ES2376022T3 - Factor viii recombinante demanosilado para el tratamiento de pacientes con hemofilia a. - Google Patents

Abstract

Una proteína FVIII con actividad procoagulante que incluye un polipéptido FVIII modificado cuya modificación comprende la sustitución o deleción de al menos un aminoácido seleccionado del grupo formado por asparagina 239, asparagina 2118, serina 241 y treonina 2120, comprendiendo dicha modificación preferentemente al menos - la sustitución de la asparagina 239 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, glicina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina; - la sustitución de la asparagina 2118 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina; - la sustitución de la asparagina 239 y la asparagina 2118 por alanina o glutamina; - la sustitución de la asparagina 239 por alanina y la asparagina 2118 por glutamina - la sustitución de la asparagina 239 por glutamina y la asparagina 2118 por alanina

Description

Factor VIII recombinante demanosilado para el tratamiento de pacientes con hemofilia A.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un Factor VIII modificado sustancialmente no inmunogénico o menos inmunogénico. La invención se refiere además a las construcciones de ácido nucleico, incluyendo el ADN que codifica el FVIII modificado, y a los procedimientos para la expresión y producción del FVIII modificado en una célula huésped o en un organismo. La invención también se refiere a los procedimientos de administración del FVIII modificado a un sujeto para tratar una alteración hemorrágica.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El factor humano VIII:C (FVIII) es el factor de coagulación deficiente en el trastorno hemorrágico de la hemofilia A ligado el cromosoma X, siendo la hemofilia una fuente importante de morbilidad hemorrágica y mortalidad en los hombres afectados. Tradicionalmente, los hemofílicos recibían transfusiones de toda la sangre. Más recientemente, el tratamiento ha consistido en preparaciones de concentrados de FVIII derivados de plasma humano. Sin embargo, el consumo de productos derivados de plasma expone a los pacientes hemofílicos a un posible riesgo de contraer enfermedades transmitidas por virus, como hepatitis y sida. Los costosos esquemas de purificación para reducir el riesgo aumentan los costes del tratamiento. Con el aumento de costes y la limitada disponibilidad de FVIII derivado de plasma, los pacientes reciben el tratamiento esporádicamente en base a la demanda más que en su profilaxis. El FVIII producido en forma recombinante tiene ventajas importantes con respecto al FVIII derivado del plasma en lo que respecta a su pureza y seguridad así como también por el aumento de su disponibilidad. Por consiguiente, se han hecho muchos esfuerzos por desarrollar el FVIII producido en forma recombinante. Debido a la naturaleza lábil del FVIII, especialmente después de su activación, se deben administrar grandes y repetidas dosis de proteínas derivadas del plasma o en forma recombinante para obtener un beneficio terapéutico. Sin embargo, la cantidad de proteína del FVIII a la que el paciente está expuesto se ha relacionado con el desarrollo de anticuerpos que inhiben su actividad. En virtud de esta conocida inmunogenicidad, uno de los objetivos al desarrollar nuevas formas recombinantes del FVIII para su uso como agente terapéutico es el desarrollo de productos que reducen o eliminan dicha respuesta inmunitaria. Las funciones del FVIII en la vía intrínseca de la coagulación de la sangre como cofactor para acelerar la activación del factor X mediante el factor IXa, una reacción que ocurre en una superficie fosfolipídica cargada negativamente ante la presencia de iones calcio.

La molécula del FVIII se divide en 6 dominios estructurales: un dominio A triplicado (A1, A2, A3), un dominio central rico en carbohidratos y prescindible (dominio B) y un dominio C duplicado (C1, C2) (consulte la figura 5). El FVIII es secretado al plasma como un heterodímero de una cadena pesada (dominios A1–A2–B) y una cadena ligera (dominios A3–C1–C3) asociados mediante un ligamiento no covalente de iones metálicos divalentes entre los dominios A1 y A3. En el plasma, el FVIII se estabiliza uniéndose al factor de von Willebrand. Más específicamente, la cadena ligera de FVIII se una mediante interacciones no covalentes a un centro de unión primario en el terminal amino del factor de von Willebrand. En la activación proteolítica mediante trombina, el FVIII se activa a un heterotrímero de 2 fragmentos de la cadena pesada (A1, un fragmento de 50 kDa y A2, un fragmento de 43 kDa) y de la cadena ligera (A3–C1–C2, una cadena de 73 kDa). La forma activa del FVIII (FVIIIa), por lo tanto, consiste en una subunidad de A1 asociada a través del ligamiento de iones metálicos divalentes a una cadena ligera de A3–C1–C2 escindida a la trombina y una subunidad no unida a A2 asociada con el dominio A1 a través de una asociación de iones. Este heterotrímero de FVIIIa es inestable y está sujeto a una rápida inactivación a través de la disociación de la subunidad A2 en condiciones fisiológicas. La molécula de FVIII contiene 25 secuencias de consenso (Asn–Xxx–Thr/Ser) que permiten la glicosilación ligada a N, 20 de las cuales han demostrado ser glicosiladas (1).

La proteína del FVIII puede estar definida desde el punto de vista funcional como un factor capaz de complementar el defecto de coagulación en el plasma de los pacientes afectados con hemofilia A. Para permitir el tratamiento de la hemofilia A, el FVIII ha sido purificado a partir de plasma humano o porcino y, más recientemente, producido mediante tecnologías de ADN recombinante. El documento EE. UU. 4.965.199 describe, por ejemplo, procedimientos desarrollados para la producción recombinante de cantidades terapéuticas de FVIII en células huésped de mamíferos. Asimismo, se ha informado la expresión humana del FVIII en células de ovario de hámster chino (CHO) y células de riñón de hámster bebé (BHKC) y, más recientemente, también se ha demostrado la eficacia del FVIII con el dominio B eliminado en ensayos clínicos (documento EE. UU. 4.868.112, ref. 2).

El documento US 2005/0100990 reivindica mutantes del factor VIII modificado en los que los sitios de N-glicosilación se encuentran alterados por la sustitución de un aminoácido de una secuencia consenso de glicosilación por otro aminoácido o por la deleción de todo o parte del dominio B, lo cual da como resultado la pérdida de varios sitios de Nglicosilación. Sin embargo, ninguno de los mutantes concretos descritos en este documento se corresponde realmente con la deleción o la sustitución de ninguno de los aminoácidos asparagina 239, asparagina 2118, serina 241 o treonina

La publicación “Bioengineering of coagulation factor VIII for improved secretion” Miao Hongzhi, Blood, vol. 103 nº9, 2004, se centra en un FVIII modificado cuya secreción se encuentra mejorada en particular por la deleción del dominio

B. La variante del FVIII incluye 226 aminoácidos del dominio B, en el que las Asn están sustituidas por Gln en la secuencia consenso de N-glicosilación en las posiciones 757, 784, 828, 900 y 963.

El documento US 6.759.216 reivindica moléculas modificadas del FVIII que muestran una menor inmunogenicidad y más concretamente un FVIII humano con deleción del dominio B en el que se ha incorporado un sitio de N-glicosilación en las posiciones 486-488 del dominio A2.

La publicación “The B domain of coagulation factor VIII interacts with the asialoglycoprotein receptor”, Bovenschen et al., JTH Jun 2005, vol. 3, nº 6, 2005 estudia la interacción del FVIII con el receptor lectina endocítico de asialoglicoproteínas (ASGPR). Este documento reivindica en particular que el ensamblaje del complejo FVIII-ASGPR está dirigido por elementos estructurales dentro del dominio B del FVIII y que la deglicosilación total de la cadena pesada del FVIII por la endoglicosidasa F anula completamente la interacción con el ASGPR.

Los productos terapéuticos del FVIII disponibles comercialmente incluyen el FVIII derivado del plasma (pdFVIII) y los productos del FVIII recombinante (rFVIII) como el rFVIII completo (Kogenate® Bayer, Advate® Baxter, Helixate® CSL– Behring) y un rFVIII con el dominio B eliminado (Refacto® Wyeth).

Sin embargo, a pesar de la disponibilidad del FVIII de calidad terapéutica, la necesidad de análogos del FVIII con propiedades mejoradas sigue siendo alta. Es más, el tratamiento de pacientes con hemofilia A con FVIII terapéutico (pdFVIII o rFVIII) provoca, en 15 al 30% de los casos, la aparición de anticuerpos anti FVIII (inhibidores) que neutralizan la actividad procoagulante del FVIII administrado terapéuticamente (3,4). La aparición de inhibidores se considera un reflejo de la respuesta inmunitaria alogénica a la administración repetida de una proteína del FVIII exógeno. Algunos hemofílicos son muy sensibles al factor VIII recombinante exógeno y desarrollan anticuerpos anti factor VIII limitando la eficacia del tratamiento. Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores del FVIII representa un gran obstáculo médico y un asunto de preocupación crítico ya que los pacientes que producen los inhibidores del FVIII se vuelven resistentes a la terapia de sustitución habitual. La aparición de inhibidores del FVIII no sólo provoca un aumento 3 veces mayor de los costes del tratamiento (5) sino que también afecta drásticamente la calidad de vida de los pacientes, aumentando la morbilidad y la mortalidad. En este sentido, se espera proporcionar un FVIII con reducción o ausencia del potencial para inducir una respuesta inmunitaria en los seres humanos. Además, se espera proporcionar un FVIII con un aumento del tiempo de circulación dentro del ser humano que podría proporcionar un beneficio particular en el contexto de una enfermedad crónica y recurrente, como es el caso de la hemofilia A.

La primera etapa de la respuesta inmunitaria específica dirigida al FVIII consistió en la endocitosis del FVIII por las células presentadoras de antígenos (CPA). Las células dendríticas (CD) parecen ser las CPA más potentes para cebar los linfocitos T sin tratamiento previo y para iniciar la correspondiente respuesta inmunitaria específica del antígeno (6,7). La endocitosis de antígenos por CD se realiza generalmente mediante macropinocitosis o mediante una endocitosis mediada por receptores. Es más, la superficie de CD presenta un gran número de receptores endocíticos, la mayoría de los cuales dependen de la presencia de iones bivalentes, principalmente calcio. Muchos receptores endocíticos, por sus dominios de reconocimiento de carbohidratos (DRC) expuestos, son específicos para los residuos de azúcares presentes en los antígenos (8) y se denominan receptores de lectina tipo C (CLR, por sus siglas en inglés). De esta manera, se pueden reconocer los residuos de manosa en un antígeno mediante una serie de CLR en la superficie de las CD, que incluyen el receptor de manosa (RM, CD206), ICAM3 específica de las células dendríticas que utilizan no integrinas (DC–SIGN, CD209), dectina, DEC–205 (CD205). El policarbohidrato de manano ha demostrado ser un ligando para las manosas sensibles a los CLR especialmente RM y DC–SIGN (9–11). La molécula de DC–SIGN en las CD se fija a la ICAM–3 en los linfocitos T. La interacción específica parece tener una función importante en el inicio de la sinapsis inmunológica entre las CD y los linfocitos T. La activación de los linfocitos podría, por lo tanto, inhibirse con un anticuerpo de bloqueo anti–DC–SIGN.

Se presentaron numerosos tratamientos para reducir las consecuencias de la respuesta inmunitaria al FVIII. Por ejemplo, el tratamiento formado por el consumo de desmopresina (una hormona sintética que estimula la producción de FVIII), agentes promotores de coagulación (por ejemplo, concentrado complejo de protrombina o concentrado complejo de protrombina activado), factor recombinante VIIa o perfusión del FVIII para inducir tolerancia.

Se ha desarrollado un procedimiento reciente, que consiste en el consumo de anticuerpos anti idiotípicos que interactúan con la región variable de otros anticuerpos, para neutralizar los anticuerpos inhibidores (12). De esta manera, se aisló un anticuerpo IgG4kappa monoclonal humano dirigido contra un dominio C1 anti–FVIII, que bloquea la actividad del cofactor del FVIII y su ligamiento con el factor de von Willebrand (vWF) (13). Del mismo modo, se aisló un anticuerpo monoclonal humano contra el dominio C2 anti–FVIII, BO2C11 (IgG4kappa) (14), que inhibe el ligamiento del FVIII a vWF y fosfolípidos. Este anticuerpo, por lo tanto, inhibe completamente la actividad procoagulante del FVIII nativo y activado. Otro ejemplo de anticuerpo monoclonal es el BOIIB2, dirigido contra el dominio A2 del FVIII, que bloquea el 99% de la actividad del FVIII. Sin embargo, la respuesta inmunitaria inducida por FVIII es una respuesta policlonal, y un tratamiento formado por el consumo de anticuerpos anti idiotípicos dirigidos contra los anticuerpos anti FVIII sólo podría neutralizar parcialmente la respuesta inmunitaria al FVIII.

El solicitante ha demostrado recientemente que las glicosilaciones que terminan en manosas en el FVIII median la internalización del FVIII mediante células dendríticas (CD) humanas inmaduras. Estos resultados demuestran que el bloqueo de la interacción entre los azúcares manosilados ubicados en el FVIII y los receptores de la manosa de CD reduce la internalización del FVIII y la posterior presentación a los linfocitos T específicos del FVIII. De esta manera, se puede lograr la reducción de la inmunogenicidad del FVIII reduciendo la capacidad de interactuar con los receptores sensibles a la manosa.

El solicitante además ha descubierto sorprendentemente la capacidad de un FVIII modificado, en el que uno o más aminoácidos seleccionados de la asparragina 239 (Asn239) y la asparragina 2118 (Asn2118) han sido sustituidos o eliminados, de activar los linfocitos T cuando son presentados por las CD se reduce o elimina sustancialmente, brindando la oportunidad de proporcionar a los pacientes un FVIII terapéutico no inmunogénico o menos inmunogénico.

CARACTER�?STICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una proteína del FVIII que comprende un polipéptido del FVIII modificado y caracterizado porque la capacidad de dicho polipéptido del FVIII modificado de interactuar o de ser endocitado mediante células de endocitosis disminuye o desaparece con respecto al polipéptido del FVIII correspondiente no modificado.

En una forma de realización específica, la presente invención proporciona un polipéptido del FVIII modificado cuya capacidad para interactuar con los receptores en la superficie a partir de células de endocitosis disminuye o desaparece, en particular un polipéptido del FVIII modificado, cuya capacidad disminuye o desaparece si los receptores en la superficie son receptores sensibles a la manosa y, más particularmente, si los receptores en la superficie se seleccionan de un grupo formado por un receptor de manosa (RM, CD206), ICAM3 específica de las células dendríticas que utilizan no integrinas (DC–SIGN, CD209), dectina, DEC–205 (CD205). En una forma de realización específica, las células de endocitosis son células presentadoras de antígenos (CPA) y, particularmente, células dendríticas, macrófagos, células endoteliales o células del linfocito B.

En otra forma de realización específica, la presente invención proporciona un polipéptido del FVIII modificado, cuya inmunogenicidad se ve sustancialmente reducida o eliminada en los seres humanos.

En otro aspecto, el polipéptido del FVIII modificado de la invención es sustancialmente desglicosilado, más particularmente el FVIII modificado de la invención es una estructura tipo glucano sustancialmente terminada con el polipéptido del FVIII desglicosilado del residuo de manosa.

Más particularmente, el polipéptido del FVIII modificado de la invención comprende la sustitución o la supresión de, al menos, un aminoácido de un sitio de consenso de glicosilación que tiene la secuencia de consenso Asn–Xxx–Thr/Ser, en la que Xxx representa cualquier aminoácido. Más particularmente, el polipéptido del FVIII modificado de la invención comprende la sustitución o la supresión de, al menos, un aminoácido seleccionado del grupo formado por asparragina 239, asparragina 2118, serina 241 y treonina 2120, con referencia a la secuencia del polipéptido del FVIII humano completo establecida en el identificador de secuencia Nº: 2. En una forma de realización específica, la asparragina 239 se sustituyó por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, glicina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico. En otra forma de realización específica, la asparragina 2118 se sustituyó por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico. En otra forma de realización, la asparragina 239 se sustituyó por alanina y/o asparragina 2118 se sustituyó con alanina. En otra forma de realización, la asparragina 239 se sustituyó por glutamina y/o asparragina 2118 se sustituyó por glutamina. En otra forma de realización, la asparragina 239 se sustituyó por alanina y la asparragina 2118 se sustituyó por glutamina. En otra forma de realización, la asparragina 239 se sustituyó por glutamina y la asparragina 2118 se sustituyó por alanina. En otra forma de realización específica, el polipéptido del FVIII modificado de la invención comprende, al menos, uno de (i) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 6 y/o (ii) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 8. En otra forma de realización específica, el polipéptido del FVIII modificado de la invención comprende, al menos, uno de (i) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 12 y/o (ii) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 14. En otra forma de realización específica, el polipéptido del FVIII modificado de la invención comprende (i) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 6 y (ii) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 14. En otra forma de realización específica, el polipéptido del FVIII modificado de la invención comprende (i) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 12 y (ii) la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 8.

En otro aspecto, el polipéptido del FVIII modificado de la invención es una proteína del FVIII activo al procoagulante.

En otro aspecto, el polipéptido del FVIII modificado de la invención además comprende la supresión de todo o parte del dominio B establecido en el identificador de secuencia Nº: 10. En otra forma de realización preferente, el polipéptido del FVIII modificado de la invención se elimina sólo parcialmente del dominio B y, más preferentemente, el polipéptido del FVIII modificado de la invención contiene, al menos, los primeros 226 aminoácidos del dominio B (con referencia al identificador de secuencia Nº: 10).

Es otro objeto de la invención proporcionar una molécula de ácido nucleico aislada o una secuencia nucleotídica aislada modificada que codifica una proteína del FVIII que comprende el polipéptido del FVIII modificado de la invención. En una forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 5 y/o (ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 7. En otra forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende una molécula de ácido nucleico aislada capaz de hibridarse en condiciones muy restrictivas con, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 5 y/o

(ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 7.

En otra forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 11 y/o (ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 13. En otra forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende una molécula de ácido nucleico aislada capaz de hibridarse en condiciones muy restrictivas con, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 11 y/o (ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 13.

En otra forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 5 y (ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 13. En otra forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende una molécula de ácido nucleico aislada capaz de hibridarse en condiciones muy restrictivas con, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 5 y (ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 13.

En otra forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 11 y (ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 7. En otra forma de realización específica, la secuencia nucleotídica que codifica una proteína del FVIII comprende una molécula de ácido nucleico aislada capaz de hibridarse en condiciones muy restrictivas con, al menos, uno de (i) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 11 y (ii) la secuencia nucleotídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 7.

La presente invención además proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de la invención o una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido del FVIII modificado de la invención.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una célula huésped transfectada con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que permite la expresión de una proteína del FVIII o un polipéptido del FVIII modificado de la invención.

La presente invención además proporciona un organismo transgénico no humano que expresa la proteína del FVIII de la invención y, particularmente, un organismo seleccionado a partir de un microorganismo, un animal no humano o una planta y, más particularmente, un mamífero.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que comprenda una proteína del FVIII como se presenta en la invención y, particularmente, una composición farmacéutica o una composición liofilizada, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la producción de una proteína del FVIII según la invención y que comprenda los pasos de cultivar una célula huésped transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico de la invención o con una molécula de ácido nucleico codificando una proteína del FVIII de la invención y aislando de la célula huésped y/o del medio de cultivo, la proteína del FVIII resultante de la expresión de la molécula de ácido nucleico.

La presente invención también proporciona el uso de una proteína del FVIII según la invención para el tratamiento de una enfermedad hemorrágica, particularmente una enfermedad caracterizada por una deficiencia del FVIII, más particularmente hemofilia A y hemofilia A adquirida.

En una forma de realización específica, la invención proporciona el uso de una proteína del FVIII de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar la hemofilia A o la hemofilia A adquirida así como un procedimiento para tratar la hemofilia A en un paciente, que comprende la administración de una cantidad eficaz para la coagulación de la proteína del FVIII según la invención a un paciente que la necesita.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Entrada sensible a la manosa del FVIII en las células dendríticas (CD).

(A)

Las CD se preincubaron con 5mM de EDTA, 1mg/ml de manano o 1 mg/ml de D–galactosa durante 30 minutos a 37 °C, antes de la adición de FVIII (40 ¥g/ml) durante 2 horas. Los valores informados representan una asimilación de antígenos relativa definida como [(37 °CMFIinh – 4 °CMFImedio)/(37 °CMFImedio – 4 °CMFImedio)]x100, en la que “MFIinh” representa la MFI detectada en la presencia del inhibidor. Los resultados son de 12 donantes y la importancia estadística se calculó a partir de datos no procesados, utilizando el test de Student.

(B)

La inhibición de la endocitosis en CD mediante manano. La preincubación de CD con manano (1 mg/ml) fue seguida por la adición de dextrano–FITC (50 ¥g/ml) o amarillo de Lucifer (200 ¥g/ml) durante 2 horas.

Figura 2: La entrada sensible a la manosa del FVIII mediante CD provoca la presentación de péptidos derivados del FVIII a los linfocitos T + CD4 específicos del FVIII.

(A)

Se incubaron CD generadas a partir de donantes sanos DRB1*1501/DRB5*01 (10000 células/pocillo) en un medio solo o en presencia de manano (1 mg/ml) o anti–CD206 IgG (10 ¥g/ml) seguida de la incubación con el clon D9E9 del linfocito T específico del FVIII (5000 células/pocillo) en presencia de dosis variables del FVIII (5,56; 2,78 ó 1,39 ¥g/ml) y 20 U/ml rhIL–2 durante 20 horas a 37 °C. Se evaluó la activación del linfocito T mediante la liberación de IFN–gamma en el sobrenadante del cultivo. Los resultados son de un experimento representativo de 3 a 8 experimentos independientes. Las producciones de IFN–gamma variaron con las diferentes partidas de D9E9 y las diferentes fuentes de CD donantes utilizadas en experimentos por separado.

(B)

Se preincubaron CD generadas a partir de donantes que encajan con MHC II con manano (1 mg/ml) o IgG anti– CD206 (10 ¥g/ml) seguidas de la adición del FVIII (5,56 ¥g/ml) o péptido I2144–T2161 (del identificador de secuencia Nº: 9) (2¥g/ml) y D9E9. Para cada tratamiento, la producción de IFN–gamma se representó en relación al valor máximo obtenido en cada experimento individual (*: P<0,0001, según la evaluación utilizando la prueba de Mann–Whitney). Los resultados son de 3 experimentos independientes.

(C)

Las líneas celulares LE2E9 y BO2C11 B que encajan con HLA específicas del FVIII humano o las CD se incubaron en presencia del FVIII (10 ¥g/ml) y D9E9.

Figura 3: Los residuos de manosa esperados ubicados por fuera del dominio B tienen una función importante en la endocitosis del FVIII mediante CD que conducen a la activación de los linfocitos T.

(A)

Las CD se preincubaron con manano (1, 5, 10, 100 y 1000 ¥g/ml) antes de la adición del FVIII (40 ¥g/ml 143 nM, círculos completos) y BDD–FVIII (24,31 ¥g/ml, 143 nM, círculos vacíos) o dextrano–FITC (50 ¥g/ml). Se analizó la asimilación de los antígenos mediante citometría de flujo. Se calculó el porcentaje de la inhibición para cada condición con respecto a la condición sin manano. Representativo de dos experimentos individuales.

(B)

Se separó el BDD–FVIII nativo o tratado con EndoF1 (3,7 ¥g/ml) mediante SDS–PAGE al 7,5% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas transferidas se revelaron utilizando Protogold® o después de la incubación con 10 ¥g/ml de CTLD4–7–Fc utilizando una anti–IgG humana conjugada con fosfatasa alcalina. La cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CP) se identificaron a partir de la transferencia por adsorción con IgG anti FVIII monoclonales específicas de las CP y CL (no disponibles).

(C)

Reducción de la activación de linfocitos T en el tratamiento con EndoF1 de BDD–FVIII. Los resultados representan un modelo de 3 experimentos independientes. Las producciones de IFN–gamma variaron con las diferentes partidas de D9E9 y con las diferentes fuentes de CD humanas utilizadas en los diferentes experimentos. Para realizar una comparación estadística de los tres grupos de experimentos, se normalizó la producción de IFN–gamma con respecto al valor máximo obtenido en cada experimento individual. Las diferencias en los niveles normalizados de la activación de linfocitos T fueron estadísticamente significativas entre “medio” y “tratadas con EndoF1”, según la evaluación durante ANOVA y la prueba PSLD de Fisher (P<0,0001, datos no disponibles).

Figura 4: Activación de un clon de los linfocitos T específicos del FVIII (D9E9) mediante una cadena ligera del FVIII silvestre o mutante.

(A)

y (B) Confirmación de una entrada de CD sensibles a la manosa de la cadena ligera silvestre del FVIII que conduce a la activación de linfocitos T. La cadena ligera purificada derivada del plasma del FVIII (CL silvestre) se trató con Endo– F1. La CD silvestre, la cadena ligera silvestre en presencia del manano (1 mg/ml) y la cadena ligera silvestre tratada con EndoF1 se añadieron posteriormente a las CD (panel A) o a un clon de las células B específicas del FVIII (BO2C11, panel B) y cultivadas en forma conjunta con las células D9E9 durante 20 horas. Se evaluó la activación de D9E9 midiendo el IFN–gamma en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA.

(C)

y (D) Pérdida de activación de D9E9 a partir de la mutagénesis dirigida de la cadena ligera del FVIII. El clon de las células B BO2C11 B y las CD derivadas de monocitos se incubaron con D9E9 en presencia de la CL silvestre (panel C)

o en presencia de la CL Asn2118Ala mutada (panel D). La sustitución de Asn2118 por un residuo de Ala extrae un sitio para la manosilación N. La activación de D9E9 se evaluó después de 20 horas midiendo el IFN–gamma en el sobrenadante del cultivo.

Figura 5: Representación esquemática de la estructura completa del FVIII.

El FVIII humano heterodimérico completo (del identificador de secuencia Nº: 2) está formado por 2.332 aminoácidos e incluye una “cadena pesada” que corresponde a los residuos 1 a 1.648 y que contiene los dominios A1–a1–A2–a2–B y una “cadena ligera” que corresponde a los residuos 1.649 a 2.332 y que contiene los dominios a3–A3–C1–C2 (la numeración de los residuos de los aminoácidos se refiere a la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 2). La molécula de FVIII contiene 25 secuencias de consenso (Asn–Xxx–Thr/Ser) que permiten la glicosilación ligada a N, 20 de las cuales han demostrado ser glicosiladas (1).

Figura 6: Secuencia aminoacídica del FVIII humano completo nativo (según lo establecido en el identificador de secuencia Nº: 1)

La secuencia aminoacídica subrayada corresponde al péptido de señal que contiene los primeros 19 aminoácidos del FVIII humano completo nativo. La numeración clásica de los aminoácidos del FVIII humano heterodimérico completo (del identificador de secuencia Nº: 2) se inicia con el residuo de alanina ubicado en la posición 20. Los residuos de aminoácidos en negrita corresponden a los sitios de glicosilación de consenso que se modifican preferentemente en una forma de realización de la presente invención.

El dominio B corresponde a la secuencia aminoacídica que va desde la posición 760 a la posición 1.667 de la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 1 y presentada en la figura 6.

La cadena ligera nativa utilizada como control en el ejemplo 6 y a la que se hace referencia como “la cadena ligera derivada del plasma purificada del FVIII” corresponde a la secuencia aminoacídica que va desde la posición 1.668 a la posición 2.351 de la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 1 y presentada en la figura

6.

La cadena pesada del FVIII humano nativo corresponde a la secuencia aminoacídica que va desde la posición 19 a la posición 759 de la secuencia aminoacídica establecida en el identificador de secuencia Nº: 1 y presentada en la figura 6.

Figura 7: BDD (con el dominio B eliminado) – FVIII humano.

El dominio B del factor VIII demostró no ser imprescindible para la actividad procoagulante. La figura 7 muestra la secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica correspondientes al FVIII humano con el dominio B eliminado obtenido cuando el dominio B se elimina del FVIII humano completo establecido en el identificador de secuencia Nº: 2. La secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica se unen para que cada aminoácido (en la parte superior) esté frente al codón de ácido nucleico correspondiente (en la parte inferior). La secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica correspondientes al FVIII humano con BDD se numeran independientemente una de la otra (la numeración se presenta a la derecha de las secuencias). La secuencia aminoacídica del FVIII humano con BDD presentada en la figura 7 corresponde a la secuencia establecida en el identificador de secuencia Nº: 4. La secuencia nucleotídica del FVIII humano con BDD presentada en la figura 7 corresponde a la secuencia establecida en el identificador de secuencia Nº: 3. Los residuos de aminoácidos (o los correspondientes residuos de ácido nucleico) en negrita corresponden a los sitios de glicosilación de consenso que se modifican preferentemente en una forma de realización de la presente invención. El carácter “*” se coloca por encima del codón de terminación.

Figura 8: Cadena pesada del FVIII humano modificada por la sustitución de Asn con Ala en la posición 239 (con referencia a la secuencia del FVIII humano completo establecida en el identificador de secuencia Nº: 2)

La figura 8 presenta la secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica correspondientes a la cadena pesada modificada del FVIII humano implementada en una forma de realización particular de la presente invención. La secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica se unen para que cada aminoácido (en la parte superior) esté frente al codón de ácido nucleico correspondiente (en la parte inferior). La secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica correspondientes a la cadena pesada modificada del FVIII humano se numeran independientemente una de la otra (la numeración se presenta a la derecha de las secuencias). La secuencia aminoacídica de la cadena pesada modificada del FVIII humano presentada en la figura 8 corresponde a la secuencia establecida en el identificador de secuencia Nº:

6. La secuencia nucleotídica de la cadena pesada modificada del FVIII humano presentada en la figura 8 corresponde a la secuencia establecida en el identificador de secuencia Nº: 5. El residuo de aminoácidos (alanina) (o el correspondiente codón de ácido nucleico) en negrita corresponde al sitio de glicosilación (Asn 239) que se modificó en una forma de realización de la presente invención.

Figura 9: Cadena ligera del FVIII humano modificada por la sustitución de Asn con Ala en la posición 2118 (con referencia a la secuencia del FVIII humano completo establecida en el identificador de secuencia Nº: 2)

La figura 9 presenta la secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica correspondientes a la cadena ligera modificada del FVIII humano implementada en una forma de realización particular de la presente invención. La secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica se unen para que cada aminoácido (en la parte superior) esté frente al codón de ácido nucleico correspondiente (en la parte inferior). La secuencia aminoacídica y la secuencia nucleotídica correspondientes a la cadena ligera modificada del FVIII humano se numeran independientemente una de la otra (la numeración se presenta a la derecha de las secuencias). La secuencia aminoacídica de la cadena ligera modificada del FVIII humano presentada en la figura 8 corresponde a la secuencia establecida en el identificador de secuencia Nº: 8. La secuencia nucleotídica de la cadena ligera modificada del FVIII humano presentada en la figura 8 corresponde a la secuencia establecida en el identificador de secuencia Nº: 7. El residuo de aminoácidos (alanina) (o el correspondiente codón de ácido nucleico) en negrita corresponde al sitio de glicosilación (Asn 2218) que se modificó en una forma de realización de la presente invención.

Figura 10: producción de IgG anti–FVIII en un ratón mediante una cadena ligera del FVIII silvestre o mutante.

La cadena ligera derivada del plasma purificada del FVIII humano (wtCL) y la CL mutada del FVIII (CL de Asn2118Ala) se inyectaron (0,2 µg de proteína en 200 IL de PBS) por vía intravenosa a ratones con deficiencia de FVIII cuatro veces en intervalos semanales. Una semana después de la cuarta inyección, se extrajo la sangre de los ratones y se analizaron los niveles de IgG anti FVIIIutilizando un ELISA específico para FVIII. El suero de los ratones diluido 1 en 90 se incubó en una placa de ELISA revestida con FVIII humano.(Recombinate, Baxter) Se revelaron IgG unidas utilizando una IgG anti–murino acoplada con peroxidasa y su sustrato (OPD). Se midió la intensidad de la unión mediante densidad óptica a 492 mm con un espectrómetro (Tecan Genyos).

Figura 11: representación esquemática de tres tipos de estructura tipo glucanos terminadas con residuos de manosa

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “proteína del FVIII” se refiere a una molécula de aminoácido que comprende, al menos, un polipéptido del FVIII pero que no se limita a este polipéptido. Por lo tanto, el polipéptido del FVIII de la invención representa, al menos, aproximadamente el 50%, preferentemente el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% del contenido de aminoácidos de la proteína del FVIII de la invención. Si la proporción del polipéptido del FVIII en la proteína del FVIII difiere un 100%, la proteína del FVIII puede contener cualquier secuencia aminoacídica, tal que la proteína del FVII debería considerarse como una proteína quimérica. Las secuencias aminoacídicas adicionales comprendidas en la proteína del FVIII se pueden ligar ya sea covalentemente o no covalentemente al polipéptido del FVIII y podrían corresponder u originarse desde cualquier polipéptido sintético o natural. Estas secuencias aminoacídicas adicionales podrían actuar como enzimas o proteínas activas, secuencias señal para el traslado, traslocación, exportación y secreción celular, o podrían funcionar como secuencias de reconocimiento para otras enzimas y/o proteínas de procesamiento.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "polipéptido del FVIII” se refiere a un polipéptido que tiene actividad de coagulación y similar perfil de activación de la trombina en comparación con el factor VIII humano completo del identificador de secuencia Nº 2 y tiene, al menos, aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% de identidad a las regiones 1–740 y 1689–2332 de la secuencia polipéptida representada por el identificador de secuencia Nº 2. En particular, se entiende que diversas mutaciones y cambios conservativos en los aminoácidos se pueden tolerar, así como determinados cambios no conservativos en los aminoácidos, siempre que el factor VIII variante tenga actividad de coagulación. También se permiten (y prefieren) fragmentos y determinadas glicosilaciones; es más, se permiten cambios en el polipéptido del factor VIII siempre que el polipéptido mantenga su actividad específica.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "polipéptido del FVIII” también se refiere a un polipéptido que tiene actividad de coagulación y similar perfil de activación de la trombina en comparación con el factor VIII humano completo del identificador de secuencia Nº 2 y tiene, al menos, aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% de identidad al factor VIII humano completo del identificador de secuencia Nº 2. En particular, se entiende que diversas mutaciones y cambios conservativos en los aminoácidos se pueden tolerar, así como determinados cambios no conservativos en los aminoácidos, siempre que el factor VIII variante tenga actividad de coagulación. También se permiten (y prefieren) fragmentos y determinadas glicosilaciones; es más, se permiten cambios en el polipéptido del factor VIII siempre que el polipéptido mantenga su actividad específica.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el "polipéptido del FVIII modificado”, puede contener cualquier número de aminoácidos o alteraciones de aminoácidos en la región nativa, completa o no crítica de BDD–FVIII, incluyendo las sustituciones y/o inserciones y/o supresiones en cualquier otra región de la molécula del polipéptido, siempre que la variante del polipéptido incluya una secuencia que es, al menos, aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a, al menos, aproximadamente la secuencia polipéptida 1–740 y/o 1689–2332 del identificador de secuencia Nº 2 y la presencia de las modificaciones no impiden la actividad del FVIII variante.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "polipéptido del FVIII modificado” incluye las secuencias aminoacídicas con una homología en la secuencia de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 100% a la secuencia de referencia indicada; es decir, al factor VIII humano completo del identificador de secuencia Nº:

2.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "modificado" se refiere a las moléculas con algunas diferencias en sus secuencias aminoacídicas en comparación con un polipéptido de referencia (por ejemplo, secuencia del factor VIII completo). Las alteraciones de los aminoácidos pueden ser sustituciones, inserciones, supresiones o cualquier combinación deseada de dichos cambios en una secuencia aminoacídica nativa o completa. Las sustituciones pueden ser únicas, en las que sólo se sustituye un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en las que se sustituyen dos o más aminoácidos en la misma molécula.

Para mejorar o alterar las características del polipéptido del FVIII de la presente invención, se debe emplear ingeniería de aminoácidos. La tecnología del ADN recombinante conocida por los expertos en la materia se puede utilizar para crear nuevos polipéptidos mutantes incluyendo únicas o múltiples sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos o proteínas de fusión. Dichos polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, un aumento o disminución de la actividad o aumento o disminución de la estabilidad. Además, pueden ser purificados en producciones más altas y mostrar una mejor solubilidad que el correspondiente polipéptido natural, al menos en determinadas condiciones de purificación y almacenamiento.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “polipéptido” incluye no sólo las moléculas de las proteínas completas sino también fragmentos de las mismas que, por sí mismas o con otros fragmentos, generan actividad procoagulante del FVIII en un ensayo de coagulación. Se apreciará que los polipéptidos sintéticos de las nuevas proteínas de la presente invención se encuentren también dentro del alcance de la invención y que se puedan fabricar según los procedimientos sintéticos estándar. También se apreciará que en el sistema de numeración de aminoácidos utilizado en este documento, el residuo del aminoácido 1 sea el primer residuo de la proteína del FVIII nativa y madura. Y asimismo se apreciará que el término “dominio” se refiera a las regiones aproximadas del FVIII, conocidas por los expertos en la materia.

Los símbolos de aminoácidos utilizados en la presente solicitud incluyen los siguientes: En toda la solicitud, se usan abreviaturas de una o tres letras para los aminoácidos. Estas abreviaturas se pueden utilizar indistintamente y tienen el siguiente significado: A o Ala=alanina; R o Arg=arginina; N o Asn=asparragina; D o Asp=ácido aspártico; C o Cys=cisteína; Q Gln=glutamina; E o Glu=ácido glutámico; G o Gly=glicina; H o His=histidina; I o Ile=isoleucina; L o Leu=leucina; K o Lys=lisina; M o Met=metionina; F o Phe=fenilalanina; P o Pro=prolina; S o Ser=serina; T o Thr=treonina; W o Trp=triptófano; Y o Tyr=tirosina y V o Val=valina.

Además, como se usa en la presente memoria descriptiva “la modificación del polipéptido del FVIII modificado” no está limitada al número o posición exacta indicados, siempre que se logre la misma función y resultado. Pocas posiciones de aminoácidos se pueden introducir, añadir o eliminar de los extremos terminales N o C o de cualquier otra parte del factor VIII humano completo, siempre que se mantenga la actividad funcional (como el corte de trombina) o las funciones procoagulantes. También incluidas en el alcance de la invención se encuentran las proteínas o fragmentos o derivados de las mismas que exhiben la misma o similar actividad biológica y derivados que se modifican en forma diferencial durante o después de la traducción. Es decir, mediante glicosilación, escisión proteolítica, ligamiento a una molécula de un anticuerpo u otro ligando celular y así sucesivamente.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “fragmento” se refiere a una parte de un polipéptido, que mantiene las características utilizables y funcionales. Por ejemplo, como se usa en el contexto de la presente invención, el fragmento del polipéptido del factor VIII tiene la función de coagular la sangre.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, una proteína con actividad procoagulantes del factor VIII es una proteína que causa la activación del factor X en sistemas de modelos in vitro, ex vivo o in vivo. Como ejemplos no limitantes, esta definición incluye el factor VIII humano recombinante completo y factor VIII con el dominio B eliminado. Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos FVIII “activo al procoagulante” y “activo” se pueden usar indistintamente para hacer referencia a uno o más polipéptidos o proteínas que muestran actividad procoagulante en un ensayo de coagulación. El término FVIII se puede usar en la presente memoria descriptiva para incluir FVIIIa, y un experto en la materia apreciará del contexto en que se usan los términos a qué término (FVIII activado mediante pre– trombina FVIII o FVIII activado mediante trombina (FVllla)) se hace referencia.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “estructura tipo glucano terminada con el polipéptido del FVIII desglicosilado con residuos de manosa” se refiere a un polipéptido del FVIII o un polipéptido del FVIII modificado sin una

o más estructura tipo glucanos terminadas con residuos de manosa.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “estructura tipo glucano terminada en residuos de manosa” se refiere a una estructura tipo glucano de un sitio de la glicosilación terminada con uno o más residuos de manosa lejos de la columna vertebral del polipéptido. Dicho residuo de manosa se denomina residuo de manosa terminal. El término “estructura tipo glucano terminada en residuos de manosa” incluye una estructura tipo glucano mono y multi–antenaria con uno o más residuos de manosa lejos de la columna vertebral del polipéptido, más particularmente el término “estructura tipo glucano terminada en residuos de manosa” incluye la estructura tipo glucano de tipo oligomanosa (figura 11).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “residuo de manosa terminal” se refiere a un residuo de manosa lejos de la columna vertebral del polipéptido que termina una antena de una estructura tipo glucano en un sitio de la glicosilación (figura 11).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “capaz de hibridar en condiciones muy restrictivas” significa fijar una cadena de ADN complementario al ADN de interés en condiciones muy restrictivas. Del mismo modo, “capaz de hibridar en condiciones poco restrictivas” se refiere a fijar una cadena de ADN complementario al ADN de interés en condiciones poco restrictivas. “Condiciones restrictivas” para el proceso de fijado puede significar, por ejemplo, alta temperatura y/o bajo contenido de sal, que no favorece los contactos de puentes de hidrógeno entre los pares de bases mal apareadas. “Condiciones poco restrictivas” podría significar temperaturas más bajas y/o mayor concentración de sal que la de las condiciones muy restrictivas. Estas condiciones permiten que dos cadenas de ADN se fijen si hay total complementariedad sustancial aunque no cercana entre las dos cadenas, como es el caso entre las cadenas de ADN que codifican la misma proteína pero difieren en la secuencia debido a la degeneración del código genético. Las condiciones restrictivas apropiadas que promueven la hibridación del ADN, por ejemplo, 6*SSC a aproximadamente 45[deg.] C., seguida de un lavado de 2*SSC a 50[deg.] C. son conocidas por los expertos en la materia o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.31–6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar entre una condición restrictiva baja de aproximadamente 2*SSC a 50[deg.] C. y una condición restrictiva alta de aproximadamente 0,2*SSC a 50[deg.] C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentar de una condición restrictiva baja a temperatura ambiente, aproximadamente 22[deg.] C., a condiciones restrictivas altas, a aproximadamente 75[deg.] C. Otros parámetros restrictivos se describen en Maniatis, T., y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N,Y., (1982), en las páginas. 387–389; consulte también Sambrook J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N.Y. en las páginas 8.46–8.47 (1989).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “vehículos” incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores no tóxicos para la célula o mamífero expuestos en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución acuosa amortiguadora de pH. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitaciones, soluciones amortiguadoras como fosfato, citrato y demás ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) polipéptido; proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y demás hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes de quelación como EDTA; alcoholes de azúcar como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales como por ejemplo sodio y/o tensioactivos no iónicos como por ejemplo TWEEN(R), polietilenglicol (PEG) y PLURONICS(R).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “cantidad eficaz” es la cantidad suficiente para obtener resultados clínicos o bioquímicos beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz se puede administrar una o más veces. Para los propósitos de esta invención, una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir o retrasar la progresión de la enfermedad. En una realización preferente de la invención, la “cantidad eficaz” se define como una cantidad de compuesto capaz de efectuar la coagulación de la sangre.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “células huésped” incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido receptora de un vector de esta invención. Las células huésped incluyen la progenie de una célula huésped única. La progenie no necesariamente deber ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula parenteral original debido a una mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Una célula huésped incluye las células transfectadas o infectadas in vivo o ex vivo con un vector que comprende un polinucleótido que codifica un factor angiogénico.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “purificadas” o “aisladas” se refiere a las moléculas biológicas que se extraen de su entorno natural y se aíslan o separan y no están unidas a ningún componente con el que naturalmente están asociadas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “tratamiento” es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, no peor) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación de la enfermedad y remisión (parcial o total), si se detecta o no. “Tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento alguno. El “tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como las medidas profilácticas o preventivas. Entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen aquéllas que ya tienen la enfermedad así como las que deben tomar medidas para prevenirla. “Paliar” una enfermedad significa que el alcance y/o manifestaciones clínicas no deseadas de la enfermedad disminuyen y/o el transcurso del tiempo de la progresión es más lento o va creciendo, en comparación con una situación sin tratamiento.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “vector”, “vector polinucleótido”, “construcción” y “construcción polinucleótida” se usan indistintamente en este documento. Un vector polinucleótido de esta invención puede ser tener numerosas formas, incluyendo, pero sin limitarse a, ARN, ADN, ARN encapsulado en un recubrimiento retroviral, ADN encapsulado en un recubrimiento de adenovirus, ADN dentro de otra forma vírica o similar (como herpes simple y adenovirus asociado (AAV)), ADN encapsulado en liposomas, ADN complejo con polilisina, complejo con moléculas policatiónicas sintéticas, complejo con compuestos como polietilenglicol (PEG) hasta "enmascarar" inmunológicamente la molécula y/o aumentar su semivida o conjugado a una proteína no vírica. Preferentemente, el polinucleótido es el ADN.

En la elección de una célula hospedadora preferente para la transfección con los vectores de la invención que comprenda secuencias de ADN que codifican ambos derivados del FVIII y, por ejemplo, la proteína dihidrofolato– reductasa (DHFR), es apropiado seleccionar el huésped según el tipo de proteína DHFR empleado. Si se emplea una proteína DHFR silvestre, es preferible seleccionar una célula hospedadora que sea deficiente en DHFR, permitiendo así el uso de la secuencia que codifica la DHFR como un marcador para una correcta transfección en un medio selectivo que carece de hipoxantina, glicina y timidina. Por otro lado, si se usa una proteína DHFR con una afinidad de unión baja al metotrexato (MTX) como la secuencia reguladora, no es necesario usar células resistentes al DHFR. El mutante DHFR es resistente al MTX; por lo tanto, se pueden usar medios con MTX como un medio de selección, siempre que las células hospedadoras sean sensibles al MTX. Alternativamente, se puede utilizar un gen de DHFR silvestre como marcador de amplificación en una célula huésped que no es deficiente en DHFR siempre que se utilice un segundo marcador de selección del fármaco, como resistencia a la higromicina. Los ejemplos enumerados describen el uso de células CHO (células CHO–DBX11) resistentes al MTX como células huésped y sobre vectores que emplean el promotor CMV y SV40 como secuencias reguladoras para conducir el “on” de los derivados del FVIII y DHFR, respectivamente. Otros marcadores de selección incluyen genes que dan resistencia a los fármacos, como neomicina, higromicina y metotrexato.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “ADN” incluye no sólo las bases A, T, C y G sino que incluye sus análogos o formas modificadas de estas bases, como nucleótidos metilados, modificaciones entre nucleótidos como ligamientos no cargados y tioatos, uso de análogos de azúcar y estructuras de la columna vertebral modificadas y/o alternativas, como poliamidas.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que se hibrida en condiciones restrictivas de hibridación a una porción de una molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente. Los polinucleótidos de hibridación son útiles como sondas y cebadores, como se analiza anteriormente. Porciones de un polinucleótido que se hibrida a un polipéptido del FVIII que codifica una secuencia, que puede estar claramente especificada por las posiciones de base de 5' y 3' o por diámetro en las bases de los nucleótidos como se describe anteriormente o claramente excluidos de la misma manera. Del mismo modo, las porciones de un polinucleótido que se hibridan al polipéptido del FVIII, que también se pueden utilizar como sondas y cebadores. Los polinucleótidos de hibridación preferentes de la presente invención son aquéllos que, cuando se etiquetan y utilizan en un ensayo de hibridación conocido en la técnica (por ejemplo, análisis de transferencia Northern y Southern), muestran la mayor concentración de señales independientemente de las demás secuencias heterólogas presentes en cantidades equimolares.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las secuencias nucleotídicas modificadas incluyen aquéllas producidas por sustituciones, supresiones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, supresiones o adiciones pueden incluir uno o más nucleótidos. Las alteraciones en la secuencia aminoacídica pueden producir sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Especialmente preferentes entre éstas se encuentran las sustituciones, adiciones y supresiones imperceptibles que no alteran las propiedades y actividades de los polipéptidos de la presente invención o porciones de los mismos. También preferentes en este aspecto son las sustituciones conservativas.

La invención permite el uso de secuencias en vectores de expresión así como la transfección de células huésped y líneas celulares, ya sean células procariotas o eucariotas. La invención también permite la purificación de los polipéptidos expresados a partir del vector de expresión. El vector de expresión puede contener diversas marcas moleculares para una fácil purificación. La construcción de la expresión obtenida posteriormente se puede transformar en cualquier célula huésped de elección. Los lisados celulares a partir de las células huésped se aíslan mediante procedimientos conocidos en la técnica.

En una forma de realización específica, los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias que codifican la proteína del FVIII o el polipéptido del factor VIII modificado se administran para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con una expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención, mediante una terapia génica. Una terapia génica se refiere a una terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta forma de realización de la invención, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que media un efecto terapéutico.

Cualquiera de los procedimientos para la terapia génica disponibles se pueden utilizar según la presente invención. En un aspecto preferente, las secuencias nucleotídicas pueden codificar un polipéptido del factor VIII, en el que las secuencias nucleotídicas son parte de los vectores de expresión que expresan los polipéptidos en un huésped adecuado. En particular, dichas secuencias nucleotídicas tienen promotores enlazados operativamente al polipéptido que codifica la región. Dicho promotor es inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico del tejido. En otra forma de realización particular, las moléculas de ácido nucleico se usan en las que el polipéptido que codifica las secuencias y cualquier secuencia deseada son flanqueadas por las regiones que promueven la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, de este modo proporcionando la expresión entre cromosomas de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo. La administración de ácidos nucleicos a un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente está directamente expuesto al ácido nucleico o a los vectores que transportan el ácido nucleico o indirecta, en cuyo caso las células primero se transforman con los ácidos nucleicos in vitro y luego se trasplantan al paciente. Estos dos enfoques son conocidos, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.

En una forma de realización específica, las secuencias nucleotídicas se administran directamente in vivo, donde se expresan para producir el producto codificado. Esto se puede lograr mediante numerosos procedimientos conocidos en la técnica; por ejemplo, mediante su construcción como parte del correspondiente vector de expresión del ácido nucleico y mediante su administración para que se conviertan en intracelulares; por ejemplo, mediante la infección de retrovirales defectuosos o atenuados o demás vectores víricos o mediante la inyección directa del ADN desnudo o mediante el recubrimiento con lípidos o receptores en la superficie celular o agentes de transfección, encapsidación en liposomas, micropartículas o microcápsulas o mediante su administración en ligamiento a un péptido que se introduce en el núcleo, mediante su administración en ligamiento a un ligando sujeto a una endocitosis mediada por el receptor (que se puede utilizar para determinar la diana de los tipos de células que expresan específicamente los receptores) y así sucesivamente.

Alternativamente, el ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar en el ADN de la célula huésped para la expresión, mediante recombinación homóloga. En una forma de realización específica, se utilizan los vectores víricos que contienen secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido. Las secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido a utilizarse en la terapia génica se clonan en uno o más vectores, lo que facilita la administración del gen al paciente. Los vectores retrovirales, vectores adenovirus y adenovirus asociados son ejemplos de vectores víricos que se pueden utilizar. Los vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el adecuado empaque del genoma vírico e integración en el ADN de la célula huésped.

Otro enfoque a la terapia génica implica la transferencia de un gen a las células del cultivo de tejidos mediante procedimientos como la electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Por lo general, el procedimiento para la transferencia incluye la transferencia de un marcador de selección a las células. Las células se colocan luego en selección para aislar aquellas células que se han asimilado y expresan el gen transferido. Dichas células se administran luego al paciente. En esta forma de realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción se puede realizar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, la transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector bacteriófago o vírico que contiene las secuencias nucleotídicas, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. Existen numerosas técnicas conocidas para la introducción de genes extraños en las células y que se pueden utilizar según la presente invención, siempre que no se interrumpan las funciones de fisiología y de desarrollo necesarias de las células receptoras. La técnica debería proporcionar una transferencia estable del ácido nucleico a la célula para que el ácido nucleico se pueda expresar mediante la célula y, preferentemente, se pueda heredar y expresar mediante la progenie celular.

Las células a las que se les puede introducir un ácido nucleico para los propósitos de la terapia génica incluyen todo tipo de células deseadas, disponibles e incluye, sin limitarse a, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitas, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas como por ejemplo linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas; por ejemplo, las obtenidas a partir de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, resto de hígado, etc.

En una forma de realización, la presente invención se refiere al tratamiento para las enfermedades de coagulación de la sangre. De esta manera, el compuesto terapéutico de la invención se puede administrar a pacientes humanos que padecen o son propensos a padecer la enfermedad suministrando compuestos que estimulan la coagulación de la sangre. En particular, la enfermedad puede ser hemofilia, en particular, hemofilia A. la formulación de los compuestos terapéuticos es generalmente conocida en la técnica y se puede hacer referencia a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., EE. UU.

Se puede ajustar el régimen de dosificación para proporcionar una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar numerosas dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según las exigencias de la situación terapéutica. El compuesto activo se puede administrar de una manera conveniente como por ejemplo por vía oral, intravenosa (soluble en agua), intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica o como supositorio o mediante el implante (por ejemplo, usando moléculas de liberación lenta por vía intraperitoneal o usando células como monocitos o células dendríticas sensibilizadas in vitro y transferidas al receptor). Dependiendo de la vía de administración, la proteína del FVIII o el polipéptido del FVIII modificado pueden necesitarse para su revestimiento en un material que lo proteja de la acción de las enzimas, ácidos y demás condiciones naturales que pueden inactivar dichos ingredientes.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones inyectables estériles o dispersión. En todos los casos, la forma debe ser estéril y fluida al punto de su fácil aplicación en la jeringa. Debe estar estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse de la acción contaminante de los microorganismos como por ejemplo bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, etc.), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Se puede mantener una adecuada fluidez, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como por ejemplo lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos la puede ocasionar diversos agentes antibacterianos y antifúngicos; por ejemplo, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos; por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La prolongada absorción de composiciones inyectables puede estar ocasionada por el uso en la composición de agentes que retrasan la absorción; por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los procedimientos preferentes para la preparación son las técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada y estéril del mismo.

Si los péptidos están adecuadamente protegidos como se describe anteriormente, el compuesto activo se puede administrar por vía oral; por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable o se puede encerrar en una cápsula de gelatina blanda o dura o se puede comprimir en comprimidos o se pueden incorporar directamente con la comida de la dieta. Para la administración terapéutica por vía oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas y similares pueden también contener lo siguiente: Un aglutinante como goma adragante o arábiga, almidón de maíz o gelatina, excipientes como fosfato bicálcico; un desintegrador como almidón de maíz, fécula de patata, ácido algínico y similares; un lubricante como estearato de magnesio y un edulcorante como sacarosa, lactosa o sacarina pueden añadirse o un aromatizante como menta negra, aceite de la gaulteria o aromatizante de cereza. Si la forma de la unidad de dosificación es una cápsula, puede contener además materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o, de otro modo, para modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas se pueden recubrir con goma laca, azúcar o ambas. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como edulcorante, metil y propilparabeno como conservantes, un tinte y aromatizantes como aroma a cereza o naranja. Por supuesto, todo material utilizado en la preparación de la forma de la unidad de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede estar incorporado en las preparaciones y formulaciones de liberación controlada.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier disolvente, medio dispersante, recubrimientos, agentes antifúngicos y antibacterianos, agentes isotónicos y dilatorios de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para los principios activos farmacéuticos es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que los medios o agentes convencionales no son compatibles con el ingrediente activo, se permite el uso del mismo en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en la forma de la unidad de dosificación para la comodidad de la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de la unidad de dosificación como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a las unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos mamíferos que se deban tratar; cada unidad con una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación de las formas de las unidades de dosificación de la invención están dictadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas del material activo y el particular efecto terapéutico que se debe alcanzar y (b) las limitaciones propias de la preparación magistral de dicho material activo para el tratamiento de la enfermedad en sujetos vivos con una condición en las que su salud física se puede ver afectada.

El principal ingrediente activo se prepara para una administración eficaz y práctica en cantidades eficaces con un adecuado vehículo farmacéuticamente aceptable en la forma de la unidad de dosificación.

Se dice que una composición es “farmacológica o fisiológicamente aceptable” si un animal receptor puede tolerar su administración y si es adecuada para la administración en ese animal. Se dice que dicho agente se administra en una “cantidad terapéuticamente eficaz” si la cantidad administrada es fisiológicamente importante. Un agente es fisiológicamente importante si su presencia provoca un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor.

En una forma de realización particular, el cultivo celular de mamíferos es un procedimiento de expresar ADN exógeno para producir los derivados del FVIII humano funcional presentados en esta invención. En particular, las células de mamíferos comunes utilizadas para la producción de proteínas recombinantes, como por ejemplo líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñón de hámster bebé (BHKC), líneas celulares COS, HKB11 (híbrido de las células de riñón y B; ATCC # CRL–12568), COS–1 (ATCC CRL 1650) y línea celular de riñón canino Madin Darby (MDCK) son de interés especial. Los vectores de expresión para tales células incluyen normalmente (si fuera necesario) un origen de replicación, un promotor localizado delante del gen que se va a expresar, junto con cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitios de ayuste del ARN, sitio de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción.

Para usar en células de mamífero, las funciones reguladoras de los vectores de expresión se pueden suministrar en material vírico. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados derivan del factor 1 de elongación (EF–1), virus simio 40 (SV40) (15), citomegalovirus (CMV) (16) y promotor tardío principal del adenovirus 2 (17). Además, también es posible, y a menudo deseable, usar promotores o secuencias reguladoras asociadas normalmente con la secuencia del gen deseado, siempre que las secuencias reguladoras sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.

Los promotores celulares incluyen el promotor del gen kappa de ratón (18), el promotor de VH del ratón (19) y el promotor de la metalotioneína–I del ratón (20). Los vectores de expresión también pueden contener un conjunto de zonas de unión exón–intrón de ARN ubicadas río abajo a partir del promotor y río arriba a partir del sitio de inserción para la secuencia del FVIII. Las zonas de unión exón–intrón preferentes del ARN se pueden obtener a partir de adenovirus y/o genes de inmunoglobulina. Los vectores de expresión también pueden contener un conjunto de zonas de unión exón–intrón de ARN ubicadas en la secuencia del FVIII del ADNc. También en los vectores de expresión se encuentra una señal de poliadenilación ubicada río abajo del sitio de inserción. Las señales de poliadenilación particularmente preferentes incluyen la señal de poliadenilación temprana o tardía a partir de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación a partir de la región 5 Elb del adenovirus o terminador del gen de la hormona del crecimiento humano (21). Los vectores de expresión también pueden incluir una secuencia guía vírica no codificante, como por ejemplo el líder tripartito 2 del adenovirus ubicado entre el promotor y los sitios de empalme del ARN y las secuencias del intensificador como el intensificador SV40.

El FVIII modificado producido según la presente invención se puede purificar mediante cromatografía de afinidad en una columna de anticuerpos anti FVIII. Se puede lograr una purificación adicional mediante medios de purificación química convencionales como por ejemplo la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Otros procedimientos de purificación, incluyendo la precipitación de citrato de bario, son conocidos en la técnica y se puede aplicar a la purificación del nuevo FVIII modificado. El FVIII modificado sustancialmente puro puede tener usos farmacéuticos. Una vez que se purifica, parcialmente o hasta su homogeneidad según se desee, el FVIII modificado puede tener un uso terapéutico.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el péptido I2144–T2161 es un péptido sintético de identificador de secuencia Nº 9. Este péptido no es manosilado, así, el manano no tiene efecto sobre la endocitosis mediada por un receptor por las células presentadoras de antígenos (CPA), como células dendríticas (CD).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las células D9E9 son clones de células humanas CD4+ T específicas del FVIII desarrolladas por Marc Jacquemin (Ref Jacquemin Blood 2003). Estas células producen IFN–gamma cuando se las incuba con las células presentadoras de antígenos que han previamente endocitado el FVIII o el péptido derivado del FVIII I2144–T2161.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las células LE2E9 son clones de células humanas B específicas del FVIII desarrolladas por Marc Jacquemin (Ref Peerlinck Blood 1999). Estas células producen una IgG4 humana específica del FVIII que reconoce el dominio C1 del FVIII.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las células BO2C11 son clones de células humanas B específicas del FVIII desarrolladas por Marc Jacquemin (Ref Jacquemin Blood 1998). Estas células producen una IgG4 humana específica del FVIII que reconoce el dominio C2 del FVIII.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la molécula CTLD4–7Fc es una construcción quimérica que incluye los dominios 4 a 7 del receptor de manosa en macrófagos murinos (CD206). La molécula CTLD4–7Fc fue producida por Luisa Martínez–Pomares (Linehan 2001 Eur J Immunol).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las células dendríticas (CD) son células que presentan antígenos profesionales que se caracterizan por una variedad de marcadores de superficie específicos (CD1a, CD11c, HLA–DR, CD80, CD86, CD83, CD40, etc.) y funciones (endocitosis de antígenos, presentación de antígenos para los linfocitos T).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el anticuerpo anti CD206 PAM–1 es un anticuerpo específicamente dirigido contra el receptor de manosa en macrófagos humanos (CD206). Fue producido por P. Allavena (Laboratorio de inmunología celular, Instituto Mario Negri, Milan, Italia).

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 1, es decir, a la secuencia aminoacídica del factor VIII humano completo nativo que comprende el péptido de señal de 19 aminoácidos:

MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIA KPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQV LKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDR DAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLM DLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPK TWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDT LLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERD LASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDS LQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTA LLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNV SSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGT TAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSK LLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPS VWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESA RWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHEN NTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTA HFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHL TPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQE SSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETS NGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKT AFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEM KKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGE LNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFD CKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPS KAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWI KVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTH YSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVD FQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQS WVHQIALRMEVLGCEAQDLY

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 2, es decir, a la secuencia aminoacídica del factor VIII humano completo que no comprende el péptido de señal de 19 aminoácidos:

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEV YDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSY LSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYV NRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGM EAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLV LAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQR GNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIG AQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDS YEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGL SLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSN NLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKN VSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLI HDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQG PSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKET LIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQ TKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAI TQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAI LTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQ GTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESN HAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSP RSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEV EDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEK DVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIM DTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHL HAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQ GARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGC DLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQG VKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCE AQDLY

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia nucleotídica del identificador de secuencia Nº: 3; es decir, a la secuencia nucleotídica que codifica el factor VIII BDD humano.

GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTG TGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTG TAGAATTCACGGTTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAG GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTA TCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTT CCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTT ACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGA GAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAA AAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATG CACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGT GATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCC AGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGT TTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAA CTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTT GATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATT GCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTT GAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGA CTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATT ATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGG AGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTG ACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAG AGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAA TGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAA CGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCA ATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAG CACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCC TATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCA GACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGA CAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAGAAATAACTCGTACTACTCT TCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGA TGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCT GGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAA AGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACT CCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATT CCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTA ATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGG GCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAA CACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCA AAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTT AAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAA AGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACT GTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCA TCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGT GTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGAC AATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCC CTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGT TCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATT CCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTAT TGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATT TAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTA CCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAG GTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAG TAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTC TTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCA CCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGG GCTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGA

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 4; es decir, a la secuencia aminoacídica del factor VIII BDD humano:

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEV YDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSY LSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYV NRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGM EAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLV LAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQR GNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIG AQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDS YEDISAYLLSKNNAIEPREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMS SSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISY EEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQ VTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSN ENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASG HIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKW QTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASS YFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQW TLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia nucleotídica del identificador de secuencia Nº: 5; es decir, a la secuencia nucleotídica que codifica la cadena pesada que comprende la mutación Asn239Ala del factor VIII humano:

GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTG TGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTG TAGAATTCACGGTTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAG GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTA TCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTT CCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTT ACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGA GAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAA AAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATG CACACAGTCAATGGTTATGTAGCCAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGT GATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCC AGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGT TTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAA CTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTT GATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATT GCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTT GAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGA CTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATT ATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGG AGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTG ACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAG AGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAA TGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAA CGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCA ATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAG CACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCC TATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCA GACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGA CAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGA

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 6; es decir, a la secuencia aminoacídica de la cadena pesada que comprende la mutación Asn239Ala del factor VIII humano:

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEV YDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSY LSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYV ARSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGM EAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLV LAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQR GNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIG AQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDS YEDISAYLLSKNNAIEPR

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia nucleotídica del identificador de secuencia Nº: 7; es decir, a la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ligera que comprende la mutación Asn2118Ala del factor VIII humano:

AGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCC ACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATG GCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAA GTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATG AGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAA GTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGA AAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGA CAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATG GAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAAT CAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCA TGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAA TGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTG GAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCC CCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGC TGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTG TTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTT TATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAGCCTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCT TTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACC CAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTG GGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCT CCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGC TGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATG TATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAA GGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTC GAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCT ACTGA

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 8; es decir, a la secuencia aminoacídica que codifica la cadena ligera que comprende la mutación Asn2118Ala del factor VIII humano:

SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVE DNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKD VHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMD TLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLH AGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQG ARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGASTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDL NSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVK SLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQ DLY

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 9; es decir, a la secuencia aminoacídica del polipéptido I2144–T2161:

HARYIRLHPTHYSIRST

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 10; es decir, a la secuencia aminoacídica del dominio B del factor VIII humano completo:

SFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDP SPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNT SSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAH GPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLN HMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEG QNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTK NFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNT SQQNFVTQRSKR

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia nucleotídica del identificador de secuencia Nº: 11; es decir, a la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ligera que comprende la mutación Asn239Gln del factor VIII humano:

GCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTG TGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTG TAGAATTCACGGTTCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAG GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTA TCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTT CCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTT ACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGA GAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAA AAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATG CACACAGTCAATGGTTATGTACAGAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGT GATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCC AGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGT TTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAA CTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTT GATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATT GCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTT GAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGA CTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATT ATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGG AGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTG ACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAG AGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAA TGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAA CGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCA ATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAG CACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCC TATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCA GACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGA CAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGA

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 12; es decir, a la secuencia aminoacídica que codifica la cadena pesada que comprende la mutación Asn239Gln del factor VIII humano:

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEV YDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSY LSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYV QRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDG MEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPL VLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGI TDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQ RGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSI GAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYED SYEDISAYLLSKNNAIEPR

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia nucleotídica del identificador de secuencia Nº: 13; es decir, a la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ligera que comprende la mutación Asn2118Gln del factor VIII humano:

AGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCC ACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATG GCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAA GTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATG AGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAA GTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGA AAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGA CAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATG GAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAAT CAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCA TGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAA TGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTG GAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCC CCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGC TGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTG TTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTT TATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGACAGTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCT TTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACC CAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTG GGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCT CCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGC TGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATG TATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAA GGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTC GAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCT ACTGA

La siguiente secuencia corresponde a la secuencia aminoacídica del identificador de secuencia Nº: 14; es decir, a la secuencia aminoacídica que codifica la cadena ligera que comprende la mutación Asn2118Gln del factor VIII humano:

SFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVE DNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKD VHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMD TLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLH AGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQG ARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGQSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDL NSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVK SLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQ DLY

La presente invención no está prevista para que esté limitada en su alcance por las formas de realización específicas descritas en este documento. Es más, varias modificaciones de la invención además de las descritas en el presente serán aparentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas. Dichas modificaciones pretenden estar incluidas en el alcance de las reivindicaciones incluidas. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración de la presente invención y no a modo de limitación.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: CD humanas derivadas de monocitos

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica a partir de capas leucocitarias heparinizadas de donantes adultos sanos por adherencia a las placas plásticas de cultivo celular en el medio con RPMI 1640 complementado con suero humano AB al 10%, glutamina y antibióticos durante 60 minutos. Se quitaron las células no adherentes mediante 3 lavados suaves con el medio. Los monocitos adherentes se cultivaron en X–VIVO 15 (Cambrex Bio Sciences, París, Francia) complementados con suero humano AB al 1%, antibióticos y en presencia de la 500 IU/mL de interleucina humana recombinante (rhIL–4), R&D Systems (Lille, Francia) y 1000 IU/mL del factor estimulador de colonias granulocíticas–macrofágicas humano recombinante (rhGM–CSF), ImmunoTools (Friesoythe, Alemania). Se reemplazó cada 2 días la mitad del medio, incluyendo todos los suplementos. Después de 5 días de cultivo, se realizó la recolección de las células no adherentes o de baja adherencia correspondientes a la fracción enriquecida con CD. Dichas células se lavaron y se utilizaron para posteriores experimentos.

Ejemplo 2: Conjugación del FVIII humano recombinante completo, FVIII humano recombinante con el dominio B eliminado con fluoresceína

El FVIII humano recombinante completo (1000 IU, Kogenate, Bayer) y el FVIII humano recombinante con el dominio B eliminado (BDD–FVIII, 1000 IU, Refacto®, Wyeth) se solubilizaron en agua y se dializaron frente a una solución amortiguadora de bicarbonato (pH 9,2) que contiene 5 mM CaCl2 a 4 °C seguida de un enlace con fluoresceína 5– isotiocianato (isómero I, Sigma–Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) durante 7 a 8 horas a 4 °C. Posteriormente, el FVIII etiquetado se dializó frente a un medio con RPMI 1640 para eliminar el FITC no enlazado. El FVIII–FITC se cuantificó mediante el ensayo de Bradford utilizando albúmina sérica bovina como estándar.

Ejemplo 3: naturaleza del receptor de la endocitosis del FVIII

Protocolo

Las DC se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC con EDTA 5 mM, manano (1 mg/ml) o galactosa (1 mg/ml) antes de añadir el FVIII–FITC (40 µg/ml) durante 2 horas.

Se utilizó la endocitosis a 4 ºC como control (no disponible).

Resultados

Figura 1A: la endocitosis del FVIII–FITC se inhibió hasta 92±16,5% (P<0,01) en el caso de EDTA. Estos datos implican una función para los receptores dependientes de iones bivalentes en la endocitosis del FVIII mediante CD. El policarbohidrato de manano, un ligando competitivo modelo para la asimilación sensible a la manosa, redujo la asimilación del FVIII–FITC un 60±19% (P<0,01), mientras que la galactosa, un ligando competitivo para la asimilación sensible a la galactosa, no tuvo un efecto significativo.

Figura 1B: La especificidad del manano para los CLR sensibles a la manosa se confirmó en nuestro ajuste experimental utilizando dextrano etiquetado FITC, un ligando típico para los CLR sensibles a la manosa, especialmente CD206 y amarillo de Lucifer (LY, por sus siglas en inglés), la internalización del cual se realiza exclusivamente mediante macropinocitosis mediada por receptores. La internalización del dextrano se bloqueó un 89±9,3% en presencia del manano, mientras que el LY no se vio afectado.

Conclusión

Los resultados indican que los receptores sensibles a la manosa median una parte significativa de la endocitosis del FVIII mediante CD.

Ejemplo 4: La entrada sensible a la manosa del FVIII mediante CD provoca la presentación de péptidos derivados del FVIII a los linfocitos T + CD4 específicos del FVIII.

Protocolo

Figura 2A: Se incubaron CD generadas a partir de donantes que encajan con MHC II (10000 células/pocillo) en un medio solo o en presencia de manano (1 mg/ml) o anti–CD206 IgG (10 µg/ml) seguida de la incubación con el clon D9E9 del linfocito T específico del FVIII (5000 células/pocillo) en presencia de dosis variables del FVIII completo (Kogenate®) (5,56, 2,78 ó 1,39 µg/ml) y 20 U/ml rhIL–2 durante 20 horas a 37 °C. Se evaluó la activación del linfocito T mediante la liberación de IFN–gamma en el sobrenadante del cultivo.

Figura 2B: Se preincubaron CD generadas a partir de donantes que encajan con MHC II con manano (1 mg/ml) o IgG anti–CD206 (10 µg/ml) seguidas de la adición del FVIII (5,56 µg/ml) o péptido I2144–T2161 (2 µg/ml) y D9E9. Para cada tratamiento, la producción de IFN–gamma se representó en relación al valor máximo obtenido en cada experimento individual (*: P<0,0001, según la evaluación utilizando la prueba de Mann–Whitney).

Figura 1C: Las líneas celulares LE2E9 y BO2C11 B que encajan con HLA específicas del FVIII humano o las CD se incubaron solas o en presencia del manano (1 mg/ml) seguidas de la incubación con FVIII completo (Kogenate®) (10 µg/ml) y D9E9.

Resultados

En conjunto, los datos validan el hecho que los efectos de la inhibición del manano en la activación de D9E9 surgen del bloqueo de la endocitosis sensible a la manosa del FVIII por parte de las CD.

Ejemplo 5: Los residuos de manosa esperados ubicados por fuera del dominio B tienen una función importante en la endocitosis del FVIII mediante CD que conducen a la activación de los linfocitos T.

Protocolo

Figura 3A: Las CD se preincubaron con manano (1, 5, 10, 100 y 1000 ¥g/ml) antes de la adición del FVIII–FITC completo (Kogenate®)(40 µg/ml, 143 nM, círculos completos) o BDD–FVIII–FITC (24,31 µg/ml, 143 nM, círculos vacíos)

o dextrano–FITC (50 ¥g/ml). Se analizó la asimilación de los antígenos mediante citometría de flujo. Se calculó el porcentaje de la inhibición para cada condición con respecto a la condición sin manano.

Figura 3B: Se separó el BDD–FVIII nativo o tratado con EndoF1 (3,7 µg) mediante SDS–PAGE al 7,5% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas transferidas se revelaron utilizando Protogold® o después de la incubación con 10 ¥g/ml de CTLD4–7–Fc utilizando una anti–IgG humana conjugada con fosfatasa alcalina. La cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CP) se identificaron a partir de la transferencia por adsorción con IgG anti FVIII monoclonales específicas de las CP y CL (no disponibles).

Figura 3C: Reducción de la activación de linfocitos T en el tratamiento con EndoF1 de BDD–FVIII. Los resultados representan un modelo de 3 experimentos independientes.

Resultados

En conjunto, los datos que confirman la implicación de glucanos que terminan en manosa ubicados por fuera del dominio B en la asimilación del FVIII.

Figura 3B: se indicó la extracción de estructuras oligomanosas en el tratamiento con EndoF1 mediante un desplazamiento del perfil de migración del BDD–FVIII y mediante la pérdida del reconocimiento del CTLD4–7–Fc.

Figura 3C: CD incubadas con D9E9 activadas con BDD–FVIII tratado con EndoF1 en menor grado que las incubadas con BDD–FVIII nativo (P<0,0001 en el caso de CD). Cabe destacar que la demanosilación del FVIII no tuvo la misma eficacia en la reducción de la activación de linfocitos T como en la saturación de los receptores de la manosa en CD utilizando manano. La capacidad residual del BDD–FVIII tratado con EnfoF1 para activar D9E9 se puede atribuir a la presencia de residuos de N–acetil–glucosamina en el FVIII, que se presentan con moderada afinidad para los receptores sensibles a la manosa.

Ejemplo 6: Activación de los linfocitos T de la cadena ligera Asn2118Ala del FVIII modificado

Protocolo

La cadena ligera derivada de plasma purificada del FVIII (wtCL) amablemente facilitado por el Dr. E. Saenko (University of Maryland, Baltimore, MD, EE. UU.) se trató o no con Endo–F1. La wtCL, la wtCL en presencia de manano (1 mg/ml) y la wtCL tratada con Endo–F1 se añadieron a las CD (figura 4A) o a BO2C11 (figura 4B) y se cultivaron en forma conjunta con células D9E9 durante 20 horas. Se evaluó la activación de D9E9 midiendo el IFN–gamma en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Las figuras C y D muestran la pérdida de activación de D9E9 en mutagénesis dirigida del CL–FVIII (Asn2118Ala–CL–FVIII). El clon de las células B BO2C11 y las CD derivadas de monocitos se incubaron con D9E9 en presencia de la CL silvestre (figura 4C) o en presencia del FVIII de la CL Asn2118Ala mutada (figura 4D). La sustitución de Asn2118 por un residuo de Ala extrae un sitio para la manosilación N. La activación de D9E9 se evaluó después de 20 horas midiendo el IFN–gamma en el sobrenadante del cultivo.

Resultados

Figuras 4A y 4B: En primer lugar, validamos que la wtCL ingresara en las CD derivadas de monocitos de una manera sensible a la manosa y activará el clon del linfocito T de D9E9 específico del FVIII. La activación de la D9E9 por las CD fue significativamente menor en el caso de la wtCL incubada con manano y en el caso de la wtCL tratada con Endo–F1 que en el caso de la wtCL no tratada (figura 4A). Por el contrario, la activación de D9E9 por la línea celular B BO2C11, que endocitosa el FVIII a través de un receptor de las células B específico del FVIII, no presentó alteraciones en la incubación de la wtCL en presencia de manano o en el tratamiento con Endo–F1 (figura 4B). Estos datos son una reminiscencia de nuestras observaciones con el FVIII intacto (figura 3) y demuestran que la entrada de la cadena ligera del FVIII en las CD derivadas de monocitos depende, en la mayor parte, de glucanos manosilados.

Figura 4C y 4D: El adecuado plegamiento de la CL Asn2118Ala se confirmó en un ELISA utilizando una IgG humana monoclonal específica para un epítopo conformacional en el dominio C2 del FVIII (es decir, IgG producida por el clon de la célula B BO2C11). La D9E9 activada de la wtCL en la presentación de BO2C11 y CD (figura 4C). Por el contrario, si bien la D9E9 se activó por el FVIII de la CL Asn2118Ala en la presentación de BO2C11, no fue cuando las CD se utilizaron como células presentadoras de antígenos (CPA) (figura 4D).

Ejemplo 7: Clonación y producción de variantes del FVIII recombinante

Etapa 1. Clonación de diferentes variantes del FVIII

El ADNc que codifica el BDD–FVIII (a partir de ATCC, clon pSP64–FVIII), FVIII recombinante completo (Kogenate, Bayer) o cualquier FVIII modificado se utilizan como “FVIII” en este ejemplo.

El FVIII se subclona en un vector de subclonación (vector pCR®–Blunt II–TOPO®) utilizando la PCR Zero Blunt® TOPO®. La mutagénesis dirigida se realiza utilizando los cebadores apropiados para generar 4 ADNc de diferentes variantes del FVIII:

-

secuencia silvestre.

-

variante única de cadena pesada: codón AAC (Asn239) –> codón GCC (Ala239)

-

variante única de cadena ligera: codón AAT (Asn2118) –> codón GCT (Ala2118)

-

doble variante: Asn239Asn2118 –> Ala239Ala2118

El inserto se digiere con las correspondientes enzimas de restricción, purificadas y ligadas a un extremo cohesivo con el vector pCDNA3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para la expresión de la proteína en líneas celulares eucariotas

o con el vector pLIVE (Mirus, Madison, WI, EE. UU.) para una inyección hidrodinámica in vivo.

Etapa 2. Transfección temporal de líneas celulares de mamíferos

Las diferentes variantes del FVIII pCDNA3.1(+) se transfectaron en diferentes líneas celulares eucariotas: Células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de hámster bebé (BHK) y células HKB11 (híbrido de las células de riñón y B; ATCC # CRL–12568), utilizando la tecnología Nucleofector® (Amaxa Biosystems). En general, la tecnología Nucleofector® permite la transfección estable de 70 a 100% de las células. Las células HKB11 se han desarrollado específicamente para la producción del FVIII recombinante.

El FVIII se detecta en el sobrenadante utilizando el ELISA tipo sándwich, resonancia de plasmón superficial (SPR, Biacore®) e inmunotransferencia tipo Western. Los niveles del FVIII se compararon con un estándar FVIII recombinante disponible comercialmente (rFVIII, Kogenate®, Bayer o BDD BrFVIII Refacto® Wyeth). Una transfección temporal indica si las células producen las variantes del FVIII.

Etapa 3. Transfección in vivo de diferentes construcciones de FVIII

Las diferentes construcciones del FVIII clonadas en el vector pLIVE se inyectaron en ratones con deficiencia de FVIII. Se inyectó cien µg de cada plásmido por vía intravenosa en 2 ml en :5 segundos. Este enfoque, al que se hace referencia como “inyección hidrodinámica”, se ha utilizado con éxito en el pasado para expresar altos niveles del factor de von Willebrand (VWF) en ratones con deficiencia de FVIII (25). En estos experimentos, la expresión de VWF se mantuvo hasta 3 semanas a niveles superiores a los encontrados en el plasma de los ratones silvestres. En este caso, la cinética de la expresión del FVIII fue seguida por 3 semanas utilizando ELISA, SPR y transferencia por adsorción tipo Western.

Etapa 4. Transfección estable de líneas celulares de mamíferos y producción a baja escala

La transfección estable se realizará como se describe en la etapa 2. Después de la transfección de la línea celular candidata utilizando la tecnología Nucleofector®, se clonarán las células limitando diluciones. Las células que producen FVIII se amplificarán y las soluciones madres se mantendrán congeladas a –80 ºC.

La producción a baja escala de las proteínas se realiza en DMEM 1:1–F12 siguiendo procedimientos clásicos. En resumen, las células se cultivan para la subconfluencia durante 3 a 4 días antes de la recolección de los sobrenadantes. Se analizarán los sobrenadantes en busca de la presencia de variantes del FVIII mediante ELISA, resonancia de plasmón superficial (SPR, Biacore®) e inmunotransferencia tipo Western, utilizando IgG anti FVIII monoclonales humanas y murinas. Las cantidades del FVIII se cuantifican utilizando el rFVIII disponible comercialmente como estándar (Kogenate, Bayer o Refacto Wyeth) para realizar una estimación de la producción del FVIII por célula por día.

Etapa 5. Solución propuesta para aumentar la producción y secreción de las variantes del rFVIII.

El nivel de producción del rFVIII por células de mamíferos se limita por diferentes factores: 1) interacciones del dominio A1 del FVIII con chaperonas del retículo endoplasmático (RE) como por ejemplo la proteína unida a la inmunoglobulina (BiP, por sus siglas en inglés), que inhibe la secreción del FVIII; 2) es necesaria la unión de los azúcares manosilados de la molécula del FVIII con LMAN1 (ERGIC53) para una adecuada exportación desde el RE al aparato de Golgi y, de este modo, se debe evitar la extracción de las glicosilaciones ligadas a N, para no prevenir la unión con LMAN1 y exportación del FVIII. A la inversa, se puede aumentar la producción y secreción del FVIII en la bioingeniería de la molécula: 1) la adición de una parte truncada del dominio B, expresando 6 sitios para la glicosilación N aumenta la producción del rFVIII muchas veces en comparación con el rFVIII eliminado del dominio silvestre; 2) la mutación de Phe309 en un residuo Ser reduce la capacidad de unión a BiP y aumenta la secreción del FVIII. En este sentido, la eliminación de sitios para la glicosilación ligada a N mediante mutagénesis dirigida podría resultar en una reducción de la producción del FVIII. Es más, el ADNc del FVIII con el dominio B eliminado silvestre presenta 3 sitios para la glicosilación. Después de la mutagénesis dirigida, se espera que sólo un sitio permanezca: Asn1810 en el dominio A3, que podría no ser suficiente para la secreción adecuada de las moléculas.

Si se obtienen producciones bajas de FVIII con variantes del rFVIII mutadas, en la construcción podríamos introducir la secuencia del ADNc que codifica los primeros 226 aminoácidos del dominio B del FVIII. Esta secuencia presenta 6 sitios para la glicosilación ligada a N. Para este propósito, ya se quitó el ARNm de los extractos del hígado humano y se preparó ADNc humano (un presente del Dr. Cavard, Institut Cochin, París). Se amplificó el ADN que codifica el dominio B utilizando cebadores adecuados y se introdujo entre las cadenas pesada y ligera de las cuatro construcciones del FVIII. El dominio B que contiene las construcciones luego se clona en los vectores pCDNA3 y pLIVE. Las células se transfectan y las expresiones se estudian según lo explicado anteriormente.

Ejemplo 8: Producción a media escala del FVIII modificado

El FVIII del ejemplo 7 (silvestre/239mut/2118mut/239mut2118mut ) se produce utilizando frascos rotativos en un medio basal con suero. Una cantidad suficiente del FVIII diferente se produce en frascos rotativos y luego se purifica mediante cromatografía de afinidad. Las cantidades estimadas necesarias para realizar todos los estudios descritos a continuación se evaluaron a aproximadamente 2 mg (10 000 UI) para cada variante del FVIII. La producción del procedimiento de purificación es cercana al 25% por lo que será necesario producir 8 mg (40 000 UI) de cada variante del FVIII.

La producción del FVIII por cada clon se adapta dependiendo de la productividad del clon. Para un productor alto (> 5UI/106 células/día), la producción se realiza en frascos rotativos en un sistema de partidas. Para un productor bajo (< 5UI/106 células/día), la producción de realiza en partidas repetidas utilizando frascos rotativos.

Ejemplo 9: Integridad estructural y funcional del FVIII modificado

Etapa 1. Transfección in vivo de variantes del FVIII recombinante

Las diferentes construcciones del FVIII del ejemplo 7 u 8 se clonan en un vector pLIVE y se expresan en ratones con deficiencia del FVIII después de la inyección hidrodinámica. Los niveles del FVIII en el plasma de los ratones se miden utilizando un ELISA tipo sándwich y ensayos de coagulación funcionales. Se investiga la corrección de la coagulación en ratones después de tomar una muestra de tejido de la cola con unas tijeras y la medición del tiempo de sangrado y de la cantidad de sangre perdida.

Etapa 2. Actividad procoagulante in vitro

La actividad procoagulante de las cuatro variantes del FVIII recombinante (ejemplo 7) se está investigando in vitro e in vivo. Se incuba FVIII en diluciones con plasma humano reducido en FVIII y su actividad se mide utilizando un ensayo de coagulación funcional (FibrinTimer CA540, Dade–Behring). Alternativamente, la actividad del FVIII se evalúa utilizando un ensayo cromogénico, en el que el FVIII se mezcla con el factor IX activado y con el factor X y los fosfolípidos. Posteriormente se mide la generación del factor X activado utilizando un sustrato sintético cromogénico del factor X activado. Se calculan las actividades específicas de las diferentes construcciones del FVIII. El FVIII con el dominio B eliminado (Refacto® Wyeth) es el preferente y el utilizado en el ensayo. Los resultados de la generación FXa se expresan como el cociente del valor del estándar divido por el valor de la muestra de la prueba t1/2 (respuesta semimáxima).

Etapa 3. Interacción del FVIII con los anticuerpos monoclonales, factor de von Willebrand y fosfolípidos

Se está investigando la interacción de las diferentes variantes del FVIII con los anticuerpos monoclonales, factor de von Willebrand y fosfolípidos.

Etapa 4. Procedimientos para el análisis de modificaciones postraduccionales

a) Desalación, concentración y activación del FVIII

La concentración y desalación de las muestras del FVIII son necesarias para eliminar las sales, monosacáridos y pequeñas moléculas que podrían interferir en varios análisis futuros.

La desalación se realiza en un sistema purificador AKTA (Amersham–Biosciences) equipado con una columna 10WC4– 25QS Uptisphere de fase reserva (FR) (Interchim) equilibrada en 5 % de MeCN + TFA al 0,1%. La elución se realizó utilizando un gradiente del 5 al 90 % de MeCN + TFA a 0,1% en 5 CV. El producto desalada se recoge y seca en un evaporador al vacío Speed–Vac.

Las muestras del FVIII purificadas puede también someterse a una activación a través de un tratamiento con trombina. Las cadenas del FVIII resultantes se pueden luego separar utilizando RP–HPLC (Uptisphere UP5WOD$25QK) utilizando un gradiente MeCN + TFA regular.

b) Desglicosilación enzimática del FVIII

i) Desglicosilación de PNGase F

La PNGase F es una enzima específica para las estructuras de N–glucano. Después de la desalación y secado, el FVIII se resuspende en la solución amortiguadora de la enzima, con o sin agentes reductores y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. La enzima se añade luego (E/S 5mIU/200µg) y la desglicosilación se realiza mediante incubación a 37 ºC durante 18 horas.

ii) Desglicosilación de Endo–H

La Endo H es una enzima específica para las N–glico estructuras de la oligomanosa y del tipo híbrido. Después de la desalación y secado, el FVIII se resuspende en la solución amortiguadora de la enzima, con o sin agentes reductores y se incuba durante 5 minutos a 95 ºC. Después de la refrigeración en hielo, la enzima se añade (E/S: 0,2 mIU/µg prot). La reacción de desglicosilación se realiza durante 2 horas a 37 ºC.

iii) Análisis de SDS–PAGE

La glicosilación del FVIII se puede caracterizar parcialmente mediante análisis de SDS–PAGE de los productos obtenidos antes y después de la desglicosilación enzimática con PNGAse F o Endo H. SDS–PAGE se realiza en un sistema NOVEX (Invitrogen, Life Technologies). La muestra se carga (0,5 y 1 µg) en condiciones no reductoras y reductoras en un gel al 4 al 12 % (Novex). Después de la migración a 200 V durante 50 minutos, las proteínas se tiñen de plata. Después del barrido digital e integración del gel (software Quantity One, Biorad), el aparente peso molecular de las diferentes bandas de proteínas se determina mediante la comparación con estándares de proteínas.

iv) Análisis de la transferencia por adsorción de lectina

La detección específica de péptidos glicosilados (tipo complejo, tipo manosa alta) y de polipéptidos, incluyendo el FVIII, se realiza utilizando un análisis de transferencia por adsorción de lectina (Fukuda y Kobata, Glycobiology a Pratical Approach). Se separan diez µg de FVIII mediante SDS–PAGE como se describió anteriormente y se transfieren a una membrana de nailon o nitrocelulosa según las instrucciones del fabricante (Novex). En resumen, una vez que la membrana se transfiere por adsorción se bloquea con BSA, se lava en PBST (PBS, Tween 20 0,05%) y se incuba a 4 ºC con la lectina correspondiente (es decir, GNA, Con A, DGA, LcH, MNA–M, VFA, PEA, PMA, AMA, etc.) etiquetada con peroxidasa (laboratorios Ey). Después de algunos lavados con PBST, la peroxidasa se revela mediante procedimientos colorimétricos y de quimioluminiscencia y se captura la imagen de la transferencia por adsorción resultante utilizando un escáner o cámara CCD. El análisis de la imagen y la cuantificación se realizan utilizando el software Quantity One (Biorad).

Etapa 5. Procedimientos para el análisis de la estructura primaria del FVIII

a) Mapeo del FVIII

El mapeo del FVIII permite el análisis de la estructura primaria. La secuencia de la proteína es única, y los péptidos generados después de la digestión con las enzimas específicas (tripsina o Asp–N endoproteasa) son característicos a la proteína de interés. Después de la desalación y secado, el FVIII se desnaturaliza (8M Urea), reduce (DTT 20 moles/mol de SH) y alquila (iodoacetamida 40 moles/mol de SH). El FVIII luego se digiere con tripsina (E/S: 1/25 m/m), que escinde la proteína después de los residuos de Arg (R) y Lys (K). Asp–N (E/S: 1/100 m/m), que escinde las proteínas antes de que los residuos de Asp (D) se utilicen. Después de la digestión de proteínas, los péptidos generados se inyectan directamente al sistema LC–MS/MS para el análisis o se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa en una columna C18 300 Å utilizando un gradiente de acetonitrilo en aumento. Las fracciones luego se recogen y se secan utilizando un Speed–Vac para análisis adicionales mediante secuenciación de Edman y MALDI–TOF MS.

b) Secuenciación de Edman

La secuenciación de Edman del extremo N terminal del FVIII se realiza en un microsecuenciador (Procise 491 HT, Applied Biosystems) en un procedimiento en tres etapas: acople – escisión y conversión. Los aminoácidos luego se separan mediante cromatografía en fase reversa. El análisis e identificación de los residuos del extremo N terminal se logran utilizando aminoácidos estándar a partir de Sequence Pro (Applied Biosystems) y se comparan con la secuencia teórica del FVIII, permitiendo así la confirmación de las sustituciones de aminoácidos, por ejemplo.

c) Espectrometría de masas

MALDI TOF (/TOF)

La espectrometría de masas mediante tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI– TOF MS) es una técnica que permite la medición de las masas moleculares con gran precisión. La MALDI–TOF MS es un procedimiento de ionización que permite el análisis de péptidos, proteínas y glucanos.

Los péptidos, proteínas o glucanos de interés (FVIII, fragmentos del mismo o glucanos) se mezclan con una matriz que se absorbe en la longitud de onda del láser. Las matrices utilizadas con mayor frecuencia son un ácido ciano–4– hidroxicinámico (HCCA para el análisis de péptidos, ácido sinapico (AS) para las proteínas y ácido 2,5– dihidroxibenzoico para los oligosacáridos (DHB). La identificación de cada péptido se puede realizar midiendo su masa mediante espectrometría de masas y comparándola con la masa teórica deducida de la secuencia de proteínas teórica. La secuenciación de péptidos se puede realizar utilizando experimentos MS/MS (espectrometría de masas en tándem, TOF/TOF) a base de iones de fragmentos obtenidos en estas condiciones para un péptido dado. Una estrategia similar se utiliza para la identificación y caracterización de los oligosacáridos. Se encuentra disponible un instrumento Bruker Autoflex 2.

Cromatografía en fase líquida acoplada con la espectrometría de masas de ionización de electronebulización (LC– ESIMS)

A diferencia de MALDI, la ionización por electronebulización (ESI, por sus siglas en inglés) no requiere el uso de una matriz. En ESI, la solución de la muestra se introduce en un capilar que se encuentra a un alto voltaje. Se aplica un fuerte campo eléctrico en los tubos que conducen a la formación de un rocío de gotitas cargadas que simultáneamente cruzan un campo eléctrico y un gradiente de presión que se encuentra en la vía del analizador de espectrometría de masas.

El análisis mediante ESIMS se puede realizar después de la separación cromatográfica de los péptidos en investigación. También se puede obtener un mapa de péptidos. En el caso del FVIII, la separación de péptidos se puede realizar en una columna Uptisphere UP5WOD25QK (Interchim) con un gradiente de acetonitrilo.

La detección mediante espectrometría de masas se realiza a través de un espectrómetro de masas híbrido Qq–TOF (tetrapolar – tiempo de vuelo, Qstar–xl, Applied Biosystems) que permite la recolección de datos de MS y MS/MS. De este modo, se puede lograr la cobertura de la secuencia aminoacídica.

d) Mapeo de oligosacáridos HPCE–LIF

La caracterización y cuantificación de diferentes estructuras de oligosacáridos relacionados con las asparraginas o “estructuras ligadas a N” se realizan mediante HPCE–LIF. Los azúcares se liberan del FVIII mediante un tratamiento de PNGase F y se aíslan mediante precipitación con etanol en hielo frío. Las muestras se tratan con exoglicosidasas (sialidasa, galactosidasa, manosidasas, N–acetilhexosaminidasa) para garantizar que todas las estructuras aisladas se cuantifiquen y caractericen. Todas las glucosidasas utilizados se obtienen de Prozyme. En esta etapa, se realiza una segunda precipitación etanólica. Los glucanos obtenidos se etiquetan con un fluoróforo (APTS) y se separan según si masa y carga. Dos estándares (homopolímeros de glucosa, oligosacáridos) permiten la identificación de las estructuras.

Un capilar recubierto N–CHO de Beckman Coulter (dimensión 50 cm x 50 µm ID) se monta en una electroforesis capilar (ProteomeLab PA800, Beckman Coulter). Las condiciones experimentales son: solución amortiguadora de separación «gel solución amortiguadora–N – Beckman coulter», migración a 25 KV, 20 min a 20 °C y detección láser utilizando Aex 488nm y Aem 520 nm.

e) Mapeo de oligosacáridos NP–HPLC

La identificación y cuantificación de las numerosas estructuras de oligosacáridos relacionadas a las asparraginas, conocidas como estructuras ligadas a N, también se pueden realizar mediante una cromatografía líquida de alta resolución en fase normal (NP–HPLC). Los N–glucanos se liberan utilizando una enzima específica (PNGase F) y se aíslan mediante precipitación de etanol. Los glucanos obtenidos se etiquetan con fluoróforo de 2–aminobenzamida (2– AB). Los glucanos etiquetados se separan mediante NP–HPLC utilizando una columna Amide–80 (Tosohaas), conectada a un sistema «Gold» (Beckman).

Antes de la inyección de la muestra, la columna se equilibra con una solución amortiguadora de acetonitrilo al 80%. Los oligosacáridos se eluyen en una gradiente en aumento de 50 mM de formiato de amonio con pH 4,45. La detección se realiza utilizando fluorescencia a Aex 330nm y Aem 420nm.

Ejemplo 10: inmunogenicidad de la CL Asn2118Ala en ratones con deficiencia de FVIII Protocolo

La cadena ligera derivada de plasma purificada del FVIII (wtCL) fue amablemente facilitada por el Dr. E. Saenko (University of Maryland, Baltimore, MD, EE. UU.) La CL mutada del FVIII (CL de Asn2118Ala) se generó y produjo. La wtCL y la CL mutada se inyectaron por vía intravenosa (0,2 µg de proteína en 200 IL de PBS) a ratones con def�c�enc�a de FVIII (un presente del Prof. Kazazian, Pennsylvania University, EE. UU.) cuatro veces en intervalos semanales. Una semana después de la cuarta inyección, se extrajo la sangre de los ratones y se analizaron los niveles de anti–IgG del– FVIII utilizando un ELISA específico para FVIII.

ELISA: El suero de los ratones diluido 1 en 90 se incubó en una placa de ELISA revestida con FVIII humano.(Recombinate, Baxter). Las placas se bloquearon utilizando PBS–1% BSA. Se revelaron IgG unidas utilizando una IgG anti–murino acoplada con peroxidasa y su sustrato (OPD). Se midió la intensidad de la unión mediante densidad óptica a 492 mm con un espectrómetro (Tecan Genyos), definiendo de esta manera los niveles de anti–IgG del FVIII.

Resultados

La administración por vía intravenosa de la cadena ligera derivada del plasma purificada del FVIII humano (wtCL) a ratones con deficiencia de FVIII indujo niveles detectables de anti–IgG del FVIII. Es interesante destacar que la respuesta inmunitaria de los ratones a la wtCL fue heterogénea entre los seis ratones incluidos en el experimento. Por contraste, el tratamiento con ratones con la CL de Asn2118Ala no pudo inducir niveles importantes de anti–IgG del FVIII.

Conclusión

Estos datos demuestran que la capacidad de la CL de Asn2118Ala para inducir una respuesta inmunitaria específica se reduce fuertemente en comparación con la wtCL.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> LFB biotechnoloies instituí National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM)

5 <120> Factor VIII recombinante demanosilado para el tratamiento de pacientes con hemofilia A

<130> 27690PC

<160> 14

<170> Patentin versión 3.3

<210> 1

10 <211> 2351

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 2332

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 4275

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 1424

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 2220

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 740

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 1932

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 643

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

10 <211> 573

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 2220

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 740

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 1932

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 643

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína FVIII con actividad procoagulante que incluye un polipéptido FVIII modificado cuya modificación comprende la sustitución o deleción de al menos un aminoácido seleccionado del grupo formado por asparagina 239, asparagina 2118, serina 241 y treonina 2120, comprendiendo dicha modificación preferentemente al menos

   �

   la sustitución de la asparagina 239 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, glicina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina;

   �

   la sustitución de la asparagina 2118 por un aminoácido seleccionado del grupo formado por alanina, serina, glutamina, treonina, ácido aspártico o ácido glutámico y preferentemente por alanina o glutamina;

   �

   la sustitución de la asparagina 239 y la asparagina 2118 por alanina o glutamina;

   �

   la sustitución de la asparagina 239 por alanina y la asparagina 2118 por glutamina

   �

   la sustitución de la asparagina 239 por glutamina y la asparagina 2118 por alanina

2. 2.

   Una proteína FVIII según la reivindicación 1, en la que la modificación de dicho polipéptido FVIII modificado incluye además la deleción de todo o parte del dominio B descrito en SEQ ID Nº: 10

3. 3.

   Una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el polipéptido FVIII modificado incluye al menos una de ambas:

   (i)

   la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº: 6; y/o

   (ii)

   la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº: 8

4. 4. Una molécula aislada de ácidos nucleicos o una secuencia aislada modificada de ácidos nucleicos que codifica la proteína FVIII de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que dicha secuencia de ácidos nucleicos o secuencia modificada de ácidos nucleicos que codifica dicho polipéptido FVIII modificado incluye al menos una de las siguientes:

   (i)

   la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº: 5; y/o

   (ii)

   la secuencia de ácidos nucleicos descrita en SEQ ID Nº: 7

5. 5.

   La molécula de ácidos nucleicos complementaria de la molécula de ácidos nucleicos aislada de la reivindicación 4.

6. 6.

   Un vector de expresión que incluye una molécula aislada de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.

7. 7.

   Una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6 o que expresa la proteína FVIII de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. 8.

   Un organismo transgénico no humano que expresa la proteína FVIII de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, siendo seleccionado preferiblemente dicho organismo entre un microorganismo, un animal, un mamífero o una planta.

9. 9.

   Una composición que incluye una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, preferiblemente una composición farmacéutica o liofilizada y más preferiblemente que incluya un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. 10.

    Un método para la producción de una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que incluye los pasos de:

    a) Hacer crecer en un cultivo una célula hospedadora transformada o transfectada con la molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 4 ó 5, o con una molécula de ácidos nucleicos que codifica una proteína FVIII como la de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y

    b) aislar de la célula hospedadora y/o del medio de cultivo la proteína FVIII resultante de la expresión de la molécula de ácidos nucleicos.

11. 11.

    La proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una deficiencia de FVIII, siendo dicha enfermedad preferentemente hemofilia A o hemofilia adquirida.

12. 12.

    El uso de una proteína FVIII según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para tratar hemofilia A o hemofilia adquirida.