ES2375601T3 - Lucha contra infecciones por virus de ih con plasma sangu�?neo humano oxidado con �?cido hipocloroso. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para preparar un fármaco para combatir una infección de una célula huésped por virus de IH, caracterizado por los pasos de: a) Proveer plasma sanguíneo humano y b) Oxidar con HOCl las proteínas y péptidos contenidos en el plasma sanguíneo.

Description

Lucha contra infecciones por virus de IH con plasma sanguíneo humano oxidado con ácido hipocloroso.

La invención se refiere al ámbito de los fármacos para combatir una infección de una célula huésped por virus de IH. Para ello se ofrecen fármacos según la invención que contienen proteínas oxidadas y péptidos oxidados, así como

5 procedimientos de preparación de tales fármacos y posibilidades de uso terapéutico de estos fármacos. En lo que sigue se denominan conjuntamente con el término "oxP" a proteínas oxidadas y péptidos oxidados obtenidos según el procedimiento de la reivindicación 1.

Tal como se describe en los documentos WO 02/22150 A2 y WO 02/32445 A2, oxP se unen al GP120 de la proteína Env de la envoltura del virus de IH, al igual que hacen, pero sin quedar limitados a éstos, la antitrombina "activada

10 para defensa inmunitaria" (IDA-ATIII), seroalbúmina oxidada, fibrinógeno oxidado. Los oxPs pueden, tal como los autores de la presente invención han demostrado para IDA-ATIII, por ejemplo, en el documento WO 02/22150 A2, impedir la multiplicación del virus de IH en la célula huésped.

En el contexto de la presente invención, los autores de la misma demuestran que oxPs pueden evitar el contacto entre el virus de IH y la célula huésped, y bloquear la formación de sincitios de células defensivas infectadas y no

15 infectadas y con ello inhibir la infección ya "a nivel de la entrada". Sorprendentemente, se ha observado además que para prevenir la infección de una célula huésped con virus de IH no son necesarias proteínas oxidadas y péptidos oxidados purificados, tales como la seroalbúmina humana, sino que el plasma sanguíneo oxidado puede impedir, como tal, una infección "a nivel de la entrada".

Aunque existen algunos medicamentos antivirales potentes, el VIH se ha desarrollado hasta constituir una verdadera

20 pandemia mundial y en consecuencia se ha convertido en la enfermedad infecciosa más importante. Actualmente más de 4 millones de personas mueren cada año por esta enfermedad. Puesto que los medicamentos contra VIH que hoy están aprobados, tales como inhibidores de proteasa e inhibidores de transcriptasa inversa no son capaces de eliminar por completo el VIH de las personas infectadas, existe la necesidad urgente de descubrir nuevos medicamentos antivirales.

25 Las infecciones por VIH o SIDA representan una de las crisis más graves en el desarrollo de la Humanidad. Por lo tanto, se debe hallar un medicamento contra el VIH que, junto a todos los requisitos científicos, sea por una parte fácil y asequible de producir y, por otra parte, se pueda hacer fácilmente accesible para las personas, especialmente en las regiones subsaharianas.

Estos problemas se han resuelto con la presente invención, ya que los oxPs aquí presentados bloquean infecciones

30 por VIH ya en el plano de entrada, que es de todos el primero, los oxPs se pueden producir de manera fácil y barata (se puede utilizar directamente proteína del plasma de una persona) y este procedimiento puede llevarse a cabo no sólo en laboratorios especializados.

Básicamente, los virus con envoltura penetran en su célula diana al entrar en contacto la membrana del virus con la membrana de la célula diana, y al acercarse después tanto las dos membranas que se fusionan. Para el contacto del

35 virus VIH-1 con la célula huésped es necesaria la unión de la proteína Env de la envoltura del VIH, que se encuentra en el exterior, al receptor CD4. Esto tiene lugar a través del componente GP120 de la Env. El GP120 se une después a uno de los co-receptores principales CXCR4 ó CCR5. La unión de GP120 a sus receptores conduce a un cambio de conformación del complejo externo GP120/GP41. Esta interacción es un requisito básico para que se genere el extremo N-terminal de GP41 vírico, que en última instancia conduce a la fusión de las membranas.

40 Uno de los factores que pueden bloquear en parte la entrada del virus son anticuerpos neutralizantes que están dirigidos contra GP120. Sin embargo, los anticuerpos neutralizantes de infecciones naturales poseen sólo una eficacia limitada, ya que por una parte el VIH produce un enorme número de diferentes variantes antigénicas, y por otra parte después de una infección se llega a una restrictiva "dominancia clonal" de anticuerpos neutralizantes de VIH. Por tanto, las nuevas variantes VIH-1 pueden escapar fácilmente de semejante respuesta, muy específica pero

45 limitada.

Recientes hallazgos han demostrado que la respuesta inmunitaria innata no específica es relevante para la defensa contra VIH. Leucocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMNL) y monocitos son, después de ser estimulados, viricidas contra VIH-1. La estimulación por lipopolisacárido (LPS), que conduce al estallido oxidativo de leucocitos, da lugar a un bloqueo de la entrada de VIH, independientemente del fenotipo de co-receptor vírico.

50 Los leucocitos generan H2O2 y secretan la hemoproteína mieloperoxidasa (MPO). Klebanoff y sus colaboradores han demostrado que PMNL estimulados de pacientes con deficiencia hereditaria de la enzima MPO poseían una actividad viricida disminuida. Mediante la adición de MPO se pudo reconstituir el poder de defensa disminuido.

Basándose en el estado actual de conocimientos se acepta que el HOCl producido por la MPO es en sí el agente activo antiviral. La expresión y la liberación de la MPO, que produce HOCl, está estrictamente controlada in vivo. El

55 HOCl libre representa una parte del estrés oxidativo.

Los autores de la presente invención han comprobado ahora, en el marco de la invención, que proteínas y péptidos que han entrado en contacto con HOCl, pueden transformarse a una forma antivírica y por tanto el HOCl tiene un efecto indirecto contra VIH-1 además del conocido efecto indirecto.

Relevancia de este tipo de inhibición para futuras aplicaciones terapéuticas: el HOCl, que es producido por la MPO en el tejido inflamado, modifica LDL y muchas otras proteínas humanas in vivo. Las proteínas modificadas por HOCl podrían ser detectadas por anticuerpos monoclonales específicos (documento WO-02/32445 A2). Por tanto, una modificación estructural, que ha sido generada por tratamiento con HOCl, ofrece un epítopo que ya está presente in vivo y por tanto es bien conocido para el sistema inmunitario. Por tanto, las oxPs deberían ser toleradas in vivo.

Además, la oxP se basa en una modificación química relativamente simple y asociada a un bajo coste.

¿Por qué el organismo no produce suficiente oxP in vivo para protegerse de la infección por VIH? Una respuesta a esta pregunta podría estar en la observación de que la función de los leucocitos neutrófilos y de los monocitos en personas infectadas con VIH empeora al comienzo de la infección, y que las pérdidas de función presentan una correlación positiva con la extensión o progreso de la enfermedad inducida por VIH.

La misión de la presente invención era, en consecuencia, poner a disposición un fármacoque inhiba la infección por VIH ya "a nivel de la entrada", y al mismo tiempo sea simple y barato de preparar y por ello también aplicable a pacientes del denominado "Tercer Mundo".

La misión se cumple mediante un procedimiento para preparar un fármaco para combatir una infección de una célula huésped por virus de IH, que está caracterizado por los pasos de:

a) Proveer plasma sanguíneo humano.

b) Oxidar con HOCl las proteínas y péptidos contenidos en la mezcla.

Mientras que en anteriores investigaciones se ha demostrado el efecto de proteínas individuales, purificadas, sobre la unión de una proteína Env a una proteína CD4, se ha puesto ahora de manifiesto, sorprendentemente, que la infección de una célula huésped por virus de IH también puede ser inhibida, reducida o incluso completamente impedida por mezclas de proteínas. En particular, estos efectos pueden ser conseguidos también por mezclas complejas que contienen proteína y/o péptido, con más de un tipo de proteína o péptido. Esto fue sorprendente, ya que era de esperar que el proceso de preparación de las proteínas y/o péptidos oxidados necesarios para combatir una infección de una célula huésped por virus de IH y/o para inhibir la unión de una proteína Env a una proteína CD4 se vería afectado en el caso de la oxidación en tales mezclas complejas por la generación de conformaciones incorrectas y por reacciones secundarias, de manera tal que la eficacia de proteínas oxidadas en semejantes mezclas se habría reducido o desparecido por completo.

En el sentido de esta invención, sangre completa es la sangre que ha sido extraída de una persona y, en su caso, se ha mezclado con un anticoagulante adecuado.

En el marco de la presente invención, como ya se ha indicado más arriba, se ha comprobado que oxP bloquea la unión de GP120 de VIH a CD4 y por tanto impide la penetración del VIH en la célula diana. Puesto que un virus, para su multiplicación, está obligado a penetrar en una célula huésped, ya no puede seguir multiplicándose. Se detiene la formación de sincitios de células defensivas infectadas por VIH, con células defensivas no infectadas, de manera que éstas continúan desempeñando sus tareas, y pueden destruir células infectadas.

Son proteínas plasmáticas y péptidos plasmáticos aquellas proteínas o péptidos que están contenidos en el líquido que se separa en la parte superior al centrifugar o sedimentar sangre completa, y las proteínas, péptidos y complejos de proteína o péptido que se pueden preparar a partir de éste. Entre las proteínas plasmáticas o péptidos plasmáticos se cuentan en particular seroalbúmina, en particular seroalbúmina humana y seroalbúmina de bovino, antitrombina, antitrombina "activada para defensa inmunitaria" (IDA-ATIII), fibrinógeno, factores de coagulación e inmunoglobulinas.

El fármaco preparado conforme al procedimiento contiene por tanto proteínas oxidadas, péptidos oxidados y aminoácidos oxidados (reunidos bajo la denominación de "oxP").

De acuerdo con la invención se pueden transformar directamente fracciones plasmáticas (mezclas de proteínas plasmáticas) del propio paciente o de un donante, sin necesidad de aislar las proteínas, en un medicamento que contiene oxP.

Evidentemente, un fármaco de acuerdo con la invención, puede contener otras sustancias auxiliares y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, con lo que se formula el fármaco para la administración local, intradérmica, superficial, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular u oral, o se posibilita su administración sobre vesículas. Por consiguiente, el fármaco de acuerdo con la invención contiene preferiblemente aquellas sustancias auxiliares y excipientes que posibilitan el modo de administración preferido en cada caso.

Además de oxP, el fármaco de acuerdo con la invención puede contener, por supuesto, otras sustancias tales como, por ejemplo, antibióticos, otros inhibidores de infección por VIH, etc. Dependiendo de la enfermedad concomitante que haya que tratar, puede ser ventajoso el tratamiento de refuerzo con fármacos conocidos. Por tanto, una combinación correspondiente de este fármaco con OXP constituye, en su caso, una forma de realización preferida de la presente invención.

A continuación se describirá con más detalle la invención por medio de los Ejemplos y las Figuras.

1.) Ejemplo de preparación de HSA oxidada de acuerdo con la solicitud WO 02/32445 A2 (Ejemplo comparativo).

Para transformar seroalbúmina humana normal a la forma antivírica, se activó HSA con HOCl. Se añadió HOCl recién preparado a HSA, en una proporción molar de 1:100. Después de un tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se eliminó por filtración en gel (Sephadex G25) el hipoclorito remanente.

En otra aplicación, con un método estándar (por ejemplo precipitación con sulfato amónico/desalificación o crioprecipitación) se aislaron de plasma humano mezclas proteicas y luego se modificaron éstas directamente con HOCl recién preparado, tal como se ha descrito para la albúmina humana.

2.) La HSA oxidada no es citotóxica (Ejemplo comparativo).

La HSA modificada con HOCl fue probada primeramente en el ensayo de incorporación de 3H-timidina. Hasta una concentración de uso de 50 Ig/mi no se pudo observar ninguna actividad anticelular con respecto a la proliferación de células Hela o GHOST en comparación con HSA normal (Fig. 1).

3.) (Ejemplo comparativo) Se ilustró la fijación de HSA oxidada a GP120 IIIB (del proyecto EVA de reactivo para SIDA) en un ensayo ELISA estándar (Fig. 2a). Además, la fijación de HSA oxidada a GP120 IIIB, así como a GP120 SF2, fue demostrada también con la espectroscopía de resonancia de plasmón superficial (siglas inglesas SPR) (Figura 2b). En ambos ensayos se demostró la interacción directa de HSA oxidada sobre GP120. Sólo después de la transformación de la proteína a la forma oxidada se pudo observar una unión específica. Cuando se usó proteína normal, en este caso HSA, seroalbúmina normal de bovino, glutatión-S-transferasa (GST) o una proteína de fusión GST-V3 que contenía el bucle V3 FP120, no se pudo observar unión alguna. En todos estos experimentos de control, las "unidades de respuesta" (siglas inglesas RU) fueron <5. Además del estudio por SPR de la fijación se investigó la cinética de la interacción oxP (en este caso oxATIII) y GP120-IIIB. El análisis proporcionó valores de ka y kd de 1,47*10-9 y 7,01*10-10 M, de los que resulta una KD de 7,0*10-10 M (Rmax = 120, Chi2 = 40).

4.) (Según la invención) Tras tratamiento con HOCl, una mezcla proteica no fraccionada procedente de plasma humano se une, tal como se ha descrito más arriba, a GP120 de VIH (Fig. 3).

5.) HSA oxidada neutraliza HIV (Ejemplo comparativo)

Para los experimentos de neutralización de VIH se utilizaron las cepas de VIH-1 NL4-3 y una variante de la NL4-3, la NL-991 en la cual el bucle V3 ha sido sustituido por un bucle V3 del aislado primario PI-991. NL4-3 es un virus monotrópico, que utiliza sólo el co-receptor CXCR4. El virus NL-991 es R5-monotrópico y utiliza sólo CCR5 como co-receptor. En la Figura 4 se muestra que la replicación de ambos virus es inhibida por oxHSA. Esto se refleja en la cantidad de antígeno p24 de VIH producido.

6.) (Ejemplo comparativo) En cultivos celulares de VIH, células infectadas con VIH se fusionan con células diana CD4+ no infectadas. Esta fusión entre las células es conocida como "formación de sincitios". Esta formación de sincitios se atribuye a la fijación de GP120, que se expresa en la membrana de células infectadas, al receptor CD4 de las células diana y la posterior inserción del extremo N-terminal de GP41 en la membrana diana. Los dos virus que se utilizaron en este ensayo de neutralización (NL4-3 y NL-991) fueron capaces de formar sincitios con las células GHOST-CXCR4 y GHOST-CCR5 (Fig. 5). Tanto la formación de sincitios inducida por el virus NL4-3 (Fig. 5a), como la inducida por el virus NL-991 (Fig. 5g), pudieron ser inhibidas por la adición de ox-HSA en concentraciones de hasta 20Ig/ml (Fig. 5e-4k). La oxHSA mostró una inhibición dependiente de la dosis (5b-e; 5h-k). Tal como se ha mostrado ya en la Figura 1, la propia oxHSA no influyó ni en la proliferación celular ni en la morfología de las células (Fig. 5f; 5l) y la tinción de los núcleos celulares atestiguó la vitalidad de las células GHOST.

7.) OxHSA bloquea la infección por VIH "a nivel de la entrada" (Ejemplo comparativo)

La formación de sincitios se basa en la presencia de la envoltura vírica y las proteínas de amarre víricas en la superficie de la membrana de las células huésped. Por tanto, se usaron células Hela-P4 (CD4+, CXCR4+, CCR5+) que expresaban además los receptores víricos GP120/GP41. Para ello se transfectaron con vectores GP160 células Hela-P4, de manera que expresaron las proteínas Env del VIH NL4-3 y del VIH NL-911. Las células HeLa-P4 transfectadas con GP160 se fusionaron y formaron sincitios al cabo de 28 horas (Fig. 6a; 6g), a diferencia de células no transfectadas (6b; 6h).

La incubación con oxHSA condujo a una inhibición dosis-dependiente de la formación de sincitios (6d, f, 6j, I) a

diferencia de la incubación con proteína no modificada (6c, e, i, k). Este ensayo de transfección imita la entrada de virus de IH X4-trópicos y R5-trópicos (NL4-3, NL-911). En ambos procedimientos de ensayo sincitial, oxHSA mostró actividad "anti-entrada de VIH" a 20 y 50 Ig/ml. Esto evidencia que oxHSA actúa al nivel de la interacción GP120-CD4 con una DI>95 a 50 Ig/ml.

8.) Precipitación de proteínas plasmáticas y su oxidación (según la invención)

10 ml de sangre citratada fueron centrifugados a 3200 rpm / 2000 g durante 10 minutos y se tomó el plasma sobrenadante. Se añadió (NH4)2SO4 5 M en una proporción 1:1 en volumen, se agitó el plasma durante 20 minutos, y de este modo se precipitaron las proteínas plasmáticas. Se centrifugó nuevamente la suspensión durante 10 minutos a 3200 rpm / 2000 g, se desechó el sobrenadante, y se resuspendieron en tampón PBS (pH 7,4) las proteínas precipitadas. Se vertió la solución en un tubo de diálisis (límite de exclusión 10.000 D) y se dializó durante 3 días contra tampón PBS. Durante este tiempo se cambió 3 veces el tampón. Como alternativa, se desalificó la proteína mediante un procedimiento de filtración en gel.

Después de la diálisis o filtración en gel, se determinó fotométricamente el contenido total de proteína por métodos estándar.

Oxidación para proporcionar el fármaco según la invención:

A 500 Ig de la solución de proteína se añadió HOCl reciente (12 Il) y se completó hasta un volumen de 1 ml con tampón PBS / EDTA 0,1 mM. Después de 15 minutos de tiempo de reacción sobre hielo (0°C), se vertió la solución en una columna de filtración por gel equilibrada con tampón PBS, y así se eliminó el HOCl no reaccionado.

Figura 1: IDA-HSA (HSA activada para defensa inmunitaria) no es citotóxica

Se cultivaron células HeLa que expresaban CD4, CXCR4 y CCR5 humanos, en presencia de [3H]-timidina y distintas concentraciones de IDA-HSA (o) ó HSA (.). Las células se sembraron por tres veces, a razón de 104células por pocillo, en una placa de 96 pocillos. En el día 2 se añadió [3H]-timidina (10 ICi/ml) a cada pocillo. Transcurridas 8 horas se recolectó el ADN, se fijó a una membrana de fibra de vidrio y se cuantificó con un contador � la [3H]-timidina incorporada.

Figura 2: IDA-HSA se une a GP120 de VIH-1

La unión específica de IDA-HSA a GP120 se ilustró en un procedimiento ELISA estándar (a) y mediante espectroscopía de resonancia de plasmón superficial (SPR) (b). Para el ELISA se revistió previamente una placa de 96 pocillos con GP120 recombinante (1 Ig/ml) a razón de 100 Il/pocillo, y a continuación se bloqueó con gelatina al 0,25% (en PBS) (1 hora a temperatura ambiente). Se añadieron IDA-HSA (o) y HSA (e) a distintas concentraciones (0, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20 Ig/ml en PBS). La proteína unida se detectó con anticuerpos específicos anti-HSA policlonales, conjugados con HRP (Sigma). Para la SPR se unió covalentemente GP120 (10 Ig/ml) a EDC/NHC en una pastilla o "chip" sensor activado con CH, revestido con dextrano (CM5, Biacore, Suecia). El caudal de paso ascendió durante 10 minutos a 5 Il/minuto. Después de bloquear con etanolamina se investigó la fijación de IDAHSA y HSA (cada una a 1 Ig/ml) con un caudal de 5 Il/minuto durante 6 minutos

Figura 3: Mezclas oxidadas de proteínas plasmáticas se unen a GP120 de VIH

Se demostró mediante espectroscopía de resonancia de plasmón superficial (SPR) la fijación específica de una mezcla de proteínas plasmáticas oxidadas a GP120. Se unió covalentemente GP120 (10 Ig/ml) a un chip sensor (C1, Biacore, Suecia).

Inyección de 20 Il de glicina 100 mM, Triton X-100 al 0,3 %, pH 12 (dos veces)

Limpieza de la superficie del sensor

5 Il/minuto

Caudal

Inyección de 20 Il de EDTA 400 mM

Eliminación de iones calcio de la superficie del sensor

Inyección de 50 Il de NHS/EDC

Activación de la superficie del sensor

Inyección de 20 Il de glicina 100 mM, Triton X-100 al 0,3 %, pH 12 (dos veces)

Limpieza de la superficie del sensor

Inyección de 20 Il de P120 100 nM en NaAc 10 mM pH 4 (dilución 1:10)

Copulación covalente de P120

Inyección de 55 Il de etanolamina

Bloqueo de los ésteres activados remanentes

Acto seguido se inyectó una disolución de PluO 93,5 nM sobre P120 inmovilizada. Se obtuvo una clara curva de unión (véase más arriba). En sucesivos experimentos se demostró que la altura de señal resultante se correlacionaba con la cantidad de P120 inmovilizada.

Figura 4: Inhibición de la replicación de VIH

5 Se infectaron células GHOST-CXCR4 ó GHOST-CCR5 con virus X4-trópico NL4-3 (triángulos) ó R5-trópico NL-991 (cuadrados) (500 TCID50). En el día 5 se ensayó el sobrenadante del cultivo celular en cuanto a antígeno p24, con un ELISA estándar para p24. Se muestra el valor medio de 3 medidas. El error típico para el valor medio fue <10%, NL4-3 + IDA-HSA (.); NL4-3 + HSA (L); NL-991 + IDA-HSA (.); NL-991 + HSA (o).

Fig.�5:�inhibición�de�la�formación�de�sincitios�inducida�por�HiV

10 Se infectaron células GHOST-CXCR4 ó GHOST-CCR5 con 500 TCID50 de los aislados de laboratorio de VIH (A-E) NL4-3 (X4-monotrópico) ó (F-L) NL-991 (R5-monotrópico). Se inhibió la infección mediante la adición de proteína IDA-HSA con una concentración final de 0, 2, 5, 10 ó 20 Ig/ml al medio de cultivo. La infección se hizo apreciable 5 días después del inicio de la infección por la aparición de los sincitios inducidos y la destrucción del tapiz celular. Para ello se tiñeron las células/núcleos mediante un procedimiento estándar de tinción con eosina/azul de

15 metileno/azur (Hemacolor, Merck). (a), células infectadas con NL4-3; (b) NL4-3 + IDA-HSA 2 Ig/ml;. (c) NL4-3 + IDA-HSA 5 Ig/ml; (d) NL4-3 + IDA-HSA 10 Ig/ml; (e) NL4-3 + IDA-HSA 20 Ig/ml; (g) células infectadas con NL-991;

(h) NL-991 + IDA-HSA 2 Ig/ml; (i) NL-911 + IDA-HSA 5 Ig/mI; (j) NL-911 + IDA-HSA 10 Ig/mI; (k) NL-911 + IDA-HSA 20 Ig/mI; (I) IDA-HSA 20 Ig/ml.

Fig.6:�inhibición�de�la�formación�de�sincitios�inducida�por�GP-160

20 Se transfectaron células HeLa, que expresaban CD4, CXCR4 y CCR5 humanos, con plásmidos pSVATGrev que expresaban las env NL4-3 ó NL-911. A esto se añadió, o bien IDA-HSA. o bien proteína HSA (concentración final 20 y 50 Ig/ml). Transcurridas 28 horas se investigó la formación de sincitios mediante microscopía de contraste de fases estándar de las células vivas. IDA-HSA impidió la formación de sincitios de manera dependiente de la dosis.

Referencias: Stephenson �: Gro�ing, Evolvlng HIV/AIDS Pandemic ls Producing Social and Economic Fallout

�AMA. 2003;289:31-33. 2 Brenner BG, Turner D, Wainberg MA: HIV-1 drug resistance: can �e overcome? Expert Opin Biol Ther. 2002;2(7):751-61. 3 K�ong PD, Wyatt R, Robinson �, S�eet RW, Sodroski �, Hendrickson WA.

Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex �ith the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature. 1998;393(6686):648-59 4 Gaschen B, Taylor �, �usim K, Foley B, Gao F, Lang D, Novitsky V, Haynes B, Hahn BH, Bhattacharya T,

Korber B. Diversity considerations in HIV-1 vaccine selection. Science. 2002;296(5577):2354-60.

5 Muller S, Wang H, Silverman G�, Bramlet G, Haig�ood N, Kohler H. B-cell abnormalities in AIDS: stable and clonally-restricted antibody response in HIV-1 infection. Scand � Immunol. 1993;38(4):327-34.

6 Nara PL, Garrity RR, Goudsmit �. Neutralization of HIV-1: a paradox of humoral proportions. FASEB �. 1991 5(10):2437-55.

7 Verani A, Sironi F, Siccardi AG, Lusso P, Vercelli D. Inhibition of CXCR4-tropic HIV-1 infectlon by Iipopolysaccharide: evidence of different mechanisms in macrophages and T Iymphocytes.

� Immunol. 2002;168(12):6388-95.

8 Chase M�, Klebanoff S� Viricidal effect of stimulated human mononuclear phagocytes on human immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992,15;89(12):5582-5.

9 Klebanoff S�, Coombs RW. Viricidal effect of polymorphonuclear leukocytes on human immunodeficiency vlrus-1. Role of the myeloperoxidase system.

� Clin Invest. 1992;89(6):2014-7. 10 Polzer S, Dittmar MT, Schmitz H, Schreiber M. The N-Iinked glycan g15 �ithin the V3 loop of the HIV-1 external glycoprotein gp120 affects coreceptor usage, cellular tropism, and neutralization. Virology. 2002 ,5;304(1):70-80. 11 Daugherty A, Dunn �L, Rateri DL, Heinecke �W.

Myeloperoxidase, a catalyst for lipoprotein oxidation, is expressed in human atherosclerotlc lesions. � Clin Invest. 1994;94(1):437-44. 12 Sugiyama S, Okada �, Sukhova GK, Virmani R, Heinecke �W, Libby P.

Macrophage myeloperoxldase regulation by granulocyte macrophage colony-stimulating factor in human atherosclerosis and implications in acute coronary syndromes. 7

Am Pathol. 2001;158(3):879-91

13 Spada C, Treitinger A, Fujimura A�. Morphofunctional Study of Blocd Polymorphonuclear Leucocytes in HIV-Seropositive Individuals. Braz � lnfect Dis. 1998;2(6):285-290

5 14 Karen C. Hayani, Stephen C. Verral, y David L. Pitrak Impaired Phagocyte Oxidative Capacity in Human Immunodeficiency Virus Infected The �ournal of Infectious Diseases 1999;179:584-589

15 WO-A-02/22150 16 WO-A-02/32445

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Procedimiento para preparar un fármaco para combatir una infección de una célula huésped por virus de IH, caracterizado por los pasos de: a) Proveer plasma sanguíneo humano y b) Oxidar con HOCl las proteínas y péptidos contenidos en el plasma sanguíneo.
2. 2. Fármaco para uso en la lucha contra una infección de células huésped por virus de IH, que se puede preparar según la reivindicación 1.

   Fig. 1:

   Fig. 2:

   Fig. 2b):

   Fig. 3: unión de mezcla oxidada de proteínas plasmáticas a GP120 de VIH

   Fig. 4:

   Fig.�5:

   Fig. 5 (continuación):

   Fig.�6: