones geneticas que pueden analizarse al mismo tiempo. Por lo tanto, los presentes metodos incluyen el analisis de multiples variaciones geneticas, como se describen en la presente memoria, en paralelo

[0302] En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un sistema informatico que comprende un procesador y medios para controlar el procesador para llevar a cabo un metodo computacional de la invencion.

[0303] La i nvencion se r efiere a demas a un programa informatico qu e c omprende un c odigo d e pr ograma informatico que cuando se ejecuta en un ordenador ored de ordenadores provocaque el ordenador o red de ordenadores lleven a cabo un metodo computacional de la invencion. El programa informatico puede almacenarse en un medio legible por ordenador.

[0304] Ademas de l as sondas y m icroplacas descritas en l a p resente m emoria, l os inventores tambien ha n disenado y validado cebadores oligonucleotidicos que son capaces de amplificar, por ejemplo, por medio de PCR multiple, regiones de ADN diana que contienen las variaciones geneticas humanas asociadas con RA de la Tabla 1A. Estos cebadores son utiles en la preparacion de un acido nucleico para su uso en los presentes metodos de genotipado, pronostico y terapeuticos.

[0305] La Tabla3 enumera parejas de cebadores que amplifican regiones de ADN diana que contienen las variaciones geneticas asociadas a R A de la T abla 1A ( SEC I D N °: 361-540) j unto co n l a va riacion g enetica correspondiente.

[0306] Los cebadores oligonucleotidicos enumerados tienen la ventaja de permitir la amplificacion especifica de dichas regiones de ADN diana en un numero muy pequeno de reacciones de PCR. Los cebadores enumerados permiten, en un numero minimo de reacciones de PCR multiple, la amplificacion de todos los fragmentos necesarios para genotipar las variaciones geneticas de la Tabla 1A, y que pueden analizarse en el Artchip.

[0307] En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a cada uno de los cebadores de PCR enumerados en la Tabla 3, y en particular a cada una de las parejas de cebadores de PCR enumeradas y a su uso en la amplificacion por PCR, por ejemplo, en una reaccion de PCR multiple, de una region de ADN diana que contiene la variacion g enetica co rrespondiente. L a invencion proporciona e n un a specto c ualquiera de est os cebadores o parejas de cebadores para su uso en medicina, en particular para su uso en los presentes metodos de genotipado, pronostico o terapeuticos.

[0308] La invencion se refiere ademas a un kit de amplificacion por PCR que comprende al menos una pareja de cebadores de PCR enumerados. El kit puede incluir ademas, por ejemplo, una polimerasa (termoestable), dNTP, un tampon adecuado, cebadores adicionales y/o instrucciones para su uso, por ejemplo, para amplificar una region de ADN diana que contiene la variacion genetica correspondiente. El kit puede usarse para la amplificacion de regiones de ADN diana a partir de muestras de acido nucleico, para su uso en los presentes metodos.

[0309] En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un kit de genotipado o diagnostico (preferentemente in vitro) para genotipar variaciones geneticas asociadas a RA y/o para diagnosticar RA o susceptibilidad a RA. El kit comprende u na mi croplaca o m atriz de A DN d e acuerdo co n l a invencion. E l k it p uede c omprender ademas instrucciones para el uso de la microplaca en un metodo de genotipado de la invencion, por ejemplo, instrucciones para su uso en el presente metodo o algoritmo analitico. Los componentes adicionales de un kit pueden incluir:

-: software informatico, un programa informatico o un sistema informatico de acuerdo con la invencion;

-: uno o mas cebadores de PCR o parejas de cebadores de PCR de acuerdo con la invencion; y/o

-: un kit de amplificacion por PCR de acuerdo con la invencion.

[0310] Las sondas para la microplaca o cebadores de PCR pueden seleccionarse como anteriormente dependiendo de las variaciones geneticas a detectar o del fin diagnostico del kit.

[0311] El kit puede contener uno o mas controles positivos y/o negativos de la reaccion de hibridacion.

[0312] La invencion se refiere ademas al uso del kit en un metodo de genotipado, pronostico o terapeutico de la invencion.

[0313] Como se d escribe e n l a p resente m emoria, l os presentes metodos de gen otipado so n ut iles para diagnosticar RA o susceptibilidad a RA en un sujeto. Los resultados de genotipado obtenidos en los metodos pueden usarse para determinar el pronostico y pueden ser utiles en la determinacion del tratamiento apropiado para la RA (por ejemplo, por prediccion de la respuesta a la terapia).

[0314] La RA presenta varios fenotipos, mas particularmente enterminos de gravedad de laenfermedad. La enfermedad leve se distingue de la enfermedad grave y destructiva, asi como la velocidad y la naturaleza de l a progresion de la enfermedad, y esta heterogeneidad clinica esta correlacionada con una heterogeneidad genetica.

[0315] Las variaciones geneticas particulares asociadas con RA pueden ser predictivas de fenotipos particulares o del desarrollo de fenotipos particulares y, por lo tanto, de la progresion de la enfermedad. En otras palabras, puede ser que haya una asociacion estadisticamente significativa ente, por ejemplo, el alelo mutante B de una variacion genetica dada y la aparicion/desarrollo de un fenotipo particular.

[0316] Puesto que lospresentes metodos de genotipado permiten un genotipado fiable de multiples variaciones geneticas en un entorno clinico, estos pueden usarse para genotipar individuos de fenotipo de RA conocido y,de este modo, identificar variaciones geneticas predictivas de fenotipos de RA particulares.

[0317] En un aspecto, la invencion se refiere por lo tanto a un m etodo de identificacion de variaciones geneticas predictivas de un fenotipo de RA particular, tal comolosfenotipos enumerados anteriormente. Elmetodo implica genotipar una pluralidad de individuos con respecto a una o mas variaciones geneticas asociadas con RA usando un metodo de la invencion. En dicho estudio retrospectivo, se genotipan tipicamente 300-1000 individuos, por ejemplo, pueden genotiparse 400, 500 o 600 individuos. El fenotipo de cada individuo ya se conoce basandose en procedimientos clinicos convencionales.

[0318] Una vez que se obtienen los genotipos, estos datos se comparan con los datos de fenotipo y se identifican asociaciones estadisticamente significativas entre genotipos particulares y fenotipos particulares. Se conocen en la tecnica metodos para determinar la significacion estadistica.

[0319] Las variaciones geneticas identificadas como predictivas de fenotipos/cursos de enfermedad particulares pueden usarse despues para diagnosticar estos fenotipos/cursos de enfermedad en individuos de ensayo, por genotipado de los individuos con respecto a la variacion o variaciones geneticas predictivas. Por lo tanto, es posible determinar el curso probable de progresion de la enfermedad en el individuo. El genotipado puede realizarse por cualquier metodo apropiado, dependiendo del numero de variaciones a ensayar. Por ejemplo, puede usarse un metodo de genotipado de la invencion. Como alternativa, pueden ser apropiados metodos basados en secuencias u otros metodos basados en microplacas.

[0320] Por lo tanto, en un aspecto, la invencion se refiere ademas a un metodo de diagnostico del fenotipo de RA o de prediccion del curso probable de progresion de la enfermedad en un individuo por determinacion del genotipo del individuo con respecto a una o mas variaciones geneticas que se han identificado como predictivas (del fenotipo o curso patologico de RA particular) mediante los metodos descritos en la presente memoria.

[0321] Una vez que se ha realizado la prediccion, entonces sera posible seleccionar la estrategia terapeutica mas adecuada, por ejemplo, determinar la necesidad de intervencion quirurgica.

[0322] Las presentes matrices y metodos proporcionan por lotanto un medio para que los medicos puedan predecir el curso probable de la progresion de la enfermedad en pacientes con RA y contribuir tambien a la seleccion del regimen de tratamiento mas adecuado. Por lo tanto, son herramientas de pronostico utiles. La informacion de genotipo obtenida de acuerdo con la presente invencion puede contribuir a l a toma de decisiones clinicas o al diagnostico en ca sos en l os que l os sintomas (fenotipo pat ologico) se an am biguos. La i nformacion g enetica proporcionada por el Artchip u otros metodos tambien podria contribuir a determinar la verosimilitud del desarrollo de la enfermedad en individuos asintomaticos (por ejemplo, miembros familiares inmediatos de los que padecen RA) permitiendo, por ejemplo, que se proporcionen directrices sobre del estilo de vida y la dieta y que se indique la necesidad de un control continuo de individuos que tengan una constitucion genetica que indique una posible susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad.

[0323] En un aspecto, la invencion se refiere por lo tanto a un metodo de diagnostico de RA o susceptibilidad a RA en un individuo, o determinacion del curso probable de la progresion de la enfermedad en un individuo como anteriormente. Preferentemente, el metodo es in vitro. La invencion se refiere ademas a un metodo de seleccion de un tratamiento, para un individuo que tiene RA, en algunos casos cuando al individuo se le ha diagnosticado o se ha ensayado de acuerdo con los metodos de la invencion. Todavia ademas la invencion se refiere en algunos aspectos a metodos de tratamiento de un individuo que padece RA en los que, despues de seleccionarse el tratamiento, el tratamiento se administra al individuo.

[0324] Los metodos de diagnostico, predictivos y terapeuticos pueden comprender llevar a cabo un metodo de genotipado de la invencion como se describe en la presente memoria. Cualquiera de los metodos puede implicar llevar a cabo un metodo de entrenamiento de la invencion como se describe en la presente memoria para obtener funciones lineales para su uso en la determinacion del genotipo. Los metodos adicionales pueden comprender el uso de una microplaca, sistema informatico, programa informatico, sondas oligonucleotidicas o parejas o conjuntos de sondas, cebadores oligonucleotidicos o parejas de cebadores, kit de amplificacion por PCR o kit de diagnostico de la invencion, como se describen en la presente memoria.

[0325] Aparte de la contribucion al diagnostico y tratamiento de la RA y al desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas para est a enf ermedad, l a pr esente invencion es util par a el ucidar l a f isiopatologia d e l a r eaccion inflamatoria en la RA, que tambien sera de gran interes para el estudio de otras enfermedades, de base autoinmune, y que pertenecen a campos tan diversos tales como la neumologia, la dermatologia, etc.

[0326] En un aspecto, la presente invencion se refiere a una micromatriz adaptada para su uso en los presentes metodos como se describe en la presente memoria.

[0327] La invencion se refiere ademas al uso de una o mas sondas oligonucleotidicas y/o uno o mas cebadores o parejas de cebadores de la invencion en un metodo para pronosticar la RA, tal como un metodo descrito en la presente memoria.

[0328] A co ntinuacion se i lustraran aspectos ad icionales de la invencion co n referencia a l as Figuras y a l a ejemplificacion experimental adjuntas, a modo de ejemplo y no como limitacion. Seran evidentes aspectos y realizaciones adicionales para los expertos en la materia.

EJEMPLOS

[0329] Aunque, en general, las tecnicas mencionadas en la presente memoria son bien conocidas en la materia, puede hacerse referencia en particular a Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual.

Ejemplo 1 - Detección de variaciones genéticas humanas asociadas a RA usando una microplaca de ADN de acuerdo con la invención (Artchip)

1.1 Diseno de la microplaca de ADN para genotipar variaciones geneticas asociadas a RA

[0330] Se diseno y fabrico una microplaca de ADN para detectar variaciones geneticas humanas asociadas con RA que permite una deteccion simultanea, sensible, especifica y reproducible. Dichas variaciones geneticas estan relacionadas con un mayor o menor riesgo de padecer RA, una mejor o peor respuesta al tratamiento y tambien un mejor o peor pronostico de la enfermedad. Se muestran en la Tabla 1A y 1B ejemplosilustrativos de variaciones geneticas humanas asociadas con ant igenos relacionados con la RA que pueden d eterminarse u sando est a microplaca de ADN.

[0331] La microplaca de ADN disenada y fabricada consiste en un soporte (portaobjetos de vidrio), que muestra una pluralidad de sondas en su superficie, que permite la deteccion de variaciones geneticas previamente mencionadas. Estas sondas son capaces de hibridar con las secuencias amplificadas de los genes relacionados con RA. Las secuencias de ADN de cada una de las sondas usadas se enumeran en la Tabla 2 (Figura 2). En general, se i ndica el n ombre d el g en y l a m utacion ( cambio d e nucl eotido, " ins" i nsercion, "del" d elecion o ca mbio de aminoacido). Todas las sondas enumeradas se han validado tecnicamente.

[0332] Las sondas se enumeran a continuacion en conjuntos de sondas, consistiendo cada conjunto en 4 o mas sondas. Las sondas enumeradas corresponden a las SEC ID N°: 1-360, dandose a las sondas consecutivas SEC ID N° co nsecutivos. P or ej emplo, en las sondas enumeradas a co ntinuacion, el conjunto para el anal isis del polimorfismo C1672T corresponde a las SEC ID N°: 1-4, respectivamente, con la primera sonda enumerada SEC ID N°: 1 y la cuarta sonda enumerada en el conjunto, SEC ID N°: 4. De forma similar, por ejemplo, las sondas enumeradas a continuacion en el conjunto para el analisis del polimorfismo G1154A (VEGF) corresponden a las SEC ID N°: 37-40, con la primera sonda enumerada SEC ID N°: 37 y la cuarta sonda enumerada en el conjunto SEC ID N°: 40.

1.2 Produccion de la microplaca de ADN

Impresión y procesamiento de los portaobjetos de vidrio

[0333] Las sondas capaces de detectar las variaciones geneticas previamenteidentificadas se imprimen sobre soportes (portaobjetos de vidrio) recubiertos con aminosilano usando DMSO como disolvente. La impresion se lleva a cabo usando una impresora o aplicador puntual de oligonucleotidos (sondas) al tiempo que controlan la temperatura y la humedad relativa.

[0334] La union de las sondas al soporte (portaobjetos de vidrio) se lleva a cabo por medio de entrecruzamiento con radiacion ultravioleta y calentamiento como se describe en la documentacion proporcionada por el fabricante (por ej emplo, C orning L ifesciences http://www.corning.com). La hum edad r elativa du rante el pr ocedimiento d e deposicion se mantiene entre el 40-50% y la temperatura alrededor de 20°C.

1.3 Validacion de la utilidad clinica de la microplaca de ADN

1.3.1 Preparación de la muestra a hibridar

[0335] El ADN del individuo se extrae de una muestra de sangre mediante un protocolo de filtracion convencional. (Por ejemplo, kits comerciales de Macherey Nagel, Qiagene etc.).

[0336] Las regiones de ADN diana que contienen las variaciones geneticas de interes se amplifican mediante PCR multiple usando parejas apropiadas de cebadores oligonucleotidicos. Puede usarse cualquier pareja de oligonucleotidos adecuada que permita una amplificacion especifica de fragmentos geneticos en los que pueda existir una variacion genetica a detectar. Ventajosamente, se usan aquellas parejas de cebadores oligonucleotidicos que permitan que dichas amplificaciones se realicen en el menor numero posible de reacciones de PCR.

[0337] Los cebadores oligonucleotidicos usados para amplificar por PCR regiones diana que contienen las variaciones geneticas de la Figura 1 se enumeran en la Tabla 3 (Figura 3). Estos cebadores representan un aspecto adicional de la invencion.

[0338] Las reacciones de PCR multiple se llevan a cabo simultaneamente en las mismas condiciones de tiempo y temperatura que permiten la amplificacion especifica de los fragmentos genicos en los que podrian existir las variaciones geneticas a detectar. Una vez que ha terminado la PCR multiple, se usa analisis en gel de agarosa para comprobar que ha tenido lugar la reaccion de amplificacion.

[0339] A continuacion, la muestra a hi bridar (productos de amplificacion) se somete a f ragmentacion con una ADNasaylos productos de fragmentacion resultantes se someten a marcajeindirecto. Una trasnferasa terminal anade un nucleotido, unido covalentemente a un miembro de una pareja de moleculas que se unen especificamente entre si (por ejemplo, biotina que permite la union especifica posterior a estreptavidina) en los extremos de estos fragmentos de ADN pequenos.

[0340] Antes de aplicar la muestra a la microplaca de ADN, la muestra se desnaturaliza por calentamiento a 95°C durante 5 minutos, y despues se anade el "tampon de hibridacion del kit ChipMap" (Ventana Medical System).

1.3.2 Hibridación

[0341] La hi bridacion se l leva a c abo a utomaticamente e n un a est acion de hi bridacion t al co mo la Ventana Discovery (Ventana Medical Systems) que se ha desarrollado especificamente para tal uso. Como alternativa, la hibridacion puede realizarse manualmente.

[0342] La prehibridacion y el bloqueo de los portaobjetos se llevan a cabo con BSA. A continuacion, se aplica la solucion de hibridacion(tampon de hibridacion del kitChipMap, Ventana Medical System) a la superficie de la microplaca de ADN, que se mantiene a 45°C durante 1 hora siguiendo el protocolo de Ventana 9.0 Europe (Ventana Medical System). Por ultimo, los portaobjetos se someten a diferentes soluciones de limpieza (tampones del kit de hibridacion ChipMap, V entana M edical S ystem). U na ve z que h a t erminado el pr ocedimiento d e hi bridacion, comienza la limpieza y el secado final de los portaobjetos.

[0343] Cuando ha tenido lugar la hibridacion, la microplaca de ADN se revela por incubacion con una molecula marcada fluorescentemente que es capaz de unirse especificamente a la molecula incorporada en el producto de amplificacion por transferasa terminal (por ejemplo, en el caso de incorporacion de biotina puede usarse un fluoroforo acoplado a estreptavidina tal como estreptavidina-Cy3) para marcar las posiciones de sondas en las que se ha producido la hibridacion.

1.3.3 Exploración de los portaobjetos

[0344] Los portaobjetos se ponen en un e xplorador confocal fluorescente, por ejemplo Axon 4100�, yla senal emitida por el fluoroforo se explora cuando se estimula por el laser.

1.3.4 Cuantificación de la imagen

[0345] El propio software del explorador permite la cuantificacion de la imagen obtenida a partir de la senal en los puntos en los que ha tenido lugar la hibridacion.

1.3.5 Interpretación de los resultados

[0346] A partir de la senal obtenida con las sondas que detectan las diferentes variaciones geneticas, se establece el genotipo del individuo. En el primer caso, el software del explorador ejecuta una funcion para restar la interferencia de fondo local del valor de intensidad de senal absoluto obtenido para cada sonda. A continuacion, las repeticiones para cada una de las 4 sondas que se usan para caracterizar cada variacion genetica se agrupan. Se calcula el valor de intensidad promedio para cada una de las 4 sondas usando el promedio cotejado a partir de las repeticiones para identificar los valores anormales(atipicos) que pueden excluirse de consideraciones adicionales. Una vez que se conoce el valor de intensidad promedio para cada una de las sondas, entonces se calculan dos cocientes (cociente 1 y cociente 2):

Intensidad promedia para sonda 1 Cociente 1 = -------------------------------------------------------------Intensidad promedia para sonda 1 + Intensidad promedia para sonda 2

Intensidad promedia para sonda 3 Cociente 2 = -------------------------------------------------------------Intensidad promedia para sonda 3 + Intensidad promedia para sonda 4

en los que la sonda 1 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion genetica A (por ejemplo, un alelo normal), la sonda 2 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion genetica B (por ejemplo, un alelo mutante), la sonda 3 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion genetica A (por ejemplo, un alelo normal) yla sonda 4 detecta (es capaz de hibridar especificamente con) la variacion geneticaB(por ejemplo, un alelo mutante).

[0347] Estos cocientes se sustituyen en tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles.

AA Funcion 1 AB Funcion 2 BB Funcion 3

[0348] La funcion que presenta el mayor valor absoluto determina el genotipo del paciente.

[0349] En este caso, las funcioneslineales se obtienen por analisis de 5 sujetos para cada uno de los tres genotipos posibles de la variacion genetica (AA, AB, BB). Con los resultados, se calculan los cocientes 1 y 2 para los 15 sujetos. Estos cocientes son variables de clasificacion para los tres grupos para crear las funciones lineales, con las que s e e valua l a c apacidad di scriminatoria d e l as dos parejas de so ndas disenadas. S i l a ca pacidad discriminatoria no es del 100%, las sondas se redisenan. Nuevos sujetos caracterizados para cada uno de los tres genotipos componen nuevos cocientes 1 y 2 para perfeccionar las funciones lineales y en breve, mejorar la capacidad discriminatoria del algoritmo basado en estas tres funciones.

[0350] Cuando se usa un explorador fluorescente confocal, para obtener resultados fiables es preferible que los cocientes 1 y 2 esten dentro del intervalo de los cocientes usados para construir losgrupos, la intensidad de fluorescencia promedio de las 4n (por ejemplo 40) repeticiones con respecto a la interferencia de fondo sea superior a 5 y el coeficiente de variacion de todas las repeticiones de la microplaca de ADN este por debajo de 0,25.

[0351] De nuevo, cuando se usa un explorador confocal fluorescente en el experimento, para que una hibridacion completa se considere fiable, preferentemente el cociente de la intensidad de fluorescencia de sonda respecto a la interferencia de fondo de todas las sondas de la microplaca de ADN esta por encima de 15. Asimismo, el promedio de todos los cocientes esta preferentemente por encima de 0,6 y el control negativo es preferentemente inferior a o igual a 3 veces la interferencia de fondo.

[0352] Resumiendo, en este caso se presentan 4 sondas (repetidas 10 veces) en el portaobjetos para la deteccion de cada mutacion. Dos de las sondas detectan una variacion genetica (A) y las otras dos la otra variacion genetica (B). La base examinada se localiza en la posicion central de las sondas.

[0353] Un sujeto homocigoto para la variacion genetica A no mostrara la variacion genetica B. Por consiguiente, en la imagen obtenida a partir del soporte de vidrio las sondas que detectan la variacion genetica B mostraran una senal de hibridacion significativamente inferior que la mostrada por la variacion A y viceversa. En este caso, los cocientes 1 y 2 resultaran 1 y a los sujetos se les asignara como homocigotos AA por el analisis de software.

[0354] Por otro lado, un sujeto heterocigoto para la variacion genetica determinada muestra ambas variaciones geneticas. Por lo tanto, las sondas que las detectan muestran una senal de hibridacion equivalente. Los cocientes 1 y 2 resultaran 0,5 y al sujeto se le asignara como heterocigoto AB por el analisis de software.

[0355] Los cebadores oligonucleotidicos usados para amplificar (por medio de PCR multiple) regiones diana que contienen variaciones geneticas asociadas a RA en la Figura 1 se enumeran en la Tabla 3. Dichos cebadores oligonucleotidicos representan un aspecto adicional de la presente invencion.

[0356] Los cebadores oligonucleotidicos usados para amplificaciones por PCR se enumeran en la Tabla 3. Estos corresponden con las SEC ID N°: 361-540, est ando l os cebadores numerados consecutivamente segun se enumeran.

Ejemplo 2 -Establecimiento de modelos para predecir fenotipos de RA

Metodos

Diseno de estudio

[0357] Se inscribieron pacientes con RA que cumplian los criterios del ACR de 1987 de cinco Departamentos de Reumatologia de hospitalesuniversitarios en Espana: Hospital Puerta de Hierro (Madrid), Hospital Virgen de las Nieves (Granada), Hospital Clinic (Barcelona), Hospital La Paz (Madrid) y Hospital Juan Canalejo (A Coruna). Para tener una gestion terapeutica homogenea, los pacientes incluidos en el estudio tenian que haber sido diagnosticados y tratados en un Servicio de Reumatologia despues del 1 de enero de 1990, es decir, las muestras debian tener al menos cinco anos de seguimiento. Los criterios de inclusion completos eran los siguientes: 1) pacientes descritos de acuerdo con los criterios del Colegio Americano de Reumatologia (ACR), 2) aparicion de RA despues de los 18 anos de edad, 3) con erosiones radiologicas, 4) caucasicos, 5) mas de 5 anos de evolucion y 6) diagnosticados despues del 1 de enero de 1990. Se incluyeron en el estudio un total de 375 individuos que se ajustaban a esos criterios.

[0358] Se registraron las variables clinicas yanaliticas basales de cada paciente: edad de aparicion, numero de articulaciones implicadas, anti-peptido ciclico citrulinado, velocidad de sedimentacion eritrocitaria, factor reumatoide, proteina C reactiva, genero, edad y estado de tabaquismo. El estudio cumplia las recomendaciones de la Declaracion de Helsinki (World Medical Association) y la EMEA (European Medicines Agency).

Fenotipos estudiados

[0359] Despues de cinco anos de seguimiento se consideraron los siete resultados siguientes: 1) Agresividad; la prediccion de RA agresiva se analizo estudiando diferentes subfenotipos: 1.1) Pacientes con un cuestionario de evaluacion de la salud (HAQ) superior a 2, en los que indica que la RA esta causando una incapacidad funcional importante. 1.2) Pacientes que muestran multiples erosiones en manos y pies. 1.3) Pacientes que reciben mas de tres tratamientos diferentes. 1.4) Pacientes cuya enfermedad les obligo a dejar sus trabajos. 1.5) Pacientes que recibieron una protesis articular debido a la RA. 2) Respuesta a la terapia; la prediccion de pacientes que muestran intolerancia a metotrexato. 3) Remision; definida como ausencia completa de sintomas articulares sin terapia durante al menos 5 anos. Cada paciente se clasifico como No/Si (0/1) respecto a esos siete fenotipos.

Genotipado y seleccion de polimorfismos de un solo nucleotido (SNP)

[0360] Se obtuvo sangre periferica (2 ml) de cada paciente, se puso en un tubo tratado con EDTA. Se extrajo el ADN plasmatico con el minikit sanguineo de ADN QIAamp (Qiagen) siguiendo las especificaciones del fabricante. El genotipado se llevo a cabo usando la microplaca de ADN ARTchip. Se genotiparon para cada paciente varios SNP que pertenecian a genes que codifican proteinas implicadas en la inmunidad innata y adaptativa y en el metabolismo del hueso y d el ca rtilago. L a se leccion d e S NP est aba basa da e n l os datos previos publicados, las terapias farmacologicas emergentes y la propia experiencia en investigacion de los inventores.

[0361] La seleccion de SNP en esos genes estaba basada en una frecuencia alelica minoritaria de 0,1. Solo se tuvieron en cuenta "TagSNP" (R2 � 0,8) ya que estos proporcionaban mas potencia estadistica por reduccion de los grados de libertad (df) de los ensayos.

TAG Directo SEC ID N°: 554 GCTAGATGAAGAGCAAGCGC TAG Inverso SEC ID N°: 555 TACAACCGACAGATGTATGT

[0362] De todos los SNP genotipados, solo se incluyo una fraccion en el analisis de regresion logistica por etapas para limitar el indice de falsos positivos global. En primer lugar, se realizaron pruebas de chi cuadrado (X2) para ensayar la conformidad con las expectativas de Hardy-Weinberg (HWE) de los polimorfismos geneticos bajo analisis. Solo se incluyeron en este estudio los SNP que concordaban con la ley de HWE en ambos grupos separados bajo analisis. Los SNP con desviaciones extremadamente elevadas de las predicciones de HWE (valores p inferiores a 0,01) se excluyeron del analisis ya que las desviaciones podian indicar problemas tales como errores de genotipado. Ademas, se llevaron a cabo ensayos de asociacion de un solo locus entre la frecuencia alelica de SNP (asociaciones alelicas) y el fenotipo del paciente usando la prueba de X2 de contingencia convencional, y se determinaron los valores p, incluyendo la correccion de Bonferroni para ensayos multiples. La posibilidad de que las desviaciones de las HWE en l a p oblacion global ( ambos fenotipos bajo analisis j untos) pu diera se r importante p ara ca usar la enfermedad tambien se investigo por combinacion del efecto de la asociacion alelica y las HWE totales. El producto del valor p de HWE y el valor p de la asociacion alelica se uso para clasificar los SNP por orden de importancia. Aquellos con los menores valores p se incluyeron en el analisis de regresion. Todos los analisis geneticos se llevaron a cabo usando el software HelixTree® (Golden Helix, Inc., Bozeman, MT, Estados Unidos).

Modelado estadistico

[0363] El analisis estadistico se llevo a cabo entre los grupos de pacientes (No-0/Si-1) para intentar la discriminacion entre ambos grupos para cada uno de los siete fenotipos diferentes estudiados. Se evaluaron siete modelos diferentes: un modelo para distinguir entre HAQ�2 y HAQ>2 (modelo 1); un modelo para distinguir pacientes con o sin multiples erosiones en manos y pies (modelo 2); un modelo para distinguir pacientes que recibieronun numero igual a o superiora o inferiora tres tratamientosdiferentes (modelo 3); un modelo para distinguir pacientes cuya enfermedad les obligo a dejar sus trabajos (Si o No) (modelo 4); un modelo para distinguir pacientes que recibieron una protesis articular debido a RA (Si o No) (modelo 5); un modelo para distinguir pacientes que mostraban intolerancia a metotrexato (Si o No) (modelo 6) y un modelo para distinguir pacientes que consiguieron una remision (Si o No) (modelo 7).

[0364] Los analisis estadisticos se realizaron usando el Paquete Estadistico para las Ciencias Sociales (SPSS Inc. Headquarters, Chicago, IL, Estados Unidos) version 11.0. Se analizaron multiples asociaciones de genotipo-fenotipo por medio de regresion logistica multivariable (LR directa) con fenotipos patologicos determinados clinicamente como variables dependientes y los loci individuales y datos clinicos y analiticos como variables independientes. La calidad de ajuste de los modelos se evaluo usando estadistica de Hosmer-Lemeshowy su precision se evaluo calculando el area bajo la curva (AUC) de la curva de caracteristicas operativas del receptor (ROC) con intervalos de confianza del 95%. La variabilidad explicada de los modelos basandose en los SNP se evaluo por medio del R2 Nagelkerke. Para medir el impacto de los SNP y las variables incluidas en los modelos de los fenotipos analizados, se calculo la sensibilidad, la especifidad y el cociente de verosimilitud positiva (LR+ = sensibilidad/(1-especifidad)) por medio de curvas de ROC.

Resultados

[0365] Para diferenciar entre HAQ>2 (modelo 1) se introdujeron 3 predictores (2 SNP + 1 variable clinica) en el modelo de LR directa. Para el modelo 2 (multiples erosiones) se introdujeron 4 predictoresSNP + 2 variables clinicas en el modelo. Para el modelo 3 (3 o mas tratamientos) se introdujeron 3 predictores SNP + 4 variables clinicas en el modelo. Para el modelo 4 (dejar el trabajo) se introdujeron solamente 3 predictores SNP en el modelo. Para el modelo 5 (protesis articular) se introdujeron 4 predictores SNP + 2 variables clinicas en el modelo. Para el modelo 6 (intolerancia a metotrexato) se introdujo 1 predictor SNP + 1 variable clinica en el modelo. Por ultimo, para el modelo 7 (conseguir un estado de remision) se introdujeron 2 predictores SNP + 1 variable clinica en el modelo. Las variables de SNP y variables clinicas incluidas en cada modelo se enumeran en la Tabla 11A (Figura 11A).

[0366] La informacion respecto a las variables (clinicas y SNP) restantes en cada funcion se muestra en las Tablas 4 a 10. Se construyeron funciones de probabilidad de regresion usando el Paquete Estadistico para las Ciencias Sociales (SPSS I nc. H eadquarters, C hicago, I L, E stados Unidos) ve rsion 14.0. S PSSv14. B es el co eficiente asociado a cada genotipo en la funcion de probabilidad. ET es el error en el calculo de B. Wald es la prueba estadistica. GL son los grados de libertad. Sig. P valor de B para la prueba de Wald. Exp (B) es el riesgo relativo.

[0367] La contribucion de los factores geneticos y clinicos a los fenotipos de RA estudiados puede demostrarse adicionalmente mediante la proporcion sustancial de varianza (R2 Nagelkerke) explicada por las funciones (26,0% para el modelo 1; 43,6% para el modelo 2; 20,1% para el modelo 3; 18,3% para el modelo 4; 15,3% para el modelo 5; 18,3% para el modelo 6 y 26% para el modelo 7). Se obtuvieron las funciones de probabilidad y curvas de ROC para cada fenotipo analizado. Se proporcionan las curvas de ROC, la sensibilidad, la especifidad y los cocientes de verosimilitud positiva (LR+) de todos los modelos en las Figuras 4 a 10.

[0368] Nagelkerke R2 es una forma de medir la proporcion de variantes explicadas por la funcion. El area bajo la curva de ROC (AUC de ROC) es una medida de rendimiento de ensayo o precision diagnostica. El cociente de verosimilitud positiva (LR+) se calcula como sensibilidad/1-especifidad.

Discusion

[0369] Los cocientes de verosimilitud son una forma util y practica de expresar la potencia de ensayos de diagnostico. Cuatro de los siete modelos descritos en esta patente presentan un valor de LR relativamente elevado, poniendo por tanto de manifiesto la capacidad de las combinaciones de SNP estudiadas para predecir ese fenotipo particular. Las altas AUC de ROC obtenidaspara estos modelos proporcionan pruebasadicionales de la elevada potencia discriminatoria de las combinaciones de SNP usadas. La utilidad de la magnitud del AUC de ROC como herramienta para evaluar la fuerza de la relacion entre genotipos y enfermedad se ha descrito anteriormente. El uso de estos SNP para obtener un perfil genetico del paciente proporciona una herramienta extra para el medico para diferenciar entre pacientes con diferente curso de laenfermedad, posibilidad de remision, presencia de erosiones principales en los rayos X y numero de tratamientos necesarios. Para los modelos restantes se obtuvo un menor LR probablemente debi do al h echo de q ue e l fenotipo est udiado tambien depende de factores ambientales no calculados en las funciones de los presentes inventores. Sin embargo, con estos modelos basados principalmente en factores geneticos, los medicos pueden considerar de forma razonable la posibilidad de una intervencion quirurgica, de que un paciente pudiera dejar su trabajoy la posibilidad de una terapia diferente. Los sintomas clinicos junto con ensayos bioquimicos de rutina forman parte del diagnostico de la RA y son necesarios para una orientacion terapeutica y de pronostico correctas. Los modelos descritos en la presente memoria basandose tanto en la ge netica co mo en datos bioquimicos de l aboratorio son ad ecuados para su us o dur ante el se guimiento de pacientes conRA, y permiten la identificacion de subtipos de pacientes bien definidos, proporcionando indicios importantes sobre su futuro tratamiento.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un metodo de pronostico de un fenotipo de remision de la artritis reumatoide (RA) en un sujeto que tiene RA, comprendiendo dicho metodo determinar (i) el genotipo de un individuo al menos en la posicion de polimorfismo de un solo nucleotido en rs2476601; y (ii) una representacion binaria del nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC BI) en el suero del sujeto.
2.

Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el metodo comprende:

(I)

obtener resultados:

(i)

de la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en el alelo nulo del gen de la Glutation S-transferasa M1 (GSTM1) y en rs2476601; y

(ii)

de una representacion binaria del nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC BI) en el suero del sujeto; y

(II)

usar los resultados obtenidos en (I) para pronosticar el fenotipo de remision de RA.
3.

Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende ademas pronosticar un fenotipo de artritis reumatoide (RA) agresivo en el sujeto, comprendiendo dicho fenotipo de RA agresivo uno o mas de: una puntuacion de cuestionario de evaluacion de la salud (HAQ) de >2 (HAQ>2); la presencia de multiples erosiones en las manos yen los pies (RX2); recibir 3 o mas tratamientos diferentes (TTO 30M); verse forzado a dejar el em pleo de bido a l a R A ( dejar el t rabajo); y r ecibir un a pr otesis articular ( intervencion qui rurgica), comprendiendo dicho metodo:

(I)

obtener resultados de acuerdo con el modelo 1, modelo 2, modelo 3, modelo 4 y/o modelo 5 para el sujeto; y

(II)

usar los resultados obtenidos en (I) para pronosticar el fenotipo de RA agresivo,

en el que:

(a)

cuando el fenotipo de RA agresivo comprende una puntuacion de cuestionario de evaluacion de la salud (HAQ) de >2 (HAQ>2), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 1, comprendiendo dichos resultados:

(i)

la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs1800790 y rs2070874;

(ii)

el nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC) en el suero del sujeto; y

(iii) la velocidad de sedimentacion eritrocitaria (VSG) en la sangre del sujeto,

(b)

cuando el fenotipo de RA agresivo comprende la presencia de multiples erosiones en las manos y en los pies (RX2), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 2, comprendiendo dichos resultados:

(i)

la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs1544410, rs2071592, rs187238 y rs1801275;

(ii)

una representacion binaria del nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC BI) enel suero del sujeto; y

(iii) el numero de articulaciones dolorosas (NoARTDOL) mencionadas por el sujeto,

(c)

cuando el fenotipo de RA agresivo comprende recibir 3 o mas tratamientos diferentes (TTO 30M), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 3, comprendiendo dichos resultados:

(i)

la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs7531668, rs419598 y rs1024611;

(ii)

el nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC) en el suero del sujeto;

(iii) el nivel de anticuerpo Factor Reumatoide (RF) en el suero del sujeto;

(iv)

el nivel de proteina C reactiva (PCR) en la sangre del sujeto; y

(v)

la edad en anos a la que se le diagnostico al sujeto la RA,

(d)

cuando el fenotipo de RA agresivo comprende verse forzado a dejar el empleo debido a la RA (dejar el trabajo), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 4, comprendiendo dichos resultados:

(i) la identidad del nucleotido en el ADNgenomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs1042522, el alelo nulo del gen de la Glutation S-transferasa T1 (GSTT1) y rs1801133,

(e) cuando el fenotipo de RA agresivo comprende recibir una protesis articular (intervencion quirurgica), dicha etapa (I) comprende obtener los resultados de acuerdo con dicho modelo 5, comprendiendo dichos resultados:

(i)

la identidad del nucleotido en el ADN genomico del sujeto en la posicion del polimorfismo de un solo nucleotido en cada uno de rs2268277, rs1042522, rs10735810 y rs3025039;

(ii)

una representacion binaria del nivel de anticuerpo anti-peptido ciclico citrulinado (ANTI-PCC BI) enel suero del sujeto; y

(iii) la velocidad de sedimentacion eritrocitaria (VSG) en la sangre del sujeto.
4. El metodode acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el metodo comprende ademas pronosticar el fenotipo de RA de intolerancia a metotrexato, en el que:

dicha etapa (I) comprende ademas obtener resultados de acuerdo con el modelo 6, comprendiendo dichos resultados:

(i)

l a i dentidad del n ucleotido en e l A DN genomico del sujeto en l a p osicion d el p olimorfismo de un so lo nucleotido en rs1801133; y

(ii)

la edad en anos a la que se le diagnostico al sujeto la RA.
5.

El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que en la etapa (II), solo se usan los resultados obtenidos en la etapa (I) para pronosticar el fenotipo de RA.
6.

El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la obtencion de resultados para variables de SNP comprende la secuenciacion o analisis de micromatrices.
7.

El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la obtencion de resultados para variables de SNP comprende el uso de una o mas parejas de sondas oligonucleotidicas indicadas en la Figura 2.
8.

El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la obtencion de resultados para variables de SNP comprende la amplificacion de acido nucleico obtenido del sujeto, y el metodo comprende el uso de una o mas parejas de cebadores oligonucleotidicos indicadas en la Figura 3.
9.

El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (II) comprende:

(i)

introducir los resultados determinados en la etapa (I) en una funcion de probabilidad, calculando de este modo un valor de funcion de probabilidad; y

(ii)

comparar el valor de la funcion de probabilidad con los valores de la funcion de probabilidad calculados para individuos de fenotipo conocido.
10.

El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende el uso de una funcion de probabilidad derivada de los datos de cualquiera de las Tablas 4 a 10.
11.

Un metodo de seleccion de un tratamiento adecuado para tratar la RA en un sujeto, comprendiendo el metodo:

(a)

pr onosticar un f enotipo de R A en el su jeto m ediante un m etodo de acu erdo co n cu alquiera de l as reivindicaciones anteriores; y

(b)

seleccionar un tratamiento que sea adecuado para el fenotipo de RA determinado.

Figura 1: Tabla 1A: Variaciones genéticas asociadas con RA

El polimorfismo C1672T de la familia de transportadores de soluto 22 A4 (SLC22A4). El polimorfismo C24658G del factor de transcripcion relacionado con Runt 1 (RUNX1). El polimorfismo G117A de la peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4). El polimorfismo G55S de la peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4). El polimorfismo V82A de la peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4). El polimorfismo G112A de la peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4). El polimorfismo Hla25 del gen relacionado con la cadena A del complejo mayor de histocompatibilidad clase I

(MICA).

El polimorfismo Hla28 del gen relacionado con la cadena A del complejo mayor de histocompatibilidad clase I

(MICA).

El polimorfismo Hla58 T/G de NOTCH4.

El polimorfismo G1154A del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

El polimorfismo C634G del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

El polimorfismo C936T del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

El polimorfismo A607C de interleucina 18 (IL18).

El polimorfismo G-137C de interleucina 18 (IL18).

El polimorfismo Q551R del receptor de interleucina 4 (IL-4R).

El polimorfismo T2018C del alelo 2 del antagonista del receptor de IL-1 (IL1RN�2).

El polimorfismo C2073T del alelo 2 del antagonista del receptor de IL-1 (IL1RN�2).

El polimorfismo C872T de muerte programada 1 (PD-1, PDCD1).

El polimorfismo Asp299Gly del receptor tipo peaje 4 (TLR4).

El polimorfismo Apos.VS7+283(b>B) del receptor de vitamina D (1,25- dihidroxivitamina D3)

El polimorfismo C-547T del dominio de inmunoglobulina de celula T y dominio de mucina 3 (TIM3).

El polimorfismo T4259G del dominio de inmunoglobulina de celula T y dominio de mucina 3 (TIM3).

El polimorfismo UTR 3� de uroquinasa (-A2849G).

El antigeno de linfocito T citotoxico 4 (CTLA4A/G) en el exon 1.

El polimorfismo Ala566Thr del transportador asociado con el procesamiento de antigenos 2 (TAP2).

El polimorfismo I kappa BL A-62T. Polimorfismo C1362T de poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1).

El polimorfismo T1858C de proteina tirosina fosfatasa.

El polimorfismo Fok I del receptor de vitamina D.

El polimorfismo G38A de uteroglobina (UG).

El polimorfismo 6A/6A de metaloproteinasa de la matriz 3 (MMP3).

Los genotipos Arg/Arg y Pro/Pro de proteina tumoral p53 en el codon 72. El polimorfismo (-A2849G) de interleucina 10 (IL-10). Los polimorfismos -308, +488, -857 y -238 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa). El polimorfismo T587G del receptor del factor de necrosis tumoral 2 (TNFR2). El polimorfismo +36 A/A del receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1). El polimorfismo G-455A del polipeptido beta de fibrinogeno B (FGB). El polimorfismo de genotipo nulo de la variante 1 del transcrito de glutation S-transferasa M1 GSTM1. El polimorfismo de genotipo GSTT1-0 de la glutation S-transferasa T1 (GSTT1). El polimorfismo (-C3435T) de la proteina de multi-resistencia a farmacos (MDR-1). El polimorfismo R241G de la molecula de adhesion 1 (ICAM1). El polimorfismo C3954T de interleucina 1 beta (IL-1B). El polimorfismo Val58lle de condromodulina II (Chm II). El polimorfismo -622 del gen de interleucina 6 (IL-6). El 347 GG de 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleotido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC).

Polimorfismo G80A del miembro 4 de la familia de transportadores de solutos 22 (SLC22A4). El polimorfismo C677T y A1298C de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). El polimorfismo 249, 365 y 720 del gen de linfotoxina alfa (LTA). El alelo -1087 G/G de interleucina 10 (IL-10) y el alelo de factor de necrosis tumoral-alfa (TNF)-308 TNF1/TNF1

(Estas variaciones se asocian con RA en combinacion, pero no en solitario). El factor de crecimiento transformante beta TGFbeta1 (alelo C poco frecuente en el codon 25) y el antagonista del

receptor de IL1 (alelo A2 en el intron 2) (Estas variaciones se asocian con RA en combinacion, pero no en solitario). Polimorfismo T869C de codon 10. El polimorfismo -1087 AA del gen de interleucina 10 (IL-10). El po limorfismo 28 2C>T, 590G >A, 341T >C, 481C >T, 803A>G, 85 7G>A y 19 1G>A de N -acetiltransferasa 2

(arilamina N-acetiltransferasa). Los polimorfismos G460A y A719G de tiopurina metiltransferasa (TPMT). El polimorfismo -C196T de proteina de tipo receptor de Fc 3 (FCRL3). El polimorfismo Arg260Thr del gen de tapasina (TPSN) El haplotipo A de poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) (410T-�A�(10)-�CA�(10-12)-1362C, que incluye alelos CA

de PARP-1 cortos) y haplotipo B (410C-�A�(11 )-�CA�(13-20)-1362T. Los polimorfismos Hla 76 y Hla 78 del antigeno de histocompatibilidad. El polimorfismo del receptor de melatonina 1B (MTNR1B). El polimorfismo (-168A-G) del transactivador del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC2TA). El polimorfismo del receptor BETA-2-adrenergico. El polimorfismo A1298C de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). El polimorfismo (-2518)G>A de la proteina quimiotactica de monocitos 1 (MCP1).

El polimorfismo menos 843C/T del gen del LIGANDO FAS. El polimorfismo IBD5 locuslGR2060a 1 del gen de la enfermedad inflamatoria del intestino. El polimorfismo V158F (G/T) del gen cd16a. El polimorfismo menos 511a/c de interleucina 1 beta (IL1b). El polimorfismo 34c/t de interleucina 4 (IL4). El polimorfismo C93T de caspasa 9. El polimorfismo K469E de la molecula de adhesion intracelular 1 (ICAM1). El polimorfismo Gly54Asp del gen de union a lectina, manosa (MBL). El polimorfismo -590 del gen de interleucina 4 (IL4). El polimorfismo T145C (Leu49Ser) del gen de TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 5 (TPMT5). El polimorfismo A539T del gen de TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 6 (TPMT6). El polimorfismo T681G (His227Gln) del gen de TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 7 (TPMT7). El polimorfismo G644A (Arg215His) del gen de TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 8 (TPMT8). El polimorfismo HLA b27 del antigeno de histocompatibilidad. El G80A de la familia de transportadores de solutos 19 (folato reductasa) SLC19A1

Figura 2: Tabla 2

1.-Polimorfismo C1672T de la familia de transportadores de soluto 22 A4 (SLC22A4) (sondas para detectar el polimorfismo C1672T del gen de la familia de transportadores de soluto 22 A4).
2.-Polimorfismo C24658G del factor de transcripción relacionado con Runt 1 (RUNX1)
3.-Polimorfismo G117A de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4)
4.-Polimorfismo G55S de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4)
5.-Polimorfismo V82A de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4) 6.-Polimorfismo G112A de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4)
7.-Polimorfismo Hla25 del gen relacionado con cadena A del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MICA)
8.-Polimorfismo Hla28 del gen relacionado con cadena A del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MICA)
9.-Polimorfismo Hla58 T/G de NOTCH4
10.-Polimorfismo G1154A del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
11.-Polimorfismo C634G del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). 12.-Polimorfismo C936T del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
13.-Polimorfismo A607C de interleucina 18 (IL18) .
14.-Polimorfismo G-137C de interleucina 18 (IL18) .
15.-Polimorfismo Q551R del receptor de interleucina 4 (IL-4R).
16.-Polimorfismo T2018C del alelo 2 del antagonista del receptor de IL-1 (IL1RN*2). 17.-Polimorfismo C2073T del alelo 2 del antagonista del receptor de IL-1 (IL1RN*2)
18.-Polimorfismo C872T de muerte programada 1 (PD-1, PDCD1).
19.-Polimorfismo Asp299Gly del receptor de tipo peaje 4 (TLR4).
20. Polimorfismo Apos. VS7+283 (b>B) del receptor de vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3).
21.-Polimorfismo C-547T del dominio de inmunoglobulina de célula T y dominio de mucina 3 (TIM3). 22.-Polimorfismo T4259G del dominio de inmunoglobulina de célula T y dominio de mucina 3 (TIM3)
23.-Polimorfismo (-A2849G) de UTR 3' de uroquinasa
24.-Antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4A/G) en exón 1.
25.-Polimorfismo Ala565Thr del transportador asociado con procesamiento de antígenos 2 (TAP2)
26.-Polimorfismo I kappa BL A-62T

27-Polimorfismo C1362T de poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1). Poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) haplotipo A (410T-[A](10)-[CA](10-12)-1362C, que incluye alelos CA de PARP-1 cortos) y haplotipo B (410C[A](11)-[CA](13-20)-1362T.
28. Polimorfismo T1858C de proteína tirosina fosfatasa.
29.-Polimorfismo Fok I de receptor de vitamina D.
30.-Polimorfismo G38A de uteroglobina (UG).
31. Polimorfismo 6A/6A de metaloproteinasa de la matriz 3 (MMP3).
32.-Genotipos Arg/Arg y Pro/Pro en el codón 72 de la proteína tumoral p53 33.-Polimorfismo (-A2849G) de interleucina 10 (IL-10).
34.- El -308 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa).
35.-El +488 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa).
37. El -238 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa). 38. Polimorfismo T587G del receptor del factor de necrosis tumoral 2 (TNFR2).
39.

Polimorfismo +36 A/A del receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1).
40.

Polimorfismo G-455A del polipéptido beta de fibrinógeno B (FGB).
41.

Polimorfismo de genotipo nulo GSTM1 de la variante 1 del transcrito de glutatión S-transferasa M1.
42.

Polimorfismo del genotipo GSTT1-0 de glutatión S-transferasa T1 ( GSTT1)
43. Polimorfismo (-C3435T) de proteína de multi-resistencia a fármacos (MDR-1).
44.

Polimorfismo R241G de molécula de adhesión 1 (ICAM1).
45.

Polimorfismo C3954T de interleucina 1 beta (IL-1B).
46.

Polimorfismo Val58Ile de condromodulina II (Chm II).
47.

Polimorfismo -622 del gen de interleucina 6 (IL-6).
48.

347 GG de 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC).
49. Polimorfismo G80A del miembro 4 de la familia de transportadores de soluto 22 (SLC22A4).
50.

Polimorfismo C677T de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR).
51.

Polimorfismo 249 del gen de linfotoxina alfa (LTA).
52.

Polimorfismo 365 del gen de linfotoxina alfa (LTA)
53.

Polimorfismo 720 del gen de linfotoxina alfa (LTA).
54. Polimorfismo -1087 G/G de interleucina 10 (IL-10)
55.

Polimorfismo -308 TNF1/TNF1 del factor de necrosis tumoral alfa (TNF).
56.

Polimorfismo de factor de crecimiento transformante TGFbeta1.
57.

Polimorfismo -1087 AA del gen de interleucina 10 (IL-10).
58.

Polimorfismo G460A de tiopurina metiltransferasa (TPMT).
59.

Polimorfismo A719G de tiopurina metiltransferasa (TPMT).
60. Polimorfismo -C196T de proteína de tipo receptor de Fc 3 (FCRL3)
61.

Polimorfismo Arg260Thr del gen de tapasina (TPSN).
62.

Polimorfismo 341T>C de N-acetiltransferasa 2 (NAT2).
63.

Polimorfismo 481C>T de N-acetiltransferasa 2 (NAT2).
64.

Polimorfismo 803A>G de N-acetiltransferasa 2 (NAT2).
65. Polimorfismo 857G> de N-acetiltransferasa 2 (NAT2).
66. Polimorfismo 191G>A de N-acetiltransferasa 2 (NAT2).

67 Polimorfismo Hla 78 del antígeno de histocompatibilidad.
68. Polimorfismo Hla 76 del antígeno de histocompatibilidad.

69 Polimorfismo de receptor de melatonina 1B (MTNR1B). 70. Polimorfismo de transactivador del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC2TA).
71.

Polimorfismo de receptor BETA-2-adrenérgico.
72.

Polimorfismo A1298C de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR).
73.

Proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP1).
74.

Polimorfismo menos 843C/T de LIGANDO FAS.
75.

Polimorfismo locusIGR2060a_1 de IBD5.
76. Polimorfismo V158F (G/T) de cd16a.
77.

Polimorfismo menos 511a/c de interleucina 1 beta.
78.

Polimorfismo 34c/t de interleucina 4 (IL4)
79.

Polimorfismo C93T de caspasa 9.
80.

Polimorfismo K469E de ICAM1.
81. Polimorfismo Gly54Asp de UNIÓN A LECTINA, MANOSA (MBL).
82.

Polimorfismo -590 de interleucina 4.
83.

Polimorfismo T145C (Leu49Ser) de tiopurina S-metiltransferasa 5 TPMT5.
84.

Polimorfismo A539T de tiopurina S-metiltransferasa 6 TPMT6.
85.

Polimorfismo T681G (His227Gln) de tiopurina S-metiltransferasa 7 TPMT7.
86. Polimorfismo G644A (Arg215His) de tiopurina S-metiltransferasa 8 TPMT 8.
87.

Polimorfismo HLA b27 del antígeno de histocompatibilidad.
88.

G80A de familia de transportadores de soluto 19 (folato reductasa) SLC19A1.
89.

Polimorfismo 282 de N-acetiltransferasa 2 (NAT2).
90.

Polimorfismo 590 de N-acetiltransferasa 2 (NAT2).

Figura 3: Tabla 3

Polimorfismo C1672T de la familia de transportadores de soluto 22 A4 (SLC22A4) (sondas para detectar el polimorfismo C1672T del gen de la familia de transportadores de soluto 22 A4)

Polimorfismo C24658G del factor de transcripción relacionado con Runt 1 (RUNX1)

Polimorfismo G117A de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4)

Polimorfismo G55S de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4)

Polimorfismo V82A de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4)

Polimorfismo G112A de peptidilarginina desiminasa tipo IV (PADI 4)

Polimorfismo Hla25 del gen relacionado con cadena A del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MICA)

Polimorfismo Hla28 del gen relacionado con cadena A del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MICA)

Polimorfismo Hla58 T/G de NOTCH4

Polimorfismo G1154A del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)

Polimorfismo C634G del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Polimorfismo C936T del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGA).

Polimorfismo A607C de interleucina 18 (IL18) .

Polimorfismo G-137C de interleucina 18 (IL18) .

Polimorfismo T2018C del alelo 2 del antagonista del receptor de IL-1 (IL1RN*2).

Polimorfismo C872T de muerte programada 1 (PD-1, PDCD1) Polimorfismo C2073T del alelo 2 del antagonista del receptor de IL-1 (IL1RN*2)

Polimorfismo Apos. VS7+283 (b>B) del receptor de vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3).

Polimorfismo C-547T del dominio de inmunoglobulina de célula T y dominio de mucina 3 (TIM3).

Polimorfismo T4259G del dominio de inmunoglobulina de célula T y dominio de mucina 3 (TIM3)

Polimorfismo (-A2849G) de UTR 3' de uroquinasa

Antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4A/G) en exón 1.

Polimorfismo Ala565Thr del transportador asociado con procesamiento de antígenos 2 (TAP2)

Polimorfismo I kappa BL A-62T

Polimorfismo C1362T de poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1). Poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) haplotipo A (410T-[A](10)-[CA](10-12)-1362C, que incluye alelos CA de PARP-1 cortos) y haplotipo B (410C[A](11)-[CA](13-20)-1362T.

Polimorfismo T1858C de proteína tirosina fosfatasa.

Polimorfismo Fok I de receptor de vitamina D

Polimorfismo G38A de uteroglobina (UG).

Polimorfismo 6A/6A de metaloproteinasa de la matriz 3 (MMP3).

Genotipos Arg/Arg y Pro/Pro en el codón 72 de la proteína tumoral p53

Polimorfismo (-A2849G) de interleucina 10 (IL-10).

Polimorfismo -308 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa)

Polimorfismo -238 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa) Polimorfismo +488 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa)

Polimorfismo -857 del promotor del gen del factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa)

Polimorfismo T587G del receptor del factor de necrosis tumoral 2 (TNFR2)

Polimorfismo +36 A/A del receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1)

Polimorfismo G-455A del polipéptido beta de fibrinógeno B (FGB).

Polimorfismo de genotipo nulo GSTM1 de la variante 1 del transcrito de glutatión S-transferasa M1

Polimorfismo del genotipo GSTT1-0 de glutatión S-transferasa T1 ( GSTT1)

Polimorfismo (-C3435T) de proteína de multi-resistencia a fármacos (MDR-1). Polimorfismo R241G de molécula de adhesión 1 (ICAM1).

Polimorfismo C3954T de interleucina 1 beta (IL-1B).

Polimorfismo Val58Ile de condromodulina II (Chm II).

Polimorfismo -622 del gen de interleucina 6 (IL-6).

347 GG de 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleótido formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa (ATIC).

Polimorfismo G80A del miembro 4 de la familia de transportadores de soluto 22 (SLC22A4).

Polimorfismo C677T de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR).

Polimorfismo A1298C de metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR).

Polimorfismo 249 del gen de linfotoxina alfa (LTA). Polimorfismo -1087 G/G de interleucina 10 (IL-10)

Polimorfismo -308 TNF1/TNF1 del factor de necrosis tumoral alfa (TNF).

Factor de crecimiento transformante beta TGF beta1 (alelo C poco frecuente en el codón 25).

Polimorfismo -1087 AA del gen de interleucina 10 (IL-10).

Polimorfismo 282C>T de N-acetiltransferasa 2 (arilamina N-acetiltransferasa) NAT2

Polimorfismo 590G>A de N-acetiltransferasa 2 (arilamina N-acetiltransferasa) NAT2

Polimorfismo G460A de tiopurina metiltransferasa (TPMT). Polimorfismo A719G de tiopurina metiltransferasa (TPMT).

Polimorfismo -C196T de proteína de tipo receptor de Fc 3 (FCRL3)

Polimorfismo Arg260Thr del gen de tapasina (TPSN).

Polimorfismo Asp299Gly de receptor de tipo peaje 4 (TLR4)

G80A de la familia de transportadores de soluto 19 (folato reductasa) SLC19A1

Polimorfismo Hla 76 del antígeno de histocompatibilidad

Polimorfismos Hla 78 del antígeno de histocompatibilidad

Polimorfismo de receptor de melatonina 1B (MTNR1B). Polimorfismo de transactivador del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC2TA).

Polimorfismo de receptor BETA-2-adrenérgico.

Polimorfismo (-2518) G>A de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP1).

Polimorfismo menos 843C/T del gen de LIGANDO FAS.

El polimorfismo IBD5 locusIGR2060a_1 del gen de la enfermedad inflamatoria del intestino.

El polimorfismo V158F (G/T) del gen cd16a

El polimorfismo menos 511a/c de interleucina 1 beta (IL1b)

El polimorfismo 34c/t de interleucina 4 (IL4)

El polimorfismo C93T de la caspasa 9 El polimorfismo R241G de la molécula de adhesión 1 (ICAM1)

El polimorfismo -590 del gen de interleucina 4 (IL4)

El polimorfismo T145C (Leu49Ser) del gen de la TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 5 (TPMT5)

El polimorfismo A539T del gen de la TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 6 (TPMT6)

El polimorfismo T681G (His227Gln) del gen de la TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 7 (TPMT7)

El polimorfismo G644A (Arg215His) del gen de la TIOPURINA S-METILTRANSFERASA 8 (TPMT8)

El polimorfismo 341T>C de la N-acetiltransferasa 2 (arilamina N-acetiltransferasa)

El polimorfismo 481C>T de la N-acetiltransferasa 2 (arilamina N-acetiltransferasa) El polimorfismo 803A>G de la N-acetiltransferasa 2 (arilamina N-acetiltransferasa)

El polimorfismo 857G>A de la N-acetiltransferasa 2 (arilamina N-acetiltransferasa)

El polimorfismo 191G>A de la de N-Acetiltransferasa 2 (arilamina N-acetiltransferasa)

El polimorfismo Gly54Asp del gen de unión a lectina, manosa (MBL)

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Figura 12: Tabla 12

Fenotipo y SNP Valor p

HAQ>2

1 SNP 78 (rs2070874) 0,01723806 2 SNP 89 (rs1041983) 0,01859894 3 SNP 40 (rs1800790) 0,01905114 4 SNP 87 (rs no disponible) 0,0480329

RX2

5 SNP 42 (rs no disponible)

0,00351956

6 SNP 26 (rs2071592)

0,02199691

7 SNP 15 (rs1801275)

0,03075416

8 SNP 34 (rs1800629)

0,03181104

TTO_3

9 SNP 20 (rs1544410) 10 SNP 87 (rs no disponible)

0,00625435 0,04457328

Intervención quirúrgica

11 SNP 41 (rs no disponible) 0,01281179

Remisión

12 SNP 87 (rs no disponible) 0,02296336 13 SNP 28 (rs2476601) 0,0237744 14 SNP 27 (rs7531668) 0,02581015

Dejar el trabajo

15 r SNP 32 (rs1042522) 0,0350

Intolerancia Metotrexato

16 SNP 50 (rs1801133)f 0,0100 17 SNP 58 (rs2842934) 0,0360 18 SNP 78 (rs2070874) 0,0270

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citada en la descripción

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